0 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE BOTUCATU FACULDADE DE MEDICINA JOSÉ SIDNEY ROQUE ENXERTOS VENOSOS AO AVESSO E NORMAL, PREENCHIDOS COM PLASMA RICO EM PLAQUETAS EM NERVO MISTO DE RATO. Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu-SP para obtenção do Título de Doutor em Bases Gerais da Cirurgia Prof. Dr. FAUSTO VITERBO ORIENTADOR BOTUCATU 2007 1 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE BOTUCATU FACULDADE DE MEDICINA JOSÉ SIDNEY ROQUE ENXERTOS VENOSOS AO AVESSO E NORMAL, PREENCHIDOS COM PLASMA RICO EM PLAQUETAS EM NERVO MISTO DE RATO. Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu-SP para obtenção do Título de Doutor em Bases Gerais da Cirurgia Prof. Dr. FAUSTO VITERBO ORIENTADOR BOTUCATU 2007 2 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP Bibliotecária responsável: Selma Maria de Jesus Roque, José Sidney. Enxertos venosos ao avesso e normal, preenchidos com plasma rico em plaquetas em nervo misto de rato / José Sidney Roque. – Botucatu : [s.n.], 2007. Isograph venous inside-out and standart filled with rich platelet plasm on mixed nerve of rat. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2007. Orientador: Fausto Viterbo Assunto CAPES: 40102017 1.Sistema nervoso periférico - Regeneração - Estudos experimentais 2. Nervos - Enxerto CDD 617.473 Palavras chave: Enxerto autólogo; Nervo ciático; Enxerto de veia jugular externa; Plasma rico em plaquetas; Ratos 3 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ JOSÉ SIDNEY ROQUE ENXERTOS VENOSOS AO AVESSO E NORMAL, PREENCHIDOS COM PLASMA RICO EM PLAQUETAS EM NERVO MISTO DE RATO. TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR BOTUCATU 2007 4 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ AGRADECIMENTOS 5 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Dedico este trabalho, Aos meus pais, José e Etelvina, razão da minha existência, que me ensinaram os valores e me mostraram o sentido da vida. À minha esposa, Fátima, minha parceira, companheira aguerrida, incentivadora em todos os momentos deste trabalho. Aos meus filhos Vinícius, Tamíris e Jéssica, meus tesouros que me impulsionam à modernidade e me ensinam a ser mais tolerante. Aos meus irmãos, Cida e Domingos, exemplos de companheirismo nos momentos difíceis de nossas vidas. Meu carinho e agradecimento 6 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Agradecimentos Especiais, Ao Prof. Dr. Jesus Carlos Andreo, pelo apoio e ombro amigo em todas as etapas no transcurso deste trabalho. Ao Prof. Dr. Antônio de Castro Rodrigues, por oferecer a condição de apreender e a inserir-me numa nova linha de pesquisa. Ao Prof. Dr. Antônio José Maria Catâneo, por confiar e permitir nosso ingresso neste conceituado curso. Ao Prof. Dr. Antônio Marcos Orsi, pelo auxílio em várias etapas deste trabalho, exemplo de professor e amigo afável. Ao Prof. Dr. Élio Hitoshi Shinohara, pelo companheirismo e atenção dispensada nos nossos pedidos. Ao Prof. Dr. Odair Francisco, pelo grande auxilio nas análises estatísticas. Ao Prof. Dr. Fausto Viterbo, pela orientação dispensada neste trabalho. Meu Eterno Agradecimento. 7 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Agradecimentos À coordenação do Programa de Pós-graduação em Cirurgia, área de Concentração em Bases Gerais da Cirurgia – Faculdade de Medicina – UNESP de Botucatu-SP, Prof. Dr. Antônio José Maria Catâneo. Aos Docentes do Programa de Pós-graduação em Cirurgia, área de Concentração em Bases Gerais da Cirurgia – Faculdade de Medicina – UNESP de Botucatu-SP Aos Funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina – UNESP de Botucatu-SP, Janete Aparecida Herculano Nunes Silva, Nathanael Pinheiro Salles, Regina Célia Spadin. À secretária do Programa de Pós-graduação em Cirurgia, área de Concentração em Bases Gerais da Cirurgia, Simone Barroso Corvino Camargo. Aos funcionários da Biblioteca da universidade Estadual Paulista – UNESP Botucatu-SP, Rosemary Cristina da Silva, A todos que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. Muito Obrigado. 8 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Sumário Resumo Abstract 1. Introdução............................................................................ 11 Considerações Gerais............................................................ 11 Indicações de cirurgia............................................................ 13 Tipos de lesões nervosas periféricas..................................... 14 Anatomia do nervo periférico................................................. 16 Lesões nervosas periféricas.................................................. 23 Fatores Neurotróficos............................................................. 25 Fatores de Crescimento do PRP........................................... 28 Plaquetas............................................................................... 30 Regeneração nervosa periférica............................................ 31 Histórico da Cirurgia dos nervos periféricos.......................... 35 2. Objetivo................................................................................ 40 3. Método.................................................................................. 42 Procedimentos cirúrgicos....................................................... 43 Sacrifício e coleta das amostras............................................ 47 Análise quantitativa e tratamento estatístico.......................... 47 Estatística Descritiva.............................................................. 48 Estatística Analítica................................................................ 48 4. Resultados........................................................................... 51 Análise macroscópica........................................................... 51 Análise histomorfológica....................................................... 52 Análise histomorfométrica..................................................... 63 5. Discussão............................................................................. 89 6. Conclusão.......................................................................... 108 7. Referências........................................................................ 110 8. Anexos................................................................................ 134 Certificados do Comitê de Ética.......................................... 135 Lista de Abreviaturas........................................................... 137 9 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ RESUMO As lesões nervosas periféricas sempre ocasionam comprometimento da sensibilidade ou da motricidade, de partes ou segmentos do organismo. Algumas lesões leves podem evoluir para a cura completa em poucas semanas, se a integridade morfológica do axônio estiver preservada. Entretanto, as lesões com perda tecidual, se não foram tratadas adequadamente, podem evoluir com prejuízos na função muscular ou na sensibilidade cutânea. Assim sendo, este trabalho teve por objetivo estudar a possível regeneração axonal do nervo ciático de rato albino (Rattus norvegicus albinus) lesado experimentalmente, através do uso de enxerto venoso ao avesso e de enxerto venoso preenchido com plasma rico em plaquetas, sob o ponto de vista histomorfológico. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (G2, G3, G4 e G5) contendo 15 animais em cada grupo e um grupo com dez animais serviu como controle (G1). Em todos os grupos o nervo ciático direito foi utilizado para estudo experimental. Os Grupos G 2, G 3, G 4 e G 5 receberam enxerto venoso da veia jugular externa, do lado esquerdo, do mesmo animal. Em todas as técnicas utilizadas, os valores médios de morfometria foram maiores no enxerto do que no coto distal. As técnicas com veias preenchidas apresentaram melhores médias aritméticas quando comparadas com as veias não preenchidas. Palavras-chave: Enxerto autólogo; Nervo ciático; Enxerto de veia jugular externa; Plasma rico em plaquetas; Ratos. 10 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ ABSTRACT Peripheral nerve lesions ever produce sensorial or motor consequences. Some lesions could have good evolution if the neural morphology integrity is preserved. Nevertheless, peripheral nerve gaps could have dramatic evolution. In the present study we tested neural regeneration of the sciatic nerve in albino laboratory rats submitted to experimental neural lesion and treatment with entubulization using venous jugular autologus grafts. Four experimental groups were used, with the vein graft replacing a sciatic gap. In two of them the veins were inverted. In a normal and inverted vein group, the veins were filled with blood plasma enriched by a pool of platelets. A “sham” group was used as control. The nerve fibers counting showed higher average in the graft stump compared to the vein graft. Both blood plasma enriched with platelets filled groups presented better results than non filled groups. Key words: Autologous graft; Sciatic nerve; External jugular vein graft; Blood plasma enriched with platelets; Rats. 11 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO 6 dias após ligadura 3 semanas Após secção 5 dias após seçção Papillary nerve of frog Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Disorganized muscular nerve 12 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Considerações Gerais As lesões nervosas periféricas sempre ocasionam comprometimento da sensibilidade e ou da motricidade. Algumas lesões leves podem evoluir para a cura completa em poucas semanas, se a integridade morfológica do axônio estiver preservada. Entretanto, as lesões com perda tecidual, se não tratadas adequadamente, podem evoluir com prejuízos na forma e ou na função do órgão alvo. As morbidades causam déficits importantes, não só da qualidade de vida dos pacientes, bem como do sistema estatal em casos de aposentadorias precoces devido à incapacidade funcional (Sunderland, 1978; Pachioni et al., 2006). Existem várias técnicas que tentam minimizar estas conseqüências, objetivando devolver a normalidade às estruturas comprometidas (Seddon, 1943; Fields et al., 1989; Sunderland, 1978; Zochodne 2.000; Schmidt & Leach, 2003). A lesão nervosa periférica mais freqüente ocorre por trauma contuso, por mísseis penetrantes ou outros objetos (Colohan, 1996). Os traumas e ressecções tumorais levam, com freqüência, a grandes perdas de tecido nervoso, impossibilitando a anastomose primária (Terzis et al., 1975). Os nervos periféricos podem ser acometidos à lesão por esmagamento, secção, em uma variedade de circunstâncias, incluindo acidentes automobilísticos, de trabalho, fraturas, luxações, ressecções tumorais e iatrogênicas. Deficiências funcionais após lesão por esmagamento não estão relacionadas apenas com o impacto do esmagamento, mas incluem componentes importantes tais como isquemia, edema e permeabilidade vascular (Lundborg et al., 1983; Pachioni et al., 2006). Diversos estudos experimentais têm demonstrado que o efeito combinado de lesão mecânica e isquemia é mais grave do que o efeito 13 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ mecânico ou isquêmico isoladamente (Schmelzer & Zochodne, 1989; Lundborg & Dahlin, 1996). Para estes casos, o enxerto de nervo é considerado tratamento de escolha. Ele une as extremidades dos cotos proximais e distais, reduzindo a tensão na linha de sutura, pode guiar o crescimento axonal (Terzis et al., 1975), e servir de ponte para a passagem de fatores neurotróficos (Lundborg et al., 1982, Mackinon & Dellon, 1990; Hentz et al., 1991; Costa et al., 2006). Muitas técnicas de tratamento para as lesões nervosas são propostas, como mostra a literatura pertinente. Pesquisas buscam soluções que permitam melhor recuperação funcional do nervo lesado. Assim, estudos são realizados nas mais variadas áreas do conhecimento científico como, a biologia molecular, auxologia, morfologia, enxertos, microcirurgia, laser de CO2, indutores de crescimento e imunosupressores (Williams et al., 1983; Becher et al., 1984; Faldini et al., 1984; Hall, 1986; Neblett et al., 1986; Fields et al., 1989; Mackinnon & Dellon, 1990; Abernethy et al., 1994; Madison & Archibald, 1994; Canpolat et al., 1999; Lundborg, 2000; Oliveira et al., 2000; Chen et al., 2001; Karacaoglu et al., 2001; Suri et al., 2002; Rummler & Gupta, 2004; Costa et al., 2006; Lee et al., 2007; Wang et al., 2007). E recentemente o uso de células tronco adultas da medula óssea associado ao plasma rico em plaquetas (PRP), com finalidade de induzir o crescimento axonal (Braga-Silva et al., 2006). Tais estudos buscam recursos e técnicas para minimizar as morbidades. Jaberi et al. (2003) afirmaram que sutura microcirurgica, término-terminal, ou término-lateral, com enxertos, deve ser indicada quando a distância (gap) entre os cotos nervosos for extensa. Relataram também que em enxertos de grande calibre, pode ocorrer atraso na vascularização, aparecimento de fibrose e até necrose em sua parte central (Jaberi et al., 2003) . Em decorrência desta constatação há atraso na revascularização e no aparecimento de fibrose “in loco” (Jaberi et al., 2003). Outra possibilidade de reparo nervoso é a sutura término-lateral, embora mostre que alguns brotos axonais não atingem o órgão alvo, ela é importante para a neurotização do músculo (Tarasidis et al., 1997; Viterbo et al., 1992; Zhao et al., 1997; Zhang 14 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ et al., 1998; Yuksel et al., 1999; Lutz et al., 2000; Yamauchi et al., 2001; Jaberi et al., 2003). Os estudos demonstraram que a intervenção cirúrgica para reparar danos nos nervos é bem sucedida, quando for realizada logo após a lesão ter ocorrido (Hupp, 2000). A compreensão sobre os vários tipos de lesão dos nervos é importante para permitir que se decida quando indicar a cirurgia de um nervo periférico lesado (Hupp, 2000). INDICAÇÕES DE CIRURGIA Em injúrias fechadas, quando após três meses de acompanhamento os estudos eletrofisiológicos não se demonstrarem retorno funcional a cirurgia é recomendada. Em injurias abertas, com laceração, a cirurgia exploratória é indicada, sempre que ocorrer perda sensitiva ou motora. Em lesões por esmagamento, o tratamento cirúrgico está indicado após algumas semanas. Entretanto, após três meses sem evidências de reinervação bioelétrica ou clínica, a cirurgia é indicada com a realização de reparos ou enxertos (Novak et al., 2004). Quando um nervo é submetido a uma pressão externa, a lesão pode ser provocada tanto pela pressão como pela isquemia. Uma isquemia acontece quando a pressão do esmagamento exceder a pressão de perfusão capilar (Schmelzer et al., 1989). TIPOS DE LESÕES NERVOSAS PERIFÉRICAS Lesões nervosas periféricas experimentais, no nervo ciático, podem ser provocadas através de diversos procedimentos, tais como: esmagamento pela compressão, transecção, estiramento e congelamento. Diversos fatores como a magnitude, a duração e o mecanismo do trauma compressivo são importantes para a determinação do grau da lesão (Diao et al., 2004). 15 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Seddon (1943) classificou as injurias nervosas em três tipos, neuropraxia, axonotmese e neurotmese. A neuropraxia é a forma leve e transitória de lesão do nervo periférico. É uma lesão temporária do nervo em que se mantém íntegra a continuidade da bainha endoneural e dos axônios. Nesta lesão não ocorre degeneração Walleriana. A neuropraxia pode ser provocada por trauma ou isquemia local do nervo. Como não houve perda na continuidade axonal, ocorre recuperação espontânea total da função nervosa, normalmente poucos dias ou semanas após a lesão. A axonotmese ocorre quando a continuidade do axônio é interrompida, mas a bainha endoneural continua intacta. Esse tipo de lesão pode ser provocada por um forte trauma fechado, esmagamento do nervo ou da tração extrema do nervo. A axonotmese provoca degeneração Walleriana no nível da lesão e no coto distal e em um ou dois nodos de Ranvier no coto proximal (Novak, et al., 2004). Como a bainha epineural continua intacta, a regeneração axonal pode ocorrer ao redor de um mm ao dia ou de uma polegada ao mês (Novak, et al., 2004), com recuperação da função do nervo entre dois a seis meses. A neurotmese é a forma mais grave de lesão do nervo. Envolve completa perda de continuidade do nervo. Pode ser provocada por fraturas com deslocamento desfavorável, rompimento do nervo por projéteis de arma de fogo ou ferimentos por arma branca. O prognóstico para recuperação espontânea para este tipo de lesão é pobre, exceto se as extremidades do nervo ficarem bem próximas e com orientação apropriada (Hupp, 2000). Posteriormente Sunderland (1951) acrescentou à classificação de Seddon (1943), mais dois tipos de lesões. Assim ter-se-ia cinco tipos de lesão nervosa descritas a seguir. A lesão tipo Sunderland I corresponderia a neuropraxia de Seddon; a Sunderland II corresponderia axonotmese de Seddon; a Sunderland III corresponderia neurotmese de Seddon; a Sunderland IV seria neurotmese com perda de continuidade do perineuro; e a lesão tipo Sunderland V seria neurotmese com perda de continuidade do epineuro. 16 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Mackinnon & Novak em 1999 descreveram a lesão do tipo VI representada por injúria nervosa mista combinando vários graus de lesões de Sunderland. Este tipo poderia apresentar alguns fascículos íntegros, com atividade normal, e outros fascículos que necessitariam intervenção cirúrgica (Mackinnon, 1989). Rummler & Gupta (2004) classificaram as injúrias nervosas em lesões agudas e crônicas. Nas lesões nervosas crônicas, tais como as síndromes dos túneis, carpal e cubital, e estenose da raiz nervosa espinhal, ocorrem dor, atrofia, e alterações sensitivas e motoras. Na fase precoce da lesão periférica crônica não aparece patologia axonal, diferentemente do que ocorre na lesão nervosa aguda (Gupta & Steward, 2003). Nestas lesões crônicas encontram-se apoptose e proliferação das células de Schwann, com um grau mínimo de patologia axonal (Gupta & Steward, 2003). O número de células de Schwann aumenta nas primeiras quatro semanas após a lesão crônica. Depois deste período o seu número diminui, porém se mantém mais alto do que no nervo sadio (Gupta et al., 2003). ANATOMIA DO NERVO PERIFÉRICO Cada nervo periférico é composto por tecido nervoso e tecido conjuntivo, ou seja, (envoltórios e células de Schwann), sendo revestido também por uma membrana conjuntiva externa, o epineuro. Esse é uma bainha flexível, de tecido conjuntivo denso não modelado, com fibras colágenas longitudinalmente orientadas e dotada de um plexo longitudinal de vasos sangüíneos (Leeson & Leeson, 1970; Bergman et al., 1996; Gartner & Hiatt, 2003). Nos nervos mielinizados cada fibra nervosa é envolvida pelo endoneuro. Grupos de fibras nervosas são envolvidos por outra membrana conjuntiva, o perineuro, formando os fascículos (Tupper et al., 1988; Novak, et al., 2004). O perineuro funciona como uma barreira semipermeável que pode apresentar uma ou mais camadas celulares que varia de acordo com a espessura do nervo (Ross & Romrel, 1993). O perineuro é constituído de 17 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ tecido conjuntivo denso e sua superfície interna é revestida por camadas de células epitelióides. Essa camada apresenta as células epitelióides ligadas por zônulas de oclusão e ligadas por uma lâmina basal que isola o ambiente neural (Gartner & Hiatt, 2003). Entre as camadas de células epitelióides existem fibras colágenas esparsas orientadas longitudinalmente e entrelaçadas com algumas poucas fibras elásticas (Leeson & Leeson, 1970; Gartner & Hiatt, 2003). O nervo periférico possui um sistema microvascular bem desenvolvido no epineuro, perineuro e endoneuro. Seus vasos encontram-se distribuídos em várias camadas do nervo e são interligados através de inúmeras anastomoses (Bell & Weddell, 1984). O sistema microvascular possui uma grande capacidade de reserva para compensar a mobilização ou lesão de vasos deste microambiente (Rempel et al., 1999; Reina et al., 2000). O suprimento sangüíneo do epineuro é relativamente rico e bem distribuído em todos os nervos (Tupper et al., 1988; Midha, 2004). No epineuro a distribuição dos vasos sangüíneos é de forma longitudinal com muitas anastomoses de vasos provindos de grandes artérias e veias perfurantes da musculatura adjacente e vasos do periósteo. Esses vasos, quando chegam ao epineuro, formam uma extensa rede de anastomoses entre arteríolas, entre vênulas, e entre arteríolas e vênulas, e se ramificam até atingirem o endoneuro (Leeson & Leeson, 1970; Bergman et al., 1996). Existem também numerosas anastomoses entre as arteríolas das bainhas, do epineuro e do perineuro, e entre os capilares do endoneuro (Bergman et al., 1996). Com os estudos sob microscopia eletrônica, observou-se que as junções das células endoteliais do epineuro aprestam aberturas variáveis que permitem passagem de macromoléculas proteícas. Diferentemente as células endoteliais do endoneuro apresentam essas junções compactas, que impedem passagem de macromoléculas de proteínas para dentro do espaço endoneural, constituindo assim barreira sangüínea nervosa (Bergman et al., 1996). A importância da vascularização dos nervos periféricos se deve ao fato dos axônios serem vulneráveis à isquemia pela grande distância que existe entre o corpo neuronal e a extensão do axônio (Reina et al., 2000). 18 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ O endoneuro é uma membrana conjuntiva, formada por fibras colágenas e reticulares, fibroblastos achatados, substância fundamental, células de Schwann, mastócitos e rede capilar endoneural (Leeson & Leeson, 1970; Bixby, et al. 1988; Bergman et al., 1996). Os axônios amielínicos estão associados em íntima relação às células de Schwann. Revestindo os axônios mielínicos em seqüência apresentam-se, a bainha de mielina, o citoplasma da célula de Schwann, a lâmina basal da célula de Schwann e as fibras colágenas do endoneuro. Esses dois últimos componentes formam a parede neural, limitando externamente a fibra nervosa em conjuntos denominados de bandas de “Bügner” (Sunderland, 1978; Lundborg, 1987; Da-Silva, 1995). Os três compartimentos morfofuncionais do neurônio são o dendrítico, o axônico e o somático. O dendrítico é muito ramificado e possui extensa superfície de membrana objetivando realizar suas conexões sinápticas e recepção de mensagens. O compartimento axônico é alongado e tem grande número de botões sinápticos, permitindo a veiculação de impulsos nervosos. O compartimento somático localiza-se entre os dois primeiros e apresenta características receptoras como os dendritos, e emissoras, como o axônio (Schuartz & De Camilli, 2000; Lent et al., 2005). Esse compartimento somático, também denominado corpo celular, contém um núcleo vesiculoso com um ou mais nucléolos evidentes. O citoplasma do corpo celular recebe o nome de pericário, termo que, às vezes, é usado como sinônimo de corpo celular (Machado, 2005). No pericário salienta-se a riqueza de ribossomos, retículo endoplasmático granular e aparelho de Golgi. Os ribossomos livres podem concentrar-se em pequenas áreas citoplasmáticas assim denominados de corpúsculo de Nissl, ou substância cromidial. Como também, os ribossomos podem aparecer aderidos às cisternas do retículo endoplasmático (Machado, 2005). No compartimento do corpo celular existe também, abundância de pequenas mitocôndrias, distribuídas por todo pericário, especialmente ao redor do corpúsculo de Nissl (Junqueira & Carneiro, 2004; Machado, 2005). Nos neurônios motores a quantidade de REG é maior que em outros neurônios (Junqueira & Carneiro, 2004). Os microtúbulos e os neurofilamentos aparecem nos três compartimentos do neurônio (Junqueira & Carneiro, 2004). 19 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Em todas as células, assim como nos neurônios, a síntese protéica é codificada no DNA nuclear, porém, somente uma parte do genoma é ativada a cada momento sob o comando de fatores de transcrição sintetizados no citosol. O neurônio expressa uma parte maior do genoma do que as outras células. Isto é, ao redor de 200 mil seqüências de RNAm, cerca de 10 a 20 vezes mais que em células renais e hepáticas (Schuartz & De Camilli, 2000; Lent et al., 2005). A intensa atividade de síntese protéica dos neurônios tem correlação com a sua microanatomia tais como ter o núcleo claro, grande e rico em eucromatina. Apresenta ainda numerosos polissomos agrupados em rosetas (grânulos de Nissl), e abundância de retículo endoplasmático rugoso, que indicam produção intensa de proteínas (Schuartz & De Camilli, 2000; Lent et al., 2005). A quantidade de retículo endoplasmático rugoso varia com o tipo e o estado funcional dos neurônios. Eles são mais abundantes nos neurônios maiores, e particularmente nos neurônios motores (Junqueira & Carneiro, 2004). Quando ocorre lesão no compartimento somático neuronal, o resultado é necrose e morte celular (Kornac & Rakic, 2001) embora haja evidências indicando ocorrência de neurogênese reativa, até mesmo ao nível do cérebro adulto (Gross, 2000; Shors et al., 2001). A grande maioria dos neurônios possui um único axônio. O axônio é um prolongamento longo e delgado que se origina do corpo celular, ou de um dendrito principal, em uma região denominada de cone de implantação (Machado, 2005). A região do cone de implantação é desprovida de corpúsculos de Nissl (Junqueira & Carneiro, 2004; Machado, 2005). Estruturalmente o axônio, na espécie humana, apresenta comprimento muito variável, podendo ter desde alguns milímetros, a mais de 1 metro (Gartner & Hiatt, 2003; Junqueira & Carneiro, 2004). Ele é cilíndrico e apresenta além da membrana plasmática, ou axolema, o citoplasma axônico, ou axoplasma (Gartner & Hiatt, 2003). Contido no interior do axoplasma encontram-se poucas organelas como retículo endoplasmático agranular, mitocôndrias, vesículas, microtúbulos de 25 nm de espessura, neurofilamentos de10 nm de espessura e microfilamentos de actina de 4 a 6 nm de espessura (Gartner & Hiatt, 2003; Junqueira & Carneiro, 2004; Machado, 2005). 20 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Os axônios não possuem ribossomos, por isso são incapazes de sintetizarem proteínas. Portanto toda proteína necessária para sua manutenção e reparação é transportada através do fluxo axoplasmático do pericário (Machado, 2005). Por outro lado, as terminações axônicas também possuem organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático agranular e microtúbulos, recebendo o nome de telodendro. Da região do telodendro existe um fluxo axoplasmático contínuo de substâncias solúveis e organelas, até a região do pericário. Também ocorre um fluxo no sentido inverso, do pericário ao telodendro (Gartner & Hiatt, 2003; Junqueira & Carneiro, 2004; Machado, 2005). Após ocorrer secção, o coto nervoso distal perde-se a comunicação com o centro trófico da célula ficando impossibilitada a manutenção de sua estrutura e integridade funcional. Este processo tem início logo após a lesão, ocorrendo desintegração do citoesqueleto axonal, envolvendo microtúbulos e neurofilamentos mediante a ação de proteases (Sunderland, 1978; Da-Silva, 1995). A bainha de mielina, no local da lesão, se fragmenta e é fagocitada, principalmente por ação dos macrófagos e pelas células de Schwann (Fernadez-Valle et al., 1995). Para realizar a reparação do axônio, há o endereçamento de organelas e macromoléculas para a área lesada, o qual é um processo especializado denominado de fluxo axoplasmático (Burack et al., 2000; Rubio, 2000). O fluxo axoplasmático apresenta dois sentidos, o anterógrado, acessando do soma para os terminais pré-sinápticos, ou retrógrado, que ocorre no sentido inverso. O fluxo axoplasmático apresenta também velocidades distintas sendo o fluxo lento menor de que 100 mm/dia. O fluxo rápido é de 100 a 400 mm/dia, porém em ambos os tipos de fluxos, os mesmos motores moleculares estão envolvidos (Shea & Flanagan, 2001; Shah & Cleveland, 2002). Como afirma Machado (2005), o fluxo axoplasmático rápido representa o transporte de organelas delimitadas por membranas como mitocôndrias, vesículas e elementos do retículo endoplasmático granular. Já o fluxo axoplasmático lento transporta proteínas do citoesqueleto e proteínas do pericário para o telodendro (Bergman et al., 1996). As proteínas e organelas produzidas no corpo celular são movimentadas ao longo do eixo do axônio através de um sistema de 21 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ transporte mediadas por cinesinas e pelos trilhos formados pelos componentes do citoesqueleto axonal (Peters et al., 1991). A transmissão do impulso nervoso, bem como o transporte axonal, requer um suprimento de energia contínuo proporcionado pelos microvasos intraneurais (Lundborg & Dahlin, 1996; Rempel et al., 1999). Materiais exógenos à célula, como os endocitados em regiões distais do axônio compreendem, fatores neurotróficos ou partículas virais, seguem para o corpo celular por transporte retrógrado (Lent et al., 2005). Este tipo de transporte retrógrado é muito importante para a reciclagem de proteínas intra-axonais, neurotransmissores e materiais exógenos (Bergman et al., 1996; Gartner & Hiatt, 2003; Junqueira & Carneiro, 2004; Lent et al., 2005; Machado, 2005). O fluxo axonal rápido ocorre nos dois sentidos, anterógrado e retrógrado, porém o fluxo axonal lento só ocorre no sentido anterógrado (Bergman et al., 1996). As fibras nervosas representam de 25% a 75% da área total de um corte transversal, do nervo, conforme o nervo estudado e sua localização (Gibbels, 1989; Bergman et al.,1996). Nos nervos que apresentam pequenos fascículos a proporção de estroma conjuntivo é grande. Esse estroma confere resistência e elasticidade aos fascículos nervosos (Ross & Romrel, 1993; Bergman et al., 1996). Eles podem ser mielinizados ou amielinizados. O diâmetro das fibras do nervo mielinizado varia de 2 μm a 25 μm, enquanto as fibras do nervo amielínico variam de 0,2 μm a 3,0 μm de diâmetro (Gibbels, 1989; Bergman et al., 1996). As fibras nervosas podem ser classificadas conforme seu diâmetro em três tipos A, B e C (Bergman et al., 1996). As fibras nervosas do tipo A são subdivididas em A� com diâmetro de 12-22 �m; A�, 5-12 �m; A�, 2-8 �m e A�, 1-5 �m e todas apresentam bainha de mielina. As fibras nervosas do tipo B possuem diâmetro menor que 3 �m e, também apresentam bainha de mielina. Nas fibras nervosas do tipo C o diâmetro varia de 0,1-3 �m, mas não apresentam bainha de mielina (Bergman et al.,1996). As fibras nervosas dos tipos A� e A� apresentam velocidade de condução de 70-120 m/seg, as dos tipos A� de 15-30 m/seg, as do tipo A� de 5-30 m/seg. Entretanto algumas fibras nervosas do tipo A� pode apresentar velocidade de 30-70 m/seg. As fibras do tipo B possuem velocidade de 3-15 m/seg, 22 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ enquanto as fibras do tipo C apresentam velocidade ao redor de 0,6-2 m/seg (Bergman et al.,1996; Gartner & Hiatt, 2003). Grupos de fibras nervosas formam “bandas”, que são denominados de fascículos. O perineuro reveste cada fascículo, o qual é composto por muitas fibras nervosas. O perineuro é delgado, sendo a menor membrana envoltória capaz de permitir sutura. O diâmetro dos fascículos varia de 0,04 mm a 3 mm (Sunderland, 1951). Os fascículos podem estar distribuídos individualmente ou em grupos, o que é característico, dos nervos longos (Midha, 2004). Os nervos periféricos são classificados em monofasciculares, oligofasciculares ou polifasciculares (Urbaniak, 1982; Millesi, 1991). Os nervos monofasciculares são encontrados nos ramos dos nervos digitais e são compostos de um grande fascículo, contendo muitas fibras nervosas. Estes nervos normalmente possuem funções exclusivas, sensitiva ou motora. Os oligofasciculares, tendo como exemplo, o nervo ulnar acima do cotovelo, apresentam poucos fascículos e cada um pode ser puro, misto, ou com ambas as funções, sensitiva e motora. Já os nervos polifasciculares são compostos por muitos fascículos pequenos. A porção superior do nervo radial do braço é um exemplo deste tipo de nervo, contendo fibras que realizam ambas as funções neuronais: sensitiva e motora. Entretanto, a anatomia pode mudar em um mesmo nervo. Assim o nervo ulnar é classificado como polifascicular na região da axila e monofascicular ao nível mão (Wilgis, 1991; Midha, 2004). LESÃO NERVOSA PERIFÉRICA Nos traumatismos nervosos periféricos a lesão mais comum é por trauma contundente por objetos penetrantes, como projéteis de arma de fogo, vidro e lâminas de metal (Colohan et al., 1996). Nos membros superiores as injúrias por arma de fogo resultam em 50% de transecção completa do nervo (Ristic et al., 2000). Nestes tipos de lesão, quando o ferimento apresentar-se limpo, é indicado o reparo primário do nervo periférico imediatamente após o trauma (Colohan et al.,1996). 23 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Quando a lesão nervosa está associada a traumas como fraturas e fraturas-luxações, que atingem partes do corpo que apresentam grande mobilidade como os membros, os danos no tecido nervoso são mais intensos (Ferreira et al., 1974; Visser et al., 1999; Cornwall & Radomisli et al., 2000; Garg et al., 2000). A formação de hematoma na região do trauma aumenta em até 4,4 vezes a probabilidade de dano ao tecido nervoso (Visser et al., 1999). As lesões por luxação, que podem ocorrer no joelho, no quadril e no ombro, resultam em trauma do nervo por estiramento (Colohan et al.,1996; Visser et al., 1999; Garg et al., 2000). Grant et al. (1999) descreveram que nervo suporta estiramento de cerca de 10% a 20% do seu comprimento, até ocorrer dano estrutural. A etiologia das lesões nervosas periféricas, em fraturas fechadas no antebraço, pode ser de origem iatrogênica, ou por trauma, em cerca de 1% a 10% dos casos (Ristic et al., 2000). A secção completa de um nervo divide o axônio em dois segmentos, um segmento proximal que se mantém em contato com o corpo celular, e outro segmento distal, que é separado do restante da célula. Com a lesão, forma-se um espaço intersegmentar, que pode apresentar dimensões variáveis (Da-Silva, 1995). O extravasamento do plasma sangüíneo precede a formação de uma matriz disposta entre os dois segmentos, a qual é composta de fibrina e fibronectina. A matriz irá atuar como um substrato adequado para a migração celular de novos prolongamentos neuronais (Fields, et al.,1989; Mathews & Ffrenchconstant, 1995). Muitos macrófagos invadem a região lesionada (Perry et al., 1987), provenientes dos cotos proximal e distal. Ocorre ainda proliferação de fibroblastos, células endoteliais e células de Schwann, que migram para o espaço intersegmentar sobre a matriz de fibrina (Williams et al., 1983). Na região de recuperação neuronal as células de Schwann tornam-se fusiformes e, através da união de suas unidades, que passam a formar cordões lineares, são denominados bandas de Bügner (Cajal, 1991; Da-Silva, 1995). Ao mesmo tempo os fibroblastos iniciam a produção de colágeno ao redor das células de Schwann, constituindo uma ponte intersegmentar tendo capilares, fibras colágenas e macrófagos (Lundborg, 1987). 24 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ FATORES NEUROTRÓFICOS Os fatores de crescimento foram descritos pela primeira vez em experimentos, quando células de mamíferos foram cultivadas em coágulos sangüíneos (Alberts et al., 1997). Depois de muitos anos, o cultivo de células in vitro só foi possível quando os pesquisadores adicionaram ao meio de cultura o soro sangüíneo. Esse soro, que permanece fluído após a coagulação do sangue, fornece proteínas altamente específicas, denominadas fatores de crescimento (Alberts et al., 1997). A proliferação das células depende de uma combinação específica de diferentes fatores de crescimento. Portanto, um número pequeno de famílias de fatores de crescimento pode ser suficiente para modular a proliferação celular (Alberts et al., 1997). Alguns fatores de crescimento apresentam especificidade restrita, enquanto outros possuem ampla especificidade como os fatores de crescimento derivado das plaquetas (PDGF). Esse fator (PDGF) pode atuar em fibroblastos, células musculares lisas e células neurogliais (Alberts et al., 1997). Inicialmente os fatores de crescimento foram considerados agentes que atuavam sistemicamente, porém evidências recentes mostraram que eles agem como reguladores ou mediadores locais (Canalis et al., 1988). Compreendem um grupo heterogêneo de polipeptídeos que atuam em receptores específicos, modulando o desenvolvimento e a manutenção dos neurônios (Walsh, 1995; Yuen & Mobley, 1995). Inicialmente, os fatores de crescimento foram nomeados por atuarem em células alvo, ou por se originarem de certas células. Devido a esta 25 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ classificação, freqüentemente os resultados de ação dos fatores neuronais não espelham seus nomes (Rudkin & Miller, 1996). Como resultado daquela classificação, às vezes a descrição não é tão adequada quanto os nomes dados, pois os fatores de crescimento de fibroblastos (FGF) também são um potente fator de crescimento angiogênico. Portanto, a ação de cada fator de crescimento é complexa e cada fator pode ter diferentes efeitos em diferentes tecidos, e também os fatores de crescimento podem interagir com outros fatores (Hom & Maisel, 1992). Os fatores de crescimento foram divididos em duas categorias: fator de crescimento angiogênico e fator BMP (Bone Morphogenetic Protein). As quatro famílias de fatores de crescimento angiogênico incluem: 1) fator de crescimento epidermal (EGF), (2) fator de crescimento fibroblástico (FGF), (3) fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e (4) fator transformador de crescimento (TGF) (Rudkin & Miller, 1996). Wang et al. (2007) sugerem que o fator BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein) estimula as células a produzirem neurofilamentos, melhorando assim a regeneração nervosa periférica. Recentemente muitos animais estudados permitiram sinalizar que ambos os fatores de crescimento dos fibroblastos, ácido e básico, estimulam a regeneração do nervo periférico (Danielsen et al., 1988; Aebischer et al., 1989; Cordeiro et al., 1989). O fator de crescimento derivado de plaquetas atua como um potente agente mitogênico de células mesenquimais, incluindo os fibroblastos e células musculares lisas, bem como promove a quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos para o local da lesão (Hudson-Goodman, et al.,1990). Assim estimula em vivo, a formação de colágeno e matriz tecidual (Grotendorst et al., 1985). Após a lesão, o coto proximal reinicia o processo de crescimento, sendo estimulado pela secreção de fatores tróficos produzidos pelos gliócitos (célula Schwann), que fornecem também apoio mecânico e químico para o crescimento ordenado do axônio. A chegada de células do sistema imunológico contribui com a secreção de citocinas e outros fatores 26 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ que favorecem o processo de reparação neuronal (Villegas-Perez et al., 1988; Carter et al., 1998). Com a formação do cone de crescimento na extremidade do coto nervoso proximal, aumenta a transcrição e a tradução gênica para os elementos relacionados à regeneração, como receptores de fatores tróficos, moléculas do citoesqueleto e componentes da membrana plasmática (Da- Silva, 1995; Walsh, 1995; Yuen & Mobley, 1995; Lent et al., 2005). As citocinas (IL-1, -2 e -6, TGB-�, IFN-�) e os fatores neurotróficos (NGF, BDNF, NT-3, FGF� e PDGF) são essenciais nesse momento, pois estimulam a multiplicação de gliócitos e favorecem o crescimento do axônio (Villegas- Perez et al., 1988; Meyer et al., 1992; Carter et al., 1998). O padrão de expressão de fatores tróficos, em nervos em degeneração, é distinto do encontrado em nervos intactos (Friedman et al., 1992; Sendtner et al., 1992; Curtis et al., 1994; Friedman et al., 1995). Os RNAms para NGF, BNDF e NT-4/5, se expressam em quantidades pequenas em nervos intactos, entretanto tem um aumento considerável em nervos em degeneração após o decurso de duas semanas do trauma (Heuman et al., 1987; Funakoshi et al., 1993). O nível de RNAm para NGF aumenta rapidamente depois da secção do nervo ciático, decrescendo no terceiro dia após a lesão, e mantendo-se estável por até duas semanas (Heuman et al., 1987; Date et al., 1994). Contudo, o nível de RNAm para BDNF aparece apenas no terceiro dia, após a lesão do nervo, aumentando e estabilizando na segunda semana do trauma (Meyer et al., 1992). Outro fator responsável pela elevação da expressão de RNAm para NGF é a citocina interleucina 1 (IL-1), secretada por macrófagos que invadem o segmento nervoso em degeneração (Heuman et al., 1987; Brown et al., 1991; Da-Silva, 1995; Hopkins & Rockwell, 1995; Otten & Cadient, 1995). O aumento do RNAm para BDNF é dependente da alteração da atividade elétrica no nervo em regeneração. O seu aumento coincide com a perda da capacidade de conduzir potenciais de ação nos axônios em degeneração (Friedman et al., 1995). A diminuição do padrão temporal coincide com a expressão de RNAm para CNTF e para a proteína relacionada à mielina P0, indicando sobreposição de mecanismos que 27 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ regulam a manutenção de proteínas da mielina bem como da concentração de CNTF (Da-Silva, 1995; Friedman et al., 1995). Autores como Meyer et al. (1992); Funakoshi et al. (1993); Rudkin & Miller (1996) e Fu & Gordon (1997), procuraram evidenciar substâncias que poderiam atuar na sobrevivência dos axônios em regeneração, via células não neurais. Substâncias neurotróficas, como neurotrofina NT-4/5, interleucina IL-1, CNTF (ciliary neurotrophic factor), BNDF (brain-derived neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor) e PDGF (platelet-derived growth factor) estariam localizadas na interface entre a lâmina basal e a membrana celular das células de Schwann (Martini et al., 1988; Meyer et al., 1992). Graves & Cochran (1994) afirmaram que os fatores de crescimento são modificadores biológicos naturais que regulam os fenômenos do reparo tecidual, tais como síntese de DNA, quimiotaxia de células, diferenciação e síntese de matriz intersticial. FATORES DE CRESCIMENTO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto autógeno, derivado do sangue e é obtido por processo laboratorial. Colhido em período pré-operatório, é rico em fatores de crescimento, que provém dos grânulos � plaquetários (Lynch et al., 1991). A obtenção do PRP é realizada em duas etapas após a colheita do sangue venoso periférico. Na primeira etapa centrifuga-se o sangue por um tempo de dez minutos utilizando-se a força de centrifugação de 300 gramas. E na segunda etapa usa-se também o tempo de dez minutos, porém com a força de centrifugação de 660 gramas (Vendramin et al., 2006). Com este protocolo obtêm-se uma concentração média de plaquetas em torno de 4,96 (± 0,36) vezes superior ao da amostra do sangue (Vendramin et al., 2006; Wilson et al., 2006). Este composto também é denominado de plasma autógeno de plaquetas, plasma enriquecido com plaquetas, plasma rico em fatores de crescimento, concentrado de plaquetas ou gel de plaquetas (Lynch et al., 1991; Whitmam, 1997; Marx et al., 1998; Anitua, 1999; Wilson et al., 2006). 28 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ O plasma rico em plaquetas é um produto orgânico, atóxico, desprovido de ação imunorreativa, usado para acelerar as fases do processo do reparo tecidual em feridas cirúrgicas (Lynch et al., 1991; Marx et al. 1998; Anitua, 1999). Os vários fatores de crescimento presentes em seus grânulos � abreviam os tempos das fases da reparação tissular (Howel et al., 1997; Whitmam, 1997). Os fatores de crescimento presentes no PRP são polipeptídeos da classe de mediadores biológicos naturais, que exercem efeitos sobre o reparo e a regeneração tecidual (Giannobile et al., 1996). Esses fatores também regulam eventos celulares, que melhoram a regeneração tecidual (Giannobile et al., 1996). O plasma rico em plaquetas (PRP) é bastante estudado na odontologia, sendo empregado em pequenos enxertos ósseos na região dos alvéolos dentais para futuros implantes dentários e em cirurgias periodontais e maxilo-faciais (Whitman & Berry, 1998; Anitua, 2001; Lozada et al., 2001; Marx, 2004; Oyama et al., 2004; Vendramin et al., 2006). O uso em medicina começa a difundir-se nas áreas de ortopedia, cirurgia plástica e neurocirurgia onde apresentaram bons resultados (Linkhart et al., 1996; Man et al., 2001; Bhanot & Alex, 2002; Freymiler & Aghaloo, 2004; Mazzucco et al., 2004; Uebel et al., 2006; Vendramin et al., 2006). Nas especialidades médicas (cirurgia plástica e otorrinolaringologia) e em odontologia é usado para produzir hemostasia, estimular a cicatrização de tecidos moles e o osso, bem como na adesão de enxertos de pele e integração de enxertos ósseos (Marx et al., 1998; Buckley et al., 1999; Zechner et al., 2003; Uebel et al., 2006; Wilson et al., 2006). As plaquetas liberam diversos fatores de crescimento que estimulam a angiogênese, promovendo crescimento vascular e proliferação de fibroblastos com aumento da síntese de colágeno (Green & Klink, 1998; Henderson et al., 2003; Marx, 2004; Vendramin et al., 2006). Foram identificados pelo menos sete diferentes fatores de crescimento secretados ativamente pelas plaquetas que atuam na fase inicial da cicatrização. São três isômeros do fator de crescimento plaquetário, PDGF��, PDGF�� e PDGF��, dois fatores de crescimento transformadores, TGF�1 e TGF�2, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento 29 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ epitelial (EGF) (Green & Klink, 1998; Robson, 1997; Freymiler & Aghaloo, 2004; Marx, 2004; Vendramin et al., 2006). Os PDGF, associados ou não com os TGF, aumentam a vascularização tissular, estimulando a produção de tecido de granulação (Knox et al., 1986; Vendramin et al., 2006). O PRP possui também proteínas como a fibrina, fibronectina e vitronectina, importantes na adesão celular, favorecendo o processo de reparo tecidual (Knox et al., 1986; Sandy et al., 1998; Marx et al., 2004). PLAQUETAS As plaquetas são pequenos fragmentos celulares, anucleados, discóides, derivados dos megacariócitos da medula óssea vermelha. O tamanho das plaquetas varia de 2 a 4 �m de diâmetro, nos esfregaços de sangue (Gartner & Hiatt, 2003). As plaquetas existem em torno de 200.000 a 400.000 unidades por microlitro cúbico de sangue, e esses fragmentos celulares vivem aproximadamente de 10 a 14 dias (Gartner & Hiatt, 2003; Junqueira & Carneiro, 2004). Ao microscópio óptico as plaquetas mostram uma região clara na periferia, chamada hialômero, e uma região central mais escura, o granulômero (Gartner & Hiatt, 2003). Estudos específicos do PRP identificaram os três principais fatores de crescimento liberados pelos grânulos � plaquetários: fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento similar à insulina (IGF-I) e fator transformador de crescimento beta (TGF-�) (Lynch, et al., 1991; Ganio, et al.,1993; Anitua, 1999; Marx, 1999). REGENERAÇÃO NERVOSA PERIFÉRICA A regeneração nervosa depende do grau da lesão, da distância entre os cotos nervosos, bem como da perda, ou não, de tecido nervoso. Nas neurotmeses severas é fundamental a preservação no entanto da membrana basal, quanto do endoneuro, para melhorar a regeneração 30 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ axonal. Isso porque aqueles servem como guia para os neuritos em crescimento (Ide et al., 1983). Hall (1997) mostrou em roedores que distâncias superiores a dois centímetros necessitam de tratamento cirúrgico, com a utilização de algum tipo de material para direcionar os neuritos para o coto distal. Nesta mesma linha de raciocínio, Mackinnon & Dellon (1990) concluíram que distâncias acima de um centímetro em roedores e três centímetros em primatas necessitam técnicas com condutos para orientar a reparação tecidual nervosa. Por outro lado Seckel et al. (1986) afirmaram que pequenas distâncias entre os cotos da ordem de um a três centímetros, podem ser reparados sem necessidade de enxerto autógeno de nervo. Neste caso, promove-se somente uma regeneração tecidual guiada. Biomateriais e materiais aloplásticos foram propostos para o favorecimento dos brotos axonais, como o uso de tubos de politetrafluoroetileno (Ruskin, et al., 1990), ácido poliglicólico (Mackinnon & Dellon, 1990), e colágeno com gel de laminina (Colin, et al., 1984; Eppley et al., 1988; Dourado et al., 2001). Todavia, Walton et al. (1989) e Chiu & Strauch (1990) propuseram a utilização de tecidos autógenos como os enxertos venosos, com o intuito de prevenir a formação de cicatrizes dentro da área em regeneração. Waller (1850) estudando nervos de sapos, com microscópio óptico, foi o pioneiro na descrição da degeneração neuronal, logo após a secção nervosa. Até esta época pouco se sabia sobre a degeneração nervosa, e por isso, este fenômeno recebeu o seu nome, degeneração Walleriana. Quando ocorre a degeneração Walleriana vários eventos ocorrem no axônio como, alterações no citoesqueleto, nas células de Schwann, na bainha de mielina e quebra nas barreiras hemato-nervosas com resposta mediada pelos macrófagos (Donat & Wisniewky, 1973; Malbouisson et al., 1984). A cicatrização do nervo obedece normalmente duas fases, degeneração Walleriana ou desmielinização segmentar e regeneração. Na degeneração por desmielinização segmentar ocorre a dissolução da bainha de mielina, em segmentos isolados. Essa desmielinização parcial causa a 31 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ diminuição na velocidade de condução nervosa e pode impedir a transmissão de alguns impulsos nervosos. A desmielinização segmentar pode ocorrer após lesões neuropráxicas, ou com distúrbios dos tecidos vascular e conjuntivo (Waller, 1850; Hupp, 2000). A degeneração Walleriana ocorre após trauma no nervo, onde o axônio e a bainha de mielina do coto distal desintegram-se totalmente. No coto proximal, no local da lesão, também ocorre degeneração, e às vezes em todo o corpo axonal, ou em alguns nodos de Ranvier. A degeneração Walleriana bloqueia toda a condução entre os cotos proximal e distal (Lent et al., 2005). A degeneração Walleriana dos axônios isolados e das bainhas de mielina dos nervos periféricos lesados é pré-requisito para se estabelecer um meio de desenvolvimento adequado à regeneração dos axônios (Fu & Gordon, 1997). Após a lesão nervosa ocorrer, num período de duas a três semanas, todos os axônios e bainhas de mielina do coto distal se desintegram e os remanescentes são geralmente removidos, via recrutamento de células mielomonocíticas. As células de Schwann se dividem e começam a alinhar-se em cordões celulares dispostos junto aos tubos da lâmina basal persistente, formando as bandas de Bügner (Griffin et al., 1993). A regeneração de um nervo periférico pode começar quase imediatamente após a lesão. Normalmente, o coto proximal forma um grupo de novas fibras, denominadas de cone de crescimento, sendo que as neo- fibras crescem em direção ao canal remanescente das células de Schwann. O crescimento progride em média de 1 a 1,5 mm por dia e continua até que o local inervado seja alcançado, ou que tenha o seu crescimento bloqueado por fibras de tecido conjuntivo frouxo ou por osso (Midha et al., 2004). Durante a regeneração, novas bainhas de mielina podem se formar, e o axônio pode aumentar de diâmetro. Como são feitos contatos funcionais, o paciente sentirá sensações alteradas na área de sensibilidade lesada, as quais assumem a forma de parestesia ou de disestesia. Durante a regeneração, podem ocorrer problemas que impedem a cicatrização normal do nervo. Assim a continuidade do canal de células de Schwann pode estar rompida, e o tecido conjuntivo pode entrar no canal enquanto este está parcialmente vazio. Quando o cone de crescimento 32 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ alcança a obstrução do tecido conjuntivo, pode encontrar um caminho ao redor do cone e continuar, ou pode formar-se uma massa de fibras nervosas sem função constituindo-se um neuroma traumático, sujeito à produção de dor quando estimulado (Hupp, 2000; Lent et al., 2005). Terzis et al. (1975) afirmaram que uma das principais razões do fracasso no reparo do nervo periférico pós-trauma, está na tensão produzida na linha de sutura, prejudicando a neo-vascularização. Várias técnicas, e emprego de biomateriais e materiais não biológicos, têm sido estudados como prováveis soluções para o reparo de nervos periféricos, destacando-se o uso de transferência de nervos (Mackinnon & Novak, 1999), tubos colágeno, enxerto de artérias e veias, e de músculos, moléculas de adesão celular, tubos de silicone e polietileno (Fields et al., 1989). Ademais o uso de conduto bioartificial, parece adequado já que pode ser manipulado antes do enxerto. Como, por exemplo, citam-se as esteiras de fibronectina, preenchidas com fatores neurotróficos ou as esponjas hidrofílicas infiltradas com células de Schwann (Plant et al., 1995) e ou com fascículos nervosos (Scharpf et al., 2003). Walton et al. (1989) concordaram que a utilização de enxertos venosos pode ser útil apenas em secções nervosas de reduzido tamanho e em nervos monofasciculados. Porém, Wang et al. (1993) observaram em nervos mistos e principalmente em nervos motores, como o nervo ciático, que após enxerto venoso, ocorre uma grande melhora na capacidade regenerativa das fibras nervosas. Esta melhora na capacidade regenerativa neuronal seria explicada pela presença da laminina (Buettner & Pittman, 1991) e ao colágeno (Woolford & Toriumi,1995), componentes das túnicas média e externa das veias (Lander et al., 1985; Valentini et al., 1987). Ferrari et al. (1999) observaram que o enxerto venoso ao avesso, usado com a exposição da túnica adventícia em contato íntimo com os axônios seccionados do nervo safeno, torna-se um bom conduto de regeneração, pois expõe fatores tróficos como colágeno, laminina e fiobronectina (Withworth et al., 1996) em proporções ideais. Neste caso oferece um microambiente favorável à regeneração axonal. Na camada adventícia dos vasos sangüíneos, abaixo da membrana basal estão presentes o colágeno tipo IV, a laminina, a 33 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ fibronectina, a elastina e as microfibrilas associadas (Packhan & Mustard, 1984). Afirmaram outros autores ser a laminina e o colágeno IV os principais componentes desta membrana endotelial (Grant & Kleinman, 1997), a qual possui uma lâmina basal rica em laminina e, a sua camada média muscular também rica em laminina. A adventícia por sua vez é muito rica em colágeno estrutural (Ferrari et al., 1999). Histórico da Cirurgia dos Nervos Periféricos Paul of Aegina (625-690) foi o primeiro a descrever a aproximação de feridas nervosas (apud Davis). Em 1850, Waller descreveu o processo da degeneração nervosa periférica em sapos. Philipeaux & Vulpein (1870) realizaram enxertos nervosos em cães, transplantando segmento de nervo óptico para o nervo hipoglosso entre um animal e outro, contudo não obtiveram sucesso. Em 1870 esses mesmos autores publicaram outro trabalho com o uso de enxerto autólogo, em cães, e obtiveram pequeno sucesso (Dourado et al., 2001). Hueter (1871 - 1873) (apud Davis) introduziu e estudou o conceito primitivo da sutura epineural. Esta técnica, modificada, refinada, e aperfeiçoada, é utilizada desde então até a atualidade. Nelaton (1864) descreveu a reparação nervosa secundária, sendo esta realizada algumas semanas após o trauma, segundo Novak et al. (2004). Em 1872 Letievant (apud Davis, 1934) foi um dos primeiros autores a descrever a anatomia da porção distal e proximal de um nervo. Albert (1876 - 1878) descreveu o uso clínico do enxerto nervoso, que foi raramente usado até Seddon (1943) iniciar a sua técnica de enxerto com a utilização de nervos cutâneos sensitivos transpostos a troncos nervosos maiores. Desde Milkulicz (1882) a idéia de tração nervosa começa a ser descrita. Loebke (1884) descreveu o encurtamento ósseo em apêndices locomotores para evitar a tração de nervos periféricos lesados em grandes segmentos (Novack, 2004). Balance et al. (1903) descreveram a neurorrafia término-lateral para paralisia do nervo facial, com incisão no nervo doador. Viterbo et al. (1992) introduziram a neurorrafia término-lateral sem lesão no 34 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ nervo doador permitindo, portanto, que qualquer nervo possa servir como doador sem prejuízos ao mesmo ou às estruturas por ele inervadas. Babcock (1927) preconizou o uso de três técnicas para o tratamento de lesões dos nervos periféricos: sutura direta, enxerto nervoso e neurólise. Na década de 40, Young & Medawar (1940) foram os primeiros a publicar trabalho experimental em cão, usando adesivo biológico (cola de fibrina). Naquela época, os estudos de Seddon (1943 e 1947) com enxertos, também tiveram bons resultados. Edshage (1964) demonstrou que a sutura epineural podia causar deslocamento dos fascículos neuronais, apesar de sua boa coaptação. Bora (1967) realizou sutura interfascicular em nervos de gatos, também com bons resultados. Brown (1972) afirmou que os principais fatores que influem na regeneração nervosa são a idade do paciente, a extensão da lesão (gap), a formação de neuromas, os fatores neurotróficos e a técnica empregada para a reparação. Sunderland (1979) após vários estudos da anatomia interna dos nervos recomendou o uso de sutura individual dos fascículos. Millesi et al. (1972) afirmaram que a sutura interfascicular pode aumentar o volume de tecido conjuntivo (perineuro), provocando tensão na área da anastomose e prejudicando o suprimento vascular do nervo (Rodrigues, 1990). Dentro daquela mesma linha de raciocínio Terzis et al. (1975) e Sunderland (1978) preconizaram evitar tensão na área da sutura, visando prevenir a isquemia e a fibrose. A reparação de lesões nervosas periféricas pode ser primária ou secundária. Sempre que possível e as condições locais e gerais permitirem, deverá ser realizada imediatamente (primária) a fim de evitar a retração do nervo. Já a reparação secundária, ou seja, realizada após algumas semanas, estará indicada quando não se conhece com exatidão os danos causados ao nervo e suas estruturas, podendo indicar-se a utilização de enxertos nervosos (Grabb, 1970; Brown, 1972; Tupper et al., 1988). Hems & Glasby (1992) preconizaram que em lesões limpas, em que ocorreu secção de nervo por arma branca ou vidro, se houver condições técnicas apropriadas, a sutura deverá ser realizada dentro das 35 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ primeiras vinte e quatro horas. Nesta fase os tubos endoneurais são de tamanho normal e a anastomose pode ser realizada sem tensão (Rodrigues et al., 1990). A neurorrafia término-terminal apresenta prognóstico favorável, porque não há retração e nem necessidade de interposição de enxerto. Este reparo nervoso primário é vantajoso nas lesões do plexo braquial e naquelas da região proximal do nervo ciático (Hems et al., 1992). Entretanto, traumas graves e ressecções tumorais, sempre levam à grande perda de tecido neural, impossibilitando muitas vezes a neurorrafia primária. Para esses casos, o enxerto nervoso é considerado o tratamento de escolha (Costa et al., 2006). As extensas perdas de tecido nervoso demandam grande quantidade de enxerto de nervo o que às vezes não é possível devido à indisponibilidade de nervo doador em tamanho suficiente (Jenq & Coggeshall, 1987a; Kelley et al., 1991; Brunelli et al., 1994). Além disto, sempre ocorrerá certa morbidade na área de retirada dos enxertos de nervos autólogos (Fawcet & Keynes, 1990; Kelley et al., 1991; Brunelli et al., 1994). A técnica de enxertos venosos oferece bons resultados (Chiu et al., 1982; Risitano et al., 1989; Hentz et al., 1991; Nicolino et al., 2003; Tos et al., 2007) porque guia e permite a comunicação bioquímica entre os cotos nervosos reparados (Wang et al., 1993), reduzindo inclusive a tensão entre os cotos nervosos. Baseados nas vantagens da tubulização com enxerto de veia autóloga, decidimos acrescentar à mesma o PRP, imaginando que, talvez, o mesmo pudesse trazer melhor resultado na regeneração dos axônios. 36 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ OBJETIVO 37 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ OBJETIVO Este trabalho teve por objetivo estudar a influência do plasma rico em plaquetas na regeneração axonial de nervo periférico seccionado e reparado mediante tubulização com enxerto de veia normal e ao avesso. 38 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ MÉTODO 39 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ MÉTODO DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Foram utilizados 70 ratos machos adultos (Rattus norvegicus albinus) da variedade Wistar tendo peso corpóreo médio variando de 180 a 200 gramas e aproximadamente dois meses de idade, fornecidos pelo Biotério Central do Campus da UNESP em Botucatu. Os animais foram distribuídos por sorteio em cinco grupos descrito a seguir: G 1 - grupo controle (Sham). n=10 G 2 - grupo com enxerto venoso ao avesso sem preenchimento (VASP). n=15 G 3 - grupo com enxerto venoso ao avesso preenchido com plasma rico em plaquetas (VAPRP). n=15 G 4 - grupo com enxerto venoso normal sem preenchimento (VNSP). n=15 G 5 – grupo com enxerto venoso preenchido com plasma rico em plaquetas (VNPRP). n=15 Em todos os grupos o nervo ciático direito foi utilizado para o estudo experimental. Os Grupos G 2, G 3, G 4 e G 5 receberam enxerto venoso da veia jugular externa do lado esquerdo do mesmo animal. Nos grupos 3 e 5, após as suturas das extremidades da veia nos cotos proximal e distal, as veias foram preenchidas com o plasma rico em plaquetas (PRP) que foi previamente ativado com solução de tromboplastina cálcica na concentração de 12,5 mol/ml*. *Soluplastin®, Wiener Laboratórios 40 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ O PRP foi colocado no interior da veia com o uso de agulha e seringa tipo Luer-Loock, em uma das extremidades do enxerto, após a outra extremidade já estar previamente suturada (Fig. 4). PROCEDIMENTO CIRÚRGICO Os animais foram anestesiados com injeção intramuscular de 50% de tiletamina e 50% de zolazepam na dose de 3 mg/kg de peso*. A anestesia foi aplicada intramuscular no músculo glúteo do antímero esquerdo, para não interferir nos resultados do lado operado. Após serem adotadas as técnicas de assepsia para procedimentos cirúrgicos, os animais foram colocados em mesa de madeira revestida de cortiça. Foram fixados à mesa operatória, posicionados em decúbito dorsal e suas patas dianteiras e traseiras em completa abdução. A seguir os animais receberam epilação na região lateral esquerda no pescoço, seguida de degermação. Com uma incisão da pele do pescoço, no antímero esquerdo, procedeu-se a divulsão dos tecidos por planos para expor a veia jugular externa esquerda, promovendo o seu isolamento. Nos animais que receberam enxertos venosos preenchidos com PRP, coletou-se um 0,8 ml de sangue da veia jugular externa, sendo este colocado em tubo de ensaio contendo solução de citrato de sódio a 10%. A seguir o tubo de ensaio foi centrifugado numa velocidade de 700-800 rotações por minuto por seis minutos, à temperatura ambiente, resultando três faixas (bandas) de componentes. Para obtenção do PRP, coletou-se o componente da banda intermediária do tubo de ensaio, que obedeceu ao protocolo preconizado por Anitua (1999). * Telazol; Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge® 41 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ No passo seguinte, introduziu-se uma sonda periodontal de aço inox na luz da veia e realizou-se a ligadura de seus segmentos, cranial e caudal, e posteriormente seccionou-se suas duas extremidades. Este segmento de aproximadamente 12 mm de veia foi mantido em soro fisiológico até o momento de sua colocação como enxerto entre os cotos nervosos lesados no nervo ciático direito (Fig. 1). Figura 1 – Coleta da veia jugular externa esquerda. Na segunda fase os animais foram posicionados e fixados em decúbito ventral com suas patas dianteiras e traseiras em completa abdução. Realizou-se a epilação da região posterior da coxa direita e “degermação” para incisão e acesso, plano a plano, do nervo ciático direito. Fig. 2. Figura 2 – Exposição do nervo ciático direito O grupo 1 (grupo controle) recebeu a cirurgia somente para exposição do nervo ciático e teve a incisão suturada com pontos simples, plano a plano, com fio monofilamentar de náilon 5-0. 42 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ O grupo 2 (VASP), após secção e retirada de um segmento de aproximadamente 10 mm do nervo ciático direito, recebeu o enxerto de veia jugular externa ao avesso sem preenchimento. Foram aplicados dois pontos simples em cada extremidade com fio monofilamentar de náilon 10-0 fixando as extremidades da veia ao epineuro, distante dois milímetros das extremidades dos cotos nervosos. Estas suturas foram realizadas em ambas extremidades da veia (Fig. 3). O grupo 3 (VAPRP) recebeu enxerto de veia jugular externa ao avesso, preenchida com PRP em seu interior, sendo suturada como os animais do grupo 2 (Fig. 4). O grupo 4 (VNSP) foi semelhante ao grupo 2, porém o enxerto de veia não foi colocado ao avesso (Fig.5). O grupo 5 (VNPRP) foi semelhante ao grupo 3, porém o enxerto de veia não foi colocado ao avesso. Figura 3 - Sutura do enxerto venoso ao avesso (VASP). Figura 4 – Sutura do enxerto venoso ao avesso preenchido com PRP (VAPRP). 43 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Figura 5 – Sutura da veia normal sem preenchimento (VNSP). Os ratos após as cirurgias foram mantidos em gaiolas individuais, em temperatura ambiente de 24°C (± 0,5), receberam alimentação e água ad libidum, respeitando-se o ciclo circadiano de 12 horas de luz e com observação periódica. Todas as fases cirúrgicas foram realizadas por apenas um operador, previamente treinado, utilizando-se de microscópio cirúrgico. Todas as etapas da realização do trabalho, bem como os procedimentos, obedeceram aos princípios bioéticos preconizados pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), e aprovados previamente pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Marília, datado de 29 de outubro de 2004 e apostilado em 30 de novembro de 2006. Sacrifício e Coleta das Amostras Os animais foram sacrificados no decorrer de 12 semanas após as cirurgias através de dose elevada de pentobarbital sódico, 150 a 200 mg por kg de peso corpóreo. Os nervos ciáticos foram retirados e fixados em glutaraldeído a 2,5%, em tampão fosfato de sódio pH 7,2, 0,1 M, para processamento de rotina em microscopia óptica (Fig. 6). 44 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Figura 6 – Coleta de segmento nervoso Análise Quantitativa e Tratamento Estatístico Para análise morfométrica utilizou-se, em média, 200 fibras nervosas por animal visualizadas em cortes transversais semifinos com espessura de 0,5 �m, e aferiram-se 100 fibras para o terço médio do enxerto e 100 fibras para o coto distal. As observações foram feitas através da escolha de um campo “randomizado”. As imagens dos cortes histológicos foram capturadas através de microscópio óptico Olympus BX 50, acoplado a um sistema de captura de imagens e a um microcomputador Pentium III, com interface para o programa Image Pro Plus, versão 4.5, pertencente ao Laboratório de Morfologia da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo. As aferições dos diâmetros das fibras nervosas, dos axônios e das espessuras das bainhas de mielina, foram realizadas através de fotografias de escala micrométrica. Com o emprego de um paquímetro Mitutoyo com precisão de 0,05 mm e da fórmula X=Y. 106 /A2 (onde o X= valor em �m2 e A= ampliação), permitiu-se as conversões das medidas de mm2 para �m2. ESTATÍSTICA DESCRITIVA Com os resultados numéricos quantitativos obtidos, foram calculadas as médias aritméticas, os desvios padrões das médias e os coeficientes de variação (Pearson), de cada animal e de cada grupo. Foi feito 45 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ estudo comparativo das áreas e dos diâmetros dos axônios e da espessura e área da bainha de mielina. Com estes dados avaliaram-se as medidas de tendência central, ou seja, os “escores” do centro do conjunto. ESTATÍSTICA ANALÍTICA A análise estatística destes resultados foi feita pela One-way analysis of variance (ANOVA) para testar a hipótese de nulidade contra a hipótese alternativa. Utilizou-se para análise comparativa entre os cinco grupos o teste F, que permite calcular a soma e as médias dos quadrados, e os graus de liberdade para se obter o valor de F. Com o valor de F calculado, localizou-se na tabela de Fischer o valor de P. Para o estudo das correlações lineares intra-grupos e entre- grupos, utilizou-se o método de Scheffé que testa 2 grupos (Vieira, 1980; Wang et al., 1993 e 1995, Campana et al., 2001; Dória Filho, 2001, Karacaoglu et al., 2001; Suchmacher & Geller, 2005), adotando-se o nível de significância de 5% (p=0,05). Foi utilizado o programa Minitab 11.0 para a formação do banco de dados, a realização da análise de variância ANOVA (one-way) e a construção dos gráficos, apresentadas nos resultados. Depois, foi aplicado método de Scheffé, onde foram comparados os grupos dois a dois entre si, perfazendo assim seis comparações para o enxerto e seis comparações para o coto distal, entre as quatro técnicas utilizadas, objetivando verificar a diferença mínima significante ao nível de 5% (p=0,05). 46 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ RESULTADOS 47 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ RESULTADOS Análise Macroscópica Na inspeção dos animais, à vista desarmada, observou-se que os animais tiveram dificuldade na marcha e realizaram automutilação (autofagia) dos dedos do membro operado. Porém, ao curso de mais ou menos quatro semanas a atividade de automutilação não persistiu e foi diferente entre os grupos operados, como mostra a Fig. 7 e Tab. 1. O grupo G3 apresentou o menor número de dedos mutilados, seguido do grupo G5, ambos com preenchimento de PRP, por sua vez seguidos pelo grupo G4. Em último lugar, e portanto com pior resultado, ficou o grupo G2. Tabela 1 - Números de dedos em que os animais realizaram autofagia do membro operado. Grupos Dedos I Dedos II Dedos III Dedos IV Dedos V G2 (VASP) Animais - - 5 6 6 G3 (VAPRP) Animais - - - - 1 G4 (VNSP) Animais - - - 4 4 G5 (VNPRP) Animais - - - 2 2 48 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Figura 7 – Animal do grupo VNSP (automutilação) ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA MICROSCOPIA ÓPTICA Para o estudo da morfologia dos cotos nervosos utilizaram-se cortes transversais semifinos contrastados com tetróxido de ósmio e contra- corados por eosina e azul de toluidina. Os cortes foram analisados primeiramente em um aumento pequeno de 40 vezes (objetiva 4X) a fim de observar-se o conjunto das estruturas. Em seqüência passou-se para aumentos maiores de 100 vezes (objetiva 10X), 200 vezes (objetiva 20X) e por último ao aumento de 400 vezes (objetiva 40X). A morfologia das estruturas foi descrita evidenciando o epineuro, o perineuro, o tecido adiposo, os vasos sangüíneos e as bainhas de mielina. Características morfológicas do grupo G1 (sham) O grupo G1 (Sham) apresentou as bainhas de mielina bem nítidas e de tamanhos variados. O epineuro era delgado, com fibras colágenas I II IIIIVV 49 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ bem organizadas e paralelas entre si. Apresentou-se nítido e revestido externamente por uma camada de tecido adiposo. A camada interna do epineuro emitia septos para o interior das fibras, constituindo assim o perineuro, que formava os fascículos. O perineuro era também delgado e nítido, e observavam-se alguns vasos sangüíneos que transitavam neste pequeno espaço. Os fascículos apresentaram-se com pouco tecido conjuntivo envolvente e eram bem compactados entre si. As bainhas de mielina que eram mais espessas e nítidas, sempre estavam posicionadas próximas aos vasos sangüíneos (Fig. 8 e 9). Figura 8 – Grupo Sham. Coloração por tetróxido de ósmio e contra coloração por azul de toluidina. A - epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4X) , B - vaso sangüíneo (seta) e epineuro (EP) (10X), C - vasos sangüíneos (setas) e perineuro (PE) (20X) e D - vaso sangüíneo (seta) e perineuro (PE) (40X) . A B C D TA EP EP PE PE 50 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Características morfológicas do grupo G2 (VASP) Região do enxerto Os cortes transversais do terço médio da região dos enxertos nos animais do grupo veia ao avesso sem preenchimento (VASP), apresentaram o nervo bastante fasciculado, com epineuro bem delimitado, espesso e às vezes irregular. Foi observada a presença de vasos sanguíneos no centro e na periferia dos fascículos que eram envolvidos pelo perineuro e também epineuro. O epineuro se apresentou fibroso, mais espesso e irregular que o observado no grupo G1 (Sham). Foram encontrados vários microfascículos no epineuro, próximo a uma camada de tecido adiposo. A espessura das bainhas de mielina era de tamanhos variados, porém nítidas, com os diâmetros das fibras de tamanhos diferentes. As maiores ladeavam os vasos sangüíneos (Fig.10). A B C D EP TA EP EP EP TA TA Figura 9 – Grupo Sham. Coloração por tetróxido de ósmio e contra coloração por eosina. A - epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4X), B - epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (10X), C - epineuro (EP) (20X) e D - epineuro (EP) (40X). 51 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Região do coto distal Observou-se o nervo muito fasciculado com epineuro e perineuro bem nítidos e bem delimitados, havendo a presença de vasos sangüíneos no centro e na periferia dos fascículos. Externamente, envolvendo o epineuro, encontrou-se uma camada de tecido adiposo. Alguns microfascículos encontravam-se próximos da camada de tecido adiposo, com a presença de vasos sanguíneos entre o tecido adiposo e os microfascículos. As bainhas de mielina estavam com espessuras menores que as correspondentes do enxerto, entretanto eram mais compactadas entre si, nítidas e mostravam- se pouco homogêneas (Fig. 11). Figura 10 – Veia ao avesso sem preenchimento (enxerto). Coloração por tetróxido de ósmio. A - vasos sangüíneos (setas), epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4X), B - epineuro (EP) e vasos sangüíneos (setas) (10X), C - vaso sangüíneo (seta), epineuro (EP) e perineruo (PE) (20X) e D - vaso sangüíneo (seta) e perineuro (PE) (40X). A B C D TA EP EP PE PE EP 52 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Características morfológicas do grupo G3 (VAPRP) Região do enxerto Os cortes transversais do terço médio da região do enxerto nos animais do grupo veia ao avesso preenchida com plasma rico em plaquetas G 3 (VAPRP) apresentaram-se muito fasciculados, com os seus fascículos nervosos de tamanhos diferentes e pouco delimitados. O epineuro mostrou-se irregular e sua superfície externa era revestida por camada de tecido adiposo, também irregular. O perineuro era espesso, irregular e fibroso. Observou-se a presença de vasos sangüíneos somente na periferia do fascículo maior, com poucas fibras na sua porção central, que era preenchida por tecido conjuntivo fibroso. Na periferia dos fascículos as bainhas de mielina eram de tamanhos homogêneos, enquanto no centro elas eram menores e de tamanhos heterogêneos. Um microfascículo foi observado entre o epineuro e a camada de tecido adiposo, próximo a vasos sangüíneos, que exibia bainha de mielina homogênea e nítida (Fig.12). TA A B C D EP EP PE EP TA Figura 11 – Veia ao avesso sem preenchimento (coto distal). Coloração por tetróxido de ósmio. A - epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4x), B - vaso sangüíneo (seta), epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (10X), C - vaso sangüíneo (seta) e epineuro (EP) (20X) e D - vaso sangüíneo (seta) e perineuro (PE) (40X). 53 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Região do coto distal O coto distal apresentou fascículos de tamanhos diferentes, tendo epineuro e perineuro bem delimitados e nítidos. O epineuro era revestido externamente por uma camada de tecido adiposo, por onde transitavam alguns vasos sangüíneos. O perineuro apresentou-se ora espesso, ora delgado, formando fascículos bem compactados. Também mostrou microfascículos entre o epineuro e a camada de tecido adiposo. As bainhas de mielina eram nítidas, pouco heterogêneas e bem compactadas entre si (Fig.13). Figura 12 – Veia ao avesso preenchida com plasma rico em plaquetas (enxerto). Coloração por tetróxido de ósmio. A - epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4X), B - vaso sangüíneo (seta) (10X), C - perineruo (PE) (20X) e D - perineuro (PE) (40X). A B C D TA PE EP PE 54 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Características morfológicas do grupo G4 (VNSP) Região do enxerto Nos animais do grupo veia normal sem preenchimento G 4 (VNSP), os cortes transversais do terço médio da região dos enxertos de nervo ciático apresentaram-se com poucos e irregulares minifascículos nervosos. Observou-se os perineuros fibrosos, irregulares e sem limites nítidos, com epineuro também irregular. As bainhas de mielina eram de espessura com tamanhos variados, porém apareciam nítidas. Foram encontrados vários microfascículos no epineuro próximo à camada de tecido adiposo, com a presença de vasos sangüíneos no perineuro e tecido adiposo (Fig.14). A B C D Figura 13 – Veia ao avesso preenchida com plasma rico em plaquetas (Coto Distal). Coloração por tetróxido de ósmio. A - vasos sangüíneos (setas), epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4X), B - epineuro (EP) e perineruo (PE) (10X), C - epineuro (EP) e perineruo (PE) (20X) e D - epineuro (EP) e perineruo (PE) (40X). EP EP PE EP EP PE TA PE 55 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Região do coto distal No coto distal foi observado o epineuro e o perineuro bem delimitados e nítidos, com a presença de tecido adiposo localizado externamente ao epineuro. Os vasos sanguíneos estavam entre a camada de tecido adiposo e o epineuro, que apresentou-se mais fibroso. Foram observados também alguns microfascículos dispostos entre o perineuro e epineuro. As bainhas de mielina eram nítidas e de espessura menor e pouco heterogêneas. Também observou-se vasos sangüíneos na periferia e no centro do nervo. Os diâmetros das fibras eram de tamanhos diferentes e menores do que os correspondentes no enxerto (Fig.15). Figura 14 – Veia normal sem preenchimento (enxerto). Coloração por tetróxido de ósmio. A - tecido adiposo (TA) e epineuro (EP) (4X), B - tecido adiposo (TA) e vaso sangüíneo (seta) (10X) , C - vaso sangüíneo (seta) e perineuro (PE) (20X) e D - vaso sangüíneo (seta) e perineuro (PE) (40X). A B C D TA EP TA PE PE 56 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Características morfológicas do grupo G5 (VNPRP) Região do enxerto No terço médio da região do enxerto nervoso do grupo G5 (VNPRP) observou-se fascículos maiores, de tamanhos variados, e muitos microfascículos dispostos ao redor dos fascículos. Nos fascículos maiores o epineuro e o perineuro eram bem delimitados e nítidos, havendo vasos sangüíneos no centro e na periferia neuronal. Também em alguns espécimes notou-se entre o epineuro e perineuro presença de tecido adiposo, onde observavam-se vasos sangüíneos presentes em suas interfaces. As bainhas de mielina tinham aspecto homogêneo, eram nítidas e bem organizadas. Já nos microfascículos as bainhas de mielina exibiam espessura heterogênea, porém nítidas, e próximas a vasos sangüíneos (Fig.16). Figura 15 – Veia normal sem preenchimento (coto distal). Coloração por tetróxido de ósmio. A - tecido adiposo (TA) e epineuro (EP) (4X), B - tecido adiposo (TA) e epineuro (EP) (10X), C - vaso sangüíneo (seta) e epineuro (EP) (20X) e D - vaso sangüíneo (seta) e perineuro (PE) (40X). A B C D TA EP TA EP PE EP 57 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Região do coto distal Os fascículos se apresentaram de tamanhos diferentes e havia vários microfascículos nas interfaces entre o perineuro e o epineuro. Os fascículos maiores apresentaram perineuro bem delimitado e presença de vasos sangüíneos. Observou-se tecido adiposo entre o epineuro e perineuro, por onde passavam vasos sangüíneos que exibiam ao seu redor microfascículos. Nos fascículos maiores a espessura das bainhas de mielina era homogênea e bem nítida, enquanto nos microfascículos ela era heterogênea, porém nítida. As bainhas de mielina se apresentaram com espessura menor que as suas correspondentes na região do enxerto (Fig.17). Figura 16 – Veia normal preenchida com plasma rico em plaquetas (enxerto). Coloração por tetróxido de ósmio. A - epineuro (EP) (4X), B - epineuro (EP) (10X), C - epineuro (EP) e perineuro (PE) (20X) e D - epineuro (EP) e perineuro (PE) (40X) . A B C D EP EP PE PE EP EP 58 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Quanto ao aspecto histológico do coto distal, observou-se que os vasos sangüíneos transitavam entre o epineuro e a camada de tecido adiposo dos grupos G2 a G5. Também observaram-se alguns vasos localizados próximos aos microfascículos dos grupos G4 e G5. O epineuro e o perineuro mostravam-se nítidos nos grupos G2 e G5, e bem delimitados nos grupos G4 e G5, entretanto no grupo G4 eles apresentaram-se mais fibrosos. Os fascículos eram de tamanhos diferentes nos grupos G2 a G5, porém no grupo G3 eles eram mais compactos. A bainha de mielina no coto distal mostrou-se nítida e homogênea nos grupos G2 e G5, enquanto nos grupos G3 e G4 eram heterogêneas. Já no grupo G2 e G3 elas apareceram mais compactas. Análise Histomorfométrica Os resultados das médias aritméticas das variáveis da área da fibra, do diâmetro da fibra, da área da bainha, da espessura da bainha de A B C D EP TA TA EP PE EP Figura 17 – Veia normal preenchida com plasma rico em plaquetas (coto distal). Coloração por tetróxido de ósmio. A - epineuro (EP) e tecido adiposo (TA) (4X), B - vasos sangüíneos (setas), perineuro (PE) e tecido adiposo (TA) (10X), C - vasos sangüíneos (setas) e epineuro (EP) (20X) e D - vasos sangüíneos (setas) e epineuro (EP) (40X). 59 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ mielina, da área do axônio e do diâmetro do axônio, estão nas tabelas de número dois a dezenove. Área da fibra nervosa na região do enxerto As áreas, em micrômetros quadrados, foram aferidas em quatro campos por lâmina. No grupo G1 (sham) a média geral foi de 42,81 (± 2,80) �m², no grupo G2 (VASP) a média geral foi de 16,97 (± 1,00) �m², no grupo G3 (VAPRP), a média geral foi de 22,14 (± 0,98) �m², no grupo G4 (VNSP), a média geral foi de15,53 (± 0,58) �m² e no grupo G5 (VNPRP) foi de 23,47 (± 0,65) �m² (Fig. 18 e tabela 2). Figura 18 – Média da área da fibra (�m²) no enxerto (En). Tabela 2 – Resultados morfométricos da área da fibra(�m²) no enxerto (En). Grupos N Média Desv.Pad. VASP-En 15 16.979 1.005 VAPRP-En 15 22.140 0.982 VNSP-En 15 15.534 0.586 VNPRP-En 15 23.479 0.653 � VNPRP-EnVNSP-EnVAPRP-EnVASP-En 25 20 15 Área da fibra - enxerto 60 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ ÁREA�DA�FIBRA���ENXERTO� Comparações/Grupos Iguais(=)�ou�diferentes(�) Valor�de�p Melhor�técnica� VASP�X�VAPRP� �� <�0,001 VAPRP� VASP�X�VNSP� �� <�0,001 VASP� VASP�X�VNPRP� �� <�0,001 VNPRP� VAPRP�X�VNSP� �� <�0,001 VAPRP� VAPRP�x�VNPRP� �� <�0,001 VNPRP� VNSP�x�VNPRP� �� <�0,001 VNPRP� Quando confrontadas com o grupo G1 (sham) (42,81 ± 2,80 �m²), o grupo que apresentou a maior média aritmética foi o grupo G5 (VNPRP) (23,47 ± 0,65 �m²), (Fig. 19 e tabela 3). Figura 19 – Média da área da fibra (�m²) no enxerto (En) e no coto distal (Ds). Tabela 3 – Resultados morfométricos da Área da Fibra (�m²) Grupos N Média Desv.Pad. CV Sham 9 42.814 2.801 6.541 VASP-En 15 16.979 1.005 5.917 VASP-Ds 15 15.543 0.666 4.287 VAPRP-En 15 22.140 0.982 4.437 VAPRP-Ds 15 13.280 1.689 12.718 VNSP-En 15 15.534 0.586 3.773 VNSP-Ds 15 11.390 1.702 14.944 VNPRP-En 15 23.479 0.653 2.782 VNPRP-Ds 15 15.279 1.029 6.732 Área da fibra nervosa na região do coto distal. VNPRP-Ds VNPRP-EnVNSP-DsVNSP-EnVAPRP-Ds VAPRP-EnVASP-DsVASP-EnSham 50 40 30 20 10 Área da fibra 61 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ No grupo G 1 (sham) a média geral foi de 42,81 (± 2,80) �m², no grupo G2 (VASP) a média geral foi de 15,54 (± 0,66) �m², no grupo G3 (VAPRP), a média geral foi de 13,28 (± 1,68) �m², no grupo G4 (VNSP), a média geral foi de 11,39 (± 1,70) �m² e no grupo G5 (VNPRP) foi de 15,27 (± 1,02) �m² (Fig. 20 e tabela 4). Figura 20 – Média da área da fibra (�m²) no coto distal (Ds). Tabela 4 – Resultados morfométricos da área da fibra(�m²) no coto distal (Ds). Grupos N Média Desv.Pad. VASP-Ds 15 15.543 0.666 VAPRP-Ds 15 13.280 1.689 VNSP-Ds 15 11.390 1.702 VNPRP-Ds 15 15.279 1.029 �� VNPRP-DsVNSP-DsVAPRP-DsVASP-Ds 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 Área da fibra - distal 62 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ ÁREA�DA�FIBRA�–�COTO�DISTAL� � Comparações/Grupos Iguais(=)�ou�diferentes(�) Valor�de�p Melhor�técnica� VASP�x�VAPRP� �� <�0,001 VASP� VASP�x�VNSP� �� <�0,001 VASP� VASP�x�VNPRP� = = 0,445 � VAPRP�x�VNSP� �� =�0,008 VAPRP� VAPRP�x�VNPRP� �� =�0,002 VNPRP� VNSP�x�VNPRP� �� <�0,001 VNPRP� Quando confrontadas com o grupo G1 (sham) (42,81 ± 2,80 �m²), o grupo que apresentou a maior média aritmética foi o grupo G2 (VASP) (15,54 ± 0,66 �m²). Vide figura 19 e tabela 3 (com sham). Diâmetro mínimo da fibra nervosa na região do enxerto Nos ratos do grupo G2 (VASP) a média do diâmetro mínimo das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, na região do enxerto, a média geral obtida foi de 5,14 (± 1,51) �m. Nos animais do grupo G3 (VAPRP) a média do diâmetro mínimo das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, foi de 4,44 (± 0,37) �m. Nos ratos do grupo G4 (VNSP) a média do diâmetro mínimo das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, a média geral foi de 3,55 (± 1,55) �m. Nos animais do grupo G5 (VNPRP) a média do diâmetro mínimo das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, foi de 4,56 (± 0,81) �m. (Fig. 21 e tabela 5). 63 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Figura 21 – Média do diâmetro mínimo da fibra (�m) no enxerto (En). Tabela 5 – Resultados morfométricos do diâmetro mínimo da fibra (�m) no enxerto (En). Grupos N Média Desv.Pad. VASP-En 15 5.145 1.519 VAPRP-En 15 4.447 0.371 VNSP-En 15 3.554 1.558 VNPRP-En 15 4.560 0.810 DIÂMETRO�MÍNIMO�DA�FIBRA�–�ENXERTO� � Comparações/Grupos� Iguais(=)�ou�diferentes(�) Valor�de�p Melhor�técnica� VASP�x�VAPRP� =� =�0,107 � VASP�x�VNSP� �� =�0,011 VASP� VASP�x�VNPRP� =� =�0,215 � VAPRP�x�VNSP� �� =0,047 VAPRP� VAPRP�x�VNPRP� =� =�0,639 � VNSP�x�VNPRP� �� =0,042 VNPRP� Quando os grupos foram confrontados com o G1 (sham) (6,23 ± 0,90 �m), o grupo que apresentou a maior média aritmética foi o grupo G2 (VASP) (5,14 ± 1,51 �m) (Fig. 22 e tabela 6). VNPRP-EnVNSP-EnVAPRP-EnVASP-En 8 7 6 5 4 3 2 Diâmetro mínimo da fibra - enxerto 64 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Figura 22 – Média do diâmetro mínimo da fibra (�m) no enxerto (En) e no coto distal (Ds). Tabela 6 – Resultados morfométricos do diâmetro mínimo da fibra(�m) Grupos N Média Desv.Pad. CV Sham 9 6.2369 0.9061 14.527 VASP-En 15 5.1450 1.5193 29.530 VASP-Ds 15 2.6294 0.4527 17.218 VAPRP-En 15 4.4470 0.3711 8.345 VAPRP-Ds 15 3.4289 0.6021 17.579 VNSP-En 15 3.5539 1.5584 43.850 VNSP-Ds 15 2.6527 0.7640 28.801 VNPRP-En 15 4.5600 0.8097 17.757 VNPRP-Ds 15 3.6342 0.4228 11.634 Diâmetro mínimo da fibra nervosa na região do coto distal. Nos ratos do grupo G2 (VASP), a média dos diâmetros mínimos das fibras nervosas em micrômetros de quatro campos por lâmina, na região do coto distal, foi de 2,62 (± 0,45) �m. Nos animais do grupo G3 (VAPRP), a média dos diâmetros mínimos das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, foi de 3,42 (± 0,60) �m. Nos roedores do grupo G4 (VNSP) a média aritmética do diâmetro mínimo das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, foi de 2,65 (± 0,76) �m. � VNPRP-Ds�VNPRP-EnVNSP-DsVNSP-EnVAPRP-DsVAPRP-EnVASP-DsVASP-En Sham 8� 7� 6� 5� 4� 3� 2� Diâmetro mínimo da fibra 65 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Nos animais do grupo G5 (VNPRP), a média dos diâmetros mínimos das fibras nervosas em micrômetros, de quatro campos por lâmina, foi de 3,63 (± 0,42) �m (Fig. 23 e tabela 7). Figura 23 – Média do diâmetro mínimo da fibra (�m) no coto distal (Ds). Tabela 7 – Resultados morfométricos do diâmetro mínimo da fibra(�m) no coto distal (Ds). Grupos N Média Desv.Pad. VASP-Ds 15 2.6294 0.4527 VAPRP-Ds 15 3.4289 0.6021 VNSP-Ds 15 2.6527 0.7640 VNPRP-Ds 15 3.6342 0.4228 DIÂMETRO�MÍNIMO�DA�FIBRA�–�COTO�DISTAL� � Comparações/Grupos� Iguais(=)�ou�diferentes(�) Valor�de�p Melhor�técnica� VASP�x�VAPRP� �� <�0,001 VAPRP� VASP�x�VNSP� =� =�0,924 VASP�x�VNPRP� �� <�0,001 VNPRP� VAPRP�x�VNSP� �� =0,007 VAPRP� VAPRP�x�VNPRP� =� =�0,343 VNSP�x�VNPRP� �� =0,001 VNPRP� Quando os grupos foram confrontados com o G1 (sham) (6,23 ± 0,90 �m), o grupo que apresentou a maior média aritmética foi o G5 (VNPRP) (3,63 ± 0,42 �m). Vide figura 22 e tabela 6. � VNPRP-DsVNSP-DsVAPRP-DsVASP-Ds� 5 4 3 2 Diâmetro mínimo da fibra - distal 66 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ Área da bainha de mielina na região do enxerto Nos roedores do grupo G2 (VASP), a média das áreas da bainha de mielina em micrômetros quadrados, de quatro campos por lâmina, foi de 11,97 (± 1,36) �m². Nos ratos do grupo3 (VAPRP), a média das áreas da bainha de mielina em micrômetros quadrados, de quatro campos por lâmina, foi de 16,76 (± 1,05) �m². Nos animais do grupo G4 (VNSP) a média das áreas da bainha de mielina em micrômetros quadrados, de quatro campos por lâmina, foi 12,76 (± 1,32) �m². Nos ratos do grupo G5 (VNPRP) a média das áreas da bainha de mielina em micrômetros quadrados, de quatro campos por lâmina, foi de 18,36 (± 1,69) �m² (Fig. 24 e tabela 8). Figura 24 – Média da área da bainha (�m²) no enxerto (En). Tabela 8 – Resultados morfométricos da área da bainha (�m²) no enxerto (En). Grupos N Média Desv.Pad. VASP-En 15 11.974 1.363 VAPRP-En 15 16.767 1.058 � VNPRP-EnVNSP-EnVAPRP-EnVASP-En 25 20 15 10 Área da bainha - enxerto 67 José Sidney Roque_______________________________________________________________________________ VNSP-En 15 12.765 1.329 VNPRP-En 15 18.365 1.694 ÁREA�DA�BAINHA�–�ENXERTO� � Comparações/Grupos� Iguais(=)�ou�diferentes(�) Valor�de�p Melhor�técnica� VASP�x�VAPRP� �� <�0,001 VAPRP� VASP�x�VNSP� =� =�0,132 � VASP�x�VNPRP� �� <�0,001 VNPRP� VAPRP�x�VNSP� �� < 0,001 VAPRP� VAPRP�x�VNPRP� �� =�0,006 VNPRP� VNSP�x�VNPRP� �� <�0