UNESP Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia Estudo do Fator de Início de Tradução de Eucariotos 5A (eIF5A) na tradução específica e na ligação direta com ribossomo Danuza Rossi Tese de doutorado Araraquara-SP 2013 Danuza Rossi Estudo do Fator de Início de Tradução de Eucariotos 5A (eIF5A) na tradução específica e na ligação direta com ribossomo Orientador: Prof. Dr. Cleslei Fernando Zanelli Co-orientador: Prof. Dr. Sandro Roberto Valentini Araraquara-SP 2013 Tese apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP, Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Doutora em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Rossi, Danuza R831e Estudo do fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) na tradução específica e na ligação direta com ribossomo / Danuza Rossi. Araraquara, 2013 138 f. + anexo Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia Orientador: Cleslei Fernando Zanelli Coorientador: Sandro Roberto Valentini 1. eIF5A. 2 Ribossomo. 3. Síntese de proteína. 4. Via secretória. I. Zanelli, Cleslei Fernando, orient. II. Valentini, Sandro Roberto, coorient. III. Título. CAPES: 40300005 DEDICATÓRIA Gostaria de dedicar este trabalho à todos amigos e familiares que o tornaram possível... Entretanto, devo dedicar especialmente aos meus grandes amores, dois pedaços da minha vida: Juliano Martoni e João Paulo Rossi Martoni (in memoria), sem os quais talvez nada disso teria acontecido. AGRADECIMENTOS Agradecer é quase sempre uma injustiça, pois é impossível em uma página trazer tudo e todos que contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho, para tanto precisaria de mil folhas... Mas tentarei, resumidamente, agradecer os principais atores, as melhores cenas e os indispensáveis editores desta peça. Inicialmente, a todas as divindades que me guiaram neste tempo, e que nunca me deixaram abater pelas dificuldades. Especialmente aos meus pais, Cida e Gilmar, por me proporcionarem uma educação indiscutívelmente completa, pois me ensinaram a amar, respeitar e, sobretudo, CRITICAR! Aos meus irmãos amados, Giuliano, Pamela, Luciene e Blain, que sempre muito próximos, participaram de (quase) todos os momentos da minha vida, ajudando a não me perder por entre elencos e cenas, mas sempre dando apoio para alcançar meus objetivos. Um agradecimento especial ao Prof. Cleslei F. Zanelli, quem me orientou desde a graduação, pelos inúmeros momentos de discussão que guiaram meu olhar para a ciência, o que fez possível este trabalho, além de ter se tornado um amigo. Ao co-orientador deste trabalho, Prof. Sandro R. Valentini, que contrubuiu muito para as DISCUSSÕES científicas. Aos professores Christopher Fraser e John Hershey que contribuíram significativamente para o avanço deste trabalho, além da ótima receptividade em Davis. Aos professores Dra. Maria Célia Bertolini e Dr. Iran Malavazi pela participação e contribuição no exame geral de qualificação deste trabalho. Aos pesquisadores Davis Ng, Jon Lorsch, Peter Walter, Colin J. Stirling, Wolf-Dietrich Heyer e John Hershey pelos reagentes doados que foram utilizados neste trabalho. À UNESP, UCDavis e Faculdade de Ciências Farmacêuticas pelo apoio insitucional de infraestrutura, à FAPESP e CAPES pelas bolsas concedidas para a realização do projeto no pais e no exterior. Ao CNPq, PADC-FCFAR e, novamente, à FAPESP e CAPES pelo apoio financeiro para a realização desse trabalho. Às funcinárias da pós-graduação e biblioteca, sempre prontas para ajudar no que foi preciso. Indispensável aqui, um agradecimento à todos os colegas e amigos de trabalho, cuja influência não se limitou aos experimentos e reuniões cientificas, indo até os bons momentos vividos. Portanto, aos atuais e antigos companheiros do “lab” BiomolVZ: Hermano, Leonardo, Fernando, Paulo, Mariana, Juliana, Kdu, Matheus, Vitor, Oedem, Carol, Pri, Cris, Marco, Thais, Arthur, Paulinha, Silvinha, Veridiana, Camila, Ana Paula, Juks, Luciano, etc, que hoje são partes permanentes da minha história. Aos companheiros do “lab” do Chris: Enkhee, Nancy, Kateryna, Masaaki, Brian que ajudaram muito no convívio longe de casa. E aos colaboradores sempre presentes Helen, Raquel, Gustavo e Julhyani por sempre contribuírem com discussões produtivas. Um agradecimento especial aos queridos amigos Tatiana W., Tatiana Mary, Daniella e Fabio, pelo envolvimento diário, que fizeram desses anos todos uma vivência inesquecível, amigos que terei orgulho de tê-los para sempre. Por fim, o agradecimento mais importante de todos, ao meu amado marido, pelo incondicional, indispensável e indubitável apoio em todos os momentos, e por me ajudar a desvendar-me a mim mesma e assim, ultrapassar os piores obstáculos e gozar dos melhores momentos!!! Concordo: o homem é um animal criativo por excelência, condenado a tender conscientemente para um objetivo e a ocupar-se da arte da engenharia, isto é, abrir para si mesmo um caminho, eterna e incessantemente, para onde quer que seja. Mas talvez, precisamente por isso, lhe vem as vezes uma vontade de se desviar, justamente por estar condenado a abrir este caminho, e talvez ainda porque, por mais estúpido que seja um homem direto e de ação, ocorre-lhe as vezes que o caminho vai quase sempre para alguma parte, e que o principal não está em saber para onde se dirige, mas simplesmente em que se dirija, e em que a criança comportada, desprezando a arte da engenharia, não se entregue à ociosidade destruidora, que, como se sabe, é a mãe de todos os vícios. O homem gosta de criar e de abrir estradas, isto é indiscutível. Mas por que ama também, até a paixão, a destruição e o caos? Dizei-me!... ... As dignas formigas começaram pelo formigueiro e certamente acabarão por ele, o que confere grande honra a sua constancia e caráter positivo. Mas o homem é uma criatura volúvel e pouco atraente e, talvez, a exemplo do enxadrista, ame apenas o processo de atingir o objetivo, e nao o próprio objetivo. E, quem sabe? Nao se pode garantir, mas talvez todo objetivo sobre a terra, aquele para o qual tende a humanidade, consista unicamente nesta continuidade do processo de atingir o objetivo, ou, em outras palavras na própria vida e nao exatamente no objetivo, o qual, naturalmente, nao deve ser outra coisa senão que dois e dois são quatro, isto é, uma formula; mas, na realidade, dois e dois nao são mais a vida, mas o começo da morte. Pelo menos, o homem sempre temeu de certo modo este dois e dois são quatro, e eu o temo até agora. Suponhamos que o homem não faça outra coisas se não procurar este dois e dois são quatro: ele atravessa os oceanos a nado, sacrifica a vida nesta busca, mas, quanto a encontrá-lo realmente... juro por Deus, tem medo. Bem que ele sente: uma vez encontrado isto não haverá mais o que procurar. FFiódor Dostoievski, Memórias do Subsolo RESUMO O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e em eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Este fator já foi relacionado com início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular. Resultados recentes colocam essa proteína novamente no cenário da síntese proteica, mais especificamente na etapa de elongação da tradução. Estudos que relacionam eIF5A com proliferação celular e transição G1/S do ciclo celular e via secretória sugerem seu envolvimento com tradução específica de proteínas que atuam na progressão do ciclo celular. No intuito de avaliar a hipótese da participação de eIF5A na tradução de um subgrupo específico de mRNAs, envolvidos na via secretória e proliferação celular, este trabalho estudou inicialmente, o envolvimento de eIF5A na translocação de proteínas para o RE. Os resultados revelam que eIF5A não atua na via pós- traducional, mas sugere que desempenhe um papel na translocação pela via co- traducional. A análise proteômica realizada com um mutante de Dys1, que apresenta redução de eIF5A ativa, revelou diversas proteínas diferencialmente presentes, as quais participam dos processos de biogênese de ribossomo e regulação da tradução, ciclo celular, organização de membrana e via secretória. A proteína Asc1 foi selecionada para análises adicionais por ser uma proteína amplamente envolvida no controle traducional, por diversos mecanismos. Foram realizados ensaios de interação genética entre Asc1, Dys1 e eIF5A, e os resultados obtidos sugerem que essas proteínas participam, conjuntamente, da regulação do processo de tradução por afetar a tradução de grupos de mRNAs codificadores de proteínas atuantes na mesma via. Para os ensaios de ligação direta de eIF5A no ribossomo, inicialmente, foram realizados experimentos para obtenção de mutantes, análise de funcionalidade e purificação das formas mutantes de eIF5A contendo cisteína única. Por ultracentrifugação e anisotropia de fluorescência, foi possível mostrar ligação direta de eIF5A de humano e de levedura na subunidade ribossomal 60S, revelando constante de dissociação de aproximadamente 260 nM. Foi também iniciada a padronização dos ensaios de clivagem de rRNA induzida por radical hidroxil, a partir do complexo eIF5A-60S, no entanto, não foram conclusivos para determinação dos pontos de interação de eIF5A no ribossomo. ABSTRACT The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes an unique and essential posttranslational modification named hypusination. This factor has been associated with translation initiation, nucleocytoplasmic transport, mRNA decay and cell proliferation. Recent results place this protein back in the protein synthesis scenario, acting specifically at the elongation step of translation. Studies that correlate eIF5A with cell proliferation, cell cycle and the secretory pathway suggest its involvement in the translation of specific mRNAs that act on cell cycle progression. In order to evaluate this hypothesis, this study has investigated the involvement of eIF5A in protein translocation into the ER. The results have shown that eIF5A does not act in the post-translational pathway, but suggest that it plays a role in protein translocation via the co-translational pathway. The proteomic analysis performed with a mutant of Dys1, which shows a reduction of active eIF5A, revealed many proteins differentially present, that participate in the process of ribosome biogenesis and regulation of translation, cell cycle, organization of membrane and secretory pathway. The protein Asc1 was chosen for futher analysis due to its involvemet in several mechanisms at translational control. We performed genetic interaction assays with Asc1, Dys1 and eIF5A, and the results suggest that these proteins coordinately regulate protein synthesis by affecting the translation of mRNAs encoding proteins that act in the same pathway. For the direct ribosome binding assays, it was initially obtained a series of eIF5A single cysteine mutants, their functionality was tested and the different mutant proteins were purified. Using ultracentrifugation and fluorescence anisotropy, it was possible to show direct binding of human and yeast eIF5A to the 60S ribosomal subunit, revealing a dissociation constant of approximately 260 nM. We also started the setting up for hydroxyl radical- induced rRNA cleavege assays, using the eIF5A-60S, however, preliminary experiments were not conclusive to determine the sites of interaction of eIF5A in the ribosome. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação esquemática do mecanismo de início da tradução 20 Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de elongação e terminação da tradução 21 Figura 3. Esquema da modificação pós-traducional de eIF5A 26 Figura 4. Representação esquemática do ensaio de metionil-puromicina 27 Figura 5. Comparação das estruturas tridimensionais de eIF5A de archea (aIF5A) e EF-P 28 Figura 6. Representação esquemática da translocação de proteínas para RE 32 Figura 7. Ensaio de translocação do repórter SS-Ura3 pela via pós- traducional, utilizando mutantes de eIF5A, revela não envolvimento de eIF5A nesta via 75 Figura 8. Ensaio de translocação do repórter DPAP B pela via co- traducional, utilizando mutantes de eIF5A, revela o envolvimento de eIF5A nesta via 78 Figura 9. Via co-traducional de translocação de proteínas para o RE 82 Figura 10. Análises genéticas de um mutante de eIF5A com mutantes de SRP e do translocon auxiliar, revelam interação genética do tipo sintético doente 83 Figura 11. Superexpressão de componentes de SRP suprime fenótipo de termossensibilidade de mutante de eIF5A 84 Figura 12. Esquema representativo da análise proteômica por 2D-DIGE, realizada com o mutante dys1-1 92 Figura 13. Distribuição dos resultados obtidos nas três análises proteômicas realizadas com o mutante dys1-1 93 Figura 14. Quadro resumo dos processos celulares resultantes das análises poteômicas 95 Figura 15. Confirmação da diferença de expressão de Asc1 na linhagem mutante dys1-1 98 Figura 16. Utilização dos mutantes de cisteína única de eIF5A para derivatização com diferentes compostos 104 Figura 17. Clonagem de EIF5A1 no vetor de expressão em levedura pYES2 105 Figura 18. Análise da funcionalidade dos mutantes de cisteína única de eIF5A de humano em S. cerevisiae 106 Figura 19. Análise da funcionalidade do mutante de eIF5A de S. cerevisiae 107 Figura 20. Ensaio de hipusinação e purificação de eIF5A em sistema de expressão heterólogo em E. coli 108 Figura 21. Produção e purificação de fatores de início de tradução, ribossomos e Met-tRNAi Met 109 Figura 22. Ensaios de ultracentrifugação revelam ligação direta de eIF5A com ribossomo de levedura 112 Figura 23. Ensaios de ultracentrifugação revelam ligação direta de mutantes de cisteína única de eIF5A de humano e levedura em ribossomo de levedura 113 Figura 24. eIF5A recombinante é capaz de competir com eIF5A endógena pela ligação ao 80S previamente formado in vivo e a presença de hipusina afeta esta capacidade 114 Figura 25. Esquema representativo da técninca de anisotropia de fluorescência 118 Figura 26. Ensaio de anisotropia de fluorescência revela que a ligação entre eIF5A e 60S é de alta afinidade e dependente de hipusina 119 Figura 27. Esquema ilustrativo do ensaio de clivagem de rRNA por radical hidroxil 122 Figura 28. Esquema do ensaio de clivagem de rRNA por radical hidroxil para busca do local de interação direta de eIF5A na subunidade 60S (utilizando o primer b) 123 Figura 29. Esquema do ensaio de clivagem de rRNA por radical hidroxil para busca do local de interação direta de eIF5A na subunidade 60S (utilizando o primer g) 124 Figura 30. Modelo proposto para o papel de eIF5A na tradução específica 127 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho 34 Tabela 2. Plasmídeos utilizados neste trabalho 36 Tabela 3.1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento, clonagem e primer extension 39 Tabela 3.2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas mutações sítio- dirigidas 39 Tabela 4. Composição dos tampões utilizados neste trabalho 41 Tabela 5. Agrupamento dos genes que codificam as proteínas identificadas nos três experimentos de análise proteômica, de acordo com o envolvimento em processos metabólicos, após análise por ontologia genética 94 ABREVIATURAS pg picograma ng nanograma μg micrograma mg miligrama μL microlitro mL mililitro nm nanômetro nM nanomolar μM micromolar mM milimolar M molar U unidade de atividade enzimática cDNA DNA complementar ao mRNA C-terminal carboxi-terminal N-terminal amino-terminal DNA ácido desoxirribonucléico RNA ácido ribonucléico mRNA RNA mensageiro tRNA RNA transportador rRNA RNA ribossomal dNTP ddNTP desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) di-desoxirribonucleotídeo (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) D.O.600nm densidade óptica a 600nm D.O.260nm densidade óptica a 260nm D.O.280nm densidade óptica a 280nm DTT ditiotreitol EDTA BABE ácido etilenodiaminotetracético bromoacetamidobenzil-EDTA PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonila KCl NaCl ácido clorídrico cloreto de sódio MgCl2 cloreto de magnésio KOAc Mg(OAc)2 acetato de potássio acetato de magnésio kDA quilodalton LB meio Luria-Bertani YPD “yeast extract, peptone, dextrose” (meio rico para levedura) SC meio sintético completo para levedura PEG polietilenoglicol pH potencial hidrogeniônico SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS SDS dodecil sulfato de sódio IPTG BME TCEP isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo beta-mercaptoetanol tris-2-carboxietil-fosfino S-SPO “super-sporulation media” (meio para esporulação de levedura) TE tampão Tris-EDTA Tris tris-hidroximetilaminometano (trizma base) Triton X-100 polietilenoglicol-terc-octilfenil eter Tween 20 DMSO monolaurato de polietilenoglicol-sorbitana dimetilsulfóxido xg aceleração gravitacional kb kilobase pb pares de base μCi microCurie 3H radioisótopo de hidrogênio trício 32P radioisótopo de fósforo de massa 32 h hora min minuto UV ultravioleta PBS “phosfate buffered saline” (solução salina tamponada com fosfato) PBST BSA PBS com Tween 20 albumina do soro bovino Cy2 cianina-2 Cy3 cianina-3 Cy5 cianina-5 mA miliampère Å angstron V volt V/h volt por hora v/v relação volume/volume m/z dFP Kd relação massa/carga desvio de luz polarizada constante de dissociação rpm rotações por minuto ODU unidade de medida óptica Ni-NTA “nickel-nitriloacetic acid column” (coluna de purificação por níquel) kV quilovolt Ω ohm μF tRNAi Met eIF1 eIF1A eIF2 eIF3 eIF5 eIF5B microfaraday tRNA iniciador de metionina fator de início de tradução 1 fator de início de tradução 1A fator de início de tradução 2 fator de início de tradução 3 fator de início de tradução 5 fator de início de tradução 5B Índice 1. INTRODUÇÃO 18 1.1. Mecanismo de tradução em eucariotos 18 1.2. eIF5A na tradução 22 1.3. eIF5A na progressão do ciclo celular 29 2. OBJETIVO GERAL 33 2.1. Objetivos específicos 33 3. MATERIAIS E MÉTODOS 34 3.1. Materiais 34 3.2. Métodos 44 3.2.1. Transformação de Microrganismos 44 3.2.2. Isolamento de DNA plasmidial 45 3.2.3. Cura plasmidial (plasmid shuffle) em levedura utilizando a marca de auxotrofia URA3 46 3.2.4. Teste de sensibilidade a temperatura 46 3.2.5. Western Blot 47 3.2.6. Análise proteômica 48 3.2.6.1. Obtenção do extrato proteico 48 3.2.6.2. Marcação e focalização isoelétrica das proteínas 48 3.2.6.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida e análise dos spots de proteína 49 3.2.7. Cruzamento, esporulação e dissecção de leveduras 52 3.2.7.1. Cruzamento 52 3.2.7.2. Esporulação 52 3.2.7.3. Dissecção 52 3.2.7.4. Caracterização de tétrades 52 3.2.8. Clonagem empregando Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) 53 3.2.8.1. Reação de PCR 53 3.2.8.2. Digestão de inserto e vetor 53 3.2.8.3. Reação de ligação e isolamento de clones 53 3.2.9. Mutagênese sítio-dirigida 54 3.2.10. Sequenciamento de DNA 55 3.2.11. Interação genética sintética utilizando mutante dys1 56 3.2.12. Medida de síntese proteica total in vivo 56 3.2.13. Perfil polissomal utilizando formaldeído 57 3.2.14. Ensaio de hipusinação in vivo em E. coli 58 3.2.14.1. Preparo das células 58 3.2.14.2. Preparo do precipitado proteico e quantificação por cintilometria 58 3.2.15. Purificação de eIF5A de humano a partir de E. coli 58 3.2.15.1. Expressão e preparo do extrato proteico 58 3.2.15.2. Cromatografia de troca iônica em FPLC 59 3.2.16. Purificação de eIF5A de levedura 60 3.2.16.1. Expressão e preparo do extrato proteico 60 3.2.16.2. Cromatografia de afinidade 60 3.2.16.3. Cromatografia de troca iônica em FPLC 60 3.2.17. Extração fenólica de ácidos nucleicos 60 3.2.18. Reação de transcrição in vitro a partir de produto de PCR ou plasmídeo 61 3.2.19. Purificação de fatores de início de tradução e tRNAi Met 61 3.2.19.1. eIF1, eIF1A e eIF5 61 3.2.19.2. eIF2 62 3.2.19.3. eIF3 63 3.2.19.4. eIF5B 64 3.2.19.5. tRNAi Met de levedura carregado com metionina 65 3.2.20. Purificação de ribossomos de levedura 66 3.2.20.1. Purificação de 80S total 66 3.2.20.2. Purificação das subunidades 40S e 60S 67 3.2.21. Reconstituição do complexo de início de tradução 67 3.2.21.1. Formação do complexo ternário (TC) 67 3.2.21.2. Formação do complexo 43S 67 3.2.21.3. Formação do complexo de iniciação 80S 68 3.2.22. Ensaio de ligação direta proteína-ribossomo por ultracentrifugação 68 3.2.23. Marcação de eIF5A por modificação covalente 69 3.2.23.1. Fluoresceína-5-malemida 69 3.2.23.2. BABE-Fe 69 3.2.24. Anisotropia ou Polarização de Luz Fluorescente (PLF) 70 3.2.25. Ensaio de clivagem de rRNA e primer extension 70 3.2.25.1. Ligação proteína-ribossomo 70 3.2.25.2. Clivagem de rRNA induzida por radical hidroxil 70 3.2.25.3. Transcrição reversa do rRNA 71 3.2.25.4. Reação de primer extension para sequenciamento do rRNA 25S 72 3.2.25.5. Gel de primer extension para identificação dos pontos de clivagem do rRNA 72 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 73 4.1. Estudo do papel de eIF5A na translocação de proteínas para o RE e na expressão gênica diferencial em nível traducional 73 4.1.1. Análise da translocação de repórteres das vias pós-traducional e co- traducional em mutantes de eIF5A 73 4.1.1.1. Pós-traducional 73 4.1.1.2. Co-traducional 76 4.1.2. Análise de interação genética entre mutantes de eIF5A e proteínas envolvidas na via co-traducional de translocação 79 4.1.3. Análise da expressão gênica diferencial em nível traducional por análise proteômica de mutante que apresenta defeito de eIF5A 85 4.1.4. Análise da correlação funcional entre Asc1, Dys1 e eIF5A, por ensaios de interação genética 96 4.2. Estudo da interação física direta de eIF5A com ribossomo in vitro 99 4.2.1. Obtenção de mutantes de cisteína única de eIF5A e outros componentes do início de tradução (fatores de tradução, ribossomos, tRNA e mRNA) 99 4.2.2. Identificação do complexo ribossomal ao qual eIF5A se liga por ultracentrifugação 110 4.2.3. Definição da constante de dissociação entre eIF5A e o ribossomo por anisotropia de fluorescência 115 4.2.4. Início do mapeamento dos pontos de ligação direta de eIF5A no ribossomo pelos ensaios de clivagem induzida de rRNA utilizando mutantes de cisteína única de eIF5A complexado com ribossomo 120 5. CONCLUSÕES 125 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 128 18 1. INTRODUÇÃO 1.1. O mecanismo de tradução em eucariotos O processo de tradução apresenta componentes altamente conservados ao longo da evolução (OUZOUNIS and KYRPIDES 1996; OLSEN and WOESE 1997), além de ser um processo complexo que envolve diversas etapas. O início da tradução de mRNAs canônicos, em eucariotos, apresenta alto grau de regulação, envolvendo diversos fatores essenciais (Figura 1). O escaneamento do mRNA para o encontro do códon de início depende da ligação do complexo ternário (eIF2 - tRNAi Met-Met - GTP) na subunidade menor do ribossomo 40S, com a ajuda do complexo MFC (multi factor complex - eIF1, eIF1A, eIF3 e eIF5) resultando assim no complexo de pré-iniciação 43S (PIC = preinitiation complex). Em levedura, o MFC é muito importante para estabilização do 43S e, consequentemente, do início da tradução (HINNEBUSCH 2011). Enquanto isso, o mRNA maduro, contendo capacete de 7-metil-guanosina e cauda de poli(A), é estabilizado pela ligação do complexo eIF4F (eIF4A, eIF4B e eIF4G) ao capacete e ao longo do mRNA, e com a ligação da proteína PABP (poliA binding protein) na cauda de poli(A). A ligação do complexo eIF4F com PABP é importante para a correta ligação do complexo 43S ao mRNA, mediada por eIF3. A formação do complexo de pré-iniciação 48S, portanto, permite que o ribossomo escaneie o mRNA até o encontro do primeiro AUG, bem como o posicionamento do metionil-tRNAi Met no sítio P (peptidil) do 40S. A hidrólise do GTP para GDP induzida por eIF5 acarreta no desligamento de fatores de início, e promove a ligação de eIF5B-GTP. Esse último fator recruta a subunidade ribossomal 60S para formação do complexo de iniciação 80S, contendo Met-tRNAi Met posicionado no códon AUG no sítio P e pronto para iniciar o primeiro ciclo de elongação da tradução (ACKER et al. 2007; HINNEBUSCH 2011). A etapa de elongação da tradução é extremamente conservada entre procariotos e eucariotos, e os modelos que se têm hoje foram derivados de estudos realizados principalmente em bactéria (RODNINA and WINTERMEYER 2009). A Figura 2A mostra um esquema representativo do processo de elongação da tradução. Assim que o Met-tRNAi Met estabiliza-se no sítio P do complexo de início de tradução 80S, a elongação da cadeia polipeptídica é iniciada. O fator de elongação eEF1A (EF-Tu em bactéria) liga-se a um tRNA aminoacilado correspondente ao segundo códon do mRNA na sua forma eEF1A-GTP, e o posiciona no sítio A (aminoacil). Esse evento 19 leva à hidrólise do GTP e desligamento de eEF1A do ribossomo, permitindo a total acomodação do tRNA aminoacilado no sítio A. Rapidamente, o sítio catalítico ribossomal PTC (peptidyl transferase center) leva à formação da ligação peptídica. Estudos estruturais recentes do ribossomo de levedura e bactéria mostram sobreposição da região PTC, sugerindo que o mecanismo de formação da ligação peptídica seja universal (BEN-SHEM et al. 2010; KLINGE et al. 2011). A mudança de cargas e conformação dos sítios neste momento, provoca o movimento dos tRNAs para os estados híbridos do ribossomo A/P e P/E (saída). Esta translocação dos tRNAs depende da ação de eEF2-GTP (EF-G em bactéria), através de seu papel na estabilização da conformação hídrida do ribossomo. Em seguida, o ribossomo volta para sua conformação desbloqueada após a hidrólise do GTP de eEF2 e ocorre a consequente movimentação do tRNA e mRNA para posicionar o próximo códon no sítio A e, assim, bloquear o estado pós-translocação. De uma maneira geral, eEF2 previne o movimento reverso do tRNA e mRNA após translocação. Exclusivamente em fungos, este evento de estabilização da conformação pós-translocação do ribossomo é auxiliado por outro fator de elongação, o eEF3, que não apresenta homólogo em outros organismos. Ainda, esse fator teria um papel na saída do tRNA desacilado do sítio E do ribossomo (TRIANA-ALONSO et al. 1995; ANDERSEN et al. 2006) e na reciclagem do ribossomo (KURATA et al. 2010). A Figura 2B mostra esquematicamente o processo de término da tradução, que por sua vez, inicia-se com o posicionamento do códon de terminação no sítio A do ribossomo. O fator de terminação eRF1 é responsável pela alta fidelidade de reconhecimento do códon e hidrólise do peptídeo do tRNA. Para a liberação do tRNA, bem como do peptídeo recém sintetizado, ocorre a participação do fator eRF3 (STANSFIELD et al. 1995; ZHOURAVLEVA et al. 1995; ALKALAEVA et al. 2006). Além disso, eRF3 parece estar envolvido no controle da ocupação do sítio A do ribossomo e no bloqueio de uma nova incorporação de tRNA aminoacilado (ATKINSON et al. 2008). Por fim, as subunidades ribossomais são recicladas (KAPP and LORSCH 2004). 20 Figura 1. Representação esquemática do mecanismo de início da tradução. Durante a fase de início, o capacete de metilguanosina (m7G) do mRNA é associado ao complexo eIF4F, mediado por eIF4E. O complexo de pré-iniciação 43S, composto pelo ribossomo 40S, complexo ternário (eIF2-GTP-tRNAi Met), eIF1, eIF1A, eIF5 e eIF3, é recrutado pelas interações entre eIF4G e eIF3, formando o complexo de pré-iniciação 48S. Inicia-se o escaneamento do mRNA até o encontro do primeiro AUG. A subunidade 60S é recrutada para este complexo e fatores de iniciação são liberados. Figura adaptada de HINNEBUSCH 2011 (HERSHEY et al. 2012). 21 Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de elongação e terminação da tradução. (A) A elongação da tradução ocorre por intermediação do fator de elongação eEF1A, que carrega os tRNAs aminoacilados para o ribossomo, e do fator eEF2, que promove a translocação. (B) Quando o códon de terminação é atingido, o fator de liberação eRF1 se liga no sítio A do ribossomo, e o fator eRF3 estimula a hidrólise de GTP e a liberação da cadeia polipeptídica, juntamente com as subunidades 40S e 60S. Figura adaptada de HERSHEY et al. 2012. 22 1.2. eIF5A na tradução eIF5A é uma proteína pequena, de aproximadamente 17 kDa, e presente tanto em eucariotos quanto em arqueas, mas não em bactérias (PARK et al. 1993a; PARK et al. 1997; KLIER et al. 1993). É uma proteína essencial em todos os organismos testados e altamente conservada evolutivamente (PARK et al. 1993a; PARK et al. 1997). As proteínas eIF5A de Saccharomyces cerevisiae e de mamíferos compartilham 63% de identidade (SCHNIER et al. 1991b; CHEN and LIU 1997), sendo que a proteína de humano substitui a de levedura, o que atesta sua conservação funcional (SCHNIER et al. 1991). Em S. cerevisiae, eIF5A é codificado por dois genes homólogos TIF51A (HYP2) e TIF51B (ANB1), gerando proteínas com 90% de identidade. Estes genes são regulados transcricionalmente pelos níveis de oxigênio, sendo expressos em condições aeróbicas e anaeróbicas, respectivamente (SCHNIER et al. 1991; WOHL et al. 1993; VALENTINI et al. 2002). Estudos utilizando linhagens expressando apenas TIF51A (presente no cromossomo V) ou TIF51B (presente no cromossomo X), sob o controle de um promotor induzível por galactose, mostraram que a expressão tanto de um gene quanto de outro é suficiente para manter o crescimento celular nas situações de aerobiose ou anaerobiose, indicando que os produtos desses dois genes possuem função indistinguível (SCHWELBERGER et al. 1993). Em humano, eIF5A também é codificado por diferentes genes, EIF5A1 e EIF5A2, os quais são filogeneticamente conservados e presentes nos vertebrados (JENKINS et al. 2001). Ambas isoformas de humano são capazes de substituir a proteína de levedura (SCHNIER et al. 1991; CLEMENT et al. 2006). eIF5A sofre uma modificação pós-traducional específica e exclusiva chamada de hipusinação (CHEN and LIU 1997; PARK et al. 1997). A formação do aminoácido hipusina (do inglês hypusine: hydroxyputrescine-lysine) ocorre através da transferência de um grupo aminobutil da poliamina espermidina para o amino grupo livre de uma lisina específica, catalizada pela enzima desoxi-hipusina sintase (Dys1 em S. cerevisiae; DHPS em humano), logo que a proteína é sintetizada. Em seguida, a hidroxilação deste grupo pela enzima desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1 em S. cerevisiae; DOHH em humano) termina a maturação de eIF5A (PARK et al. 2010) (Figura 3). O aminoácido hipusina não é removido ou modificado até que a proteína seja degradada, revelando a irreversibilidade do processo (PARK et al. 1993b). A substituição do resíduo de lisina específico de eIF5A, em S. cerevisiae, por arginina (K51R) leva à produção de eIF5A não hipusinado, o que resulta em inviabilidade 23 celular (SCHNIER et al. 1991). O fato de eIF5A ser a única proteína eucariótica que sofre hipusinação evidencia uma atividade biológica fundamental para este fator. A importância da hipusinação para a atividade de eIF5A no processo de tradução foi mostrada a partir da observação de que eIF5A humana recombinante, não hipusinada, foi incapaz de estimular a síntese in vitro de metionil-puromicina. Entretanto, quando este precursor foi modificado in vitro para a forma hipusinada, a proteína resultante tornou-se ativa neste ensaio (PARK 1989; SMIT-MCBRIDE et al. 1989). As estruturas tridimensionais de homólogos de eIF5A de três espécies de arqueas (KIM et al. 1998; PEAT et al. 1998; YAO et al. 2003), de dois protozoários (1XTD e 1X6O), de S. cerevisiae (3ER0) e de humano (3CPF) foram determinadas e revelaram várias características comuns. Segundo esses estudos, eIF5A trata-se de uma proteína dividida em dois domínios predominantemente compostos por folhas beta. A comparação destes domínios com outras proteínas de estruturas tridimensionais conhecidas mostra que o domínio N-terminal, o qual contém a hipusina, possui um dobramento classificado como Translation Protein SH3-like motif, o qual também está presente em algumas proteínas ribossomais. O domínio C- terminal, por sua vez, é similar ao dobramento presente em proteínas que se ligam a ácidos nucleicos de fita simples ("Single-stranded Oligonucleotide Binding Fold"), e desempenham diferentes funções celulares (http://supfam.org/SUPERFAMILY) (GOUGH et al. 2001). De fato, dois trabalhos publicados tentam correlacionar a função de eIF5A com a ligação a mRNAs, porém a extensão de tais estudos ainda necessita ser ampliada para se estabelecer um papel de eIF5A na interação física direta com mRNAs (XU and CHEN 2001; XU et al. 2004). eIF5A foi inicialmente considerado um fator de início da tradução em eucariotos (eukaryotic translation initiation factor 5A) (BENNE and HERSHEY 1978) por estimular a síntese in vitro de metionil-puromicina (BENNE and HERSHEY 1978). O ensaio de metionil-puromicina mede a incorporação de metionina radioativa, a partir de metionil-tRNAi Met, à puromicina, através de catálise ribossomal, sendo, portanto, um ensaio bastante utilizado para avaliar a influência de diferentes fatores no início da tradução. A Figura 4A mostra esquematicamente a estrutura da puromicina e a sua incorporação à cadeia polipeptídica, pela atividade peptidil-transferase do ribossomo. A Figura 4B representa o ensaio de metionil-puromicina in vitro. Apesar da capacidade evidente de eIF5A estimular a síntese de metionil-puromicina in vitro, utilizando-se tripletes AUG ou mRNA de globina, a não adição de eIF5A não mostrou 24 nenhum impacto sobre a síntese de globina in vitro, discordando, assim, de resultados obtidos na ausência dos outros fatores de início de tradução também testados: eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5B e eIF5 (BENNE and HERSHEY 1978). Assim, apesar de eIF5A ter sido denominado inicialmente um fator de início de tradução, a sua função como tal não foi claramente demonstrada. Dados recentes da associação de eIF5A com ribossomos ativamente engajados na tradução fortalecem o envolvimento desta proteína na síntese proteica (JAO and CHEN 2006; ZANELLI et al. 2006). Ensaios de co-purificação seguidos de identificação por espectrometria de massas revelaram que eIF5A interage com as proteínas ribossomais P0, S5 e L11 e com eEF2, componentes da maquinaria de tradução (ZANELLI et al. 2006). Além disso, defeitos observados em mutantes sensíveis a temperatura, quando cultivados na temperatura não permissiva, sugerem um papel para eIF5A na elongação da tradução por apresentarem defeitos claros na síntese de proteínas (DIAS et al. 2008) e um aumento nas frações polissomais em relação às frações de 80S (GREGIO et al. 2009; SAINI et al. 2009), semelhante ao que ocorre para um mutante dominante negativo de eEF2 (GREGIO et al. 200b). Ainda, foi verificado que os mesmos mutantes apresentam um atraso significativo no tempo de trânsito ribossomal (GREGIO et al. 2009; SAINI et al. 2009). Adicionalmente, mutantes de eIF5A não apresentaram formação de P-bodies (agregados de mRNA e proteínas, onde também ocorre a degradação do mRNA) na temperatura não permissiva, característica semelhante à observada para células tratadas com ciclo-heximida, um inibidor da elongação da tradução. Este efeito sobre os P-bodies também é consistente com um papel de eIF5A na fase de elongação de tradução (GREGIO et al. 2009). Além desses resultados, um mutante condicional de eIF5A tem seus defeitos de crescimento, síntese protéica e perfil polissomal suprimidos pelo aumento da expressão de eEF2, revelando uma relação funcional próxima entre eIF5A e eEF2 (DIAS et al. 2012). Estes dados sugerem um papel para eIF5A na etapa de elongação da tradução, no entanto, o mecanismo molecular pelo qual eIF5A afeta a tradução e se este efeito afeta a tradução global ou de um grupo específico de mRNAs, como tratado a seguir, são questões ainda em aberto. Apesar de bactéria não possuir eIF5A, seu homológo estrutural em bactéria é o fator de elongação da tradução EF-P. A Figura 5A mostra que EF-P possui 3 domínios (azul) e eIF5A somente 2 (amarelo), sendo os domínios I e II de EF-P sobreponível aos domínios N-terminal e C-terminal de eIF5A, respectivamente (HANAWA-SUETSUGU et al. 2004). A Figura 5B mostra o grau de conservação dos 25 resíduos de aminoácidos entre eIF5A e EF-P (HANAWA-SUETSUGU et al. 2004). EF-P possui efeito estimulatório na formação de ligações peptídicas, sendo considerado um fator de elongação da tradução (GLICK and GANOZA 1975). Apesar de EF-P não ser totalmente essencial para a viabilidade celular (BULLWINKLE et al. 2012), como eIF5A, EF-P é capaz de estimular a síntese de metionil-puromicina in vitro e tem sua função alterada por inibidores da atividade peptidil-transferase do ribossomo (GANOZA et al. 2002), assim como eIF5A (BENNE and HERSHEY 1978). Dados recentes sugerem que EF-P esteja envolvido no correto posicionamento do tRNAMet iniciador, atuando na formação da primeira ligação peptídica (BLAHA et al. 2009). Além disso, foi mostrado que EF-P não só afeta a formação da primeira ligação peptídica, como também da ligação de outros tRNAs, como tRNAPro e tRNAGly e, consequentemente, garante a correta geração de sequências peptídicas ricas em prolina e prolina-glicina, as quais formam ribosome stalling motifs, sequências de parada da tradução durante a elongação (DOERFEL et al. 2013; UDE et al. 2013). Uma vez definido e envolvimento de eIF5A na tradução, é essencial a determinação do mecanismo de ação desse fator a partir da definição do tipo de complexo ribossomal ao qual eIF5A se liga, bem como dos locais de interação no ribossomo. Considerando que muitos dos mecanismos de tradução em eucarioto derivam da análise em modelos de procariotos (RODNINA and WINTERMEYER 2009), devido ao alto grau de conservação do processo ao longo da evolução, o conhecimento que se tem hoje sobre EF-P é um ponto de partida para essa análise. Apesar de os ensaios de co-cristalização, ressonância magnética nuclear (RMN) e crio-microscopia eletrônica de complexos ribossomais se tornarem cada vez mais frequentes para procariotos, esses ensaios ainda não são primeira escolha para eucariotos (AGIRREZABALA et al. 2012; DÖNHÖFER et al. 2012; GREBER et al. 2012). Sendo assim, outros ensaios de ligação direta de fatores de tradução no ribossomo, como os de anisotropia de fluorescênia e de clivagem induzida de rRNA têm contribuído muito para a determinação estrutural e mecanística de formação dos complexos ribossomais em eucariotos (NOLLER et al. 1995; DINMAN 2009). Esses ensaios permitem dizer a afinidade de ligação dos fatores nos complexos ribossomais e a localização dessas interações. 26 Figura 3. Esquema da modificação pós-traducional de eIF5A. O grupo aminobutil da poliamina espermidina é transferido para o aminogrupo do resíduo específico de lisina, pela enzima desoxi-hipusina sintase (Dys1). Posteriormente, o intermediário de eIF5A é hidroxilado, pela desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1), formando assim eIF5A hipusinado e ativo. Figura adaptado de PARK 2006. 27 Figura 4. Representação esquemática do ensaio de metionil-puromicina. (A) Estruturas do peptidil-tRNA no sítio P e puromicina no sítio A, e a incorporação de uma molécula de puromicina à cadeia peptídica pela atividade peptidil-transferase do ribossomo (NELSON AND COX, 2004). (B) Esquema do ensaio de metionil-puromicina in vitro pela incorporação de metionina radioativa à uma molécula de puromicina, a partir de tRNAi Met . 28 Figura 5. Comparação das estruturas tridimensionais de eIF5A de archea (aIF5A) e EF- P. (A) Estrutura de eIF5A (marcado em amarelo) mostrando os domínios I (N- terminal) e II (C-terminal) em sobreposição com os domínios I e II da estrutura de EF-P (marcado em azul). (B) Conservação dos resíduos de aminoácidos entre eIF5A e EF-P (HANAWA-SUETSUGU et al. 2004). 29 1.3. eIF5A na progressão do ciclo celular eIF5A também foi envolvido com a progressão no ciclo celular em diferentes organismos. Em S. cerevisiae, verificou-se que a depleção de eIF5A leva a um aumento de células na fase G1, sugerindo um papel de eIF5A na progressão do ciclo celular (KANG and HERSHEY 1994). O envolvimento de eIF5A na proliferação celular também foi sugerido pela observação de que a inibição das duas enzimas envolvidas na etapa de hipusinação resulta no bloqueio da proliferação celular em cultura de diferentes linhagens de células de mamíferos (HANAUSKEABEL et al. 1994; CHEN et al. 1996; CARAGLIA et al. 2001). Baseado nessas observações, foi levantada a hipótese de que eIF5A atue como um fator de tradução seletivo para um subgrupo específico de mRNAs, que codificam para proteínas envolvidas com progressão do ciclo celular (KANG and HERSHEY 1994; PARK et al. 1997). Adicionalmente, outras evidências também correlacionam eIF5A com progressão do ciclo celular. Por exemplo, experimentos utilizando linfócitos T ativados demonstraram indução da expressão de eIF5A nesse processo (BEVEC et al. 1994). Além disso, em D. melanogaster, foi demonstrada a perda de controle no ciclo celular no início do desenvolvimento deste inseto em consequência da alteração dos níveis de eIF5A (LEE et al. 2001). Mais recentemente, utilizando mutantes condicionais de eIF5A em S. cerevisiae, foram isolados, em um rastreamento de alto número de cópias em nosso laboratório, fatores envolvidos com a correta morfologia celular durante a transição G1/S e estes mutantes condicionais apresentam defeito na polarização do citoesqueleto de actina, a qual é essencial para a transição G1/S nesse organismo (ZANELLI and VALENTINI 2005). Ainda, reforçando os dados de correlação funcional de eIF5A com a proliferação celular, foi descoberto em nosso laboratório o envolvimento de eIF5A com via secretória (FRIGIERI et al. 2007). Em um rastreamento de letalidade sintética com um mutante de eIF5A (tif51A-3), foi isolado um mutante do gene YPT1, cujo produto Ypt1 (yeast protein transport 1) é essencial por atuar na fusão de vesículas do retículo endoplasmático (RE) no Complexo de Golgi (SEGEV 2001). A identificação da letalidade sintética entre TIF51A e YPT1 revela uma conexão entre tradução e crescimento polarizado, sugerindo que o trabalho em conjunto dessas proteínas garanta a síntese e secreção proteica para a correta formação do broto durante o ciclo celular (FRIGIERI et al. 2008). O envolvimento de eIF5A na via secretória por interação genética com Ypt1, 30 bem como por apresentar-se ligado a frações de membrana (FRIGIERI et al. 2008), levou à análise de transporte vesicular em mutantes de eIF5A. Os resultados obtidos revelaram que mutantes de eIF5A, diferentemente de mutantes de Ypt1, não apresentam defeito no trânsito vesicular (FRIGIERI et al. 2008). Assim, apesar da correlação funcional entre Ypt1 e eIF5A e da presença de eIF5A na fração de membranas, eIF5A não deve agir diretamente no transporte de vesículas. Muitas proteínas que sofrem modificação pós-traducional, as que residem em compartimentos celulares (RE, Golgi, vacúolo, etc) e membranas, bem como as direcionadas para o broto, precisam ser direcionadas ao RE. O direcionamento, por sua vez, pode ocorrer após o término da síntese da cadeia polipeptídica (via pós- traducional) (Figura 6A) ou concomitantemente à tradução (via co-traducional) (RAPOPORT et al. 1999; KEENAN et al. 2001) (Figura 6B). Na via pós-traducional, mais comum em eucariotos inferiores (MATHEUS et al 2007), o direcionamento de proteínas para o RE ocorre sem o auxílio de SRP (Signal Recognition Particle) (DESHAIES and SCHEKMAN 1989; ROTHBLATT et al. 1989; RAPOPORT et al. 1999). Neste caso, chaperonas são requeridas para manter o peptídeo nascente em estado desnaturado no citoplasma, para que este possa passar através do translocon, formado pelos complexos multiproteicos Sec61 e Sec62/Sec63, para atingir o lúmen do RE (CHIRICO et al. 1988; CAPLAN et al. 1992) (Figura 6A). E ao atingir o RE outras chapenoras, como Kar2, também auxiliam no correto enovelamento proteico (Figura 6A). Por outro lado, a translocação da proteína para o RE mediado pelo complexo SRP, cujo receptor está localizado na membrana do RE (NG et al. 1996), ocorre assim que o peptídeo nascente emerge do ribossomo. Assim, SRP liga-se a uma sequência específica de aminoácidos no próprio peptídeo nascente, conhecida como sequência sinal. Esta ligação promove uma parada na elongação até que o complexo de SRP ligada a ribossomo/mRNA/peptídeo nascente (RNC – Ribosome- Nascent Chain Complex) seja direcionado ao RE e ocorra ligação ao translocon, conhecido como complexo Sec61 (NG et al. 1996). Este complexo é responsável pela formação de um canal na membrana do RE, que permite a translocação da proteína para o lúmen da organela (JOHNSON and VAN WAES 1999) (Figura 6B). Levando em consideração o envolvimento de eIF5A na tradução e o reflexo de seu papel na correlação com via secretória e ciclo celular, é possível que eIF5A tenha uma atuação essencial no encontro entre síntese proteica e via secretória, no RE, isto é, um papel na tradução específica, envolvendo proteínas que necessitam da via secretória, como os componentes de membrana e parede e, principalmente, as 31 que são direcionadas ao broto. Com o objetivo de elucidar estas questões, este trabalho buscou entender o papel de eIF5A na translocação de proteínas para o RE e na expressão gênica diferencial por análise proteômica, utilizando diferentes mutantes que apresentam defeito em eIF5A. Ainda, para a melhor compreensão do papel de eIF5A na tradução, é muito importante a definição do local de ligação de eIF5A no ribossomo. Como apresentado anteriormente, o modelo atual de muitos dos mecanismos de início e elongação da tradução é derivado do conhecimento estrutural dos complexos formados entre os fatores de tradução e o ribossomo. Dessa forma, este trabalho também abordou o estudo da ligação direta de eIF5A no ribossomo por ensaios de anisotropia de fluorescênia e de clivagem local induzida de rRNA, utilizando mutantes de cisteína única de eIF5A. 32 Figura 6. Representação esquemática da translocação de proteínas para o retículo endoplasmático (RE). (A) Via pós-traducional. Chaperonas ligam-se à cadeia polipeptídica enquanto está sendo sintetizada. Após o término da tradução, o polipeptídeo é direcionado para o RE e, através do translocon (complexo Sec61 associado ao complexo Sec62/63), a proteína passa para o lúmem do RE onde é corretamente enovelada, com gasto energético. (B) Via co-traducional. A sequência sinal sintetizada sinaliza para ligação com o complexo SRP (signal recognition particle), que executa uma parada temporária na elongação da tradução até que o complexo RNC (ribosome-nascent-chain) seja direcionado ao RE. O complexo SRP promove a interação ribossomo-translocon, composto por complexo Sec61, por interagir com seu receptor, adjacente ao translocon. Uma vez ligado ao translocon, o ribossomo re-inicia a elongação da tradução e a proteína recém sintetizada é direcionada ao lúmen do RE, onde assume sua conformação tridimensional adequada Figura adaptada de RAPOPORT 2007. 33 2. OBJETIVO GERAL Estudar o papel de eIF5A na tradução específica, pela análise da translocação de proteínas para o retículo endoplasmático (RE) e da expressão gênica diferencial em nível traducional, bem como determinar os pontos de ligação direta de eIF5A ao ribossomo. 2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2.1.1. Estudo do papel de eIF5A na translocação de proteínas para o RE e na expressão gênica diferencial em nível traducional: 2.1.1.1. Análise de repórteres de translocação das vias pós-traducional e co- traducional em mutantes de eIF5A; 2.1.1.2. Análise da interação genética entre mutantes de eIF5A e proteínas envolvidas na via co-traducional de translocação; 2.1.1.3. Análise da expressão gênica diferencial em nível traducional, por análise proteômica de mutante que apresenta defeito de eIF5A; 2.1.1.4. Análise da correlação funcional entre Asc1, Dys1 e eIF5A, por ensaios de interação genética. 2.1.2. Estudo da interação física direta de eIF5A com ribossomo in vitro: 2.1.2.1. Obtenção de mutantes de cisteína única de eIF5A e outros componentes do início de tradução (fatores de tradução, ribossomos, tRNA); 2.1.2.2. Identificação do complexo ribossomal ao qual eIF5A se liga por ultracentrifugação; 2.1.2.3. Definição da constante de dissociação entre eIF5A e o ribossomo por anisotropia de fluorescência; 2.1.2.4. Início do mapeamento dos pontos de ligação direta de eIF5A no ribossomo pelo ensaio de clivagem induzida de rRNA, utilizando mutantes de cisteína única de eIF5A complexo com ribossomo. 34 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. MATERIAIS As Tabelas 1 e 2 descrevem todos as linhagens de S. cerevisiae e plasmídeos utilizados neste trabalho, respectivamente. As Tabelas 3.1 e 3.2 descrevem os oligonucleotídeos utilizados para sequenciamento de DNA, clonagem, primer extension e mutações sítio-dirigidas. Por fim, a Tabela 4 descreve a composição química dos tampões utilizados. Tabela 1 - Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho Linhagem Genótipo Origem SVL14 MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3 can1 tif51A-1 Coleção do laboratório SVL32 MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3 can1 tif51A-3 Coleção do laboratório SVL82 (W3O3) MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3 can1 Pamela Silver SVL132 MATα leu2 ura3 his3 tif51A::HIS3 [TIF51A/URA3/CEN - pSV138] Coleção do laboratório SVL272 (BY4741) MATa leu2 ura3 his3 met15 Coleção do laboratório SVL453 MATα leu2 trp1 ura3 his3 dys1::HIS3 (pSV526) Coleção do laboratório SVL613 MATa leu2 trp1 ura3 his3 dys1::HIS3 (pSV520) Coleção do laboratório SVL614 MATa leu2 trp1 ura3 his3 dys1::HIS3 (pSV730) Coleção do laboratório VZL959 (DNY66) MATα ura3 leu2 his3 trp1 ade2 sec62-101 [SSCPY-URA3/HIS3/CEN] (pVZ1064) Davis Ng VZL961 (DNY116) MATα ura3 leu2 his3 trp1 ade2 sec61-101 [SSCPY-URA3/HIS3/CEN] (pVZ1064) Davis Ng VZL1021 MATα ura3 leu2 his3 trp1 ade2 sec61-101 Este trabalho VZL1074 MATa his3 leu2 ura3::CMV-tTA Coleção do 35 (TH2639 modificada) 1kanR-tetO7-TATA-TIF51A laboratório VZL1103 (GP3511) MATα ura3 leu2 gcn2Δ pep4::LEU2 sui2Δ [SUI2, SUI3, 6xHis-GCD11/URA3/2μ] Jon Lorsch VZL1104 (LPY201) MATa ura3 leu2 prt1::kanMX4 [6xHis-PRT1/URA3/2μ] Jon Lorsch VZL1133 MATa ura3 his3 leu2 met15 asc1::kanMX4 Coleção de nocautes VZL1134 MATα ura3 his3 trp1 leu2 met15 asc1::kanMX4 dys1::HIS3 (pSV526) Este trabalho VZL11378 MATα ura3 his3 trp1 leu2 met15 asc1::kanMX4 tif51A::HIS3 [TIF51A/URA3/CEN - pSV138] Este trabalho VZL1181 MATa ade2 leu2 srp102::URA3 [srp102K51I/TRP/CEN] Peter Walter VZL1235 MATa his3 leu2 ura3 ssh1::kanMX4 Coleção do laboratório VZL1247 (CSY150) MATa leu2 ura3 trp1 his4 sec61-3 Colin J. Stirling VZL1248 (CSY126) MATa ura3 ade2 trp1 leu2 his3 sec65-1 Colin J. Stirling VZL1249 MATα ura3 his3 leu2 trp1 pep4::HIS3 prb1 can1 Wolf-Dietrich Heyer 1 kanR-tetO7-TATA corresponde ao cassete contendo o promotor Tet (reprimível por tetraciclina) e a marca de resistência a geneticina (G418), kanR 36 Tabela 2. Plasmídeos utilizados neste trabalho Plasmídeo Características Origem pSV57 (pRS313) CEN, HIS3 Coleção do Laboratório pSV58 (pRS314) CEN, TRP1 Coleção do Laboratório pSV59 (pRS315) CEN, LEU2 Coleção do Laboratório pSV60 (pRS316) CEN, URA3 Coleção do Laboratório pSV63 (pRS424) 2µ, TRP1 Coleção do Laboratório pSV65 (pRS426) 2µ, URA3 Coleção do Laboratório pSV107 TIF51A, 2µ, URA3 Coleção do Laboratório pSV138 TIF51A, CEN, URA3 Coleção do Laboratório pSV139 tif51A-1, CEN, LEU2 Coleção do Laboratório pSV146 TIF51A, CEN, LEU2 Coleção do Laboratório pSV364 (YEp352) 2µ, URA3 Coleção do laboratório pSV374 (YEp351) 2µ, LEU2 Coleção do laboratório pSV520 DYS1, TRP1, URA3 Coleção do Laboratório pSV526 DYS1, CEN, URA3 Coleção do Laboratório pSV550 (pYES2) 1GAL1p, 2µ, URA3 Coleção do Laboratório pSV730 dys1-1, CEN, TRP1 Coleção do Laboratório 37 pVZ975 GAL1p-TIF51A, 2µ, URA3 Coleção do Laboratório pVZ1009 (pST39) Ampr Song Tan pVZ1011 pST39-EIF5A1-DHPS-DOHH Coleção do Laboratório pVZ1012 pST39-eif5a1K50R-DHPS-DOHH Coleção do Laboratório pVZ1025 GAL1p-EIF5A1, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1047 GAL1p-eif5aC22A/C38A/C73AC129, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1048 GAL1p-eif5aC22A/C38A/C129SC73, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1049 GAL1p-eif5aC22A/C38A/C73A/C129S, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1050 GAL1p-eif5aC22A/C38A/V41C/C73A/C129S, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1051 GAL1p-eif5aC22A/C38A/V56C/C73A/C129S, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1052 GAL1p-eif5aC22A/C38A/C73A/G97C/C129S, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1053 GAL1p-eif5aC22A/G35C/C38A/C73A/C129S, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1054 GAL1p-eif5aC22A/C38A/C73A/C129S/T142C, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1064 (pDN106) 2SSCPY-URA3, HIS3, CEN Davis Ng pVZ1073 GAL1p-eif5aC22A/C38A/C73A/C129S/L102C, 2µ, URA3 Este trabalho pVZ1088 pST39-6xHis-TIF51A-DYS1-LIA1 Coleção do Laboratório pVZ1110 (BG1805-ura3- DAP2) GAL1p-DAP2-6xHis-HA-Protease C site-ProtA, 2µ, URA3 Open Biosystem pVZ1142 (4891) pET24b-6xHis-DHPS John Hershey pVZ1150 pET28a-metionil-tRNAMet sintetase de humano John Hershey pVZ1171 pUC19-tRNAi Met de S. cerevisiae Jon Lorsch pVZ1172 pTYB2-6xHis-SUI1 (gene que codifica eIF1) Jon Lorsch 38 pVZ1173 pTYB2-6xHis-TIF11 (gene que codifica eIF1A) Jon Lorsch pVZ1174 pTYB2-6xHis-TIF5 (gene que codifica eIF5) Jon Lorsch pVZ1176 pMGA-6xHis-TEV site-fun12 truncado (gene que codifica eIF5B) Jon Lorsch pVZ1246 pST39-eif5aC22A/C38A/C73AC129-DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1247 pST39-eif5a C22A/C38A/C129SC73-DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1248 pST39-eif5a C22A/C38A/C129S/C73A DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1249 pST39-eif5a C22A/C38A/V56C/C73A/C129S-DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1250 pST39-eif5a C22A/C38A/C73A/G97C/C129S-DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1251 pST39-eif5a C22A/C38A/C73A/C129S/L102C-DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1252 pST39-eif5aC22A/C38A/C73A/C129S/T142C-DHPS-DOHH Este trabalho pVZ1343 pST39-tif51AC39AC23-DYS1-LIA1 Este trabalho pVZ1359 (pMW295) SEC65, SRP21, SRP72, 2µ, URA3 Colin J. Stirling pVZ1360 (pMW299) SCR1, SRP14, SRP54, SRP68, 2µ, LEU2 Colin J. Stirling pVZ1367 GAL1p-tif51AC39AC23 Este trabalho 1 GAL1p corresponde ao promotor de GAL1 (induzível por galactose). 2 SSCPY - sequência sinal de CPY (gene PRC1) em fase com URA3. 39 Tabela 3.1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento, clonagem e primer extension Oligonucleotídeo Sequencia (5’-3’) Sítio de restrição1 SVO76 (T7 promoter) GTAATACGACTCACTATAGGGC - VZO669 CGCGGATCCATGGGATCACACCACCACCACCA CCACGCAGATGACTTGGACTTCGAGACAGGAG BamHI VZO670 CCGGAATTCTTATTTTGCCATGGCCTTGATTGC EcoRI VZO1264 ATGTGCCGCCCCAGCCAAACTCCCC - VZO1268 GTAACATTCATCAGTAGGGTAAAAC - 1 Os sítios de restrição estão representados em negrito Tabela 3.2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas mutações sítio-dirigidas Oligonucleotídeo Sequencia (5’-3’) Gene/mutação VZO661 GCCACCTTCCCAATGCAGGCCTCAGCATTAC GTAAG EIF5A1/C22A VZO662 GCCATTCTTACGTAATGCTGAGGCCTGCATTG GGAAGG EIF5A1/C22A VZO663 CTCAAAGGCCGGCCAGCTAAGATCGTCGAGA TG EIF5A1/C38A VZO664 CTCGACGATCTTAGCTGGCCGGCCTTTGAGC AC EIF5A1/C38A VZO665 GGGAAGAAATATGAAGATATCGCCCCGTCAA CTCATAA EIF5A1/C73A VZO666 GAGCAGAAGTACGACTCTGGAGAAGAGATCC TGATC EIF5A1/C73A VZO667 GATCTCTTCTCCAGAGTCGTACTTCTGCTCAA TCTCC EIF5A1/C129S VZO668 GGACATCCATATTATGAGTTGACGGGGCGAT ATCTTCATATT EIF5A1/C129S 40 VZO677 GGCCATGTAAGATCTGCGAGATGTCTAC EIF5A1/V41C VZO678 CGAAGTAGACATCTCGCAGATCTTACATG EIF5A1/V41C VZO679 GGCCACGCCAAGTGCCATCTGGTTGGTATTG EIF5A1/V56C VZO680 CAACCAGATGGCACTTGGCGTGGCCGTG EIF5A1/V56C VZO681 GGTGCTCAAATGCCGGCCATGTAAGATC EIF5A1/G35C VZO682 CTTACATGGCCGGCATTTGAGCACCACAAAG EIF5A1/G35C VZO683 CATCCAGGATTGCTACCTATCACTGCTCC EIF5A1/G97C VZO684 GTGATAGGTAGCAATCCTGGATGCCAATC EIF5A1/G97C VZO685 GTCTGCCATGTGCGAGGAGGCAGCTGTTG EIF5A1/T142C VZO686 CTGCCTCCTCGCACATGGCAGACAGCAC EIF5A1/T142C VZO706 GATGGGTACCTATCACTGTGCCAGGACAGCG GGG EIF5A1/L102C VZO707 GTACCTCCCCGCTGTCCTGGCACAGTGATAG GTAC EIF5A1/L102C VZO1261 CAAGAGTAGACCAGCTAAGATTGTCGACATG TCCAC TIF51A/C39A VZO1262 GTCGACAATCTTAGCTGGTCTACTCTTGATGA CAACG TIF51A/C39A 41 Tabela 4. Composição dos tampões utilizados neste trabalho Tampão Composição TE Tris 10 mM pH 8,0 e EDTA 1 mM pH 8,0 Tampão de Lise 1 Triton X-100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris-HCl pH 8,0 10 mM e EDTA 1mM PBS Na2HPO4 0,1 mM, KH2PO4 1,8 mM pH 7,4, NaCl 1,4 mM, KCl 2,7 mM PBST PBS 1x, 0,25% Tween-20 Tampão de Lise 2 Tris 10 mM pH 7,5, uréia 7,7 M, tiouréia 2,2 M, chaps 4,4 %, inibidores de protases1 Tampão de Equilíbrio Tris-HCl 50mM pH8,8, uréia 6M, glicerol 30%, SDS 2% TAE Tris 40 mM, ácido acético 0,11% e EDTA 1 mM Tampão de Amostra azul de bromofenol 0,125%, xileno cianol 0,125% e glicerol 50% Tampão de Lise 3 50 mM de Tris-Cl pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, inibidores de proteases Tampão A1 50 mM de Tris-Cl pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% de glicerol Tampão B1 Tampão A1 contendo 1 M de KCl Tampão A2 50 mM de Tris-Cl pH 7,0, 300 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 30 mM de imidazol Tampão B2 Tampão A2 contendo 300 mM de imidazol Tampão de Transcrição 40 mM Tris-Cl pH 8,1, 0,01% Triton X-100, 30 mM MgCl2 Tampão de Lise- Inteín 20 mM Hepes pH 7,4, 500 mM KCl pH 7,6, 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, inibidores de proteases Tampão de Lavagem-Inteín Tampão de Lise-Intein acrescido de 1 M de KCl sem inibidores de protease Tampão Eluição- Inteín 20 mM Hepes pH 7,4, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 75 mM DTT Tampão A3 20 mM Hepes pH 7,6, 100 mM KCl, 10% de glicerol, 2 mM de DTT Tampão B3 Tampão A3 contendo 1 M de KCl 42 Tampão de Estoque 1 20 mM Hepes pH 7,6, 100 mM KOAc pH 7,6, 0,1 mM Mg(OAc)2, 10% glicerol, 2 mM DTT Tampão de Lise 4 75 mM Hepes pH 7,6, 100 mM KCl, 100 μM GDP�Mg2+, 10 mM BME, inibidores de proteases Tampão A4 20 mM Hepes pH 7,6, 500 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 μM GDP�Mg2+, 10% glicerol, 20 mM imidazol, 10 mM BME, inibidores de proteases Tampão B4 Tampão A4 contendo 250 mM de imidazol Tampão A5 20 mM Hepes pH 7,6, 100 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 μM GDP�Mg2+, 10% glicerol, 2 mM DTT Tampão B5 Tampão A5 contendo 1 M de KCl Tampão de Estoque 2 20 mM Hepes pH 7,6, 100 mM KOAc, 0,1 mM Mg(OAc)2, 10% glicerol, 2 mM DTT Tampão de Lise 5 10 mM MOPS pH 6,7, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 3 mM BME, inibidores de proteases Tampão A6 Tampão de Lise 5 sem inibidores de proteases Tampão B6 Tampão A6 contendo 250 mM de imidazol Tampão A7 10 mM MOPS pH 6,7, 100 mM NaCl, 10 mM BME, 0,1 mM PMSF pão B7 Tampão A7 contendo 500 mM NaCl TBE 90 mM Tris-Cl, 90 mM ácido bórico, 2 mM EDTA Tampão A9 20 mM Hepes pH 7,5, 300 mM KCl, 20 mM imidazol, 1 mM DTT, inibidores de proteases Tampão B8 Tampão A8 contendo 250 mM imidazol Tampão de Carregamento 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 50 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA Tampão A9 20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT, inibidores de proteases Tampão de Ribossomo 1 20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT, 10% glicerol Tampão de Ribossomo 2 20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT, 10% glicerol, 0,1% Triton X-100 Tampão de Ribossomo 3 20 mM Hepes pH 7,5, 300 mM KCl, 1 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT Tampão de 20 mM Hepes pH 7,5, 75 mM KCl, 3 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT, 43 Ribossomo 4 10% glicerol Tampão Rec 20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT Tampão de Reação 20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT Tampão de Modificação 1 20 mM Hepes pH 7,0, 150 mM KCl, 5% DMSO, 10% glicerol, 1 mM TCEP, 5 mM EDTA Tampão de Armazenamento 20 mM Hepes pH 7,0, 150 mM KCl, 10% glicerol, 5 mM EDTA Tampão de Modificação 2 50 mM Tris-Cl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% glicerol Tampão de Estoque 3 20 mM Hepes pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glicerol Tampão de Clivagem 20 mM Hepes pH 7,5, 75 mM KCl, 1 mM DTT Tampão de Extensão 130 mM Tris-Cl pH 8,5, 10 mM Mg(OAc)2, 10 mM DTT 1 Nos diferentes experimentos, foram usados diferentes inibidores de proteases de acordo com sua disponibilidade, sendo eles cOmplete EDTA-free (Roche) ou PLAC (5 mg/mL de antipaína, leupeptina, aprotinina, quimostatina e pepstatina - Sigma), acrescidos ou não de PMSF. 44 3.2. MÉTODOS A manutenção e o cultivo das linhagens de levedura e de E. coli, a composição e o preparo dos meios de cultura e soluções e as técnicas básicas utilizadas neste trabalho seguiram procedimentos padrões (GUTHRIE e FINK, 1991; AUSUBEL et al. 2005; AMBERG et al. 2005). 3.2.1. Transformação de microrganismos - Quimio-transformação de bactérias As células de E. coli DH5α competentes estocadas foram descongeladas em banho de gelo. Em um tubo de microcentrífuga, foram adicionados 100 µL das células competentes e 50–250 ng de DNA plasmidial ou a reação de ligação. Os tubos foram mantidos em banho de gelo por 30 minutos e submetidos ao choque térmico em banho-maria a 42ºC por 2 minutos. A seguir, 1 mL de meio LB líquido foi adicionado ao tubo, o qual foi incubado por 1 hora a 37ºC, sob agitação. Finalmente, as células foram plaqueadas em meio seletivo (meio LB contendo ampicilina 50 µg/mL) e incubadas a 37ºC até a obtenção de colônias. - Eletroporação de bactérias Dois μL de DNA plasmidial purificado de levedura foram adicionados a 40 μL de células eletrocompetentes de E. coli DH5α. Estas foram transferidas para uma cubeta de eletroporação (0,1 cm) e submetidas a um pulso elétrico com as seguintes constantes elétricas: voltagem 1,7 kV, resistência 200 Ω e capacitância 25 μF. Em seguida, as células foram removidas da cubeta com 1 mL de meio LB e incubadas a 37ºC por 1 hora sob agitação. Finalmente, as células foram plaqueadas em meio seletivo para possibilitar a seleção do plasmídeo contendo a marca desejada. A seguir, as placas foram incubadas a 37ºC até a obtenção de colônia. - Transformação de alta eficiência de leveduras Uma colônia da linhagem de levedura de interesse foi inoculada em 10 mL de meio adequado e incubada a 30ºC sob agitação por toda a noite. A partir desta cultura, inoculou-se 5,0x106 células/mL em 10 mL de meio pré-aquecido. As células foram incubadas a 30ºC até que a concentração atingisse 2,0x107 células/mL, centrifugadas a 3.000 xg por 5 minutos e lavadas com água. Após centrifugação, as 45 células foram suspensas em 600 μL de solução de acetato de lítio 100 mM e incubadas por 15 minutos a 30ºC. Coletou-se novamente as células por centrifugação e removeu-se o sobrenadante. Foram adicionados, na seguinte ordem: 480 μL de PEG 50%, 72 μL de acetato de lítio 1 M, 50 μL de DNA de esperma de salmão e 1 μg da biblioteca de cDNA, completando-se o volume de reação com 108 μL de água. O tubo foi então agitado vigorosamente (vortex) por 1 minuto e incubado a 30ºC por 30 minutos. O choque térmico foi dado incubando-se o tubo a 42ºC, por 20 minutos, tomando-se cuidado de inverter o tubo a cada 5 minutos para equilíbrio da temperatura. As células foram centrifugadas como descrito acima, suspensas em 2 mL de água, plaqueadas em meio seletivo e incubadas a 30ºC até o aparecimento das colônias. 3.2.2. Isolamento de DNA plasmidial - Preparação de DNA plasmidial de E. coli em pequena escala (MiniPrep) Células da linhagem de E. coli DH5α contendo os plasmídeos de interesse foram inoculadas em 3 mL de meio LB contendo antibiótico na concentração recomendada, e incubadas a 37ºC por aproximadamente 16 horas, sob agitação constante. A cultura foi centrifugada por 1 minuto a 12.000 xg. As células foram suspensas em 200 μL de TE. Foram adicionados 200 μL de solução NaOH/SDS (NaOH 0,2 M e SDS 1%), incubando-se por 5 minutos a 37ºC. Em seguida foram adicionados 150 μL de acetato de sódio 3 M pH 4,8 e o tubo foi invertido várias vezes. Após centrifugação por 6 minutos a 12.000 xg, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. A seguir, foi adicionado isopropanol (3 vezes o volume da amostra). Após incubação de 5 minutos a 37ºC, o tubo foi centrifugado por 10 minutos a 12.000 xg. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado duas vezes com etanol 75%. Depois de seco, o DNA foi suspenso em 50 μL de TE pH 8,0. - Preparação de DNA plasmidial de E. coli em média escala (MidiPrep) Uma colônia isolada de E. coli DH5α contendo o plasmideo de interesse foi inoculada em 100 mL de LB contendo antibiótico desejado e crescida a 37°C por 16 horas sob agitação constante. As células foram coletada por centrifugação a 6.000 xg por 15 minutos a 4°C. Os plasmídeos foram purificados utilizando o kit Plasmid MidiPrep (QIAGEN) de acordo com as recomendações do fabricante. 46 - Preparação de DNA plasmidial de S. cerevisiae em pequena escala De uma cultura estacionária da linhagem de levedura desejada, um volume de 1,5 mL foi centrifugado a 12.000 xg por 1 minuto. A seguir, o sobrenadante foi desprezado, as células lavadas com 1 mL de água e suspensas em 200 μL de Tampão de Lise 1. Foram adicionados 200 μL da mistura fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (24:25:1) e 300 mg de pérolas de vidro. O tubo foi então agitado vigorosamente (vortex) por 5 minutos e centrifugado a 16.000 xg por 1 minuto. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e adicionada de igual volume de isopropanol. Após centrifugação de 10 minutos a 16.000 xg, o sobrenadante foi removido e o precipitado lavado com 500 μL de etanol 75% gelado. O precipitado, depois de seco, foi ressuspenso em 50 μL de água. 3.2.3. Cura plasmidial (plasmid shuffle) em levedura utilizando a marca de auxotrofia URA3 A partir de uma cultura saturada da linhagem de interesse, contendo um plasmídeo que possui marca de seleção URA3, as leveduras foram plaqueadas em meio de cultura SC-ura adicionado de 0,1% de ácido 5-fluorótico (5FOA) e incubadas na temperatura permissiva, por 2 dias. Colônias isoladas obtidas foram re-plaqueadas e incubadas nas mesmas condições. 3.2.4. Teste de sensibilidade a temperatura As linhagens de interesse foram crescidas em 10 mL de meio apropriado (YPD ou SC) até atingir concentração celular correspondente à D.O.600nm = 0,6 a 0,8. Um volume ideal de cultura foi centrifugado a 600 xg por 7 minutos e ressuspenso em meio de cultura apropriado para concentração final de 2,5x108 células/mL. Em microplaca de 96 poços, foram aplicados 100 μL de cada amostra no primeiro poço da microplaca. Outros poços foram preenchidos com 90 μL do mesmo meio de cultura. Em seguida, foram realizadas cinco diluições seriadas (1:10), homogeneizando bem em cada etapa. Com ajuda de micropipetador multicanal, foram aplicados 2,5 μL de cada amostra e suas respectivas diluições nos meios de cultura apropriados. As placas foram incubadas nas temperaturas de interesse, sempre mantendo um controle a 25ºC. 47 3.2.5. Western blot - Quimioluminescente (enhanced chemiluminescence - ECL) Amostras contendo entre 15-20 μg de proteínas totais foram aplicadas em SDS-PAGE, para separação das proteínas por peso molecular. Em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose, sob diferença de potencial de 100 V, por uma hora. O padrão de peso molecular foi anotado com auxílio do corante Vermelho de Ponceau S. A membrana foi bloqueada com tampão PBST, contendo leite desnatado a 5% por 1 hora, a temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi incubada com uma diluição adequada de soro primário (anticorpo primário) em PBST, contendo 5% de leite desnatado, por 2 horas a temperatura ambiente. Após esse período, a membrana foi lavada três vezes com PBST e incubada novamente com uma diluição adequada de soro secundário (anticorpo secundário - anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase) em PBST, contendo 5% de leite desnatado, por uma hora a temperatura ambiente. Após três novas lavagens com PBST, a membrana foi submetida a tratamento com reagentes quimioluminescentes (Amershan ECL – GE Healthcare) para posterior exposição ao filme autorradiográfico, e revelação utilizando soluções reveladora e fixadora (Kodak). - Fluorescente Amostras contendo entre 7,5-15 μg de proteínas totais foram aplicadas em SDS-PAGE para separação das proteínas por peso molecular. Em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose, sob diferença de potencial de 100 V, por uma hora. O padrão de peso molecular foi anotado com auxílio do corante Vermelho de Ponceau S. A membrana foi bloqueada com tampão PBST, contendo leite desnatado a 5% por 1 hora, a temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi incubada com uma diluição adequada de soro primário (anticorpo primário) em PBST, contendo 5% de leite desnatado, por 2 horas a temperatura ambiente. Após esse período, a membrana foi lavada três vezes com PBST e incubada novamente com anti-IgG de coelho marcado com Cy5 (Amershan ECL Plex – GE Healthcare) diluído 1:5000 em PBST, por 45 minutos a temperatura ambiente. Após três novas lavagens com PBST e uma com água Milli-Q, a membrana foi escaneada utilizando o equipamento Scanner Typhoon Trio (GE Healthcare). As 48 imagens obtidas foram tratadas utilizando o programa ImageQuantTL (GE Healthcare), para quantificação das bandas. Os valores absolutos de quantificação das bandas de interesse foram normalizados pelas bandas de uma proteína controle da mesma amostra. Os valores relativos das proteínas de interesse foram analisados utilizando o programa Excel. 3.2.6. Análise proteômica 3.2.6.1. Obtenção do extrato proteico As linhagens de interesse (SVL613 – selvagem e SVL614 – dys1-1) foram crescidas em meio YPD acrescido de 1 M de sorbitol na temperatura permissiva (25ºC) até atingir D.O.600nm= 1,0. A cultura foi centrifugada a 14.000 xg por 20 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e as células lavadas com PBS 1x gelado. Em seguida, as células foram lisadas adicionando ao precipitado celular o mesmo volume de Tampão de Lise 2 e o mesmo volume de contas de vidro. O microtubo contendo células, tampão e contas de vidro foi submetido a agitação vigorosa no aparelho FastPrep, a 4ºC (3 ciclos de 20 seg de agitação a 4 m/s - 1 min descanso). O lisado foi centrifugado a 20.000 xg por 20 minutos a 4ºC. O extrato proteico total obtido foi quantificado pelo método de Bradford, utilizando o kit Bio-Rad Protein Assay (Bio- Rad). 3.2.6.2. Marcação e focalização isoelétrica das proteínas A partir do extrato proteico quantificado, as amostras foram marcadas separadamente em microtubos: 50 μg de proteína total da SVL613 com 400 pg do fluoróforo Cy3 (emissão máxima ou λem = 580 nm); 50 μg de proteína total da SVL614 com 400 pg do fluoróforo Cy5 (λem = 670 nm); 25 μg de proteína total de cada linhagem com 400 pg do fluoróforo Cy2 (λem = 520 nm, utilizado na amostra normalizadora dos lisados) (GE Healthcare). Para o gel preparativo, de onde foram recortados os spots, foi separado em outro microtubo um volume correspondente a 300 μg de proteína total (150 μg de cada linhagem). Cada tira de gradiente de pH foi reidratada aplicando uma mistura composta de extrato proteico das 3 amostras marcadas (Cy3, Cy5 e Cy2) ou da mistura preparada para o gel preparativo, adicionado de 1,5% de IPGBuffer na faixa de pH correspondente a tira utilizada (GE Healthcare) e de solução DeStreak (GE Healthcare) para um volume final de 250 μL. 49 As tiras foram então incubadas em suporte adequado, protegidas da luz, calor e umidade, por 16-24 horas. Em seguida, as tiras foram submetidas ao processo de focalização isoelétrica, a fim de separar as proteínas na matriz de acordo com seus pontos isoelétricos. Para tanto, foi utilizado o aparelho Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare). Para tiras de 13 cm, foram usados os seguintes parâmetros para a focalização: step – 300 V por 12 horas; grad – 1.000 V até acumular 1.000 V/h; grad – 8.000 V até acumular 8.000 V/h; step – 8.000 V até acumular 20.000 V/h; step – 8.000 V por mais 4 horas, ou até acumular 36.000 a 40.000 V/h. 3.2.6.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida e análise dos spots de proteínas Após a focalização das proteínas, as tiras de gradiente de pH foram tratadas com DTT (ditiotreitol 10 mg/mL em Tampão de Equilíbrio) e ioadacetamida (25 mg/mL em tampão de equilíbrio, adicionado de azul de bromofenol), por 20 minutos cada, à temperatura ambiente, para promover a redução e alquilação de grupamentos reativos, permitindo boa migração das proteínas e ausência de alguns artefatos. Após o tratamento, as tiras foram aplicadas em contato com gel de poliacrilamida 12,5%, para realização da eletroforese em cuba SE600 (GE Healthcare), utilizando a amperagem de 15-20 mA por gel e potência e voltagem máximas, utilizando a fonte EPS601 (GE Healthcare). A eletroforese foi acompanhada até o corante atingir o limite inferior do gel (8-10 horas). Por fim, os géis analíticos foram escaneados no Scanner Typhoon Trio (GE Healthcare) e as imagens obtidas foram analisadas utilizando o programa ImageMaster 2D Platinum (GE Healthcare). O gel preparativo, por sua vez, foi submetido ao protocolo de coloração com o corante fluorescente DeepPurple, de acordo com instruções do fabricante (fixação de proteínas no gel com etanol 15% e ácido cítrico 1% por 16 h; coloração DeepPurple 200 x diluído em solução de borato de sódio – 1 h; lavagem com etanol 15%; fixação/descoloração com solução de fixação – 24 h). Após coloração do gel preparativo, este foi também escaneado no Scanner Typhoon Trio e armazenado em tampão de fixação a 4ºC, até o recorte dos spots de proteínas. Os spots identificados como diferencialmente presentes entre as linhagens analisadas foram validados por teste t de Student, utilizando o programa ImageMaster 2D Platinum, e então recortados do gel com auxílio do aparelho Ettan Spot Picker (GE Healthcare). 50 - Tratamento dos spots recortados do gel e identificação das proteínas por MALDI ToF-ToF Os spots foram lavados quatro vezes com bicarbonato de amônio (NH4HCO3) 50 mM em acetonitrila (ACN) 50%, para a remoção do SDS presente na amostra. Em seguida, foram desidratados com adição de ACN 100% e mantidos à temperatura ambiente por 16 horas. A reidratação foi feita com a adição de 20 μL de NH4HCO3 100 mM (pH 8,0), contendo 0,5 mg de tripsina sequencing grade (Promega) por 1 h à temperatura ambiente. Após a reidratação, 50 μL de NH4HCO3 10 mM foram adicionados aos spots e incubados em banho seco a 37ºC por 24 horas. A hidrólise foi interrompida com adição de ácido fórmico 5% e incubação à temperatura ambiente por 3 horas, para permitir a difusão dos peptídeos hidrolisados do gel para a solução. Esta etapa foi repetida duas vezes. As frações obtidas foram reunidas e concentradas em concentrador a vácuo. Os peptídeos concentrados foram purificados utilizando ponteiras de micropipeta contendo resina hidrofóbica C18 VydacTM (Grace Davison Discovery Sciences), empacotadas manualmente. A solução concentrada de peptídeos foi aplicada na resina ativada com metanol 100% e equilibrada com ácido fórmico 0,2% (v/v). As lavagens foram feitas com ácido fórmico 0,2% (v/v) e eluição com solução contendo ácido fórmico 5% (v/v) e metanol 60% (v/v). A solução de peptídeos purificados foi concentrada em concentrador a vácuo e ressupendida em 10 μL de uma solução da matriz orgânica ácido α-ciano-hidroxicinâmico (Sigma-Aldrich), preparada em ácido trifluoroacético e ACN. Somente 2 μL dessa solução foi aplicada na placa de MALDI (Matrix-assisted laser desorption ionization) e levada ao espectrômetro de massas modelo AXIMA Performance (Shimadzu). As listas de m/z dos íons, geradas a partir dos espectros MS/MS, foram submetidas à análise pelo programa MASCOT (http://www.matrixscience.com), alimentado com banco de dados de Saccharomyces cerevisiae e de Homo sapiens, sendo o segundo apenas para detecção de proteínas contaminantes no experimento. Para tanto, foram utilizados os seguintes parâmetros de análise: 1) enzima: tripsina; 2) modificação fixa: carbamidometilação, devido ao fato de as proteínas serem alquiladas e reduzidas em processos anteriores à identificação; 3) modificações variáveis: oxidação, pois pode haver oxidação dos resíduos de metionina durante o tratamento das amostras; 4) falha de clivagem: 1, visto que a tripsina pode ter deixado de clivar alguns sítios; 5) tolerância de massa de peptídeos e fragmentos: 0,5-0,8 Da; 6) significância: 0,5; 7) top hits de proteínas: 10; e 8) valor de score limite para identificação dos peptídeos: 50 (p≤0,05). 51 As etapas de digestão das amostras, concentração dos peptídeos hidrolisados, aplicação das amostras no espectrômetro de massas, bem como análise dos dados, foram realizadas em colaboração com o Prof. Dr. Lewis Greene do Centro de Química de Proteínas, USP - Ribeirão Preto, com auxílio das alunas de doutorado Helen Cristina Miranda e Helen Julie Laure. Os resultados das duas primeiras análises proteômicas foram obtidos com esta colaboração. - Tratamento dos spots recortados do gel e identificação das proteínas por ESI Q-ToF Os spots foram lavados quatro vezes com bicarbonato de amônio (NH4HCO3) 50 mM em acetonitrila (ACN) 50%, para a remoção do SDS presente na amostra. Em seguida foram desidratados com adição de ACN 100% por 5 minutos. ACN foi evaporada em evaporador e os spots foram submetidos a tratamento de redução e alquilação com adição de uma solução de DTT 10 mM e, em seguida, de iodacetamida 50 mM, com incubações de 30 minutos a temperatura ambiente. Ao fim do tratamento, foi adicionada aos spots uma solução de NH4HCO3 100 mM por 10 minutos. Os spots foram novamente desidratados com ACN 100% e os peptídeos hidrolisados pela adição de uma solução 20 ng/mL de tripsina sequencing grade (Promega) em solução de bicarbonato de amônio 50 mM, por 30 minutos em banho de gelo. O excesso de solução de tripsina foi removido e os spots incubados a 37ºC por 16 horas. A extração dos peptídeos do gel foi repetida duas vezes, com adição da solução de ácido fórmico 5% em ACN 50%. As frações foram unidas e concentradas em concentrador a vácuo até aproximadamente 1 μL. Por fim, o concentrado de peptídeos foi ressuspenso em 20 μL de ácido fórmico 5% para aplicação de todo o volume no espectrômetro de massas Q-ToF Premier – Micromass (Waters), utilizando a fonte de ionização ESI (electrospray ionization). As listas de m/z dos íons, geradas a partir dos espectros MS/MS, também foram submetidas à análise pelo programa MASCOT. Os parâmetros de análise utilizados foram os mesmos descritos anteriormente. Todo o protocolo de tratamento dos spots e identificação de proteínas foi desenvolvido em nosso laboratório, utilizando protocolos estabelecidos pelo Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), vinculado ao Laboratório Nacional de Luz Sincontron (LNLS), onde realizamos a espectrometria de massas. Os resultados da terceira análise proteômica foram obtidos com esta colaboração. 52 3.2.7. Cruzamento, esporulação e dissecção de leveduras 3.2.7.1. Cruzamento Cepas haplóides de interesse, de S. cerevisiae, foram cruzadas na superfície de ágar YPD e incubadas por uma noite a 25ºC. A seleção de diplóides foi feita pela transferência, com veludo estéril, do crescimento obtido na placa de YPD para a placa de meio duplo seletivo, de acordo com as marcas auxotróficas de cada linhagem. As placas foram incubadas a 25ºC até o aparecimento de massa celular no meio duplo seletivo. O crescimento obtido foi repassado para o mesmo meio seletivo, para isolamento de colônias dos diplóides. 3.2.7.2. Esporulação Após seleção adequada do diplóide, foi preparado inóculo deste em meio S- SPO líquido (2,5 g de extrato de levedura; 15 g acetato de potássio; 40 mg de adenina, uracila e tirosina; 20 mg de histidina, leucina, lisina, triptofano, metionina e arginina; 100 mg de fenilalanina e 350 mg de treonina em 1 litro de água destilada) e incubado a 25ºC, sob agitação, até a formação de ascos (cerca de 5 a 10 dias). 3.2.7.3. Dissecção Foram centrifugados momentaneamente 200 µL da cultura submetida à esporulação. O sobrenadante foi removido e as células ressuspensas em 100 μL de sorbitol 20%. A quebra de parede do asco se deu com a adição de 1,5 μL de zimoliase (10 µg/µL, β-glusuronidase) e incubação da reação a temperatura ambiente por 8 minutos. Em seguida, foi adicionado 1 mL de sorbitol 20% para diluir a reação de digestão e as células ficaram em gelo até a dissecção. A dissecção dos ascos foi realizada utilizando microscópio de dissecção, em placa de meio YPD, que posteriormente foi incubada a 25ºC até a obtenção de colônias isoladas. 3.2.7.4. Caracterização de tétrades As marcas de auxotrofia para os haplóides obtidos foram determinadas utilizando diferentes meios de cultura seletivos. O mating type foi determinado através do cruzamento com cepas de mating type conhecido e seleção dos diplóides em meio seletivo apropriado. Outras marcas, como resistência a antibióticos e análogos tóxicos, como 5-FOA, também foram analisadas utilizando placas de meio YPD/SC- ura contendo esses reagentes. 53 3.2.8. Clonagem empregando Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) 3.2.8.1. Reações de PCR As reações de PCR foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,5 mL contendo 1 μM de cada oligonucleotídeo, VZO669 e VZO670, 40 ng de DNA molde (bilbioteca de cDNA de cérebro fetal humano - Clontech), 2 U da enzima pFU DNA polimerase (New England Biolabs) e 2 μL de uma mistura de desoxiribonucleotídeos (10 mM cada), num volume final de reação de 100 μL. As condições das reações foram estabelecidas de acordo com a temperatura de desnaturação dos oligonucleotídeos utilizados. Após o último ciclo, a reação foi mantida a 72°C por 5 minutos e, a seguir, a 4°C até o momento da próxima etapa. Então, os produtos da reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 0,8% em TAE, contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídio. Ao DNA foi adicionado Tampão de Amostra e a solução foi aplicada no gel. O gel foi submetido a diferença de potencial de 80 V, por 1 hora. O DNA foi visualizado utilizando luz ultravioleta e a imagem documentada utilizando o aparelho AlphaImager 2200 (Alpha Innotech Corporation). 3.2.8.2. Digestão do inserto e vetor O produto amplificado foi purificado utilizando o kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN) a submetido a digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, seguindo as condições recomendadas pelo fabricante (New England Biolabs), por 16 horas a 37°C. O vetor foi também digerido com as mesmas enzimas e os produtos das digestões foram purificados após eletroforese em gel de agarose 0,8%, utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). 3.2.8.3. Reação de ligação e isolamento dos clones Por fim, foi preparada a reação de ligação num volume de 20 μL final, utilizando tampão apropriado, com um excesso de 10 vezes de inserto em relação ao vetor, e 200 U de T4 DNA ligase. A reação foi então incubada a 16°C por 16 horas. Uma alíquota da bactéria E. coli DH5α ultracompetente foi transformada com todo o volume todo da reação de ligação. A placa de transformação foi incubada por 16 horas a 37°C, e as colônias crescidas foram analisadas contra o controle negativo da 54 ligação. As colônias da placa da ligação foram submetidas a preparação de DNA plasmidial e o mesmo foi analisado por diagnóstico de restrição para confirmação da clonagem e seleção do clone. 3.2.9. Mutagênese sítio-dirigida O vetor de interesse, contendo o inserto a ser mutagenizado, foi preparado a partir de extração de DNA plasmidial utilizando kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). A preparação plasmidial foi quantificada por D.O.260nm e, em seguida, a reação de PCR para mutagênese sítio dirigida foi preparada. Os oligonucleotídeos para induzir as modificação de bases nitrogenadas foram desenhados seguindo recomendações descritas no kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) e estão mostrados na Tabela 3.2, juntamente com as respectivas mutações. Em um microtubo foram pipetados os seguintes reagentes: Reagentes Reação Controle negativo Molde (DNA plasmidial) 45 ng 45 ng Tampão Rxn 10X 2,5µL 2,5µL dNTPmix 0,5µL 0,5µL Oligo 1 (0,3µg/µL) 0,3µL 0,3µL Oligo 2 (0,3µg/µL) 0,3µL 0,3µL DNA polimerase TURBO 0,5µL - H2O Milli-Q qsp 25µL 25µL 12-18 ciclos * utilizar Tm entre 45-62°C Etapas Temperatura/Tempo Desnaturação/Hot Start 95°C – 1’ Desnaturação 95°C – 50” Anelamento Tm do primer * - 50” Extensão 68°C – 1’/Kb Extensão final 68°C – 10’ 55 Metade do volume do produto da PCR foi digerido com a enzima DpnI (NEB), adicionando 1,0 µL da enzima, 2,5 µL do seu tampão próprio e 9 µL de água Milli-Q. A reação de digestão foi incubada por 12-16 horas a 37ºC. Em seguida, todo o volume da reação foi transformado em E. coli ultracompetente e as células plaqueadas em meio LB contendo o antibiótico para seleção do plasmídeo utilizado. A placa foi incubada por 12-16 horas a 37ºC. Em paralelo à reação de mutagênese sítio dirigida, foi preparada outra reação com os mesmos componentes, entretanto, na ausência de DNA polimerase, a qual foi utilizada como controle negativo da mutagênese. O crescimento de colônias nas placas da reação e do controle negativo foi analisado. Quando o crescimento de colônias na placa da reação for ≥ 5x o controle negativo, significa que a mutagênese foi eficiente e, portanto, deve-se prosseguir com a identificação de clones mutagenizados. Cinco a dez colônias foram inoculadas em LB líquido contendo o mesmo antibiótico e incubadas por 12-16 horas a 37ºC. A preparação plasmidial das culturas utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) seguiu conforme protocolo do fabricante. Por fim, foi realizado o sequenciamento do gene de interesse a partir dos plamídeos purificados. 3.2.10. Sequenciamento de DNA Após preparação e quantificação do DNA plasmidial obtido por kit Plasmid Miniprep (QIAGEN), foi realizada a reação de PCR para sequenciamento e detecção da mutação pontual no gene de interesse, utilizando reagentes da Applied Biosystems. Em um microtubo de 200 µL, foram pipetados 400 ng do DNA molde, 1 µL do oligonucleotídeo que flanqueia o gene de interesse (3,2 µM) (na maioria dos casos foi usado SVO76), 1 µL de BigDye diluído 8x e 3,5 µL do tampão de seqüenciamento 5x, completando o volume final para 20 µL final com água Milli-Q. As condições da reação utilizadas estão na tabela abaixo: 25 ciclos Etapas Temperatura/Tempo Desnaturação/Hot Start 96°C – 1’ Desnaturação 96°C – 10” Anelamento Tm do primer – 5” Extensão 60°C – 4’ Extensão final 60°C – 5’ 56 Em seguida, foi realizada a purificação do produto de PCR utilizando o kit Big Dye X-Terminator (Applied Biosystems). Para tanto, foram pipetados 45 µL do tampão SAM e 10 µL da resina de precipitação de DNA sobre 10 µL da reação de PCR. O microtubo ficou sob agitação vigorosa 30 minutos a temperatura ambiente e, em seguida, foi centrifugado por 2 minutos a 1000 xg. Durante todo o procedimento, as amostras foram protegidas da luz. Após centrifugação, as amostras foram aplicadas no aparelho sequenciador 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems). 3.2.11. Interação genética sintética utilizando o mutante dys1-1 Devido à severidade e alta taxa de surgimento de revertentes do mutante dys1-1 (dados não mostrados), decidiu-se realizar a substituição do alelo selvagem pelo alelo mutante, por plasmid shuffle, após geração dos haplóides de interesse. Para tanto, o haplóide contendo nocaute duplo nos genes ASC1 e DYS1 foram gerados utilizando as linhagens SVL453 (dys1::HIS3 e VZL1133 (asc1::kanMX4) (3.2.7). Os esporos de interesse foram selecionados na presença de geneticina e na ausência de histidina e uracila. O haplóide foi então transformado com os plasmídeos de interesse e, após seleção dos transformantes, foi realizada a troca do plasmídeo contendo o alelo selvagem DYS1 (item 3.2.3) 3.2.12. Medida de síntese proteica total in vivo As linhagens de levedura contendo alelos selvagem e mutante do gene DYS1 foram cultivadas em 10 mL de meio YPD adicionado de sorbitol 1 M e 2 μCi/mL de [3H] leucina (PerkinElmer), até D.O.600nm = 0,5 a 25°C. Alíquotas das culturas foram recolhidas de hora em hora até 3 horas, as células coletadas por centrifugação a 1.500 xg por 5 minutos e congeladas a -80°C. Os precipitados celulares foram ressuspensos em uma solução de ácido tricloroacético (TCA) 15% e incubados em gelo durante 15 min. As amostras foram aquecidas a 72°C durante 30 min seguido de incubação em gelo por 15 min. O precipitado proteico foi obtido por centrifugação a 15.000 xg, a 4°C, por 10 min, seguido de quatro lavagens com TCA 10% para remoção da [3H] leucina livre. Os precipitados finais foram ressuspensos em 100 μL de 0,2 M de NaOH, e alíquotas de 50 μL foram utilizadas para determinar a 57 radioatividade, incorporada durante a síntese de proteínas, em cintilador Beckman Scintillation Counter (Beckman Coulter). A quantificação de proteínas totais, após precipitação proteica, foi obtida usando o kit BCA Protein Assay (Thermo Scientific), seguindo recomendações do fabricante. A relação entre os valores obtidos no cintilador e o conteúdo total de proteínas foi calculado para cada amostra separadamente, e os dados foram apresentados em gráficos obtidos no programa Microsoft Excel. 3.2.13. Perfil polissomal utilizando formaldeído As linhagens de interesse foram incubadas em 100 mL de meio rico e cultivadas na temperatura permissiva até D.O.600nm = 0,6. As células foram submetidas a crosslinking pela adição de 1% de formaldeído, durante 1 h, em banho de gelo. O formaldeído foi, então, neutralizado com adição de 125 mM de glicina, e as células foram coletadas por centrifugação. A lise celular foi realizada conforme o protocolo de western blot (item 3.2.5) e a quantificação de RNA total do extrato foi realizada por D.O.260nm. Cerca de 15 ODU foram aplicadas em gradiente de sacarose 10-50%, preparado em tampão de lise no equipamento GradientMaster (Biocomp), seguindo instruções do fabricante. Os gradientes foram centrifugados durante 3 h a 39.000 rpm a 4°C em rotor Beckman SW41-Ti. Os gradientes foram subsequentemente fracionados através de deslocamento para cima com uma solução de 60% de sacarose (m/v), utilizando um fracionador de gradiente ligado a uma unidade de controle de UV (Amersham), para a determinação contínua da absorbância a 254 nm. As frações de perfil polissomal foram, coletadas, tratadas para purificação de proteínas por TCA, como descrito no item 3.2.12, e analisadas por western blot (item 3.2.5). Os filmes de western blot foram escaneados utilizando ImageScanner III (GE Healthcare). A quantificação das bandas de interesse foi realizada utilizando o programa ImageQuantTL (GE Healthcare), e os níveis da proteína de interesse foram normalizados pelos níveis da proteína ribossomal Rpl5. Os valores relativos da proteína de interesse, em cada fração, foram comparados entre as diferentes linhagens analisadas. O gráfico representa o valor médio obtido da triplicata experimental. 58 3.2.14. Ensaio de hipusinação in vivo em E. coli 3.2.14.1. Preparo das células Uma colônia isolada da bactéria E. coli BL21, co-expressando a chaperona groES (pG-KJE8 –Taraka Bio) e contendo o plasmídeo de expressão policistrônico pST39 indicado para cada amostra, foi inoculada em 5 mL de LB adicionado dos antibióticos ampicilina (100 mg/mL) e cloranfenicol (32 mg/mL) e incubada a 16°C por 16 horas. A cultura foi diluída 100x para um novo frasco contendo 10 mL do mesmo meio adicionado de tetraciclina (1 ng/mL) para indução da expressão da chaperona e 5 μCi/mL de [3H] espermidina. Quando a cultura atingiu D.O.600nm de aproximadamente 0,5, foi adicionado 1 mM de IPTG, para indução da expressão da proteína eIF5A de interesse. A cultura foi incubada por mais 4 horas na mesma temperatura. 3.2.14.2. Preparo do precipitado proteico e quantificação por cintilometria Ao final, as células foram coletadas, lavadas com PBS 1x e lisadas sob agitação e com adição de uma solução de TCA 15%, adicionada de 1 mM de espermidina e espermina. O precipitado proteico formado foi mantido em gelo por 10 min e, em seguida, aquecido a 96°C por 10 min. Outra incubação em gelo foi realizada e a separação do precipitado foi feita por centrifugação a 20.000 xg por 20 min. O precipitado foi lavado cerca de 10x com acetona 100% gelada e, por fim, ressuspenso em 50 µL de uma solução de NaOH 200 mM. A radioatividade presente em uma alíquota de 10 µL foi determinada em cintilador, após adição de 5 mL de solução amplificadora de sinal (PerkinElmer). Novamente, a normalização do conteúdo proteico de cada amostra analisada foi realizada por quantificação do conteúdo total de proteínas pelo método de BCA Protein Assay (Thermo Scientific). A relação entre os valores de radioatividade e de proteína total, para cada amostra, foi mostrada em gráfico obtido no programa Microsoft Excel. 3.2.15. Purificação de eIF5A de humano a partir de E. coli Este protocolo foi baseado em PARK et al. 2011. 3.2.15.1. Expressão e preparo do extrato protéico 59 A linhagem de E. coli BL21, co-expressando a chaperona groES, foi transformada com um plasmídeo codificando a enzima desoxi-hipusina sintase de humano (DHPS – pVZ1142) e as formas selvagem ou mutadas de cisteína única de eIF5A de humano, todas em vetor pST39. Uma colônia isolada de cada transformante foi crescida em 100 mL de meio de cultura LB contendo 50 μg/mL de cloranfenicol (seletivo para o plasmídeo codificando groES), 50 μg/mL de kanamicina (seletivo para o plasmídeo codificando DHPS) e 100 μg/mL de ampicilina (seletivo para o plasmídeo codificando eIF5A), por 16 horas a 37°C, sob agitação constante. Essa cultura foi diluída em 4 litros do mesmo meio de cultura, acrescido de 1 ng/mL de tetraciclina (indução da expressão de groES) e incubada nas mesmas condições até atingir D.O.600nm = 0,6. A indução da expressão de eIF5A, bem como DHPS, foi feita acrescentando 1 mM de IPTG na cultura e incubando a 30°C por 4 horas sob agitação constante. As células foram coletadas por centrifugação a 8.800 xg por 10 minutos e lavadas com PBS 1x gelado, antes de serem ressuspensas em 50 mL de Tampão de Lise 3 e lisadas em sonicador (ciclo de 15 minutos: 5 segundos ON e 10 segundos OFF, amplitude de 60%). O lisado foi clarificado por centrifugação a 20.000 xg por 30 minutos a 4°C. O extrato protéico foi coletado e submetido à precipitação em alta concentração de sal, adicionando sulfato de amônio até saturação de 75% (cerca de 24 g de sal para cada 50 mL de extrato). Após uma hora a 4°C e sob agitação, as proteínas foram separadas por centrifugação e, em seguida, ressuspensas em 50 mL de Tampão A e dialisadas contra um litro do Tampão A por 16 horas 4°C. O dialisado foi filtrado em membrana de 0,22 μm diâmetro de poro e submetido a cromatografia. 3.2.15.2. Cromatografias de troca iônica em FPLC O extrato filtrado foi aplicado em coluna HiTrap Q HP de 5 mL (GE Heathcare), previamente equilibrada com o Tampão A em fluxo constante de 1 mL/min. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e, em seguida, as proteínas foram eluídas em gradiente de 0-60% de Tampão B, também em fluxo de 1 mL/min. As frações correspondentes a 7-20% de Tampão B foram analisadas em SDS-PAGE após coloração por Coomassie Blue R. As frações que apresentaram eIF5A foram reunidas e dialisadas contra Tampão A por 16 horas a 4°C. O dialisado foi aplicado em coluna HiTrap SP HP de 5 mL (GE Healthcare), previamente equilibrada com Tampão A, em fluxo constante de 1 mL/min. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e, em seguida, as proteínas foram eluídas em gradiente de 0-60% de Tampão B, também em fluxo de 1 mL/min. As frações correspondentes 60 aos 2 picos vistos no cromatograma (Figuras 20B e 20C) foram analisados em SDS- PAGE após coloração por Coomassie Blue R. As frações que apresentaram apenas as formas de eIF5A não hipusinada (primeiro pico) ou hipusinada (segundo pico) foram reunidas, concentradas utilizando concentradores Amicon de 3 kDa de poro (Millipore), quanti