UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL� ATIVIDADE PATOGÊNICA DOS FUNGOS Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana E Paecilomyces fumosoroseus PARA Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae) Luciana Yoshida Zootecnista JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL 2007 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIA VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL� � � � � � ATIVIDADE PATOGÊNICA DOS FUNGOS Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana E Paecilomyces fumosoroseus PARA Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae) � � Luciana Yoshida Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Monteiro � � Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária. � � JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Julho de 2007 Yoshida, Luciana Y64a Atividade patogênica dos fungos Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana e Paecilomyces fumosoroseus para Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae)/ Luciana Yoshida. – – Jaboticabal, 2007 xii, 84 f. : il. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2001 Orientador: Antônio Carlos Monteiro Banca examinadora: Giane Serafim da Silva, Érika Barbosa Neves Graminha Bibliografia 1. Controle biológico. 2. Controle microbiano. 3. Fungos entomopatogênicos. 4. Chrysomya putoria. I. Título. II. Jaboticabal- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 576.8595.733.4 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DA AUTORA LUCIANA YOSHIDA - Filha de Julio Yoshida e Helena Yoshida, nasceu em 02 de janeiro de 1975, em São Paulo. Em 1999 concluiu o curso de Zootecnia na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, recebendo o título de Zootecnista. Durante a graduação, estagiou em diversas áreas junto aos departamentos de tecnologia, nutrição de não- ruminantes, engenharia rural e CPPAR, todos pertencentes a Unesp – Jaboticabal. No período de 1999 a 2004, atuou como coordenadora de projetos de pesquisas mercadológicas, junto ao mercado de sementes e defensivos agrícolas. Em 2005 ingressou no curso de Pós-graduação em Microbiologia, área de concentração em Microbiologia Agrícola, no Departamento de Produção Vegetal da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal. Durante o curso de Mestrado participou de congressos e fóruns publicando trabalhos na área de entomopatógenos. A meu amor, companheiro e amigo..... MarcoA meu amor, companheiro e amigo..... MarcoA meu amor, companheiro e amigo..... MarcoA meu amor, companheiro e amigo..... Marco Por acreditar e lutar pelos meus sonhos, como se fossem seus. Por acreditar em mim, nos momentos em que nem mesmo eu acreditava. Eu te amo! DEDICODEDICODEDICODEDICO Aos meus paisAos meus paisAos meus paisAos meus pais Julio e Helena Julio e Helena Julio e Helena Julio e Helena ---- pelo carinho, incentivo e dedicação. OFEREÇOOFEREÇOOFEREÇOOFEREÇO A DEUS DEUS DEUS DEUS - pelo dom da vida e oportunidade de estar aqui. A Espiritualidade maiorEspiritualidade maiorEspiritualidade maiorEspiritualidade maior - pela presença constante nos momentos de alegria e nas horas mais difíceis. AGRADEÇOAGRADEÇOAGRADEÇOAGRADEÇO AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Monteiro - pela oportunidade, confiança, amizade, orientação e principalmente pelo exemplo de caráter de justiça. A CAPES - pela bolsa de mestrado, que permitiu minha total dedicação a este trabalho. Aos Prof. Dr. José Carlos Barbosa, Dr. Gener Tadeu Pereira e ao Dr. Vando Edésio Soares - pelo auxílio na realização das análises estatísticas. Ao Prof. Dr. Wesley Augusto Conde Godoy - pela identificação da espécie da mosca. Ao Prof. Dr. Ely Nahas e ao Prof. Dr. Fernando A. Ávila, pelas importantes sujestões científicas no exame de qualificação. A Dra. Erika Barbosa Neves Graminha e a Dra. Giane Serafim da Silva, pela participação da banca examinadora da defesa e correções tão importantes. Ao bibliotecário Fabio Assis Pinho - pelo auxílio nas correções da bibliografia citada. As minhas grandes amigas, Dinalva, Ana Carolina e Claudia Demétrio – pelo apoio técnico, moral, psicológico em todas etapas, tornando todos os momentos únicos e agradáveis. Aos colegas do Laboratório de Microbiologia, Thaís, Carina, Manuela e Lucas e Carime pelo apoio nos experimentos realizados. Aos amigos do Laboratório de Microbiologia, Marquinhos, Nancy e Mara – pela amizade, incentivo e companheirismo. A Edna, secretária do Laboratório de microbiologia, por estar sempre pronta a ajudar, sendo prestativa em todos os momentos. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho. i SUMÁRIO Página LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. iv LISTA DE TABELAS ................................................................................................ vii APÊNDICE ................................................................................................................ 82 RESUMO ................................................................................................................... xi ABSTRACT ............................................................................................................... xii CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................... 1 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................. 2 2.1 Moscas sinantrópicas .................................................................................. 2 2. 2 Fungos entomopatogênicos ....................................................................... 4 2. 3 Controle biológico ....................................................................................... 6 3. REFERÊNCIAS................................................................................................... 7 CAPÍTULO 2 – EFICIÊNCIA DE Metarhizium anisopliae NO CONTROLE DA MOSCA VAREJEIRA Chrysomya putoria................................................................. 14 RESUMO.................................................................................................................... 14 SUMARY ................................................................................................................................ 15 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16 2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 17 2.1 Fungo........................................................................................................... 17 2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria ................................... 18 2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria ................................... 18 2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria ............................ 19 2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria ................................. 20 2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria................................ 20 2.7 Análise estatística ........................................................................................ 21 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 21 3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria...................................................... 21 3. 2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria.............................................. 23 ii Página 3. 3 Patogenicidade para pupas de C. putoria .................................................. 26 3. 4 Patogenicidade para adultos de C. putoria ................................................ 29 4. CONCLUSÕES .................................................................................................. 32 5. REFERÊNCIAS................................................................................................... 32 CAPÍTULO 3 - SUSCEPTIBILIDADE DE Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae) A AÇÃO PATOGÊNICA DO FUNGO Beauveria bassiana ............... 37 RESUMO ................................................................................................................... 37 SUMARY.................................................................................................................... 38 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 39 2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 40 2.1 Fungo .......................................................................................................... 40 2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria ................................... 41 2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria ................................... 41 2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria ............................ 42 2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria ................................. 43 2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria ............................... 43 2.7 Análise estatística ........................................................................................ 44 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 44 3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria ..................................................... 44 3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria .............................................. 46 3.3 Patogenicidade para pupas de C. putoria ................................................... 49 3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria ................................................. 52 4.CONCLUSÕES ................................................................................................... 55 5. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 55 CAPÍTULO 4- PATOGENICIDADE DE Paecilomyces fumosoroseus PARA A MOSCA SINANTRÓPICA DE AVIÁRIO Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae) ........................................................................................................... 60 RESUMO ................................................................................................................... 60 SUMARY ................................................................................................................... 61 iii Página 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 62 2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 63 2.1 Fungo .......................................................................................................... 63 2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria ................................... 64 2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria ................................... 64 2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria ............................ 65 2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria ................................. 66 2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria ............................... 66 2.7 Análise estatística ........................................................................................ 66 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 67 3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria ..................................................... 67 3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria .............................................. 69 3.3 Patogenicidade para pupas de C. putoria ................................................... 72 3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria ................................................. 75 4.CONCLUSÕES ................................................................................................... 77 5. REFERÊNCIAS................................................................................................... 77 CAPÍTULO 5 – IMPLICAÇÕES................................................................................. 81 iv LISTA DE FIGURAS Página Capítulo 2 Figura 1. Larvas mortas de Chrysomya putoria apresentando extrusão de Metarhizium anisopliae.......................................................................... 23 Figura 2. Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de Metarhizium anisopliae, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento............................................... 25 Figura 3. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria emergidos de pupas tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento................................................. 27 Figura 4. Pupa de Crysomya putoria morta apresentando extrusão de Metarhizium anisopliae.......................................................................... 28 Figura 5. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria pulverizados com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de Metarhizium anisopliae, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento................................................................ 30 Figura 6. Adultos de Chrysomya putoria mortos pelo fungo Metarhizium anisopliae exibindo a extrusão do patógeno......................................... 31 v Capítulo 3 Figura 1. Larvas de Chrysomya putoria morta pelo fungo Beauveria bassiana exibindo a extrusão do patógeno............................................................. 46 Figura 2. Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de Beauveria bassiana, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento....................................................... 48 Figura 3. Pupas de Chrysomya putoria morta pelo fungo Beauveria bassiana. A: Crescimento hifálico do patógeno sobre o cadáver da pupa; B: pupa exibindo a extrusão do patógeno na fase de conidiogênese................... 49 Figura 4. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria emergidos de pupas tratadas com suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de Beauveria bassiana, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento................................................... 51 Figura 5. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria pulverizados com suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de Beauveria bassiana, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento........................................................................ 54 Figura 6. Moscas adultas de Crysomya putoria mortas pelo fungo B. bassiana exibindo a extrusão do patógeno............................................................. 55 vi Capítulo 4 Figura 1. Larvas de C. putoria mortas pelo fungo P. fumosoroseus. A: visualização de uma das câmaras úmidas para verificação da extrusão do patógeno; B: Larva apresentando extrusão do fungo......................... 69 Figura 2. Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de P. fumosoroseus, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento.................................. 71 Figura 3. Pupas mortas pelo fungo Paecilomyces fumosoroseus. A: pupa colonizada pelo fungo na fase hifálica. B: Mosca emergindo da pupa colonizada pela fungo na fase de esporulação........................................... 73 Figura 4. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria emergidos de pupas tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de P. fumosoroseus, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento................................................ 74 Figura 5. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria pulverizados com suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de P. fumosoroseus, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento................................................... 76 vii LISTA DE TABELAS Página Capítulo 2 Tabela 1. Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval, tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e emergência de adultos de Chrysomya putoria após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos isolados de Metarhizium anisopliae............................................................................................... 22 Tabela 2. Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida em dias de larvas L2 de Chrysomya putoria, após tratamento com suspensões de conídios dos isolados de Metarhizium anisopliae, avaliadas diariamente até 15 dias após tratamento.............................. 24 Tabela 3. Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios de isolados de Metarhizium anisopliae. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos................................................. 26 Tabela 4. Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria tratados com suspensões de conídios de isolados de Metarhizium anisopliae. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos........................................................................... 29 viii Capítulo 3 Tabela 1. Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval, tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e emergência de adultos de Chrysomya putoria após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos isolados de Beauveria bassiana ................................................................................................ 45 Tabela 2. Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida em dias de larvas, pupas e adultos oriundos de larvas L2 de Chrysomya putoria, após tratamento com suspensões de conídios dos isolados de Beauveria bassiana, avaliadas diariamente pelo período 30 dias........................................................................................................ 47 Tabela 3. Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios de isolados de Beauveria bassiana. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos................................................. 50 Tabela 4. Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria tratados com suspensões de conídios de isolados de Beauveria bassiana. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos................................................. 53 ix Capítulo 4 Tabela 1. Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval, tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e emergência de adultos de Chrysomya putoria após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos isolados de Paecilomyces fumorosoroseus....................................................................................... 68 Tabela 2. Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida em dias de larvas, pupas e adultos oriundos de larvas L2 de Chrysomya putoria, após tratamento com suspensões de conídios dos isolados de Paecilomyces fumorosoroseus, avaliadas diariamente pelo período 30 dias ......................................................................................................... 70 Tabela 3. Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios de isolados de Paecilomyces fumosoroseus. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos.......................................... 72 Tabela 4. Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria tratados com suspensões de conídios de isolados de Paecilomyces fumosoroseus. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos............................................................................ 75 x APÊNDICE Página Figura 1. Caixas de criação das moscas. A: Vista lateral; B: Vista superior...................................................................................................... 83 Figura 2. Ovos acondicionados sobre papel de filtro e este sob dieta de carne bovina; A: ovos tratados antes da eclosão; B: ovos eclodidos após 12 horas de inoculação.................................................................................. 83 Figura 3. Visualização de uma câmara úmida e os recipientes plásticos interligados e vedados com tecido voile, onde os grupos de ovos e larvas foram mantidos durante a fase larval............................................. 84 Figura 4. Caixa de isopor adaptada para manutenção das moscas durante a fase adulta de todos ensaios............................................................................ 84 Figura 5. Sachês contendo a ração que compunha a dieta para ensaio das larvas de Chrysomya putoria............................................................................... 85 Figura 6. Câmara úmida composta de duas placas de Petri e algodão umedecido para verificação da extrusão do patógeno................................................ 85 Figura 7. Visualização das caixas de isopor em que os adultos de Chrysomya putoria foram acondicionados................................................................... 85 xi ATIVIDEDE PATOGÊNICA DOS FUNGOS Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana E Paecilomyces fumosoroseus PARA Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae) RESUMO - O presente estudo investigou, em condições de laboratório, a atividade patogênica de diferentes isolados dos fungos Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana e Paecilomyces fumosoroseus, aplicados nas concentrações de 1x106 e 1x108 conídios/mL nos estágios de ovo, larva L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria. Grupos de 30 ovos, 20 larvas L2 e 20 pupas foram banhados com as suspensões de conídios e no ensaio com adultos, grupos de 30 moscas, foram pulverizados com as mesmas suspensões. Em todos os ensaios, utilizaram-se quatro repetições por tratamento. Os três fungos e seus respectivos isolados apresentaram baixa atividade patogênica para a fase de ovo. Os isolados de B. bassiana e M. anisopliae, aplicados na concentração de 108 conídios/mL, promoveram 100% de mortalidade de larvas de C. putoria. O tratamento de pupas com o isolado JAB 07 de B. bassiana, na concentração de 108 conídios/mL, reduziu significativamente a emergência de adultos. O efeito dose- resposta foi melhor evidenciado no ensaio com adultos, pois os isolados de M. anisopliae e B. bassiana dimimuiram a sobrevivência somente quando aplicados na concentração de 108 conídios/mL. Todos os fungos se mostraram patogênicos para C. putoria, havendo diferença entre os isolados quanto a ação patogênica. Os isolados de B. bassiana e M. anisopliae foram mais eficientes, atuando principalmente nas fases de larva e adulto. P. fumosoroseus evidenciou menor atividade patogênica, apenas reduzindo a sobrevivência de adultos emergidos a partir de pupas inoculadas. A eficiência do controle foi influenciada pela concentração de conídios, obtendo-se os melhores resultados com as suspensões mais concentradas. Palavras-chave: Controle biológico, controle microbiano, fungo entomopatogênico, avicultura de postura, mosca sinantrópica. xii PATHOGENIC ACTIVITY OF Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana AND Paecilomyces fumosoroseus AGAINST Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae) ABSTRACT - The present study investigated, in laboratory conditions, the pathogenic activity of different isolates of the fungi Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus, applied in the concentrations of 1x106 and 1x108 conidia/ml in the stages of egg, L2 larvae, pupa and adult of Chrysomya putoria. Groups of 30 eggs, 20 L2 larvae e 20 pupae were bathed with the conidia suspensions and in the assay with adult, groups of 30 flies were pulverized with the same suspensions. In all the assays there were used four replicates per treatment. The three fungus and their respective isolates presented low pathogenic activity for the egg stage. The isolates B. bassiana and M. anisopliae, applied in the concentration of 108 conidia/ml, promoted a 100% of C. putoria larvae mortality. The pupae treatment with the isolate JAB 07 of B. bassiana, in the concentration of 108 conidia/ml, decreased significantly adult emergence. The dose-response effect was better evidenced in the assay with adults, because the isolates of M. anisopliae and B. bassiana only reduced the survival when applied in the concentration of 108 conidia/ml. All fungus demonstrated to be pathogenic to C. putoria, although there is a difference between the isolates in their pathogenic activity. The isolates of B. bassiana and M. anisopliae were more efficient, mainly acting in the larva and adult stages. P. fumosoroseus evidenced lower pathogenic activity, decreasing the survival of emerged adult only through inoculated pupae. The control efficiency was influenced by the conidia concentration, obtaining the best results with the most concentrated suspension. Key words: biologic control; microbial control; entomopathogenic fungus and poultry, synonthropic fly. 1 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 1. INTRODUÇÃO O controle de moscas representa um dos principais problemas para a indústria avícola de postura, apresentando custos diretos estimados em 13 centavos de dólar por ave ao ano nos EUA (AXTELL, 1986). Atualmente, existem várias alternativas de controle destes dípteros em aviários. Entretanto, o uso indiscriminado de inseticidas nas granjas promove a ocorrência de resistência aos produtos químicos, eleva os riscos de poluição ambiental e aparecimento de resíduos nos ovos e carnes das aves, além de possibilitar o desequilíbrio da fauna de inimigos naturais das moscas (BRUNO et al., 1993). Outro aspecto relevante é a contaminação dos dejetos, pois em algumas granjas, a produção de esterco é da ordem de 2000 toneladas mensais, sendo comercializado como adubo orgânico, uma atividade econômica de grande importância para o setor (GUIMARÃES, 1988). As práticas adequadas de manejo para os estercos, associados à atividade de predadores naturais, os chamados manejos integrados, são bastante eficientes no controle das moscas, porém requerem maior freqüência de coleta, processamento e armazenamento do mesmo, tornando a atividade onerosa (AXTELL, 1986). A identificação de competitividade entre organismos em um ecossistema específico representa, neste contexto, uma perspectiva promissora para o tratamento de inúmeras enfermidades. No caso das moscas sinantrópicas, o controle biológico utilizando agentes microbianos, especialmente fungos entomopatogênicos como o M. anisopliae e B.bassiana, apresenta significativo potencial profilático, tendo em vista que estes microrganismos exercem atividade patogênica para uma grande variedade de artrópodes, pois invadem o hospedeiro através da cutícula, auxiliado pela ação simultânea hidrolítica de enzimas como proteases, quitinases e lípases (BITTENCOURT et al., 1999). No entanto, pouco se sabe da patogenicidade destes fungos sobre estágios larvares de dípteros sinantrópicos presentes nos excrementos das aves. 2 A Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae) é uma espécie de mosca de grande importância médico sanitária, pois atua como vetor mecânico e/ou biológico de diversos agentes patogênicos, incluindo parasitos do homem e de animais domésticos. O stress causado por infestações de C.putoria causam sérios problemas em criações de animais, interferindo no ganho de peso como agente causador de estresse, podendo afetar a postura em aves, resultando assim em perdas econômicas significativas. Em sistemas de produção avícola de postura comercial, as galinhas poedeiras são alojadas em gaiolas suspensas, em condições de alta densidade, com conseqüente acúmulo de esterco, excelente substrato para o desenvolvimento de moscas sinantrópicas (SILVA et al., 2000). Tendo em vista a escassa literatura envolvendo a competição entre os fungos M. anisopliae, B. bassiana, P. fumosoroseus e os dípteros sinantrópicos, associado ao desafio que representa estabelecer programas profiláticos eficazes contra estes vetores, há necessidade de conduzir trabalhos que investiguem a potencialidade do uso destes agentes no controle de moscas sinantrópicas. O presente estudo propõe investigar, em condições de laboratório, a atividade entomopatogênica dos fungos Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana e Paecilomyces fumosoroseus aplicados nas concentrações de 1x106 e 1x108 conídios/mL, para os estágios de ovo, larva L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria, em experimentos realizados em condições laboratoriais. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Moscas Sinantrópicas Os dípteros muscóides das famílias Calliphoridae, Fanniidae, Muscidae e Sarcophagidae apresentam elevado potencial como vetores mecânicos de agentes etiológicos como vírus, bactérias, cistos de protozoários e ovos de helmintos. Estes artrópodes são de grande interesse médico-sanitário pelo índice de ocorrência, 3 distribuição e predominância em áreas metropolitanas (MARICONI et al.,1999). Segundo D’ALMEIDA & ALMEIDA (1996), a adaptação destes dípteros às condições ambientais modificadas pelo homem intensificou o convívio entre ambos, aumentando a probabilidade de ocorrência na transmissão de patógenos, permitindo a classificação destes vetores como moscas sinantrópicas. Estudos de prevalência em fazendas avícolas identificaram as principais espécies de moscas sinantrópicas presentes em aviários no Brasil. A Musca domestica (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) é a espécie de maior interesse sanitário devido a seu caráter sinantrópico, sua endofilia, abundância na região urbana, capacidade de se desenvolver em vários tipos de substrato, alto poder reprodutivo e por ser apontada como veiculadora de patógenos ao homem e a animais (MENDES & LINHARES, 1993; NEVES, 2000). GREENBERG (1971) relatou a importância da mosca doméstica como vetor dos causadores da febre tifóide, desinteria, cólera, bouba, carbúnculo e algumas formas de conjuntivite. Outros estudos descrevem esta espécie como a mais prevalente em aviários comerciais (ANDERSON & POORBAUGH, 1964; BRUNO et al., 1993), representando mais de 90% do total das espécies que se desenvolvem em tais ambientes (GUIMARÃES, 1988). Outra espécie de mosca sinantrópica é a mosca varejeira do gênero Chrysomya que se constitui em problema no ambiente rural e nas grandes cidades do mundo, onde locais com infra-estrutura inadequada de água, esgoto e acúmulo de material orgânico em decomposição, como no caso dos aviários de postura comercial do Brasil, tornam- se criadouros naturais destes insetos, com conseqüente transmissão de patógenos e propagação de doenças (CARVALHO et al., 2005). Sua tolerância às variações climáticas como temperatura, umidade relativa e luminosidade, pode ser considerada como um dos fatores determinantes da alta capacidade adaptativa verificada nas regiões invadidas, facilitando assim sua expansão geográfica (PARALUPPI & CASTELLÓN, 1993). A Chrysoma putoria (Wiedemann) – “Mosca Africana”, pertencente à família Calliphoridae, apresenta origem africana, foi introduzida no Brasil em meados de 1970. 4 Os adultos apresentam coloração verde metálica com reflexos azulados e espiráculos brancos. O ciclo biológico total evolui num processo de transformação de 4 etapas :ovo (12 a 24 horas), larva (5 a 7 dias), pupa (7 a 9 dias) e adulto (até 2 meses), dependendo da temperatura e umidade.� Essa espécie se cria com freqüência nos aviários, em fezes liquefeitas, ovos quebrados ou carcaças de aves. (GUIMARÃES, 1984). 2.2 Fungos entomopatogênicos O controle de insetos usando agentes biológicos, tais como, fungos entomopatogênicos, com o objetivo de evitar aplicação de produtos químicos sintéticos e para aumentar a segurança ambiental, apresenta expectativas promissoras na profilaxia de vetores (AHMED & LEATHER, 1994). A grande variabilidade genética dos fungos entomopatogênicos pode ser considerada uma das principais vantagens no controle microbiano de artrópodes. ALVES (1998) relatou que é possível, por meio de técnicas apropriadas, selecionar isolados de fungos altamente virulentos, específicos ou não, com características adequadas para serem utilizados como inseticidas microbianos. Entre os fungos entomopatogênicos mais empregados no controle de pragas estão B. bassiana (Vuillemin, 1912), M. anisopliae (Metsch.) Sorokin e Paecilomyces fumosoroseus (Wise) (Holm ex SF Gray). Tal fato se deve provavelmente à sua ampla distribuição geográfica, à variedade de hospedeiros e às condições naturais, enzoóticas ou epizoóticas em que são encontrados (ALVES, 1998). M. anisopliae é um deuteromiceto amplamente distribuído na natureza e pode ser encontrado facilmente nos solos, onde sobrevive por longos períodos (ALVES et al., 1998). Considerado patogênico para um grande número de espécies de artrópodes, foi o primeiro microrganismo a ser reconhecido pela sua importância para controle de pestes na agricultura (FRAZZON et al., 2000). 5 Infecta mais de 300 espécies de insetos das diferentes ordens (ALVES, 1998). Alguns de seus hospedeiros são pragas na agricultura, como a cigarrinha da cana-de- açúcar (Mahanarva posticata), a cigarrinha das pastagens (Deois sp e Zulia sp), a lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), Ceratitis capitata (MOCHI et al., 2006) a formiga saúva (Atta sexdens) e os térmitas subterrâneos (Isoptera: Rhinotermitidae). Sua patogenicidade tem sido ainda demonstrada para carrapatos de diferentes gêneros e espécies (MONTEIRO et al, 1998; GARCIA et al, 2004; BASSO et al, 2005; PRETTE et al, 2005). REINECKE et al. (1990) e KURAMOTO & SHIMAZU, (1992) descreveram a atividade patogênica do M. anisopliae para moscas domésticas adultas. Outro estudo relatou elevado índice de mortalidade de moscas domésticas adultas submetidas ao tratamento com dieta contendo o metabólito, destruxina E, deste deuteromiceto (BARSON et al., 1994). BARSON et al. (1994) demonstraram em seu estudo a elevada virulência do fungo entomopatogênico M. anisopliae para o terceiro instar larval de Musca domestica, pois o tratamento com o deuteromiceto na concentração de 1X105 conídios/mL preveniu 100% da emergência de moscas. Estes inóculos apresentaram também excelente atividade para indivíduos adultos que morreram seis dias após o desafio com o fungo. B. bassiana é um fungo entomopatogênico de distribuição cosmopolita, amplamente aplicado no controle de pragas (BELL & HAMALLE, 1970) e recentemente nos carrapatos (PAIÃO et al, 2001). Causador de epizootia, se caracteriza pela alta taxa de crescimento, produção elevada de unidades infectivas, capacidade de sobrevivência no ambiente, facilidade de penetração pelo tegumento e alcançar a hemolinfa do hospedeiro, reafirmando sua alta patogenicidade (FUXA, 1987). STEINKRAUS et al. (1990) e GEDEN et al. (1995) relataram casos de moscas domésticas com infecções naturais pelo fungo B. bassiana, sendo cerca de 85% das ocorrências constatadas no final do verão. Estudos no laboratório utilizando estes isolados demonstram excelente atividade patogênica sobre larvas de terceiro instar e pupas de M. domestica em desafios in vitro. 6 B. bassiana apresenta excelente potencial como agente biocontrolador de Stomoxys calcitrans (WATSON & PETERSEN, 1993) e Musca domestica (BARSON et al., 1994; RENN et al., 1999). GEDEN et al. (1995) verificaram alta mortalidade de Muscidifurax raptor após desafio com o este hifomiceto. No entanto, pouco se sabe da atividade deste fungo sobre os estágios larvares de outras moscas sinantrópicas. P. fumosoroseus é comumente encontrado no solo, sendo também isolado a partir de uma diversidade de insetos em todo o mundo (CANTONE & VANDENBERG, 1998). Por causa da sua capacidade de promover epizootias em diferentes regiões do mundo, começa a ser explorado e desenvolvido como um possível agente biocontrolador (JACKSON et al., 1997), sendo uma espécie de fungo muito estudado e produzido para controlar a mosca branca (JACKSON et al., 2004). CASTILLO et al. (2000) demonstraram os efeitos patogênicos de M. anisopliae e P. fumusoroseus em Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae), os graus diminuíram a fecundidade e fertilidade das fêmeas desafiadas com os fungos. 2.3 Controle Biológico Observações epizoóticas da ação patogênica natural de microrganismos em populações de artrópodes encorajaram intenso número de estudos para aplicação de fungos entomopatogênicos no controle biológico (FENG et al., 1994; SMITH et al., 2000). A maioria dos fungos patogênica ataca artrópodes após contato externo com o hospedeiro promovendo penetração pela cutícula debilitando e matando o hospedeiro (SMITH et al., 2000). Segundo BARSON et al. (1994), o desenvolvimento de resistência à maioria dos inseticidas químicos evidencia a necessidade da adoção de novos métodos para controle das moscas sinantrópicas. Neste contexto, LIU & YUE (2000) verificaram a ocorrência de resistência cruzada de moscas (diptera-muscidae) aos inseticidas do grupo dos piretróides. A análise do fipronil mostrou resultados semelhantes na ativação destes mesmos mecanismos. No entanto, a atividade pesticida dos organofosforados 7 não apresentou o desenvolvimento de resistência por ativação destes ciclos metabólicos. Tais prerrogativas ressaltam a importância na determinação de procedimentos alternativos para controle de vetores em aviários de postura. Outro aspecto relevante para o sucesso em programas de controle biológico envolve a identificação de características semelhantes nas condições ambientais que favoreçam o desenvolvimento do ciclo biológico tanto do parasito quanto do hospedeiro. SMITH & RUTZ (1991) avaliaram o efeito das condições ambientais na incidência de ovos, larvas, pupas e adultos de várias moscas da família muscidae em fazendas no Estado de Nova York. Entre os parâmetros avaliados neste estudo, a umidade presente nos alimentos e excrementos dos animais apresentou maior influência no ciclo biológico destes artrópodes, ocorrendo reduções significativas nas populações de moscas quando submetidas a ambientes secos ou com baixa umidade relativa. BRUNO et al. (1993) estudaram a relação entre a umidade do esterco de aves e o desenvolvimento larval de moscas sinantrópicas em amostra coletadas no Estado de São Paulo. Os achados desta investigação demonstraram que as larvas dos dípteros requerem elevados níveis de umidade, variando entre 45 e 80%, condições ambientais consideradas satisfatórias para o cultivo e crescimento dos fungos M. anisopliae e B. bassiana (BARSON et al., 1994 e FERRON, 1977, respectivamente). Outro aspecto relevante no emprego do controle biológico são os programas de biossegurança adotados na avicultura, cada vez mais exigentes pelos consumidores internos e externos, quanto à presença de resíduos em produtos, além da comercialização do esterco dos aviários, destinados à adubações em produções agrícolas e da preservação do meio ambiente. 3. REFERÊNCIAS AHMED, S. I.; LEATHER, S. R. Suitability and potential of entomopathogenic microorganisms for forest pest management – some points for consideration. International Journal of Pest Management, Cardif, v.40, p.287-292, 1994. 8 ALVES, R. T. et al. Effects of simulated solar radiation on conidial germination of Metarhizium anisopliae in different formulations. Crop protection, Budapest, v.17, p.675-79, 1998. ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. São Paulo: Manole, 1998, 386p. ANDERSON, J. R.; POORBAUGH, J. H. Observations on the ethology and ecology of various Díptera associated with northem California poultry ranches. 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Grupos de 30 ovos, 20 larvas e 20 pupas foram banhados em suspensões de conídios, sendo a mortalidade avaliada diariamente, considerando-se as respectivas fases subseqüentes do ciclo da mosca, até o 20o dia da fase adulta. No ensaio com adultos, grupos de 30 moscas foram pulverizados com 1 mL das suspensões de conídios, mantidos em gaiolas para avaliação diária da mortalidade, durante 20 dias. Larvas, pupas e adultos mortos foram acondicionados em câmaras úmidas para observação de extrusão do patógeno. Os isolados E 9 e IBCB 425 promoveram um aumento significativo (P<0,05) no tempo médio de empupação e tempo médio de vida da pupa, respectivamente quando aplicados na concentração de 1x108 conídios/mL na fase de ovo. Ambos os isolados causaram 100% de mortalidade no tratamento de larvas (L2), submetidas às concentrações de 1x106 e 1x108 conídios/mL. Nos ensaios com pupas e adultos, verificou-se significativa mortalidade (P<0,05) após a administração de inóculos com 1x108 conídios/mL dos isolados IBCB 425 e E 9. Os resultados indicam que o isolado E9 de M. anisopliae, na concentração de 108 conídios/mL, é patogênico para as fases de larva, pupa e adulto de C. putoria, apresentando perspectivas promissoras para o uso em programas de controle biológico da mosca. Palavras-chave: Controle biológico, controle microbiano, fungo entomopatogênico, avicultura de postura, mosca sinantrópica. 15 CHAPTER 2- EFICIENCY OF Metarhizium anisopliae IN THE CONTROL OF BLOWFLY Chrysomya putoria ABSTRACT - This study evaluated the efficiency of the isolates E 9 and IBCB 425 of Metarhizium anisopliae applied to the different development stages of Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae), a kind of synantropic blowfly. The fungi suspensions were tested in the concentrations of 1x106 and 1x108 conidia/ml, on egg’s stage, larval L2, pupae and adult of C. putoria. Groups of 30 eggs, 20 larvae and 20 pupae were bathed in conidia suspension, being mortality daily evaluated, and considered the respective subsequent stages of the fly cycle, until the 20th day of the adult stage. For the adults, groups of 30 flies were pulverized with 1ml of the conidia suspensions and maintained for 20 days in cages for daily mortality examination. Deceased larvae, pupa and adults were transferred to humid cameras to verify the pathogen extrusion. The isolates E 9 and IBCB 425 promoted a significant increase (P<0,05) in the average time of the pupa’s process and pupa’s average life time, respectively, when submitted to 1x108 conidia/ml on egg stage. Both isolates caused 100% of the mortality on larvae L2 treatment with 1x106 and 1x108 conidia/ml. In the assays with pupa and adults, it was observed significant mortality (P<0,05), after to be challenged with 1x108 conidia/ml of IBCB 425 and E 9 isolates. The results indicated that the isolate E 9 of M. anisopliae, in the concentration of 108 conidia/ml, is pathogenic to larva, pupa and adults stages of C. putoria, showing satisfactory potential for biological control of this blowfly. Key words: Biological control, microbial control, entomopathogenic fungus, poultry, synantropic fly. 16 1. INTRODUÇÃO A alta densidade de aves adotada em granjas causa grande acúmulo de esterco, excelente substrato para a proliferação de moscas. Dentre os principais califorídeos que ocorrem nesse meio, está a mosca varejeira Chrysomya putoria, podendo causar diversos danos aos aviários, deixando manchas nos equipamentos da granja, as quais podem causar redução na intensidade de iluminação (BICHO et al., 2004). Estes insetos podem ainda veicular patógenos, principalmente quando pousam em ovos recém-colocados, pois por meio do seu corpo, trato digestivo ou até mesmo das suas fezes, podem ser transmissoras de diversos microrganismos tanto para o homem como para as aves (AXTELL & ARENDS, 1990). O uso indiscriminado de inseticidas químicos para controle destes dípteros nas granjas propicia a seleção de biótipos resistentes aos produtos (SCOTT et al., 2000), aumenta os riscos de poluição ambiental e aparecimento de resíduos químicos nos ovos e carnes das aves, além de possibilitar o desequilíbrio na população de outros artrópodes inimigos naturais das moscas (BRUNO et al., 1993). Os fungos entomopatogênicos são responsáveis por 80% das doenças causadas em insetos e possui a vantagem de ter uma grande variabilidade genética, o que evita possíveis problemas de resistência de pragas a este patógeno (ALVES, 1998). Entre os entomopatógenos, Metarhizium anisopliae Metsh. (Sorokin) tem se destacado como um importante agente de controle microbiano (ALVES, 1998), sua aplicação apresenta significativo potencial profilático, tendo em vista que este microrganismo exerce atividade patogênica para uma grande variedade de artrópodes (DIMBI et al., 2003; BASSO et al., 2005; MOCHI et al., 2006; BRIGGS et al., 2006; CABRAL et al., 2007). A infecção de insetos adultos pelo M. anisopliae, ocorre por penetração pela cutícula, por uma combinação entre a barreira físico-química e a degradação enzimática (HAJEK e ST. LEGER, 1994). Com um mecanismo de infecção especializado, alguns fungos podem infectar diferentes estágios de desenvolvimento dos hospedeiros (MCCOY e MILANI-TIGANO, 1992). 17 Na literatura existem vários trabalhos envolvendo a atividade do fungo M. anisopliae no controle de moscas sinantrópicas como a Musca domestica (WATSON et al., 1996; CRESPO et al., 1998), a Stomoxys calcitrans (WATSON et al., 1995) e a Haemathobia irritans (ANGEL-SAHAGÚN et al., 2005). Entretanto há carência de estudos envolvendo moscas do gênero Chrysomya. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade de M. anisopliae, em condições laboratoriais, nas concentrações de 1x106 e 1x108 conídios/mL, para os estágios de ovo, larva L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Fungos Foram utilizados os isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, pertencentes à coleção do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Produção Vegetal da FCAV/Unesp. Os isolados foram mantidos em tubos de ensaio contendo 5 mL de meio BDA (batata, dextrose e ágar) inclinado, estocados a 4ºC. Para utilização nos ensaios foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA, acondicionadas em estufa a 27 ± 0,5ºC, durante 15 dias, com ausência de iluminação. A viabilidade dos isolados, determinada pelo método descrito por MARQUES et al.(2004), nos ensaios de ovo, larva, pupa e adulto os resultados observados de viabilidade foram respectivamente, de: IBCB 425 (99, 98, 98, e 97%) e E 9 (100, 100, 100, 100%). Para a produção dos inóculos, os esporos da parte superficial de colônias jovens do fungo foram transferidos para tubos contendo 20 mL de solução Tween 80® (0,1% v/v) esterilizada. Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos, as suspensões foram padronizadas em 1 x 106 e 1 x 108 conídios/mL, com auxílio da câmara de Neubauer. 18 2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria. Amostras de excrementos contendo larvas de C. putoria, coletadas em aviários de galinhas de postura, pertencentes à FCAV/Unesp, foram acondicionadas em caixas isopor de 15 litros adaptados de BELO (1991) (Figura 1 do Apêndice) adaptadas para implantação e manutenção da colônia utilizada durante os bioensaios com os diferentes estágios de desenvolvimento da mosca. Os adultos provenientes dessas larvas foram confinados nas caixas de isopor e para sua manutenção utilizou-se uma mistura de leite em pó e açúcar (1:1) e água destilada oferecida ad libitum em algodão saturado. A ovipostura foi estimulada oferecendo carne bovina in natura. Em seguida, os ovos foram transportados para copos plásticos (60 mm de diâmetro x 70 mm de altura) vedados com tecido voile e contendo uma dieta artificial composta de farelo de trigo (18%), farelo de milho (17%), farelo de soja (51%), farelo de arroz (14%) e água em quantidade suficiente para proporcionar consistência pastosa. Após a eclosão, as larvas permaneceram nos mesmos recipientes até atingirem o terceiro ínstar, quando foram colocadas nas caixas de manutenção de moscas para a empupação e emergência de adultos, todos mantidos à temperatura ambiente. A cada 30 dias novas larvas da mosca eram colhidas no ambiente natural e introduzidas na colônia para minimizar o efeito endogâmico. 2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria Grupos de 30 ovos com até quatro horas de idade, foram banhados por 30 segundos com as suspensões de conídios obtidas como já descrito e os grupos controle foram banhados apenas no veículo da suspensão. Em seguida, foram colocados sobre papel de filtro esterilizado o qual foi depositado sobre 5 g de carne bovina moída e em processo inicial de decomposição que serviu de dieta para as larvas eclodidas (Figura 2 do Apêndice). Esta preparação foi acondicionada em recipiente de plástico (30 mm de diâmetro x 50 mm de altura) interligado a outro idêntico por um A 19 orifício no intuito de oferecer um ambiente mais seco para a empupação. Os recipientes foram vedados com malha fina de nylon e acondicionados em câmaras úmidas (Figura 3 do Apêndice) à 27 ± 0,5 ºC, umidade relativa do ar entre 60 e 70% e fotoperíodo de 14 horas. A avaliação de eclosão foi realizada a partir de 12 horas após a inoculação do fungo. No estádio larval, os imagos foram inspecionados diariamente para verificação da empupação e as pupas formadas foram separadas e acondicionadas em placas de Petri com algodão umedecido. As moscas adultas emergidas foram transferidas para caixas de isopor (2 litros), adaptadas de acordo com BELO (1991) (Figura 4 do apêndice), mantidas à temperatura ambiente, oferecendo, ad libitum, dieta composta por uma mistura de leite em pó e açúcar refinado (1:1), e água em algodão saturado, durante o período de 20 dias, para avaliação diária da longevidade. A extrusão do patógeno em pupas e adultos foi observada como um dado complementar para verificação da atividade patogênica. 2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria Grupos de 20 larvas (L2), com 72 horas de idade, foram imersos durante 30 segundos nas suspensões de conídios ou veículo das suspensões (controle), como descrito anteriormente, e em seguida, mantidos em dois recipientes de plástico. Para evitar a remoção de conídios do tegumento, as larvas foram deixadas por 24 horas nos recipientes de plástico e em seguida foram alimentadas com a dieta artificial usada para manutenção de larvas, autoclavada, oferecida na forma de sachês (Figura 5 do apêndice). A montagem, finalidade e manutenção dos recipientes plásticos foram realizadas conforme descrito no ensaio anterior. A inspeção das larvas foi efetuada diariamente por 30 dias para verificação da mortalidade e empupação. As pupas foram transferidas para caixas de isopor (2 litros) adaptadas conforme descrito por BELO (1991) (Figura 4 do apêndice), para observação da emergência e do tempo de vida dos adultos. Larvas, pupas e adultos mortos foram 20 transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27oC para verificação da extrusão do patógeno (Figura 6 do apêndice). 2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria Grupos de 20 pupas com um a dois dias de idade, com quatro repetições, foram imersos durante 30 segundos nos veículos ou nas suspensões de conídios já referidas e mantidos à temperatura ambiente, em caixas de isopor, como descrito no item 2.3, ensaio com ovos. As caixas foram inspecionadas diariamente para observação de emergência e mortalidade de adultos, durante 20 dias após o 3° dia de incubação, ocasião em que ocorreu a primeira emergência. As pupas que não geraram adultos até o quinto dia após o tratamento, foram consideradas mortas. Pupas e adultos mortos foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27oC para verificação da extrusão do patógeno. 2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria Grupos de 30 moscas adultas, com um a cinco dias de idade, foram separados em recipientes de plástico, cobertos com tecido voile e mantidos a temperatura de 0°C até a completa imobilização das moscas. Com auxílio de um pequeno aspersor manual, foram pulverizados com 1 mL das suspensões de conídios e mantidos em temperatura ambiente, sendo oferecido água em algodão saturado. Os grupos controles foram pulverizados apenas com o veículo das suspensões. Após 12 horas, as moscas foram transferidas e mantidas durante 20 dias em caixas de isopor, como anteriormente descrito, para avaliação diária da longevidade dos adultos (Figura 7 do apêndice). Os adultos mortos foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27oC para verificação da extrusão do patógeno (Figura 6 do apêndice). 21 2.7 Análise estatística Todos os ensaios foram conduzidos com quatro repetições. Para análise dos dados utilizou-se o programa SAS, versão 8.2 (SAS, 1999). Inicialmente, todas as variáveis foram estudadas de maneira descritiva, pelo cálculo da média, desvio padrão e mediana. Em seguida os valores percentuais de mortalidade foram transformados em Arco seno = ( )[ ] π/180100% ×emortalidad , e o tempo médio de vida (TMV) foi calculado pela média ponderada da mortalidade e o tempo em dias TMV = �(dias x sobreviventes)/�sobreviventes. Todas as médias dos dados foram analisadas em um delineamento inteiramente casualizado (ANOVA) e as comparações múltiplas foram aferidas pelo teste de Tukey (P�0,05). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria A aplicação dos isolados de IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae em ovos de C. putoria não apresentou efeito significativo (P>0,05) sobre o percentual de eclosão (Tabela 1). O tempo médio de eclosão de larvas de C. putoria ocorreu a partir de 12 horas da ovipostura. Em ensaios de viabilidade, a germinação dos isolados IBCB 425 e E 9, após 12 horas de incubação, foi de 78 e 75%, respectivamente. Como os conídios foram inoculados nos ovos quatro horas após a postura, provavelmente a eclosão das larvas ocorreu antes da germinação e penetração do fungo no ovo, o que justifica a baixa atividade patogênica para este estágio de desenvolvimento da C. putoria. A eficiência do controle biológico depende do sincronismo na relação parasito-hospedeiro, fato não observado na fase de ovo do ciclo da mosca. Desta forma, os resultados observados sugerem que os isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae não apresentam potencial patogênico para ovos de C. putoria, contrariamente às observações de 22 ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) que verificaram, após tratar os ovos de Haematobia irritans com inóculos contendo 106 conídios/mL, redução significativa na porcentagem de emergência de adultos em quatro de 11 isolados de M. anisopliae estudados. TABELA 1 - Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval, tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e emergência de adultos de Chrysomya putoria após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos isolados de Metarhizium anisopliae. Tratamentoa Eclosão (%) Mortalidade larval TMEb (dias) TMVPc (dias) Emergência (%) IBCB 425 106 90,84 ± 5,0 A 1,50 ± 1,3 A 7,26 ± 0,3 AB 3,83 ± 0,1 AB 94,98 ± 4,0 A IBCB 425 108 95,83 ± 3,2 A 1,00 ± 1,4 A 7,60 ± 0,5 A 3,87 ± 0,3 AB 93,54 ± 7,5 A E9 106 87,50 ± 3,2 A 1,00 ± 2,0 A 7,38 ± 0,4 AB 3,83 ± 0,1 AB 98,15 ± 3,7 A E9 108 95,00 ± 3,3 A 2,25 ± 1,0 A 7,12 ± 0,1 AB 3,90 ± 0,1 A 99,07 ± 1,9 A Controled 87,50 ± 5,0 A 2,00 ± 1,8 A 6,82 ± 0,1 B 3,58 ± 0,1 B 96,83 ± 4,0 A Valor de F 2,44NS 0,71NS 4,39* 1,59NS 0,75NS Pr>Fe 0,0918 0,5996 0,0151 0,2272 0,5750 C.V. (%)f 8,09 97,76 3,84 7,46 14,04 DMS (Tukey)g 15,67 5,76 0,61 0,63 28,56 Médias seguidas por pelo menos por uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). NS não significativo; *significativo a 5% de probabilidade. a isolado, seguido da concentração de conídios/mL usada. b TME: Tempo médio de empupação; c TMVP: Tempo médio de vida das pupas. d Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%. e Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F f C.V.: Coeficiente de variação g DMS: Diferença mínima significativa. CASTILLO et al. (2000) descreveram a atividade patogênica de cepas deste fungo sobre a fertilidade de ovos de Ceratitis capitata, observando redução significativa de 40 a 50% no percentual de eclosão após tratamento de fêmeas adultas com inóculos de 106 conídios do isolado CECT 2952 de M. anisopliae. No presente estudo não houve aumento significativo (P>0,05) na mortalidade de larvas de C. putoria provenientes dos ovos tratados com inóculos de 106 e 108 conídios/mL de ambos os isolados (Tabela 1). Porém, se observa aumento no tempo médio de empupação das larvas quando 23 comparadas ao grupo controle, sendo estatisticamente significativo (P<0,05) apenas para os ovos tratados com 108 conídios do isolado IBCB 425 de M. anisopliae. Na análise do tempo médio de vida da pupa, o isolado E 9 na concentração de 108 conídios/mL apresentou aumento significativo (Tabela 1), corroborando a ausência da atividade do fungo para esta fase do ciclo biológico da mosca, pois o fungo não afetou a emergência de adultos após o tratamento dos ovos com as suspensões, sendo confirmada pela completa ausência da extrusão do patógeno observado em pupas e adultos mortos, reafirmando a pequena atividade patogênica do fungo para ovos de C. putoria. 3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria No bioensaio realizado com larvas (L2), avaliou-se o efeito patogênico dos tratamentos fúngicos por meio do estudo do tempo médio de vida das larvas de C. putoria. Verificou-se redução significativa (P<0,01) do tempo médio de vida das larvas e total nos tratamentos com os isolados E 9 e IBCB 425 de M. anisopliae nas duas concentrações de conídios testadas quando comparadas ao controle (Tabela 2), apresentando 100% de mortalidade nesta fase do ciclo, confirmada pela presença de extrusão do fungo em larvas mortas (Figura 1). Tal fato evidencia que estes isolados apresentam acentuada atividade patogênica para larvas de C. putoria. Como conseqüência, não se observou atividade patogênica residual para pupas e adultos. Figura 1. Larvas mortas de Chrysomya putoria apresentando extrusão de Metarhizium anisopliae. 24 Analisando graficamente a sobrevivência larval observou-se que as larvas de C. putoria tratadas com os isolados E 9 e IBCB 425 de M. anisopliae, apresentaram 100% de mortalidade no 8° e 9° dias, respectivamente, após tratamento com a concentração de 108 conídios/mL. No entanto, o efeito da concentração de conídios ficou menos evidente visto que o isolado E 9 aplicado na concentração de 106 conídios/mL, também promoveu 100% de mortalidade de larvas no 8° dia após tratamento (Figura 2). TABELA 2 - Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida em dias de larvas L2 de Chrysomya putoria, após tratamento com suspensões de conídios dos isolados de Metarhizium anisopliae, avaliadas diariamente até 15 dias após tratamento. Tempo médio de vida (dias) Tratamentoa Larva Total IBCB 425 106 3,07 ± 0,1 B 3,07 ± 0,1 B IBCB 425 108 3,00 ± 0,1 B 3,00 ± 0,1 B E9 106 3,44 ± 0,2 B 3,44 ± 0,2 B E9 108 2,96 ± 0,1 B 2,96 ± 0,1 B Controled 5,62 ± 0,7 A 8,42 ± 0,7 A Valor de F 47,49** 199,29** Pr>Fc <0,0001 <0,0001 C.V. (%)d 9,10 8,07 DMS (Tukey)e 0,72 0,74 Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). **Significativo a 1% de probabilidade. a Isolado e concentração de conídios/mL. b Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%. c Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F d CV: Coeficiente de variação e DMS: Diferença mínima significativa. Tais achados estão em concordância com o descrito por BARSON et al. (1994) que constataram significativa redução na porcentagem de emergência de adultos de mosca doméstica após tratar larvas de terceiro ínstar com o isolado 27585 de M. anisopliae na concentração de 106 conídios/mL, quando comparado ao tratamento com 104 conídios/mL. No entanto, o resultado do tratamento com 106 conídios/mL não diferiu 25 do obtido na concentração de 108 conídios/mL, achado congruente com o verificado neste trabalho para as concentrações de 106 e 108 conídio/mL do isolado E 9. Figura 2: Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de Metarhizium anisopliae, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento. Recentemente, BERNARDI et al. (2006) e MOCHI et al. (2006) relataram aumento significativo na mortalidade de pupas de M. domestica e na emergência de adultos de Ceratitis capitata, respectivamente, após tratarem larvas destes dípteros com inóculos maiores que 106 conídios/mL dos isolados CG 34 e E 9 de M. anisopliae, respectivamente. Os dados observados neste estudo confirmam a patogenicidade do fungo M. anisopliae pelos isolados IBCB 425 e E 9 para larvas de segundo ínstar de C. putoria quando aplicado na concentração de 106 e 108 conídios/mL. 106 106 108 108 26 3.3 Patogenicidade para pupas de C. putoria Para o estudo da atividade patogênica dos isolados durante a fase pupal de C. putoria foram analisados a emergência de adultos, o tempo médio de vida dos adultos e mortalidade total. Pela análise da emergência de adultos, não foi observado efeito significativo (p>0,05) (Tabela 3), Tal resultado é, provavelmente, conseqüências de características fisico-químicas específicas da pupa dos artrópodes, que favorecem sua defesa contra a ação lesiva de patógenos. BIDOCHKA e KHACHATOURIANS (1992) verificaram que proteínas cuticulares influenciaram diretamente na germinação e crescimento de B. bassiana em Melanoplus sanquinipes, enquanto MARMARA et al. (1993) mostraram que proteínas presentes na cutícula de C. capitata foram responsáveis pelo reconhecimento e eliminação de bactérias infectantes. TABELA 3 - Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de C. putoria tratadas com suspensões de conídios de isolados de Metarhizium anisopliae. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos. Tratamentoa Emergência (%)b TMVc Mortalidade total IBCB 425 106 11,50 ± 2,38 A 10,30 ± 0,17 A 10,00 ± 1,83 CB IBCB 425 108 9,25 ± 2,50 A 10,22 ± 0,26 A 12,00 ± 2,00 AB E 9 106 12,00 ± 2,45 A 10,40 ± 0,09 A 8,75 ± 2,06 CB E 9 108 10,00 ± 1,83 A 9,39 ± 0,73 B 14,25 ± 1,71 A Controled 13,50 ± 0,58 A 10,36 ± 0,16 A 7,50 ± 1,00 C Valor de F 2,61NS 5,23** 9,23** Pr>Fe 0,0779 0,0077 0,0006 C.V. (%)f 18,47 3,62 16,77 DMS (Tukey)g 4,54 0,80 3,84 Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). NS não significativo; **significativo a 1% de probabilidade. a Isolado e concentração de conídios/mL. b Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno; c TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias). d Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%. e Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F f CV: Coeficiente de variação g DMS: Diferença mínima significativa. 27 A análise do tempo médio de vida dos adultos que emergiram a partir das pupas tratadas, mostrou que somente o tratamento com o isolado E 9 de M. anisopliae, na concentração de 108 conídios/mL, reduziu significativamente (P<0,01) a sobrevivência das moscas, quando comparado ao controle. Na avaliação da mortalidade total de pupas de C. putoria, se observou aumento significativo (P<0,01) na mortalidade dos grupos banhados com suspensões dos isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, na concentração de 108 conídios/mL (Tabela 3). Resultados similares aos descritos por ANGEL-SAHAGUN (2005), aplicando M. anisopliae em pupas de H. irritans com mortalidade de 50%. Analisando graficamente a sobrevivência de moscas emergidas de pupas tratadas com as suspensões de conídios de IBCB 425 e E 9 de M anisopliae se observou acentuada mortalidade de adultos emergidos (Figura 3). Figura 3: Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria emergidos de pupas tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento. 106 106 108 108 28 Outro aspecto importante a ser considerado é a redução na sobrevivência de adultos provocada pelo aumento da concentração dos inóculos, sendo mais evidente a atividade dose-resposta para o isolado E 9 de M. anisopliae (Figura 3). A redução na longevidade dos adultos emergidos de pupas tratadas com isolado IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae é importante para o controle de C. putoria, diminuindo a duração da fase reprodutiva da mosca, como em estudos com adultos de C. capitata, que apresentaram menor longevidade após o tratamento das pupas com diferentes isolados de M. anisopliae (BISOLLI, 2004). Os resultados obtidos no bioensaio com pupas de C. putoria demonstraram a atividade patogênica do M. anisopliae, confirmada pela presença de extrusão do patógeno em pupas (Figura 4) e adultos, causando aumento da mortalidade de adultos na aplicação dos isolados IBCB 425 e E 9 na concentração de 108 conídios/mL, sendo mais evidente pelo isolado E 9, promovendo diminuição no tempo médio de vida das moscas provenientes de pupas tratadas com suspensões de 108 conídios/mL. Figura 4: Pupa de Crysomya putoria morta apresentando extrusão do isolado E9 de Metarhizium anisopliae. 29 3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria Na análise comparativa da atividade patogênica dos isolados aplicados diretamente sobre adultos de C. putoria, se observou resultados significativos (P<0,01) na redução do tempo médio de vida e no aumento da mortalidade das moscas tratadas com suspensões de 108 conídios/mL de M. anisopliae (Tabela 4). Adultos de C. putoria tratados com suspensões 108 conídios/mL dos isolados IBCB 425 e E9 de M. anisopliae apresentaram percentuais de mortalidade de 64,16 e 61,70 respectivamente, durante o período de 20 dias, sendo cerca de 50% maiores do TABELA 4 - Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria tratados com suspensões de conídios de isolados de Metarhizium anisopliae. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos. Tratamentosa TMVb Mortalidade (%)c IBCB 425 106 9,75 ± 0,17 A 39,71 ± 1,87 BC IBCB 425 108 7,58 ± 0,47 B 64,16 ± 3,50 A E9 106 9,56 ± 0,13 A 42,60 ± 3,28 B E9 108 7,70 ± 0,10 B 61,70 ± 1,16 A Controled 9,86 ± 0,41 A 32,89 ± 8,29 C Valor de F 58,94** 40,17** Pr>Fe <0,0001 <0,0001 C.V. (%)f 3,36 9,11 DMS (Tukey)g 0,65 9,59 Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). **Significativo a 1% de probabilidade; a Isolado e concentração de conídios/mL. b TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias). c Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno; d Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%. e Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F f CV: Coeficiente de variação g DMS: Diferença mínima significativa. 30 que os valores observados no controle (Tabela 4). Tais achados estão em concordância com os descritos por WRIGHT et al. (2004) que verificaram mortalidade de 64% de adultos da varejeira Lucilia sericata após o tratamento com suspensões de 107 conídios/mL de M. anisopliae, e por e LOHMEEYER & MILLER (2006), pelas mortalidades de 43,5 e 73% após tratamento de adultos de H. irritans com elevada concentração de conídios (109 conídios/g). ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005), avaliando a patogenicidade do M. anisopliae em adultos de H. irritans, com suspensões de 108 conídios/mL, obtiveram de 50 a 100% de mortalidade em 8 dos 11 isolados testados. O efeito dose-resposta para estes isolados ficou evidente nesta análise, pois os adultos tratados com suspensões de 106 conídios/mL apresentaram mortalidades estatisticamente similares ao grupo controle (Tabela 4). Esse efeito foi descrito em outros estudos com dípteros por BARSON et al. (1994) e BERNARDI et al. (2006) que mostraram o efeito dose-resposta para a ação patogênica de isolados de M. anisopliae no controle de adultos de mosca doméstica, e em C. capitata por CASTILLO et al. (2000). Analisando graficamente a sobrevivência de adultos de C. putoria durante o período de 20 dias, observa-se o efeito dose-resposta, verificando acentuada 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias após tratamento N º de a du lto s so br ev iv en te s M.a.IBCB425 106 M.a.E9 106 Controle M.a.IBCB425 108 M.a.E9 108 Figura 5: Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria pulverizados com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de Metarhizium anisopliae, nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL e controle, até o 20° dia após tratamento. 31 mortalidade das moscas a partir do sexto e 14° dias, respectivamente após o tratamento com os isolados de M. anisopliae (Figura 5) na concentração de 108 conídios/mL. Neste contexto, podemos afirmar que adultos de C. putoria são susceptíveis aos isolados E 9 e IBCB 425 de M. anisopliae, sendo mais eficiente na concentração de 108 conídios/mL, dados confirmados pelas observações de extrusão do fungo nos exemplares mortos deste ensaio (Figura 6). Como C. putoria habitualmente se alimenta e reproduz em excretas de aves, uma das estratégias seria a pulverização de suspensão de conídios sobre os mesmos, o que possibilitaria a atuação direta sobre larvas e indireta sobre adultos. De acordo com WRIGHT et al. (2004), o contato do tarso de adultos de varejeira L. sericata, com inóculos de 107 conídios/mL de M. anisopliae resultou em 64% de infecções das moscas. É necessário estabelecer estratégias que permitam a utilização de M. anisopliae como alternativa aos tratamentos convencionais com pesticidas químicos, atualmente empregados no manejo sanitário de aviários de postura, mais estudos neste sentido devem ser conduzidos. Figura 6. Adultos de Chrysomya putoria mortos pelo fungo Metarhizium anisopliae exibindo a extrusão do patógeno. 32 4. CONCLUSÕES 1. O fungo M. anisopliae é eficiente no controle de C. putoria. 2. A mosca C. putoria é mais susceptível ao fungo nas fases de larva e adulto. 3. Os isolados IBCB 425 e E9 são patogênicos para C. putoria, sendo mais efetivos quando aplicados na concentração de 108 conídios/mL. 4. O isolado E 9 de M. anisopliae na concentração de 108 conídios/mL. é indicado para o controle de C. putoria, foi capaz de agredir as fases de larvas, pupas e adultos. 5. REFERÊNCIAS ALVES, S. B. Fungos entomopatogênicos, In:_____. Controle microbiano de insetos. 2. ed. Piracicaba: FELQ, 1998. cap.11, p.289-381. ANGEL-SAHAGÚN, C. A.; LEZAMA-GUTIÉRREZ, R.; MOLINA-OCHOA, J.; GALINDO- VELASCO, E.; LÓPEZ-EDWARDS, M.; REBOLLEDO-DOMINGUEZ, O.; CRUZ- VÁZQUEZ, C.; REYES-VELÁZQUEZ, W. P.; SKODA, S. R.; FOSTER, J. E. 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O tratamento dos ovos com os isolados de B. bassiana apenas apresentaram efeito sobre o aumento do tempo médio de vida das pupas quando aplicados nas concentrações de 106 e 108 conídios/mL. Os isolados de B. bassiana, aplicados nas duas concentrações promoveram significativa mortalidade (P<0,05) quando aplicados em larvas de C. putoria. O tratamento de pupas com o isolado JAB 07 de B. bassiana, na concentração de 106 e 108 conídios/mL, reduziu significativamente (P<0,05) a emergência de adultos. O efeito dose-resposta foi melhor evidenciado no ensaio com adultos, pois os isolados de B. bassiana dimimuiram a sobrevivência somente quando aplicados na concentração de 108 conídios/mL. Ambos os isolados foram eficientes no controle de C. putoria, porém o isolado JAB 07 se destacou por atuar na maioria das fases de vida do ciclo da mosca. Palavras-chave: Controle biológico, controle microbiano, fungo entomopatogênico, mosca varejeira, avicultura de postura. 38 CHAPTER 3 - SUSCEPTIBILITY OF Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae) TO THE PATHOGENIC ACTION OF THE FUNGUS Beauveria bassiana. ABSTRACT - The present study investigated, in laboratory conditions, the pathogenic action of the isolates JAB 07 and AM 9 of Beauveria bassiana, applied in the concentrations of 1x106 and 1x108 conidia/mL, in the stages of egg, L2 larvae, pupae and adult of Chrysomya putoria. In the bioassays, groups with 30 eggs, 20 pupae and 20 L2 larvae were bathed with conidia suspensions. For adults, groups of 30 flies were pulverized with 1mL of the same suspensions. All biossay were performed using four replicates per treatment and the control groups were treated with solution tween. Eggs treatment with B. bassiana showed an effect in the average pupa’s life time when submitted to 106 and 108 conidia/mL. The B. bassiana isolates applied in both concentrations promoted significant (P<0,05) mortality in C. putoria larvae treatment. The pupae bioassay with the isolate JAB 07 of B. bassiana, in the concentration of 106 and 108 conidia/mL, reduced significantly (P<0,05) the adult emergence. The dose- response effect was more evident in the adult study, because the isolates of B. bassiana decreased the survival only when applied in the concentration of 108 conidia/mL. Both of the isolates were efficient on the control of C. putoria, although JAB 07 isolate demonstrated better results by acting in most stages of the fly’s cycle. Key words: Biological control, microbial control, entomopathogenic fungus, blowfly, poultry. 39 1. INTRODUÇÃO No confinamento de animais domésticos, especialmente em aviários de postura, existe uma produção significativa de esterco, que atua como substrato para o desenvolvimento de inúmeras espécies de artrópodes, principalmente moscas sinantrópicas. Dentre os dípteros sinantrópicos, destacam-se as moscas do gênero Chrysomya, causando prejuízos econômicos diretos e indiretos para o avicultor, pois os ovos são freqüentemente contaminados por estes dípteros (AXTELL, 1999), além de constituírem uma ameaça à saúde pública, pois veiculam agentes etiológicos de enfermidades como enteroviroses, enterobacterioses, oocistos de protozoários e ovos de helmintos (CABRAL et al., 2007). As espécies de Chrysomya apresentam grande capacidade de adaptação a diferentes tipos de ambientes e notável habilidade competitiva, capaz de deslocar espécies nativas (MARCHIORI et.al., 2000). Atualmente a alternativa de controle mais utilizada em aviários são os inseticidas químicos, resultando em vários efeitos negativos ao ambiente. A mídia, a facilidade de aquisição, e também os efeitos obtidos, quase que imediatos, colaboraram para a utilização indiscriminada e descontrolada de tais produtos, gerando desequilíbrio, pois o complexo biótico da natureza pode ser alterado, afetando plantas, animais e o próprio homem. O uso de fungos entomopatogênicos como bioinseticidas já vem sendo praticado a alguns anos a partir de populações naturais e melhoradas (ALVES,1998). Estes microorganismos ocorrem naturalmente em mais de 300 espécies de insetos, em seus vários estágios de desenvolvimento, ocupando um lugar relevante na manutenção do equilíbrio ecológico. De acordo com ALVES (1998), os fungos entomopatogênicos englobam cerca de 90 gêneros e 700 espécies, estando Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces entre os mais comumente utilizados no controle de pragas. Na literatura encontram-se vários trabalhos sobre a atividade do fungo B. bassiana em diversas espécies de dípteros como mosca-branca, Bemisia argentifolii (WRAIGHT et al., 1998), Ceratitis capitata (KONSTANTOPOULOU e MAZOMENOS, 2005; DIMBI et al., 2003), Haematobia irritans (LOHMEYER e MILLER, 2006; ANGEL- 40 SAHAGÚN et al., 2005), Cochliomya macellaria (MACIEL et al., 2005), Stomoxys calcitrans (WATSON et al, 1995), sendo Musca domestica a mais estudada (LECUONA et al., 2005; WATSON et al., 1996; SIRI et al., 2005; BERNARDI et al., 2006). Em um estudo de campo, KAUFMAN et al. (2005) verificaram que a aplicação de B. bassiana resultou em controle mais eficaz de moscas de aviário quando comparado ao tratamento com inseticida à base de piretróides. Neste contexto, evidenciando a necessidade de estudos alternativos de controle e o grande potencial do fungo entomopatogênico B. bassiana como um possível agente controlador de diversas espécies de moscas, o presente estudo investigou, em condições de laboratório, a patogenicidade dos isolados JAB 07 e AM 9 do fungo B. bassiana, aplicado nas concentrações de 1x106 e 1x108 conídios/mL, nos estágios de ovo, larva (L2), pupa e adulto de C. putoria. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Fungo Foram utilizados os isolados AM 9 e JAB 07 de B. bassiana, pertencentes à coleção do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Produção Vegetal da FCAV/Unesp. Os isolados foram mantidos em tubos de ensaio contendo 5 mL de meio BDA (batata, dextrose e ágar) inclinado, estocados a 4ºC. Para utilização nos ensaios foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA, acondicionadas em estufa a 27 ± 0,5ºC, durante 15 dias, com ausência de iluminação. A viabilidade dos isolados foram conduzidos seguindo metodologia descrita por MARQUES et al.(2004). Nos ensaios de ovo, larva, pupa e adulto os resultados observados de viabilidade foram respectivamente, de: AM 09 (98, 95, 90 e 95%), JAB 07 (98, 94, 98 e 98%). Para a produção dos inóculos, os esporos da parte superficial de colônias jovens do fungo foram transferidos, para tubos contendo 20 mL de solução Tween 80® (0,1% v/v) esterilizada. Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos, as suspensões 41 foram padronizadas em 1 x 106 e 1 x 108 conídios/mL, com auxílio da câmara de Neubauer. 2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria. Amostras de excrementos contendo larvas de C. putoria, coletadas em aviários de galinhas de postura, pertencentes a FCAV/Unesp, foram acondicionadas em caixas de isopor de 15 litros (BELO, 1991) (Figura 1 do apêndice) adaptadas para implantação e manutenção da colônia utilizada durante os bioensaios com os diferentes estágios de desenvolvimento da mosca. Os adultos provenientes dessas larvas foram confinados nas caixas de isopor e para sua manutenção utilizou-se uma mistura de leite em pó e açúcar (1:1) e água destilada oferecida ad libitum em algodão saturado. A ov