RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 02/03/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA- UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Efeito da suplementação com óleo de Copaifera ducke em Oreochromis niloticus desafiadas com Streptococcus agalactiae Nicoli Paganoti de Mello Correia Jaboticabal, SP 2022 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Efeito da suplementação com óleo de Copaifera ducke em Oreochromis niloticus desafiadas com Streptococcus agalactiae Nicoli Paganoti de Mello Correia Orientadora: Dra. Julieta Rodini Engrácia de Moraes Coorientador: Dr. Gustavo da Silva Claudiano Jaboticabal, SP 2022 Tese apresentada ao programa de Pós-graduação em Aquicultura do Centro de Aquicultura da UNESP – Caunesp, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor. 2 Correia, Nicoli Paganoti de Mello C824e Efeito da suplementação com óleo de Copaifera ducke em Oreochromis niloticus desafiadas com Streptococcus agalactiae / Nicoli Paganoti de Mello Correia. – – Jaboticabal, 2022 ix, 68 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura, 2022 Orientadora: Julieta Rodini Engrácia de Moraes Coorientador: Gustavo da Silva Claudiano Banca examinadora: Marcello Pardi de Castro, Geovana Dotta Tamashiro, Paulo Fernandes Marcusso, Jaqueline Dalbello Biller Bibliografia 1. Tilápia. 2. Copaíba. 3. Imunização. 4. Imunidade. 5. Streptococcus agalactiae. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura. CDU 639.3.043 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Jaboticabal/SP - Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 3 4 APOIO FINANCEIRO O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) 2018/06137-1. 9 RESUMO O óleo de copaíba, extraído do tronco de árvores amazônicas da espécie Copaifera possui propriedades anti-inflamatórias demonstradas em humanos e animais além de apresentar atividade bactericida contra microrganismos. Assim, o presente estudo objetivou avaliar a atividade bactericida in vitro do óleo de copaíba contra as cepas patogênicas da tilapicultura e os efeitos da suplementação em Oreochromis niloticus sobre os parâmetros zootécnicos e sanitários. Inicialmente foram executados ensaios in vitro para avaliar a atividade bactericida do óleo contra cepas de Streptococcus agalactiae e Flavobacterium columnare (Experimento I). Para analisar os efeitos in vivo, os peixes foram suplementados com óleo copaíba (0,25%, 0,50%, 0,75% e 1,0%) por 30 dias e realizados os experimentos II e III. No experimento II após 30 dias de suplementação, foram coletadas amostras de sangue com separação de soro e plasma para análises hematológicas (contagem total e diferencial de células), bioquímicas (proteínas totais, albumina, globulina, glicose, colesterol total, triglicérides, HDL, LDL, enzimas hepáticas ALT e AST), e imunológicas (burst respiratório, lisozima, mieloperoxidase e atividade bactericida do soro das tilápias), além de análise histológica de intestino, baço e fígado. No experimento III, após 30 dias de suplementação, as tilápias foram desafiadas com S. agalactiae e realizadas as análises supracitadas e porcentagem relativa de sobrevivência. Os resultados in vitro expressaram atividade bactericida do óleo comercial contra F. columnare e S. agalactiae. A suplementação nas concentrações de 0,75% e 1,0% evidenciaram melhora de alguns dos parâmetros hematológicos, albumina e da atividade lítica do soro. O resultado da análise histomorfométrica demonstrou que o óleo aparentemente induziu aumento das vilosidades intestinais nas respectivas concentrações de 0,75% e 1,0%. O óleo não exerceu influência sobre a porcentagem relativa de sobrevivência de peixes infectados. Conclui-se que o óleo de copaiba apresenta atividade bactericida in vitro contra patógenos de tilápias e atividade anti- inflamatória em tiápias desafiadas com Streptococcus agalactiae nas doses preconizadas. Palavras-chave: Tilápia; Óleo de copaíba; Imunoestimulante; Imunidade Inata; Streptococcus agalactiae. 10 ABSTRACT Copaiba oil extracted from the trunk of Amazonian trees of the Copaifera species has anti- inflammatory properties demonstrated in humans and animals, besides of having bactericidal activity against microorganisms. This study aimed to evaluate the in vitro bactericidal activity of copaiba oil against pathogenic bacterias of tilapia culture and the effects of supplementation in Oreochromis niloticus on zootechnical and sanitary parameters. Initially, in vitro assays were performed to evaluate the bactericidal activity of the oil against strains of Streptococcus agalactiae and Flavobacterium (Experiment I). To analyze the in vivo effects, the fish were supplemented with copaiba oil (0.25%, 0.50%, 0.75% and 1.0%) for 30 days and experiments II and III were carried out. In experiment II, after 30 days of supplementation, blood samples were collected with separation of serum and plasma for hematological (total and differential cell counts), biochemical (total proteins, albumin, globulin, glucose, total cholesterol, triglycerides, HDL, LDL, liver enzymes ALT and AST), and immunological (respiratory burst, lysozyme, myeloperoxidase and bactericidal activity of tilapia serum), in addition to histological analysis of intestine, spleen and liver. In experiment III, after 30 days of supplementation, the tilapia were challenged with S. agalactiae and the aforementioned analyzes and cumulative survival were performed. The results showed that the oil showed in vitro bactericidal activity against F. columnare and S. agalactiae. Supplementation at concentrations of 0.75% and 1.0% demonstrated improvement in some of the hematological parameters, albumin and serum lytic activity. The histomorphometric analysis showed that the oil apparently induced an increase in intestinal villi at the respective concentrations of 0.75% and 1.0%. The oil had no influence on cumulative survival in infected fish. Conclusion: copaiba oil has in vitro bactericidal activity against tilapia pathogens and anti-inflammatory activity in tilapia challenged with S. agalactiae at tested doses. Keywords: Tilapia; Copaiba oil; Immunostimulant; Innate Immunity; Streptococcus agalactiae. 11 INTRODUÇÃO GERAL A atividade de aquicultura cresce a nível mundial a cada ano e está sendo considerada uma das mais importantes fontes de nutrição para o futuro. A previsão de crescimento para o setor é de mais de 14% até o ano de 2030 (FAO, 2022). No Brasil, evidencia-se um forte crescimento nesta atividade, sendo que, no setor de piscicultura a produção de peixes de cultivo já ultrapassou 841 mil toneladas (PEIXE BR, 2022). Dentre as espécies mais cultivadas no país, a tilápia corresponde a 63,5% desta produção (PEIXE BR, 2022). Entretanto, nestes sistemas intensivos, existem fatores que contribuem para a proliferação de patógenos de origem bacteriana como: manejo inadequado, baixa qualidade de água, elevada densidade de estocagem, amônia e nitrito e o excesso de resíduos orgânicos no viveiro, sendo este último, o grande contribuinte para a multiplicação de bactérias (MARCELINO, 2016). No Brasil, as principais bacterioses que afetam o setor de tilapicultura são causadas por Aeromonas hydrophila e Edwardsiella tarda e a estreptococose causadas pelas bactérias Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae e S. ictaluri (MARCELINO, 2016; ZHANG et al., 2018; DELPHINO et al., 2019; JUNIOR et al., 2020). Além disso, a tilápia está susceptível também à columnariose causada pela Flavobacterium columnare que também contribui para o aumento na taxa de mortalidade (XU et al., 2014). Bacterioses como estas são normalmente tratadas com o uso de antibióticos adicionados à ração. Porém, este método de antibioticoterapia pode ser inviável uma vez que o animal doente reduz o apetite em situações infecciosas (MARCELINO, 2016). Além disso, o uso inadequado de antibióticos pode levar ao surgimento de patógenos resistentes aos antimicrobianos (CHIESA et al., 2018) e contribuir para a poluição do meio ambiente (ZHONG et al., 2018). Assim, é crescente a busca por tratamentos alternativos. Dentre as alternativas, o uso de óleos essenciais e extratos de plantas destacam-se, devido aos efeitos imunomodulador e anti-inflamatório observados em peixes que contribuem para prevenção e controle de bacterioses (YUNIS-AGUINAGA et al., 2016). Os fitoterápicos são alternativas ecologicamente sustentáveis e econômicas para redução da quantidade de antibióticos utilizados em aquicultura 12 (SOUZA et al., 2015; BRUM et al., 2017; BRUM et al., 2018; SILVA et al., 2019; SOUZA et al., 2019). O óleo de copaíba é um fitoterápico que possui ação anti-inflamatória, cicatrizante, antisséptica (HECK et al., 2012) antitumoral (LIMA et al., 2003), antibacteriana e antimicrobiana (SANTOS et al., 2008). Também foram relatados efeitos germicida, expectorante, diurético (VEIGA JÚNIOR et al., 2002) e ação anti-diabética (CARVALHO et al., 2017) com capacidade de reduzir o estresse oxidativo em animais com hiperglicemia (BASHA & SANKARANARAYANAN, 2016). Foi observado, ainda, efeito analgésico em humanos e animais (RIGAMONTE AZEVEDO et al., 2004). Este óleo é extraído do tronco de árvores nativas da região Amazônica e possui as frações óleo-resina e óleo essencial com ação anti-inflamatória mais eficaz do que o diclofenaco de sódio em humanos (CAVALCANTE, 2013). Esta planta é utilizada na medicina popular há mais de 500 anos por conta destas propriedades. Sendo assim, explorar as frações dos componentes do óleo de copaíba é uma fonte alternativa no tratamento de patologias animais e humanas (PIERI et al., 2009). A composição do óleo de copaíba é a base de sesquiterpenos como cubeno e cadineno, ácidos graxos, cumarina, tocoferol, bisaboleno, ácido copálico, cariofileno, flavonas, copaeno, copaína, carioazuleno, humuleno, saponinas, quininos, taninos e selineno (CAVALCANTE, 2013). Dentre os compostos do óleo, a resposta anti-inflamatória se dá pela ação do cariofileno (CAVALCANTE, 2013). Em estudos realizados em ratos com artrite induzida por adjuvante foi observado que os efeitos debilitantes das inflamações articulares e sistêmicas foram reduzidos nos animais após o tratamento com o óleo de copaíba (COMAR et al., 2013). Sua ação como receptor agonista seletivo do canabinóide periférico (CB2) demonstrou estar relacionada ao processo de inflamação e dor (GERTSCH et al., 2008) além de ser um dos principais componentes do óleo de copaíba e atuar como um potente anti-inflamatório por meio da inibição das vias histamínicas e serotoninérgicas com efeito antinociceptivo (mediado por receptores opioides) (GOMES et al., 2010; LUCCA et al., 2015). Outros benefícios do óleo de copaíba, estão relacionados à atividade antimicrobiana e antifúngica que age contra bactérias e fungos em condições infecciosas (TOBOUTI et al., 2017). A ação antimicrobiana contra patógenos 13 (YANG et al., 2015) foi observada no trabalho realizado por Yoo e Jwa (2018) em que houve inibição do crescimento de biofilmes microbianos de Streptococcus mutans, comprovando a eficácia antimicrobiana do cariofileno. Isto porque o cariofileno tem capacidade de penetrar em biofilmes que protegem as bactérias, auxiliando também na inibição da formação do mesmo (YOO & JWA, 2018). Em peixes, foi demonstrado efeito antiparasitário do óleo de copaíba da espécie Copaifera ducke, utilizadas na imersão de pacus (Piaractus mesopotamicus) infectados por parasitas monogêneos (COSTA et al., 2017). Os autores ressaltam que o óleo-resina é uma alternativa promissora no tratamento contra estes parasitas. Contudo, ainda não se sabe o que o óleo de copaíba causaria no organismo de tilápias suplementadas ou se este fitoterápico teria efeitos anti- inflamatórios e bactericidas em situações de infecção induzida por patógenos como Streptococcus agalactiae. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi verificar os efeitos anti- inflamatórios e antimicrobiano do óleo de copaíba em tilápias desafiadas com a bactéria Streptococcus agalactiae. 59 CONCLUSÃO O óleo de copaíba possui atividade bactericida in vitro contra cepas patogênicas de F. columnare e S. agalactiae. A suplementação oral (30 dias) de tilápias O. niloticus nas concentrações de 0,75% e 1,0% melhora os parâmetros hematológicos, albumina e atividade lítica do soro. O óleo de copaíba não é toxico para as tilápias nas concentrações preconizadas e contribui para o aumento das vilosidades intestinais, melhorando a superfície de absorção. Em processos infecciosos, apesar de não interferir no curso da infecção, o óleo de copaíba apresentou um efeito anti-inflamatória apresentando um efeito hepatoprotetor nas tilápias na concentração de 1,0%. REFERÊNCIAS Adel, M., Amiri, A.A., Zorriehzahra, J., Nematolahi, A., Esteban, M.A. 2015. 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