UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL BIOCOMPATIBILIDADE DE IMPLANTE DE CO-POLIAMIDA ASSOCIADA À ELASTÔMERO TERMOPLÁSTICO (PCTPE) CUSTOMIZADO POR IMPRESSORA TRIDIMENSIONAL EM ANASTOMOSE TRAQUEAL DE COELHO (Oryctolagus cuniculus) Laise Michi Yamashiro Médica Veterinária 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL BIOCOMPATIBILIDADE DE IMPLANTE DE CO- POLIAMIDA ASSOCIADA À ELASTÔMERO TERMOPLÁSTICO (PCTPE) CUSTOMIZADO POR IMPRESSORA TRIDIMENSIONAL EM ANASTOMOSE TRAQUEAL DE COELHO (oryctolagus cuniculus) Laise Michi Yamashiro Orientador: Profa. Dra. Paola Castro Moraes Coorientador: Prof. Dr. Alexandre Lima de Andrade Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Cirurgia Veterinária. 2019 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Laise Michi Yamashiro, nasceu em São Paulo-SP, aos 15 de janeiro de 1991. Cursou graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP, Campus Araçatuba, de março de 2010 a dezembro de 2014. Realizou Residência em Clínica Cirúrgica de Pequenos Animais na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP- Campus de Araçatuba de março de 2015 a fevereiro de 2017. Em março de 2017, ingressou no programa de Pós-graduação em Cirurgia Veterinária, curso de mestrado, sendo bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, sob orientação da Professora Doutora Paola Castro Moraes. "Se antes de cada ato nosso nos puséssemos a prever todas as consequências dele, a pensar nelas a sério, primeiro as imediatas, depois as prováveis, depois as possíveis, depois as imagináveis, não chegaríamos sequer a mover-nos de onde o primeiro pensamento nos tivesse feito parar. Os bons e os maus resultados dos nossos ditos e obras vão-se distribuindo, supõe-se que de uma forma bastante uniforme e equilibrada, por todos os dias do futuro, incluindo aqueles, infindáveis, em que já cá não estaremos para poder comprová-los, para congratularmos ou pedir perdão, aliás, há quem diga que isso é que é a imortalidade de que tanto se fala." José Saramago DEDICATÓRIA Dedico aos meus pais Kazuya Yamashiro e Silmara A. Yamashiro, à minha irmã Larisse M. Yamashiro e a todos os animais, sem os quais, não seria possível a realização desse trabalho. Fonte: arquivo pessoal AGRADECIMENTOS Agradeço, Primeiramente a Deus, Meu Pai, que me abençoou com essa vida, sempre iluminando meu caminho e me dando sabedoria e discernimento para chegar até aqui. Aos meus pais, razões da minha vida, Kazuya Yamashiro e Silmara Aparecida Vascon Yamashiro, por me apoiarem infinitamente em todos os momentos e possibilitarem a realização dos meus objetivos. À minha irmã, Larisse Miki Yamashiro, por completar minha vida e estar sempre comigo. Aos meus avós, Isamo Yamashiro, Chieco Yamashiro, Neusa Campos Vascon, e familiares, que sempre torceram por mim. A Fernanda Paes pelos conselhos tanto profissionais, como pessoais, por me mostrar que a pós-graduação é feita para mentes curiosas, engenhosas e ao mesmo tempo humildes. Te admiro muito. Sou grata por ter compartilhado essa etapa da vida com você. Obrigada por estar ao meu lado. Aos meus animais, Grince e Charlote, que proporcionam mais alegria e leveza à minha vida. À Profa. Paola Castro Moraes, pela oportunidade de me receber como orientada em sua equipe e desenvolver em mim qualidades e habilidades muito além das profissionais. Sou grata por todo o companheirismo, amizade e paciência, por sempre confiar nas minhas ideias e propósitos e incentivar cada passo dado. Obrigada por direcionar nossos projetos com tanta vontade, pelas correções e ensinamentos. Ao Prof. Alexandre Lima Andrade, por ter apoiado a minha decisão de ir buscar novo conhecimento na Unesp de Jaboticabal e por compartilhar sua inteligência criativa. Foi através dos seus projetos com biomateriais na Unesp de Araçatuba que surgiu a ideia desse trabalho. Ao doutorando Thiago André Salvitti de Sá Rocha, que através da sua enorme sabedoria sobre impressão em três dimensões, acreditou nos meus propósitos e confeccionou com maestria o implante utilizado. Fico muito feliz por ter trabalhado contigo e ter dividido o seu conhecimento comigo. Aos membros do Serviço de Cirurgia de Tecidos Moles da Unesp de Jaboticabal, residentes e pós-graduandos, principalmente Juliana Ribeiro e Gabriel Montanhim e ao Cleber Ido que estiveram presentes em etapas cruciais do projeto, sempre dispostos e levando mais alegria para esses momentos. Ao Fernando Fernandes, grande amigo, que aceitou com muito entusiasmo participar do projeto. Obrigada por dividir o seu conhecimento com seriedade e singeleza. A minhas amigas e companheiras de apartamento Mayara Baller e Tamyris Beluque que fizeram a minha passagem por Jaboticabal ser muito feliz, pelas conversas em frente à televisão, por toda a ajuda e pela parceria, nossa despedida é momentânea e nos veremos em breve. E ao cachorrinho John que trouxe muita felicidade para a nossa casa. Aos meus amigos de Araçatuba que convivem comigo até os dias de hoje, Adriana Lima Kandrotas, Tairini Cruz, Thainá Landim de Barros, Juliana Massunari, Ana Carolina Martinez Albuquerque, Renata Haddad Pinho, Jessica Motta, Carlos Eduardo de Siqueira e Bruno Ribas, pelo apoio, por cada conversa e por sempre compartilharem momentos felizes. Obrigada a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp Jaboticabal pela oportunidade de aprendizado, ensino e pesquisa. A todos que contribuíram direta ou indiretamente, na realização deste trabalho. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. i SUMÁRIO CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ................ iii LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................ vi LISTA DE TABELAS ....................................................................................... vii LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... viii LISTA DE APÊNDICES ................................................................................... xi 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 12 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................. 13 2.1 Anatomia .................................................................................................. 13 2.2 Incidência e Etiologia ................................................................................ 14 2.3 Reconstrução Traqueal ............................................................................. 16 2.4 Impressão em 3 dimensões na Área Médica ............................................ 17 3. OBJETIVO.............................................................................................. 18 4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 19 4.1 Aspectos Éticos ........................................................................................ 19 4.2 Modelo Experimental ............................................................................... 19 4.3 Prótese em 3D .......................................................................................... 20 4.4 Protocolo Anestésico ................................................................................ 23 23 4.5 Procedimento Cirúrgico ............................................................................ 24 4.6 Avaliação Pós-Operatória ......................................................................... 27 4.7 Avaliação Clínico Cirúrgica e Eutanásia.................................................... 27 4.8 Avaliação Macroscópica ........................................................................... 27 4.9 Análise Histopatológica ............................................................................. 28 4.9.1 Critério para avaliação da biocompatibilidade da prótese ............... 29 4.10 Análise Estatística ................................................................................... 29 5. RESULTADOS ....................................................................................... 30 5.1 Avaliação Clínico-cirúrgica ....................................................................... 30 5.2 Avaliação Macroscópica .......................................................................... 30 5.3 Análise Histopatológica ............................................................................. 35 Página ii 6. DISCUSSÃO .......................................................................................... 42 7. PERSPECTIVAS FUTURAS .................................................................. 49 8. CONCLUSÕES ...................................................................................... 49 9. REFERÊNCIAS ...................................................................................... 50 10. APÊNDICES ........................................................................................... 58 iii CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS iv BIOCOMPATIBILIDADE DE IMPLANTE DE CO-POLIAMIDA ASSOCIADA À ELASTÔMERO TERMOPLÁSTICO (PCTPE) CUSTOMIZADO POR IMPRESSORA TRIDIMENSIONAL EM TRAQUEIA DE COELHO (Oryctolagus cuniculus) RESUMO - O escopo do presente trabalho visa a análise da reparação tecidual traqueal, viabilidade e biocompatibilidade de implante manufaturado tridimensionalmente por método de modelagem por fusão e deposição de co- poliamida associado a elastômero termoplástico aplicado por técnica de anastomose, em coelhos. Quinze animais foram divididos em três grupos homogêneos, referentes aos momentos das eutanásias programadas: sete, 15 e 30 dias. Sinais de caráter clinico e cirúrgico foram observados diariamente durante o tempo de sobrevida de cada grupo, indicando ausência de sinais respiratórios e complicações com a técnica de implantação. Avaliações macroscópicas foram realizadas, para verificar o comportamento tecidual perante a inserção do biomaterial por inspeção direta, assim como análise histopatológica em coloração hematoxilina-eosina para investigação das reações celulares locais. Os resultados dos estudos citado à cima foram aplicados ao teste Exato de Fisher, sob significância de 5% (p<0,05). Não houve deformidade traqueal, deiscência de sutura e luxação da prótese em nenhum animal do projeto. Processo inflamatório de padrão misto foi notado em todos os tempos explorados de forma decrescente, presença de crescimento tecidual sob implante conforme a reparação do organismo frente a prótese ocorreu de forma progressiva e houve escassez de células gigantes, comprovando ausência de reação tipo corpo estranho, revelando boa aceitação do implante e do material proposto na reparação de tecido traqueal. Dessa forma, conclui-se que a prótese traqueal biomimética oferece facilidade de fabricação, características estruturais adequadas, não tóxica, favorecendo a função anatómica e ótima integração biológica. Palavras-chave: biomaterial, impressão 3D, prótese traqueal, reparação tecidual v BIOCOMPATIBILITY OF CO-POLYAMIDE IMPLANT ASSOCIATED WITH THERMOPLASTIC ELASTOMER (PCTPE) CUSTOMIZED BY THREE- DIMENSIONAL PRESSURIZER IN RABBIT TRACEY (Oryctolagus cuniculus) ABSTRACT - The scope of the present work aims at the analysis of the tracheal tissue repair, viability and biocompatibility of a three-dimensional manufactured implant by fusion molding and co-polyamide deposition associated with thermoplastic elastomer applied by anastomosis technique in rabbits. Fifteen animals were divided into three homogeneous groups, related to the euthanasia moments programmed: seven, 15 and 30 days. Signs of clinical and surgical character were observed daily during the survival time of each group, indicating absence of respiratory signs and complications with the implantation technique. Macroscopic evaluations were performed to verify the tissue behavior before insertion of the biomaterial by direct inspection, as well as histopathological analysis in hematoxylin-eosin staining to investigate the local cellular reactions. The results of the above-mentioned studies were applied to Fisher's exact test, in a significance of 5% (p <0.05). There was no tracheal deformity, suture dehiscence, and dislocation of the prosthesis in any animal of the project. Inflammatory process of mixed pattern was observed at all times explored decreasingly, presence of tissue growth under implant as the repair of the organism before the prosthesis occurred progressively and there was a shortage of giant cells, proving absence of foreign body type reaction, revealing good acceptance of the implant and of the proposed material in the repair of tracheal tissue. Thus, it is concluded that the biomimetic tracheal prosthesis offers ease of manufacture, adequate structural characteristics, non-toxic, favoring the anatomical function and optimal biological integration. Keywords: 3D printing, biomaterial, tissue repair, trachea implant vi LISTA DE ABREVIATURAS 3D Três dimensões 7d Sete dias 15d Quinze dias 30d Trinta dias ASTM American Society for Testing and Material CAD Computer-aided design CD Craniocaudal CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais cm Centímetro CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal CR Cranial ETC Estenose Traqueal Congênita FMD Fused Deposition Modeling GP Grupo Prótese HE Hematoxilina-Eosina IM Intramuscular kg Quilograma L Litro mg Miligrama min Minuto mL Mililitro mm Milímetro N Número PCTPE Co-Poliamida Associado à Elastômero Termoplástico PLGA Poli Ácido Láctico-co-Glicólico STL Stereolithography Format TC Tomografia Computadorizada UNESP Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" ≥ Maior e igual % Porcentagem μm Micrômetro vii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Dados do estudo estatístico da avaliação macroscópica referente ao processo de biocompatibilidade das próteses traqueais impressas em impressora 3D utilizadas em coelhos dos grupos de sete, 15 e 30 dias. Jaboticabal, 2018. ....................................................................................... Tabela 2. Dados do estudo estatístico da avaliação microscópica referente ao processo de biocompatibilidade das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos dos grupos de sete, 15 e 30 dias. Jaboticabal, 2018. ................................................................................ Página s 31 39 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Prótese projetada em programa computacional de prototipagem tridimensional Solidworks 2016. Comprimento = 15 mm, diâmetro de circunferência cranial 4 mm, diâmetro de circunferência caudal 5 mm, espessura da parede = 0,5 mm. A análise da espessura da parede é marcada por tons alaranjados, sendo sempre do mesmo tom como demonstrado pela projeção digital, por possuir uniformidade constante da parede = 0,5 mm, sem deformações. Fonte: Arquivo pessoal. ..................................................................................... Figura 2. Prótese no ato de impressão em três dimensões pelo método de modelagem por fusão e deposição em impressora da marca Prusa modelo I3. (B) Imagem fotográfica das próteses traqueais confeccionada em impressora em três dimensões com nylon associado a elastômero termoplástico. Fonte: Arquivo pessoal. ..................................................................................... Figura 3. Sequência de imagens fotográficas de implantação da prótese traqueal confeccionada em impressora 3d, em coelhos. (A) Exposição e isolamento do órgão através da aplicação de fio de reparo cranial (CR) e caudal (CD) ao local da incisão (B). Ressecção total em 360 graus da traqueia na altura do 5º anel traqueal até o anel 8º gerando o defeito. (C) Implante de PCTPE manufaturado por impressora 3D ajustado para ser suturado no interior da borda cranial da traqueia de coelho. (D) Sutura simples separada armada em borda cranial da traqueia de coelho. Fonte: Arquivo pessoal. ....................................................................................... Figura 4. Prótese traqueal de PCTPE confeccionada em impressora 3D implantada em traqueia de coelho. Padrão de sutura ponto simples separado em quatro pontos cardeais nas extremidades da prótese e borda cranial (CR) e caudal (CD) traqueal, utilizando nylon 3- 0 agulhado. Fonte: Arquivo pessoal. ............................. Página 21 25 22 26 ix Figura 5. (A) Preparo de retalho do músculo esternohioideo. (B) Retalho do músculo esternohioideo acomodado sobre a junção traqueia/prótese em segmento cranial (CR) e caudal (CD). Fonte: Arquivo pessoal. ............................ Figura 6. Momento imediato pós eutanásia do grupo de sete dias. (A) Exposição de traqueia cervical, no local da implantação, para observar reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados. Notar ausência de deiscência de sutura e aderência tecidual discreta. (B) Peça cirúrgica – Traqueia de coelho com prótese de PCTPE confeccionada em impressora 3D. Observar ausência de recobrimento tecidual. Fonte: Arquivo pessoal. .................................. Figura 7. Momento imediato pós eutanásia do grupo de 15 dias. (A) Exposição de traqueia cervical, local da implantação, para observar reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados. Notar ausência de deiscência de sutura e aderência tecidual moderada. (B) Peça cirúrgica – Traqueia de coelho com prótese de PCTPE confeccionada em impressora 3D. Observar recobrimento tecidual moderado. Fonte: Arquivo pessoal. ............................... Figura 8. Momento imediato pós eutanásia do grupo de 30 dias. (A) Exposição de traqueia cervical, local da implantação, para observar reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados. Notar ausência de deiscência de sutura e aderência tecidual moderada. (B) Peça cirúrgica – Traqueia de coelho com prótese de PCTPE confeccionada em impressora 3D. Observar recobrimento tecidual importante. Fonte: Arquivo pessoal. .............................. 33 34 35 26 x Figura 9. Fotomicrografia do segmento distal de interface entre prótese e traqueia de coelho – grupo de sete dias, coradas com hematoxilina e eosina (HE). Corte histológico mostra da direita para a esquerda, camada adventícia com congestão acentuada (setas brancas, submucosa com infiltrado inflamatório difuso moderado e edema (asterisco), e mucosa com ausência de epitélio ciliado. Conteúdo intraluminal discreto constituído por restos celulares e hemácias (seta preta). Objetiva 10 X. Fonte: Arquivo pessoal. ............... Figura 10. Fotomicrografias de traqueia de coelho – grupo de 15 dias, coradas com hematoxilina e eosina (HE). (A) Segmento proximal da região de interface entre prótese e traqueia. Corte histológico revela mucosa (seta preta) com destruição das células do epitélio ciliado, apresentando arrasamento celular, acompanhando intenso infiltrado inflamatório associado a edema importante e congestão moderada difusa (asterisco) da camada submucosa. Objetiva 20x. (B) Segmento proximal da região de prótese. Observa- se proliferação de tecido conjuntivo fibroso organizado (asterisco vermelho), com formação de pequenos vasos, apresentando infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear discreto a moderado. Objetiva 20x. Fonte: Arquivo pessoal. ................................................. Figura 11. Fotomicrografias de traqueia de coelho – grupo de 30 dias, coradas com hematoxilina e eosina (HE). (A) Segmento distal da região de prótese. Corte histológico evidenciando espaço ocupado pela prótese (asterisco azul). Nota-se à esquerda da prótese, conteúdo intraluminal constituído por restos celulares, células inflamatórias e hemácias. À direita da prótese, presença de tecido conjuntivo recobrindo a prótese. (Objetiva 4x) (B) Segmento distal da região de interface entre prótese e traqueia. Notar área de cartilagem (asterisco amarelo), a direita, infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear acentuado, congestão e edema acentuado difuso em camada submucosa. Observa-se a alta celularidade do tecido associado a congestão marcada, caracterizada pela dilatação de vasos preenchidos por hemácias (seta preta). Objetiva 10x. Fonte: Arquivo pessoal. ......................................... 37 36 38 xi LISTA DE APÊNDICES Apêndice 1. Critérios da avaliação macroscópica das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos do grupo de sete dias. Jaboticabal, 2018. .......................... Apêndice 2. Critérios da avaliação macroscópica das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos do grupo de 15 dias. Jaboticabal, 2018. ............................. Apêndice 3. Critérios da avaliação macroscópica das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos do grupo de 15 dias. Jaboticabal, 2018. ............................. Apêndice 4. Critérios da análise histopatológica das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos do grupo de sete dias. Jaboticabal, 2018. .......................... Apêndice 5. Critérios da análise histopatológica das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos do grupo de 15 dias. Jaboticabal, 2018. ............................. Apêndice 6. Critérios da análise histopatológica das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos do grupo de 30 dias. Jaboticabal, 2018. ............................. 58 Página s 58 59 59 60 60 12 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA 1. INTRODUÇÃO Os defeitos traqueais têm sido alvo de estudos experimentais e clínicos desde o século XIX, com o propósito de restabelecer a viabilidade da via aérea superior (Grillo, 2002). As injúrias traqueais, na maioria das vezes, são consequências de problemas após intubação, traumas, compressão por tumores e, em algumas situações, por alterações congênitas, tuberculose, blastomicose ou ainda idiopáticas (Musah et al., 2012). Doenças obstrutivas congênitas em cães como estenose, colapso e hipoplasia traqueal são descritas por Slatter (1985). A hipoplasia da traqueia é condição frequente em cães com a Síndrome do Braquicefálico, presente em 39% dos casos estudados por Fasanella et al. (2010) e 53,9% no estudo elaborado por Riecks et al. (2007). A estenose inflamatória traqueal e a malácia são consequências de trauma e isquemia da mucosa respiratória, produzida pelo tubo endotraqueal ou tubo de traqueostomia. O resultado dessa agressão é inflamação e fibrose, que pode ser grave e comprometer toda a parede traqueal, levando não apenas à diminuição do lúmen das vias aéreas, mas também à perda de seu suporte cartilaginoso e colapso traqueal, resultando em malácia (Courey, 1995; Grillo et al., 1995). A iniciativa por pesquisas de substituição traqueal promoveu a utilização de próteses equivalentes a condutos tubulares, as quais provaram ser ineficazes. A traqueia pode ser encurtada em 50% do seu comprimento em humanos adultos, e cerca de 1/3 em crianças pequenas sendo submetida à anastomose primária término- terminal, tornando este o padrão ouro de tratamento. Contudo, não se pode generalizar que todas as moléstias traqueais possam ser corrigidas por essa técnica, principalmente quando o defeito é maior do que os valores relatados acima, sendo os principais desafios na reconstrução traqueal os riscos de infecção, extrusão, obstrução, estenose e rejeição crônica (Grillo, 2002). Em decorrência a esses obstáculos, o emprego de materiais autólogos, heterólogos ou sintéticos são utilizados para a correção de defeitos traqueais. No entanto, as respostas não são satisfatórias e, portanto, ainda não fora encontrado até o presente momento, um conduto de ar 13 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA com a flexibilidade e rigidez necessárias para a substituição deste órgão (Musah et al., 2012). A impressão em três dimensões (3D) é campo promissor que já está emergindo como ferramenta crítica para o cirurgião de cabeça e pescoço, além da otorrinolaringologia pediátrica. Tem potencial para fornecer modelos médicos rápidos e personalizados para auxílio no planejamento cirúrgico. A tecnologia da impressão em três dimensões surgiu como importante adjunto para uma variedade de aplicações craniofaciais (Kaye et al., 2016). As preocupações com a reconstrução da traqueia são crescentes nos últimos anos. Esta informação é facilmente identificada ao se analisarem as publicações no Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) com a pesquisa da palavra chave tracheal prosthesis. Durante o período de 2010 a 2017, 912 publicações foram indexadas no Pubmed sobre o tema. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Anatomia A traqueia dos mamíferos se estende da cartilagem cricoide da laringe até a carina, porção de bifurcação em brônquios principais direito e esquerdo. Anteriormente, é composta de anéis cartilaginosos em forma de ferradura, formando dois terços de sua circunferência e, posteriormente, por uma porção membranosa conectando os anéis. (Laroia et al., 2010). Em seres humanos adultos, a traqueia dispõe de 12 a 15 cm de comprimento, e seu diâmetro varia entre seis a oito mm, conforme a idade e o sexo, variando de 16 a 20 anéis cartilaginosos (Gardner et al., 1963; Junqueira e Carneiro, 2008). A traqueia canina confere de 15 a 22 cm de comprimento e seu lúmen tem entre 16 a 25 mm. Sob extensão, a traqueia do cão pode chegar a 30 cm. Há cerca de 32 a 47 anéis traqueais, o dobro do encontrado no homem. No coelho, a extensão traqueal varia de 12 a 18 cm (Fergusson et al., 1950). 14 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA A mobilidade é possível devido à cartilagem ser formada por anéis individuais conectados por ligamentos fibroelásticos, ao invés de uma lâmina contínua. A traqueia apresenta uma parte cervical e uma torácica. O segmento cervical alonga-se da laringe à primeira costela, e a traqueia torácica comporta a porção da primeira costela até a carina. A camada mucosa é composta de epitélio colunar ciliado pseudo- estratificado, com células caliciformes; as glândulas tubulares secretoras de muco situam-se na submucosa. As células ciliadas do epitélio fazem parte do sistema de transporte mucociliar, propelindo o muco e os debris inspirados em direção à faringe. Do mesmo modo que outros tecidos do organismo, a traqueia dispõem de limitações para responder a uma agressão (Grandage e Richardson, 1998; Ettinger et al., 2004; Fingland, 2005). 2.2 Incidência e Etiologia A traqueia pode sofrer agressões de caráter contuso (lesões por esmagamento ou estrangulamento) e penetrantes (Pereira et al., 2011). Lacerações traumáticas na traqueia não são corriqueiras em animais de companhia, mas podem advir de resultados de atropelamentos, feridas por mordeduras no pescoço, acidentes com projéteis de arma de fogo, iatrogênica no lavado traqueal, da superinsuflação de cuffs de tubos endotraqueais, associação com trauma torácico, punção de veia jugular durante ou após procedimentos cirúrgicos envolvendo a traqueia (Kirpenstejin e Haar, 2006). Na clínica de pequenos animais não há dados epidemiológicos sobre a incidência de injúrias traqueais e tipos de traumas associados, porém, na medicina humana, os ferimentos penetrantes de traqueia dispõem maior incidência. Aproximadamente 21% dos pacientes que sofreram trauma de via aérea superior não sobrevivem às primeiras duas horas de internação hospitalar (Pereira et al., 2011). As variações clínicas podem ocorrer após horas e/ou dias nos cães e gatos após o trauma traqueal, sendo as mais presentes taquipneia, dispneia e enfisema subcutâneo, podendo ou não estar presente pneumotórax ou pneumomediastino (Scott et al., 2006). 15 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA Outra condição incomum porém, com alta taxa de mortalidade, principalmente em neonatos, é a estenose traqueal congênita (ETC). Tratamentos cirúrgicos e não cirúrgicos estão disponíveis (Tsang et al., 1989; Filler et al., 1995; Elliott et al., 1996; Maeda et al., 2001; One et al., 2004; Vondrys et al., 2011). A estenose traqueal pós-intubação provocada pela traqueostomia ou intubação de longo prazo é situação relativamente frequente (Sarper et al., 2005). Embora sua incidência tenha diminuído devido à melhoria nos procedimentos de terapia intensiva, continua a ser problemática incômoda. A taxa de estenose traqueal associada a intubação prolongada varia entre 0,6% e 21% (Grillo et al., 1995; Sarper et al., 2005). A estenose traqueal pós-intubação ocorre devido à hiper-insuflação do tubo endotraqueal ou do manguito da traqueostomia, causando necrose isquêmica devido à pressão na traqueia (Liu et al., 2015). A traqueomalácia é mais uma doença traqueal grave. Surge a partir de múltiplas fraturas dos anéis traqueais, com potencial de provocar movimento paradoxal no local da lesão. Na inspiração, o segmento instável colapsa causando obstrução. Na expiração, de maneira inversa, ocorre protrusão externa (Shaw et al., 1961; Amauchi et al., 1983; Baumgartner et al., 1990). A traqueomalácia é caracterizada por deficiência congênita ou adquirida de suporte da cartilagem traqueal e pode resultar em colapso das vias aéreas, dificuldades respiratórias, eventos agudos com risco de morte. A incidência estimada de traqueomalácia congênita é de 1 em 2100 humanos recém-nascidos (Boogaard et al., 2005). A hipoplasia traqueal, condição congênita predominantemente em cães de raças braquicefálicas, é um componente da síndrome da via aérea obstrutiva braquicéfala e relatada como sendo mais comum em Bulldogues ingleses (Suter et al., 1972; Harvey e Fink,1982; Suter et al., 1984; Coyne et al., 1992). Caracteriza-se pela luz traqueal marcadamente reduzida ao longo da traqueia (Suter et al., 1972; Stadler et al., 2011). As cartilagens traqueais são pequenas e rígidas e suas extremidades livres são próximas ou se sobrepõem, com encurtamento da membrana elástica dorsal e do músculo traqueal (Zook e Hathaway, 1966; Suter et al., 1972; Harvey; Fink,1982; Suter et al., 1984; Reed e Evans, 2009; Clarke et al., 2011). 16 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA 2.3 Reconstrução Traqueal Toda vez que a anatomia da traqueia permitir, deve-se tentar reconstruí-la com seu próprio tecido. A dissecção cuidadosa do tecido conjuntivo e fáscia cervical interna, frequentemente promovem adequada mobilização traqueal, sendo o suficiente para seu reparo primário. O reparo termino-terminal dos segmentos é a melhor técnica instituída. A reconstrução direta permite a continuidade da camada mucosa com seu aparelho ciliar, que é fundamental para a mobilização do muco e eliminação de corpos estranhos (Moghissi, 1975; Nelson et al., 1983; Massone, 2003). Desde a primeira ressecção traqueal bem-sucedida com anastomose das bordas traqueais realizada no final do século XIX (Grillo, 2002), grande variedade de métodos cirúrgicos e técnicas de reconstrução traqueal estão sendo desenvolvidas, dependendo da gravidade e da causa da doença traqueal. Anastomose de ponta a ponta é preferida na reconstrução de defeitos traqueais inferiores a 50 ou 60 mm em seres humanos (Neville et al., 1990). No entanto, lesões de larga extensão exigem terapias eficientes (Martinod et al., 2005; Macchiarini et al., 2008; Jungebluth et al., 2009), e para tal há vários procedimentos operatórios, promovendo custos elevados para o sistema de saúde (Yamashita et al., 2007; Baiguera et al., 2010). Dessa forma, não existe terapia ideal para o tratamento de danos traqueais extensos (Martinod et al., 2013; Gonfiotti et al., 2014). A traqueia não se trata de um órgão oco apenas, é na verdade órgão bastante complexo capaz de realizar diversas funções (Delaere et al., 2001; Van Raemdonck, 2014) tais como, ventilação, umidificação aquecimento e limpeza das vias aéreas (Haykal et al., 2014). Um substituto traqueal deve ser capaz de realizar todas essas funções, apresentando aspectos estruturais, morfológicos e mecânicos específicos (Baiguera et al., 2010). Assim, o surgimento de próteses sofisticadas para o aparelho respiratório vem incentivando muitos estudos na área (Webakey et al., 1962; Worman et al.,1964). Vários substitutos para a reconstrução da traqueia foram elaborados, incluindo o uso de tecido autólogo, autoenxertos, aloenxertos, materiais protéticos, engenharia 17 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA tecidual, ou a combinação dessas abordagens (Delaere et al., 2001; Fuchs et al., 2011). Os enxertos à base de colágeno tipo patch são utilizados com frequência para o tratamento de defeitos traqueais parciais. Os enxertos autólogos de tecido, tais como a cartilagem costal e o pericárdio, têm sido empregados para substituição parcial com sucesso. Contudo, estes enxertos autólogos apresentam várias desvantagens como a dificuldade de projetar, morbidade do sítio doador, propriedades biomecânicas impróprias, vulnerabilidade à infecção e reabsorção após a enxertia. Próteses sintéticas de silicone, teflon e polietileno também foram utilizadas em cirurgias reconstrutivas traqueais, no entanto, eles não possuem as estruturas macro e microanatômicas dos arcabouços naturais (Haykal et al., 2014). Polímeros biodegradáveis têm sido amplamente utilizados para reconstrução traqueal. Contudo, é controverso que as próteses implantadas no tecido traqueal possam assegurar propriedades biomecânicas adequadas no reparo funcional durante o processo de remodelação. Além disso, a discrepância entre a degradação da prótese e a formação da neoepitelização pode ser uma consideração importante, sendo essa uma complicação (Park et al., 2012; Chua et al., 2013; Kojima e Vacanti, 2014). Apesar do intenso empenho clínico, ainda não há na literatura um substituto traqueal que supra as seguintes características: rigidez lateral, flexibilidade longitudinal, hermeticidade, biocompatibilidade, integração tecidual, não- imunogênico, não tóxico, não carcinogênico, resistente à colonização bacteriana, sem necessidade de imunossupressão, de fácil implantação e promotor da reepitelização (Baiguera et al., 2010; Haag et al., 2013; Haykal et al., 2014). 2.4 Impressão em 3 dimensões na Área Médica A impressão tridimensional é o processo para arquitetar objetos sólidos baseado em um formato de modelo digital. Pode ser personalizado, de acordo com as características anatômicas e patológicas do paciente. Dessa forma, tem sido amplamente utilizado em muitos campos médicos, como a simulação de 18 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA procedimentos (Bustamante et al., 2014), transplante de fígado (Zein et al., 2013), e cirurgias torácicas (Akiba et al., 2013; Nakada et al., 2014). Também conhecida como modelagem por fusão e deposição ou fused deposition modeling (FMD), o objeto é criado por meio da deposição de sucessivas camadas de material fundido à medida que a máquina de impressão lê os dados do desenho computadorizado ou computer-aided design (CAD) (Cummins, 2010; Rengire et al., 2010). Cada camada é equivalente à seção transversal do modelo CAD, que são fusionadas para criar a forma final. Kodama (1981) descreveu pela primeira vez esse processo, quando elaborou métodos de fabricação para criar modelo de plástico 3D. Desde então, o processo tem amadurecido e muitas impressoras diferentes e sofisticadas estão sendo utilizadas atualmente (Bird, 2012). Sendo assim, a aplicação da impressora 3D está presente em diversos campos, incluindo aeroespacial, engenharia, produtos de consumo, artes, indústria alimentar, educação, fabricação e medicina (Murphy e Atala, 2014). Vantagens da impressão em 3D incluem a customização, produção local, confecção de formas complexas, capacidade de criar objetos singulares e pouco desperdício de matéria prima (Bird, 2012). A impressão 3D tem sido reconhecida pelo seu potencial na modelagem cirúrgica. Os cirurgiões podem fabricar um modelo 3D impresso e este objeto pode ser utilizado para educar o paciente, planejar a abordagem cirúrgica e atuar como guia cirúrgico durante o procedimento. Modelos médicos impressos em 3D estão sendo usados para aplicações cardíacas, ortopédicas, dentárias e craniofaciais (Goldstein et al, 2015). Tecnologia de impressão 3D também está sendo usada atualmente para o planejamento cirúrgico para reconstrução craniofacial pediátrica e adulta (Choi e Kim, 2015). 3. OBJETIVO Objetivou-se com o presente estudo a construção de modelo de traqueia para implante, utilizando técnicas de impressão em três dimensões por modelagem de 19 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA fusão e deposição, para aplicação em anastomose, além de analisar a viabilidade e biocompatibilidade do uso de prótese confeccionada em co-poliamida associado ao elastômero termoplástico. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Aspectos Éticos O projeto foi realizado nas dependências da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Câmpus de Jaboticabal – UNESP. A avaliação clínica e os procedimentos cirúrgicos foram realizados no Hospital Veterinário (HV) “Governador Laudo Natel”. O presente estudo foi realizado respeitando-se os princípios éticos adotados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). Foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias- Unesp – Câmpus de Jaboticabal (Protocolo nº 007989-17) 4.2 Modelo Experimental Foram utilizados 15 coelhos fêmeas da linhagem Nova Zelândia Branco (Oryctolagus cuniculus), com peso vivo variando entre 3,0 kg a 3,5 kg, fisicamente hígidos, provenientes do biotério central da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Estadual Paulista (UNESP – Campus Botucatu), acondicionados em gaiolas individuais com dimensões de 55 x 55 x 55 cm e suspensas a 80 cm do chão. A temperatura ambiente foi mantida em torno de 23ºC com ciclos de luz variando entre 12-14h. Foi fornecido ração para coelhos padrão comercial1, água à vontade, e mantidos sob cuidados técnicos especializados. 20 __________________ 2 Impressora 3d - reprap - prusa i3 - multivisi comércio e importação eireli – Uberlândia - MG 3 Taulman nylon bridge 3d printing filament - Bridge - USA Nestas condições permaneceram por dois meses, período considerado como de adaptação ao ambiente e manejo para ganho de peso antes de iniciar a fase experimental. Foram randomizados por sorteio e distribuídos em três grupos, referentes aos momentos das eutanásias programadas de sete, 15 e 30 dias. Foi criado defeito de 0,5 cm a partir da ressecção de três anéis cartilaginosos, na altura do 5º ao 8º espaço entre os anéis traqueais, para implantação da prótese confeccionada 4.3 Prótese em 3D As próteses foram projetadas em programa computacional de prototipagem tridimensional Solidworks 2016 (Figura 1). Posteriormente o arquivo foi convertido em formato STL (stereolithography format) e impresso no método de modelagem por fusão e deposição em impressora da marca Prusa modelo I32. O material utilizado para a confecção das próteses foi o nylon associado a elastômero termoplástico (Taulman PCPTE)3. As dimensões foram baseadas na média das mensurações prévia da porção média traqueal de cadáveres de coelhos, com as seguintes dimensões: comprimento = 15 mm, diâmetro de circunferência cranial 4 mm, diâmetro de circunferência caudal 5 mm, espessura da parede = 0,5 mm. Os protótipos foram embalados em papel grau cirúrgico e auto clavadas em ciclo rápido em 121 ºC por 15 minutos. A Figura 2 ilustra as próteses confeccionadas em impressora 3D. 21 Figura 1 - Prótese projetada em programa computacional de prototipagem 3D Solidworks 2016. Comprimento = 15 mm, diâmetro de circunferência cranial 4 mm, diâmetro de circunferência caudal 5 mm, espessura da parede = 0,5 mm. A análise da espessura da parede é marcada por tons alaranjados, sendo sempre do mesmo tom como demonstrado pela projeção digital, por possuir uniformidade constante da parede = 0,5 mm, sem deformações. Fonte: Arquivo pessoal. 22 Figura 2 - (A) Prótese no ato de impressão em 3D pelo método de modelagem por fusão e deposição em impressora da marca Prusa modelo I3. (B) Imagem fotográfica das próteses traqueais confeccionada em impressora em três dimensões com nylon associado a elastômero termoplástico. Fonte: Arquivo pessoal. A B 23 __________________ 4 Cloridrato de clorprometazina - cristália prod. Quím. Farm. Ltda. São paulo - SP 5 Morfina - cristália prod. Quím. Farm. Ltda. São paulo - SP 6 Propofol - cristália prod. Quím. Farm. Ltda. São paulo - SP 7 Sonda Endotraqueal desc. S/bl (2,5mm) – Solidor – SP 8 Aparelho de anestesia Nikkei K-Takaoka. São Paulo – SP. 9 Isoforine - Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda. São Paulo – SP. 4.4 Protocolo Anestésico Os animais foram preparados um dia antes do procedimento cirúrgico, com tricotomia ampla da porção cervical ventral. Não houve necessidade de jejum prévio devido ao alto metabolismo da espécie, além de não fazerem êmese (Flecknell, 2009). O protocolo anestésico constituiu-se em medicação pré-anestésica utilizando Cloridrato de Clorpromazina4, na dose de 0,5 mg/kg, e Morfina5, na dose de 0,5 mg/kg, diluídos na mesma seringa, por via intramuscular (IM). Em seguida foi realizada tricotomia ampla da região das orelhas para o acesso venoso. A indução anestésica foi conduzida com o uso de propofol6, na dose de 10mg/kg, seguida de intubação orotraqueal com sonda de Magill7 de 2,5 mm de diâmetro sem cuff, conectada ao aparelho de anestesia para fornecimento fluxo total de 1 L/min de oxigênio a 100% por meio de circuito anestésico avalvular8. Foi instituída anestesia geral inalatória com isofluorano9, na dose de 3%, diluído em 100% oxigênio. 24 __________________ 10 Fio nylon 0-0 – 45 cm agulha 3/8 cortante – Procare - SP 4.5 Procedimento Cirúrgico Após treinamento prévio da técnica de aplicação da prótese, os animais do experimento foram submetidos ao procedimento cirúrgico, sempre realizado pela mesma cirurgiã, auxiliar e equipe. Após antissepsia prévia e definitiva da região cervical ventral com clorexidine degermante e alcoólico com posterior colocação de campos estéreis, foi realizada incisão longitudinal da pele desde a cricoide até o manúbrio, com posterior divulsão da camada subcutânea e músculos esternoioídeos, ao longo de suas linhas médias, afastando-os lateralmente com auxílio de afastadores de Farabeuf. Dissecção do tecido conjuntivo da traqueia com pinça hemostática Halstead, preservando as porções laterais, responsáveis pela vascularização e nervos laringeos recorrentes. Exposição e isolamento do órgão por meio da aplicação de fio de reparo cranial e caudal ao local da incisão com fio de nylon 3-0 (Figura 3A). Utilizando lamina de bisturi número 11, foi realizada ressecção total em 360 graus da traqueia na altura do 5º espaço de cartilagem interanelar até o 8º espaço de cartilagem interanelar, ou seja, defeito criado pela remoção de 3 anéis traqueais, com aproximadamente 0,5 cm (Figura 3B). A sonda endotraqueal foi tracionada cranialmente, e a remoção de coágulos de sangue e secreções do lúmen foi efetuada. O implante de PCTPE manufaturado por impressora 3D foi adaptado para obter 0,7 cm de comprimento e ajustado no interior do lúmen dos segmentos por técnica de anastomose (Figura 3C/3D), fixado e suturado com quatro pontos cardeais de reparo nas extremidades da prótese, utilizando nylon 3-010 agulhado (Figura 4). Após o término da sutura, foi realizado retalho do músculo esternohioideo, que se acomodou sobre a junção traqueia/prótese (Figura 5), para auxiliar o recobrimento tecidual e evitar escape de ar, o músculo esternotireoideo foi aproximado por sutura contínua com fio de nylon 3-0 agulhado. A pele foi suturada em padrão simples separado com fio de nylon 3-0. 25 Figura 3 - Sequência de imagens fotográficas de implantação da prótese traqueal confeccionada em impressora 3D, em coelhos. (A) Exposição e isolamento do órgão através da aplicação de fio de reparo cranial (CR) e caudal (CD) ao local da incisão (B). Ressecção total em 360 graus da traqueia na altura do 5º anel traqueal até o anel 8º gerando o defeito. (C) Implante de PCTPE manufaturado por impressora 3D ajustado para ser suturado no interior da borda cranial da traqueia de coelho. (D) Sutura simples separada armada em borda cranial da traqueia de coelho. Fonte: Arquivo pessoal. ta CR CR CR CR CD CD CD CD D A B A C A A 26 Figura 4 - Prótese traqueal de PCTPE confeccionada em impressora 3D implantada em traqueia de coelho. Padrão de sutura ponto simples separado em quatro pontos cardeais nas extremidades da prótese e borda cranial (CR) e caudal (CD) traqueal, utilizando nylon 3-0 agulhado. Fonte: Arquivo pessoal. Figura 5 - (A) Preparo de retalho do músculo esternohioideo. (B) Retalho do músculo esternohioideo acomodado sobre a junção traqueia/prótese em segmento cranial (CR) e caudal (CD). Fonte: Arquivo pessoal. a A a B CR CD CR CD CR CD 27 __________________ 11 Enrofloxacino 2,5% injetável – Laboratórios Vencofarma do Brasil Ltda. –SP 12 Cloridrato de tramadol 50mg injetável – União Química – SP 4.6 Avaliação Pós-Operatória Após o procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos intubados por 10 minutos para redução da porcentagem de anestésico inalatório de forma gradual. Houve avaliação da recuperação anestésica por meio da oximetria de pulso, e quando extubavam e apresentavam oximetria ≥ 98%, os animais eram destinados às suas respectivas gaiolas. A alimentação e fornecimento de água seguiu a rotina instituída na fase de adaptação e oferecidas logo após o despertar anestésico. Como protocolo terapêutico pós-operatório foi instituída terapia antimicrobiana com enrofloxacina11 na dose de 5 mg/kg por via subcutânea, a cada 12 horas por sete dias e como protocolo de analgesia, cloridrato de tramadol12 na dose de 4 mg/kg, por via subcutânea, a cada 12 horas, durante cinco dias. 4.7 Avaliação Clínico Cirúrgica e Eutanásia Os animais foram observados diariamente para avaliação de padrão respiratório relacionado a possíveis complicações: dispneia, cianose, ruídos respiratórios, tosse, e quaisquer alterações atribuídas ao procedimento cirúrgico: edema, hematoma, enfisema subcutâneo e presença de secreção local, bem como alterações comportamentais referentes a dor. Foram submetidos à eutanásia programada para cada grupo (7, 15 e 30 dias), com a administração por via endovenosa de propofol (dose-resposta) e, ao certificar-se da ausência de reflexos corneal e pupilar, foi realizada a aplicação de 20 mL de cloreto de potássio por via endovenosa para a indução de assistolia. 4.8 Avaliação Macroscópica Após a eutanásia, o local do defeito traqueal foi acessado cirurgicamente e avaliado macroscopicamente, por intermédio de inspeção direta. Foram observadas reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de inflamação ou 28 __________________ 11 Enrofloxacino 2,5% injetável – Laboratórios Vencofarma do Brasil Ltda. –SP 12 Cloridrato de tramadol 50mg injetável – União Química – SP tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados em (-) ausente; (+) discreto; (++) moderado; (+++) intenso. 4.9 Análise Histopatológica Após a eutanásia dos animais, as traqueias foram dissecadas e retiradas até dois centímetros da carina, para análise histopatológica pós-implante. Os fragmentos das traqueias foram preservados em frascos contendo formol 10% no mínimo por 72 horas e encaminhados para estudo para o Laboratório de Patologia da Universidade de Medicina Veterinária de Araçatuba - UNESP. Os segmentos fixados foram recortados com lâmina de bisturi, com o cuidado de se conservar todas as camadas de tecido. A desidratação desses segmentos foi efetuada em bateria de álcool e xilol. Após diafanização no xilol, os segmentos foram incluídos à vácuo em parafina e em seguida recortados com uso de micrótomo (Leica modelo RM2145) com espessura de 5 μm. Os cortes, após reidratação em bateria de xilol e álcool, foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e avaliados para verificação do comportamento cicatricial, rejeição, processo inflamatório e proliferação granulomatosa. Foi analisada a incorporação da prótese traqueal à traqueia dos animais por meio das evidências de rejeição e deiscência e a reparação, com especial atenção às alterações relacionadas com absorção do enxerto, substituição por fibrose, presença de necrose na região da anastomose, rejeição, crescimento de tecido ósseo ou cartilaginoso, granulomas, estenoses, metaplasia óssea, fibroplasia, crescimento de epitélio interno, infecção, proliferação de colágeno, neoformação vascular, proliferação de colágeno e presença de microfístulas. 29 4.9.1 Critério para avaliação da biocompatibilidade da prótese Na avaliação da biocompatibilidade atribuiu-se o grau de aceitação a prótese baseando se nos parâmetros: Inflamação: avaliação do grau de infiltrado inflamatório e localização deste. Tipo de resposta: discriminação por quais células inflamatórias o infiltrado é composto. Necrose: identificação da presença ou não de necrose (restos celulares ou destruição tecidual) e avaliação do grau de acometimento e localização. Congestão e edema: identificação da presença de congestão vascular e edema celular ou intersticial, a localização, bem como avaliação do grau de acometimento e grau de hemorragia. Fibrose: Identificação da presença de tecido conjuntivo, a localização e graduação. Crescimento ou conteúdo luminal: identificação dos possíveis componentes, quando presentes, na luz do órgão ou prótese, quer seja devido ao crescimento tecidual, conteúdo inflamatório ou necrótico. Presença de bactérias: Avaliação de elementos bacterianos nos cortes histológicos e quantificação microbiana em: ( - ) = Ausente, ( + ) = Discreto, ( ++ ) = Moderado, ( +++ ) = Acentuado 4.10 Análise Estatística Os dados, referentes a avaliação macroscópica como, escore de reação a sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho e dados correspondentes a análise histopatológica como a graduação de inflamação, necrose e fibrose para pequenas amostras foram analisados pelo teste Exato de Fisher. Todas as análises foram realizadas sob significância de 5% (p<0,05). 30 5. RESULTADOS 5.1 Avaliação Clínico-cirúrgica Os animais foram examinados diariamente até o momento da eutanásia e não foram observadas quaisquer alterações que pudessem ser atribuídas aos implantes, tais como alterações respiratórias (taquipneia, dispneia, cianose, ruídos respitatórios e tosse), enfisema subcutâneo, hematoma, edema, secreção, variação comportamental: apatia, anorexia ou agressividade, pescoço rígido, esticado e/ou elevado. 5.2 Avaliação Macroscópica Os critérios do estudo macroscópico foram examinados individualmente, para cada amostra, nos grupos de sete, 15 e 30 dias como apresentados sequencialmente nos Apêndices 1, 2 e 3. Os dados estatísticos correspondentes à avaliação macroscópica estão ilustrados na Tabela 1. 31 Tabela 1. Dados do estudo estatístico da valiação macroscópica referente ao processo de biocompatibilidade das próteses traqueais impressas em impressora 3D utilizadas em coelhos dos grupos de sete, 15 e 30 dias. Jaboticabal, 2018. * Nível de significância (p<0,05), Discreto = (+), Moderado = (++), Acentuado = (+++) Foi observada diferença significativa entre os diferentes grupos nas variáveis aderência, sinais de inflamação, granuloma e recobrimento tecidual. As variáveis deiscência de sutura e deformidade traqueal não apresentaram diferenças entre os grupos, estando ausente em todos os animais dos três grupos. Quando comparados os grupos nos valores referentes à aderência, foi verificado que o grupo de sete dias foi diferente dos outros grupos, com aderência discreta em 100% dos animais, à medida que nos grupos de 15 e 30 dias a aderência apresentou-se de forma moderada em todos os animais, com significância (p<0,001). Ao analisarmos os dados dos grupos em relação a sinais de inflamação, também se observa variação significativa entre as distribuições dos animais do grupo de sete dias, pois não houve sinais de inflamação em dois animais: n=2 (40%), grau discreto em dois animais: n=2 (40%) e apenas um animal com graduação moderada: n=1 (20%). Ao passo que não foi verificado sinais de inflamação em nenhum animal dos grupos de 15 e 30 dias, com significância (p=0,022). 7 dias 15 dias 30 dias n (%) n (%) n (%) Discreto (+) 5 (100%) - - Moderado (++) - 5 (100%) 5 (100%) Ausente 2 (40%) 5 (100%) 5 (100%) Discreto (+) 2 (40%) - - Moderado (++) 1 (20%) - - Ausente 2 (40%) 3 (60%) 3 (60%) Discreto (+) 1 (20%) 2 (40%) 2 (40%) Moderado (++) 1 (20%) - - Acentuado (+++) 1 (20%) - - DEISCÊNCIA DE SUTURA Ausente 5 (100%) 5 (100%) 5 (100%) - DEFORMIDADE TRAQUEAL Ausente 5 (100%) 5 (100%) 5 (100%) - Ausente 3 (60%) - - Discreto (+) 2 (40%) - - Moderado (++) - 5 (100%) - Acentuado (+++) - - 5 (100%) ANÁLISE ESTATÍSTICA DA AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA ADERÊNCIA * <0,001 P-valor SINAIS DE INFLAMAÇÃO * 0,022 0,022GRANULOMA * RECOBRIMENTO TECIDUAL * <0,001 GRADUAÇÃOCRITÉRIOS 32 A correlação entre os grupos correspondente à formação de granuloma expressa variação entre as distribuições dos animais do grupo de sete dias, uma vez que não houve formação de granuloma em dois animais: n=2 (40%), e formação de granulação em um animal de grau discreto: n=1 (20%), moderado: n=1 (20%) e acentuado: n=1 (20%). A distribuição dessa alteração nos animais do grupo de 15 e 30 dias revelaram ausência de formação de granuloma em três animais: n=3 (60%) e formação discreta em dois animais: n=2 (40%), com significância (p=0,022). A comparação entre os coelhos no grupo de sete dias perante ao recobrimento tecidual mostra variação entre as distribuições, visto que houve recobrimento tecidual em três animais: n=3 (60%), e recobrimento em dois animais de grau discreto: n=2 (40%). A disposição dessa alteração nos animais do grupo de 15 e 30 dias exibiram recobrimento tecidual moderado e acentuado em todos os animais respectivamente, com significância (p<0,001). Foi registrado por meio de imagens fotográficas a dissecação da traqueia em tempo real de cada eutanásia, programada para sete dias (Figura 6), 15 dias (Figura 7) e 30 dias (Figura 8), para verificação e graduação dos critérios explorados. 33 Figura 6 - Momento imediato pós eutanásia do grupo de sete dias. (A) Exposição de traqueia cervical, no local da implantação, para observar reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados. Notar ausência de deiscência de sutura e aderência tecidual discreta. (B) Peça cirúrgica – Traqueia de coelho com prótese de PCTPE confeccionada em impressora 3D. Observar ausência de recobrimento tecidual. Fonte: Arquivo pessoal. A A A B 34 Figura 7 - Momento imediato pós eutanásia do grupo de 15 dias. (A) Exposição de traqueia cervical, local da implantação, para observar reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados. Notar ausência de deiscência de sutura e aderência tecidual moderada. (B) Peça cirúrgica – Traqueia de coelho com prótese de PCTPE confeccionada em impressora 3D. Observar recobrimento tecidual moderado. Fonte: Arquivo pessoal. A A A B 35 Figura 8 - Momento imediato pós eutanásia do grupo de 30 dias. (A) Exposição de traqueia cervical, local da implantação, para observar reações como deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de infecção ou tipo corpo estranho. Tais achados foram graduados. Notar ausência de deiscência de sutura e aderência tecidual moderada. (B) Peça cirúrgica – Traqueia de coelho com prótese de PCTPE confeccionada em impressora 3D. Observar recobrimento tecidual importante. Fonte: Arquivo pessoal. 5.3 Análise Histopatológica As imagens do estudo histopatológico, exibem a reação do tecido traqueal frente a implantação da prótese de (PCTPE) em cada grupo: 7, 15 e 30 dias, em relação aos conceitos analisados (Figura 9, 10 e 11). A B A A 36 Figura 9 - Fotomicrografia do segmento distal de interface entre prótese e traqueia de coelho – grupo de sete dias, coradas com hematoxilina e eosina (HE). Corte histológico mostra da direita para a esquerda, camada adventícia com congestão acentuada (setas brancas, submucosa com infiltrado inflamatório difuso moderado e edema (asterisco), e mucosa com ausência de epitélio ciliado. Conteúdo intraluminal discreto constituído por restos celulares e hemácias (seta preta). Objetiva 10 X. Fonte: Arquivo pessoal. * 37 Figura 10 - Fotomicrografias de traqueia de coelho – grupo de 15 dias, coradas com hematoxilina e eosina (HE). (A) Segmento proximal da região de interface entre prótese e traqueia. Corte histológico revela mucosa (seta preta) com destruição das células do epitélio ciliado, apresentando arrasamento celular, acompanhando intenso infiltrado inflamatório associado a edema importante e congestão moderada difusa (asterisco) da camada submucosa. Objetiva 20x. (B) Segmento proximal da região de prótese. Observa-se proliferação de tecido conjuntivo fibroso organizado (asterisco vermelho), com formação de pequenos vasos, apresentando infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear discreto a moderado. Objetiva 20x. Fonte: Arquivo pessoal. A A * * A B 38 Figura 11 - Fotomicrografias de traqueia de coelho – grupo de 30 dias, coradas com hematoxilina e eosina (HE). (A) Segmento distal da região de prótese. Corte histológico evidenciando espaço ocupado pela prótese (asterisco azul). Nota-se à esquerda da prótese, conteúdo intraluminal constituído por restos celulares, células inflamatórias e hemácias. À direita da prótese, presença de tecido conjuntivo recobrindo a prótese. (Objetiva 4x) (B) Segmento distal da região de interface entre prótese e traqueia. Notar área de cartilagem (asterisco amarelo), a direita, infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear acentuado, congestão e edema acentuado difuso em camada submucosa. Observa-se a alta celularidade do tecido associado a congestão marcada, caracterizada pela dilatação de vasos preenchidos por hemácias (seta preta). Objetiva 10x. Fonte: Arquivo pessoal. Os critérios do estudo histopatológico foram graduados individualmente, para cada amostra, nos grupos de sete, 15 e 30 dias como apresentados sequencialmente nos Apêndices 4, 5 e 6. Os dados estatísticos correspondentes à análise histopatológica estão demonstrados na Tabela 2. * * A A A B 39 Tabela 2. Dados do estudo estatístico da avaliação microscópica referente ao processo de biocompatibilidade das próteses traqueais impressas em impressora 3D em coelhos dos grupos de sete, 15 e 30 dias. Jaboticabal, 2018. * Nível de significância (p<0,05), Discreto = (+), Moderado = (++), Acentuado = (+++) As variáveis da análise histopatológica foram consideradas significativas, com exceção dos valores de infiltrado de células gigantes, congestão vascular traqueal, edema celular ou intersticial traqueal e proliferação tecidual traqueal interno. Os dados para esses quatro critérios citados não manifestaram diferença estatística (p>0,05). Os parâmetros fibrose em região traqueal e estenose intraluminal, igualmente não demonstraram diferença estatística, devido à falta de alteração de distribuição, permanecendo ausente em todos os animais dos três grupos, sete, 15 e 30 dias. Os três grupos foram comparados referente ao parâmetro de infiltrado de células gigantes, apresentando inconstância dentre as distribuições das amostras. No 7 dias 15 dias 30 dias n (%) n (%) n (%) Discreto(+) - - 1 (20%) Moderado (++) - 1 (20%) 3 (20,0%) Acentuado (+++) 5 (100%) 4 (80%) 1 (20%) Discreto(+) - - 1 (20%) Moderado (++) - 1 (20%) 3 (60%) Acentuado (+++) 5 (100%) 4 (80%) 1 (20%) Moderado (++) - 1 (20%) 4 (80%) Acentuado (+++) 5 (100%) 4 (80%) 1 (20%) Ausente 3 (60%) 5 (100%) 5 (100%) Discreto(+) 2 (40%) - - Discreto(+) 1 (20%) 1 (20%) - Moderado (++) 1 (20%) 1 (20%) 2 (40%) Acentuado (+++) 3 (60%) 3 (60%) 3 (60%) Discreto(+) 1 (20%) 1 (20%) - Moderado (++) 1 (20%) 1 (20%) 2 (40%) Acentuado (+++) 3 (60%) 3 (60%) 3 (60%) Ausente 4 (80%) 2 (40%) 4 (80%) Discreto(+) 1 (20%) 1 (20%) - Moderado (++) - 2 (40%) 1 (20%) FIBROSE EM REGIÃO TRAQUEAL Ausente 5 (100%) 5 (100%) 5 (100%) - Ausente 5 (100%) 1 (20%) - Discreto(+) - 1 (20%) 1 (20%) Moderado (++) - 2 (40%) 2 (40%) Acentuado (+++) - 1 (20%) 2 (40%) ESTENOSE INTRALUMINAL Ausente 5 (100%) 5 (100%) 5 (100%) - Ausente 5 (100%) - - Moderado (++) - 5 (100%) - Acentuado (+++) - - 5 (100%) Ausente 3 (60%) 5 (100%) 5 (100%) Discreto(+) 2 (40%) - - INFILTRADO DE CÉLULAS GIGANTES ANÁLISE ESTATÍSTICA DA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA CRITÉRIOS GRADUAÇÃO P-valor 0,0067 0,0067 0,0083 GRAU DE INFLAMAÇÃO * INFILTRADO POLIMORFONUCLEAR * INFILTRADO MONONUCLEAR * 0,0952 PROLIFERAÇÃO TECIDUAL TRAQUEAL (INTERNO) 0,0952 PROLIFERAÇÃO TECIDUAL TRAQUEAL (EXTERNO) * CONGESTÃO VASCULAR TRAQUEAL EDEMA CELULAR OU INTERSTICIAL TRAQUEAL HEMORRAGIA TRAQUEAL * FIBROSE EM REGIÃO DE PRÓTESE E ANASTOMOSE * 0,0533 0,0533 0,025 <0,001 <0,001 40 grupo de sete dias, não houve presença de células gigantes em três animais: n=3 (60%) e dois animais apresentaram presença discreta: n=2 (40%), à medida que nos grupos de 15 e 30 dias foi ausente a presença de células gigantes em todos os animais, com ausência de significância (p=0,0952). Nos dados correspondente à congestão vascular traqueal, notou-se alteração entre as distribuições dos três grupos, pois os grupos de sete e 15 dias exibiram congestão em um animal de forma discreta: n=1 (20%), um animal de forma moderada: n=1 (20%) e três animais de forma acentuada: n=3 (60%). Enquanto no grupo de 30 dias, a presença de congestão vascular traqueal foi constatada em dois animais de graduação moderada: n=2 (40%) e em três animais de grau acentuado: n=3 (60%), com ausência de significância (p=0,0533). A comparação referente à edema celular ou intersticial traqueal, indicou oscilação entre as distribuições dos três grupos, já que os grupos de sete e 15 dias revelaram edema em um animal de grau discreto: n=1 (20%), um animal de grau moderado: n=1 (20%) e três animais de graduação acentuada: n=3 (60%). E, no grupo de 30 dias, foi observado em dois animais de forma moderada: n=2 (40%) e em três animais de forma acentuada: n=3 (60%), com ausência de significância (p=0,0533). Também houve diferença entre os dados que se referem à proliferação tecidual traqueal interna. O grupo de sete dias retratou ausência de proliferação tecidual em 3 três animais: n=3 (60%) e proliferação de forma discreta em 2 animais: n=2 (40%). À medida que, nos grupos de 15 e 30 dias, não houveram proliferação tecidual traqueal interna em nenhum animal, com ausência de significância (p=0,0952). Foi possível observar variação significativa na análise de grau de inflamação, em que no grupo de sete dias todos os animais demonstraram inflamação acentuada, à proporção que, no grupo de 15 dias houve um animal com inflação moderada: n=1 (20%) e quatro animais com inflação de grau acentuado: n= 4 (80%). Assim como, o grupo de 30 dias apresentou um animal com inflamação de forma discreta: n=1 (20%), três animais de forma moderada: n=3 (60%) e um animal de forma acentuada: n=1 (20%), com significância de (p=0,0067). A partir do critério infiltrado polimorfonuclear, foi possível observar que ocorreu variação significativa, pois houve infiltração de grau acentuado nos cinco animais do grupo de sete dias. No grupo de 15 dias houve um animal com infiltrado de graduação 41 moderada: n=1 (20%) e quatro animais com infiltração de forma acentuada: n=4 (80%). Ao passo que, no grupo de 30 dias observou-se um animal com infiltrado de forma discreta: n=1 (20%), três animais de forma moderada: n=3 (60%) e um animal de forma acentuada: n=1 (20%), com significância de (p=0,0067). Houve variação significativa igualmente na avaliação de infiltrado mononuclear, dado que o grupo de sete dias apresentou esse tipo de infiltrado de forma acentuada em todos os animais. O grupo de 15 dias apontou um animal com infiltrado mononuclear de grau moderado: n=1 (20%) e quatros animais com graduação acentuada: n= 4 (80%). Enquanto o grupo de 30 dias mostrou quatro animais com esse infiltrado de forma moderada: n=4 (80%) e apenas um animal de forma acentuada: n=1 (20%), com significância de (p=0,0083). Quando se compara o grau de hemorragia traqueal entre os três grupos, é notável variação significativa, em razão de que o grupo de sete dias possuía quatro animais com ausência de hemorragia: n=4 (80%) e um animal com hemorragia de grau discreto: n=1 (20%). Já no grupo de 15 dias, não houve hemorragia traqueal em dois animais: n=2 (40%), um animal com presença discreta de tal fator: n=1 (20%), e dois animais com grau moderado: n=2 (40%). E, no grupo de 30 dias a ausência de hemorragia foi notável em quatro animais: n=4 (80%) e houve presença discreta do critério estudado em um animal: n=1 (20%), com significância de (p=0,0250). Ao analisarmos os dados dos grupos em relação a fibrose em região de prótese e anastomose, observou-se variação significativa entre as distribuições, visto que, no grupo de sete dias não houve fibrose em nenhum dos cinco animais. Foi evidenciado no grupo de 15 dias, um animal com ausência de fibrose: n=1 (20%), um animal com crescimento discreto de fibrose: n=1 (20%), dois animais que apresentaram fibrose de forma moderada: n=2 (40%) e um animal exibiu tal fator de forma acentuada: n=1 (20%). Bem como no grupo de 30 dias um animal manifestou grau discreto de fibrose: n=1 (20), dois animais apresentaram grau moderado: n=2 (40) e, em dois animais, houve grau acentuado desse mesmo critério: n=2 (40%), com significância de (p<0,001). Ademais, o estudo da proliferação tecidual traqueal externo se apresenta igualmente aos itens anteriores, com variação significativa entre as distribuições, pois, no grupo de sete dias não ocorreu esse tipo de proliferação em nenhum dos animais. 42 No grupo de 15 dias houve graduação moderada desse elemento nos cinco animais. E no grupo de 30 dias a proliferação tecidual traqueal externa esteve presente em todos os animais, com significância de (p<0,001). 6. DISCUSSÃO Há mais de quarenta anos os transplantes traqueais são estudados e pesquisados, porém ainda sem sucesso (Macchiarini et al., 2008). Defeitos traqueais extensos são desafio na prática cirúrgica em razão das dificuldades para o tratamento, não existindo para tanto terapia padrão (Shaari et al., 1998; Montovani e Nakajima, 2003; Wu et al., 2007; Macchiarini et al., 2008). Ressecção de anéis traqueais não é isenta de riscos (Montovani e Nakajima, 2003). A principal opção de tratamento é o reparo primário termino-terminal, quando ocorrem grandes lesões tanto benignas como malignas, porém, nem sempre são viáveis (Macchiarini et al., 2008; Jungebluth et al., 2009). Essa abordagem é possível nas situações de lesões menores do que 50% (6,0 cm) do comprimento da traqueia de um adulto e 30% da traqueia de criança (Baiguera et al., 2010; Haag et al., 2013; Haykal et al., 2014). No entanto, a maioria das afecções desse órgão acomete largas extensões, impossibilitando a reconstrução cirúrgica, por não haver tecido adjacente suficiente para a realização das traqueoplastias, como acontece em deformidades congênitas, estenoses e tumores (Conconi et al., 2005; Martinod et al., 2005; Jungebluth et al., 2009; Baiguera et al., 2010). Esse estudo teve como objetivo propor a possibilidade da construção de substituto traqueal que apresentasse as propriedades anatômicas e biocompatíveis similares à traqueia nativa, por meio da confecção de prótese de co-poliamida associada a elastomêro termoplástico, por meio de impressão em três dimensões pelo método de modelagem por fusão de deposição aplicada por técnica de anastomose em traqueia de coelhos. A seleção do modelo animal depende do objetivo da pesquisa (Hallers et al., 2004). Não existe na literatura nenhum estudo experimental referente ao modelo animal ideal para aplicação de prótese total traqueal. Entretanto, há vários trabalhos 43 que utilizam coelhos para as pesquisas dessa área (Hallers et al., 2004). A escolha do coelho foi baseada em dois aspectos principais. Primeiramente pela fácil disponibilidade deste animal em biotério parceiro à instituição, segundo pelo calibre da via aérea que é maior quando comparada com ratos, outro animal disponível à pesquisa. Optou-se assim, pelo animal de maior porte. A bioprintificação de tecidos e órgãos ainda está em desenvolvimento. Contudo, muitos estudos já provam o conceito. Pesquisadores utilizam impressoras 3D para criar menisco de joelho, válvula cardíaca, disco espinhal, outros tipos de cartilagens, ossos e orelha artificial (Bartlet, 2013; Mertz, 2013; Gross et al., 2014). Cui et al. (2012) aplicaram a tecnologia da impressão em três dimensões para construir cartilagem articular humana. Uma pesquisa realizada na Universidade de Michigan utilizou impressora 3D e imagens de TC das vias aéreas de um paciente que permitiu fabricar um arcabouço traqueal biorreabsorvível e precisamente modelada sendo implantada cirurgicamente em um bebê com traqueobroncomalácia. O paciente se recuperou e a reabsorção total da prótese supostamente ocorreria dentro de três anos (Bartlet, 2013). As aplicações médicas para tal processo estão se expandindo rapidamente e espera-se que revolucionem a responsabilidade com a saúde (Schubert et al., 2014). As amplas categorias da impressão em 3D podem ser classificadas como fabricação de tecidos e órgãos; criação de próteses customizadas, implantes e modelos anatômicos e pesquisa farmacêutica sobre as formas de dosagem e distribuição de medicamentos (Klein et al., 2013). A grande vantagem da produção em 3D é a liberdade de elaborar produtos e equipamentos sob medida (Banks, 2013). Implantes customizados, acessórios e ferramentas cirúrgicas, podem ter impacto positivo em relação ao tempo cirúrgico, tempo de recuperação do paciente e do sucesso tanto da cirurgia como do implante (Mertz, 2013). Materiais de polímeros artificiais não reabsorvíveis ou reabsorvíveis, materiais poliméricos semi-naturais ou derivados e materiais naturais ou nativos, como enxertos e transplantes, são muito utilizados na substituição e reconstrução de tecidos moles, pertencendo aos elastômeros o uso predominante em aplicações que requerem adesão aos tecido moles (Peppas e Langer, 1994). Implantes de poliésteres (PET), fluoropolímeros (PTFE), polipropileno (PP), poliuretanos (PU) e silicones, já são bem 44 estabelecidos no meio médico, por serem correspondentes à materiais inertes e biocompatíveis. Novos biomateriais considerados na literatura são geralmente uma modificação dessas estruturas básicas (Pinchuk, 1995). O material para a confecção da prótese em impressora 3D adotado nesse trabalho foi de co-poliamida associada à elastômero termoplástico (PCTPE). A co- poliamida é sabidamente biocompativel, caracteriza-se pela elasticidade devido a sua resistência mecânica e produz baixa reatividade tecidual (Hendler, 2000). Apresentam propriedades atóxicas (Hollingsworth, 2010), mínima reação inflamatória (Souza, 2001) e podem ser empregados em quase todos os tipos de tecidos, inclusive em anastomoses gastrointestinais e biliares (Marques, 2005). Elastómeros termoplásticos (TPE) são uma classe de materiais que combinam as propriedades da borrachas e do plásticos. As fases plásticas elastoméricas e plásticas amorfas ou cristalinas se separam em nanoescala, criando uma estrutura de rede fisicamente reticulada. À temperatura ambiente, os TPEs se comportam como borracha reticulada, contudo, podem ser fundidos em temperaturas mais altas como plástico e serem processados a partir de métodos convencionais. São caracterizados por alto alongamento na ruptura, alta flexibilidade e baixa deformação permanente na carga estática e dinâmica. São materiais muito versáteis que são usados no corpo há mais de 20 anos (Pinchuk, 1995). A ideia da associação da co-poliamida com o elastômero termoplástico acarreta benefícios para o protótipo, visto que, propõem alternativa de material com menor capacidade de reação ao organismo frente a processos inflamatórios, pois implantes de co-poliamida apresentam alta rigidez e resistência mecânica (Piatti e Rodrigues, 2005) o que poderia causar atrito importante, favorecendo formação de granuloma. A curva de aprendizado para a aplicação da prótese foi rápida, em virtude da técnica cirúrgica não ser trabalhosa porém, minuciosa e para que a cirurgia fosse bem sucedida alguns pontos foram considerados. Foram realizados de forma prévia cinco procedimentos cirúrgicos pilotos, para desenvolvimento da habilidade da cirurgiã, avaliação anestésica e comportamento pós-operatório. Foi notada a importância da limpeza com gazes e com pinça hemostática Halstead do segmento caudal da traqueia para remoção de coágulos pois, mesmo que pequeno, o coagulo bloqueava a translocação de ar e causava importantíssimo prejuízo ventilatório, não permitindo 45 aporte de oxigênio. Outra colocação, é a necessidade de redução gradual de taxa anestésica ao termino do procedimento cirúrgico, para prevenir apneia nos coelhos, e risco de óbito. Com relação à avaliação clínica diária, todos os animais do experimento apresentaram estabilidade pós-operatória e resposta favorável a técnica cirúrgica e a prótese aplicada. Não foram constatados transtornos respiratórios, complicações no local de implantação e alterações comportamentais relacionadas a dor. Jung et al. (2016), aplicaram prótese de poliuretano impressa em 3D para reconstrução parcial da traqueia em 29 coelhos e, não apontaram complicações graves até os pontos de tempo designados. O trabalho de Shi et al. (2005) propôs a confecção de três próteses traqueais cujo esqueleto básico é formado por malha tubular de polipropileno (PP) associado à fibra de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Os protótipos foram implantados em 16 cães. Alterações como formação de abscessos, deiscência de anastomose ou luxação protética não foram evidenciadas em nenhum dos cães do projeto quando fora realizada inspeção macroscópica direta no momento da eutanásia. Em todos os cães que viveram por mais de dois meses após a operação, a prótese traqueal foi completamente incorporada à traqueia receptora por tecido conjuntivo fibroso. Assim como ocorre no presente estudo, em que foi notado ausência de deiscência da sutura, aderência e reações sugestivas de inflamação, tipo corpo estranho e deformidade traqueal. Da mesma maneira foi observado crescimento tecidual sob a área externa da prótese de forma gradual a resposta do organismo frente a reparação tecidual do segmento operado. Para desenvolver a prótese traqueal de reconstrução total biomimética, atentou-se principalmente para: interação biológica, funcionalidade anatômica e fabricação. O entendimento de biocompatibilidade dá-se pela interação entre o material a ser implantado e o ambiente biológico receptor. A falha de um biomaterial em oferecer biocompatibilidade geralmente acontece por rompimento das propriedades do material ou por resposta biológica insatisfatória. O principal aspecto da biocompatibilidade é a resposta tecidual local. A resposta do processo cicatricial é um fenômeno dinâmico, no qual as células interagem para reparar o tecido danificado. Muitas células estão envolvidas neste processo reparador, incluindo macrófagos e 46 leucócitos polimorfonucleares. A observação da distribuição e contagem dessas células podem ser usadas na descrição da reação inflamatória (Vince et al, 1991). A análise histopatológica em coloração hematoxilina-eosina (HE) foi escolhida para tal finalidade, porque fornece informações qualitativas e quantitativas gerais da resposta tecidual. É o método mais utilizado para avaliação de biocompatibilidade, em estudos experimentais (Högset e Bredberg, 1986; Bonzon et al, 1995; Schwager e Geyer, 1998; Meijer et al, 2002; Hoffman et al, 2003; Trabandt et al, 2004; Spiegel e Kessler, 2005; Weber et al, 2006). A integração biológica entre o enxerto manufaturado implantado e o tecido hospedeiro adjacente é fundamental para promover reparação tecidual. A aderência tecidual identificada macroscopicamente a partir dos 15 dias e a formação de granuloma foram mais evidentes nos cinco animais do grupo de sete dias, em diferentes graus, mas não prejudicaram em nada o recobrimento tecidual conjuntivo fibroso que foi visto em face externa à prótese e área em região de anastomose de forma significativa 15 dias após implante e de forma importante em 30 dias, em razão da realização do flap do musculo externohioideo proposta pela técnica cirúrgica, que permitiu aporte vascular e formação de tecido conjuntivo, além de viabilizar vedação, pois impede a translocação de ar para a área externa da traqueia. No interior da luz traqueal e da prótese não foi observado o mesmo comportamento, visto que o tecido traqueal não apresenta suporte vascular eficiente e não tem capacidade para desenvolver produção celular satisfatória. A cartilagem que sofre trauma não se regenera bem, à exceção de crianças (Wu et al., 2007; Junqueira e Carneiro, 2008). Células do pericôndrio invadem a área lesionada e dão origem a tecido cartilaginoso que reparar o defeito, mas quando a área é extensa, ou mesmo, algumas vezes, em lesões pequenas, o pericôndrio, em vez de formar tecido cartilaginoso novo, gera cicatriz de tecido conjuntivo denso (Junqueira e Carneiro, 2008). Foi constatado presença de resposta inflamatória mista, ou seja, infiltrado inflamatório polimorfonuclear e mononuclear em todas as amostras dos três grupos. Com ressalva de que, observa-se existência de forma acentuada de infiltrado polimorfonuclear em todos os animais do grupo de sete dias e em quatro animais no grupo de 15 dias, a medida que no grupo de 30 dias apenas uma amostra apresentou 47 tal padrão inflamatório de graduação acentuada. Da mesma forma sucede o infiltrado inflamatório mononuclear, visto que houve manifestação dessa categoria celular nos cinco animais do grupo de sete dias e em quatro animais no grupo de 15 dias, a proporção de que no grupo de 30 dias um animal obteve esse tipo de infiltrado de forma intensa. A inflamação é a principal reação do organismo vivo à presença de corpo estranho. Consiste estruturalmente em exsudação de líquidos e proteínas plasmáticas, edema, migração de leucócitos e principalmente neutrófilos, nas primeiras horas ou dias do processo agudo. Esta reação tornar-se-á crônica, com o passar dos dias, surgem os linfócitos e macrófagos e há proliferação de vasos sanguíneos e tecido conjuntivo (Robbins et al., 1994). Segundo Bonzon et al. (1995), a biocompatibilidade dos enxertos revelam nos primeiros oito dias edema ao redor do tecido e reação inflamatória próximo do implante. Ocorre maior concentração de células inflamatórias, em sua maioria linfócitos e neutrófilos, na interface entre o implante e o tecido conjuntivo. Após 15 dias, há a proliferação de alguns capilares no tecido conjuntivo e no local de implantação. Não são observadas células gigantes multinucleadas de corpo estranho ou formação de cápsula fibrosa. Alguns macrófagos podem estar presentes. Após de três semanas percebe-se menor resposta inflamatória e o início da resposta fibroblástica. Com 30 dias, quase não é perceptível resposta inflamatória e o tecido conjuntivo está parcialmente organizado. Esses dados condizem com a reação inflamatória analisadas em todos os grupos, pois houve estimulação de inflamação e incentivo de reparo tecidual tanto nas camadas da traqueia como na interface da prótese, essa última colocação mais evidente no grupo de 30 dias, por maior evidência de tecido fibroso e formação de novos capilares para deposição de tecido conjuntivo. Reação tipo corpo estranho, processo que acontece para tentar isolar o material inerte do restante do organismo, composta por macrófagos e monócitos bem ativados, com presença de células multinucleadas (gigantes) foi visto em apenas dois animais do grupo de sete dias em grau discreto na adventícia. Houve ausência total desse tipo celular e em três amostras do grupo de sete dias e em todos os animais dos grupos de 15 e 30 dias. Crescimento celular intraluminal em área de prótese não foi visto, contudo foi notado a presença de desprendimento celular de leucócitos, restos celulares e 48 bactérias, uma vez que a prótese é um material inorgânico, e não dispõem da capacidade da proliferação celular espontânea sendo assim, as celularidades observadas na face interna do implante são fruto de tal migração. Os resultados revelaram que o protótipo traqueal impresso em 3D poderia proporcionar integração biológica adequada com o tecido traqueal circundante. De acordo com a American Society for Testing and Material (ASTM), biocompatibilidade é a relação entre a resposta tecidual submetida a aplicação do implante e o reconhecimento adequado do biomaterial em estudo. Em adição as propriedades anatômicas do suporte traqueal implantado devem ser semelhantes às do tecido traqueal nativo. Durante a respiração, mudanças de alta pressão ocorrem no lúmen da traqueia, desde a pressão positiva alta (expiração) até a pressão negativa baixa (inspiração). Se a prótese traqueal não tiver rigidez suficiente e elasticidade, será eventualmente achatada. Por isso, foi selecionado PCTPE, perfazendo a classe de elastômeros que tem sido amplamente empregado na engenharia de tecidos (Zdrahala e Zdrahala, 1999), pelo fato de exigir flexibilidade e rigidez (Du et al., 2005; Verma e Marsden, 2005). A avaliação macroscópica revelou que a traqueia operada de todos os animais manteve sua forma sem distorção e deformidade. Sendo assim, a prótese de co-poliamida associada ao elastômero termoplástico impresso em 3D demonstrou ser um excelente suporte, devido falta de falhas na área de enxertia, permitindo adequado fluxo de ar pelo conduto traqueal. Por fim, próteses traqueais que utilizam tecnologia de impressão 3D, pelo método de modelagem por fusão e deposição, oferecem produção simples e personalizada com alta precisão (Murphy Atala, 2014; Chia et al., 2015). O protótipo traqueal possuiu arquitetura semelhante à traqueia original, contendo dimensões equivalentes, impermeabilização de ar e superfície rugosa para facilitar o crescimento do tecido hospedeiro. Em comparação com outras técnicas de fabricação, este método avançado de impressão 3D pode oferecer construções traqueais estáveis e personalizadas de qualquer tamanho e formato para uso clínico futuro (Kang et al., 2016). 49 7. PERSPECTIVAS FUTURAS - O tempo de sobrevida dos animais foram no máximo de 30 dias. Seria interessante avaliar a resposta in vivo por período maior, a fim de analisar a possibilidade de sinais clínicos futuros. - Os transplantes traqueais foram aplicados em segmentos curtos com acometimento de 0,5 cm de traqueia de coelho. A realização de transplantes com acometimento de 30% - 50% do comprimento total da traqueia do animal para avaliação de comportamento celular seria opção futura. - Não se tratou de um ensaio cíclico que avaliasse a fadiga da amostra utilizada, sendo pertinente estudo de resistência mecânica para aplicações que venham a provir. - A partir da nova prótese de PCTPE impresso em 3D há a perspectiva de estudos que invistam na ciência de implantes customizados por impressora 3D como alternativa para o reparo de defeitos traqueais de grandes extensões. 8. CONCLUSÕES Nas condições em que este trabalho fora conduzido é possível concluir que a prótese traqueal biomimética desenvolvida usando a tecnologia de impressão 3D são facilmente fabricados, oferecem boas características estruturais, ótima função anatómica e excelente integração biológica. 50 9. REFERÊNCIAS Akiba T, Inagagaki T, Nakada, T (2013) Three-dimensional printing model of anomalous bronchi before surgery. Annals of Thoracic and Cardiovascular Surgery 2013. Disponivel em: . Amauchi W, Birolini D, Branco PD, Oliveira MR (1983) Lesões da Árvore Traqueobrônquica Por Traumatismo Torácico Fechado. Revista do Hospital das Clińicas 38:130-136. Baiguera S, Birchall MA, Macchiarini P (2010) Tissue-engineered tracheal transplantation. Transplantation 89: 485-49.1 Banks J (2013) Adding value in additive manufacturing: Researchers in the United Kingdom and Europe look to 3D printing for customization. IEEE Pulse 4: 22–26. Bartlet S (2013) Printing organs on demand. 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