i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL DIVERSIDADE PATOGÊNICA EM ISOLADOS DE Thielaviopsis paradoxa PROVENIENTES DE DIFERENTES ÁREAS PRODUTORAS DE CANA-DE-AÇÚCAR Débora Maria Sansoli Chanquinie Bióloga 2015 i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL DIVERSIDADE PATOGÊNICA EM ISOLADOS DE Thielaviopsis paradoxa PROVENIENTES DE DIFERENTES ÁREAS PRODUTORAS DE CANA-DE-AÇÚCAR Débora Maria Sansoli Chanquinie Orientador: Prof. Dr. Antonio Goes 2015 Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) Sansoli Chanquinie, Débora Maria S229d Diversidade patogênica em isolados de Thielavipsis paradoxa provenientes de diferentes áreas produtoras de cana-de-açúcar / Débora Maria Sansoli Chanquinie. – – Jaboticabal, 2015 ix, 45 p. : il. ; 29 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015 Orientador: Antonio Goes Banca examinadora: Ivan Antonio dos Anjos, Margarete Camargo Bibliografia 1. Manejo. 2. Podridão abacaxi. 3 Saccharum officinarum. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 632.4:633.61 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR DÉBORA MARIA SANSOLI CHANQUINIE – casada, nascida em 12 de agosto de 1986 em Ribeirão Preto (SP), Brasil. Ingressou em 2005, no curso de Ciências Habilitação Plena em Biologia no Centro Universitário Barão de Mauá, Ribeirão Preto. Durante a graduação, estagiou em 2007 no Departamento de Água e Esgoto de Ribeirão Preto (DAERP), onde atuou no projeto “DAERP na Escola” ministrando palestras de educação ambiental, abordando temas como "Conscientização do uso racional da água", "Aquífero Guarani" e "Coleta Seletiva de Resíduos Sólidos (Lixo)", junto às escolas públicas e privadas de ensino fundamental e médio. Em 2008 recebeu grau de Licenciatura em Ciências Biológicas. De 2008 a 2010 realizou estágio junto ao Laboratório de Biotecnologia do Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio de Cana - IAC/Apta, onde foi bolsista de Apoio Técnico desenvolvendo atividades em biologia molecular (extração de DNA de cana-de-açúcar, preparo de géis, preparo de soluções, reações de PCR, genotipagem, análise de dados, interpretação de resultados), micropropagação de cana-de-açúcar, além de técnicas em sistemas de diagnósticos de doenças em genótipos comerciais de cana, sob a orientação da Dra. Silvana Creste. No início de 2010 foi contratada como técnica de laboratório, atuando principalmente na área de fitopatologia, diagnosticando doenças de diversas regiões canavieiras. Em 2012 ingressou no curso de Mestrado em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Campus de Jaboticabal. “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King) DEDICATÓRIA Dedico este trabalho primeiramente а Deus, pоr ser essencial еm minha vida, autor dе mеυ destino, mеυ guia e socorro presente nаs horas de angústia. Aos meus pais: Sérgio Sansoli, meu saudoso pai, homem de índole incomparável, o qual me deu os melhores ensinamentos de vida cristã. Sua presença é constante em meu coração. Tenho certeza que, onde estiver, estará muito feliz com mais essa conquista na minha vida, como sempre esteve! E à minha amada mãe, por toda ajuda e companheirismo em todos os dias da minha vida, mulher inabalável e de um coração puro e bondoso. Ao meu marido Pedro Henrique Chanquinie, pessoa cоm quem аmо partilhar а vida, que sempre esteve ao meu lado, sendo o maior incentivador para a realização desse sonho. Todo seu amor e carinho contribuíram para que eu não desanimasse, seus conselhos sempre cautelosos me fizeram acreditar que mesmo quando estamos cansados ainda podemos ir mais longe. À minha amada filha Helena Sansoli Chanquinie, que mesmo tão pequenina é a razão de toda a minha alegria. Sua chegada veio para confirmar a presença de Deus na minha vida. Toda minha luta é por ela e para ela! Aos meus irmãos Fábio Aurélio Sansoli e Eduardo Sérgio Sansoli e suas respectivas esposas, pela amizade e carinho, por sempre estarem por perto em todos os momentos, bons e ruins! AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida e por se fazer sempre presente, realizando incontáveis maravilhas. À Dra. Silvana Creste, que foi mais que uma co-orientadora, sempre dedicando sua atenção e ajuda quando precisei. Agradeço, também, a oportunidade de ter realizado todo o mestrado no laboratório do Centro de Cana-IAC. Ao meu orientador Prof. Dr. Antonio de Goes, que sempre esteve disponível em ajudar todas as vezes que precisei. Por me acolher como orientada. Agradeço a paciência, disponibilidade e orientação. Ao Professor Dr. Dilermando Perecin por toda ajuda e disponibilidade na produção deste trabalho. Aos professores do Departamento de Fitossanidade Laboratório de Fitopatologia, Professora Dra. Rita de Cassia Panizi e Professora Dra. Margarete Camargo pelos ensinamentos e amizade. Ao Dr. Álvaro Sanguino por compartilhar de todo seu conhecimento e por toda ajuda na realização deste trabalho. Às minhas grandes amigas Ana Carolina Tardiani e Camila Nunes. Amigas de longa data, há mais de dez anos partilhando de uma amizade fiel e verdadeira, desejo tê-las sempre por perto em minha vida! Às irmãs Melloni, Maria Letícia e Maria Natália, dois anjos na minha vida. Toda minha gratidão a elas que me ajudaram antes mesmo de iniciar o mestrado. Que Deus as conserve sempre assim, bondosas e amorosas. A todos os amigos e colegas do laboratório do Centro de Cana-IAC, Luís Fernando, Thaís, Maicom, Izadora, Larissa, Fernanda, Rafael, Alexandre, Paula, Michael e todos os demais, pelo companheirismo, trocas de experiências, ajudas, momentos de descontração, dicas e conselhos. A todos aqueles qυе dе alguma forma estiveram е estão próximos dе mim, fazendo a vida valer cada vеz mais а pena. vii SUMARIO PÁGINA RESUMO....................................................................................................................... viii ABSTRACT ................................................................................................................... ix 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 3 2.1. Etiologia ................................................................................................................ 4 2.2. Patogenicidade ................................................................................................ 7 3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 10 3.1. Obtenção dos isolados de Thielaviopsis paradoxa ........................................ 10 3.2. Preservação dos isolados de Thielaviopsis paradoxa ................................... 11 3.3. Preparo do inóculo ......................................................................................... 12 3.4. Experimentos ................................................................................................. 13 3.4.1. Avaliação da diversidade patogênica ............................................................... 13 3.4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa contrastantes quanto à patogenicidade .......................................................................... 15 3.4.3. Avaliação da sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis ........................................................ 16 4. RESULTADOS ....................................................................................................... 18 4.1. Diversidade patogênica de Thielaviopsis paradoxa ....................................... 18 4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa contrastantes quanto à patogenicidade .......................................................................... 20 4.3. Sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis ............................................................................................ 24 5. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 35 6. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 39 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 40 viii DIVERSIDADE PATOGÊNICA EM ISOLADOS DE THIELAVIOPSIS PARADOXA PROVENIENTES DE DIFERENTES ÁREAS PRODUTORAS DE CANA-DE- AÇÚCAR RESUMO - Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, é um fungo apontado como a principal causa da baixa germinação de toletes de cana-de- açúcar. A doença é uma das principais causas pela redução da brotação e consequente falhas no stand. Não existem variedades resistentes, e quanto mais rápida é a emergência das plantas, menor é o dano causado pelo patógeno. Nesse estudo foi avaliada a diversidade patogênica de onze isolados de T. paradoxa oriundos de toletes de canas-de-açúcar com sintomas, coletados em cinco Estados brasileiros (SP, GO, MG, BA e PR). Na inoculação foram empregados toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, de nove meses de idade. Constatou- se diferença estatisticamente significativa entre os isolados, com destaque para os isolados 6 e 7, os mais patogênicos, ambos provenientes de Guaíra-SP. O isolado 2, proveniente de Santa Juliana-MG, foi o menos patogênico. Testes complementares com três isolados contrastantes (baixo, intermediário e alto grau de patogenicidade) inoculados em três variedades de cana-de-açúcar (IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039) comprovaram o comportamento diferenciado, sendo reproduzidas características fenotípicas semelhantes àquelas quando da inoculação na variedade IACSP95-5000. As três variedades de cana-de-açúcar empregadas nesse estudo mostraram-se suscetíveis, com indicação e possível comprovação da inexistência de variedades resistentes. Não foi constatado relação entre a origem geográfica dos isolados e níveis de patogenicidade. Testes in vitro com fungicidas dos grupos das estrobilurinas (trifloxistrobina e piraclostrobina) e triazol (tebuconazole), nas concentrações 1, 10 e 100 µgmL-1 de ingrediente ativo, tornaram evidente que apenas o fungicida tebuconazole, isoladamente ou em combinação com trifloxistrobina, mostrou-se eficiente na inibição do tamanho das colônias, quando a 100µgmL-1 de i.a.. Estudos complementares acerca da viabilidade de fungicida do grupo dos triazóis, in vitro, em concentrações mais elevadas, com respectiva validação sob condições de campo, fazem-se necessários. Palavras-chave: manejo, podridão abacaxi, Saccharum officinarum ix PATHOGENIC DIVERSITY IN ISOLATES OF THIELAVIOPSIS PARADOXA FROM DIFFERENT PRODUCING AREAS OF SUGARCANE ABSTRACT - Thielaviopsis paradoxa, causal agent of pineapple disease is a main cause of poor germination of sugarcane sets. The disease is one of major cause for the reduction of budding and consequent failures on the stand. There is no resistant varieties, and as faster is the plant emergence, less is the damage caused by the pathogen. In this study it was evaluated the pathogenic diversity of eleven isolates of T. paradoxa from stalks of sugarcane with symptoms collected from five Brazilian states (SP, GO, MG, BA and PR). For the inoculation it was used sugarcane sets of the variety IACSP95-5000, with nine months of age. Data analysis revealed differences among the isolates, especially isolates 6 and 7, the most pathogenic, both from Guaíra-SP. The isolated 2, from Santa Juliana-MG was the least pathogenic. Additional tests with three contrasting isolates (low, intermediate and high level of pathogenicity) inoculated in three varieties of sugarcane (IACSP95- 5000, IAC911099 and IACSP97-4039) confirmed the different behavior, being reproduced phenotypic characteristics similar to those when inoculated in variety IACSP955000 . The three varieties of sugarcane used in this study showed to be susceptibles, with indication and possible evidence of absence of resistant varieties. It was not found relation between the geographical origin of the isolates and pathogenicity levels. In vitro tests with fungicides of the strobilurin group (pyraclostrobin and trifloxystrobin) and triazole (tebuconazole) at concentrations of 1, 10 and 100µgmL-1 active ingredient, became clear that only the fungicide tebuconazole alone or in combination with trifloxystrobin, showed efficient in inhibiting the size of the colonies, when at 100µgmL-1. Complementary studies about the fungicide viability of the group triazoles, in vitro, at higher concentrations, with their validation under field conditions, are necessary. Keywords: management, pineapple disease, Saccharum officinarum 1. INTRODUÇÃO A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma das culturas mais importantes no cenário socioeconômico brasileiro, sendo fonte de matéria-prima para produção de açúcar e etanol combustível. Além disso, também fornece inúmeros subprodutos, tais como bagaço, vinhaça e torta de filtro. Atualmente, o Brasil é o maior produtor mundial de açúcar e etanol, com área plantada de nove milhões de hectares, seguido por Índia, Tailândia e Austrália. Com produção de 38 milhões de toneladas de açúcar por ano, dos quais 60% são destinados à exportação, e 23,6 bilhões de litros de etanol/ano, é o único país a utilizar o etanol em larga escala como combustível renovável e alternativo ao petróleo (UNICA, 2014). Porém, a cultura da cana-de-açúcar no campo está sujeita a diferentes tipos de estresses, bióticos ou abióticos, os quais comprometem sua produtividade, podendo culminar em impactos negativos na economia sucro-alcooleira. Dentre as principais doenças que acometem a cultura da cana-de-açúcar, a podridão abacaxi, causada pelo fungo Thielaviopsis paradoxa, tem apresentado crescente destaque, visto que o patógeno infecta toletes, com consequente atraso na germinação, causando redução no stand e, consequentemente, reduzindo a produtividade. Essa condição é verificada principalmente em plantios de outono- inverno, que abrangem o período de junho até início de setembro. Dessa forma, infecções nos toletes após o plantio resultam em germinação irregular, com muitas falhas, resultando, em alguns casos, na necessidade do replantio (TOKESHI; RAGO, 2005; RAID, 2010). Em vista do exposto, presume-se que, no Brasil, por consequência das colheitas mecanizadas (com ausência de queimadas) e deposição de grande quantidade de matéria orgânica no solo, o fungo encontre boas condições para a formação de grande quantidade de inóculo e, por consequência, sob condições ambientais favoráveis possa causar elevados prejuízos. De um modo geral, a literatura para grande parte das doenças associadas à cana-de-açúcar mostra-se 2 muito escassa, e, por vezes muito antigas. Nesse cenário inclui-se a relação Saccharum-T. paradoxa. Até o momento, não há relatos acerca da diversidade patogênica de T. paradoxa, e também quanto à existência de variedades de cana-de-açúcar resistentes ao patógeno. O controle do patógeno baseia-se na adoção de práticas culturais, como plantio de mudas de boa qualidade, devendo ser realizado em épocas apropriadas (SEGATO et al., 2006). O controle químico tem também se apresentado como alternativa para o controle do patógeno (CHAPOLA et al., 2014). Entretanto, há ainda escassez de informações sobre a viabilidade técnica do controle do patógeno mediante fungicidas, fato esse que contribui à baixa disponibilidade de fungicidas registrados para o controle do patógeno. Nos diversos patossistemas, para o desenvolvimento de variedades de plantas resistentes aos patógenos, há a necessidade da existência de fontes de resistência, viabilidade técnica e agronômica na sua incorporação, assim como procedimentos experimentais adequados. O conhecimento prévio da variabilidade genética do patógeno insere-se dentre os cuidados experimentais mais importantes, visto que os métodos de melhoramento são também definidos em função do comportamento fenotípico desses agentes fitopatogênicos. Em vista do exposto, e dada à importância de T. paradoxa no cenário sucro- alcooleiro, à escassez de literatura pertinente ao assunto, no presente trabalho objetiva-se determinar a variabilidade patogênica de isolados desse fungo, procedentes de diferentes estados produtores de cana-de-açúcar, assim como avaliar o efeito de fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis, isoladamente ou em mistura comercial, na inibição in vitro do crescimento micelial do patógeno. 3 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Tradicionalmente, em todo o mundo, a cana-de-açúcar é propagada vegetativamente por segmentos do colmo, denominados de toletes. Estes, uma vez plantados, sofrem indução das gemas e formação do sistema radicular (VIEIRA et al., 1981). Quando há condições ambientais favoráveis (umidade, temperatura, solo, etc.), iniciam-se as atividades meristemáticas nos primórdios radiculares, resultando no desenvolvimento de raízes e na formação do broto. Esta fase é muito importante, pois quando há uma boa brotação, geralmente obtêm-se plantas com alto vigor. Ao contrário, fatores bióticos e abióticos podem comprometer seriamente o estande germinativo, e, consequentemente, resultar em grandes falhas no talhão, com grande redução na produtividade. Para uma brotação satisfatória dos toletes é necessário que a temperatura do solo esteja acima de 21°C, já que sob temperaturas mais baixas pode culminar em brotação muito lenta, ou mesmo em falhas de brotação (CLEMENTS et al.,1940). Da mesma forma, quando há falta ou o excesso de água, a brotação das gemas pode também ser seriamente afetada (CASAGRANDE et al., 1991). A cana-de-açúcar, após o plantio, ou subsequente às fases iniciais de desenvolvimento das brotações, quando sob estresse biótico por período prolongado, pode ocorrer elevado nível de podridões, destacando-se a podridão abacaxi. A podridão-abacaxi é uma doença causada pelo fungo do grupo dos ascomicetos, representado por Ceratocystis paradoxa (De Seynes) Moreau, e na fase anamórfica Thielaviopsis paradoxa (De Seynes) Höhn) (EDGERTON,1958; TOKESHI ; RAGO, 2005). Segundo Wismer (1961), T. paradoxa foi observado pela primeira vez em 1886, pelo pesquisador francês De Seynes, causando queima em frutos de abacaxi, e foi descrito como Sporochisma paradoxum. Entretanto, de acordo com Wismer (1961), em 1892 o patógeno foi reavaliado por Saccardo, sendo reclassificado como Chalara paradoxa (De Seynes) Sacc. Posteriormente, em 1893, o fungo foi encontrado na cultura da cana-de-açúcar, em Java, por Went, que o classificou 4 como Thielaviopsis ethaceticus Went. Nessa etapa, por consequência da similaridade do odor produzido e liberado por toletes doentes e aquele produzido por frutos de abacaxi, mesmo sadios, a doença passou a ser denominada “podridão- abacaxi”. Von Höhnel, em 1904, constatou que T. ethaceticus Went era idêntico ao Sporochisma paradoxum, o qual havia sido observado em coqueiros, fato que proporcionou um novo registro do patógeno, sendo descrito como T. paradoxa (De Seynes) Höhn. (WISMER,1961). As muitas designações adotadas para a fase assexual do patógeno também ocorreram para a fase sexual. Segundo Wismer (1961), em 1928 a fase sexuada foi descrita por Dade, como Ceratostomella paradoxa (De Seynes) Dade. Já em 1934, Melin e Nannfeldt renomearam para Ophiostoma paradoxum, e em 1935, Ceratostomella paradoxa. Finalmente, em 1952, quando da reclassificação do gênero Ceratostomella, o nome foi redescrito, sendo adotado Ceratocystis paradoxa. No Estado de São Paulo, condições desfavoráveis à brotação das gemas e, portanto, favoráveis à T. paradoxa são representadas por plantios tardios, realizados de março até agosto (ARRUDA, 1946; GALLI et al., 1980), com consequente falhas que podem abranger grandes extensões que, em alguns casos, podem levar ao replantio da área. 2.1. Etiologia Thielaviopsis paradoxa produz microconídios e macroconídios (Figura 1). Os primeiros são produzidos sobre conidióforos, são hialinos, pequenos, eretos e liberados na forma de bastonetes em cadeia. Nas hifas mais velhas formam-se numerosas ramificações que produzem conidióforos curtos onde são formados os macroconídios ovais, pardo-escuros, com tamanho 3 a 4 vezes maior que o microconídio (EDGERTON, 1958; TOKESHI; RAGO, 2005). Enquanto os microconídios germinam muito rapidamente, sendo responsáveis pela rápida disseminação do patógeno, os macroconídios permanecem viáveis em épocas cujas 5 condições climáticas podem ser adversas à sua sobrevivência (WISMER, 1961; KILE, 1999; TOKESHI, 1980). Em sua fase teleomórfica, Thielaviopsis paradoxa (Ceratocystis paradoxa) produz peritécio, dentro do qual são produzidas as ascas e, por sua vez, os ascósporos (EDGERTON, 1958; TOKESHI; RAGO, 2005). Segundo Chi (1949), citado por Wismer (1961), T. paradoxa tem seu crescimento e desenvolvimento limitados quando sob temperatura de cerca ou próxima de 10ºC e 34ºC, e em pH em torno de 3 e 9. De acordo com Yadahalli, Adiver e Kulkarni (2007), os intervalos de temperatura entre 25ºC e 28ºC, e de pH entre 6 e 7, foram as condições de ambientes que se mostraram adequadas ao desenvolvimento do fungo e à produção de esporos, em grande quantidade. Quando a 5 ºC o fungo teve o seu desenvolvimento vegetativo inibido. Em termos de sintomas, nas extremidades de toletes infectados por T. paradoxa observa-se um encharcamento do tecido que, à medida que a podridão avança, a sua coloração vai se alterando, acompanhado pela formação de tecido avermelhado contendo substâncias de defesa da planta, passando para cinza, parda-escura e, finalmente, negra (Figura 2). Os tecidos parenquimatosos são Figura 1. Vista parcial de microconídios e macroconídios de Thielaviopsis paradoxa ao microscópio óptico, objetiva de 100x. A- Vista parcial microconídios em de cadeia. B- Vista parcial de macroconídios (estruturas mais escuras). B Macroconídio Microconídio A 6 destruídos, restando somente os feixes fibrovasculares, cobertos pelos esporos escuros do fungo (TOKESHI; 1997). Raízes e gemas podem iniciar seu desenvolvimento em toletes infectados com o patógeno, os quais, no entanto, têm seu crescimento inibido ou retardado e, na maioria dos casos, morrem antes mesmo de emergirem do solo. Às vezes, dão origem a plantas sem vigor e com pouca chance de sobrevivência (MOHANRAJ et al., 2002; TOKESHI; RAGO, 2005). O sintoma mais típico da doença podridão-abacaxi é a fermentação dos tecidos dos toletes, dos quais exala um odor característico de essência de abacaxi. Tal odor ocorre devido à produção de acetato de etila, toxina que é responsável pela inibição da brotação das gemas. O fungo produz maiores quantidades de acetato de etila a 20°C do que a 28°C (Kuo et AL. 1969), o que pode explicar a maior importância da doença no período de inverno. Já a fermentação é mais acentuada nas fases iniciais de infecção, quando o tolete tem mais reservas de açúcar (TOKESHI; RAGO, 2005). Figura 2. A. Vista parcial de toletes de cana-de-açúcar colonizados por Thielaviopsis paradoxa. B. Vista parcial em lupa, aumento de 10x, das fibras vasculares mostrando-se muito escuras resultantes da elevada esporulação do fungo. A B 7 2.2. Patogenicidade A penetração de T. paradoxa ocorre por ferimentos do colmo da planta, onde o fungo penetra por cortes ou rachaduras da superfície, sendo incapaz de penetrar por aberturas naturais. Por isso, em cana-de-açúcar, o estudo deste fungo é particularmente importante visto que, no plantio convencional, as canas são cortadas em toletes por ocasião do plantio, representando, portanto, a porta de entrada para o fungo. Normalmente, quanto maior a pressão de seleção, maior são as alterações, com consequente modificações genéticas. Também, dependendo das diferentes formas de sobrevivência, disseminação, faixas de hospedeiros e modos de reprodução, podem ocorrer expressiva variabilidade genética dos organismos. Entre os fungos, a variabilidade pode ocorrer por diferentes formas, incluindo heterocariose (MCGUIRE et al., 2004; MILGROOM et al., 2009), recombinação genética (SOUZA-PACCOLA et al., 2003, SIJMEN et al., 2007), aneuplodia (MORROW; FRASER, 2013) e parassexualidade (MILGROOM et al., 2009). A variabilidade, em termos pontuais, pode ocorrer entre culturas monoconidiais (CASELA; FREDERIKSEN, 1986), assim como entre isolados intra-campos (XU et al., 2008). O fungo T. paradoxa conta com diversas formas de sobrevivência e disseminação, favorecido naturalmente pela elevada esporulação (ALEXOPOULOS et al.,1996). Em etapas posteriores da colonização do fungo, e por consequência do apodrecimento dos tecidos dos toletes infectados, grande quantidade de esporos são produzidos e dispersos no solo, servindo como fonte de inóculo para o próximo plantio (RAID, 1998). De acordo com Milanes Virelles et al. (1994), citados por Rott et. al (2000), a sobrevivência de T. paradoxa no solo pode ultrapassar 15 meses. Em alguns casos, plantas de cana-de-açúcar já constituídas podem ser afetadas pela doença, caso os esporos do patógeno, trazidos pelo vento, encontrem no colmo aberturas provocadas, por exemplo, por injúrias resultantes de danos mecânicos ou por insetos (FAWCETT, 1931; WISMER, 1961). A broca da cana-de- 8 açúcar (Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Pyralidae), por exemplo, pode facilitar a introdução e disseminação do patógeno (FAWCETT, 1931). Segundo Gheller (1995), T. paradoxa afeta apenas as gemas que levam muitos dias para brotar, sendo que, em condições normais de umidade e temperatura, a brotação inicial das gemas de cana-de-açúcar ocorre em apenas 15 dias. Segundo Boyd e Allison (1968), essa brotação inicial da cana-de-açúcar é uma etapa crucial, visto que a gema em crescimento deve se estabelecer antes do patógeno invasor. Normalmente, esporos de T. paradoxa presentes no solo, estimulados por substância liberadas pela cana, germinam e penetram nos toletes por meio de ferimentos. Quando as gemas brotam, no período normal, e iniciam o processo fotossintético, a doença não se manifesta, uma vez que o patógeno não consegue penetrar ou colonizar os tecidos da planta devido às respostas de defesas da planta (TOKESHI, 1980). Em canaviais da Flórida, T. paradoxa tem causado grande falhas de brotação (RAID, 2010). Rahman e Mandall (2014), assim como Chapola et al., (2014), destacaram, em seus estudos, que a podridão-abacaxi pode reduzir em quase 50% da brotação da cana-de-açúcar, ocasionando redução de 31% a até 42% na produtividade final. Tratamentos térmicos, quando feitos de forma inadequada, incluem-se dentre alguns fatores que podem contribuir à predisposição da cana-de-açúcar ao fungo T. paradoxa. O ideal é que a germinação ocorra de forma rápida para diminuir o impacto da doença (RAID, 1998). Uma medida importante e recomendada para o controle da podridão-abacaxi trata-se do uso de variedades com rápida brotação. Outra alternativa prática de controle da doença baseia-se na utilização de gemas do ápice (mais novas), pois estas tendem a brotar mais rapidamente (CASAGRANDE, 1991), e a utilização de quantidades maiores de gemas por metro de sulco, com consequente compensação de falhas. Além disso, é recomendável adotar bom preparo do solo e plantio mais raso, pois tais práticas resultam em brotação mais rápida da cana-de-açúcar, mais uniforme e mais vigorosa (TOKESHI; RAGO, 2005). Também, as novas tecnologias para o plantio, como o Mudas pré-brotadas (MPB), e até mesmo mudas de meristema, deverão contribuir para a redução do impacto da podridão-abacaxi na 9 cultura da cana-de-açúcar, uma vez que são mudas/plantas já estabelecidas e, portanto, menos suscetíveis a infecção do patógeno (LANDELL et al., 2012). 10 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Obtenção dos isolados de Thielaviopsis paradoxa Toletes de cana-de-açúcar com sintomas de podridão-abacaxi foram coletados em canaviais, de diversas variedades, em municípios localizados nos estados de São Paulo, Paraná, Minas Gerais, Goiás e Bahia (Tabela 1), e levados ao Laboratório de Fitopatologia do Centro de Cana do Instituto Agronômico de Campinas, da Agencia Paulista de Tecnologia do Agronegócio (APTA) em Ribeirão Preto/SP, onde foram cortados longitudinalmente e retirados fragmentos de tecidos lesionados, visando o isolamento do patógeno. Para o isolamento foram retirados fragmentos de aproximadamente 5 mm2 de tecido lesionado, os quais, após desinfestação superficial, lavagem em água estéril e secagem em papel de filtro, foram depositados em meio batata-dextrose-ágar (BDA) em placas de Petri. Posteriormente, as placas de Petri foram armazenadas a 28°C, por sete dias, em estufas para B.O.D.. A partir da referência da morfologia descrita para o patógeno e sua confirmação em microscópio ótico (EDGERTON, 1958; TOKESHI; RAGO, 2005), foram obtidos isolados do fungo, a partir dos quais foram repicados e purificados. 11 Tabela 1. Isolado, variedade de cana-de-açúcar, local e ano de coleta dos isolados de Thielaviopsis paradoxa utilizados no presente estudo. Isolado Variedade Município/Estado Ano 1 n.r. n.r. /Bahia 2004 2 n.r. Buritizal/SP 2006 3 RB 72454 Barrinha/SP 2004 4 n.r. Pradópolis/SP n.r 5 RB 867515 Água Emendada/GO 2012 6 SP 81-3250 Santa Juliana/MG 2012 7 SP 81-3250 Guaíra/SP 2012 8 SP 81-3250 Guaíra/SP 2012 9 SP 81-3250 Guaíra/SP 2012 10 RB 867515 Conceição das Alagoas/MG 2012 11 RB867515 Colorado/PR 2012 n.r.: Não registrado. 3.2. Preservação dos isolados de Thielaviopsis paradoxa Os 11 isolados de T. paradoxa foram crescidos em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA. Após a esporulação, uma suspensão de conídios de cada um dos isolados foi obtida e diluída de forma seriada em água estéril, da qual retirou-se uma alíquota de 0,1 mL, e plaqueada novamente em meio ágar/água (15 gL-1). A seguir, as culturas foram incubadas a 28 ºC, com fotoperíodo durante 12h, para a germinação dos conídios. Um único conídio germinado, observado em aumento 100x em microscópio óptico, foi retirado e transferido para outras placas de Petri contendo meio BDA, seguido de incubação a 28°C durante cinco dias, obtendo-se, assim, colônia monospórica. A partir da colônia monospórica, o fungo foi repicado para tubos de ensaio contendo meio BDA que, após seu crescimento vegetativo e esporulação, foi recoberto com óleo mineral estéril para para paralisação do seu metabolismo e evitar 12 ressecamento (Figura 3). Os tubos contendo cada isolado foram armazenados a 12°C. Esses isolados, em número de 11, foram utilizados nos estudos subsequentes. Figura 3. Vista parcial de tubos de ensaios contendo culturas de isolados de Thielaviopsis paradoxa 3.3. Preparo do inóculo Para os testes de patogenicidade foi utilizada suspensão contendo 106 conídios mL-1. Para tal, culturas monospóricas de T. paradoxa foram transferidas e multiplicadas em placas de Petri contendo BDA, por sete dias, a 28°C, e fotoperíodo 12 h. Posteriormente, em cada uma dessas placas foram adicionados 5 mL de água estéril contendo gotas de tween a 0,1% (v/v), seguido de raspagem superficial das colônias, mediante o uso de um pincel de cerdas macias, com movimentos circulares e suaves. A suspensão obtida foi posteriormente filtrada em camada dupla de gaze esterilizada, seguido da calibração na concentração desejada, empregando-se câmara de Neubauer. 13 3.4. Experimentos 3.4.1. Avaliação da diversidade patogênica O experimento foi conduzido no laboratório e casa de vegetação do Centro de Cana-de-açúcar, no período 2/set/2013 e 11/out/2013. A diversidade patogênica foi determinada mediante inoculação de 11 isolados (Tabela 1) em toletes de cana-de-açúcar, com três gemas, obtidos de plantas da variedade IACSP95-5000, com nove meses de idade, provenientes de viveiros de mudas do Centro de Cana, (IAC-Apta), em Ribeirão Preto/SP. Para inoculação, nas extremidades dos toletes foi infiltrado 1 mL da suspensão conidial, empregando-se seringa hipodérmica. A testemunha constituiu-se da infiltração de 1 mL de água estéril. Após inoculação, os toletes, em número de seis, foram acondicionados em bandejas de alumínio medindo 51,5 x 35,5 x 7,3cm, contendo substrato estéril Tropstrato®, sendo mantidos em casa de vegetação à temperatura de 17°C, por 40 dias. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, sendo cada unidade amostral constituída de seis toletes, ou uma bandeja. O experimento foi realizado em duplicata. Após 40 dias da inoculação, os toletes foram cortados longitudinalmente para avaliação dos níveis de severidade dos sintomas. Para tal, foi utilizada uma escala de notas variando de 1 a 5, elaborada nesse trabalho seguindo observações visuais dos sintomas da doença ao longo de seu desenvolvimento (Figura 4), onde 1= sem sintomas, 2= avermelhamento das fibras internas do tolete, em resposta da planta à infecção do patógeno, 3= necrose com coloração parda, ocorrendo da extremidade do tolete em direção ao centro, 4= necrose atingindo 90% do tolete, coloração pardo-escuro, 5= necrose em toda extensão do tolete, coloração negra, com odor semelhante a essência de abacaxi. 14 A B C D E Figura 4. Ilustração da escala de notas empregada na avaliação da severidade de sintomas causados por Thielaviopsis paradoxa inoculados em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. A – corresponde à nota de severidade 1; B - nota de severidade 2; C - nota de severidade 3; D - nota de severidade 4 e; E - nota de severidade 5. Alem da severidade dos sintomas, também foram avaliadas ss variáveis (i) número de gemas viáveis e (ii) de gemas brotadas. A contagem das gemas brotadas foi estabelecida a partir daquelas cujos brotos apresentavam tamanho igual ou superior a dois centímetros. Gemas viáveis foram consideradas as que mostravam-se intactas ou que haviam emergido do solo até dois centímetros. Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, utilizando o teste “t” (LSD = least significant difference) a 5% (P≤0,05). 15 3.4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa contrastantes quanto à patogenicidade Esse experimento foi implantado e conduzido de forma semelhante àquele descrito no item 3.4.1., sendo realizado no período de 7/abr/2015 a 27/abr/2015. Para tal, foram empregados três isolados de T. paradoxa, que apresentaram comportamento patogênico distinto em relação ao número de gemas brotadas e viáveis quando da inoculação em cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. Os isolados avaliados foram o 2, 4 e 7, os quais apresentaram três níveis de patogenicidade, sendo: (i) fracamente patogênico, (ii) medianamente patogênico e, (iii) fortemente patogênico, respectivamente. Para inoculação adotou-se procedimento semelhante ao descrito no item 3.4.1., sendo empregado as variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97- 4039, pertencentes ao Programa Cana-de-açúcar do Instituto Agronômico (Centro de Cana-de-açúcar). Os toletes inoculados, oriundos de plantas de cana-de-açúcar de nove meses de idade, foram acondicionados em bandejas de alumínio (51,5 x 35,5 x 7,3 cm) contendo substrato da marca Tropstrato e mantidos em casa de vegetação, com temperatura controlada a 17°C. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, constituído de cinco repetições. Cada unidade amostral foi constituída por cinco toletes de três gemas. Como testemunha, toletes foram inoculados com água destilada estéril, a fim de avaliar qualquer contaminação cruzada de ocorrência natural, além de comprovar que os toletes inoculados não apresentavam contaminação prévia. O experimento foi realizado em duplicata de forma a assegurar a repetibilidade dos dados. A metodologia de avaliação foi semelhante a adotada e descrita no item 3.4.1, sendo determinado a severidade dos sintomas, número de gemas viáveis e número de gemas brotadas. Porém, nesse caso, a avaliação deu-se após 20 dias da inoculação dos isolados. A análise de variância e demais procedimentos estatísticos foram semelhantes aos adotados no item 3.4.1. 16 Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, utilizando o teste “t” (LSD = least significant difference) a 5% (P≥0,05). 3.4.3. Avaliação da sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis A sensibilidade dos isolados 2, 4 e 7 de T. paradoxa foi determinada em meio de cultivo BDA acrescido de fungicidas, sobre o qual foi determinado o crescimento das colônias. Os fungicidas avaliados foram trifloxistrobina (Flint®, 500 µgmL-1 de ingrediente ativo (i.a.), Bayer S.A., São Paulo/SP), piraclostrobina (Comet®, 250 µgmL-1 de i.a., Basf S.A., São Paulo, SP), tebuconazole (Folicur®, 250 µgmL-1 de i.a., Bayer, São Paulo, SP) e trifloxistrobina + tebuconazole (Nativo®, 100 µgmL-1 de i.a. + 200 µgmL-1 de i.a., Bayer S.A., São Paulo, SP). Os fungicidas trifloxistrobina e piraclostrobina pertencem ao grupo químico das estrobilurinas, enquanto o fungicida tebuconazole pertence ao grupo dos triazóis (AGROFIT, 2015). A metodologia de preparo dos meios de cultivo com fungicidas foi semelhante à adotada por Hincapie et al. (2014), com modificações. Para tal, os fungicidas foram dissolvidos em água, e após diluições seriadas obteve-se as concentrações 0, 1, 10 e 100 μgmL-1, os quais foram adicionados ao meio de cultura BDA a 45 °C. Placas de Petri contendo meio BDA sem fungicida foram também empregadas e se constituíram na testemunha. Após 24 h do preparo dos meios de cultura com fungicidas, discos de colônias do fungo, com 5 mm de diâmetro, obtidos da periferia de colônias de T. paradoxa, previamente mantidas em estufas para B.O.D. a 25°C±1, sob fotoperíodo de 12 h, por 7 dias, foram transferidos para o centro das placas de Petri pertencentes ao experimento. Posteriormente, as placas de Petri contendo meio de cultivo e os respectivos isolados foram expostas às condições ambientais descritas anteriormente. 17 O delineamento experimental usado foi o inteiramente casualizado, com 4 fungicidas, 3 isolados e 4 repetições. Cada unidade amostral foi representada por uma placa de Petri. A avaliação baseou-se na determinação do tamanho das colônias, em sentidos perpendiculares entre si, após 7 dias de incubação, quando as culturas dos isolados do fungo alcançaram a borda das placas de Petri nos tratamentos testemunha. Quando da avaliação, o diâmetro original dos discos de colônias, de 5 mm de diâmetro, foi subtraído. A normalidade dos dados foi testada mediante análises univariadas, seguido da aplicação da análise de variância. A média dos tratamentos foi comparada mediante emprego do teste F usando a diferença mínima significativa (PROC GLM; SAS 9.3; SAS Institute). Os dados foram avaliados segundo arranjo em fatorial, de forma individualizada para cada um dos isolados avaliados. Foram realizadas análises de regressão e consequente determinação da correlação dos dados. 18 4. RESULTADOS 4.1. Diversidade patogênica de Thielaviopsis paradoxa O critério mediante o emprego de escala de notas mostrou-se uma alternativa interessante e viável para a discriminação dos isolados de T. paradoxa quanto ao seu nível de patogenicidade, quando inoculado em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. Após 40 dias da inoculação, todos os toletes inoculados com os onze isolados de T. paradoxa apresentaram diferentes níveis de expressão de sintomas de podridão-abacaxi. As médias fenotípicas atribuídas a partir da escala de notas encontram-se apresentadas na Tabela 2. Verificou-se que houve diferença significativa entre os isolados, sendo os isolados 5, 2 e 9 os mais patogênicos. O isolado 1 apresentou o menor nível de patogenicidade, com menor expressão de sintomas típicos da doença (Figura 5). Tabela 2. Médias dos níveis de severidade de sintomas oriundos da inoculação com 11 isolados de Thielaviopsis paradoxa em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95- 5000, sob condições de casa de vegetação à temperatura de 17°C, avaliado após 40 dias da inoculação. Isolado Média das notas Testemunha 1,28 eY 1 4,18 d 2 4,70 a 3 4,61ab 4 4,43 bc 5 4,73 a 6 4,43 bc 7 4,45 bc 8 4,30 cd 9 4,70 a 10 4,48 bc 11 4,43 bc YMédias seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si (Teste “t”; P≥ 0,05). 19 Figura 5. Vista parcial das respostas oriundas dos testes de patogenicidade realizados com 11 isolados de Thielaviopsis paradoxa inoculados em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, após 40 dias da inoculação. Em relação ao número médio de gemas viáveis, gemas brotadas, ou gemas mortas de cana-de-açúcar inoculadas com T. paradoxa, observou-se diferença estatisticamente significativa entre os isolados (teste t; P≥0,05) (Tabela 3). Os isolados 6 e 7, os quais provieram de toletes de canas-de-açúcar coletados em Santa Juliana/MG e Guaíra/SP, respectivamente, apresentaram o maior nível de patogenicidade, com consequente menor número de gemas viáveis e gemas brotadas, e maior número de gemas mortas. O isolado 2, proveniente de Buritizal/SP, contrariamente, apesar de não apresentar diferença significativa com a testemunha, assim como quanto ao isolado 10, na variável gemas viáveis mostrou- se o menos patogênico, com consequente maior quantidade de gemas brotadas, e menor número de gemas mortas. Isolado 5 Isolado 9 Isolado 2 Isolado 1 Mais patogênicos Menos patogênico 20 Tabela 3. Número médio de gemas viáveis, de gemas brotadas ou de gemas mortas de toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000 inoculados com 11 isolados de Thielaviopsis paradoxa e mantidos em ambiente de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, avaliados após 40 dias da inoculação. Isolado Gemas viáveisX Gemas brotadasX Gemas mortasX Testemunha 10,0 ab Y 59,4 a Y 30,5 e Y 1 6,1 bcd 2,2 c 91,1 bc 2 12,2 a 1,6 b 76,1 d 3 5,0 cde 1,1 c 92,7 abc 4 2,2 de 3,8 c 93,8 abc 5 5,5 bcde 3,3 c 91,6 bc 6 1,1 e 0 c 98,8 a 7 1,1 e 0 c 98,8 a 8 4,4 cde 1,6 c 93,8 abc 9 7,7 abc 3,3 c 88,8 c 10 4,4 cde 2,7 c 93,8 abc 11 1,6 de 2,2 c 96,1 ab XDados reais transformados em porcentagem de gemas viáveis, brotadas e mortas. YMédias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05). 4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa contrastantes quanto à patogenicidade Após vinte dias da inoculação, observou-se que os isolados 2, 4 e 7, de T. paradoxa, apresentaram comportamento semelhante àquele quando do primeiro 21 ensaio, conforme dados citados no item 4.1. Observou-se que, mesmo com a inclusão das variedades IAC911099 e IACSP97-4039, a resposta dos isolados avaliados foi semelhante àquela verificada quando da inoculação unicamente na variedade IACSP95-5000. Dessa forma, verificou-se que o comportamento fenotípico dos isolados foi mantido, com baixos, médios e elevados níveis de severidade, para os isolados 2, 4 e 7, respectivamente. (Tabela 4). Tabela 4. Níveis de severidade oriundos da inoculação de três isolados contrastantes (fracamente patogênico, medianamente patogênico e altamente patogênico) de Thielaviopsis paradoxa inoculados em toletes de cana-de-açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, sob condições de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, após 20 dias da inoculação. Isolados Média de severidade 2 2,049 c 4 2,079 b 7 2,132 a Testemunha 1,791 d Dados transformados em log 5. Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05). Para interação isolados vs variedades, verificou-se que houve significância apenas à variedade IACSP95-5000 quando inoculado com o isolado 7 (Tabela 5), mostrando, assim, que para essa variedade, esse isolado apresentou maior nível de patogenicidade. As testemunhas das três variedades não diferiram entre si. 22 Tabela 5. Níveis de severidade de sintomas em toletes de três variedades de cana- de-açúcar (IACSP95-5000, IAC911099, IACSP97-4039) resultantes da inoculação de três isolados de Thielaviopsis paradoxa, contrastantes entre si (fracamente patogênico, medianamente patogênico e altamente patogênico) em ambiente de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, após 20 dias da inoculação. Isolados Variedades Média IACSP95-5000 IAC911099 IACSP97-4039 2 2,055 d 2,048 d 2,045 d 2,049 4 2,094 bc 2,076 bcd 2,067 cd 2,079 7 2,194 a 2,112 b 2,090 bc 2,132 Testemunha 1,791 e 1,791 e 1,791 e - Média 2,114 2,078 2,067 - Dados reais transformados em log 5. Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05). Quanto às respostas ao efeito dos isolados 2, 4 e 7 inoculados em toletes de canas-de-açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039 observou-se que não houve diferença estatisticamente significativa entre os mesmos, os quais, porém, diferiram estatisticamente da testemunha. No tratamento testemunha foi observado maior média de gemas brotadas e de gemas viáveis com indicação, portanto, do efeito patogênico dos isolados avaliados (Tabela 6). 23 Tabela 6. Efeito de três isolados contrastantes (fracamente patogênico, medianamente patogênico e altamente patogênico) de Thielaviopsis paradoxa no número médio de gemas brotadas e gemas viáveis de toletes de cana-de-açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, inoculados e mantidos em ambiente de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, por 20 dias. Isolado Número médio de gemas brotadas Número médio de gemas viáveis 2 1,357 b 1,027 b 4 1,013 c 1 b 7 1,148 c 1 b Testemunha 2,171 a 1,301 a Dados reais transformados em √ (contagem + 1) de gemas brotadas e viáveis. Médias seguidas da mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05). Quando se analisa o comportamento diferencial das variedades inoculadas com os três isolados de T. paradoxa contrastantes entre si, observou-se que, quanto ao número médio de gemas brotadas, houve diferença estatisticamente significativa entre as variedades, onde IACSP95-5000 e IAC911099 mostraram-se as menos suscetíveis, com maior número médio de gemas brotadas. Em relação ao número médio de gemas viáveis, não houve diferença estatisticamente significativa entre as variedades (Tabela 7). 24 Tabela 7. Número médio de gemas brotadas e gemas viáveis de toletes de cana-de- açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, inoculadas com três isolados de Thielaviopsis paradoxa, contrastantes entre si (altamente patogênico, medianamente patogênico e fracamente patogênico), sob condições de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, por 20 dias. Variedades Número médio de gemas brotadas Número médio de gemas viáveis IACSP95-5000 1,298 a 1,106 a IAC911099 1,778 a 1,060 a IACSP97-4039 1,191 b 1,080 a Dados reais transformados em √ (contagem + 1). Médias seguidas da mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05). 4.3. Sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis Independente dos isolados de T. paradoxa avaliados, foi verificado diferença estatisticamente significativa quanto aos fungicidas, concentrações de fungicidas e na interação fungicidas e concentrações (Tabela 8). Ilustração com vista parcial do tamanho das colônias dos isolados 2, 4 e 7 nos diferentes fungicidas e concentrações encontram-se apresentadas nas Figuras 7, 8 e 9. 25 Tabela 8. Dados relativos à análise de variância do efeito de fungicidas do grupo das estrobilurinas e triazóis, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição (em %) do tamanho de colônias de três isolados de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro. Isolado Causas da variação SQ QM F 2 Efeito de Fungicida (F) 38,895 12,965 155,58** Efeito de Dose (D) 77,041 38,52 462,25** Ef. Interação FxD 77,791 12,965 155,58** CV (%) 3,76 4 Efeito de Fungicida (F) 44,545 14,848 588,28** Efeito de Dose (D) 87,21 43,605 1727,61** Ef. Interação FxD 89,091 14,848 588,28** CV (%) 2,08 7 Efeito de Fungicida (F) 62,334 20,778 1150,45** Efeito de Dose (D) 111,28 55,64 3080,69** Ef. Interação FxD 111,681 18,613 1030,61** CV (%) 1,80 **Altamente significativo (P≤0,01). Os isolados de T. paradoxa mostraram-se sensíveis apenas aos fungicidas tebuconazole e tebuconazole + trifloxistrobina, quando na concentração contendo 100 µgmL-1 de i.a. Nas concentrações contendo 1 e 10 µgmL-1 de i.a., todos os isolados mostraram-se insensíveis, apresentando comportamento semelhante ao observado quando no tratamento testemunha. Esse mesmo comportamento foi observado para os três isolados de T. paradoxa quando expostos aos fungicidas trifloxistrobina e pyraclostrobina, independente das concentrações de i.a. avaliadas (Tabela 9). 26 Figura 7. Vista parcial de colônias de Thielaviopsis paradoxa (isolado 2), agente causal da podridão-abacaxi, em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA suplementado com trifloxistrobina (A), piraclostrobina (B), tebuconazole (C) e tebuconazole + trifloxistrobina (D) com 0 (Testemunha), 1, 10 e 100 µgmL-1 de i.a., após 7 dias de incubação em estufas para B.O.D. a 25°C ± 1°C, sob fotoperíodo de 12h. 0 1 10 100 0 1 10 100 A 0 1 10 100 0 1 10 100 B C D 27 Figura 8. Vista parcial de colônias de Thielaviopsis paradoxa (isolado 4), agente causal da podridão-abacaxi, em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA suplementado com trifloxistrobina (A), piraclostrobina (B), tebuconazole (C) e tebuconazole + trifloxistrobina (D) com 0 (Testemunha), 1, 10 e 100 µgmL-1 de i.a., após 7 dias de incubação em estufas para B.O.D. a 25°C ± 1°C, sob fotoperíodo de 12h. A 0 1 10 100 0 1 10 100 0 1 10 100 0 1 10 100 B B D 28 Figura 9. Vista parcial de colônias de Thielaviopsis paradoxa (isolado 7), agente causal da podridão-abacaxi, em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA suplementado com trifloxistrobina (A), piraclostrobina (B), tebuconazole (C) e tebuconazole + trifloxistrobina (D) com 0 (Testemunha), 1, 10 e 100 µgmL-1 de i.a., após 7 dias de incubação em estufas para B.O.D. a 25°C ± 1°C, sob fotoperíodo de 12h. Para o caso específico do isolado 2, a inibição do crescimento das colônias foi de 59,0% quando em meio BDA suplementado com 100 µgmL-1 de i.a. de tebuconazole, e de 67,0% quando em meio contendo 100 µgmL-1 de i.a. de tebuconazole e tebuconazole + trifloxistrobina (Tabela 9). Resultados semelhantes 0 1 10 100 0 1 10 100 0 1 10 100 0 1 10 100 A B C D 29 foram obtidos para os isolados 4 e 7, os quais mostraram-se sensíveis apenas aos fungicidas tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole quando em meio de cultivo contendo 100 µgmL-1 de i.a.. A porcentagem de inibição do crescimento das colônias foi respectivamente, de 60,0 e 74,0%, e 77,0% e 78,0%, para os isolados 4 e 7, aos fungicidas tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole a 100 µgmL-1 de i.a. De acordo com os dados obtidos, verificou-se que houve significância apenas quando das avaliações dos fungicidas tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, independe dos modelos de regressão avaliados. Para esses fungicidas, a regressão que melhor se ajustou aos dados foi a linear (Tabelas 10, 11 e 12), cujos dados mostram-se ilustrados na Figura 10. Tabela 9. Efeito de fungicidas do grupo das estrobilurinas e triazóis, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição (em %) do tamanho de colônias de três isolados de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro. Fungicidas Concentração de i.a. Isolados 2 4 7 Trifloxistrobina 100 0,0 aX,Y 0,0 aX,Y 0,0 aX,Y 10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a Piraclostrobina 100 0,0 a 0,0 a 0,0 a 10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a Tebuconazole 100 59,0 b 60,0 b 77,0 b 10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a Trifloxistrobina + Tebuconazole 100 67,0 c 74,0 c 78,0 b 10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a D.M.S. 0,54 0,30 0,25 C.V. (%) 3,76 2,08 1,80 XDados reais do tamanho das colônias transformados em porcentagem de inibição do crescimento micelial. YMédias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si (Teste t; P≥0,05). 30 Tabela 10. Análise do desdobramento de dados e de regressão quanto ao efeito dos fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição do tamanho de colônias do isolado 2 de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro. Fungicidas Causas da variação QM F Trifloxistrobina Regressão Linear 0,000 0,00NS Regressão Quadrática 0,000 Piraclostrobina Regressão Linear 0,000 0,00NS Regressão Quadrática 0,000 Tebuconazole Regressão Linear 66,216 794,59** Regressão Quadrática 0,45 5,42* Trifloxistrobina + Tebuconazole Regressão Linear 87,57 1050,85** Regressão Quadrática 0,595 7,15* **Significativo (P≤0,001); *Significativo (P≤0,05); NS: Não significativo 31 Tabela 11. Análise do desdobramento de dados e de regressão quanto ao efeito dos fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição do tamanho de colônias do isolado 4 de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro. Fungicidas Causas da variação QM F Trifloxistrobina Regressão Linear 0,000 0,00NS Regressão Quadrática 0,000 Piraclostrobina Regressão Linear 0,000 0,00NS Regressão Quadrática 0,000 Tebuconazole Regressão Linear 105,542 4181,49** Regressão Quadrática 0,717 28,45** Trifloxistrobina + Tebuconazole Regressão Linear 87,57 2756,23** Regressão Quadrática 0,595 18,75** **Significativo (P≤0,001); *Significativo (P≤0,05); NS: Não significativo 32 Tabela 12. Análise do desdobramento de dados e de regressão quanto ao efeito dos fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição do tamanho de colônias do isolado 7 de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro. Fungicidas Causas da variação QM F Trifloxistrobina Regressão Linear 0,000 0,00NS Regressão Quadrática 0,000 Piraclostrobina Regressão Linear 0,000 0,00NS Regressão Quadrática 0,000 Tebuconazole Regressão Linear 105,9 5863,55** Regressão Quadrática 0,019 1,07* Trifloxistrobina + Tebuconazole Regressão Linear 116,25 6436,60** Regressão Quadrática 0,79 43,79** **Significativo (P≤0,001); *Significativo (P≤0,05); NS: Não significativo As equações de regressão, assim como os valores do seu respectivo coeficiente encontram-se apresentados nas Figuras 10A, 10B e 10C, para os isolados 2, 4 e 7, respectivamente, para os fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole e suas respectivas concentrações. 33 A B C = - 0,0006 f2 + 0,0062 f + 8,4944 R² = 1 C = - 0,0006 n2 + 0,0071 n + 8,4935 R² = 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 20 40 60 80 100 C ol ôn ia (c m ) Concentração (µgmL-1 ) Isolado 2 1 2 3 4 C = -0,0007 f2 + 0,0078 f + 8,4929 R² = 1 C = - 0,0006 n2 + 0,0063 n + 8,4942 R² = 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 20 40 60 80 100 C ol ôn ia (c m ) Concentração (µgmL-1 ) Isolado 4 1 2 3 4 34 Figura 10. Modelo de ajuste dos dados relativos ao crescimento de colônias dos isolados 2 (A), 4 (B) e 7 (C) de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, em meio de cultura contendo diferentes concentrações (em µgmL-1 ou o equivalente em µgmL-1 de ingrediente ativo) dos fungicidas 1 (trifloxistrobina), 2 (piraclostrobina), 3 (tebuconazole) e 4 (tebuconazole+trifloxistrobina), sob condições in vitro. C C = - 0,0007 f2 + 0,0081 f + 8,4927 R² = 1 C = - 0,0007 n2 + 0,0082 n + 8,4926 R² = 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 20 40 60 80 100 C ol ôn ia (c m ) Concentração (µgmL-1 ) Isolado 7 1 2 3 4 35 5. DISCUSSÃO Os resultados desse estudo confirmaram comportamento diferenciado de T. paradoxa, obtidos de cinco Estados brasileiros, independente das variedades de cana-de-açúcar da qual o fungo foi isolado. A uniformidade proporcionada pelo ambiente o qual o experimento foi conduzido demonstra que as respostas não foram determinadas por influências locais, ou do comportamento inerente das próprias plantas. Para a interação Saccharum-T. paradoxa, esse é o primeiro relato da existência de variabilidade patogênica desse patógeno. A variabilidade, incluindo a patogênica, é uma condição que garante, dentre outros atributos, a maior possibilidade de sobrevivência dos organismos nos seus diferentes ecossistemas. A necessidade da sua permanência em ambientes altamente instáveis, faz com que a variabilidade seja uma alternativa fundamental para a sua sobrevivência, e desenvolvimento coevolutivo. Em razão disso, a interação planta-patógeno é acentuadamente marcada por um processo altamente dinâmico, com respostas que possam atender o curso natural e coevolutivo de ambos os organismos. Patógenos que sobrevivem saprofiticamente, geralmente são menos afetados pelas influências do meio, e, dessa forma, tendem a apresentar populações genéticas mais estáveis. Thielaviopsis paradoxa apresenta a propriedade de sobreviver saprofiticamente no solo, na forma de macroconídios e microconídios, e também na forma micelial. A sua longevidade, mediante tais formas, ainda não foi determinada. Segundo Milanes Virelles e Herrera Isla (1994), citados por Rott et al., (2000), T. paradoxa pode sobreviver no solo por pelo menos 15 meses. Assim sendo, a permanência de estruturas do patógeno de uma safra para a outra pode contribuir para essa variabilidade patogênica, visto que pode ocorrer recombinação entre o patógeno, nas diversas regiões de cultivo. A falta de estudo da variabilidade patogênica do fungo T. paradoxa dificulta a avaliação segura de variedades de canas-de-açúcar resistentes para esta doença, o que representa grave dificuldade para os programas de melhoramento genético. Não 36 há, no momento, variedades de cana-de-açúcar resistentes a T. paradoxa e, pela natureza biológica do patógeno, aparentemente esses aspectos continuarão sendo um grande desafio nos programas de melhoramento dessa cultura. A falta de conexão quanto aos níveis de patogenicidade dos isolados avaliados e as respectivas regiões de origem são também indicativos quanto à dificuldade no alinhamento e desenvolvimento de programas de melhoramento visando resistência de canas-de-açúcar a T. paradoxa. Dessa forma, a variabilidade patogênica existente entre os isolados de T. paradoxa pode ser explicada, entre outros fatores, pela baixa especificidade desse fungo em relação aos seus hospedeiros. Trata-se de patógeno polífago, capaz de infectar uma grande gama de espécies de plantas como banana, coco, abacaxi, manga, eucalipto. Thielaviopsis paradoxa é encontrado em praticamente todas as regiões de cultivo da cana-de-açúcar, o que, obviamente, aumenta a dificuldade de obtenção de genétipos de cana-de-açúcar resistentes. Os resultados obtidos tanto no experimento com a variedade IACSP95-5000, quanto nas variedades IAC911099 e IACSP97-4039 revelaram o mesmo comportamento fenotípico dos isolados, com baixos, médios e elevados níveis de severidade. Tais dados, além de corroborar a existência da variabilidade patogênica dos isolados, comprova, também, a vulnerabilidade das variedades de cana-de- açúcar avaliadas. Ainda que tenha havido interação isolados x variedades na relação isolado 7 e a variedade IACSP95-5000, o que poderia caracterizar a existência de uma interação diferencial, e consequente resistência vertical, verifica-se que o comportamento dos isolados, em termos patogênicos, assim como as variedades, em termos de níveis de severidade, as respostas mostram-se mais coerentes ao efeito de genes menores (JOHNSON, 1979; VANDERPLANK, 1984). Além disso, de certa forma houve um ranking quanto aos níveis de patogenicidade entre os isolados avaliados, assim como quanto ao comportamento das variedades, com indicação da predominância do efeito da resistência quantitativa. Normalmente, os testes in vitro se constituem em alternativa para a realização de prognósticos quanto à viabilidade de fungicidas e outros tipos de moléculas quanto à sua eficiência a diversos alvos biológicos, incluindo os fungos 37 fitopatogênicos. Posteriormente, dependendo do desempenho dos mesmos, são realizados estudos complementares com vistas à determinação da sua viabilidade técnica, econômica e toxicológica. No presente estudo verificou-se que os fungicidas pertencentes ao grupo das estrobilurinas, trifloxistrobina e piraclostrobina, até à concentração contendo 100 µgmL-1 de ingrediente ativo mostraram-se ineficientes quanto à inibição in vitro de T. paradoxa. Por outro lado, tebuconazole isoladamente ou em mistura com trifloxistrobina, a 100 µgmL-1 foi eficiente no controle do patógeno, refletindo em inibição do crescimento das colônias do fungo. O fungicida piraclostrobina conta com registro para o controle de T. paradoxa na cultura da cana-de-açúcar, na dosagem de 400 a 500 mL por hectare, com emprego de 80 a 100 litros de calda por hectare, aplicado nos sulcos de plantio (AGROFIT, 2015). No presente estudo, dada à ausência de eficiência observada com piraclostrobina, ainda que o seja na concentração contendo 100 µgmL-1, justificam- se estudos complementares, com concentrações mais elevadas. Infere-se que, no contexto do presente estudo, indícios de que a eficiência desse fungicida deve ser reavaliada sob condições de campo, após a complementação de testes in vitro, com concentrações mais elevadas do ingrediente ativo. Obviamente, as considerações apresentadas a piraclostrobina se estendem também para trifloxistrobina, embora esse não seja registrado junto ao Ministério da Agricultura para o propósito em questão. Em nossos estudos, tebuconazole, isoladamente ou em mistura, foi o único fungicida eficiente, embora em nenhuma concentração tenha alcançado 100% de inibição do crescimento de colônias de T. paradoxa. A inibição do crescimento das colônias mediante tebuconazole, isoladamente ou em mistura a 100 µgmL-1 variou de 59% a 78%. Há, obviamente, necessidade de estudos complementares para a determinação das concentrações necessárias para determinação dos valores de EC50, conforme normalmente adotado para estudos dessa natureza (BARTLETT et al., 2002; MYRESIOTIS et al., 2008; HINCAPIE et al, 2014;). Ainda que as combinações formadas pelas misturas de trifloxistrobina e tebuconazole tenha também propiciado inibição do crescimento das colônias de T. 38 paradoxa in vitro, aparentemente essa resposta resultou do efeito do fungicida triazol, já que as estrobilurinas, quando empregadas isoladamente, mostraram-se ineficientes quanto à inibição in vitro do patógeno. Mediante estudos in vitro, Vijaya, Kulkarni e Hedge (2007) observaram que dentre dez fungicidas avaliados quanto à inibição de T. paradoxa, propiconazol e carbendazim, pertencentes respectivamente ao grupo dos triazóis e benzimidazóis, foram os mais eficientes. Segundo os autores, aparentemente essa melhor resposta resultou do efeito sistêmico desses fungicidas. Nossos estudos mostram resultados convergentes, já que tebuconazole é um fungicida pertencente ao grupo dos triazóis e apresenta propriedade sistêmica. Provavelmente, por essas propriedades esse fungicida poderá mostrar-se eficiente sob condições naturais de campo. Em se admitindo tal proposição como procedente, a ineficiência demonstrada pelas estrobilurinas poderá estar associado ao fato desses fungicidas apresentarem propriedades exclusivamente mesosistêmicas, ou com efeito de translocação, porém nunca com propriedade sistêmicas (OLAYA; KÖLLER, 1999; GISI et al., 2000). 39 6. CONCLUSÕES - Há variabilidade patogênica entre isolados de T. paradoxa provenientes de diferentes áreas produtoras de cana-de-açúcar do Brasil; - A variabilidade patogênica entre isolados de T. paradoxa, obtidos de diversas variedades de cana-de açúcar, não é restrita a uma região específica; - A variabilidade patogênica de T. paradoxa aparenta ter um comportamento estável, já que respostas semelhantes foram obtidas em dois ensaios, e com diferentes variedades de cana-de-açúcar; - As três variedades de cana-de-açúcar empregadas nesse estudo mostraram-se suscetíveis, com indicação e possível comprovação da inexistência de variedades resistentes; - O fungicida tebuconazole, pertencente ao grupo dos triazóis, apresenta potencial para o controle de T. paradoxa. - Estudos complementares quanto ao efeito de fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis, in vitro, em concentrações mais elevadas, com respectiva validação sob condições de campo fazem-se necessários. 40 7. 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