UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Campus Araraquara Gabriel Brenner DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES PARA O DIAGNÓSTICO DO VÍRUS SARS-CoV-2 Araraquara, Sp 2022 Gabriel Brenner DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES PARA O DIAGNÓSTICO DO VÍRUS SARS-CoV-2 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, área: análise clínicas . Orientadora: Profª. Drª Danielle Biscaro Pedrolli Araraquara 2022 Brenner, Gabriel. B732d Desenvolvimento de biossensores para o diagnóstico do vírus SARS- CoV-2 / Gabriel Brenner. – Araraquara: [S.n.], 2022. 71 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Área de concentração: Análises Clínicas. Orientadora: Danielle Biscaro Pedrolli. 1. Biologia sintética. 2. Diagnóstico viral. 3. Circuito genético. 4. Riboreguladores tipo Toehold. 5. Expressão gênica in vitro. I. Pedrolli, Danielle Biscaro, orient. II. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030081P7 Esta f icha não pode ser modif icada Resumo O diagnóstico preciso de COVID-19 é feito hoje, principalmente, por técnica de RT-PCR, que demanda equipamentos laboratoriais e mão de obra especializada para a realização do teste, o que encarece o diagnóstico e, principalmente, torna o processo moroso. Além disso, essa dependência de estrutura laboratorial torna o diagnóstico inviável em regiões remotas do Brasil, outra opção é a utilização de testes de antígeno, que são mais rápidos e baratos, porém possuem uma menor eficácia pois eles não conseguem detectar os anticorpos antes do sétimo dia de infecção. Como contrapartida ao teste utilizando a reação de PCR, o desenvolvimento de um riboregulador do tipo toehold switch se torna uma alternativa interessante devido ao seu baixo custo, fácil manuseio e alta sensibilidade e especificidade. Este projeto propõe o desenvolvimento de biossensores do tipo para a identificação rápida de RNA viral de Sars-Cov-2. Para tanto, foi construído um dispositivo de RNA regulatório capaz de ativar a expressão de um gene repórter a partir da identificação do RNA viral. Os toehold switch construídos à partir das sequências de RNA viral do SARS-CoV-2 foram clonados em um plasmídeo contendo o gene repórter Epic Luciferase através da técnica de digestão e ligação e testados em reações de tradução e transcrição cell free, obtendo resultados promissores onde o switch 8a apresentou um aumento de expressão de 3 vezes quando comparado o trigger específico com os controles. Os resultados obtidos mostram que a utilização de riboreguladores do tipo toehold switch para detecção do vírus SARS-CoV-2 é promissora. Palavras-Chave: Biologia sintética, Diagnóstico viral, Circuito genético, Riboreguladores tipo Toehold, Expressão gênica in vitro Abstract The precise diagnosis of COVID-19 is made today, mainly, by the RT-PCR technique, which requires laboratory equipment and specialized labor to carry out the test, which makes the diagnosis more expensive and, above all, makes the process time-consuming. In addition, this dependence on laboratory structure makes the diagnosis unfeasible in remote regions of Brazil, another option is the use of antigen tests like lateral flow immunotherapy tests, which are faster and cheaper, but are less effective because they cannot detect antibodies before the seventh day of infection.. As a counterpart to the test using the PCR reaction, the development of a toehold switch riboregulator becomes an interesting alternative due to its low cost, easy handling and high sensitivity and specificity. This project proposes the development of biosensors of this type for the rapid identification of Sars-Cov-2 viral RNA. To this end, a regulatory RNA device capable of activating the expression of a reporter gene was built from the identification of viral RNA. The toehold switches constructed from the SARS-CoV-2 viral RNA sequences were cloned into a plasmid containing the Epic Luciferase reporter gene through the digestion and ligation technique and tested in cell free translation and transcription reactions, obtaining promising results where switch 8a showed a 3-fold increase in expression when comparing the specific trigger with controls. The results obtained show that the use of toehold switch riboregulators for the detection of the SARS-CoV-2 virus is promising. Keywords: Synthetic biology, viral diagnosis, genetic circuit, toehold switch, in vitro gene expression 1. Introdução 7 1.1 Variantes do SARS-CoV-2 9 1.2 Infecção por SARS-CoV-2 11 1.3 Epidemiologia da Covid-19 12 1.3.1 Covid-19 no Brasil 13 1.4 Diagnóstico 16 1.4.1 RT-PCR 17 1.4.2 Imunocromatografia 18 1.4.3 RT-LAMP 20 1.4.4 Comparação entre os testes comerciais 20 1.4.5 Métodos diagnósticos em desenvolvimento 21 1.5 Toehold Switch 24 1.5.1 Toehold switch para detecção do SARS-CoV-2 32 1.6 Comparação entre os métodos diagnósticos em desenvolvimento 34 2. Objetivo 35 2.1 Objetivos específicos 35 3. Materiais e métodos 35 3.1 Seleção das sequências-alvo para construção dos RNA switches 36 3.2 Design in silico dos biossensores 37 3.3 Construção do sistema de expressão 39 3.4 Síntese dos RNA Triggers 43 3.5 Teste de funcionalidade e especificidade dos RNAs switch 44 4. Resultados e discussão 46\ 4.1 Seleção das sequências-alvo para construção dos RNA switches 46 4.2 Design in silico dos biossensores 47 4.3 Construção do sistema de expressão 54 4.4 Teste de funcionalidade e especificidade dos RNAs switch 57 5. Conclusões 63 6. Referências Bibliográficas 64 7 1. Introdução A família Coronaviridae é composta por vírus de RNA fita simples positiva envelopados e possuem os maiores genomas dos vírus de RNA (27kb a 32kb), estes grandes genomas são possíveis apenas devido a um sistema de proof-reading presente nos vírus desta família que evita um grande acúmulo de mutações que poderiam causar erros na replicação viral (ENJUANES, et al., 2022). Este genoma é composto por um conjunto de 4 genes que codificam proteínas estruturais, sendo elas a spike (S), a da membrana (M), o envelope (E) e o nucleocapsídeo (N) e outros 16 genes que codificam proteínas não estruturais (RAABAN, et al., 2020; TAKENOUCHI, et al., 2021). Estes vírus possuem altos níveis de mutação devido à propensão à erros da RNA polimerase e à recombinação frequente entre diferentes cepas de coronavírus, o que possibilita a adaptação do vírus à pressão seletiva do meio levando à um aumento na diversificação do vírus e eventual evolução (ENJUANES, et al., 2021; THAKUR et al., 2021). À família Coronaviridae possui 3 subfamílias sendo elas Letovirinae, Orthocoronavirinae e Pitovirinae esta última é dividida em 4 gêneros, sendo os únicos que possuem vírus que afetam humanos os gêneros Alphacoronavirus através dos vírus HCoV-229E e HCoV-NL63 e os Betacoronavirus através dos vírus HCoV-HKU1, HCoV-OC43, MERS-CoV, SARS-CoV e SARS-CoV-2 (LIU, et al., 2021). Os vírus HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E e HCoV-NL63 são responsáveis por 15% à 30% dos casos de resfriado comum em adultos apresentando sintomas mais leves que podem ser mais fortes em crianças, idosos e pessoas imunossuprimidas, enquanto os vírus SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 apresentam sintomas mais graves (LIU, et al., 2021). O SARS-CoV-2 é composto por 4 proteínas estruturais sendo elas E, M, N e S (Figura 1). A Proteína E é uma proteína transmembrana que forma um canal iônico e tem uma massa molecular aproximada de 8-12 kDa. A sua porção N-terminal localiza-se na parte externa e a C-terminal na parte interna da membrana. Cepas de SARS-CoV recombinantes, com a exclusão da proteína E, demonstraram uma virulência e aptidão competitiva inferiores quando comparadas ao vírus selvagem (NIETO-TORRES, et al., 2014; RAABAN, et al., 2020). A proteína M é uma proteína com uma massa molecular de 25-30 kDa, 8 sendo encontrada como um dímero. Essa proteína dá formato ao vírus, mantendo a curvatura da membrana e é a peça central na montagem de novas partículas virais, assim como a proteína E, sua porção N-terminal localiza-se na parte externa e a C-terminal na parte interna da membrana (NEUMAN, et al., 2011). A proteína N é formada por 2 domínios, um N-terminal e um C-terminal, é altamente fosforilada, o que aumenta a sua afinidade pelo RNA viral, e sua principal função é o encapsulamento do RNA viral no virião, através de uma interação com a proteína M (HURST, et al., 2013). A proteína spike possui 150-200 kDa e é altamente glicosilada na porção N. Essa proteína é clivada por uma protease do hospedeiro em 2 domínios funcionais, o S1 que se liga ao receptor da membrana celular da célula hospedeira, e o S2 que permite que o vírus faça a fusão com a membrana da célula hospedeira (TANG, et al., 2020). O SARS-CoV-2 possui 16 proteínas não estruturais (non-structural proteins, Nsp), essas proteínas possuem diversas funções como à Nsp1 que suprime a síntese de proteínas da célula hospedeira e à resposta à base de interferons, à Nsp3 é uma papain-like protease, à Nsp5 é a protease principal dos coronavírus às Nsp7, 8, 9 e 10 estão associadas ao complexo de replicação juntamente com a Nsp12 que é uma RNA polimerase, à Nsp13 é responsável por separar duplas fitas de DNA para prover o template para a síntese de RNA à Nsp14 é responsável pelo proofreading do RNA genômico e às Nsps 15 e 16 tem um importante papel em combater o sistema imune do hospedeiro (LIU et al., 2021). Figura 1: Figura ilustrativa da composição viral. 9 1.1 Variantes do SARS-CoV-2 O SARS-CoV-2 possui diversas variantes sendo elas divididas entre variantes de interesse (variants of interest, VOI) ou variantes de preocupação (variants of concern, VOC), para uma variante ser considerada uma VOI ela deve apresentar mutações que são suspeitas ou conhecidas por causar mudanças significativas e têm ampla circulação (muitos grupos infectados ou circulação em diversos países) (OMS, 2022). Essas variantes são observadas continuamente casos elas venham a se tornar VOCs, que por sua vez são variantes que se espalham com maior facilidade, causam sintomas mais graves, evadem à resposta imunológica, mudam à apresentação clínica ou diminuem à efetividade das ferramentas utilizadas no combate da doença (medidas de saúde pública, diagnóstico, tratamentos ou vacinas) (OMS, 2022). Essas diferentes VOCs e VOIs apresentam principalmente mutações na proteína S, podendo ser deleções, substituições ou recombinações, essas alterações podem criar variantes altamente letais e altamente transmissíveis através de alterações na afinidade da ligação com à ACE-2 (THAKUR et al., 2022). Já foram observadas 9 variantes que foram identificadas como VOI, sendo à de maior interesse entre essas à variante Delta que foi reclassificada como VOC posteriormente, atualmente todas essas variantes já foram desclassificadas não 10 existindo nenhuma variante classificada como VOI no presente momento (OMS, 2022) (Tabela 1). Atualmente existe apenas uma variante classificada como VOC, a Omicron, porém já foram identificadas 5 VOCs diferentes (Tabela 2). Atualmente a única variante que tem sido encontrada nos sequenciamentos realizados de pessoas infectadas é à omicron em 99% dos casos, sendo este o motivo de não existir mais nenhuma variante classificada como VOI e à única VOC ser à própria omicron (OMS, 2022). Tabela 1: Variantes do SARS-CoV-2 previamente descritas como VOI. Fonte: OMS 2022. Identificação OMS Primeira observação Designação como VOI Desclassificação Epsilon 03/2020, EUA 05/03/2021 06/07/2021 Zeta 04/2020, Brasil 17/03/2021 06/07/2021 Eta 12/2020, diversos países 17/03/2021 20/09/2021 Theta 01/2021, Filipinas 24/03/2021 06/07/2021 Iota 11/2020, EUA 24/03/2021 20/09/2021 Delta 10/2020, Índia 04/04/2021 11/05/2021 Kappa 10/2020, Índia 04/04/2021 20/09/2021 Lambda 12/2020, Peru 14/06/2021 09/03/2022 Mu 01/2021, Colômbia 30/08/2021 09/03/2022 Tabela 2: Variantes do SARS-CoV-2 descritas como VOC, à única variante que ainda é descrita como VOC é a Omicron, todas as outras já foram desclassificadas. Fonte OMS, 2022. 11 Identificação OMS Primeira observação Designação como VOC Desclassificação Alpha 09/2020, Reino Unido 18/12/2020 09/03/2022 Beta 04/2020, África do Sul 18/12/2020 09/03/2022 Gamma 11/2020, Brasil 11/01/2021 09/03/2022 Delta 10/2020, Índia 11/05/2021 07/06/2022 Omicron 11/2021, diversos países 26/11/2021 - 1.2 Infecção por SARS-CoV-2 Na fase inicial da infecção, o SARS-CoV-2 acessa o parênquima pulmonar onde começa a se proliferar. A porção S1 da proteína spike se liga ao receptor ACE2 da célula hospedeira, proteína de membrana importante para o sistema renina-angiotensina-aldosterona. Após esta ligação a ACE2 à infecção pode ocorrer de duas maneiras, caso a célula alvo contenha a TMPRSS2, serinoprotease transmembrana II, a proteína S é clivada separando os domínios S1 e S2, o domínio S2 permite então a fusão do virião com a membrana celular da célula alvo (HOFFMANN et al., 2020). Caso o complexo ACE2-SARS-CoV-2 não entre em contato com à TMPRSS2 à partícula viral é internalizada por endocitose e à proteína S é clivada por catepsinas separando os domínios S1 e S2 permitindo assim à fusão do virião com à membrana celular (JACKSON et al., 2021). À replicação e transcrição do genoma viral ocorre na membrana citoplasmática da célula infectada, onde um complexo formado por até 16 subunidades virais e diversas proteínas celulares coordenam à replicação viral, o virião é montado na membrana celular e após ocorrer à incorporação do RNA viral começa um processo de brotamento, permitindo que o vírus infecte outras células (MOUSAVIZADEH et al., 2020). A replicação e o brotamento viral causam a apoptose de células alveolares do tipo 2 o que provoca uma resposta 12 inflamatória que, juntamente com o stress oxidativo, causam lesões e necrose de células alveolares (IMAI et al., 2008). Essas lesões no parênquima pulmonar pode levar a diversas complicações como hipóxia, choque séptico, lesões agudas em diversos órgãos como o coração, o fígado e os rins, hemorragia, infecções secundárias, dentre outras (TSANG, et al., 2020). 1.3 Epidemiologia da Covid-19 A transmissão da Covid-19 se dá de pessoa para pessoa através do contato direto com a pessoa infectada ou através de gotículas e aerossóis expelidas através da tosse ou espirros esses aerossóis permanecem viáveis no ar por até três horas, enquanto as gotículas podem viajar até 8 metros de distância e ficam viáveis em superfícies metálicas por até 14 dias e em superfícies plásticas por até 21 dias (HOSSEINI et al., 2021; SALIAN et al., 2021). No dia 18 de dezembro de 2019 foram identificados os primeiros casos de Covid-19 em Wuhan, China, onde 5 pacientes foram hospitalizados com síndrome respiratória aguda grave, tendo como o ponto epidemiológico em comum um mercado de frutos do mar e animais vivos da cidade (BOGOCH et al., 2020). Um mês após os primeiros casos, já haviam mais de 7000 ocorrências da doença apenas na China e quase 100 casos no resto do mundo em países como Alemanha, Canadá, Estados Unidos, França, Finlândia. O primeiro milhão de casos foi confirmado menos de 5 meses após os primeiros relatos, neste mesmo período de tempo ocorreram mais de 50 mil óbitos, sendo as áreas mais afetadas neste momento a Europa, com mais de 500 mil ocorrências da doença, e as Américas, com mais de 200 mil casos (ROTHAN et al., 2020; OMS, 2020). Em 6 meses foram relatados mais de 4.6 milhões de casos de Covid-19 e mais de 300 mil óbitos. As regiões mais afetadas continuaram sendo a Europa e as Américas, sendo os 2 países mais afetados os EUA com 1,4 milhões de ocorrências da doença e a Rússia com 290 mil casos (OMS, 2020). No primeiro ano da pandemia, foram registrados 75 milhões de ocorrências da doença e 1,6 milhões de óbitos, as regiões mais afetadas ainda eram a Europa e as Américas com mais de 55 milhões de casos somados e 1,3 milhões de óbitos, sendo os países mais 13 afetados os EUA e o Brasil (OMS, 2021). Dois anos após os primeiros casos reportados, haviam sido identificados mais de 270 milhões de ocorrências da doença e mais de 5 milhões de óbitos, sendo os países que registraram um maior aumento no número de casos os EUA, o Reino Unido e a França, durante este período de tempo foram identificadas 4 novas VOCs sendo elas à Alpha, Beta, Delta e à Gamma (OMS, 2022). Os dados mais recentes mostram um total de 500 milhões de ocorrências da doença e mais de 6 milhões de mortes mundialmente, sendo os países com a maior incidência de novos casos a Coreia do Sul, a Alemanha e a França, sendo identificada uma nova VOC sendo ela à Omicron (John Hopkins University, 2022). 1.3.1 Covid-19 no Brasil O Brasil teve seu primeiro caso de Covid-19 confirmado no dia 25 de fevereiro de 2020, sendo o primeiro país da América Latina afetado pela doença (Vital Strategies, VS). O Brasil foi fortemente afetado no início da pandemia no final de maio. Três meses após os primeiros relatos de Covid-19 no Brasil, já haviam mais de 500 mil ocorrências no país e quase 30 mil mortes, o que representava mais de 8% dos 6 milhões de casos e dos 370 mil óbitos da doença até o momento, mesmo o Brasil tendo menos de 3% da população mundial total. O único país que havia sido mais afetado que o Brasil durante este período de tempo havia sido os EUA (OMS, 2022). A segunda onda atingiu o país com ainda mais força, em março de 2021 o país havia acumulado 11,3 milhões de ocorrências da doença e 275 mil óbitos, totalizando quase 10% dos casos e óbitos globais até este momento pela Covid-19, este aumento de casos foi ocasionado principalmente pela identificação de uma nova VOC no país, à variante Gamma (THAKUR et al, 2021). Com o aumento no número de casos no país o sistema de saúde ficou sobrecarregado, com todos os estados, com exceção de Roraima, ficando com as taxas de ocupação dos leitos de UTI em estado crítico (Figura 2) (Fiocruz, VS). Figura 2: Evolução dos níveis de ocupação das UTIs do Brasil entre julho de 2020 e março de 2021 (Fiocruz, 2021). 14 A quantidade de novos casos no Brasil diminuiu durante o ano de 2022. Após o pico de casos em janeiro de 2022 ocasionado principalmente pelas festas de fim de ano e pela introdução de uma nova VOC, à Omicron, o país vem tendo uma diminuição nos números de novos casos da doença (100,000 ocorrências de Covid-19 por semana), registrando os menores números desde dezembro de 2021 (21,717 casos por semana), quando o país teve seus melhores números desde abril de 2020 (10,567 casos por semana). Até abril de 2022, o Brasil já contabiliza mais de 30 milhões de casos e mais de 660 mil mortes, totalizando 6% dos casos e 10% das mortes globais (Figura 3) (OMS, 2022). Figura 3: Número de casos semanais de Covid-19, Fonte: World Health Organization, 2022. 15 Porém, estes dados apresentam alguns problemas, pois diversos estudos apontam uma subnotificação de casos no país. Estima-se que haja uma subnotificação de 42% casos no país durante o ano de 2020. Em Curitiba um estudo sorológico estimou uma subnotificação de mais de 47% na cidade durante o ano de 2021, o que indica que o número de 42% de casos não identificados no país é muito próximo da estimativa real (AMARAL et al., 2020: HUERGO et al., 2022). Em 2020 estima-se que houve 42% de subnotificação dos óbitos causados por Covid-19 entre janeiro e junho. A estimativa foi feita através de um estudo que avaliou a quantidade de óbitos por SRAG nos anos anteriores à pandemia com os números obtidos durante os meses de janeiro e junho de 2020, quando foi encontrado um grande aumento nas mortes por SRAG, sendo a única nova fonte de mortes por esse tipo no país a Covid-19 (MARINHO et al., 2021). Essa subnotificação pode ter várias causas, como a dificuldade operacional de se realizar o diagnóstico para identificação da doença, devido a necessidade de equipamentos e mão de obra especializada, o alto custo dos testes que dificulta o acesso da população de baixa renda, a escassez de insumos no país, principalmente nos períodos iniciais da pandemia e a recomendação do governo de apenas realizar testes caso a pessoa esteja com sintomas graves, o que causa uma subnotificação de casos de leve e média gravidade (BASTOS et al., 2020; MARINHO et al., 2021; PRADO et al., 2020;). Ter uma estimativa real do número de casos é de extrema importância para realizar um manejo adequado dos recursos utilizados para combater a pandemia e de medidas de distanciamento pessoal e de controle da doença (MARINHO et al., 2021; PRADO et al., 2020). 16 Como pode ser observado os casos e óbitos relacionados a Covid-19 no Brasil vem diminuindo no ano de 2022, essa diminuição se dá principalmente devido à vacinação da população (MOURA et al., 2022). À vacinação teve início à partir da terceira semana epidemiológica de 2021, embora à vacinação tenha começado de forma simultânea em todas as regiões do país à evolução da cobertura vacinal se deu de formas distintas, às regiões sul e sudeste apresentaram uma evolução mais rápida quando comparada ao restante do país, enquanto à região sudeste alcançou uma cobertura vacinal de 50% da população na 38ª semana epidemiológica à região norte alcançou esta marca apenas na 48ª semana epidemiológica, está diferença se dá principalmente pelas proporções continentais do país, onde áreas mais remotas e com menos recursos possuem uma maior dificuldade em realizar os manejos adequados dos recursos (AQUINO et al., 2020; MOURA et al., 2022). Ao final do ano de 2021 a cobertura vacinal do país era de aproximadamente 70% da população, subindo para 82,7% da população em dezembro de 2022 (CNS, 2022; MOURA et al., 2022). 1.4 Diagnóstico Como pudemos analisar anteriormente, o Brasil tem tido dificuldades para diagnosticar efetivamente a doença, por ser um país de proporções continentais os recursos do país são distribuídos de formas desiguais, sendo assim áreas mais remotas do país possuem pouco ou nenhum acesso à infraestrutura necessária para realização da testagem adequada para obtenção de dados mais precisos sobre a pandemia (AQUINO et al., 2020). Uma das causas dessa dificuldade são os métodos diagnósticos disponíveis no mercado, sendo os principais testes utilizados para o diagnóstico da Covid-19 o RT-PCR, testes de antígeno utilizando o ensaio de fluxo lateral e o RT-LAMP. O RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), que é um método extremamente específico e sensível, sendo considerado o padrão ouro para detecção do vírus causador da doença. Porém, este tipo de diagnóstico apresenta alguns problemas como a necessidade de equipamento especializado e profissionais treinados para realizar o teste, além do alto custo e tempo de processamento das amostras. A alternativa são os testes de imunocromatografia para identificação de antígenos do vírus ou para detecção de anticorpos, que costumam ter um custo menor e 17 uma maior disponibilidade. Porém, possuem baixa sensibilidade, o que o torna uma opção menos confiável (FILCHAKOVA et al., 2022). Como discutido anteriormente, a necessidade de um diagnóstico preciso da doença é importante para a tomada de decisão do governo e de outras instituições de saúde quanto às medidas para diminuição do impacto na economia e no bem-estar das pessoas causado pela pandemia, e impedir uma maior disseminação do vírus. Portanto, é necessário o desenvolvimento de métodos diagnósticos capazes de prover um diagnóstico preciso de alta sensibilidade e baixo custo (MAJUMDER et al., 2021; PRADO et al., 2020). Com este objetivo em mente, diversos estudos estão buscando o desenvolvimento de novas técnicas para os diagnósticos point-of-care custo-efetivo, alguns exemplos recentes são a RT-LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification), CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) e dPCR (Digital PCR) (SHARMA et al., 2021). Para o desenvolvimento de um teste com alta sensibilidade é importante avaliar à carga viral dos diferentes tipos de amostra disponíveis para utilização, com essa finalidade foram realizados diversos estudos para avaliar a carga viral presente em diversos tipos de amostra, levando em conta às amostras utilizadas com maior frequência, o esfregaço de garganta possui uma carga viral de aproximadamente 7,99 x 10⁴ cópias por mL, o escarro possui uma carga de 7,5 x 10⁵ cópias por mL, já saliva e o swab nasal possuem uma média de carga viral de 6,76 x 10⁵ cópias por mL (PAN et al., 2020; WÖLFEL et al., 2020; YOKOTA et al., 2021) 1.4.1 RT-PCR O RT-PCR é o padrão ouro para o diagnóstico da Covid-19, sendo uma técnica extremamente específica devido a utilização de primers específicos para o vírus, apresentando uma especificidade de 100% uma sensibilidade de 95% Esta técnica também é utilizada para o diagnóstico de outras doenças virais, além da Covid-19, como a Zika, Dengue e HPV (ARBYN, et al., 2015; CORMAN et al., 2016; CORMAN et al., 2020; FILCHAKOVA et al., 2022). Para realização do teste, primeiramente é realizada a extração de RNA viral da amostra, em seguida é utilizada uma enzima para a transcrição reversa do RNA viral, que gera uma fita simples de DNA complementar. O cDNA é amplificado pela reação de PCR através de ciclos de desnaturação, anelamento e 18 extensão, utilizando primers específicos para genes do SARS-COV-2, transformando então esse cDNA em um DNA dupla fita. A reação é desenvolvida em um termociclador, o que aumenta o custo de estrutura necessária para o diagnostico, devido ao alto valor do equipamento (KEVADYA et al., 2021). A principal forma de coleta de amostra para este tipo de teste é o swab nasofaringeal. Porém, alternativas já foram testadas como soro, saliva, sangue, swab nasal e escarro, com variados níveis de sucesso (CARTER et al., 2020). O principal molde utilizado para criação dos primers é a região que codifica a proteína S, porém existem kits que utilizam primers para as regiões codificadoras ORF1ab e OR1a e das proteínas RdRp, E e N (AIELENE et al., 2022). Embora tenha alta especificidade, sensibilidade e versatilidade, a técnica de RT-PCR possui algumas desvantagens como seu alto custo devido a necessidade de mão de obra e equipamentos especializados, o que acaba limitando os laboratórios e hospitais capazes de realizar os testes causando uma carência em locais mais remotos. Além disso, o processamento das amostras é demorado devido a quantidade de etapas presentes no processo. 1.4.2 Imunocromatografia Os testes que utilizam a imunocromatografia, mais especificamente o ensaio de fluxo lateral, são a outra opção comercial de métodos diagnósticos para Covid-19. Estes testes utilizam o princípio da imunocromatografia e do ensaio de fluxo lateral para identificação de amostras contendo anticorpos contra o vírus (IgG e IgM). As principais vantagens são o baixo tempo necessário para a realização do teste, variando de 10 a 30 minutos, baixo custo quando comparado com o RT-PCR e facilidade para a realização e obtenção do resultado, já que não são necessários equipamentos ou mão de obra altamente qualificada, possibilitando assim a sua utilização para triagem de uma grande quantidade de pessoas. O teste é composto por um cassete contendo uma membrana de nitrocelulose com uma pad para aplicação da amostra, uma pad imobilizada com anticorpos IgM anti-humano conjugados com nanopartículas de ouro coloidal, uma membrana analítica que contém as 2 fitas visíveis no dispositivo, uma com um antígeno do SARS-CoV-2, sendo os principais antígenos utilizados neste tipo 19 de teste são a proteína N e a proteína S, e outra com um anti-mouse que serve como controle negativo da reação. Alguns testes utilizam uma fita para detecção de IgG e outra para detecção de IgM, utilizando anticorpos específicos para cada alvo além da fita controle (Figura 4). Estes testes possuem uma especificidade de 90% a 99% e sensibilidade 73% a 100%, nas condições ideais, variando de acordo com a fabricante do kit (HUANG et al., 2020; LI et al., 2020). Figura 4: Esquema do cassete de ensaio de fluxo lateral para detecção do SARS-CoV-2 (HUANG et al., 2020). Embora tenha baixo custo e facilidade de manuseio, este tipo de método diagnostico possui algumas limitações. O teste não consegue detectar anticorpos antes do sétimo dia de infecção, e antes do 14° dia de infecção a sensibilidade 20 deste teste ainda é relativamente baixa chegando aos 80% (FILCHAKOVA et al., 2022). 1.4.3 RT-LAMP RT-LAMP é uma das técnicas mais recentes a ser aprovada para o diagnóstico de Covid-19, eles se baseiam na amplificação isotérmica do material genético do vírus utilizando primers específicos sendo assim similar a técnica de RT-PCR. Porém, as maiores diferenças são que todo o processo do teste é realizado em uma mesma temperatura, sem a necessidade de se empregar um termociclador, sendo a reação incubada em um banho-maria ou termobloco. O tempo para realização do teste é muito inferior quando comparado ao RT-PCR, demorando entre 40 a 50 minutos para se obter o resultado, e o resultado do teste se dá através de uma reação colorimétrica ou através da leitura da fluorescência emitida como é o caso do kit diagnóstico desenvolvido pela Abbott (AIELENE et al., 2022; LU et al., 2020). O único kit diagnóstico comercial para diagnóstico da Covid-19 que utiliza o RT-LAMP é o ID NOW™ desenvolvido pela Abbott, este kit recebeu autorização de emergência da FDA para sua utilização. Este kit é composto por um tampão de eluição próprio, os primers específicos para o gene Rdrp liofilizados e um cartucho para a realização da reação, esse kit diagnóstico necessita de um equipamento específico fornecido pela Abbott para leitura do resultado, o que acaba encarecendo este método diagnóstico, este teste apresenta uma sensibilidade de 84% e uma especificidade de 99,8% (ABBOTT, 2022; TU et al., 2021). 1.4.4 Comparação entre os testes comerciais Como visto anteriormente os principais métodos diagnósticos comerciais utilizados para o diagnóstico da Covid-19 são o RT-PCR, testes de antígeno utilizando o ensaio de fluxo lateral e o RT-LAMP, esses testes possuem uma grande variação de preço e de sensibilidade e especificidade (tabela 3) (FILCHAKOVA et al., 2022). Tabela 3: comparação entre os testes comerciais disponíveis. Os dados de tempo para obtenção do resultado e o preço foram orçados pela Padrão medicina 21 diagnóstica personalizada no dia 07/10/2022, os dados de especificidade e sensibilidade foram obtidos na literatura (FILCHAKOVA et al., 2022; HUANG et al., 2020; TU et al., 2021) Tipo do teste Tempo para obtenção do resultado Especificidade Sensibilidade Preço RT-PCR 2 dias 100% 95% R$186,00 Teste sorológico 1 hora 90% a 99% 73% a 100% R$74,00 ID NOW™ 3 horas 99,8% 84% R$326,00 1.4.5 Métodos diagnósticos em desenvolvimento Como visto anteriormente existe uma carência de testes diagnósticos comerciais que combinem uma boa sensibilidade e especificidade para detecção da doença no início da infecção, baixo custo e que não necessitem de equipamento e mão de obra especializada para viabilizar a sua utilização em regiões mais remotas. Com isto em mente existem diversos estudos que buscam novas formas de detecção da doença. Algumas das metodologias mais promissoras são a CRISPR, sensores de nanomateriais, nanoscaffolds de DNA e Toehold switches (FILCHAKOVA et al., 2022; JIAO et al., 2020). O uso do CRISPR vem sendo aplicado no desenvolvimento de métodos diagnósticos para Covid-19 (FILCHAKOVA et al., 2022). As duas principais variações utilizadas são a DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) e a SHERLOCK (Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking). As maiores vantagens destas técnicas são o baixo custo por amostra, o baixo tempo para obtenção do resultado e a dispensa de equipamentos de alto custo. Porém, ainda é necessário mão de obra especializada para realização do teste (HOU et al., 2020). Zhang e colaboradores (2020) desenvolveram um teste diagnóstico utilizando a técnica de SHERLOCK, que consiste, primeiramente, na extração do RNA viral da amostra do paciente. Então, é realizada uma 22 amplificação isotérmica do RNA utilizando um kit de RPA (recombinase polymerase amplification). Após, são realizadas duas reações utilizando a enzima Cas13, uma para detecção do gene S e outra para o gene Orf1ab. Quando o RNA viral está presente na amostra, a Cas13 cliva uma molécula repórter, que é identificada utilizando um kit para ensaios de fluxo lateral da HybriDetect. Esse procedimento foi testado apenas utilizando fragmentos de RNA. Porém, ele apresentou resultados promissores nestes ensaios iniciais, sendo necessário ainda a validação utilizando amostras de pacientes (ZHANG et al., 2020). Broughton e colaboradores (2020) utilizaram a técnica DETECTR para o desenvolvimento de um diagnóstico para Covid-19, que consiste, primeiramente, em uma reação de RT-LAMP para amplificação do RNA viral extraído da amostra do paciente infectado. Esse RNA é então utilizado em duas reações contendo a enzima Cas12, uma utilizando um RNA guia para a detecção de SARS-CoV-2 e outra para detecção de outros vírus da família coronavírus. Nas reações positivas, a molécula repórter é clivada e o resultado é visualizado através de um ensaio de fluxo lateral. Foram realizados testes iniciais com 60 amostras, 30 negativas e 30 positivas, sendo verificada uma sensibilidade de 95% e uma especificidade de 100% (BROUGHTON et al., 2020). Nanomateriais podem ser utilizados de diversas formas para diagnóstico da Covid-19, seja conjugado com biossensores ou outras moléculas para aumento da efetividade dos testes. Exemplos são os ensaios de fluxo lateral que utilizam nanomateriais conjugados com moléculas repórteres ou como testes inteiros (KEVADIYA et al., 2021). Shan e colaboradores desenvolveram uma matriz de sensores baseados em nanomateriais para detecção do SARS-CoV-2 no ar exalado pela respiração das pessoas. O aparelho é formado por 8 quimioresistores com núcleos formados por nanopartículas esféricas de ouro, um sensor para detecção do ar exalado e sensores auxiliares de temperatura e umidade. Os quimioresistores detectam compostos orgânicos voláteis relacionados à infecção por SARS-CoV-2 e emitem sinais elétricos. Com a análise da frequência dos sinais elétricos, podem se obter diversos resultados como infecção por SARS-Cov-2, pessoa em estágio de recuperação da doença, curado, negativo ou infecção pulmonar por outros motivos. Esse teste se mostrou muito promissor, apresentando uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 90% nos testes iniciais, e de 61% em um segundo teste (SHAN et al., 2020). 23 Nanoscaffolds são biossensores capazes de reconhecer RNA, suas maiores vantagens são o baixo tempo para realização do teste e baixo custo por amostra. Porém, ainda é necessário um leitor de fluorescência para avaliação do resultado. Este biossensor é formado por uma fita repetitiva longa de DNA, que possui uma área de ancoramento para uma sequência complementar e um hairpin que captura uma molécula repórter, além de uma área de ancoragem para um oligo complementar. Quando este biossensor entra em contato com o RNA alvo, ele ativa uma reação em cascata através da abertura de um dos hairpins que se liga com um dos oligos complementares, desfazendo assim os hairpins presentes no biossensor. O resultado é a emissão de fluorescência capaz de ser captada por equipamentos específicos (Figura 5), sendo assim uma alternativa para o diagnóstico da Covid-19 (JIAO et al., 2020). Jiao e colaboradores (2020) desenvolveram nanoscaffolds capazes de detectar o RNA viral do SARS-CoV-2. Quando o RNA viral é reconhecido pelo biossensor, o corante fluorescente 5-carboxyfluorescein (FAM) presente dentro do hairpin do nanoscaffold é liberado, gerando o resultado que pode ser lido utilizando uma leitora de fluorescência. A especificidade foi testada utilizando sequências com 1 a 4 bases com mismatches em comparação à sequência alvo. Já a sensibilidade foi testada utilizando diversos comprimentos de onda, obtendo ótimos resultados em ambos os quesitos. Porém, ainda não foram testadas amostras clínicas. Outra limitação desta técnica é a necessidade de um equipamento especializado para realizar a leitura do resultado, o que acaba limitando o número de locais capazes de realizar o teste (JIAO et al., 2020). Figura 5: esquema do funcionamento dos nanoscaffolds para detecção do RNA de SARS-CoV-2. a: Síntese dos nanoscaffolds, através da hibridização do molde de DNA com as sondas H1 que possuem a FAM que emite fluorescência quando ativada e à sequência BHQ1 que serve para inibir à fluorescência do sensor no estado OFF, o oligo H2 possui sequências complementares ao H1 (T2 e C2). b: esquema da ativação do nanoscaffold, o RNA viral desfaz um dos hairpins do nanoscaffold ativando uma cascata onde o oligo H2 se liga à sequência H1 aberta e desfaz o restante dos hairpins presentes no nanoscaffold. c: exemplo de uma reação no estado OFF onde não há à molécula e não ocorre à reação em cascata 24 e uma reação no estado ON onde o RNA viral se liga ao H1 ativando à reação em cascata que gera à fluorescência (JIAO et al., 2020). 1.5 Toehold Switch Como visto anteriormente, existe uma carência de métodos diagnósticos comerciais que possuam um baixo custo por amostra, não necessitem de equipamentos específicos, sejam de fácil realização e possuam uma boa eficácia. Apesar de haver diversos estudos para o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos, a maioria destes testes não consegue preencher todos estes requisitos. Sendo assim, o desenvolvimento de um método diagnóstico que utilize como base biossensores do tipo toehold switch é interessante, pois estes são extremamente custo-eficiente, de fácil armazenamento e distribuição, e devido a flexibilidade da escolha do gene repórter, podem ser utilizados métodos 25 colorimétricos para leitura do teste. A tecnologia de toehold switches já foi estudada para o desenvolvimento de métodos diagnósticos para diversas doenças virais, como dengue, zika, ebola e norovírus. As maiores vantagens destes testes são o baixo custo, alta sensibilidade e especificidade (CHAU et al., 2020). Toehold switches são RNAs regulatórios projetados com base em estudos que descrevem a influência de estruturas secundárias na tradução do mRNA e conhecimento de termodinâmica e cinética de RNAs para cumprir essa função. Eles são capazes de alternar entre duas estruturas secundárias, uma que previna (estado off) e outra que promove a tradução (estado on), a partir da ligação de um RNA cognato transativador. O RNA é projetado para promover um deslocamento de fita a partir de um ponto de ancoragem linear. Neste sistema, as interações entre as espécies reativas são controladas cineticamente por hairpins ou complexos multifitas, que possuem domínios de fita simples expostos, os quais servem como ponto de ancoragem (toehold) (GREEN et al., 2014). Um sistema de Toehold switch é composto por duas fitas de RNA, denominadas switch (interruptor) e trigger (gatilho). O RNA switch é inserido na extremidade 5'-UTR do RNA mensageiro que contém a sequência codificadora do gene. O switch consiste em um módulo capaz de formar um hairpin que sequestra um sítio de ligação do ribossomo (RBS) e o códon inicial do gene. Este é ligado ao switch por uma sequência conectora (linker) de 21 nucleotídeos, que codificam aminoácidos de baixa massa molecular, fusionados à sequência N-terminal do gene repórter (GREEN et al., 2014). O RNA switch também contém a sequência de ancoragem que servirá de sítio para pareamento inicial do RNA trigger. O RNA trigger, por sua vez, é uma sequência de RNA fita simples capaz de se ligar ao RNA switch, desestruturar o hairpin, e expor as sequências do RBS e do códon inicial para que a transcrição do gene repórter seja ativada (Figura 6) (GREEN et al., 2014). Figura 6: Esquema ilustrando o funcionamento do Riboregulador. O RNA switch mantém a transcrição do gene repórter reprimida até que o RNA trigger seja adicionado à reação. O RNA trigger pareia com o RNA switch a partir da sequência de ancoragem (toehold) desestruturando o hairpin e liberando tanto o sítio de ligação do ribossomo (RBS) quanto o códon inicial do gene repórter. 26 Desta forma, a tradução é ativada. As sequências variáveis são mostradas em cinza (GREEN et al. 2014). A primeira aplicação de toehold switches para o diagnóstico de doenças virais foi por Pardee e colaboradores (2014) que desenvolveram uma “Paper-based Synthetic Gene Networks”, onde um switch é adsorvido em um papel filtro juntamente com uma mistura pronta para expressão gênica in vitro. A adição da amostra viral reidrata essa mistura e ativa o sistema de tradução e transcrição in vitro. Esse sistema se mostrou extremamente estável, mantendo atividade mesmo após 1 ano estocado a -80°C (Figura 7) (PARDEE et al., 2014). Esse sistema construído por Pardee e colaboradores apresentou ótimos resultados, permitindo diferenciar 2 cepas diferentes de Ebola com uma diferença de expressão de até 77 vezes, e detectar o RNA viral em concentração de 30 nM. Algumas outras vantagens deste sistema são o baixo custo por amostra, que foi estimado entre 35 a 65 centavos de dólar, e o método colorimétrico, que possibilita a visualização do resultado a olho nú, sem necessidade de equipamentos para a sua leitura (Figura 8). Este sistema foi construído em menos de um dia, mostrando a agilidade para o desenvolvimento deste tipo de sensor quando comparado com anticorpos para testes de ELISA e afins, que podem demorar de 2 a 6 meses para a sua construção (PARDEE et al., 2014). Este sistema se mostra extremamente promissor para o desenvolvimento de testes diagnósticos para doenças virais devido ao seu baixo custo, facilidade de 27 armazenamento e transporte e rapidez para o desenvolvimento de novos sistemas, o que é extremamente importante para doenças emergentes como a Covid-19. Figura 7: Comparação da fluorescência emitida pelo sistema de expressão entre uma amostra nova e uma amostra que passou um ano estocada a -80°C (PARDEE et al., 2014) Tempo (minutos) Figura 8: (A) teste de especificidade dos switches (SD, SE, SG e SH são switches específicos para a cepa de ebola do sudão e ZD, ZE, ZG e ZH para à cepa do Zaire) que obtiveram os melhores resultados utilizando as duas cepas de ebola. (B) teste colorimétrico dos switches onde as amostras amarelas são os controles e os switches que não foram ativados e o roxo são os switches ativados (PARDEE et al., 2014) 28 Pardee e colaboradores (2016) também desenvolveram um toehold switch para o diagnóstico do zika vírus. O sistema utilizado é similar ao construído para detecção do vírus ebola, sendo a maior diferença e adição de uma etapa de amplificação prévia do RNA viral através da técnica de NASBA (nucleic acid sequence-based amplification). A técnica de NASBA faz a amplificação do RNA em dois passos, um primeiro a 65°C para ligação dos primers, e um segundo a 41°C para uma amplificação isotérmica. Este segundo passo é necessário pois a carga viral presente nas amostras (1,2 fM a 365 fM) é abaixo do nível de sensibilidade do switch (30 nM). Como o teste utiliza um volume de microlitros do produto da NASBA, o custo do teste se mantém baixo e ocorre um aumento significante na sensibilidade do teste diagnóstico. A única desvantagem da adição deste passo é o tempo da reação de amplificação, que adiciona aproximadamente 2 horas no tempo de desenvolvimento do teste (Figura 9) (PARDEE et al., 2016). A adição de uma etapa de amplificação do RNA viral traz um grande aumento de sensibilidade ao teste. Porém, esta etapa pode trazer alguns problemas, como o aumento do tempo de realização, possibilidade de contaminação da amostra durante a reação de NASBA e a possibilidade de diminuição na especificidade do teste devido a reações cruzadas que podem ocorrer com os primers (PARDEE et al., 2016) Figura 9: Workflow da realização do teste para detecção do zika vírus desenvolvido por Pardee e colaboradores (PARDEE et al., 2016) 29 Zocca (2018) desenvolveu um toehold switch para a identificação do vírus da dengue. Para os testes com este switch, foi desenvolvido um vetor plasmidial utilizando a luciferase como gene repórter. Nos testes realizados, não foi possível avaliar a resposta a olho nú, porém foi avaliado um aumento de mais de 11 vezes de expressão gênica quando o switch está no seu estado ON comparado com o OFF. A proporção ideal para a reação foi a de 1:100 do plasmídeo contendo o switch em relação ao trigger específico (Figura 10). Nos testes com amostras clínicas, foram testadas amostras de pacientes infectados com Dengue e com Zika para avaliar a especificidade dos switches (Figura 11). Porém, devido ao baixo volume amostral e a baixa concentração viral das amostras (DENV-1 210 ng, DENV-4 64 ng e ZIKV 112 ng) não foi possível padronizar os testes. Mesmo assim, o switch apresentou uma maior afinidade pelas amostras de dengue, principalmente a DENV-4 (ZOCCA et al., 2018). Apesar da necessidade de uma leitora de luminescência para ler o resultado da reação de transcrição e tradução in vitro, o teste se mostrou efetivo na identificação de amostras virais de dengue e apresentou uma boa especificidade, mostrando novamente que esta tecnologia é muito promissora para o desenvolvimento de ferramentas para detecção de vírus de RNA. Figura 10: Amplitude de ativação do switch DENV10550(2) em reações com diferentes proporções de DNA plasmidial e RNA viral. Entre parênteses no eixo X é mostrado quantas vezes mais de trigger há em relação ao DNA plasmidial em ng. A barra vertical representa o desvio padrão (ZOCCA et al., 2018). 30 Figura 11: Ativação da expressão gênica, sob controle do Switch DENV10550(2), em reação com diferentes proporções entre DNA plasmidial e RNA viral (DENV-1, DENV-4 e ZIKV) extraído de amostras humanas. Entre parênteses, no eixo x, é mostrado quantas vezes mais RNA há na reação em relação ao DNA plasmidial em ng (ZOCCA et al., 2018). Ma e colaboradores (2018) desenvolveram um sistema utilizando toehold switches para a detecção do Norovirus, usando uma metodologia similar a que Pardee e colaboradores utilizaram para detecção do Zika vírus. Nos dois casos uma amostra viral é amplificada através de NASBA e aplicada em um dispositivo 31 contendo o RNA switch e a mistura para tradução e transcrição in vitro. A principal diferença da técnica aplicada por Ma e Pardee é a adição de uma etapa onde synbodies, peptídeos sintéticos com afinidade a um antígeno específico similar a um anticorpo monoclonal, ligados à beads magnéticas, são utilizados para concentrar as moléculas virais para aumentar a sensibilidade do teste (Figura 12). Por esse método, foi reportado um aumento de 1000 vezes na sensibilidade (Figura 13). Porém, a adição desta etapa aumenta consideravelmente o preço médio estimado do teste de menos de um dólar para o teste utilizando apenas o sistema baseado em papel para aproximadamente três dólares com a adição da etapa de amplificação por NASBA para quase nove dólares com a adição dos synbodies ligados às beads magnéticas (MA et al., 2018; PARDEE et al., 2016). Este estudo mostra novamente a versatilidade da tecnologia de toehold switches, que pode ser empregada com outras técnicas para aumentar sua eficiência de detecção e as formas como ela pode ser empregada, devido a possibilidade de se utilizar diferentes genes repórteres podendo ser utilizada em testes colorimétricos ou de fluorescência. Figura 12: Etapas do teste para detecção de Norovírus desenvolvido por Ma e colaboradores (MA et al., 2018). Figura 13: Amplitude de ativação do switch para norovírus em reações com diferentes concentrações virais, onde o eixo X é o fator de diluição da amostra, as colunas em azul são o teste direto sem a contração utilizado os synbodies e as colunas verdes são com a concentração utilizando os synbodies. 32 Como visto previamente, a tecnologia de toehold switch é utilizada para o diagnóstico de diversas doenças virais, de rápido desenvolvimento, baixo custo, de fácil armazenamento e transporte, possui uma excelente sensibilidade, se mostra extremamente específica e possui uma alta versatilidade, podendo ser utilizada em conjunto com diferentes técnicas, sendo assim muito interessante para o desenvolvimento de kits diagnósticos para Covid-19. 1.5.1 Toehold switch para detecção do SARS-CoV-2 Atualmente existem diversos estudos utilizando a tecnologia de Toehold switch para o desenvolvimento de testes diagnóstico para SARS-CoV-2, estes estudos utilizaram amostras de swab nasofaringeal e de saliva e utilizaram diferentes técnicas em conjunto com o toehold switch mostrando assim à versatilidade desta tecnologia (GERALDI et al., 2022). Chakravarty e colaboradores (2021) desenvolveram um sistema chamado de PHANTOM (PHAsed NASBA-Translation Optical Method) onde à amostra viral obtida do paciente é amplificada utilizando NASBA com primers específicos para a ORF1ab, e então o produto desta NASBA é utilizado em uma reação de transcrição e tradução in vitro juntamente com um toehold switch, o resultado obtido deste teste pode ser avaliado tanto por olho nu como pela utilização de equipamentos de leitura de luminescência (CHAKRAVARTY et al., 2021). Este sistema foi capaz de detectar o vírus em uma quantidade de até 100 cópias mostrando então uma capacidade de 33 detectar o vírus em quantidades extremamente baixas (Figura 14), e obteve uma sensibilidade de 85% e uma especificidade de 100% utilizando amostras de swab nasofaringeal mostrando-se uma tecnologia promissora (CHAKRAVARTY et al., 2021). Figura 14: Teste do sistema PHANTOM utilizando diferentes quantidades de RNA trigger. Fonte: CHAKRAVARTY et al., 2021. Park e colaboradores (2021) desenvolveram um sistema utilizando o toehold switch em conjunto com RT-LAMP para amplificação da amostra viral, para este teste foi utilizada a saliva como amostra, primeiramente foi adicionado um tampão para estabilizar o Ph da saliva juntamente com a proteinase K, essa solução com a saliva foi então colocada em um termobloco para realizar à inibição térmica da amostra, após essa inibição à amostra foi amplificada utilizando RT-LAMP, o produto desta amplificação foi então adicionado à uma reação de transcrição e tradução cell free, utilizando esta metodologia foi possível detectar o vírus com apenas 120 cópias, mostrando-se assim uma metodologia muito promissora (PARK et al., 2021). Hunt e colaboradores (2022) desenvolveram um sistema para detecção do SARS-CoV-2 utilizando o toehold switch liofilizado adsorvido em papel juntamente com o sistema de transcrição e tradução cell free e um inibidor de RNAses que permite à adição da saliva no sistema sem que as RNAses presentes na amostra interfiram no teste, após a adição da amostra ao sistema à reação ocorre 34 rapidamente se obtendo o resultado em até 30 minutos, esse teste foi capaz de detectar amostras com até 10 nM de RNA e um preço de fabricação de aproximadamente 0,50 centavos de dólar (HUNT et al., 2022). 1.6 Comparação entre os métodos diagnósticos em desenvolvimento Tabela 4: Comparação entre os diversos métodos diagnósticos em desenvolvimento apresentados. Os dados de sensibilidade e especificidade foram retirados dos artigos previamente. Teste Especificidad e Sensibilidade Amplificação Pontos positivos Pontos negativos DETECTR 100% 95% Sim Baixo custo, rápida execução, não necessita de equipamentos Mão de obra especializadaSHERLOCK - - Sim Sensores a base de nanomateriais 61%-90% 100 Não Fácil execução; resultado rápido Baixa especificidade ; resposta cruzada com infecções pulmonares Nanoscaffolds - - Não Resultado rápido; Baixo custo Mão de obra especializada; equipamento para leitura do resultado PHANTOM 100% 85% Sim Baixo custo; Não necessita de equipamentos Mão de obra especializadaToehold + RT-LAMP - - 35 especializado s Paperbased Toehold - - Não Baixo custo; Não necessita de mão de obra especializada; resultado rápido - 2. Objetivo Desenvolvimento de um riboregulador do tipo toehold switch para a detecção do vírus SARS-CoV-2 2.1 Objetivos específicos ● Desenhar os riboreguladores do tipo toehold switch; ● Analisar in silico os toehold switches; ● Construir os vetores de expressão contendo os toehold switches e o gene repórter; ● Confirmar a funcionalidade do sistema através de testes de transcrição e tradução in vitro 3. Materiais e métodos Os cultivos de E. coli top 10 foram realizados em meio de cultura Luria-Bertani (LB) com a adição do antibiótico cloranfenicol para triagem dos clones recombinantes. A linhagem foi utilizada para construção dos plasmídeos, armazenamento e propagação dos mesmos. 36 3.1 Seleção das sequências-alvo para construção dos RNA switches Nesta primeira etapa foram identificadas sequências-alvo no genoma do vírus Sars-Cov-2 através de alinhamentos realizados com o software CLC genomics workbench. Foram alinhados os genomas das principais cepas de Sars-Cov-2 encontradas na América Latina para anotação das principais mutações e as áreas mais conservadas do genoma destas cepas. Após esta análise, foi realizado o alinhamento com os genomas de cepas dos vírus HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, MERS-Cov e Sars-Cov (Tabela 5), para anotação das áreas onde ocorre sobreposição entre os genomas. Essa análise foi realizada para evitar a resposta cruzada dos switches desenhados para o reconhecimento do Sars-Cov-2 com o RNA dos vírus previamente citados. Os principais parâmetros escolhidos para os alvos foram sequências que são traduzidas para proteínas por serem trechos com uma menor taxa de mutação, áreas conservadas entre as principais cepas de Sars-Cov-2 encontradas na América Latina, trechos onde não ocorre a sobreposição com os outros vírus previamente mencionados. Tabela 5: Identificação das sequências genômicas virais utilizadas nos alinhamentos Vírus Código de identificação (NCBI) País de origem SARS-CoV-2 MT126808 Brasil SARS-CoV-2 MT350282 Brasil SARS-CoV-2 MT256924 Colômbia SARS-CoV-2 MT470219 Colômbia SARS-CoV-2 MT263074 Peru SARS-CoV-2 MT466071 Uruguai SARS-CoV NC_004718 Canadá MERS-CoV NC_019843 - 37 HCoV-229E NC_002645.1 - HCoV-HKU NC_006577.2 - HCoV-NL63 NC_005831.2 Holanda HCoV-OC43 NC_006213.1 USA 3.2 Design in silico dos biossensores Os Toehold switches foram desenhados in silico usando o pacote de design e análise de RNAs NUPACK (Zadeh et al. 2011), a partir de dois scripts desenvolvidos para este tipo de biossensor, à diferença entre estes scripts está na utilização de um sítio de ligação do ribossomo diferente e um pequeno espaçador adicionado ao script otimizado (Figura 15a e Figura 15b). Após o desenho in silico, foram realizados cálculos utilizando o software RBS calculator para se obter níveis aproximados da expressão gênica sob controle dos switches no seu estado ON e OFF, e da energia necessária para a ligação do ribossomo. Após as clonagens iniciais e dos testes para determinar a amplitude dinâmica de ativação, novas sequências de RNA switches foram projetadas utilizando um script otimizado. Figura 15: Scripts desenvolvidos para o design dos toehold switches no pacote NUPACK. A) Primeiro script, utilizado para projetar os primeiros Toehold switches, incluindo o 7, 8 e 13. B) Script otimizado utilizado para o design dos Toehold switches 79 e 84. 38 NUPACK design Toehold switch # design a toehold switch # design material, temperature (C), and trials material = rna temperature =37.0 trials = 6 # target structures structure switch = U20 D18 (U3 D5 U10 U3) structure trigger = U40 structure detect = D40 + U42 # sequence domains # a* is the trigger; a is the reverse complement of the trigger # domain c = RBS + codon inicial # AUA at the end of the RBS may be exchanged for any 3 nt combination of A and U domain a = N40 domain b = N6 domain c = N3 AGGAGGAAUA N2 ATG #18 domain d= N18 # thread sequence domains onto target structures switch.seq = a b c d trigger.seq = a* detect.seq = a* a b c d # specify stop conditions for normalized ensemble defect # default: 1.0 (percent) for each target structure trigger.stop = 5.0 # larger defect for unpaired structures # prevent sequence patterns prevent = AAAA, CCCC, GGGG, UUUU, KKKKKK, MMMMMM, RRRRRR, SSSSSS, WWWWWW, YYYYYY 39 NUPACK design Toehold switch 2 # design a toehold switch # design material, temperature (C), and trials material = rna temperature = 37.0 trials = 10 # target structures structure switch = U20 D18 (U3 D5 U15 U3) structure trigger = U40 structure detect = D40 + U47 # sequence domains # a* is the trigger; a is the reverse complement of the trigger # domain c = RBS + codon initial # RBS may be exchanged by a sequence of purines RRRRRRR domain a = N40 domain b = N6 domain c = N3 VVVVVAGAGGAGWWW N2 AUG #23 domain d = N18 # thread sequence domains onto target structures switch.seq = a b c d trigger.seq = a* detect.seq = a* a b c d # specify stop conditions for normalized ensemble defect # default: 1.0 (percent) for each target structure trigger.stop = 5.0 # larger defect for unpaired structures # prevent sequence patterns prevent = AAAA, CCCC, GGGG, UUUU, KKKKKK, MMMMMM, RRRRRR, SSSSSS, WWWWWW, YYYYYY 3.3 Construção do sistema de expressão Os RNAs switch desenhados in silico foram comprados como sequências de DNA sintéticas em dupla fita diretamente, como gBlocks, ou como oligonucleotídeos de fita simples, fita direta e fita reversa, que foram então anelados. Cada sequência 40 correspondente a um RNA switch foi clonada no plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc (Figura 16), sob controle do promotor forte T7 e fusionadas ao gene repórter através da reação de Golden gate ou através de reações de digestão e ligação. Como gene repórter foi usada a Epic Luciferase, que realiza uma reação de oxirredução para gerar luminescência quando adicionado o substrato luciferina. Figura 16: Mapa do plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc (3797 pb). O plasmídeo possui o promotor T7, o gene repórter EPIC Luciferase, terminador T500 e o gene de resistência a cloranfenicol. Figura construída usando o software SnapGene 41 O plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc foi utilizado em reações de golden gate (Tabela 6) juntamente com os oligos dos switches desenhados, utilizando o primeiro script descrito para inserção dos switches no plasmídeo. Porém, devido às dificuldades encontradas para a transformação do plasmídeo utilizando está técnica, os novos oligos para os switches desenhados utilizando o script otimizado foram construídos com o sítio de ligação da enzima de restrição SalI ao final do switch, permitindo a utilização das reação tradicionais de digestão e ligação para clonagem dos oligos no plasmídeo alvo (Tabela 7 e 8). Essa reação foi então utilizada no protocolo de transformação de E. coli por choque térmico, utilizando os 20 µl da reação de Golden Gate ou de ligação e 50 µl de Escherichia coli Top10 quimicamente competente. Essa reação foi então incubada em gelo por 30 minutos, após este tempo a reação foi colocada em banho maria à 42 °C por 30 segundos e incubada em gelo novamente por 2 minutos. Após este tempo, foi então adicionado 250 µl de meio SOC (5g de extrato de levedura, 20g de triptona, 0,584 g NaCl, 0,186 g KCl, 2,4 g MgSO4 e 20 ml de glucose 20% por litro). A mistura foi incubada por 1h à 37 °C sob agitação de 220 rpm. Após a incubação foram plaqueados 100 µl de reação em uma placa de meio LB sólido com adição de cloranfenicol. Tabela 6: Reação de Golden Gate. As reações foram incubadas a 37°C por 5 minutos e 16°C por 5 minutos por 60 ciclos, e incubação final a 65°C por 5 minutos. Componentes Volume Plasmídeo 25 ng Inserto 500 ng Buffer 10x 2 µl T4 DNA Ligase 0,5 µl RE BsaI (Fastdigest) 0,5 µl H2O MiliQ QSP. 20 µl Volume Total 20 µl 42 Tabela 7: Reação de digestão por enzimas de restrição. As reações foram incubadas a 37°C por 2 horas seguida por 80°C por 20 minutos para inativação das enzimas de restrição. Componentes Volume Plasmídeo ou inserto 600 ng Buffer 10x 2 µl RE XbaI (Fastdigest) 1 µl RE SalI (Fastdigest) 1 µl H2O MiliQ QSP. 20 µl Volume Total 20 µl Tabela 8: Reação de ligação de DNA, foi utilizado a proporção de 1:20 de vetor (3893 pb) para inserto (151 pb). As reações foram incubadas a 22°C por 2 horas ou 16°C por overnight. Componentes Volume Plasmídeo 60 ng Inserto 46 ng Buffer 10x 2 µl T4 DNA Ligase 0,5 µl H2O MiliQ QSP. 20 µl Volume Total 20 µl Para a confirmação dos clones recombinantes foi feita a extração plasmidial através do kit PureYield™ Plasmid Miniprep System da Promega, para a primeira triagem foi feita uma reação de digestão enzimática utilizando enzimas específicas 43 para cada Switch (Tabela 9). Os plasmídeos potencialmente positivos foram submetidos ao sequenciamento de DNA pelo método de Sanger para confirmar se as construções estavam corretas e posteriormente foram realizados os alinhamentos das sequências esperadas dos plasmídeos contendo os switches com a sequência obtida através do sequenciamento através do software Benchling [Biology Software]. (2022). Estes plasmídeos transformados foram primeiramente propagados e clones recombinantes de E. coli portando o plasmídeo foram estocados em glicerol a -80ºC. Amostras desses plasmídeos contendo os switches foram então utilizadas para os testes de funcionalidade dos Toehold Switches. Tabela 9: Reação de digestão enzimática para triagem dos clones recombinantes. As reações foram incubadas a 37°C por 2 horas para a digestão e 65°C por 20 minutos ou 80°C por 10 minutos para inativação das enzimas. Componentes Volume Plasmídeo 600 ng Buffer 10x 2 µl Enzima de restrição I 1 µl Enzima de restrição II 1 µl H2O MiliQ QSP. 20 µl Volume Total 20 µl 3.4 Síntese dos RNA Triggers A síntese dos RNAs triggers foi realizada por reação de transcrição in vitro, utilizando a T7 RNA polimerase (Promega) e os oligos de DNA molde dos anelados em fita dupla (Tabela 10). Após a transcrição in vitro, foi realizada a degradação do molde de DNA utilizando DNAse I (Promega), onde foi adicionado 5 µl de DNAse, 6,5 µl do buffer da DNAse e 3,5 µl de H2O RNAse free ao tubo da reação de transcrição, essa reação foi então incubada à 37 °C por 1 hora a 400 rpm. Após a degradação do molde, foi realizado o protocolo de precipitação com etanol para 44 purificação da amostra de RNA. Primeiramente foi adicionado 10% do volume total (6,5 µl para uma reação de 65 µl) de acetato de sódio 3 M e 3 vezes o volume de etanol 100% (214,5 µl para 71,5 µl de reação) à reação. A mistura foi incubada à -80°C por 30 minutos à uma hora, dependendo do tamanho do inserto (quanto menor o inserto maior o tempo de incubação), após este tempo a reação foi centrifugada à 4°C por 30 minutos à 17.000 G. O sobrenadante foi então descartado, adicionados 50 µl de etanol 70% e realizada outra centrifugação de 5 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi retirado e o pellet foi seco por 10 minutos a 40°C em um termobloco. Após este tempo, o pellet foi ressuspendido em 20 µl de H2O RNAse free. Os plasmídeos contendo os toehold switches passaram por este mesmo processo de purificação através de precipitação com etanol para remoção de qualquer contaminação por RNAses. Todo o processo foi realizado utilizando reagentes RNAse free e tomando os devidos cuidados para não contaminar as amostras com RNAses. Tabela 10: Reação de transcrição in vitro. As reações foram incubadas a 37°C por 16h sob agitação de 400 rpm em termobloco. Componentes Volume DNA 500 ng Buffer para transcrição 5X 10 µl DTT 100mM 5 µl T7 RNA Polimerase 40 U H2O MiliQ QSP. 50 µl Volume Total 50 µl 3.5 Teste de funcionalidade e especificidade dos RNAs switch A funcionalidade dos RNAs switch foi testada contra sequências sintéticas correspondentes aos RNAs virais delimitados como sequências trigger. Por uma questão prática, inicialmente não foram testados RNAs virais completos, que seriam difíceis de produzir em quantidades adequadas in vitro, já que o sistema de 45 transcrição com a T7 polimerase é mais eficiente para sequências curtas. Usar sequências curtas de RNA trigger não deve distorcer os resultados já que, segundo Pardee et al. (2014), pequenos RNAs trigger fornecem uma indicação representativa da função dos sensores. Assim, a partir das medidas de ativação de expressão gênica geradas por cada RNA switch testado, serão calculadas as amplitudes dinâmicas de ativação. A especificidade de cada RNA switch construído foi testada a partir da incubação da reação de expressão gênica in vitro com RNAs não específicos, ou seja, em reações cruzadas onde o RNA alvo de um switch foi tentado com outro switch. A reação de expressão in vitro foi realizada utilizando o Trigger de RNA obtido na etapa 3.4, os switches de RNA previamente construídos e o kit E. coli T7 S30 extract system for circular RNA (Promega). O kit contém um extrato de E. coli BL21 que possui a T7 RNA polimerase para a transcrição e todos os componentes necessários para este processo e para a tradução de proteínas, exceto os aminoácidos que foram adicionados separadamente à reação. Os testes de funcionalidade foram realizados com amostras sintéticas de RNA, que representam os alvos escolhidos no genoma do Sars-CoV 2. Foram testadas diferentes concentrações de plasmídeo contendo o switch para padronização da reação. Já a quantidade de trigger utilizada na reação foi de 1:100 (plasmídeo-switch:RNA-trigger), a qual foi padronizada em experimentos previamente realizados pelo grupo de pesquisa. A reação foi incubada em banho maria a 30°C por até 3 horas, com coleta de alíquotas nos tempos de 30 minutos, 1 hora e 2 horas. As reações foram paradas com a adição de BSA 1% (m/v) numa proporção de 1:10 (reação:BSA) para inibir a reação. Após a reação de expressão in vitro, foram realizadas as reações de produção de luminescência utilizando luciferina como substrato para a enzima Epic Luciferase, controlada pelo switch. Esta reação foi realizada em uma placa branca de 96 poços, a qual foram adicionados aos poços 50 µl de solução de luciferina e 10 µl da reação contendo a luciferase. A reação foi realizada na leitora de placas Infinite® M200 Pro (Tecan) a uma temperatura de 25°C em 15 ciclos de 5 segundos a uma agitação de 158 rpm e com um tempo de integração de 1000 ms. 46 4. Resultados e discussão 4.1 Seleção das sequências-alvo para construção dos RNA switches Nesta primeira etapa foi realizado o alinhamento de sequências de diferentes cepas de Sars-Cov-2 com Sars-Cov e MERS-Cov para identificação de possíveis sequências-alvo para o desenho dos biossensores. Através dos alinhamentos, foi possível identificar diversas áreas do genoma do Sars-Cov-2 que se mostravam conservadas entre diferentes cepas do vírus, possibilitando assim a identificação de diversos alvos para o desenho de Toehold switches. Estes alvos apresentam uma baixa similaridade entre si e com as sequências dos vírus previamente descritos, sendo assim possível realizar o desenho de biossensores que sejam específicos para o SARS-CoV-2 e que não apresentem reações cruzadas com vírus similares. Dentre eles, foram escolhidos inicialmente 15 alvos, os alvos 1 a 9 tem como base à Orf1Ab Polyprotein e os alvos 10 a 15 tem como base à o gene da proteína S (Tabela 11). Tabela 11: alvos do genoma de Sars-Cov-2 escolhidos após a análise dos alinhamentos dos genomas para o desenho dos biossensores. Alvos Sequência Alvo 1 TCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTA Alvo 2 TTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATA Alvo 3 CCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCC Alvo 4 TATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGA Alvo 5 CGAATACCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGT Alvo 6 GGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAGA Alvo 7 TTGTACAGAAAGTGTGTTAAATCCAGAGAAGAAACTGGCC Alvo 8 TTTACAACCATTAGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAA Alvo 9 CAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATT 47 Alvo 10 ACATGTCTCTGGGACCAAAGGTACTAAGAGGTTTGATAAC Alvo 11 AAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTA Alvo 12 GAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACG Alvo 13 CTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAA Alvo 14 AAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGA Alvo 15 TCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGT 4.2 Design in silico dos biossensores Após a escolha destes alvos, foi utilizado o software NUPACK para o desenho dos Toehold switch. Foram desenhados dois biossensores para cada uma das 15 sequência-alvo utilizando o código desenvolvido. Após o desenho dos switches, o comportamento dos mesmos sozinhos e em solução com os RNAs alvo foi simulado. Os switches desenhados apresentaram a estrutura secundária desejada, ocultando o RBS e códon inicial do gene repórter. Ainda, todos os switches formaram o pareamento programado com seus respectivos RNAs-alvo, de forma a liberar o RBS e ATG inicial, com 100% de complexo sendo previsto para o equilíbrio (Figura 17 e 18). Após desenho e análise dos biossensores, foram realizados testes utilizando o software RBS calculator para avaliar os níveis de expressão e energia necessária para ligação do RBS nas variações ON e OFF dos biossensores, onde a variação ON seria o nível de expressão com o hairpin desfeito pelo RNA trigger e a OFF com o hairpin ativo (Tabela 12). Após estes testes in silico, foram escolhidos os 3 biossensores mais promissores para a realização de testes in vitro (Tabela 13). Os Toehold switches escolhidos apresentam altas taxas de tradução quando ativados e quantidades quase nulas de tradução quando inativados, mostrando resultados promissores para os testes in vitro. Estes Switches foram então comprados como oligos contendo os switches e o promotor T7 para clonagem em plasmídeo. Devido a dificuldades para a clonagem dos switches alvo, foi realizado o design de 10 novos biossensores para os alvos 7 e 8 utilizando um script otimizado, que apresentaram melhores resultados nos testes in silico do primeiro grupo de switches desenhados. Os biossensores que utilizam este novo script apresentaram 48 uma melhora considerável em todos os parâmetros avaliados (Tabela 14), sendo o switch mais promissor para cada um destes 2 alvos comprados como oligos (Figura 19, 20 e Tabela 15). Os oligos construídos para estes novos switches tiveram o sítio de ligação da enzima de restrição SalI adicionado entre a estrutura do biossensor e o gene EPIC luciferase. Essa alteração foi realizada para possibilitar a utilização do método tradicional de digestão e ligação para a clonagem destes alvos no vetor de expressão alvo, ao invés da inserção por método de Golden Gate. Figura 17: Análise in silico dos biossensores escolhidos através do NUPACK. Do lado direito está uma escala com a probabilidade de formação das estruturas no equilíbrio. quanto maior o número na escala, maior a probabilidade da interação ocorrer no equilíbrio. A) estrutura alvo dos switches. B) estrutura do switch 7b. C) estrutura do switch 8b D) estrutura do switch 13a. 49 Figura 18: Análise in silico dos biossensores escolhidos através do NUPACK. Do lado direito está uma escala com a probabilidade de formação das estruturas no equilíbrio. quanto maior o número na escala, maior a probabilidade da interação ocorrer no equilíbrio. A) estrutura alvo dos complexos switch + trigger. B) estrutura do complexo formado pelo switch 7b ligado ao trigger específico. C) estrutura do complexo formado pelo switch 8b ligado ao trigger específico. D) estrutura do complexo formado pelo switch 13a ligado ao trigger específico. 50 Tabela 12: Simulação com o software RBS Calculator dos três switches desenhados. TR off - taxa de tradução off, ΔGt Off - energia para ligação do ribossomo off, TR on - taxa de tradução on, ΔGt On - energia para ligação do ribossomo on. Alvo TR Off ΔGt Off TR On ΔGt On s7b 8,00 1,00 11286 -4,92 s8a 2,46 3,82 6630 -3,74 51 s13a 6,23 1,75 7067 -3,38 Tabela 13: Sequências de RNA dos Toehold Switches projetadas utilizando o script otimizado para o NUPACK. Alvo Switch Alvo s7b GGCCAGUUUCUUCUCUGGAUUUAACA CACUUUCUGUACAAGCUUAUAGCAGG AGGAAUAAGAUGGUACAGAAAGUGUG UUAA Alvo s8b UUCAACAGCUUCACUAGUAGGUUGUU CUAAUGGUUGUAAACCUUAUGAUAGG AGGAAUAAGAUGUACAACCAUUAGAA CAAC Alvo s13a UUCUACAGUGAAGGAUUUCAACGUAC ACUUUGUUUCUGAGGCUUAUAGCAG GAGGAAUAAGAUGCAGAAACAAAGUG UACGU Tabela 14: Simulação com o software RBS Calculator dos dois switches mais promissores desenhados com o script otimizado. TR off - taxa de tradução off, ΔGt Off - energia para ligação do ribossomo off, TR on - taxa de tradução on, ΔGt On - energia para ligação do ribossomo on. Alvo TR Off ΔGt Off TR On ΔGt On s79 2,14 14,13 45514 -8,02 s84 0,76 16,42 19095 -6,09 Figura 19: Análise in silico dos biossensores escolhidos através do NUPACK. Do lado direito está uma escala com a probabilidade de formação das estruturas no 52 equilíbrio. quanto maior o número na escala, maior a probabilidade da interação ocorrer no equilíbrio. A) estrutura alvo dos switches. B) estrutura do switch 79. C) estrutura do switch 84. Figura 20: Análise in silico dos biossensores escolhidos através do NUPACK. Do lado direito está uma escala com a probabilidade de formação das estruturas no equilíbrio. quanto maior o número na escala, maior a probabilidade da interação ocorrer no equilíbrio. A) estrutura alvo dos complexos switch + trigger. B) estrutura do complexo formado pelo switch 79 ligado ao trigger específico. C) estrutura do complexo formado pelo switch 84 ligado ao trigger específico. 53 Tabela 15: Sequências de RNA dos Toehold Switches desenhados utilizando o script otimizado. Alvo Switch Alvo s79 GGCCAGUUUCUUCUCUGGAUUUAACA CACUUUCUGUACAAGCUAUAAGACAG GCAGAGGAGUAUAGUGGUACAGAAAG UGUGUUUA Alvo s84 UUCAACAGCUUCACUAGUAGGUUGUU CUAAUGGUUGUAAAGCUAUACGGGAG CCAGAGGAGUAUAAUGUACAACCAUA AGAACAAC 54 4.3 Construção do sistema de expressão A clonagem dos switches iniciais através da técnica de Golden gate se mostrou desafiadora sendo possível realizar apenas a clonagem de um dos três alvos propostos. Utilizando essa técnica, o único switch clonado foi o s7b (Figura 21). Após realizada a troca para os oligos desenhados para serem clonados através da metodologia tradicional de digestão e ligação, técnica mais simples e bem descrita na literatura, foi possível realizar a clonagem de dois de três dos switches propostos (Figura 22 e Figura 23). As metodologias de digestão e ligação se mostraram eficientes para a clonagem dos vetores de expressão, assim como a transformação dos alvos através da técnica de choque térmico possibilitando a rápida clonagem dos switches nos vetores de expressão. A triagem através da digestão enzimática se mostrou eficiente para a seleção dos clones recombinantes, sendo possível observar as bandas nos tamanhos esperados no gel de agarose após a eletroforese. O sequenciamento pelo método de Sanger possibilitou a confirmação da construção dos vetores de expressão realizados até o momento (Figuras 24, 25 e 26), possibilitando o avanço para as próximas etapas onde foram realizados os testes para avaliar a funcionalidade dos switches construídos. Para tanto, foi realizada a análise do nível de expressão da proteína EPIC luciferase em testes de cinética, utilizando os triggers específicos e inespecíficos. 55 Figura 21: Eletroforese em gel de agarose para triagem dos clones recombinantes contendo o plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc ligado ao Switch 7b através da reação de golden gate. Todas as amostras foram digeridas com a enzima de restrição HindIII. C–Controle negativo, plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc não transformado. 31–35 e 41-45 amostras das transformações de E. coli com a reação de Golden gate. Neste gel, a única colônia potencialmente positiva foi a 42, que apresentou duas bandas de tamanhos aproximados de 3267 pb e 593 pb. Figura 22: Eletroforese em gel de agarose para triagem dos clones recombinantes contendo o plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc ligado ao Switch 8a através de reações de restrição e ligação. Todas as amostras foram digeridas com as enzimas de restrição SpeI e HindIII. 1 a 9) plasmídeos extraídos das colônias de E. coli transformantes. Neste gel, as colônias potencialmente positivas foram a 1, 2, 4 e 6, as quais apresentam uma banda de 618 pb. 56 Figura 23: Eletroforese em gel de agarose para triagem dos clones recombinantes contendo o plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc_s8a ligado ao switch 79. Todas as amostras foram digeridas com as enzimas de restrição SpeI e HindIII. C - Amostra do plasmídeo pSB1C3_T7-EpicLuc_s8a digerido e utilizado como controle negativo. As amostras identificadas como s79 1:50 1-7 e s79 1:20 1-7 correspondem aos plasmídeos extraídos das colônias de E. coli transformantes. Neste gel as colônias potencialmente positivas foram a s79 1:50 2, 5 e 7, que não apresentam a banda de 618 pb. Figura 24: Alinhamento da sequência do pSB1C3_T7-EpicLuc contendo o Switch 7b com as sequências obtidas através do sequenciamento das fitas direta e reversa, por método de Sanger, da amostra “42”, apresentada na figura 21 (Benchling). Figura 25: Alinhamento da sequência do pSB1C3_T7-EpicLuc contendo o Switch 8a com as sequências obtidas através do sequenciamento por método de Sanger da amostra 2 obtida após a triagem por digestão enzimática (Benchling). 57 Figura 26: Alinhamento da sequência do pSB1C3_T7-EpicLuc contendo o Switch 79 com as sequências obtidas através do sequenciamento por método de Sanger das 3 amostras positivas (2, 5 e 7) apresentadas na figura 23 (Benchling). 4.4 Teste de funcionalidade e especificidade dos RNAs switch O primeiro switch a ter sua funcionalidade avaliada foi o s7b, que utiliza como base a sequência alvo 7. Primeiramente, foi feita a padronização da quantidade de plasmídeo necessária para uma ativação satisfatória do switch. 58 Neste primeiro teste, demonstrou-se expressão gênica adequada utilizando apenas 30 ng de plasmídeo, sendo então utilizada como padrão para a realização dos testes de especificidade (Figura 27). Considerou-se como uma expressão gênica adequada para o controle níveis correspondentes a atividade luciferase de até 500 unidades arbitrárias de luminescência emitida (u.a.). Isso corresponde a um valor pouco maior do que uma reação em branco (sem molde), que apresenta resultado de até 100 u.a. Após esta padronização, foi realizado o teste utilizando triggers inespecíficos para avaliar a especificidade do switch. O teste foi realizado de forma cruzada, utilizando o switch 7b com o trigger 8. O resultado obtido foi negativo, com as quantificações indicando nenhuma diferença com o trigger específico (Figura 28). Porém, neste novo teste, o trigger específico não apresentou o resultado positivo obtido anteriormente sendo assim descartado. Figura 27: Resultados da reação de expressão in vitro da luciferase sob controle do switch 7b, contida no plasmídeo pSB1C3_T7-Switch7b-EpicLuc. A) reação utilizando 10 ng de plasmídeo contendo o switch e trigger na proporção de 1:100 (aproximadamente 9.79 x 10¹³ cópias) . B) reação utilizando 20 ng de plasmídeo contendo o switch e trigger na proporção de 1:100 (aproximadamente 1.96 x 10¹⁴ cópias). C) reação utilizando 30 ng de plasmídeo contendo o switch e trigger na proporção de 1:100 (aproximadamente 2.93 x 10¹⁴ cópias) D) reação utilizando 50 ng de plasmídeo contendo o switch e trigger na proporção de 1:100. A reação com 30 (aproximadamente 4.89 x 10¹⁴ cópias) ng de plasmídeo se mostrou a mais eficiente sendo utilizada para o teste com triggers inespecíficos. 59 Figura 28: Resultados da reação de expressão in vitro da luciferase sob controle do switch 7b, contida no plasmídeo pSB1C3_T7-Switch7b-EpicLuc. Neste teste foi utilizada uma quantidade de 30 ng do plasmídeo, que se mostrou a quantidade mais eficiente, e uma proporção de 1:100 (aproximadamente 2.93 x 10¹⁴ cópias) de plasmídeo para trigger. Na reação controle foi utilizado apenas o switch sem adição do trigger. Como trigger específico foi utilizado o trigger 7 e como trigger inespecífico foi utilizado o trigger para o alvo 8. 60 Foram realizados dois testes para avaliação do sistema s8a, um utilizando uma quantidade de 80 ng de plasmídeo e outro utilizando 20 ng de plasmídeo. A quantidade de 80 ng resultou em um aumento de quase 3 vezes no nível de luminescência, sendo possível observar um aumento no nível de expressão do switch já com 30 minutos. Porém, não foi analisado o nível de expressão com 2 horas pois os níveis de luminescência com uma hora já se apresentavam bastante elevados. Sendo assim necessária a repetição do teste com quantidade menor de plasmídeo para avaliar a viabilidade deste switch. Ainda assim, foi possível identificar que este biossensor se mostra promissor, apresentando atividade luciferase pelo menos três vezes maior para o trigger específico em relação ao controle (Figura 29). Foram então realizados novos testes utilizando 20 ng de plasmídeo contendo o toehold switch s8a, este novo teste apresentou resultados promissores, gerando um alto nível de expressão gênica a partir do switch quando adicionado o trigger específico e um nível adequado de repressão do gene repórter nos controles utilizados, apresentando uma luminescência de até 3 vezes maior na reação utilizando o trigger específico quando comparado à reação controle no tempo de 1 hora (Figura 30). Figura 29: Resultados da reação de expressão in vitro da luciferase sob controle do switch s8a, contida no plasmídeo pSB1C3_T7-Switch8a-EpicLuc utilizando 80 ng do plasmídeo contendo o switch em uma proporção de 1:100 (aproximadamente 7.83 x 10¹⁴ cópias) de switch para trigger. A reação utilizando o trigger específico mostrou um aumento no nível de luminescência já aos 30 minutos de reação. 61 Figura 30: Resultados da reação de expressão in vitro da luciferase sob controle do switch s8a, contida no plasmídeo pSB1C3_T7-Switch8a-EpicLuc utilizando 20 ng do plasmídeo contendo o switch em uma proporção de 1:100 (aproximadamente 1.96 x 10¹⁴ cópias) de switch para trigger. A reação utilizando o trigger específico mostrou um aumento no nível de luminescência já aos 30 minutos de reação. Como trigger específico foi utilizado o trigger 8, o trigger inespecífico 1 é o trigger para o alvo 13 e um trigger inespecífico 2 é um trigger para um switch para detecção do vírus DENV. 62 O switch 79 não apresentou bons resultados nos testes de especificidade, não sendo capaz de distinguir o trigger específico do controle e dos inespecíficos não sendo possível obter resultados satisfatórios ao utilizar este switch em testes diagnósticos pois ocasionaria falsos positivos devido ao alto vazamento da expressão basal (Figura 31). Este resultado pode ser atribuído ao vazamento da expressão do gene repórter controlado pelo switch 79. Assim, os níveis de expressão basal se aproximaram do nível de expressão induzido pelo trigger específico. Figura 31: Resultados da reação de expressão in vitro da luciferase sob controle do switch 79, contido no plasmídeo pSB1C3_T7-Switch79-EpicLuc. Neste teste foi utilizada uma quantidade de 10 ng do plasmídeo e uma proporção de 1:100 (aproximadamente 9.79 x 10¹³ cópias) de plasmídeo para trigger. Na reação controle foi utilizado apenas o switch sem adição do trigger. Como trigger específico foi utilizado o trigger 7, o trigger inespecífico 1 é o trigger para o alvo 13 e um trigger inespecífico 2 é um trigger para um switch para detecção do vírus DENV. 63 5. Conclusões Após a análise dos resultados in silico é possível concluir que o desenvolvimento de biossensores do tipo Toehold switch para detecção de Sars-Cov-2 é viável com o script otimizado e mostra-se um método promissor. O alinhamento do genoma de SARS-CoV-2 com os diferentes tipos de coronavírus que afetam humanos ajudou a identificar sequências similares que poderiam levar a resposta cruzada com estes outros vírus. Enquanto o alinhamento de diversas cepas de SARS-CoV-2 possibilitou a seleção de sequências conservadas do genoma, o que aumenta a probabilidade do teste funcionar também em cepas de SARS-CoV-2 mutantes. O desenho dos biossensores através do NUPACK possibilitou uma visualização prévia da provável estrutura do Toehold switch e da sua viabilidade para testes in vitro. Já os cálculos feitos no RBS Calculator forneceram dados que ajudaram na seleção dos switches mais promissores através das previsões de taxa de tradução nos estados ON e OFF dos Toehold switch. A construção e clonagem dos sistemas de expressão se mostraram desafiadoras devido ao pequeno tamanho do inserto a ser inserido no plasmídeo na reação de Golden gate. Porém, após as mudanças no protocolo para utilizar a metodologia de digestão e ligação para clonagem, foi possível realizar a construção dos plasmídeos. O teste de funcionalidade do switch 7b se mostrou promissor, porém o teste de especificidade do switch apresentou incapacidade deste em distinguir os triggers específicos e inespecíficos. O switch 79 não apresentou capacidade de distinção entre o trigger específico e os inespecíficos, não apresentando boa capacidade de conter a expressão gênica na ausência do trigger específico, gerando alta expressão basal. Os testes do switch 8a se mostraram extremamente promissores. Quando utilizada a quantidade de 20 ng de plasmídeo, foi possível observar um aumento expressivo na expressão gênica controlada pelo switch no estado ativo sendo possível observar um aumento de luminescência de até 3 vezes o valor obtido no controle sem trigger e uma repressão forte dessa expressão no controle negativo e nos controles utilizando triggers inespecíficos. 64 Conclui-se que os objetivos deste trabalho foram alcançados com sucesso, tendo sido desenvolvido um toehold switch (s8a) funcional e com alta especificidade para a detecção de RNA do vírus SARS-CoV-2. 6. Referências Bibliográficas AILENI, M.; ROHELA, G.K.; JOGAM P; SOUJANYA, S.; ZHANG, B.; Biotechnological Perspectives to Combat the COVID-19 Pandemic: Precise Diagnostics and Inevitable Vaccine Paradigms. Cells. v. 31 March 2022. doi: 10.3390/cells11071182. ARBYN, M.; SNIJDERS, P.J.; MEIJER, C.J.; BERKHOF J, CUSCHIERI K, KOCJAN BJ, POLJAK M. 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