UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA 

 

 

 

VICTOR GUSTAVO BALERA BRITO 

 

 

 

 

PAPEL DOS MASTÓCITOS SOBRE O METABOLISMO 

ÓSSEO LOCAL E SISTÊMICO DE RATOS NORMOTENSOS 

E HIPERTENSOS COM DOENÇA PERIODONTAL 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ARAÇATUBA 

2018  



 
 

 

 

 

 

 

 

VICTOR GUSTAVO BALERA BRITO 

 

 

 

 

PAPEL DOS MASTÓCITOS SOBRE O METABOLISMO 

ÓSSEO LOCAL E SISTÊMICO DE RATOS NORMOTENSOS 

E HIPERTENSOS COM DOENÇA PERIODONTAL 

 

 

 

Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-

Graduação em Ciências Fisiológicas, da Faculdade de 

Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho”, para obtenção do título de Mestre 

em Ciências Fisiológicas. 

 

Orientadora: Prof.ª Tit. Sandra Helena Penha de Oliveira 

 

 

 

 

 

ARAÇATUBA 

2018  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Catalogação na Publicação (CIP) 

Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP 

 

 Brito, Victor Gustavo Balera. 

B862p  Papel dos mastócitos sobre o metabolismo ósseo local e 

 sistêmico de ratos normotensos e hipertensos com doença 

 periodontal / Victor Gustavo Balera Brito. - Araçatuba, 2018 

  139 f. : il. ; tab. 

 

  Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, 

 Faculdade de Odontologia de Araçatuba 

  Orientadora: Profa. Sandra Helena Penha de Oliveira 

 

  1. Doenças periodontais 2. Mastócitos 3. Hipertensão 

 4. Ratos endogâmicos SHR I. T. 

 

    CDD 612 

 

Claudio Hideo Matsumoto CRB-8/5550 

 

 

 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DADOS CURRICULARES 

 

 

 

 

  



 
 

 

 

VICTOR GUSTAVO BALERA BRITO 

 

 

 

 

Nascimento: 15 de fevereiro de 1993; Birigüi/SP. 

 

 

 

 

Filiação: Carlos dos Santos Brito 

Filiação: Cássia Rosane Balera Brito 

 

 

 

 

2011/2015: Graduação em Farmácia, Centro Universitário Católico Salesiano 

Auxilium de Araçatuba (UniSalesiano). 

 

 

 

 

2016/2018: Curso de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, nível Mestrado 

Acadêmico, pelo Programa Multicêntrico de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, 

Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista “Júlio de 

Mesquita Filho” (Foa/Unesp). 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DEDICATÓRIA 

 

 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Aos alicerces da minha vida, 

meus pais Carlos e Cássia e avós Dona Cida e Seu Daniel. 

 

 

 

 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AGRADECIMENTOS 

 

 

 

 

  



 
 

AGRADECIMENTOS 

 

À Faculdade de Odontologia de Araçatuba / Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho”, nas pessoas de sua direção Professor Titular Wilson Roberto 

Poi e Professor Titular João Eduardo Gomes Filho, por oferecer a oportunidade de 

realizar esta pesquisa. 

 

Ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da 

Sociedade Brasileira de Fisiologia (SBFis), nas pessoas de sua coordenação geral, 

Professora Ilma Brum Silva (UFRGS) e presidente da SBFis, Professor Vagner 

Roberto Antunes (ICB/USP). 

 

Ao Conselho Local do Programa, na pessoa de sua coordenação, Professora 

Cristina Antoniali Silva, e demais membros, pelo trabalho e esforços realizados para 

o crescimento, visibilidade e reconhecimento deste Programa. 

 

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), 

pela concessão da bolsa de mestrado. 

 

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo 

financiamento desta pesquisa. 

 

À Pró-reitora de pós-graduação da UNESP (PROPG/UNESP), pelo apoio 

financeiro nas viagens para realização das disciplinas. 

 

Ao Laboratório Multiusuário de Biotecnologia e Bioengenharia (MUBIO) 

(Convênio FINEP 01.12.0530.00 - PROINFRA 01/2011) da Foa/Unesp, onde foram 

realizadas as análises de microtomografia, em especial aos seus responsáveis, 

Professora Sandra Helena Penha de Olivera e Professor Alberto Carlos Botazzo 

Delbem, e as amigas Melise Jacon Peres Ueno e Fernanda Fernandes, pela ajuda 

nas análises. 

 



 
 

À Seção Técnica de Pós-Graduação desta instituição, e seus servidores 

técnicos-administrativos, Valéria de Queiroz Marcondes Zagato, Cristiane Regina Lui 

Matos e Lilian Sayuri Mada, pela eficiência e cordialidade nas ocasiões de 

necessidade. 

 

A todos os demais funcionários da Foa/Unesp, cujos trabalhos são essenciais 

para o bom funcionamento desta universidade. Em especial aos senhores Camilo 

Roberto Venâncio, João Batista Alves Correa e Alan Roger Cenerine Carvalho, 

responsáveis pelo Biotério Central, pelo trabalho e cordialidade; Aos servidores da 

Seção de Conservação e Manutenção, por nos salvar nos momentos dos imprevisto; 

A Seção Técnica de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extensão (STAEPE), por todo o 

suporte solicitado; Aos servidores da limpeza, em especial a Dona Marcia Castellani, 

por seu trabalho, bom humor e carinho com todos do departamento; e a Dorinha da 

Cantina, pelo seu trabalho, bom humor e carinho conosco. 

 

Aos professores do Departamento de Ciências Básicas desta instituição, por 

sua contribuição científica, além do carinho e cuidado não apenas comigo, mas com 

todos os alunos. 

 

As professoras Cristina Antoniali Silva Ana Claúdia de Melo Stevanato 

Nakamune, pela disponibilidade, atenção e valiosas contribuição em meu Exame 

Geral de Qualificação. 

 

Aos amigos discentes e egressos do Programa Multicêntrico de Pós-graduação 

em Ciências Fisiológicas desta instituição, pela amizade e companheirismo. 

 

A amiga Monique Patricio Singulani, por gentilmente me receber em sua casa 

em São Paulo, durante o curso das disciplinas no Instituto de Ciências Biomédicas da 

Universidade de São Paulo. 

 

Aos amigos da FamacoA, Murilo Eduardo Graton, Jéssica Antonini Troiano, 

Simone Regina Potje e Heitor Ceolin Araujo, pela ótima convivência, deixando os dias 

de trabalho muito mais agradáveis. 

 



 
 

Aos amigos do laboratório, a FarmacoB, pela colaboração e boa vontade diária. 

Em especial, aos parceiros Carluci Tais Beltran, Ayna Alves Barreto, Sabrina Cruz 

Tfaile Frasneli, Dayane Priscilla Queiroz, Letícia Vieira, Mariana Souza Patrocinio, 

Maria Carolina Linjardi de Souza, que tiveram papel fundamenta na realização deste 

trabalho, além de se mostrarem muito mais do que colegas de trabalhos, verdadeiros 

amigos! Muitas vezes, passamos mais tempo dentro do laboratório do que com 

nossas próprias famílias, mas fico muito feliz de que este tempo seja com vocês! 

 

A minha orientadora, Professora Sandra Helena Penha de Oliveira, por ter 

aberto as portas de seu laboratório em 2012 para um estagiário. Muito obrigado por 

todos os ensinamentos, broncas, berros e desesperos que nos fez passar! Toda a 

cobrança e rigidez foi essencial para a minha formação e crescimento científico! Profa 

Sandra é um dos meus grandes exemplos de trabalho e competência! 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EPÍGRAFE 

 

 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Onde quer que esteja, esteja por inteiro. Se o seu aqui e agora o 
deixam infeliz, há três opções: abandona-los, mudá-los ou aceitá-los 
totalmente. Deves escolher uma das opções e aceitar as consequências. 
Sem desculpas. Sem negatividade. 

 

Adaptado de Eckhart Tölle, 

em o Poder do Agora: Um guia para a iluminação espiritual, 1997. 

 

 

 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RESUMO 

 

 

 

 

  



 
 

BRITO, V. G. B. Papel dos mastócitos sobre o metabolismo ósseo local e 

sistêmico de ratos normotensos e hipertensos com doença periodontal. 

Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Odontologia, Universidade Estatual Paulista, 

Araçatuba, 2018. 

 

RESUMO 

 

Introdução: A doença periodontal (DP) é uma desordem inflamatória dos tecidos de 

suporte dos dente, iniciada pelo acumulo de biofilme bacteriano, apresentando 

consequências locais e sistêmicas. A coexistência de doenças sistêmicas, como a 

hipertensão, pode levar a uma inflamação exacerbada, maior reabsorção óssea e 

dano sistêmico pronunciado. Além disso, células imunes residentes têm importante 

papel na progressão da DP, porém, a participação dos mastócitos (MC) ainda não é 

bem compreendida. Objetivos: Avaliar o papel dos MC sobre o metabolismo ósseo 

local (mandíbula) e sistêmico (fêmur), em modelo animal normotenso (ratos Wistar) e 

hipertenso (ratos SHR) com DP. Métodos: Ratos machos Wistar e SHR (10 semanas) 

foram utilizados. A depleção de MC foi conduzida pelo pré-tratamento com o composto 

48/80 e a DP foi induzida por ligadura bilateral nos primeiros molares inferiores, 

mantida por 15 dias. Foi realizada a identificação de MC no tecido gengival, por 

coloração com Azul de Toluidina. A perda óssea alveolar e parâmetros de arquitetura 

óssea na mandíbula e fêmur foram avaliados por microtomografia computadorizada, 

a expressão gênica de marcadores de formação, remodelamento e reabsorção na 

mandíbula e fêmur foram avaliada por RT-PCR em tempo real, e a produção de 

citocinas nos tecidos de interesse foi avaliada por ELISA. Principais resultados: 

Observamos significativa perda óssea induzida por DP, principalmente no SHR, em 

comparação ao Wistar, e a depleção de MC foi capaz de prevenir esta perda. A DP 

levou a expressão aumentada de Opn, Opg, Rankl e Rank, Trap, Ctsk, Vtn, Itga5 e 

Itgb5, além de aumento na produção de TNF-α, IL-6, IL-10 e CXCL3 na mandíbula, o 

que foi reduzido em animais depletados de MC. No fêmur, a DP não levou a alterações 

da arquitetura óssea, mas foi capaz de aumentar a expressão de Runx2, Opn, Opg, 

Rankl, Rank, Trap, Mmp2, Mmp9, Vtn, Itga5 e Itgb5, o que também foi 

significativamente reduzido pela depleção de MC. Conclusões: Nossos dados 

sugerem um importante papel dos MC nas consequências ósseas locais (mandíbula) 

da DP, especialmente nos animais SHR, além dos efeitos sistêmicos (fêmur) onde os 

MC possivelmente têm participação na modulação da expressão de marcadores 

ósseo, alterados pela DP, o que foi mediado por vias diferentes das observadas na 

resposta local. 

 

Palavras chave: Doença periodontal; Mastócitos; Hipertensão; rato SHR. 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ABSTRACT 

 

 

 

 

  



 
 

BRITO, V. G. B. Mast cells role on local and systemic bone metabolism of 

normotensive and hypertensive rats with periodontal disease. Dissertação 

(Mestrado) - Faculdade de Odontologia, Universidade Estatual Paulista, Araçatuba, 

2018. 

 

ABSTRACT 

 

Introduction: Periodontal disease (PD) is an inflammatory disorder of the tissues 

supporting the teeth, which start from the bacterial biofilm accumulation, and results in 

local and systemic damage. The coexistence of systemic diseases, such as 

hypertension, can lead to exacerbated inflammation, increased alveolar bone 

resorption and increased systemic damage. In addition, resident immune cells have 

an important role in PD progression, however the mast cells (MC) participation is still 

not well understood. Aims: To evaluate the role of MC in the local (mandible) and 

systemic (femur) bone metabolism in a normotensive (Wistar) and hypertensive (SHR) 

rats with PD. Methods: Males Wistar and SHR rats (10-week old) were used. MC 

depletion was conducted by compound 48/80 treatment and PD was induced by 

bilateral ligature placed in the lower first molars, which was maintained for 15 days. 

The identification of MC in the gingival tissue was done by Toluidine Blue staining, 

alveolar bone loss and bone architecture parameters of mandible and femurs were 

evaluated by micro-computed tomography, bone markers gene expression on the 

mandible and femur were evaluated by real time RT-PCR, and the cytokines 

production was evaluated by ELISA. Key results: We observed a more significant PD-

induced bone loss in SHR, compared to Wistar, and MC depletion was able to prevent 

this loss. PD increased the expression of Opn, Opg/ Rankl/Rank, Trap, Ctsk, Vtn, Itga5 

and Itgb5, as well as increased production of TNF-α, IL-6, IL-10 and CXCL3 in the 

mandible, what was prevented by MC depleted animals. In the femur, PD did not 

change bone architecture parameters, but was able to increase expression of Runx2, 

Opn, Opg/Rankl/Rank, Trap, Mmp2, Mmp9, Vtn, Itga5 and Itgb5, which also was 

significantly reduced by MC depletion. Conclusions: Our data suggest an important 

role of MC in the local bone consequences (mandible) of PD, especially in SHR, as 

well the systemic effects (femur), where MC may have a role in bone dynamics by 

modulating the expression of bone markers, altered by PD, through different 

mechanism from those observed in the local response. 

 

Key worlds: Periodontal disease; Mast cells; Hypertension; SHR. 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LISTA DE FIGURAS 

 

 

 

 

  



 
 

LISTA DE FIGURAS 

 

Figura 1 - Fotomicrografia de citocentrifugação do lavado peritoneal 

corado com Azul de Toluidina 56 

Figura 2 - Fotos realizadas durante a indução da doença periodontal 57 

Figura 3-1 - Fotomicrografia do tecido gengival, corado com Azul de 

Toluidina 70 

Figura 3-2 - Fotomicrografia do tecido gengival, corado com Azul de 

Toluidina 71 

Figura 4 - Análise de microCT do osso alveolar de animais Wistar e SHR 

com doença periodontal, previamente depletados de 

mastócitos 73 

Figura 5 - Reconstrução tridimensional da mandíbula (região do primeiro 

molar) de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente 

depletados de mastócitos 74 

Figura 6 - Expressão gênica das citocinas (A) IL1b, (B) Tnfa e (C) IL6 em 

mandíbula de Wistar e SHR com doença periodontal, 

previamente depletados de mastócitos 76 

Figura 7 - Produção das citocinas (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-10 e das 

quimiocinas (D) CXCL3/CINC-2 e (E) CCL20/MIP-3 α em 

mandíbula de Wistar e SHR com doença periodontal, 

previamente depletados de mastócitos 78 

Figura 8 - Expressão gênica dos fatores de transcrição (A) Runx2, (B) 

Osx e (C) Catnb em mandíbula de Wistar e SHR com doença 

periodontal, previamente depletados de mastócitos 80 

Figura 9 - Expressão gênica dos marcadores de formação óssea (A) Alp, 

(B) Col1a1, (C) Opn, (D) Ocn, (E) Bsp, e (F) Bmp2 em 

mandíbula de Wistar e SHR com doença periodontal, 

previamente depletados de mastócitos 82 

Figura 10 - Expressão gênica de marcadores de remodelação óssea (A) 

Opg, (B) Rankl e (C) Rank em mandíbula de Wistar e SHR 

com doença periodontal, previamente depletados de 

mastócitos 84 



 
 

Figura 11 - Expressão gênica dos marcadores de reabsorção óssea (A) 

Trap, (B) Mmp2, (C) Mmp9, (D) Ctsk, (E) Oscar, (F) Vtn, (G) 

Itga5, e (H) Itgb5 em mandíbula de Wistar e SHR com doença 

periodontal, previamente depletados de mastócitos 86 

Figura 12 - Análise de microCT do fêmur distal de Wistar e SHR com 

doença periodontal, previamente depletados de mastócitos 88 

Figura 13 - Reconstrução tridimensional da mandíbula (região do primeiro 

molar) de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente 

depletados de mastócitos 89 

Figura 14 - Expressão gênica dos fatores de transcrição (A) Runx2, (B) 

Osx e (C) Catnb no fêmur de Wistar e SHR com doença 

periodontal, previamente depletados de mastócitos 92 

Figura 15 - Expressão gênica dos marcadores de formação óssea (A) Alp, 

(B) Col1a1, (C) Opn, (D) Ocn, (E) Bsp, e (F) Bmp2 no fêmur 

de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente 

depletados de mastócitos 94 

Figura 16 - Expressão gênica de marcadores de remodelação óssea (A) 

Opg, (B) Rankl e (C) Rank no 20emur de Wistar e SHR com 

doença periodontal, previamente depletados de mastócitos 96 

Figura 17 - Expressão gênica dos marcadores de reabsorção óssea (A) 

Trap, (B) Mmp2, (C) Mmp9, (D) Ctsk, (E) Oscar, (F) Vtn, (G) 

Itga5, e (H) Itgb5 no fêmur de Wistar e SHR com doença 

periodontal, previamente depletados de mastócitos 98 

Figura 18 - Esquema do papel dos mastócitos no metabolismo ósseo local 

(mandíbula) de animais Wistar com doença periodontal 118 

Figura 19 - Esquema do papel dos mastócitos no metabolismo ósseo local 

(mandíbula) de animais SHR com doença periodontal 118 

Figura 20 - Esquema do papel dos mastócitos no metabolismo ósseo 

sistêmico (fêmur) de animais Wistar com doença periodontal 119 

Figura 21 - Esquema do papel dos mastócitos no metabolismo ósseo 

sistêmico (fêmur) de animais SHR com doença periodontal 119 

Figura 22 - Esquema das conclusões do trabalho 121 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LISTA DE TABELAS 

 

 

 

 

  



 
 

LISTA DE TABELAS 

 

Tabela 1 - Relação dos anticorpos utilizados (R&D systems) 61 

Tabela 2 - Relação dos ensaios TaqManTM utilizados 65 

 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

 

 

 

 

  



 
 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

 

µA - Microampere 

µL - Microlitro 

µL - Microlitro 

µm - Micrometro 

Actb - Beta actin 

Alp - Bone alkaline phosphatase 

ANOVA - Analysis of variance, análise de variância 

ASB - Albumina sérica bovina 

Bmp2 - Bone morphogenetic protein 2 

Bsp/Ibsp - Bone sialoprotein / Integrin-binding sialoprotein 

BV/TV - Bone volume/Total volume, Volume ósseo/Volume total 

c48/80 - Composto 48/80 

Catnb - β-catenin / Cadherin associated protein beta 1 

CCL20 - Chemokine (C-C motif) ligand 20, Ligante quimiocina (motivo C-C) 
20 

cDNA - Complementary deoxyribonucleic acid, Ácido desoxirribonucleico 
complementar 

CINC-2 - Cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2, Quimiotático de 
neutrófilo induzido por citocina-2 

Co.Po - Porosidade cortical 

Co.Th - Espessura cortical 

Col1a1 - Collagen type I alpha 1 

Ct - Cycle threshold, Ciclo limiar 

Ctsk - Cathepsin K 

CXCL2 - Chemokine (C-X-C motif) ligand 2, Ligante quimiocina (motivo C-X-
C) 2 

DEPC - Diethyl pyrocarbonate, Pirocarbonato de dietila 

DNA - Deoxyribonucleic acid, Ácido desoxirribonucleico 

DNase - Desoxirribonuclease 

DP - Doença periodontal 

HIV - Human immunodeficiency virus, Vírus da imunodeficiência humana 

IL-10 - Interleukin-10, Interleucina-10 

IL-6 - Interleukin-6, Interleucina-6 

Itgav - Integrin, alpha V 



 
 

Itgb5 - Integrin, beta 5 

Kg - Quilograma 

kVp - Pico de quilovoltagem 

mg - Miligrama 

microCT - Micro-computed tomography, micro tomografia computadorizada 

MIP-3α - Macrophage inflammatory protein-3 alpha, Proteína inflamatória de 
macrófago-3 alfa 

mL - Mililitro 

mm - Milímetro 

Mmp2 - Matrix metalloproteinase 2 

Mmp9 - Matrix metalloproteinase 9 

ms - Milissegundo 

Ocn/Bglap - Osteocalcin / Bone gamma-carboxyglutamate protein 

Opg - Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11b 

Opn/Spp1 - Osteopontina / secreted phosphoprotein 1 

Oscar - Osteoclast associated immunoglobulin-like receptor 

Osx/Sp7 - Osterix/Sp7 transcription factor 

p - Probabilidade 

PBS - Phosphate-buffered saline, Tampão fosfato salino 

qRT-PCR - Reverse transcription polymerase chain reaction quantitative real 
time, Reação de transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia 
da polimerase quantitativo em tempo real 

Rank - Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a 

Rankl - Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 

RCF - Relative centrifugal force, Força centrífuga relativa 

RNA - Ribonucleic acid, Ácido ribonucleico 

RNase - Ribonuclease 

ROI - Region of interest, Região de interesse 

RQ - Relative quantitation, Quantificação relativa 

Runx2  - Runt-related transcription factor 2 

S48/80 - Grupo experimenta SHR depletado de mastócitos, com doença 
periodontal 

SC - Grupo experimental SHR controle 

SDP - Grupo experimental SHR com doença periodontal 

SEM - Standard error of the mean, Erro padrão da média 

SHR - Spontaneously hypertensive rat, Rato espontaneamente hipertenso 



 
 

SMI - Structure model index, Índice de modelo estrutural 

Tb.N - Trabecular number, Número de trabéculas 

Tb.Sp - Trabecular separation, Separação trabecular 

Tb.Th - Trabecular thickness, Espessura trabecular 

TNF-α - Tumor necrosis factor alpha, Fator de necrose tumoral 

Trap/Acp5 - Acid phosphatase 5, tartrate resistant 

USP - United States Pharmacopeia 

VOI - Volume of interest, Volume de interesse 

Vtn - Vitronectin 

W48/80 - Grupo experimenta Wistar, depletado de mastócitos, com doença 
periodontal 

WC - Grupo experimental Wistar controle 

WDP - Grupo experimental Wistar com doença periodontal 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LISTA DE SÍMBOLOS 

 

 

 

 

  



 
 

LISTA DE SÍMBOLOS 

 

α - Alfa 

* - Asterisco 

β - Beta 

º - Grau 

ºC - Graus Celsius 

+ - Mais 

± - Mais ou menos 

® - Marca registrada 

< - Menor que 

- - Menos 

: - Para (razão matemática) 

% - Porcentagem / Por cento 

TM - Trademark; Marca comercial 

∆ - Variação 

∆∆ - Variação da variação 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LISTA DE ANEXOS 

 

 

 

 

  



 
 

LISTA DE ANEXOS 

 

Anexo 1 - Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais 138 

 

 

  



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SUMÁRIO 

 

 

 

 

  



 
 

SUMÁRIO 

INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 34 

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 35 

1.1. Doença periodontal, aspectos gerais........................................................... 35 

1.2. Aspectos sistêmicos da doença periodontal ................................................ 40 

1.3. A hipertensão arterial e sua relação com a doença periodontal .................. 41 

1.4. Desordens de perda ósseas e sua relação com a doença periodontal e 
hipertensão arterial ............................................................................................. 43 

1.5. Mastócitos e sua relação com a doença periodontal ................................... 46 

PROPOSIÇÃO .......................................................................................................... 49 

2. Proposição .......................................................................................................... 50 

OBJETIVOS .............................................................................................................. 51 

3. Objetivos ............................................................................................................. 52 

3.1 Objetivo geral ............................................................................................... 52 

3.2 Objetivos específicos .................................................................................... 52 

MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 54 

4. Material e métodos ............................................................................................. 55 

4.1. Animais e aspectos éticos ........................................................................... 55 

4.2. Tratamento com o composto 48/80 ............................................................. 55 

4.3. Indução da doença periodontal ................................................................... 57 

4.4. Marcação de mastócitos no tecido gengival ................................................ 58 

4.5. Micro tomografia computadorizada (microCT) ............................................. 58 

4.5.1. Analise do osso alveolar ......................................................................... 58 

4.5.2. Analise do porção distal do fêmur ........................................................... 59 

4.6. Dosagem de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) e quimiocinas (CXCL3/CINC-2 
e CCL20/MIP-3α) na mandíbula e fêmur ............................................................ 60 

4.6.1. Extração das amostras ........................................................................... 60 

4.6.2. Ensaio de ELISA sandwich (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) .... 60 

4.7. Análise da expressão gênica de marcadores ósseos .................................. 62 

3.7.1. Coleta das amostras ............................................................................... 62 

4.7.2. Extração e quantificação do RNA total ................................................... 62 

4.7.3 Síntese do DNA complementar e reação em cadeia da polimerase em 
tempo real ......................................................................................................... 64 

4.7.4 Analise dos dados de expressão gênica .................................................. 66 

4.8. Análise estatística ........................................................................................ 67 

RESULTADOS .......................................................................................................... 68 

5. Resultados .......................................................................................................... 69 

5.1. Mastócitos são mais frequentes na gengiva de animais com doença 
periodontal .......................................................................................................... 69 



 
 

5.2. A depleção de mastócitos previne a perda óssea alveolar induzida pela 
doença periodontal, principalmente em SHR ..................................................... 72 

5.3. A depleção de mastócitos reduz a expressão de citocinas induzida pela 
doença periodontal em SHR ............................................................................... 75 

5.4. A depleção de mastócitos reduz a produção de mediadores inflamatórios na 
mandíbula, principalmente SHR ......................................................................... 77 

5.5. Depleção de mastócitos reduz a expressão de Runx2 e Catnb em 
mandíbulas de SHR com doença periodontal .................................................... 79 

5.6. Depleção de mastócitos previne o aumento da expressão de Opn induzida 
por doença periodontal em mandíbula ............................................................... 81 

5.7. Depleção de mastócitos previne as alterações no eixo Opg/Rankl/Rank 
induzida por doença periodontal na mandíbula de Wistar e SHR ...................... 83 

5.8. Depleção prévia de mastócitos previne as alterações em marcadores de 
reabsorção óssea em mandíbula de Wistar e SHR com doença periodontal ..... 85 

5.9. Doença periodontal não altera a arquitetura óssea em fêmur de Wistar e 
SHR .................................................................................................................... 87 

5.10. Expressão e produção de citocinas no fêmur ............................................ 90 

5.11. Depleção de mastócitos reduziu a expressão de fatores de transcrição no 
fêmur de animais com doença periodontal ......................................................... 91 

5.12. O aumento da expressão de marcadores de formação óssea no fêmur, 
induzido pela doença periodontal, tem participação dos mastócitos .................. 93 

5.13. O aumento da expressão de Opg/Rankl/Rank no fêmur, induzido pela 
doença periodontal, tem participação dos mastócitos ........................................ 95 

5.14. O aumento da expressão dos marcadores de reabsorção óssea, induzido 
pela doença periodontal, tem participação dos mastócitos ................................ 97 

DISCUSSÃO ............................................................................................................. 99 

6. Discussão ......................................................................................................... 100 

CONCLUSÃO ......................................................................................................... 120 

7. Conclusão ......................................................................................................... 121 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 122 

ANEXOS ................................................................................................................. 137 

Anexo 1 - Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais .......................... 138 

 

 

 

 



34 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

INTRODUÇÃO 

 

 

 

 

  



35 
 

1. INTRODUÇÃO 

 

1.1. Doença periodontal, aspectos gerais 

A doença periodontal é um termo que compreende diversas desordens 

que afetam o periodonto, ou seja, os tecidos circundantes e de suporte do dente 

(Pihlstrom, Michalowicz et al. 2005, Kinane, Stathopoulou et al. 2017). O 

periodonto exerce a função primária de ancorar os dentes no alvéolo dentário, 

com uma organização anatômica e funcional complexa. Basicamente, 

compreende quatro estruturas: a) Gengiva (Tecido conjuntivo mole que recobre 

o osso alveolar e a raiz dos dentes até a porção cervical, na junção cemento-

esmalte, podendo ser anatomicamente dividida em gengiva marginal, aderida e 

interdental, tem função primária de resistir a danos mecânicos e ataque 

microbiológico, protegendo os tecidos internos) (Cho and Garant 2000); b) 

Ligamento periodontal (Intimamente ligado ao tecido gengival e processo 

alveolar, mediando a ancoragem dos dentes, além de importante papel na 

manutenção e adaptabilidade do periodonto) (Newman, Takei et al. 2006); c) 

Cemento (Tecido conectivo mineralizado e não vascularizado que cobre a 

superfície radicular dos dentes, formando uma interface entre a dentina e o 

ligamento periodontal, onde este se insere) (Cho and Garant 2000); e d) Osso 

alveolar (Processo alveolar dos ossos da mandíbula e maxila, na qual os dentes 

estão inseridos, abrigam as raízes dos dentes e recebem e distribuem as 

pressões oclusais, tratando-se de uma estrutura bastante ativa e grande 

capacidade de remodelamento) (Cho and Garant 2000, Huja, Fernandez et al. 

2006). 



36 
 

Assim, tais condições podem ter diversas etiologias e fatores de risco, 

entretanto a forma mais comum e estudada é a doença periodontal resultante do 

biofilme bacteriano ou placa dentária adjacente aos dentes, acumulada 

diariamente, devido a higienização incorreta (Pihlstrom, Michalowicz et al. 2005). 

Ainda assim, outras naturezas etiológicas podem ser elencadas: a) 

Desordens genéticas com manifestação periodontal, como síndrome de Haim-

Munk e Papillon-Lefèvre (mutação no gene da catepsina K, leva a destruição 

periodontal prematura) (Rai, Thiagarajan et al. 2010), síndrome Chédiak-Higashi 

(mutação no gene regulador de tráfico lisossomal, leva a disfunção fagocítica, 

predispondo a infecções frequentes) (Bailleul-Forestier, Monod-Broca et al. 

2008), síndrome Ehlers-Danlos tipo 4 e 8 (mutação em diversos genes que 

compromete a estrutura do tecido conjuntivo e a resposta imunológica) 

(Kapferer-Seebacher, Pepin et al. 2016), síndrome de Kindlers (desordem 

dermatológica com manifestações periodontais, causada por mutação no gene 

da proteína kindlin-1) (Wiebe, Petricca et al. 2008), e síndrome de Cohen 

(alteração no cromossomo 8, leva a atrasos no desenvolvimento neurogênico e 

obesidade, sendo isto associado a prejuízos periodontais precoces (Alaluusua, 

Kivitie-Kallio et al. 1997); b) Síndromes metabólicas, como diabetes em 

indivíduos com mau controle glicêmico que aumentam significativamente o risco 

para o desenvolvimento e progressão da doença periodontal (Preshaw, Alba et 

al. 2012); c) Osteoporose, síndrome osteometabólica que leva a prejuízos 

ósseos generalizados, e pode ser apontada como fator de risco para a doença 

periodontal (Wang and McCauley 2016); d) Hábitos deletérios, como o 

tabagismo e etilismo, que contribuem para o desenvolvimento e severidade da 

doença periodontal, por serem potencialmente agressivos aos tecidos 



37 
 

periodontais (Tezal, Grossi et al. 2001, Bergstrom 2004); e) Deficiências 

imunológicas, de origem genética ou adquirida, como na infecção por HIV, que 

levam a uma resposta imune prejudicada, favorecendo a colonização bacteriana 

e a progressão da doença periodontal (Al-Hezaimi, Javed et al. 2012), e f) Outros 

fatores, como nutrição, trauma e neoplasias também podem ser associados a 

condições periodontais, mas com menor incidência (Newman, Takei et al. 2014). 

Devido alta prevalência, a doença periodontal é considera um problema 

de saúde pública bastante significativo, e segundo dados do Global Burden of 

Diseases Study, a prevalência global da doença em 2016 foi de 10.54% 

(aproximadamente 750 milhões de pessoas), e no Brasil, 11.9% 

(aproximadamente 24 milhões de pessoal), considerando ambos sexos e todas 

as idades, sendo observada maior prevalência em indivíduos adultos a partir de 

35 anos (16.5%) e acima de 45 anos (45%) (Richards 2014, DALYs and 

Collaborators 2016). Como pontuado por Chapple (2014), trata-se de uma das 

doenças inflamatórias crônicas mais comuns, especialmente na população 

socioeconomicamente desfavorecida, sem acesso a informações e atendimento 

médico-odontológico adequado, sendo a principal causa de perda dentária, 

favorecendo disfunções mastigatórias, comprometimento de fala e prejuízos na 

qualidade de vida (Bonfim Mde, Mattos et al. 2013, Batchelor 2014). 

A patogênese da doença periodontal, de maneira geral, apresenta as fase 

comuns da demais desordens inflamatórias crônicas. Inicialmente, o acumulo de 

biofilme dental gera uma resposta local, o que posteriormente se agrava levando 

a um quadro de gengivite com sinais clínicos já pronunciados, mas ainda 

reversíveis, visto que nesta fase a remoção do biofilme dental, cessa o estímulo 

inflamatório levando a resolução espontânea (Hasan and Palmer 2014, Lindhe, 



38 
 

Lang et al. 2015). Por outro lado, a permanência do biofilme dental leva a 

cronificação do processo inflamatório infecioso, e eventualmente, o agravo da 

condição resulta na formação de bolsas periodontais, caracterizadas pelo 

aprofundamento do sulco gengival, criando um compartimento colonizado por 

microrganismos (Pihlstrom, Michalowicz et al. 2005, Newman, Takei et al. 2014)  

Neste ponto, a doença pode levar a consequências irreversíveis à saúde 

periodontal, principalmente pela progressão mais acelerada, visto que a 

higienização oral convencional não é mais suficiente para eliminar o foco 

infeccioso, exigindo atenção odontológica especializada (Plessas 2014, 

Teughels, Dhondt et al. 2014). O tratamento adequado pode resolver a 

contaminação e inflamação, assim como levar a regeneração parcial dos tecidos 

epiteliais e conjuntivos, incluindo o ósseo, entretanto a completa restauração das 

estruturas periodontais não ocorre. Sem o tratamento, o avanço patológico 

poderá levar a perda do elemento dentário pela deterioração periodontal 

progressiva, cuja inclusive pode dificultar ou comprometer uma reabilitação 

protética posterior (Berglundh, Persson et al. 2002, Schou, Holmstrup et al. 2006, 

Donos, Laurell et al. 2012). 

Apesar do fator determinante para o desenvolvimento da doença 

periodontal ser o microbiológico, a progressão da doença também depende da 

susceptibilidade do hospedeiro, configurando uma interação dinâmica patógeno- 

hospedeiro. A resposta frente ao desafio microbiológico é essencialmente 

protetora, porém a hiper-responsividade ou hiporresponsividade de vias imunes 

especificas podem contribuir significativamente para a destruição tecidual. Por 

exemplo, a atividade de células imunes fagocíticas é bastante importante na 

contenção do avanço microbiológico, de modo que a subatividade ou a 



39 
 

hiperatividade destas células podem causar prejuízos a saúde periodontal 

(Preshaw, Seymour et al. 2004). Ainda deve-se considerar o recrutamento 

crônico de células imunes, característica da resposta inflamatória periodontal, 

devido a permanência do estímulo microbiano. Tanto as células do hospedeiro 

quanto os microrganismo produzem enzimas proteolíticas que mediam a 

desorganização e destruição dos tecidos periodontais (Scott and Krauss 2012). 

Ademais, células imunes residentes e recrutadas e células não imunes 

produzem grande quantidade de mediadores inflamatórios de diferentes 

naturezas, como eicosanoides, vasoativos, quimiocinas (quimiotáticos) e 

citocinas (sinalizadores pleiotrópicos), que orquestram a transição de uma 

resposta imune predominantemente inata, para uma resposta inata/adaptativas, 

na fase crônica, com componentes de resposta celulares (principalmente Th1, no 

início da fase crônica, e Th2 e Th17, fases mais tardias) e humoral (células B). 

Assim, a resposta imune inflamatória torna-se cada vez mais robusta, menos 

autolimitada e incapaz de reestabelecer a homeostasia periodontal (Cekici, 

Kantarci et al. 2014). 

Atualmente, nenhum fator do hospedeiro é especificamente identificado 

como a razão da progressão patológica, mas é bem estabelecido que a resposta 

inflamatória, inicialmente protetora, quando crônicas, frente ao constante desafio 

microbiológico, é significativamente responsável pelo dano periodontal 

progressivo (Cekici, Kantarci et al. 2014, Kulkarni and Kinane 2014). 

 

 

 

 



40 
 

1.2. Aspectos sistêmicos da doença periodontal 

Atualmente, entende-se por “medicina periodontal” como o campo 

dedicado ao estudo da saúde periodontal associada a saúde geral do indivíduo, 

cujo objetivo é evidenciar possíveis correlações que apresentem mecanismos de 

causalidade (Williams and Offenbacher 2000). Apesar da percepção e interesse 

da comunidade científica pela relação entre a saúde oral e sistêmica existir 

desde o início do século XX (Hunter 1900, Hunter 1911, Newman 1996), apenas 

trabalhos científicos surgidos nas últimas décadas apresentando maior rigor 

científicos associado a métodos mais modernos permitiram, de fato, estabelecer 

relações de causalidade e propor mecanismos biológicos plausíveis para as 

observações no âmbito da medicina periodontal (Winning and Linden 2017). 

Dessa forma, recentemente tem crescido o número de trabalhos que 

relacionam a doença periodontal com condições sistêmicas, sendo alguns 

capazes de estabelecer uma relação bidirecional (Kim and Amar 2006), 

principalmente doenças cardiovasculares arterioscleróticas (Yamazaki, Honda et 

al. 2007, Tonetti, Van Dyke et al. 2013), síndromes metabólicas, como diabetes 

(Taylor 2001, Chapple, Genco et al. 2013), complicações gestacionais (Sanz, 

Kornman et al. 2013), e osteoporose (Svedha, Mahendra et al. 2017). Além 

disso, outras condições também já foram relacionadas a doença periodontal, 

como artrite reumatoide, obesidade, doenças respiratórias, disfunções renais, e 

câncer (Linden, Herzberg et al. 2013, Koziel, Mydel et al. 2014, Olsen 2015). 

Mecanismos patológicos já foram propostos para explicar tais relações, 

sendo principalmente: 

a) Mecanismo direto: A progressão da doença com a formação de bolsas 

periodontais eventualmente leva a ulcerações do epitélio de revestimento e 



41 
 

desorganização do tecido conjuntivo adjacente, favorecendo o acesso de 

patógenos, ou componentes e subprodutos microbiológicos patogênicos, à 

circulação sistêmica; como já evidenciado pela identificação de bactérias 

periodontais em trombos no miocárdio infartado (Ohki, Itabashi et al. 2012); e 

b) Mecanismo indireto: Atualmente já é bem estabelecido que a 

inflamação trata-se de um denominador comum para diversas doenças 

sistêmicas crônicas, como complicações cardiovasculares, diabetes e 

obesidade, deste modo, a doença periodontal trata-se de uma fonte crônica para 

um processo inflamatório sistêmico de baixa intensidade (low-grade systemic 

inflammation), como já evidenciado por trabalhos mostrando principalmente o 

aumento dos níveis de proteína C reativa circulantes como um marcador 

(Paraskevas, Huizinga et al. 2008). 

Apesar de ainda serem necessário mais estudos no âmbito 

epidemiológico, clinico e básico, para melhor compreender as respostas 

biológicas, as evidências reunidas até o momento já são suficientes para que a 

doença periodontal seja vista não mais apenas como uma condição oral, mas 

como uma doença de impacto sistêmico. 

 

 

1.3. A hipertensão arterial e sua relação com a doença periodontal 

A hipertensão arterial é uma doença crônica caracteriza pela elevação da 

pressão arterial, e basicamente, pode ser classificada como secundária, quando 

apresenta uma causa definida, sendo as mais comuns desordens hormonais e 

disfunções renais, enquanto a hipertensão primária, também chamada essencial 

ou idiopática, não apresenta causa inicial definida, mas é associada 



42 
 

principalmente a fatores genéticos (hereditariedade) e hábitos de vida 

(sedentarismo, dieta desregrada, estresse entre outros), correspondendo a 

cerca de 90% dos diagnósticos de hipertensão (Carretero and Oparil 2000, 

Poulter, Prabhakaran et al. 2015). Estima-se por estudos sistemáticos que cerca 

de 30% da população mundial seja hipertensa, com maior prevalecia na 

população mais velha, e em países emergentes (Mills, Bundy et al. 2016). 

Epidemiologicamente, é bastante associada a níveis de mortalidade e 

comorbidades, alarmando diversas entidades de saúde pública (Whitworth and 

World Health Organization 2003, Malachias, Souza et al. 2016). 

Desse modo, é bem alta a probabilidade de coexistência da hipertensão 

a outras condições, sendo uma delas a doença periodontal, neste caso, 

principalmente por compartilharem vários fatores de risco, como revisado por 

Lockhart, Bolger et al. (2012). Ambas condições intuitivamente não parecem ter 

relação direta, entretanto evidências têm permitido estabelecer estas 

associações, como por exemplo, o processo inflamatório sistêmico crônico, que 

vem sendo discutido como o principal mecanismo comum entre as duas 

condições (Boos and Lip 2006, Harrison, Guzik et al. 2011, Caillon and Schiffrin 

2016). 

A relevância do componente inflamatório no estabelecimento da 

hipertensão arterial tem sido amplamente estudado nos últimos anos, como 

revisado por muitos autores (Savoia and Schiffrin 2006, Harrison, Guzik et al. 

2011, Harrison, Marvar et al. 2012). Como sugerido por Caillon and Schiffrin 

(2016), a hipertensão aparenta apresentar um “ciclo vicioso inflamatório”, onde 

elementos patofisiológicos, como por exemplo o shear stress e alterações do 

sistema renina-angiotensina, levam a processos inflamatórios que por sua vez 



43 
 

agravam as condição hipertensiva. Diversos trabalhos já mostraram a relação da 

doença com a produção aumentada de citocinas (Mirhafez, Mohebati et al. 

2014), estresse oxidativo (Brock, Butterworth et al. 2004, Bullon, Cordero et al. 

2011), e disfunções endoteliais (Higashi, Goto et al. 2009, Brito, DalBo et al. 

2013). 

Processos imunológicos têm se mostrado mais relevantes e chamado 

mais atenção, não apenas na hipertensão, mas em diversas doenças sistêmicas. 

Como revisado por Harrison, Guzik et al. (2011) pontua diversos mecanismos 

imunológicos possivelmente relacionados a hipertensão, alguns com potencial 

terapêutico, permitindo assim entender melhor as relações da doença 

periodontal e a hipertensão, assim como visar novos avanços terapêuticos. 

Apesar de não haver um consenso sobre relações de causalidade entre a 

hipertensão e a doença periodontal, baseado nas diversas evidências 

apresentadas, várias autores defendem esta hipótese (Leong, Ng et al. 2014, 

Macedo Paizan and Vilela-Martin 2014). 

 

 

1.4. Desordens de perda ósseas e sua relação com a doença periodontal e 

hipertensão arterial 

Assim como os demais sistemas orgânicos, os ossos são suscetíveis a 

desordens homeostáticas e processo patológicos de diferentes naturezas que 

podem levar a perda óssea progressiva, possivelmente resultando em dores, 

limitação de movimentos, maior risco de fraturas, entre outros prejuízos para 

qualidade de vida (Feng and McDonald 2011). 



44 
 

A osteopenia e osteoporose estão entre as desordens ósseas de maior 

prevalência, sendo caracterizadas pela redução da massa óssea e deterioração 

da arquitetura tecidual, aumentando a fragilidade e o risco de fraturas (Nih 

Consensus Development Panel on Osteoporosis Prevention and Therapy 2001). 

O processo patogênico se estabelece a partir de déficits nos ciclos de 

remodelamento ósseo, onde a reabsorção é maior que o de formação óssea, 

havendo alterações na densidade mineral óssea e microarquitetura normal do 

tecido. 

Tratando-se de um distúrbio osteometabólico multifatorial, diferentes 

variáveis afetam o estabelecimento patológico, entre os principais contribuintes 

estão a idade (Beausejour 2007, Kassem and Marie 2011), herança genética (Li, 

Chen et al. 2004), influência hormonal (Vanderschueren, Vandenput et al. 2004, 

Weitzmann and Pacifici 2006), alterações nutricionais (Cashman 2007), 

atividade física (Forwood and Burr 1993, Langsetmo, Hitchcock et al. 2012) e 

alterações no microambiente ósseo, como aumento de espécies reativas de 

oxigênio e mediadores inflamatórios circulantes. 

Nos últimos anos muitos estudos têm demostrado os mecanismos 

relacionados às desordens ósseas induzidas por mediadores inflamatórios 

(Ginaldi, Di Benedetto et al. 2005, Mundy 2007), bem como a associação entre 

doenças inflamatórias sistêmicas e perda óssea, incluindo a doença periodontal 

e hipertensão (Hardy and Cooper 2009, Barbato, Francioni et al. 2015). 

A hipertensão é um fator de risco para as desordens de perda óssea 

(Rodan and Martin 2000, Woo, Kwok et al. 2009). Estudos epidemiológicos e em 

animais têm demonstrado que a alta pressão sanguínea está associada ao 

metabolismo anormal de cálcio, incluindo o aumento na excreção urinária de 



45 
 

cálcio, níveis elevados de hormônio da paratireoide e uma tendência de níveis 

reduzidos de cálcio ionizado no soro (Cappuccio, Kalaitzidis et al. 2000). Esta 

perda de cálcio poderia levar ao aumento do movimento do íon a partir do osso 

e assim, o aumento do risco para osteoporose. As estratégias usadas para o 

manejo da osteoporose incluem moduladores seletivos de estrógenos, terapia 

de reposição hormonal, calcitonina e bisfosfonatos (Rodan and Martin 2000). 

Embora estes protocolos terapêuticos estejam disponíveis e sejam amplamente 

utilizados clinicamente, apresentam limitações terapêuticas, talvez em partes por 

não apresentarem nenhum efeito sobre os componentes inflamatórios. 

Um modelo experimental muito utilizado, que inclui desordens ósseas e 

hipertensão arterial são os SHR (Spontaneously Hypertensive Rats; Ratos 

espontaneamente hipertensos). Desenvolvidos como um modelo genético de 

hipertensão arterial, são bastante similares em muitos aspectos à hipertensão 

arterial essencial humana (Okamoto and Aoki 1963, Yamori 1994). Estes animais 

nascem normotensos com pressão arterial média de 110 mmHg e desenvolvem 

espontaneamente aumento de pressão arterial a partir da 6ª semana de vida, 

podendo alcançar valores próximo a 200 mmHg aos 12 meses de idade, além 

de apresentarem alterações ósseas intrínsecas (Landim de Barros, Brito et al. 

2016). 

Diferentes estudos clínicos e experimentais têm mostrado que a 

hipertensão prejudica a qualidade e densidade de tecidos ósseos (Afghani and 

Johnson 2006, Afghani and Goran 2007). Entre eles, muitos têm mostrado que 

ratos SHR apresentam alterações importantes no metabolismo ósseo, como 

aumento no turnover ósseo e redução na massa óssea cortical e trabecular 

(Inoue, Moriya et al. 1995, Bastos, Brilhante et al. 2010, Manrique, Pereira et al. 



46 
 

2012). Dessa forma, investigar os mecanismos envolvidos no metabolismo 

óssea em ratos SHR com doença periodontal poderá ser uma ferramenta 

importante para entender as causas de uma maior perda óssea nestes animais, 

o que pode levar a inovações terapêuticas. 

 

 

1.5. Mastócitos e sua relação com a hipertensão e a doença periodontal 

Os mastócitos são células residentes do tecido conjuntivo, originados de 

células hematopoiéticas pluripotentes da medula óssea. São células 

relativamente grandes e morfologicamente variam de acordo com a sua 

localização, com aparência fusiforme, poligonal ou oval (Rao and Brown 2008). 

Comumente encontrados nos tecidos subcutâneos e nas mucosas, próximos a 

vasos sanguíneos e nervos. Apresentam núcleos basófilos, levemente 

excêntricos, com à presença de um ou mais nucléolos. Caracterizados por 

apresentar diferentes grânulos metacromáticos, em grande quantidade no 

citoplasma, ricos em mediadores químicos, secretados pelo processo de 

degranulação (da Silva, Jamur et al. 2014). 

Os mastócitos desempenham um papel fundamental na resposta 

inflamatória, no reparo tecidual e na defesa do organismo, envolvidos na 

resposta imune inata e adquirida, produzindo mediadores que atuam na resposta 

celular tipo Th1 e Th2. Quando entram em contato com produtos bacterianos, 

são imediatamente ativadas, liberando grande quantidade mediadores pró-

inflamatórios, como histamina, leucotrienos, fator ativador de plaquetas, fator de 

necrose tumoral, interleucinas e quimiocinas. Em relação ao reparo tecidual, 

atuam induzindo a produção de metaloproteinases de matriz, além disso, são 



47 
 

capazes de fagocitar, processar e fazer apresentação de antígenos (Walsh 2003, 

Krystel-Whittemore, Dileepan et al. 2015). 

Ademais, os mastócitos têm mostrado uma relação direta com doenças 

cardíacas hipertensivas (Shiota, Rysa et al. 2003, Zhang and Shi 2012), 

corroborando com as evidências apresentadas anteriormente a respeito de 

processos imunológicos mais pronunciados relacionados a hipertensão. 

Também deve ser pontuado que além do sistema renina-angiotensina 

tradicional, já extensivamente estudado, têm surgido evidências de sistemas 

renina-angiotensina locais, em diversos tecidos, incluindo o periodonto, com 

funções fisiopatológicas não cardiovasculares, como inflamação e reparo 

tecidual (Paul, Poyan Mehr et al. 2006, Santos, Morandini et al. 2015). Sendo os 

mastócitos a única fonte de renina extra-renal até então conhecida (Silver, Reid 

et al. 2004), possivelmente são capazes de modular esses sistemas, e por 

consequências as respostas teciduais frente a desordens. 

Na doença periodontal, a destruição do periodonto pode estar relacionada 

com as populações de mastócitos residentes e migrantes durante a resposta 

imunológica inflamatória. Carranza and Cabrini (1955) foram os primeiros a 

pesquisarem a presença de mastócitos na doença periodontal em humanos, 

observando-os em grande número nos tecidos periodontais inflamados. Desde 

então, muitos trabalhos relataram o aumento significativo de mastócitos em 

pacientes com gengivite e periodontite crônica, reforçando a hipótese de que 

estas células podem promover a destruição tecidual (Frame and Nixon 1968, 

Barnett 1974, Naesse, Schreurs et al. 2003, Batista, Rodini et al. 2005). Assim, 

supõe-se que os mastócitos possam ter um importante papel na resposta 



48 
 

inflamatória periodontal, no entanto, os mecanismos pelos quais estas células 

contribuir para o prejuízo ósseo são pouco conhecidos. 

Embora exista um vasto conhecimento científico a respeito da patogênese 

da doença periodontal e seus efeitos sistêmicos, o presente trabalho visa 

investigar o papel dos mastócitos sobre o metabolismo ósseo local e sistêmico 

de ratos normotensos e hipertensos com doença periodontal. 

 

 

  



49 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

PROPOSIÇÃO 

 

 

 

 

  



50 
 

2. PROPOSIÇÃO 

 

A grande prevalência da hipertensão e da doença periodontal, além da 

possível coexistência destas patologias, devido fatores de riscos comuns, fazem 

desta situação um relevante problema de saúde pública. Assim, cada vez mais 

estudos são direcionados para a melhor compreensão dos mecanismos 

patogênicos e descoberta de novos alvos terapêuticos, no objetivo de ampliar as 

alternativas de tratamentos, bem como otimizar as terapias já estabelecidas, 

para assim melhorar a qualidade de vida dos indivíduos acometidos. 

A participação dos mastócitos na doença periodontal ainda é pouco 

compreendida, e quando associada a hipertensão, podem haver possíveis 

diferenças na resposta destas células, provavelmente marcada por uma 

resposta inflamatória exacerbada, favorecendo a destruição periodontal, bem 

como os efeitos sistêmicos da doença. Os animis SHR apresentam alterações 

genéticas que resultam no estabelecimento da hipertensão arterial, além de 

apresentarem alterações no metabolismo ósseo e na resposta imune, 

caracterizando um modelo interessante para os objetivos deste trabalho. 

Considerando as informações acima expostas, justificamos as 

investigações propostas no presente trabalho, que analisará o papel dos 

mastócitos sobre o metabolismo ósseo local (mandíbula) e sistêmicos (fêmur) 

em modelo animal normotenso e hipertenso com doença periodontal 

experimentalmente induzida, sob a hipótese de que estas células tenham 

importante papel na severidade e consequências sistêmicas da doença.  



51 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

OBJETIVOS 

 

 

 

 

  



52 
 

3. OBJETIVOS 

 

3.1 Objetivo geral 

Avaliar o papel dos mastócitos sobre o metabolismo ósseo local e 

sistêmico de animais Wistar (normotenso) e SHR (espontaneamente hipertenso) 

com doença periodontal. 

 

3.2 Objetivos específicos 

Para responder a proposição e cumprir nosso objetivo geral, foram 

propostas as seguintes estratégias: 

a) Prévia depleção de mastócitos com agente farmacológico (composto 

48/80); 

b) Estabelecer a doença periodontal por 15 dias no modelo animal 

proposto, por ligadura bilateral nos primeiros molares inferiores; 

c) Identificar a presença de mastócitos no tecido gengival, no modelo 

proposto; 

d) Avaliar a consequências na arquitetura óssea local (osso alveolar) e 

sistêmica (fêmur) da doença periodontal no modelo proposto, por 

microtomografia computadorizada; 

e) Avaliar qualitativamente o tecido ósseo na mandíbula e fêmur no 

modelo proposto, pela expressão gênica de formação óssea (Runx2, Osterix, β-

catenina, osteoprotegerina, proteína morfogenética óssea-2, fosfatase alcalina 

específica do osso; osteocalcina, osteopontina e sialoproteína óssea), 

reabsorção/remodelamento ósseo (fosfatase ácida resistente ao tartarato, Rank, 

Rankl, catepsina K, metaloproteinases da matriz 2 e 9, vitronectina, integrinas e 

molécula co-assessória OSCAR); 



53 
 

f) Avaliar a expressão e produção de mediadores inflamatórios na 

mandíbula e fêmur, no modelo proposto, pelo ensaio de RT-PCR em tempo real 

e ELISA, respectivamente. 

 

  



54 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MATERIAL E MÉTODOS 

 

 

 

 

  



55 
 

4. MATERIAL E MÉTODOS 

 

4.1. Animais e aspectos éticos 

Foram utilizados ratos machos (Rattus novergicus), sendo 40 animais da 

linhagem Wistar e 40 animais da linhagem SHR (Spontaneouly Hypertensive 

Rats), adultos (10 semanas), oriundos do Biotério do Departamento de Ciências 

Básicas, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Unesp. Os animais Wistar 

e SHR foram mantidos em salas separadas, com umidade e temperatura 

controlada (22 ± 1ºC), ciclo claro/escuro (12/12 horas), 3-4 animais por caixa 

plástica forradas com maravalha, consumindo o mesmo tipo de ração (Labina, 

Nestlé, Brasil) e água potável ad libitum. Foram tomadas todas as medidas 

necessárias para utilizar o menor número possível de animais e evitar seu 

sofrimento. Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão Local 

de Ética para Experimentação Animal (Protocolo CEUA/FOA nº 00686-2016), 

cujo certificado encontra-se no Anexo I. 

 

4.2. Tratamento com o composto 48/80 

Para avaliar o papel dos mastócitos no modelo experimental proposto os 

animais foram previamente depletados de mastócitos, a partir do tratamento com 

o composto 48/80 (Sigma-Aldrich; St. Louis, Missouri, USA) (c48/80; agente 

farmacológico indutor da degranulação de mastócitos). O c48/80 foi administrado 

via intraperitoneal, por 4 dias de 12/12 horas, em doses crescentes (1º e 2º dia: 

0,6 mg/kg, 3º dia:1,2 mg/kg; e 4º dia: 2,4 mg/kg), para que no 5º dia fosse 

realizada a indução da doença periodontal. Para comprovar a depleção 

sistêmica dos mastócitos, foi coletado o lavado peritoneal, e lâminas foram 



56 
 

confeccionadas por citocentrifugação e coloradas com Azul de Toluidina, para 

identificação das células. Imagens representativas são mostradas na Figura 1. 

 

 

 

 

 
 
Figura 1 - Fotomicrografia de citocentrifugação do lavado peritoneal corado com 
Azul de Toluidina. Mastócitos observados colorados em roxo intenso. As imagens são 
representativas dos grupos. 

 

 

 

 

 

 



57 
 

4.3. Indução da doença periodontal 

O procedimento para indução da doença periodontal foi baseado na 

adaptação de modelo já caracterizado e aceito na literatura científica, e em nosso 

grupo de trabalho (Bonato, do-Amaral et al. 2012). Os animais foram 

anestesiados pela administração intraperitoneal da associação de hidrocloreto 

de quetamina 80 mg/Kg (Cetamim, Syntec; Hortolândia, São Paulo, Brasil) e 

hidrocloreto de xilazina 10 mg/Kg (Calmium, Agener União; Embu-Guaçu, São 

Paulo, Brasil). Após não apresentarem mais reflexos de dor, os animais foram 

posicionados em mesa odontológica adaptada para roedores, em decúbito 

ventral tendo a boca mantida aberta por retratores apoiados nos dentes incisivos. 

O procedimento seguiu com a inserção bilateral de ligadura submarginal de fio 

de seda (USP 4-0; Diâmetro 0,15 mm) nos primeiros molares inferiores, com 

amarração mesial (Figura 2). Após um período de 15 dias, os animais foram 

submetidos à eutanásia, por overdose de anestésico inalatório (Halotano; 

Tanohalo®, Cristália, Itapina, SP, Brasil), para coleta das amostras (gengivas, 

hemi-mandíbulas e fêmures). Foram utilizados apenas os animais que 

apresentaram a ligadura bilateral, devidamente inserida. 

 

 

 
 

Figura 2 - Fotos realizadas durante a indução da doença periodontal. (A) 
Posicionamento do animal na mesa de procedimento, (B) Posição dos retratores; (C) 
Inserção do fio de seda, e (D) Amarração da ligadura. 



58 
 

4.4. Marcação de mastócitos no tecido gengival 

As gengivas foram fixadas por 24 horas em solução de formaldeído 10% 

tamponado (pH 7.4) e posteriormente lavadas em água correte por 24 horas. O 

tecido foi então desidratado em concentrações crescentes de álcool etílico, 

diafanizados em xilol, infiltrado e emblocado em parafina. As peças foram então 

usadas para microtomia, e as lâminas foram confeccionadas com cortes de 3 µm 

de espessura. As lâminas foram então coradas por solução aquosa de Azul de 

Toluidina 1%, para a identificação de mastócitos no tecido gengival. 

 

4.5. Micro tomografia computadorizada (microCT) 

Analises tridimensionais por microCT na região do primeiro molar das 

hemi-mandíbulas direitas e porção distal dos fêmures direitos foram realizadas 

utilizando um sistema SkyScan 1272 (Bruker microCT; Kontich, Belgium). Os 

espécimes foram posicionados verticalmente no tomógrafo e as imagens foram 

adquiridas (70kVp; 142μA; filtro de alumínio 0.5 mm; voxel isotrópico de 9 µm; 

tempo de exposição de 1100 ms; rotação de 180º, etapa de rotação 0.5º). As 

imagens foram reconstruídas com o software NRecon (v1.6, Bruker microCT), 

alinhadas tridimensionalmente com o software DataViewer (v1.5.1.2, Bruker 

microCT), analisadas com o software CT Analyser (v1.13, Bruker microCT), e 

posteriormente as imagens tridimensionais representativas de cada grupo foram 

feitas com o software CTvox (v3.0, Bruker microCT). 

 

4.5.1. Analise do osso alveolar 

Uma região de interesse (ROI) foi padronizada a partir de pontos 

anatômicos determinados (Limite superior: teto da furca; Limite inferior: 100 



59 
 

fatias a partir do teto (900 µm); Limite distal: raiz proximal do 2º molar; Limite 

proximal: raiz proximal do 1º molar; e Limites vestibular e lingual: limites do osso 

alveolar). Um volume de interesse (VOI) foi delimitado automaticamente, 

utilizando o software de análise, considerando as bordas do osso alveolar na 

região de interesse. Os espaços ocupados pelo dente (cora e raízes) foram 

desconsiderados na análise. Foi considerado a porcentagem de osso (BV/TV), 

número (Tb.N), espessura (Tb.Th) e separação (Tb.Sp) de trabéculas (Bouxsein, 

Boyd et al. 2010). 

 

4.5.2. Analise do porção distal do fêmur 

Duas regiões de interesse (ROI) foram padronizadas, para o osso 

trabecular (Limite superior: 150 fatias abaixo da placa de crescimento; Limite 

inferior: 100 fatias a partir do limite superior (900 µm)), e para o osso cortical 

(Limite superior: ausência de osso trabecular; Limite inferior: 100 fatias abaixo 

do limite superior (900 µm)). Os volumes de interesse (VOI) foram delimitado 

automaticamente, utilizando o software de análise, para o osso trabecular 

(Limites da borda interna do córtex medular) e cortical (limites dos osso cortical). 

Na porção trabecular foi analisado a porcentagem de osso (Tb.BV/TV), SMI 

(Tb.SMI), número de trabécula (Tb.N), espessura de trabécula (Tb.Th) e 

separação de trabécula (Tb.Sp), e na porção cortical foi avaliado a espessura da 

cortical (Co.Th) e porcentagem de porosidade cortical (Co.Po) (Bouxsein, Boyd 

et al. 2010). 

 

 

 



60 
 

4.6. Dosagem de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) e quimiocinas (CXCL3/CINC-

2 e CCL20/MIP-3α) na mandíbula e fêmur 

 

4.6.1. Extração das amostras 

Foi utilizada a porção da mandíbula referente aos dentes molares (corpo 

da mandíbula) e a porção distal do fêmur. O tecido foi macerado em nitrogênio 

líquido e posteriormente homogeneizado com tampão de lise (Tris 100 mM, NaCl 

150 mM, Tween 20 1%, deoxicolato de sódio 0.5% e coquetel inibidor de 

proteases cOmplete™/Sigma, pH 7.4), na proporção de ±100 µg de tecido/800 

µL de tampão em um homogeneizador de tecidos (Omni TH, Omni International; 

Tulsa, Oklahoma, EUA). As amostras foram então centrifugadas (16000 RCF, 20 

minutos, 4 ºC), o sobrenadante coletado e o conteúdo de proteínas totais foi 

determinado pelo método de Lowry (Lowry, Rosebrough et al. 1951). 

 

4.6.2. Ensaio ELISA sandwich (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 

Para quantificação das citocinas Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α), 

Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-10 (IL-10), e quimiocinas CXCL3/CINC-2 e 

CCL20/MIP-3α, foi utilizada a técnica ELISA sandwich, brevemente descrita a 

seguir. 

Primeiramente, microplacas (96 poços) foram incubadas com os 

respectivos anticorpos de captura diluídos em PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, 

KHPO4 2 mM, e Na2HPO4 8 mM) (16 horas, 4ºC) (R&D systems, Minneapolis, 

Minnesota, EUA). As placas foram lavadas com solução de lavagem (PBS, 

Tween 20 1%) e bloqueadas com solução de albumina sérica bovina 1% (ASB 

1% em PBS) (1 hora, temperatura ambiente). Em seguida, as placas foram 



61 
 

novamente lavadas, e foram incubadas as respectivas curvas padrões (4000-

31.25 pg/mL, diluição seriada de 2x em ASB 1%) e as amostras (3 horas, 

temperatura ambiente). As placas foram novamente lavadas e incubadas com 

os respectivos anticorpos biotinilados (1 hora, temperatura ambiente). 

Posteriormente as placas foram lavadas e incubadas com avidina conjugada a 

peroxidase (ExtrAvidin®−Peroxidase, Sigma) (30 minutos, temperatura 

ambiente, no escuro). As placas foram então lavadas e incubadas com o 

substrato cromogênico (solução de TMB, 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) (30 

minutos, temperatura ambiente, no escuro). Ao final, a reação de cor foi 

interrompida com ácido sulfúrico 1 N, as absorbâncias foram determinadas em 

450 nm, as concentrações dos alvos nas amostras foram determinados em 

relação a curva padrão e depois normalizados pelo respectivo conteúdo de 

proteínas totais. Os anticorpos utilizados encontram-se listados na Tabela 1. 

 

 

Tabela 1. Relação dos anticorpos utilizados (R&D systems) 

Alvo Anticorpo de captura Proteína recombinante Anticorpo biotinilado 

TNF-α MAB510 510-RT BAF510 

IL-10 MAB519 522-RL BAF519 

IL-6 MAB506 506-RL BAF506 

CXCL3 MAB516 516-CA BAF516 

CCL20 MAB540 540-RM BAF540 

 

 

 

 

 

 



62 
 

4.7. Análise da expressão gênica de marcadores ósseos 

 

3.7.1. Coleta das amostras 

A coleta das amostras destinadas a referida analise foi realizada com 

técnica asséptica, em campo e material cirúrgico limpo com o reagente de 

descontaminação RNAse AwayTM (InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific; 

Carlsbad, CA, USA) e tubos com especificação PCR clean (livre de 

DNase/RNase). As amostras de hemi-mandíbula foram cortadas nas regiões de 

interesse (região do molares, corpo da mandíbula, ±100 mg de tecido) e os 

tecidos moles adjacentes foram removidos. Os fêmures cortados e a porção 

distal foi utilizada, sendo a medula lavada com água tratada com pirocarbonato 

de dietila (água-DEPC). Os tecidos foram imediatamente congelados em 

nitrogênio e armazenados a -80 °C, até a realização das seguintes etapas. 

 

4.7.2. Extração e quantificação do RNA total  

A extração de RNA total foi realizada com reagente Trizol LS 

(InvitrogenTM), com protocolo adaptado a partir do recomendado pelo fabricante. 

As amostras de tecido (corpo da mandíbula e fêmur distal) foram pulverizadas 

com gral e pistilo, em nitrogênio líquido, posteriormente foi adicionado ao pó 3 

mL do reagente Trizol LS, para homogeneização com o tecido. O homogenato 

foi transferido para um tubo de 2 mL e centrifugado para clarificação da amostra 

de partículas de osso não homogeneizadas (14000 RCF, 20 minutos; 4 °C). O 

volume de 1 mL do sobrenadante foi transferido para um tubo limpo, ao qual foi 

adicionado 300 µL de clorofórmio, seguido de vigorosa homogeneização em 

agitador vórtex (2800 rpm; 20 segundos) e incubados por 10 minutos a 



63 
 

temperatura ambiente. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas (13000 

RCF; 15 minutos; 4 °C) e a fases aquosa foi coletada (400 µL) em um tubos 

limpos. Aos tubos, foi adicionado mais 1 mL de Trizol LS e 300 µL de clorofórmio. 

Os tubos foram vigorosamente agitados e incubados em temperatura ambiente 

por 5 minutos. As amostras foram centrifugadas (13000 RCF; 15 minutos; 4 °C) 

e a fase aquosa foi novamente coletada (400 µL) em um tubos limpos. 

Para precipitação do RNA foi adicionados 500 μL isopropanol, e as 

amostras foram mantidas a -20 °C por 2 horas. Os tubos foram então 

centrifugados (13000 RCF; 15 minutos; 4ºC), o pellet foi lavado em etanol 75% 

e novamente centrifugado (10000 RCF;10 minutos; 4ºC), o sobrenadante foi 

descartado e o residual de solução foi evaporado com o tubo invertido. O 

precipitado foi diluído em 30 μL de água-DEPC e as amostras foram 

armazenadas a -80 °C, até os procedimentos seguintes. 

A quantificação do RNA total foi realizada por fluorometria com o Quant-

iT™ RiboGreenTM RNA Assay Kit (InvitrogenTM) em equipamento Nanodrop 4000 

(Thermo Fisher Scientific), seguindo as recomendações do fabricante. Além 

disso, a pureza das amostras foi avaliada por espectrofotometria com leituras 

nos comprimentos de onda de 260 nm (para ácidos nucleicos), 280 nm (para 

proteínas) e 230 nm (para fenol), considerando as razões 260/280 (satisfatória 

entre 1.8 - 2.0) e 260/230 (satisfatório entre 2.0 – 2.2). Posteriormente, com o 

propósito de eliminar possível contaminação por DNA genômico, anteriormente 

a transcrição reversa, as amostras foram tratadas com kit DNAse I (Sigma-

Aldrich), seguindo as recomendações do fabricante. 

 



64 
 

4.7.3 Síntese do DNA complementar e reação em cadeia da polimerase em 

tempo real 

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 μg de RNA total, 

por reação de transcrição reversa, utilizando o High Capacity Kit RNA-to-cDNA 

(Applied BiosystemsTM, Themo Fisher Scientific), seguindo as recomendações 

do fabricante. A quantificação comparativa da expressão dos diferentes alvos foi 

realizada por reações em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) 

aparelho StepOne™ Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientifics). Para 

as reações, foi utilizado o sistema TaqMan (TaqManTM Gene Expression Assays, 

Applied BiosystemsTM), com sonda conjugada a fluoróforo FAM® e extintor MGB 

(FAM fluorophore reporter / non fluorescente quencher MGB), seguindo as 

instruções do fabricante, para os alvos descritos na Tabela 2. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



65 
 

Tabela 2 - Relação dos ensaios TaqManTM utilizados 

Fatores de transcrição 

Runx2  Runt-related transcription factor 2 Rn01512298_m1 

Osx/Sp7 Osterix/Sp7 transcription factor Rn02769744_s1 

Catnb β-catenin/cadherin associated protein beta 1 Rn00584431_g1 

Marcadores de formação óssea 

Alp Bone alkaline phosphatase Rn01516028_m1 

Col1a1 Collagen type I alpha 1 Rn01463848_m1 

Opn/Spp1 Osteopontina / secreted phosphoprotein 1 Rn00681031_m1 

Ocn/Bglap Osteocalcin / bone gamma-carboxyglutamate protein Rn00566386_g1 

Bsp/Ibsp Bone sialoprotein / integrin-binding sialoprotein Rn00561414_m1 

Bmp2 Bone morphogenetic protein 2 Rn00567818_m1 

Marcadores de reabsorção / Remodelamento ósseo 

Opg Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11b Rn00563499_m1 

Rankl Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Rn00589289_m1 

Rank Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a Rn04340164_m1 

Trap/Acp5 Acid phosphatase 5, tartrate resistant Rn00569608_m1 

Mmp2 Matrix metalloproteinase 2 Rn01538170_m1 

Mmp9 Matrix metalloproteinase 9 Rn00579162_m1 

Ctsk Cathepsin K Rn00580723_m1 

Oscar Osteoclast associated immunoglobulin-like receptor Rn01530958_m1 

Vtn Vitronectin Rn01466920_g1 

Itgav Integrin, alpha V Rn01485633_m1 

Itgb5 Integrin, beta 5 Rn01439348_m1 

Citocinas  

Il1b Interleukin 1 beta Rn00580432_m1 

Tnfa Tumor necrosis factor alpha Rn99999017_m1 

Il6 Interleukin 6 Rn01410330_m1 

Gene constitutivo (Housekeeping gene) 

Actb Beta actin Rn00667869_m1 

 



66 
 

Para eleição da diluição do cDNA melhor eficiência de reação, foram 

realizadas diluições seriadas de um pool de cDNA das amostras (1:2, 1:4; 1:8; 

1:16, e 1:32). Os ensaios foram então conduzidos as amostras nas diluições de 

1:8 ou 1:4 com reagentes Taqman® Gene Expression Master Mix (Applied 

BiosystemsTM) e ensaio inventoriado, seguindo as etapas de reação como 

determinado pelo fabricante (Passo 1: 2 minutos a 50 °C; Passo 2: 10 minutos a 

95 °C; e Passo 3: 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 1 minutos e 60 °C). Uma 

reação negativa (água) foi feita para cada um dos ensaios, como controle 

negativo. 

 

4.7.4 Analise dos dados de expressão gênica 

Os níveis de expressão dos genes alvo foi determinada por método de Ct 

comparativo, com a equação Quantificação Relativa (RQ) = 2-ΔΔCt (Livak and 

Schmittgen 2001). De maneira breve, para o cálculo do RQ de cada amostra, foi 

utilizado o valor de Ct (cycle threshold ou ciclo limiar) do gene alvo e constitutivo 

(Actb). O valor do Ct do gene alvo foi subtraído do valor do Ct do gene 

constitutivo, resultando no valor de ΔCt; que por sua vez foi subtraído do valor 

do ΔCt do calibrador (grupo referência, Wistar Controle), para resultar no valor 

de ΔΔCt. Este valor foi utilizado na fórmula do RQ, onde o número 2 representa 

a somatória da eficiência do gene alvo e do constitutivo (Livak and Schmittgen 

2001). 

 

 

 

 



67 
 

4.8. Análise estatística 

A normalidade e a homocedasticidade dos dados foram avaliados pelos 

testes de Shapiro-Wilk, e a partir destes resultados, foi aplicado teste 

paramétrico, análise de variância de um fator (one-way ANOVA), seguido de 

teste post hoc de Sidak, incluindo as comparações Controle vs DP, DP vs 

48/80+DP, e Wistar vs SHR nas mesmas condições experimentais. 

Os gráficos representam os dados como a média e o erro padrão da média 

(SEM, standard error of the mean) Os níveis de significância são indicados pelo 

valor ajustado de p, como * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001), e **** (p<0.0001). 

As analises foram realizadas no software estatístico Graph Pad Prism v7.0 

(GraphPad Software Inc.; San Diego, Califórnia, USA). 

 

  



68 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RESULTADOS 

 

 

 

 

  



69 
 

5. RESULTADOS 

 

5.1. Mastócitos são mais frequentes na gengiva de animais com doença 

periodontal 

 

Inicialmente, identificamos a presença de mastócitos no tecido gengival, 

pela coloração com Azul de Toluidina. Nos grupos Wistar e SHR controle (WC e 

SC) foram observados raros mastócitos, entretanto, nos grupos com doença 

periodontal (WDP e SPD), a frequência destas células foi maior, como é possível 

visualizar na Figura 3-1 B,b e Figura 3-2 E,e (mastócitos apontados pelas setas). 

Em contrapartida, como esperado, nos grupos depletados de mastócitos, pelo 

tratados prévio com composto 48/80, estas células foram muito menos 

numerosas. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



70 
 

 

 

 

Figura 3-1. Fotomicrografia do tecido gengival, corado com Azul de Toluidina. (A,a) Wistar 

controle, (B,b) Wistar com doença periodontal, e (C,c) Wistar com doença periodontal 

previamente depletado de mastócitos. A figura mostra imagens representativas (n=4), com 

tratamento de contraste. Setas prestas identificam os mastócitos, corados em roxo.  



71 
 

 

 

 

Figura 3-2. Fotomicrografia do tecido gengival, corado com Azul de Toluidina. (D,d) SHR 

controle, (E,e) SHR com doença periodontal, e (F,f) SHR com doença periodontal previamente 

depletado de mastócitos. A figura mostra imagens representativas (n=4), com tratamento de 

contraste. Setas prestas identificam os mastócitos, corados em roxo.  



72 
 

5.2. A depleção de mastócitos previne a perda óssea alveolar induzida pela 

doença periodontal, principalmente em SHR 

 

Primeiramente, analisamos a perda óssea alveolar e os parâmetros de 

arquitetura óssea por micro tomografia computadorizada (microCT) em 

mandíbulas de Wistar e SHR com 15 dias de doença periodontal, depletados ou 

não de mastócitos. 

Os grupos WC e SC apresentaram parâmetros similares de porcentagem 

e arquitetura óssea (%BV/TV, Tb.N, Tb.Th e Tb.Sp). Por outro lado, os grupos 

Wistar e SHR com doença periodontal (WPD e SPD) apresentaram perda óssea 

significativa, observada pela menor porcentagem de volume ósseo, em relação 

aos respectivos controles (p<0.05 e p<0.001, respectivamente), o que foi mais 

significativo nos animais SHR (p<0.01). No entanto, a DP não alterou 

significativamente o número, espessura e espaçamento trabecular (Tb.N, Tb.Th 

e Tb.Sp) (Figura 4B, C e D). 

De maneira interessante, depleção prévia de mastócitos reduziu a perda 

óssea alveolar induzida pela DP nos animais Wistar (5%, p=0.550) e, mais 

significativamente em SHR (10%, p<0.01), enquanto a arquitetura trabecular não 

foi significativamente alterada. 

 

 

 

 

 

 



73 
 

 

 

 

 

 

Figura 4 - Análise de microCT do osso alveolar de animais Wistar e SHR com 
doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. (A) Porcentagem 
óssea, (B) Número de trabéculas, (C) Espessura de trabéculas, (D) Separação de 
trabéculas. Gráficos representam a média ± erro padrão da média (n=5). Diferenças 
estatísticas expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



74 
 

 
 
Figura 5 - Reconstrução tridimensional da mandíbula (região do primeiro molar) 
de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. 
Imagens representativas dos grupos (A) WC, (B) WDP, (C) W48/80, (D) SC, (E) SDP, e 
(F) S48/80.   



75 
 

5.3. A depleção de mastócitos reduz a expressão de citocinas induzida pela 

doença periodontal em SHR 

 

Ademais, avaliamos também a expressão gênica das citocinas IL1b, Tnfa 

e IL6, em mandíbula, nas condições experimentais propostas. 

Em reação aos grupos controle, não houveram diferenças constitutivas na 

expressão das citocinas analisadas, entretendo nos grupos com DP, foram 

observadas diferenças significativas. O grupo WPD apresentou maior expressão 

de Tnfa (p<0.05) e IL6 (p<0.05), comparada a WC. Nos animais SHR, o grupo 

SDP apresentou maior expressão de todos as citocinas analisadas IL1b 

(p<0.001), Tnfa (p<0.01), e IL6 (p<0.01), em relação a SC, além de maior 

expressão de IL1b (p<0.05) e IL6 (p<0.05), comparado a WDP. 

A depleção de mastócitos nos grupo W48/80 não levou a alterações 

significativas, mas nos grupo S48/80 houve redução significativa da expressão 

de IL1b (p<0.05) e IL6 (p<0.05), em relação a SPD. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



76 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6 - Expressão gênica das citocinas (A) IL1b, (B) Tnfa e (C) IL6 em mandíbula 
de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. 
Gráficos representam a média ± erro padrão da média (n=6). Diferenças estatísticas 
expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



77 
 

5.4. A depleção de mastócitos reduz a produção de mediadores 

inflamatórios na mandíbula, principalmente SHR 

 

No intuído de corroborar com os dados de expressão gênica, 

quantificamos a produção das citocinas TNF-α, IL-6, IL-10, e quimiocinas 

CXCL3/CINC-2 e CCL20/MIP-3α, em mandíbula, nas condições experimentais 

propostas. Em relação as diferenças constitutivas entre os grupos controle, SC 

apresentou maior produção de IL-6 (p<0.01), CXCL3 (p<0.05) e CCL20 (p<0.01), 

em relação a WC. 

A doença periodontal levou a maior produção de todos os alvos 

analisados em ambas linhagem, em relação aos respectivos controles, exceto 

pela quimiocinas CCL20, sendo os aumentos de TNF-α, IL-6 e CXCL3 maiores 

no grupo SDP, comparado a WPD. A depleção de mastócitos levou a menor 

produção de IL-6 (p<0.05), e CXCL3 (p<0.01) no grupo W48/80, em relação ao 

WDP, já no grupo S48/80 houve redução da produção TNF-α (p<0.001), IL-6 

(p<0.05), e CXCL3 (p<0.001). A produção de IL-10 e CCL20 não foi alterada pela 

depleção de mastócitos. 

 

 

 

 

 

 

 

 



78 
 

 

 

 

 

Figura 7 - Produção das citocinas (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-10 e das quimiocinas 
(D) CXCL3/CINC-2 e (E) CCL20/MIP-3 α em mandíbula de Wistar e SHR com doença 
periodontal, previamente depletados de mastócitos. Gráficos representam a média 
± erro padrão da média (n=6). Diferenças estatísticas expressas por * (p<0.05), ** 
(p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



79 
 

5.5. Depleção de mastócitos reduz a expressão de Runx2 e Catnb em 

mandíbulas de SHR com doença periodontal 

 

Com objetivo de avaliar o papel local dos mastócitos nas expressão 

gênica de marcadores de formação óssea, primeiramente analisamos três 

importantes fatores de transcrição, Runx2, Osx e Catnb, em mandíbula, no 

modelo experimental proposto. Em relação as diferenças constitutivas entre as 

linhagens Wistar e SHR, SC apresentou menor expressão de Runx2 (p<0.01), 

enquanto a expressão de Osx e Catnb foram similares. 

O grupo WDP não apresentou alterações significativas na expressão dos 

fatores de transcrição analisados, comparado a WC, entretanto, a depleção 

prévia de mastócitos reduziu a expressão Catnb (p<0.05), comparado a WPD. 

No grupo SPD houve um aumento significativo da expressão de Catnb 

(p<0.05), comparado a WC, e a depleção prévia de mastócitos levou a redução 

significativa de Runx2 (p<0.05) e Catnb (p<0.0001), comparado a SPD. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



80 
 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
Figura 8 - Expressão gênica dos fatores de transcrição (A) Runx2, (B) Osx e (C) 
Catnb em mandíbula de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente 
depletados de mastócitos. Gráficos representam a média ± erro padrão da média 
(n=6). Diferenças estatísticas expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** 
(p<0.0001).  



81 
 

5.6. Depleção de mastócitos previne o aumento da expressão de Opn 

induzida por doença periodontal em mandíbula 

 

Posteriormente, avaliamos a expressão gênica de Alp, Col1a1, Opn, Ocn, 

Bsp, e Bmp2, em mandíbula, no modelo experimental proposto. O grupo SC 

apresentou expressão reduzida de Opn e Bmp2 (p<0.05 e p<0.01, 

respectivamente), comparados ao grupo WC, enquanto a expressão dos demais 

alvos avaliados mostrou-se semelhante. 

A doença periodontal nos animais Wistar levou a redução da expressão 

de Alp (p<0.0001) e aumento de Opn (p<0.05), enquanto a depleção prévia de 

mastócitos foi capaz de reduzir a expressão de Opn (p<0.01), comparado ao 

grupo WPD. 

Nos animais SHR, a doença periodontal causou redução da expressão de 

Alp (p<0.001) e aumento de Opn (p<0.01), similar ao grupo WPD. A depleção 

prévia de mastócitos também preveniu o aumento de Opg (p<0.05), e além disso, 

levou a redução da expressão de Col1a1 (p<0.05) e Bmp2 (p<0.05). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



82 
 

 

 

 

 
 
Figura 9 - Expressão gênica dos marcadores de formação óssea (A) Alp, (B) 
Col1a1, (C) Opn, (D) Ocn, (E) Bsp, e (F) Bmp2 em mandíbula de Wistar e SHR com 
doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. Gráficos representam 
a média ± erro padrão da média (n=6). Diferenças estatísticas expressas por * (p<0.05), 
** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



83 
 

5.7. Depleção de mastócitos previne as alterações no eixo Opg/Rankl/Rank 

induzidas por doença periodontal na mandíbula de Wistar e SHR 

 

Avaliamos também a expressão dos componentes do eixo 

Opg/Rankl/Rank. Nosso resultados evidenciaram que a expressão de Opg no 

grupo SC foi constitutivamente menor (p<0.001), comparado a WC, enquanto a 

expressão de Rankl e Rank foi similar. 

No grupo WDP houve redução da expressão de Opg (p<0.01), e aumento 

de Rankl (p<0.0001) e Rank (p<0.05), comparado a WC, e a depleção prévia de 

mastócitos reduziu a expressão de Opg (p<0.05), Rankl (p<0.001) e Rank 

(p<0.01), comparado a WPD. 

No grupo SDP houve aumentou da expressão de todos os alvos Opg 

(p<0.0001), Rankl (p<0.0001) e Rank (p<0.01), comparado a SC, e a depleção 

de mastócitos preveniu estas alterações, visto que foram observadas reduções 

da expressão de Opg (p<0.0001), Rank (p<0.0001) e Rank (p<0.0001), 

comparado a SPD. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



84 
 

 

 

 

 

 

 

 
 
Figura 10 - Expressão gênica de marcadores de remodelação óssea (A) Opg, (B) 
Rankl e (C) Rank em mandíbula de Wistar e SHR com doença periodontal, 
previamente depletados de mastócitos. Gráficos representam a média ± erro padrão 
da média (n=6). Diferenças estatísticas expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), 
***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



85 
 

5.8. Depleção prévia de mastócitos previne as alterações em marcadores 

de reabsorção óssea em mandíbula de Wistar e SHR com doença 

periodontal 

 

Nosso próximo passo foi avaliar os marcadores de reabsorção óssea 

Trap, Mmp2, Mmp9, Ctsk, Oscar, Vtn, Itga5, e Itgb5, buscando compreender os 

mecanismos envolvidos na resposta observada. O grupo SC apresentou 

constitutivamente maior expressão de Trap (p<0.0001), Mmp9 (p<0.01), Mmp2 

(p<0.0001), e Oscar (p<0.01), comparado a WC. 

Em relação ao grupo WDP, houve um aumento significativo da expressão 

de todos os marcadores avaliados, exceto por Vtn, e a depleção prévia de 

mastócitos foi capaz de reduzir a expressão de Trap, Mmp2, Itga5 e Itgb5, e Vtn, 

comparado a WPD. 

No grupo SDP, houve aumento significativo da expressão de todos os 

marcados avaliados, exceto por Mmp2, e a depleção prévia de mastócitos foi 

capaz diminuir esta resposta para Trap, Ctsk, Vtn, Itga5, e Itgb5. A expressão de 

Mmp2 manteve-se sem alterações, semelhante a SC, e a expressão de Oscar 

manteve-se aumentada, similar a SDP. 

 



86 
 

 
 
Figura 11 - Expressão gênica dos marcadores de reabsorção óssea (A) Trap, (B) 
Mmp2, (C) Mmp9, (D) Ctsk, (E) Oscar, (F) Vtn, (G) Itga5, e (H) Itgb5 em mandíbula 
de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. 
Gráficos representam a média ± erro padrão da média (n=6). Diferenças estatísticas 
expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



87 
 

5.9. Doença periodontal não altera a arquitetura óssea do fêmur de Wistar 

e SHR 

 

Posteriormente, no intuito de avaliar os efeitos da doença periodontal e da 

depleção prévia de mastócitos sobre o metabolismo ósseo sistêmico, avaliamos 

a arquitetura óssea na porção proximal do fêmur, no modelo experimental 

proposto. Nossos resultados não evidenciaram diferenças significativas entre os 

grupos WC e SC, exceto pela porosidade cortical, que foi aumentada nos 

animais SHR (p<0.05). 

Em relação a doença periodontal, não observamos alterações nos 

parâmetros analisados, em relação aos grupos controle, entretanto o grupo SDP 

apresentou menor porcentagem óssea trabecular (Tb.BV/TV), quando 

comparado ao grupo WDP (p<0.05). Da mesma forma, a depleção prévia de 

mastócitos não alterou o perfil de resposta de maneira significativa, entretanto, 

o grupo S48/80 apresentou maior porcentagem de porosidade cortical, em 

relação ao grupo W48/80 (p<0.05). 

 



88 
 

 
 
Figura 12 - Análise de microCT do fêmur distal de Wistar e SHR com doença 
periodontal, previamente depletados de mastócitos. (A) Porcentagem óssea 
trabecular, (B) SMI trabecular, (C) Número de trabéculas, (D) Espessura de trabéculas, 
(E) Separação de trabéculas, (F) Espessura cortical, e (G) Porcentagem de porosidade 
cortical Gráficos representam a média ± erro padrão da média (n=5). Diferenças 
estatísticas expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



89 
 

 
 
Figura 13 - Reconstrução tridimensional do fêmur (região distal) de Wistar e SHR 
com doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. Imagens 
representativas dos grupos (A) WC, (B) WDP, (C) W48/80, (D) SC, (E) SDP, e (F) 
S48/80.  



90 
 

5.10. Expressão e produção de citocinas no fêmur 

 

Não foi possível a quantificação dos mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-

6, IL-10, CXCL3, e CCL20) pelo ensaio de ELISA, bem como a quantificação 

relativa da expressão de Tnfa, Il6 e Il10, visto que os analitos nas amostras 

encontrava-se abaixo dos limites de detecção dos ensaios propostos. 

 

  



91 
 

5.11. Depleção de mastócitos reduziu a expressão de fatores de transcrição 

no fêmur de animais com doença periodontal 

 

Apesar de não termos observado diferenças na arquitetura óssea do 

fêmur, no modelo experimental proposto, decidimos avaliar a expressão gênica 

de marcadores ósseos, no intuito de evidenciar possíveis alterações induzidas 

pela doença periodontal, bem como o efeito da depleção dos mastócitos. 

Portanto, primeiramente avaliamos a expressão dos fatores de transcrição 

Runx2, Osx e Ctnb. Não foram observadas diferenças constitutivas significativas 

entre WC e SC, entretanto, a doença periodontal, no grupo WDP, observou-se 

aumento da expressão de Runx2 (p <0,001), em relação a WC, e a depleção 

prévia de mastócitos foi capaz de reduzir esta resposta (p<0.05). 

Por outro lado, no grupo SDP, não foram observadas diferenças 

significativas, como observado em WDP, porém a depleção prévia de mastócitos 

foi capaz de reduziu a expressão de Runx2 (p<0.001), Osx (p<0.0001) e Catnb 

(p <0.0001), de maneira mais significativa que o observado em W48/80. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



92 
 

 

 

 

 

 

 

 
 
Figura 14 - Expressão gênica dos fatores de transcrição (A) Runx2, (B) Osx e (C) 
Catnb no fêmur de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente depletados 
de mastócitos. Gráficos representam a média ± erro padrão da média (n=6). Diferenças 
estatísticas expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



93 
 

5.12. O aumento da expressão de marcadores de formação óssea no fêmur, 

induzido pela doença periodontal, tem participação dos mastócitos 

 

Na sequência, avaliamos a expressão dos marcadores de formação 

óssea no fêmur no modelo proposto. Em relação as diferenças constitutivas entre 

Wistar e SHR, o grupo SC apresentou menor expressão de Alp (p<0.05) e 

Col1a1 (p <0.001), em relação a WC. 

Em relação aos efeitos da doença periodontal, no grupo WDP 

observamos maior expressão de Col1a1 (p<0.01), Opn (p<0.0001), Ocn 

(p<0.001) e Bsp (p<0,01), em relação a WC, e a depleção prévia de mastócitos 

foi capaz de reduzir significativamente a expressão de Opn (p<0.001), em 

relação a WDP. 

No grupo SDP, observamos apenas aumenta da expressão de Opn 

(p<0.05), entretanto a depleção prévia de mastócitos levou redução da 

expressão de Alp (p <0.0001) e Opn (p<0,0001), de maneira mais significativa 

que o observado no grupo W48/80. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



94 
 

 

 

 

 
 
Figura 15 - Expressão gênica dos marcadores de formação óssea (A) Alp, (B) 
Col1a1, (C) Opn, (D) Ocn, (E) Bsp, e (F) Bmp2 no fêmur de Wistar e SHR com 
doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. Gráficos representam 
a média ± erro padrão da média (n=6). Diferenças estatísticas expressas por * (p<0.05), 
** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



95 
 

5.13. O aumento da expressão de Opg/Rankl/Rank no fêmur, induzido pela 

doença periodontal, tem participação dos mastócitos 

 

No passo seguinte, avaliamos a expressão gênica do eixo 

Opg/Rankl/Rank em fêmur no modelo experimental proposto. Wistar e SHR não 

apresentaram diferenças constitutivas. Em Wistar, a doença periodontal levou a 

expressão aumentada de Opg (p<0,01), Rankl (p<0,05) e Rank (p<0,05), e a 

depleção de mastócitos reduziu significativamente todos os alvos. No SHR, a 

doença periodontal aumentou a expressão de Rankl (p<0.01), enquanto a 

depleção de mastócitos foi capaz de diminuir a expressão de Opg (p<0.001), 

Rankl (p<0.001) e Rank (p<0,05). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



96 
 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
Figura 16 - Expressão gênica de marcadores de remodelação óssea (A) Opg, (B) 
Rankl e (C) Rank no fêmur de Wistar e SHR com doença periodontal, previamente 
depletados de mastócitos. Gráficos representam a média ± erro padrão da média 
(n=6). Diferenças estatísticas expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** 
(p<0.0001).  



97 
 

5.14. O aumento da expressão dos marcadores de reabsorção óssea, 

induzido pela doença periodontal, tem participação dos mastócitos 

 

Finalmente, avaliamos a expressão de marcadores de reabsorção óssea 

em fêmur, no modelo experimental proposto. Em relação as diferenças 

constitutivas entre Wistar e SHR, o grupo SC apresentou maior expressão de 

Mmp9 (p<0.05) e Vtn (p <0.0001), em relação a WC. 

Em relação a doença periodontal nos animais Wistar, o grupo WDP 

apresentou maior expressão de Trap (p<0.01), Mmp2 (p<0.001), Mmp9 (p<0.01), 

Ctsk (p<0.05), Itga5 (p<0.0001) e Itgb5 (p<0.001), em relação a WC, e a 

depleção prévia de mastócitos reduziu a expressão de Vtn (p<0.05), Itga5 

(p<0.0001) e Itgb5 (p <0.0001), em relação a WPD. 

No grupo SDP houve aumento de Trap (p<0.001), Mmp9 (p<0.01), Oscar 

(p<0.05) e Itgb5 (p<0.05), em relação a SC, enquanto a depleção prévia de 

mastócitos foi capaz de reduzir significativamente a expressão de Trap (p<0.01), 

Mmp2 (p<0.0001), Mmp9 (p<0.01), Vtn (p<0.0001), Itga5 (p<0.001) e Itgb5 

(p<0.0001), um perfil diferente ao do observado no grupos W48/80. 

 



98 
 

 
 
Figura 17 - Expressão gênica dos marcadores de reabsorção óssea (A) Trap, (B) 
Mmp2, (C) Mmp9, (D) Ctsk, (E) Oscar, (F) Vtn, (G) Itga5, e (H) Itgb5 no fêmur de 
Wistar e SHR com doença periodontal, previamente depletados de mastócitos. 
Gráficos representam a média ± erro padrão da média (n=6). Diferenças estatísticas 
expressas por * (p<0.05), ** (p<0.01), ***(p<0.001) e **** (p<0.0001).  



99 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DISCUSSÃO 

 

 

 

 

  



100 
 

6. DISCUSSÃO 

 

O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da depleção de 

mastócitos, sobre o metabolismo ósseo local, na mandíbula, e sistêmico, no 

fêmur, de animais normotensos (Wistar) e espontaneamente hipertensos (SHR), 

submetidos a doença periodontal. Nossos resultados sugerem um importante 

papel dos mastócitos na destruição óssea alveolar de ratos com doença 

periodontal, especialmente no modelo hipertenso, evidenciado principalmente 

pela modulação da expressão gênica de marcadores da osteoclastogênese na 

mandíbula e fêmur, e a produção de mediadores inflamatórios na mandíbula. 

Primeiramente, avaliamos a presença de mastócitos no tecido gengival 

dos grupos experimentais, observando maior frequência destas células nos 

grupos com doença periodontal. Corroborando com nossos resultados, trabalhos 

já haviam associado um aumento do número mastócitos no tecido gengival com 

a severidade da doença periodontal em humanos, reforçando a ideia de uma 

importante participação células no processo patológico. No entanto, a natureza 

desta participação ainda não é totalmente compreendida (Batista, Rodini et al. 

2005, Huang, Lu et al. 2013, Marjanovic, Andjelkovic et al. 2016). Além disso, 

trabalhos já sugeriram que os animais SHR apresentam uma resposta mais 

pronunciada destas células, como Shen, Xia et al. (2015) na bexiga, e Shiota, 

Rysa et al. (2003) no tecido cardíaco, ambos os trabalhos mostrando um número 

aumentado de mastócitos no tecido, possivelmente associado à inflamação e 

fibrose mais pronunciada, em relação a controles normotensos. 

A partir disso, pontuamos a importância do presente trabalho, para melhor 

compreender o papel destas células na doença periodontal e em animais SHR, 



101 
 

e para tanto optamos pela metodologia de depleção sistêmica destas células a 

partir do tratamento prévio com o c48/80. Observamos que os grupos depletados 

apresentaram um número reduzido de mastócitos no tecido gengival, 

comparados aos grupos com doença periodontal, validando nosso modelo 

experimental, já utilizado em outros trabalhos, em diferentes modelos 

patológicos (Ribeiro, Souza-Filho et al. 1997, Oliveira, Costa et al. 2002, 

Carvalho, Benjamim et al. 2005, Yillar and Kucukhuseyin 2008). 

Posteriormente, avaliamos as consequências da doença periodontal no 

osso alveolar, pela microtomografia computadorizada (microCT). Observamos 

uma significativa perda óssea alveolar, o que foi mais expressivo nos animais 

SHR. Além disso, possivelmente o aumento da produção das citocinas, tais 

como TNF-α e IL-6, e das quimiocinas CXCL3 e CCL20, sugerem um processo 

inflamatório mais exacerbado, com aumento do recrutamento de células 

inflamatórias, como já mostrado por Bonato, do-Amaral et al. (2012), estando 

também estas citocinas relacionadas a processos de perda óssea (Graves, Li et 

al. 2011). 

Além disso, observamos uma menor expressão constitutiva de Runx2, 

Opn, Bmp2 e Opg, e aumento constitutivo na expressão de Trap, Mmp9, Mmp2 

e Oscar, na mandíbula do grupo SC, comparado ao WC, dados que corroboram 

com a maior susceptibilidade a perda óssea no animais SHR, como já sugerido 

por outros autores (Leite, Redins et al. 2005, Bonato, do-Amaral et al. 2012). 

Em relação a participação dos mastócitos, nossos resultados mostraram 

uma resposta bastante interessante, ao observamos pela microCT que os 

grupos depletados de mastócitos tiveram menor perda óssea alveolar, 

especialmente nos animais SHR, assim como houve menor expressão e 



102 
 

produção de mediadores inflamatórios Tnfa, Il6 e Il1b na mandíbula. 

Corroborando com nossos resultados, Malcolm, Millington et al. (2016) observou 

menor perda óssea alveolar e menor expressão de Tnfa, Il6 e Il1b no tecido 

gengival de camundongos deficiente de mastócitos (C57BL/6 c-Kit knockout) 

com doença periodontal induzida por Porphyromonas gingivalis, e tal evidencia 

reforça a hipótese de um efeito deletério destas células, visto que sua depleção 

levou a proteção do periodonto, assim como observamos em nossos dados. 

O TNF-α tem importante papel na doença periodontal, e embora muitas 

células o produzam em resposta ao estímulo bacteriano, os mastócitos possuem 

grânulos da citocina pré-formada (Gordon and Galli 1990) e apresentam-se em 

número aumentado no periodonto inflamado. Além disso, sabe-se que na 

doença periodontal. Ainda, estudos mostram que administração de TNF-α na 

periodontite exacerba o recrutamento de células inflamatórias e induz a 

reabsorção óssea alveolar (Gaspersic, Stiblar-Martincic et al. 2003). Dessa 

forma, em nosso modelo experimental o TNF-α também pode apresentar um 

importante efeito na indução da reabsorção óssea, principalmente nos animais 

SDP, que possuem mais produção desta citocina. 

Junto ao TNF-α, os mastócitos também produz e têm estocado nos 

grânulos IL-1β e IL-6 (Steinsvoll, Helgeland et al. 2004) e trabalhos já mostraram 

seu aumento na doença periodontal (Chen, Chang et al. 1997, Noh, Jung et al. 

2013), assim como mostrado em nossos resultados. Ambas citocinas têm 

importante participação na perda óssea alveolar e regulação do metabolismo 

ósseo. IL-1β já foi associada a ativação direta da sinalização de RANK, assim 

como é capaz de induzir a expressão de Rankl (Kim, Jin et al. 2009, Lee, Fujikado 

et al. 2010, Izawa, Ishihara et al. 2014). 



103 
 

O papel da IL-6 entretanto, ainda é bastante discutido, visto ter 

participação fisiológica em processos reabsortivos, assim como de formação 

óssea (Franchimont, Wertz et al. 2005). Já em condições de alto turnover ósseo, 

como em processos inflamatórios, associada a outras citocinas como TNF-α e 

IL-1β, seus efeitos sobre a atividade dos osteoclastos aparentam ser mais 

pronunciados (Kwan Tat, Padrines et al. 2004, Liu, Kirschenbaum et al. 2006). 

Além disso, Desai, Jung et al. (2016) mostrou que a IL-6 aumenta a proliferação 

e reatividade de mastócitos humanos CD34+ in vitro (isolados do sangue 

periférico). Desta forma, sugerimos ser um dos possíveis mecanismos 

observados nas diferenças observadas, visto que o grupo SDP apresentou maior 

expressão e produção de IL-6 na mandíbula, o que pode ser associado a 

quantidade aumentada de mastócitos no tecido gengival, assim como maior 

perda óssea alveolar. 

Por outro lado, a IL-10 é uma das principais citocinas anti-inflamatórios, e 

apresenta importante papel protetor na perda óssea alveolar induzida pela 

doença periodontal (Al-Rasheed, Scheerens et al. 2004, Sasaki, Okamatsu et al. 

2004). Nossos resultados evidenciaram maior produção de IL-10 nos grupos 

WDP e SDP, o que sugere um mecanismo protetor compensatório (Zhang, Chen 

et al. 2014). Entretanto, não observamos diferenças entre as linh