UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE PRODUÇÃO ANIMAL E MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA AVALIAÇÃO MOLECULAR PARA Fasciola hepatica EM BOVINOS ABATIDOS EM FRIGORÍFICO DO CENTRO- OESTE PAULISTA E ANÁLISE ESPACIAL ANDRESA XAVIER FRADE GOMES Botucatu – SP Junho - 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE PRODUÇÃO ANIMAL E MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA AVALIAÇÃO MOLECULAR PARA Fasciola hepatica EM BOVINOS ABATIDOS EM FRIGORÍFICO DO CENTRO-OESTE PAULISTA E ANÁLISE ESPACIAL Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar. Orientadora: Profª. Dra. Simone Baldini Lucheis Coorientadora: Dra. Maria Izabel Merino de Medeiros Botucatu – SP Junho - 2023 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA ANDRADE CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Gomes, Andresa Xavier Frade. Avaliação molecular para Fasciola hepatica em bovinos abatidos em frigorífico do Centro-Oeste paulista e análise espacial / Andresa Xavier Frade Gomes. - Botucatu, 2023 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Simone Baldini Lucheis Coorientador: Maria Izabel Merino de Medeiros Capes: 50502000 1. Fasciola hepatica. 2. Georreferenciamento. 3. Ruminantes. 4. Saúde Pública. 5. Zoonoses. Palavras-chave: Fasciola hepatica; Georreferenciamento; Ruminantes; Saúde Pública; Zoonose. Andresa Xavier Frade Gomes AVALIAÇÃO MOLECULAR PARA Fasciola hepatica EM BOVINOS ABATIDOS EM FRIGORÍFICO DO CENTRO-OESTE PAULISTA E ANÁLISE ESPACIAL. COMISSÃO EXAMINADORA Profª . Dra. Simone Baldini Lucheis Presidente e Orientadora Depto de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva FMVZ - UNESP- Botucatu ____________________________ Profº Dr. Fernando Paiva Membro da Banca Instituto de Biociências - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul ________________________________ Profº Dr. Helio Langoni Membro da Banca Depto de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva FMVZ - UNESP- Botucatu ________________________________ Data da Defesa: 28 de Abril de 2023. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001". "This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001". DEDICATÓRIA Aos meus avós, Valter e Ivone (in memorian). Aos meus pais, Clóvis e Nilsen. AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Nilsen Xavier da Silva Gomes e Clóvis Frade Gomes, pelos ensinamentos, incentivo, e pelo apoio incondicional em todas as áreas da minha vida. Ao meu pai por sempre me acompanhar nas viagens até Botucatu e Bauru, todas as vezes que precisei, sem medir esforços. À minha mãe pelo apoio financeiro, afetivo e emocional. Aos dois, por sempre me lembrarem que os estudos são o maior tesouro que eles puderam me proporcionar. Serei eternamente grata. À minha irmã, Mayara Xavier Frade Gomes, pelo encorajamento e companheirismo mesmo à distância, durante esses dois anos. A minha orientadora, professora Drª Simone Baldini Lucheis, por me acolher como sua aluna, mesmo sem me conhecer, e confiar a mim um trabalho tão importante com sua incrível orientação. Ao laboratório da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (Apta) de Bauru e todas(os) dele, em especial à Dra. Maria Izabel Merino de Medeiros, Isabella Aires e Thaina Bertozzo, que me auxiliaram quando precisei, foram sempre gentis, compreensivas, e me ensinaram com paciência e atenção. A Dra. Ana Paula Flamino, do Laboratório de Enfermidades Infecciosas de Botucatu, que auxiliou na realização do diagnóstico molecular em tempo real para a confecção dessa pesquisa. A Letícia Rossi, médica veterinária do frigorífico Frigol, de Lençóis Paulista, por ceder amostras de Fasciola para realização deste trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da FMVZ - Unesp - Botucatu/SP, pelo auxílio prestado durante o curso de mestrado. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) – Auxílio a Pesquisa Regular – Processo 2020/09409-2. LISTA DE QUADROS Quadro 1. Procedência dos animais utilizados na pesquisa............................. 26 Quadro 2. Número de animais positivos e negativos para Fasciola hepatica por município, segundo método e intervalo de confiança de 95% para o total de amostras positivas. .......................................................................................... 36 Quadro 3. Resultado geral da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR em tempo real (qPCR) para Fasciola hepatica a partir de fígado de 140 bovinos abatidos em frigorífico do Centro-Oeste Paulista e municípios de procedência. .................................................................................................... 60 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Resultados dos testes moleculares de PCR e qPCR para Fasciola hepatica em bovinos abatidos em frigorífico do Centro-Oeste Paulista. ........... 35 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Eletroforese em gel de agarose a 2% para os primers FhCO1F e FhCO1R (405pb) para Fasciola hepatica. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 14 e 17 – amostras amplificadas; 23 – controle positivo (Fasciola hepatica); 24 – controle negativo (água ultra pura). ......................................... 31 Figura 2. Eletroforese em gel de agarose a 2% para os primers COX1F e COX1R (535pb) para Fasciola hepatica. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 11 e 12 – amostras amplificadas; 34 – controle positivo (Fasciola hepatica); 35 – controle negativo (água ultra pura). ................................................................. 31 Figura 3. Eletroforese em gel de agarose a 2% para os primers COX1F e COX1R (535pb) para Fasciola hepatica. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 2, 5, 6, 7 e 8 – amostras amplificadas; 13 – controle positivo (Fasciola hepatica); 14 – controle negativo (água ultra pura). .............................................................. 31 Figura 4. Curva de melting para Fasciola hepatica pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR), amplificadas à temperatura de 82,94°C. ........................................................................................................... 34 Figura 5. Localização do Brasil na América do Sul, evidenciando o estado de São Paulo e os municípios de procedência dos animais para a pesquisa de Fasciola hepatica. .......................................................................................................... 38 Figura 6. Mapa do estado de São Paulo evidenciando a localização dos municípios de procedência dos animais para a pesquisa de Fasciola hepatica. ........................................................................................................................ 39 Figura 7. Mapa do estado de São Paulo com destaque para amostras positivas para Fasciola hepatica à PCR e seu respectivo município. Em vermelho, sete amostras positivas ao primer COX1 - Avaré (1), Bariri (4) e Vargem (2). Em amarelo, amostras positivas ao primer FhCO1 – Riversul (2). ......................... 40 Figura 8. Mapa do estado de São Paulo com as amostras positivas para Fasciola hepatica destacando os municípios de origem das 64 amostras positivas pela técnica de qPCR – Bariri (4), Bauru (1), Itaporanga (3), Itaí (8), Lençóis Paulista (8), Presidente Alves (13), Riversul (13), Santa Cruz do Rio Pardo (6), Vargem (8). ................................................................................................................... 41 Figura 9. Mapa dos municípios do estado de São Paulo e comparação das amostras positivas para Fasciola hepatica pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase para os dois pares de primers (em amarelo, o primer FhCO1 e em vermelho, o primer COX1) e pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR), destacado na cor laranja. ......................................... 42 LISTA DE ABREVIAÇÕES APTA - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios ºC – Graus Celsius DNA - Ácido Desoxirribonucleico ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay PCR – Reação em Cadeia da Polimerase qPCR – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real ou Quantitativa IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento OMS – Organização Mundial da Saúde SST – Solução Salina Tamponada SP – São Paulo SIF – Serviço de Inspeção Federal PBS - Phosphate Buffer Saline Ph – Potencial Hidrogeniônico Pb – Pares de Base UV – Ultravioleta mL – Mililitros μl – Microlitros SUMÁRIO Resumo ...................................................................................................... 14 Abstract ...................................................................................................... 15 CAPÍTULO 1 .............................................................................................. 16 1. INTRODUÇÃO .................................................................................... 17 2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................... 18 2.1. Epidemiologia ..................................................................................... 18 2.2. Patogenia............................................................................................ 19 2.3. Diagnóstico ......................................................................................... 21 2.3.1. Diagnóstico em Humanos............................................................. 21 2.3.2. Diagnóstico em Animais ............................................................... 21 2.4. Tratamento ......................................................................................... 22 3. JUSTIFICATIVA .................................................................................. 23 CAPÍTULO 2 .............................................................................................. 24 4. OBJETIVOS ........................................................................................ 25 4.1. Gerais ................................................................................................. 25 4.2. Específicos ......................................................................................... 25 5. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 25 5.1. Local de Realização das Técnicas ...................................................... 25 5.2. Aspectos éticos ................................................................................... 25 5.3. Procedência das amostras e quantidade de animais .......................... 25 5.4. Amostras Biológicas ........................................................................... 26 5.4.1. Colheita e armazenamento das amostras biológicas .................... 26 5.4.2. Processamento das amostras biológicas ...................................... 27 5.5. Exames Diagnósticos ......................................................................... 27 5.5.1. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ........................................ 27 5.5.1.1. Extração .................................................................................... 27 5.5.1.2. Amplificação do DNA ................................................................ 28 5.5.1.3. Eletroforese ............................................................................... 29 5.6. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) ............... 29 6. Análise estatística ............................................................................... 30 7. Análise espacial .................................................................................. 30 8. RESULTADOS .................................................................................... 30 8.1. Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ........................................... 30 8.2. Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR) ............... 32 8.3. Análise Estatística ............................................................................... 35 8.4. Análise espacial .................................................................................. 37 9. DISCUSSÃO ....................................................................................... 43 10. CONCLUSÃO ..................................................................................... 51 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS* ................................................... 52 ANEXOS .................................................................................................... 58 ANEXO 1. .................................................................................................... 59 ANEXO 2. .................................................................................................... 60 CAPÍTULO 3. ............................................................................................. 65 Artigo Científico ........................................................................................... 65 ANEXO 3. .................................................................................................... 82 GOMES, A.X.F. AVALIAÇÃO MOLECULAR PARA Fasciola hepatica EM BOVINOS ABATIDOS EM FRIGORÍFICO DO CENTRO OESTE PAULISTA E ANÁLISE ESPACIAL. Botucatu, 2023.82p. Exame Geral de Qualificação (Mestrado). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista (UNESP). Resumo Fasciola hepatica (F. hepatica) é um parasita trematoda que afeta os tecidos de animais e humanos. Este parasita se aloja principalmente no fígado de seus hospedeiros, e seu ciclo de transmissão envolve um hospedeiro intermediário, o caramujo do gênero Lymnaea. Há eliminação de ovos do parasita nas fezes de animais infectados, contaminando locais úmidos. Para o diagnóstico, realizou-se a prova molecular de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com a utilização de dois pares de primers para F.hepatica; e o exame de PCR em tempo real (qPCR), com um par de primers. Foram utilizadas 140 amostras de fígado de bovinos abatidos em um frigorífico da região Centro Oeste Paulista. Verificou-se que, à PCR , para os dois primers, nove das 140 amostras (6,4%) foram positivas, sendo duas (1,4%) com o par de primers FhC01, e sete (5%) com o par de primers COX1. Pela técnica de qPCR, com os primers SSCPFaF e SSCPFaR, sessenta e quatro (45,7%) amostras mostraram-se positivas para Fasciola hepatica. Foi possivel observar amostras positivas procedentes das cidades de Vargem e Lençóis Paulista, com positividade de 80%, respectivamente. Quatro municípios apresentaram todas as amostras negativas para a detecção de Fasciola hepatica. A utilização das provas moleculares, em especial a qPCR, possibilitou o conhecimento de dados epidemiológicos sobre a fasciolíase no universo amostral estudado e sugerem um alerta para implementação de programas sanitários em busca da melhoria da sanidade do rebanho de bovinos de corte das propriedades avaliadas. Palavras-chave: Diagnóstico; Fasciola hepatica; Zoonose; Ruminantes; Saúde Pública; Georreferenciamento. GOMES, A.X.F. MOLECULAR EVALUATION FOR Fasciola hepatic IN CATTLE SLAUGHTERED IN A REFRIGERATOR IN THE CENTRAL WEST PAULISTA AND SPATIAL ANALYSIS. Botucatu, 2023. 82p. General Qualification Exam (Masters). Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu, São Paulo State University (UNESP). Abstract Fasciola hepatica (F. hepatica) is a fluke parasite that affects the tissues of animals and humans. This parasite lives mainly in the liver of its hosts, and its transmission cycle involves an intermediate host, the snail of the genus Lymnaea. There is elimination of parasite eggs in the feces of infected animals, contaminating wet places. For the diagnosis, the molecular test of Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed, using two pairs of primers for F.hepatica; and real-time PCR (qPCR) with a pair of primers. 140 samples of liver from cattle slaughtered in a slaughterhouse in the Midwest region of São Paulo were used. It was verified that, at PCR, for the two primers, nine of the 140 samples (6.4%) were positive, two (1.4%) with the FhC01 primer pair, and seven (5%) with the FhC01 pair of primers. of COX1 primers. By the qPCR technique, with SSCPFaF and SSCPFaR primers, sixty-four (45.7%) demonstrations were positive for F. hepatica. It was possible to observe positive positive procedures in the cities of Vargem and Lençóis Paulista, with positivity of 80%, respectively. Four municipalities had all samples negative for the detection of F. hepatica. The use of molecular tests, especially qPCR, allowed the knowledge of epidemiological data on fascioliasis in the studied sample universe and suggested an alert for the implementation of sanitary programs in search of the improvement of the health of the herd of beef cattle of the evaluated properties. Keywords: Diagnosis; Fasciola hepatica; Zoonosis; Ruminants; Public health; Georeferencing. 16 CAPÍTULO 1 17 1. INTRODUÇÃO Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758), é um parasita do Filo Platelminto, Classe Trematoda (em formato de folha), Ordem Digenea e Família Fasciolidae. Possui ciclo indireto, ou seja, as gerações sexuadas ou assexuadas parasitam hospedeiros alternados (BOWMAN, 2010). Seu principal hospedeiro intermediário são caramujos, em especial os do gênero Lymnaea, Galba, Fossaria e Pseudosuccinea (CDC, 2019). Esse parasita acomete diferentes órgãos, mas principalmente o fígado e ductos biliares de várias espécies de mamíferos, como ovinos, bubalinos, equinos, suídeos e camelídeos (WHO., OIE., FAO., 2021). O parasita está distribuído em mais de 70 países, especialmente em locais onde há criação de ovinos ou bovinos. Casos humanos já foram relatados na América Latina, Oriente Médio, Caribe, Ásia, África, partes da Europa e raros casos na Austrália. Existem duas espécies capazes de infectar pessoas, F. hepatica e Fasciola gigantica (F.gigantica), sendo essa última mais comumente identificada na África e na Ásia. A doença é considerada mais comum em animais, entretanto, o número de registros de casos humanos habitantes de nações em desenvolvimento é considerado de grande importância e deve ser levado em consideração (CDC, 2019). O Tratado de Saúde Animal do Mundo Árabe, de 865 a.C, do século IX, traz o primeiro caso já registrado de fasciolíase. Nele, cita-se a ocorrência de uma “doença do fígado” em ovinos (MENDES, 2006 apud REZENDE, 1979). O primeiro relato da circulação desse parasita no Brasil foi feito por Adolfo Lutz em 1921, que o detectou ao observar o fígado alterado de carneiros e bovinos abatidos, além de haver a presença de uma espécie de Lymnaea. Esses animais eram provenientes da Barra do Piraí, as margens do Paraíba, no Rio de Janeiro. Em relação ao ciclo de vida, F. hepatica adulta se estabelece nos ductos biliares e fígado de mamíferos, que são os hospedeiros definitivos. Os ovos são carreados pela bile até a luz do intestino e então são eliminados nas fezes. Esses ovos, por sua vez, só tornam-se infectantes na forma de larva ciliada (miracídio), ao entrar em contato com a água (BOWMAN, 2010). 18 O complexo período de eclosão dos ovos só pode acontecer sob circunstâncias favoráveis, principalmente no que se refere à temperatura. Temperaturas moderadas, entre 10ºC a 30ºC, pH 7 (variando entre 4,2 e 9,0), ambiente anaeróbico e presença obrigatória de água são condições necessárias para o desenvolvimento embrionário e desprendimento da larva, que mede 220- 500 μm por 70-80 μm com vida útil de 8 a 10 horas em ambiente aquático favorável (COSTA, 2010). O miracídio, ao encontrar um hospedeiro intermediário, penetra no caramujo do gênero Lymnaea, local onde perde sua superfície ciliada, e migra para as glândulas digestivas do mesmo, estabelecendo-se na forma de esporocisto. Após múltipas divisões celulares, os esporocistos se transformam em rédias, que possuem aparelho bucal e passam a se alimentar dos tecidos do caramujo. As formas jovens, chamadas cercárias, são a próxima fase de evolução da Fasciola hepatica. As cercárias saem das rédias e abandonam o caramujo para vida livre na água, nadando à procura de plantas onde possam fixar-se, na lâmina d’água. Nesse estágio, perdem a cauda e passam a ser a forma infectante para as pessoas e animais, a metacercária, que é ingerida na água contaminada ou durante o pastejo. Sob condições convenientes, o ciclo de vida da Fasciola hepatica pode ser considerado completo entre três a quatro meses (BOWMAN, 2010). Diante da grande quantidade de hospedeiros definitivos, é possível observar o quão adaptável e ecologicamente versátil este helminto é, o que explica sua incrível dispersão geográfica (OLIVEIRA; RESENDE, 2017). 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Epidemiologia Considerada um sério problema de saúde pública mundial, a fasciolíase é a infeccção helmíntica de maior importância em bovinos, principalmente em países tropicais, causando vários prejuízos econômicos com a condenação de fígados parasitados e perdas no rendimento de carcaças devido a baixa conversão alimentar. Em estudo recente, verificou-se o aumento no número global de casos humanos da doença. A Organização Mundial da Saúde (OMS) 19 admitiu que a fasciolíase é uma doença emergente, sendo observada em mais de 70 países e com relatos de 2,4 milhões de pessoas infectadas de 1990 até 2019, além de 180 milhões de pessoas em situação de risco de infecção (MAS- COMAS et al., 2019; WHO, 2020). No Brasil, apesar da prevalência da fasciolíase ser considerada baixa, ela ainda representa grande prejuízo econômico e social. Estima-se que a incidência da doença nos rebanhos do Rio Grande do Sul chegue a 91%, sendo o estado mais afetado do Brasil (MOLENTO et al., 2018). A região Norte tem apenas registros de infecção humana, enquanto a região Nordeste tem registro dos parasitas, sem casos humanos ou animal (FURTADO et al., 2015). A taxa de prevalência da Fasciola hepatica no Brasil variou entre 4-8%, tendo alcançado um pico de 11,55% em 2006, principalmente devido ao aumento da prevalência nos estados do Rio Grande do Sul (RS) e Santa Catarina (SC) (BENNEMA et al., 2014). O uso dessa base de informações é considerado de grande valia para previsão de eventos futuros relacionados a essa e outras doenças (MOLENTO et al., 2018). 2.2. Patogenia Casos humanos ocorrem após a ingestão da forma infectante do agente, a metacercária, em alimentos ou água contaminados. No organismo, durante a fase aguda, o parasita migra pela parede do intestino e penetra na cápsula de Glisson, chegando ao parênquima hepático, onde tornam-se adultos. Já nesta fase é caracterizada como doença crônica. Os pacientes apresentam sintomas como dor, hipereosinofilia, colecistite e pancreatite aguda (WEB; CABADA, 2018). Em algumas situações, entretanto, não há relato de sintomas. Algumas pessoas sentem mal estar apenas no início da infecção, chamada fase aguda, quando vermes imaturos migram do intestino para a cavidade abdominal e o fígado. Nesses casos os fenômenos podem começar entre 4 a 7 dias após a exposição e durar várias semanas ou meses. Durante as duas fases da infecção, 20 as características clínicas podem incluir febre, mal-estar, dor abdominal, eosinofilia, hepatomegalia e testes hepáticos anormais (CDC, 2019). Já as manifestações em animais geralmente incluem o rebanho todo, e os sintomas apresentam-se como vagos ou inespecíficos, normalmente demonstrados pela produtividade reduzida. Isso torna difícil a distinção entre o manejo inadequado dos ruminantes ou outras doenças crônicas. A fasciolíase bovina é mais comum na forma subclínica; entretanto, altas cargas parasitárias podem se manifestar com surtos da doença nas formas aguda ou subaguda (KAPLAN, 2001). A patologia em animais ocorre da seguinte forma: as metacercárias, consideradas a forma infectante, quando imaturas, realizam migração pelo fígado antes de se alojarem no destino final, os ductos biliares. Essa movimentação na fase aguda ocasiona traços hemorrágicos no parênquima hepático necrótico, visíveis a olho nu, de cor vermelho-escura que, após certo tempo, passam a ficar descorados em relação ao parênquima ao redor, com áreas de fibrose. As manifestações clínicas dessas movimentações são variadas e podem incluir desde peritonite aguda e abscessos hepáticos, até a morte do hospedeiro em decorrência de necrose hepática aguda difusa, caso haja migração em grandes quantidades. Pode haver ainda a multiplicação de Clostridium haemolyticum ou Clostridium novyi no tecido lesionado, com desenvolvimento consectivo de hemoglobinúria bacilar ou hepatite necrótica infecciosa, nessa ordem (ZACHARY, 2018). Os ductos intra e extra hepáticos, por sua vez, são colonizados pela forma adulta do parasita, causando colangite. A forma crônica da colangite, associadas a obstrução do ducto biliar, geram estenose dos ductos e ectasia, além de espessamento da parede, aumentando seu tamanho. O conteúdo encontrado nesses ductos é de aspecto viscoso, de cor castanho-escura, resultante da mistura de bile modificada, dejetos celulares e excreção de pigmento porfirina dos parasitas (ZACHARY, 2018). 21 2.3. Diagnóstico 2.3.1. Diagnóstico em Humanos Para humanos, há vários testes diagnósticos com o intuito da detecção de Fasciola spp, como testes imunológicos que recentemente vem sendo desenvolvidos (COLLETT et al., 2022). O diagnóstico da infecção por Fasciola é desafiador e requer uma combinação de achados clínico-epidemiológicos e testes laboratoriais específicos. A microscopia de fezes e a sorologia são comumente utilizadas, mas apresentam limitações. Testes radiológicos podem auxiliar no diagnóstico durante a fase aguda ou parenquimatosa hepática da doença. O teste sorológico para anticorpos contra antígenos de F. hepatica tem alta sensibilidade e pode ser usado durante a fase aguda. Testes moleculares a partir de fezes, como o PCR em tempo real, são altamente sensíveis e específicos, permitindo distinguir entre infecções por F. hepatica e F. gigantica e entre Fasciola spp. e outras infecções parasitárias (WEBB & CABADA., 2018). Exames de imagem podem ser úteis para confirmação da doença, e entre seus achados incluem-se hemorragia subcapsular, lesões parenquimatosas nodulares mal definidas que podem conectar-se em trilhas tubulares, preenchimento nas vias biliares e nódulos indistintos subcapsulares, peribiliários ou periportais e abscessos. O uso de ultrassom e tomografia computadorizada, ressonância magnética e em menor grau, medicina nuclear digitalizada também tem a mesma função. A colangiopancreatografia endoscópica retrógrada e a colangiopancreatografia por ressonância magnética (MRCP) são úteis na doença crônica quando os vermes adultos ocupam a árvore biliar (TOLAN, 2011). 2.3.2. Diagnóstico em Animais Habitualmente, o diagnóstico de fasciolíase é feito nos animais pelo método de contagem de ovos em fezes, utilizando a técnica de sedimentação. Entretanto, essa metodologia possui sensibilidade limitada quando utilizada para um grande número de amostras ou quando realizada por pessoas inexperientes. Não obstante, essa técnica só pode ser utilizada após o período pré patente de 12 semanas. Como solução a isso, foi criado o kit comercial de ELISA 22 coprológico para detecção da Fasciola spp., assim como o teste de PCR, ambos utilizados em amostras de fezes (CALVANI et al., 2017). Os dois mostram-se mais eficazes e permitem maior eficiência na análise da amostra quando comparados à sedimentação tradicional, a qual necessita de duas sedimentações para resultados com maior sensibilidade. Além disso, os testes moleculares permitem o armazenamento do DNA para múltiplos usos (CALVANI et al., 2017 apud MEZO, 2004). A identificação molecular baseada em genes, quando comparada ao uso da caracterização e morfologia para diferenciação da Fasciola spp., é mais segura, visto que a última só deve ser utilizada para a distinção de parasitas adultos encontrados nos ductos biliares (CWIKLINSKI; DALTON, 2018). As análises moleculares são, portanto, de caráter essencial na identificação, resolvendo discrepâncias em relação ao reconhecimento entre espécies (AMER et al., 2016). Ademais, a técnica de PCR é um método valioso para diagnosticar infecção por vermes em fígados de ovinos. A especificidade do nested-PCR permite o seu uso como um bom método para estudos epidemiológicos. Ensaios moleculares podem ser úteis para verificar a eficácia dos anti-helmínticos após o tratamento (MARTINEZ-PEREZ, 2012). 2.4. Tratamento Para animais, o tratamento é realizado com triclabendazol administrado por via oral, com alimentos, para melhor absorção (CDC, 2019). No Brasil, somente albendazol e closantel estão disponíveis para uso em humanos. Todavia, o único composto que tem efeito tanto nas formas adultas quanto jovens do parasita é o triclabendazol (PRITSCH & MOLENTO apud KELLEY et al., 2016). A resistência ao triclabendazol foi documentada em animais infectados, porém em estudo realizado por Carneiro et al., (2012), a dose de 10 mg/kg associada ao uso de abamectina, mostraram-se eficientes no combate ao parasita em caprinos no estado do Espírito Santo. https://www.sinonimos.com.br/distincao/ 23 O aparecimento da doença crônica ou não, depende de mecanismos imunológicos desenvolvidos pelos vermes adultos. O fato de o sistema de ductos biliares constituir um local pouco acessível à resposta imune do hospedeiro, também contribui para dificuldade de controle. Levando tudo isso em conta, acredita-se que os esforços para o controle da fasciolíase devem ser feitos nos estágios iniciais do parasita, gerenciando assim a enfermidade de forma mais eficaz (GONZÁLEZ-MIGUEL et al., 2020). Novos medicamentos anti-helmínticos vêm sendo estudados pois os benzimidazóis utilizados para o controle da fasciolíase apresentam certas limitações, sendo elas a atividade escassa contra estágios imaturos do verme. Além disso, há a proibição de seu uso em animais produtores de leite para consumo humano e o desenvolvimento da resistência anti-helmíntica. Há esforços da União Europeia para elaboração de uma vacina eficaz, além da tentativa de estabelecer limites máximos de resíduos no leite, permitindo sua utilização no gado leiteiro (CHARLIER et al., 2013). Vários estudos demonstram benefícios econômicos quanto ao controle da fasciolíase, sendo as diferenças entre os estudos, principalmente a amplitude no nível do benefício. Apesar de haver alguns estudos publicados que não conseguiram demonstrar qualquer impacto econômico quanto a infecções causadas por parasitas do fígado em bovinos, a revisão da literatura disponível sugere que os benefícios econômicos do controle do verme são substanciais (KAPLAN, 2001). 3. JUSTIFICATIVA Frente ao exposto, considerando o cenário da doença no país, sua nomeação como doença negligenciada, a identificação, consequências econômicas e impacto na saúde pública, o presente trabalho propôs realizar o diagnóstico molecular para Fasciola hepatica em amostras de fígado de bovinos abatidos em um frigorífico da região Centro-Oeste Paulista, bem como a distribuição geográfica dos municípios de procedência dos animais para Fasciola hepatica. 24 CAPÍTULO 2 25 4. OBJETIVOS 4.1. Gerais Diagnosticar Fasciola hepatica em bovinos abatidos em frigorífico localizado na região Centro-Oeste Paulista. 4.2. Específicos - Comparar as técnicas moleculares de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR em Tempo Real (qPCR) para detecção de Fasciola hepatica, a partir de fígado de bovinos abatidos em frigorífico da região Centro-Oeste do Estado de São Paulo; - Plotar os locais de ocorrência a partir da procedência das amostras de fígado desses animais. 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Local de Realização das Técnicas O procedimento molecular para PCR foi realizado no Laboratório de Sanidade Animal (LASAB) da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios – APTA/SAA – Bauru. O exame molecular de qPCR foi realizado junto ao Depto. de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva da FMVZ – UNESP – Botucatu. 5.2. Aspectos éticos O presente projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética-CEUA da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ-Unesp Botucatu , sob número 0047/2021 (Anexo 1). 5.3. Procedência das amostras e quantidade de animais Foram utilizadas 140 amostras de fígado de bovinos previamente abatidos. As peças de fígado foram inspecionadas apenas após a coleta dos fragmentos. A escolha dos animais foi aleatória, sem discriminação de sexo, raça e idade, considerando apenas animais procedentes de propriedades localizadas 26 no Centro-Oeste do estado de São Paulo. Os animais eram originários de quatorze diferentes municípios (Quadro 1). Quadro 1. Procedência dos animais utilizados na pesquisa. Municípios Número de animais Bariri 10 Bauru 7 Itaporanga 7 Riversul 23 Presidente Alves 22 Lençóis Paulista 10 Vargem 10 Itaí 16 Santa Cruz do Rio Pardo 18 Colômbia 5 Avaí 7 Sabino 1 Avaré 3 São José do Barreiro 1 Total 140 5.4. Amostras Biológicas 5.4.1. Colheita e armazenamento das amostras biológicas Tendo em vista a pandemia da Covid-19, como normativa sanitária, houve a restrição presencial em frigorífico para coleta de material com finalidade de pesquisa. Sendo assim, foram aproveitadas 140 amostras de fígado de bovinos de corte, de ambos os sexos e diferentes idades, que foram coletadas entre agosto e outubro de 2017, durante a linha de abate de um frigorífico localizado na região Centro-Oeste Paulista. As amostras foram devidamente armazenadas em freezer a -20ºC no Laboratório de Sanidade Animal – LASAB - APTA Centro-Oeste – Bauru, até o momento de seu processamento para extração de DNA. As amostras de fígado foram colhidas com tesouras e pinças de metal esterilizadas em álcool 70% no momento de cada colheita, e os fragmentos dos 27 tecidos eram identificados com o registro do animal e envoltos em papel alumínio, sendo acondicionados em caixa térmica refrigerada. 5.4.2. Processamento das amostras biológicas Foram determinadas as taxas de 1 grama de fígado utilizando uma balança analítica dentro de uma capela de fluxo laminar. As amostras foram aliquotadas em microtubos contendo 200 microlitros de PBS pH 7,6 e armazenadas em freezer a -20°C até o seu processamento. Em capela de fluxo laminar, a próxima etapa no processamento das amostras foi a preparação dos inóculos para posterior extração do DNA. Desta forma, os fragmentos de fígado foram retirados dos microtubos e macerados em almofariz e pistilo estéreis. Após a maceração, adicionou-se 2 mL de Solução Salina Tamponada (SST) pH 7,6 pipetando-se 1.000 microlitros do sobrenadante para dois microtubos livres de DNAse e RNAse (1 mL para cada um), identificados e mantidos em freezer a -20 °C até a realização da extração de DNA. Para a preparação da extração do DNA de Fasciola hepatica para controle positivo, foi utilizado o próprio parasita previamente armazenado em álcool para conservação. Em capela de fluxo laminar esterilizada durante quinze minutos na luz UV, macerou-se em almofariz estéril, duas amostras de Fasciola hepatica adultas, acrescentando-se 2mL de PBS pH 7,2 ao macerado. 5.5. Exames Diagnósticos 5.5.1. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 5.5.1.1. Extração A extração de DNA a partir da Fasciola hepatica foi realizada utilizando- se o kit CellcoTM Blood-Animal-Plant DNA Preparation Kit DPK 112L para 250 preparações, conforme instruções do fabricante. As amostras de fígado foram extraídas utilizando-se o kit Illustra® Tissue & Cells Genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare®), conforme recomendações do fabricante. 28 5.5.1.2. Amplificação do DNA Foram testados dois pares de primers na PCR. Os primers do primeiro par foram descritos por CUCHER et al. (2006), os quais amplificam parcialmente uma região com aproximadamente 405 pb do gene da subunidade 1 do citocromo c oxidase (posição do gene corresponde aos nucleotídeos 1888-3420 de X15613.1), como segue: FhCO1F (5`TATGTTTTGATTTTACCCGGG-3`) FhCO1R (5`ATGAGCAACCACAAACCATGT-3`) O segundo par de primers foi descrito SARKARI et al. (2018), e foi composto por fragmentos de 438 pb do gene mitocondrial COX1, descrito a seguir: 5'-ACGTTGGATCATAAGCGTG-3’ 5′-CCTCATCCAACATAACCTCT-3′ As reações de PCR foram realizadas em microtubos de 0,2 mL com volumes totais de 25μl, sendo 2,5μl de MgCl2 (1,5mM); 0,5 μl de solução de dNTP (0,2mM); 0,5μl de Taq Platinum DNA (1U) (Invitrogen®); 0,5μl de cada primer ou primer (10pM); 17,75μl de água ultrapura e 2μl de DNA da amostra obtida no final da extração a 10ɳg. Como controle positivo dos testes utilizou-se o DNA de F. hepatica adulta e como controle negativo, água ultra-pura. Tanto a preparação do primeiro quanto do segundo par de primers foi realizada no termociclador Mastercycler Pro gradiente (Eppendorf®), segundo o perfil de ciclagem descrito por Cucher et al. (2006) e Sarkari et al. (2018), respectivamente. O procedimento do primeiro par consistiu em 60s desnaturação em 95ºC, seguido por 60s de anelamento em 56ºC e 90s de extensão a 72ºC, por 30 ciclos. Foram incluídos também uma etapa inicial de 3 min a 98°C e uma etapa final de 3 min a 72ºC. O segundo par de primers consistiu de ciclo inicial de desnaturação com início a 94ºC por 2 minutos; seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto; reaquecimento a 55ºC por 1,5 minutos; extensão a 72ºC por 2 minutos e extensão final a 72ºC por 1 minuto. 29 5.5.1.3. Eletroforese A visualização dos produtos amplificados foi realizada pela técnica de eletroforese. Para tanto foi preparado um gel de agarose a 2% acrescentado com 10μl/mL de SYBR® Safe DNA gel stain (Life Technologies®). Foram utilizados 8μl do produto de PCR e como marcadores de peso molecular 5μl de 100 pb ladder (Invitrogen®) . Para todas as amostras foram acrescentados 2μl de uma solução de Blue Juice Gel Loading (Life Technologies®). O gel foi submetido a corrida eletroforética em uma cuba horizontal HE33 (Amershan Biosciences®) contendo TBE 1X (0,1M Tris, 0,09mL de ácido bórico e 0,001M de EDTA) e a voltagem de 80V por 60 minutos, utilizando a fonte Electrophoresis Power Supply Model EPS 301 (GE Healthcare®). O gel foi visualizado no transluminador de luz UV e a imagem capturada pelo sistema Major Science® e documentada utilizando-se o software Vision Works LS®. 5.6. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qPCR) foi realizada junto ao Depto. de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva da FMVZ – UNESP – Botucatu. Para a reação da qPCR foi empregado o set de primers descritos por Calvani et al., (2017) gerando amplicons de 140 pb da Fasciola hepatica, descritos na sequência: SSCPFaF [S0754] (50-TTG GTA CTC AGT TGT CAG TGT G-30) SSCPFaR [S0755] (50-AGC ATC AGA CAC ATG ACC AAG-30) As reações foram executadas no equipamento Applied Biosystems™ StepOne™ Real-Time PCR System da marca Thermo Fisher Scientific™. As reações de qPCR utilizaram volumes iniciais de até 10μl, que incluíram 2,5μl de DNA molde de Fasciola hepatica e 7,5 μl de mix. Iniciaram-se as reações a 95˚C por 3 min, seguidas por 40 ciclos de 5s a 95˚C e 10s a 60˚C. Utilizou-se SYBR® Green e Taq DNA Polymerase®, ambos da marca ProMega - Merck®. Água foi utilizada como controle negativo, e DNA extraído de Fasciola hepatica, como controle positivo. 30 6. Análise estatística Foi calculado o percentual de amostras positivas por região de procedência, como também o intervalo de 95% confiança para o total de amostras positivas. Foi estimada uma prevalência de 6,32% (BENNEMA et al., 2014) com uma margem de erro de mais ou menos 5%. O cálculo do tamanho das amostras foi realizado com o programa OpenEpi, com uma população considerada de 150 animais (DEAN et al., 2015). 7. Análise espacial Por meio de uma base de dados digital, realizou-se o geoprocessamento a partir do mapeamento das amostras, visando compreender espacialmente a distribuição na área de estudo. Para isso, o instrumento de Sistema de Informação Geográfica (SIG) foi utilizado, além do software QGIS 3.16 para confecção dos mapas. 8. RESULTADOS 8.1. Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) A PCR foi realizada conforme protocolo anteriormente descrito por CUCHER et al., (2006) e SARKARI et al., (2018). Assim, foram detectadas duas amostras de fígado positivas com o par de primers FhCO1, de número de identificação 125 e 128, e correspondentes a 1,4% do total de 140 amostras. Foram detectadas duas amostras (1,4%) positivas para os primers FhCO1 na PCR, identificados pelos números 125 e 128 e provenientes do município de Riversul. As amostras 86 e 87, avaliadas com o conjunto de primers COX1 eram provenientes do município de Vargem, enquanto que as outras cinco amostras (números 140, 143, 144, 145 e 146) eram procedentes da cidade de Bariri. O número total de amostras positivas para esse conjunto de primers foi de sete (4,9%). A figura 1 mostra o resultado da PCR com o par de primers FhCO1, enquanto as figuras 2 e 3 demonstram a amplificação com os primers COX1. 31 Figura 1. Eletroforese em gel de agarose a 2% para os primers FhCO1F e FhCO1R (405pb) para Fasciola hepatica. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 14 e 17 – amostras amplificadas; 23 – controle positivo (Fasciola hepatica); 24 – controle negativo (água ultra pura). Figura 2. Eletroforese em gel de agarose a 2% para os primers COX1F e COX1R (535pb) para Fasciola hepatica. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 11 e 12 – amostras amplificadas; 34 – controle positivo (Fasciola hepatica); 35 – controle negativo (água ultra pura). Figura 3. Eletroforese em gel de agarose a 2% para os primers COX1F e COX1R (535pb) para Fasciola hepatica. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 2, 32 5, 6, 7 e 8 – amostras amplificadas; 13 – controle positivo (Fasciola hepatica); 14 – controle negativo (água ultra pura). 8.2 Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR) As análises da PCR em tempo real foram realizadas segundo o protocolo anteriormente descrito por CALVANI et al., (2017). Realizou-se inicialmente a técnica de qPCR com um pool de amostras como triagem inicial e, tendo-se resultados, a técnica foi repetida para a obteção de positivos. Desta forma, verificou-se a presença de DNA a partir da amostra 49 até a 140. Na qPCR, observou-se sessenta e quatro amostras positivas, representando 45,7% do total nesse exame diagnóstico. A distribuição desse resultado por município foi: quatro da cidade de Bariri, uma de Bauru, oito de Itaí, três de Itaporanga, oito de Lençóis Paulista, doze de Presidente Alves, treze de Riversul, seis de Santa Cruz do Rio Pardo e oito da cidade de Vargem. Apenas cinco municípios apresentaram resultados negativos para Fasciola hepatica na qPCR, sendo Avaí, Avaré, Colombia, Sabino e São José do Barreiro. 33 Os resultados positivos são apresentados na Figura 4 e podem ser visualizados pela curva de melting. 34 Figura 4. Curva de melting para Fasciola hepatica pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR), amplificadas à temperatura de 82,94°C. A curva de desnaturação mostra a variação da fluorescência em função da temperatura. As cores da legenda A, B, C, D, E e F, correspondem aos 35 diferentes produtos amplificados que estão sendo analisados, permitindo a identificação e diferenciação das amostras. A Tabela 1, a seguir, sumariza em porcentagem os resultados obtidos em cada teste utilizados. Tabela 1. Resultados dos testes moleculares de PCR e qPCR para Fasciola hepatica em bovinos abatidos em frigorífico do Centro-Oeste Paulista. PCR primer COX1 PCR primer FhCO1 qPCR Positivos 7 (5%) 2 (1,4%) 64 (45,7%) Negativos 133 (95%) 138 (98,6%) 76 (54,3%) Total 140 (100%) 140 (100%) 140 (100%) 8.2. Análise Estatística A porcentagem de resultados positivos estimada para o primer COX1 ficou entre 1,4% e 8,5% com um intervalo de confiança de 95%. Da mesma forma, para o primer FhCO1, a porcentagem estimada de resultados positivos ficou entre 0% e 3,3% dentro de um intervalo de 95%. O teste de qPCR demonstrou uma variação de 37,5% a 54% com um intervalo de confiança de 95%. O teste de qPCR apresentou uma positividade de 45,7%, enquanto os testes de PCR com o primer COX1 e PCR com o primer FhCO1, apenas 5% e 1,4%, respectivamente. O valor de p foi estimado em p < 0,001, o que significa que a probabilidade de o resultado observado ser devido ao acaso é inferior a 0,1%. Isso evidencia que há uma diferença significativa tanto entre os testes de PCR e qPCR, quanto entre os primers COX1 e FhCO1. O maior número de amostras positivas foi encontrado nas cidades de Lençóis Paulista e Vargem (80%), Presidente Alves (59%) e Itaí (47,1%). Quatro cidades não obtiveram nenhum caso confirmatório para nenhuma das técnicas avaliadas, sendo Avaí, Colombia, Sabino e São José do Barreiro. 36 Quadro 2. Número de animais positivos e negativos para Fasciola hepatica por município, segundo método e intervalo de confiança de 95% para o total de amostras positivas. Procedência PCR primer COX1 PCR primer FhCO1 qPCR Total de amostras Avaí 7 Prevalência % 0 0 0 100% Avaré 1 3 Prevalência % 33,3% 0 0 100% Bariri 4 4 10 Prevalência % 40% 0 40% 100% Bauru 1 7 Prevalência % 0 0 14,3% 100% Colombia 5 Prevalência % 0 0 0 100% Itaí 8 16 Prevalência % 0 0 47,1% 100% Itaporanga 3 7 Prevalência % 0 0 42,9% 100% Lençóis Paulista 8 10 Prevalência % 0 0 80% 100% Presidente Alves 13 22 Prevalência % 0 0 59% 100% Riversul 2 13 23 Prevalência % 0 8,7% 56,5% 100% Sabino 1 Prevalência % 0 0 0 100% São José do Barreiro 1 Prevalência % 0 0 0 100% Sta Cruz Rio do Rio Pardo 6 18 Prevalência % 0 0 33,3% 100% Vargem 2 8 10 Prevalência % 20% 0 80% 100% Total 7 2 64 140 Prevalência por exame % 5% 1,4% 45,7% 100% IC de 95% [1,4 ; 8,5] [0,0 ; 3,3] [37,5 ; 54] 37 8.3. Análise espacial Quatro municípios (28,6%) dentre as quatorze pesquisadas apresentaram todas as amostras negativas para as técnicas de técnicas de cPCR ou qPCR. Foram eles: Avaí, Colombia, Sabino e São José do Barreiro. As outras dez cidades (71,42%), apresentaram uma ou mais amostras positivas para um dos exames. Os municípios que revelaram maior número de positivos na qPCR foram Lençóis Paulista e Vargem, com 80% de suas amostras positivas (8 de 10 amostras avaliadas). Ao comparar as duas técnicas, foi possível visualizar que as amostras 86, 87, 125, 142,143, 144 e 145 coincidiram em positividade entre as técnicas de qPCR e o primer COX1 da PCR. O mesmo aconteceu com as amostras 125 e 128, que foram positivas tanto na qPCR, quanto na PCR, essa última com o primer FhCO1. Pelo georreferenciamento, observou-se os resultados dos exames e sua distribuição, por município, em cada mapa. Os mapas com as localizações geográficas estão representados a partir da Figura 5 até a Figura 9. 38 Figura 5. Localização do Brasil na América do Sul, evidenciando o estado de São Paulo e os municípios de procedência dos animais para a pesquisa de Fasciola hepatica. 39 Figura 6. Mapa do estado de São Paulo evidenciando a localização dos municípios de procedência dos animais para a pesquisa de Fasciola hepatica. 40 Figura 7. Mapa do estado de São Paulo com destaque para amostras positivas para Fasciola hepatica à PCR e seu respectivo município. Em vermelho, sete amostras positivas ao primer COX1 - Avaré (1), Bariri (4) e Vargem (2). Em amarelo, amostras positivas ao primer FhCO1 – Riversul (2). 41 Figura 8. Mapa do estado de São Paulo com as amostras positivas para Fasciola hepatica destacando os municípios de origem das 64 amostras positivas pela técnica de qPCR – Bariri (4), Bauru (1), Itaporanga (3), Itaí (8), Lençóis Paulista (8), Presidente Alves (13), Riversul (13), Santa Cruz do Rio Pardo (6), Vargem (8). 42 Figura 9. Mapa dos municípios do estado de São Paulo e comparação das amostras positivas para Fasciola hepatica pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase para os dois pares de primers (em amarelo, o primer FhCO1 e em vermelho, o primer COX1) e pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR), destacado na cor laranja. 43 9. DISCUSSÃO As perdas econômicas e reprodutivas resultantes da infecção por F. hepatica frequentemente não recebem a devida atenção ou são confundidas com outras enfermidades, o que pode acarretar a subnotificação de sua ocorrência no estado de São Paulo. A fim de auxiliar em seu diagnóstico e trazer luz à sua importância como problema de saúde pública, procedeu-se a pesquisa molecular de F. hepatica a partir de amostras de fígado bovino coletadas ainda na linha de abate no interior da região Centro-Oeste paulista, pela técnica de PCR e pelo exame de PCR em tempo real, bem como a distribuição dos casos pelo georreferenciamento em mapas do estado de São Paulo, Brasil. Os resultados positivos dos exames de PCR e PCR em Tempo Real obtidos nesse estudo sugerem a dispersão da F. hepatica no interior do centro- oeste paulista, no universo amostral pesquisado. Fasciola hepatica foi detectada pela primeira vez no Brasil em 1918 em bovinos e ovinos do Rio Grande do Sul (NEVES, 2005). Após isso, sua circulação em bovinos foi descrita em 1921 em trabalho publicado por Adolfo Lutz, que confirmou a suspeita de fasciolíase pelo exame de decantação de ovos extraídos da bile e das fezes desses animais, na Barra do Piraí, Rio de Janeiro. A época, Adolfo Lutz observou a ausência da F.hepatica e de caramujos Lymnaea em São Paulo e no Norte do país, o que sugere que a doença não havia se disseminado para essas regiões. A presença do parasita no estado de SP permaneceu sem registros oficiais até 1967, quando o pesquisador França (1967), divulgou trabalho comprovando a existência de bovinos infectados com F.hepatica na região do Vale do Paraíba entre São Paulo e Rio de Janeiro. França verificou que 10% das fezes examinadas continham ovos do helminto, e com isso declarou pela primeira vez a presença da doença no estado. A predominância de casos notificados no estado de São Paulo encontra- se no Vale do Paraíba. Esse fato é corroborado pela existência de um maior 44 número de pesquisas feitas nessa região (LUTZ, 1921; DOS SANTOS, VIEIRA; 1967; FRANÇA, 1967). Após o estudo de França (1967), pessoas e animais domésticos da região do Vale do Paraíba (municípios de Taubaté, São Luiz do Paraitinga, Redenção da Serra, Caçapava, Paraibuna, Natividade da Serra e Jambeiro) foram examinadas em busca de novos casos de fasciolíase. Nesse mesmo ano, ficou comprovado por exame coproparasitológico e pela presença do caramujo do gênero Lymnaea nas regiões pesquisadas, a existência da F. hepatica e sua transmissão autóctone humana e animal, no estado de São Paulo, com sete casos humanos confirmados (DOS SANTOS; VIEIRA, 1967). A infecção humana acontece por meio da ingestão de metacercárias em água ou hortifruti contaminados. Entretanto, não se descarta outras formas de transmissão, como por exemplo, pelo consumo de fígado cru e migração da metacercária. Essa forma costuma ocorrer em países onde há o hábito de ingestão de alimentos crus. As pessoas mais susceptíveis são aquelas que habitam zonas rurais onde geralmente compartilham a fonte de água com animais domésticos (MAS-COMAS et al., 2019). As mudanças climáticas, atribuídas ao aquecimento global, podem estar modificando o ciclo de transmissão da doença e consequentemente aumentando gradativamente o número de casos em pessoas desde os anos 80. Esse fato pode ser explicado devido a modificação do ciclo natural da Fasciola, que sofre adaptações quando há maior disponibilidade de chuvas, além da irrigação de plantações e cultivos em locais não explorados anteriormente, sendo a água um meio essencial para propagação do parasita (MAS-COMA et al., 2009). A fascioliase já foi reportada em 51 países ao redor do mundo, nos 5 continentes. Estima-se que 17 milhões de pessoas possam estar infectadas, com os relatos de de 2500 casos em 1990 para 2,4 milhões em 2019 (MAS-COMAS et al., 2019). O estado de São Paulo faz divisa com os estados de Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná e Rio de Janeiro (IBGE, 2021). Essas regiões possuem características geográficas e climáticas semelhantes, podendo oferecer condições adequadas para a sobrevivência e reprodução do parasita. 45 A presença de animais silvestres infectados com F. hepatica próximos aos bovinos também é um fator importante na disseminação do helminto, fato observado por Martins et al. (2021), no estado do Estado do Espirito Santo (Brasil), onde comprovou-se a presença do parasita em fezes de capivaras. Essa, por sua vez, atua como reservatório silvestre, possivelmente contribuindo para a expansão geográfica deste agente zoonótico. No estado de São Paulo, Labruna et al. (2018) descreveram um surto de fasciolíase em capivaras do Parque Alberto Lofgren, na cidade de São Paulo. Durante um ano, houve uma queda na população de capivaras, que contava com 12 a 13 indivíduos, para apenas dois. Seis capivaras foram submetidas a necropsia para avaliação da causa das mortes. Foi possível observar que esses animais apresentaram lesões graves no fígado e presença de vermes hepáticos da espécie F.hepatica. O exame de fezes das cinco capivaras restantes detectou ovos do mesmo verme. Esse resultado sugere que apesar das infecções por esse parasita não sejam comuns na região, esse grupo de animais ainda é vulnerável a surtos letais da doença. Outro estudo realizado por Dracz et al. (2016) em Confins, Minas Gerais, Brasil, verificou a presença de ovos de F. hepatica a partir de fezes frescas de capivaras próximo a lagos, o que possibilita a expansão e distribuição geográfica da fasciolíase na região, necessitando-se de controle epidemiológico para esta zoonose. Em relação ao estado do Paraná, Kouba et al. (2005), buscaram determinar a prevalência de ovos de F. hepatica e parasitas intestinais, e a presença de caramujos no habitat utilizado pelas ferais nútrias (Myocastor coypus), também conhecidas como ratão-do-banhado, em uma área protegida em Curitiba, Brasil. Foram examinadas as fezes de 16 nútrias e os resultados demonstraram a prevalência geral de fezes de nove animais (56,25%) contendo ovos do parasita. Os caramujos encontrados foram Physa cubensis, Physa marmorata e Biomphalaria tenagophyla. Isso demonstra que as nútrias infectadas podem servir como fonte de infecção para outros animais, humanos e contaminação para a água. 46 A movimentação de animais entre os estados que fazem fronteira com São Paulo é comum, seja para fins de criação ou comércio. Isso aumenta o risco de disseminação da infecção, uma vez que animais infectados podem albergar o parasita e contaminar novas áreas. A vigilância nesses locais é essencial para monitorar a presença da F.hepatica, identificar áreas de maior risco, implementar medidas de controle adequadas e prevenir a disseminação da infecção. Isso pode envolver a realização de exames parasitológicos em animais, monitoramento da qualidade da água e programas de educação e conscientização para os criadores de animais e a população em geral. Há um histórico bem descrito de relatos sobre casos de infecção por F. hepatica humana e animal no país, datados desde o início do século XX. Foram relatados 48 casos de fasciolíase humana no Brasil desde 1958. A maioria dos casos (43,7%) ocorreu na região Sul do país, seguida pela região Sudeste (25%) e Norte (23%) (PRITSCH; MOLENTO, 2018). O caso mais recente registrado no Brasil foi descrito por Pritsch et al. (2019), que relataram o primeiro caso de fasciolíase humana no estado de Santa Catarina, Brasil. Uma paciente de 57 anos com dores abdominais foi diagnosticada com F. hepatica por meio de ultrassom e ELISA indireto. Apenas 4,2% dos casos humanos ocorreram no Nordeste e Centro-Oeste. Os estados com o maior número de casos relatados foram Paraná (20), seguido por Amazonas (11) e São Paulo, com sete casos (PRITSCH; MOLENTO, 2018). Estudos relacionados à presença e ocorrência da doença no país são desigualmente distribuídos. Existe um maior número de registros publicados nos estados do Sul do Brasil, onde o impacto econômico é mais evidente, tendo em vista que o maior número de casos concentra-se no estado do Rio Grande do Sul. Entretanto, isso reflete na baixa quantidade de publicações sobre a presença da parasitose não só no estado de São Paulo, como no restante do país (BENNEMA et al., 2014). Em revisão de literatura sobre a expansão geográfica da F. hepatica e sua disseminação no Brasil, após reunir diversos estudos publicados no país, 47 Oliveira; Resende (2017) concluíram que o clima é uma limitação para a disseminação territorial do ciclo biológico da fasciolíase. Os primeiros casos foram notificados no início do século XX no Sul do Brasil e apenas no século XXI há os primeiro registros de sua presença na região Norte. Já a região Nordeste apresenta apenas indícios da existência de casos, ainda sem confirmação definitiva. Os dados obtidos sugerem que é uma questão de tempo até que o parasita seja encontrado em todas as regiões, visto a alta gama de hospedeiros definitivos que podem se infectar, mantendo assim, o ciclo na natureza. Esclarecimentos quanto as condições ecológicas, epidemiológicas e climáticas nos municípios mencionados neste trabalho e também no estado de São Paulo, necessitam de maior esclarecimento, tendo em vista a influência clara desses fatores para ocorrência do ciclo completo da Fasciola. É sabido que a presença de água e existência do caramujo Lymanaea são fatores obrigatórios para a ocorrência do ciclo. A pesquisa malacológica deve ser levada em consideração ao realizar medidas de profilaxia e controle do parasita. Mapeando a distribuição da fasciolíase no Brasil, Bennema et al., (2014), agruparam os dados disponíveis no SIF sobre o abate de bovinos entre os anos de 2002 e 2011, e encontraram discrepâncias significativas na prevalência da doença entre os estados. Observou-se que as regiões com maior prevalência de casos no Brasil são as Centro-Oeste e Sul. Nesse mesmo estudo, ficou comprovado que 192 municípios de São Paulo registraram a presença de F. hepatica em fígado de bovinos na inspeção post-mortem, o que gerou a prevalência de 0,09% no estado. Já em 2021, o censo agropecuário do IBGE contabilizou o rebanho do estado de São Paulo em 10.718.494 milhões de cabeças de gado bovino (bois e vacas). Dados disponibilizados pelo site do MAPA (2023) mostram que de fevereiro de 2021 até fevereiro de 2023, foram notificados pelo SIF 4.552 casos de fasciolíase apenas no estado de São Paulo. Segundo esse resultado, a prevalência estimada atualmente para F. hepatica no estado de SP é de 0,42%. No presente estudo, as prevalências encontradas no universo amostral pesquisado variaram de acordo com cada município, ultrapassando a média 48 estadual, como o caso da cidade de Lençóis Paulista e Vargem, onde 8 das 10 amostras avaliadas (80%) foram positivas para presença de Fasciola no exame de qPCR. Os municípios avaliados neste trabalho, quando comparados, mostram grande variação de prevalências de uma região para outra, que vão de 14,3% à 80%. Para além da variação na quantidade de amostras coletadas em cada cidade, tal fator pode ser atribuído as diferenças ambientais, como índice pluviométrico, temperatura, clima, topografia e perfil do rebanho, além da relação do município com o nível do mar. A relação da fasciolíase com o nível do mar foi tratada por Silva et al. (2020), e correlacionou altitude e clima no estado de Santa Catarina, demonstrando que os casos da doença mantiveram-se elevados o ano todo ao longo das estações, concluindo que a parasitose está mais relacionada à altitude dos municípios quanto ao nível do mar, do que aos índices pluviométricos. Estender esse estudo ao estado de São Paulo pode ajudar a entender a distribuição e a presença dos casos aqui encontrados. Ao buscar pela destino final do fígado de bovinos de ambos os sexos entre fevereiro de 2021 até fevereiro de 2023 no site do Ministério da Agricultura (MAPA, 2023), houve condenação total de 4.272 fígados de bovinos acometidos por fasciolíase. O destino final dos fígados utilizados no presente estudo não foi determinado. Condenações hepáticas totais tem alto impacto econômico para o produtor de forma direta e indireta, assim como para os frigoríficos. Diretamente, o matadouro frigorífico perde dinheiro por quilo de fígado condenado. Indiretamente, o parasitismo prejudica o ganho de peso, reduzem a fertilidade, diminuem a imunidade e assim deixam o animal susceptível a outras doenças, e em casos graves pode levar à óbito. Ainda em relação as perdas econômicas, um estudo realizado por Rosa (2016) relativo a inspeção de fígado de bovinos em frigoríficos fiscalizados pelo SIF, entre o período de 2010 a 2014, nos estados da região Sul do Brasil, o mais afetado foi o Rio Grande do Sul. O prejuízo estimado foi de R$ 18.461.718,00 49 milhões pela condenação de fígados bovino. Dos 4.062.788 milhões de bois abatidos no período, 559.446 mil foram condenados por fasciolose. À época, o valor da peça de fígado custava por volta de R$ 33,00. Esses resultados demonstram a grande perda de potêncial econômico e produtivo do rebanho em decorrência da parasitose. Molento et al., (2018) avaliaram o impacto econômico das perdas pela doença no Brasil de 2002 a 2010, por estado. Foi possível visualizar a concentração dos danos nos três estados do Sul, sendo o Rio Grande do Sul o mais afetado, com US$147 milhões de dólares perdidos. Em contraste, em todo o país estima-se um prejuízo de US$ 210 milhões. O estado de São Paulo, por sua vez, teve um rombo de US$114.615 mil por ano com a parasitose, e aparece em quarto lugar; enquanto Minas Gerais desponta em quinto, com US$ 134.140 mil em perdas. Sobre os métodos diagnósticos acessíveis, de acordo com Álvarez et al., (2014), é possível notar que ainda não há métodos sensíveis disponíveis para detecção da infecção por F.hepatica e a diferenciação do estado pré-patente de patente. O exame de PCR em amostras de fezes, considerado altamente sensível e muito específico, é capaz de discriminar infecção atual, porém apenas quando há formas adultas da Fasciola. O diagnóstico definitivo e de alta acurácia para comprovação de F.hepatica é a visualização do parasita no exame post-mortem. Entetanto, esse não é um método de escolha sempre viável, visto que só pode ser utilizado em animais mortos, impedindo a realização do diagnóstico em rebanhos. Outras formas de detecção do parasita podem ser utilizadas, como contagem de ovos nas fezes, copro-ELISA, contagem de ovos em bile, antircorpo sérico ELISA (sELISA) e teste de ELISA para leite (SABATINI et al., 2023; MAZERI et al., 2017). A Reação em Cadeia da Polimerase é comumente utilizada em diferentes países para diferenciar híbridos de F. hepatica e F. gigantica devido a morfometria e aferimento pela localização geográfica do parasita não serem completamente confiáveis (PENG et al., 2009; ICHIKAWA et al., 2016; THANG et al., 2019; KASAHARA et al., 2021). 50 Técnicas moleculares também parecem ser úteis como ferramentas de diagnóstico (MAS-COMAS, 2005). Há vários trabalhos sobre a utilização da qPCR e desenvolvimento de probes para detecção de caramujos infectados com miracídio ou outras formas da F.hepatica (SHUBKIN et al., 1992; HEUSSELER et al., 1993; CUCHER et al., 2006). Apesar de caro, o teste de qPCR oferece alta sensibilidade e especificidade. Cabada et al., (2016) realizaram experimentos que utilizaram qPCR e PCR em amostras de fezes com baixas cargas parasitárias. Os resultados mostraram sensibilidade de 87% e 66% respectivamente. Ambos foram 100% específicos. Os testes ainda mostraram-se eficientes por não ocasionar reação cruzada com outros parasitas cestódeos, trematódeos ou nematódeos, além de detectarem 47% e 26% de infecções que não foram diagnosticadas na microscopia. Semelhante ao encontrado por Cabada et al., (2016), observou-se uma eficácia superior no exame de qPCR quando comparado a PCR. Enquanto a prevalência com a técnica convecional conseguiu detectar entre 14,4% e 5% de amostras positivas (para o primer FhCO1 e COX1, respectivamente), na PCR em tempo real a média de prevalência foi de 45,7%. Esse resultado sugere uma maior acurácia no teste em tempo real. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) preconiza o uso de saneante, como o hipoclorito de sódio (água sanitária), na proporção de 20mL em 1000L de água, para desinfecção de verduras e legumes antes de consumo humano, como forma de prevenção contra patógenos, de acordo com a Lei n° 6.360, de 23 de setembro de 1976 e a Resolução RDC n°59, de 17 de dezembro de 2010. Entretanto, de acordo com estudo realizado por Costa (2020), a utilização de água sanitária em concentrações até dez vezes maior do que a recomendada, não surtiu efeito quanto a destruição e viabilidade das metacercárias, sendo que estas continuaram infectantes para camundongos. Ainda são necessários mais estudos para se encontrar produtos capazes de destruir o parasita nos alimentos. 51 A prevalência da fasciolíase e a detecção molecular de F. hepatica em amostras de fígados de bovinos procedentes de fazendas localizadas em diferentes municípios da região Centro-Oeste Paulista, reforça a necessidade de novas pesquisas sobre o assunto na região, além de programas de controle de moluscos em áreas alagadas próximas ao convívo dos animais. É necessário fortalecer a qualidade e sanidade dos rebanhos para diminuir as perdas econômicas e melhorar as condições sanitárias dos mesmos. Além disso, também indica que pode haver casos subnotificados de infecções humanas nessas regiões, reforçando a necessidade de ações de vigilância epidemiológica rígidas, para o controle desta zoonose. 10. CONCLUSÃO - Os resultados obtidos revelam a importância da avaliação diagnóstica para Fasciola hepatica em bovinos de corte procedentes dos municípios avaliados neste estudo, bem como em outras regiões da federação; - O uso das provas moleculares, em especial a qPCR, foi uma ferramenta diagnóstica efetiva para a identificação dos animais parasitados; - A distribuição a partir dos casos demonstrou que a fasciolíase está amplamente disseminada nos municípios avaliados e sugere um alerta para implementação de programas sanitários em busca da melhoria da sanidade do rebanho de bovinos de corte. 52 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS* ALVAREZ ROJAS, C. A.; JEX, A. R.; GASSER, R. B.; SCHEERLINCK, J.-P. Y. Techniques for the diagnosis of Fasciola infections in animals. Advances in Parasitology, London, v. 85, p. 65-107, 2014. DOI 10.1016/b978-0-12-800182- 0.00002-7. AMER, S.; ELKHATAM, A.; ZIDAN, S.; FENG, Y.; XIAO, L. Identity of Fasciola spp. in sheep in Egypt. 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Acesso em: 12 set. 2022. 57 ZACHARY, J. F. Bases da patologia em veterinária. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2018 *Referências de acordo com a ABNT NBR 6023:2018. 58 ANEXOS 59 ANEXO 1. Documento de aprovação - CEUA - Comitê de Ética Animal. 60 ANEXO 2. Quadro 3. Resultado geral da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR em tempo real (qPCR) para Fasciola hepatica a partir de fígado de 140 bovinos abatidos em frigorífico do Centro-Oeste Paulista e municípios de procedência. ANIMAL PROCEDÊNCIA PCR primer COX1 PCR primer FhCO1 qPCR 1 Riversul Negativo Negativo Negativo 2 Riversul Negativo Negativo Negativo 3 Riversul Negativo Negativo Negativo 4 Riversul Negativo Negativo Negativo 5 Riversul Negativo Negativo Negativo 6 Itaí Negativo Negativo Negativo 7 Itaí Negativo Negativo Negativo 8 Sabino Negativo Negativo Negativo 11 Avaí Negativo Negativo Negativo 12 Avaí Negativo Negativo Negativo 13 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 14 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 15 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 16 Avaí Negativo Negativo Negativo 17 Avaí Negativo Negativo Negativo 18 Avaí Negativo Negativo Negativo 19 Avaí Negativo Negativo Negativo 20 Avaí Negativo Negativo Negativo 21 Colombia Negativo Negativo Negativo 22 Colombia Negativo Negativo Negativo 23 Colombia Negativo Negativo Negativo 25 Colombia Negativo Negativo Negativo 26 Colombia Negativo Negativo Negativo 30 Sta Cruz Rio do Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 31 Sta Cruz Rio do Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 33 Sta Cruz Rio do Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 34 Sta Cruz Rio do Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 61 36 Sta Cruz Rio do Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 37 Sta Cruz Rio do Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 38 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 39 São José do Barreiro Negativo Negativo Negativo 40 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 41 Riversul Negativo Negativo Negativo 42 Riversul Negativo Negativo Negativo 43 Riversul Negativo Negativo Negativo 44 Bauru Negativo Negativo Negativo 45 Bauru Negativo Negativo Negativo 46 Bauru Negativo Negativo Negativo 47 Bauru Negativo Negativo Negativo 48 Bauru Negativo Negativo Negativo 49 Bauru Negativo Negativo Positivo 50 Bauru Negativo Negativo Negativo 51 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Positivo 52 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Positivo 53 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 54 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Positivo 55 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 56 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 57 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Positivo 58 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Positivo 59 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Negativo 60 Sta Cruz Rio Pardo Negativo Negativo Positivo 61 Itaí Negativo Negativo Positivo 62 Itaí Negativo Negativo Negativo 63 Itaí Negativo Negativo Negativo 62 64 Itaí Negativo Negativo Negativo 65 Itaí Negativo Negativo Negativo 66 Itaí Negativo Negativo Positivo 67 Itaí Negativo Negativo Positivo 68 Itaí Negativo Negativo Positivo 69 Itaí Negativo Negativo Negativo 71 Itaí Negativo Negativo Positivo 72 Itaí Negativo Negativo Negativo 73 Itaí Negativo Negativo Positivo 74 Itaí Negativo Negativo Positivo 75 Itaí Negativo Negativo Positivo 76 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 77 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 78 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 79 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 80 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 81 Riversul Negativo Negativo Positivo 82 Riversul Negativo Negativo Positivo 83 Riversul Negativo Negativo Positivo 84 Riversul Negativo Negativo Positivo 85 Riversul Negativo Negativo Positivo 86 Vargem Positivo Negativo Positivo 87 Vargem Positivo Negativo Positivo 88 Vargem Negativo Negativo Negativo 89 Vargem Negativo Negativo Positivo 90 Vargem Negativo Negativo Positivo 91 Vargem Negativo Negativo Positivo 92 Vargem Negativo Negativo Negativo 93 Vargem Negativo Negativo Positivo 94 Vargem Negativo Negativo Positivo 95 Vargem Negativo Negativo Positivo 96 Lençois Paulista Negativo Negativo Negativo 97 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 98 Lençois Paulista Negativo Negativo Negativo 63 99 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 100 Lençois Paulista Negativo Negativo Positivo 102 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 103 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 104 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 105 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 106 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 107 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 108 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 109 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 110 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 111 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 112 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 113 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 114 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 115 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 116 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 117 Presidente Alves Negativo Negativo Negativo 118 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 119 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 120 Presidente Alves Negativo Negativo Positivo 121 Riversul Negativo Negativo Positivo 122 Riversul Negativo Negativo Negativo 64 123 Riversul Negativo Negativo Positivo 124 Riversul Negativo Negativo Positivo 125 Riversul Negativo Positivo Positivo 126 Riversul Negativo Negativo Positivo 127 Riversul Negativo Negativo Positivo 128 Riversul Negativo Positivo Positivo 129 Riversul Negativo Negativo Positivo 130 Riversul Negativo Negativo Negativo 131 Itaporanga Negativo Negativo Positivo 132 Itaporanga Negativo Negativo Negativo 133 Itaporanga Negativo Negativo Negativo 134 Itaporanga Negativo Negativo Negativo 135 Itaporanga Negativo Negativo Positivo 136 Itaporanga Negativo Negativo Negativo 137 Itaporanga Negativo Negativo Positivo 138 Avaré Negativo Negativo Negativo 139 Avaré Negativo Negativo Negativo 140 Avaré Positivo Negativo Negativo 141 Bariri Negativo Negativo Negativo 143 Bariri Positivo Negativo Positivo 144 Bariri Positivo Negativo Positivo 145 Bariri Positivo Negativo Positivo 146 Bariri Positivo Negativo Positivo 147 Bariri Negativo Negativo Negativo 148 Bariri Negativo Negativo Negativo 149 Bariri Negativo Negativo Negativo 150 Bariri Negativo Negativo Negativo *Amostras: 9, 10, 24, 27, 28, 29, 32, 35, 70 e 142 não realizadas. 65 CAPÍTULO 3. Artigo Científico 66 Artigo a ser enviado para a revista Zoonosis and Public Health (Normas de publicação – ANEXO 3) 67 Spatial analysis and molecular evaluation for Fasciola hepatica in cattle 1 slaughtered in a slaughterhouse in the Midwest of São Paulo, Brazil 2 ¹São Paulo State University (UNESP), School of Veterinary Medicine and Animal 3 Science, Brazil 4 Correspondence: 5 Adress: Department of Animal Production and Preventive Veterinary Medicine, School 6 of Veterinary Medicine and Animal Science, Sao Paulo State University (UNESP), 7 Botucatu, SP. Code 18618-681. Road: Professor Doctor Walter Maurício Correa s/n, 8 UNESP Campus de Botucatu - Caixa Postal 560., Zip code: 18.618-681 - Distrito de 9 Rubião Júnior, Botucatu, São Paulo, Brazil. Phone: (+55) (14) 3880-2090. 10 E-mail: simone.b.lucheis@unesp.br 11 Keywords: Diagnosis; Fasciola hepatica; zoonosis; ruminants; slaughterhouse; 12 georeferencing. 13 Abstract 14 Fasciola hepatica (F. hepatica) is a fluke parasite that affects the tissues of animals and 15 humans. This parasite lives mainly in the liver of its hosts, and its transmission cycle 16 involves an intermediate host, the snail of the genus Lymnaea. There is elimination of 17 parasite eggs in the feces of infected animals, contaminating wet places. For the 18 diagnosis in this work, the molecular test of Polymerase Chain Reaction (PCR) was 19 performed, using two pairs of primers for F.hepatica; and real-time PCR (qPCR) with a 20 pair of primers. 140 samples of liver from cattle slaughtered in a slaughterhouse in the 21 Midwest region of São Paulo were used. It was verified that, at PCR, for the two primers, 22 nine of the 140 samples (6.4%) were positive, two (1.4%) with the FhC01 primer pair, 23 and seven (5%) with the FhC01 pair of primers. of COX1 primers. By the qPCR 24 technique, with SSCPFaF and SSCPFaR primers, sixty-four (45.7%) demonstrations 25 were positive for F. hepatica. It was possible to observe positive positive procedures in 26 the cities of Vargem and Lençóis Paulista, with positivity of 80%, respectively. Four 27 municipalities had all samples negative for the detection of F. hepatica. The use of 28 molecular tests, especially qPCR, allowed the knowledge of epidemiological data on 29 fascioliasis in the studied sample universe and suggested an alert for the implementation 30 of sanitary programs in search of the improvement of the health of the herd of beef cattle 31 of the evaluated properties. 32 Keywords: Diagnosis; Fasciola hepatica; Zoonosis, Ruminants; Public Health; 33 Georreferencing. 34 Impacts 35 - The results obtained reveal the importance of the diagnostic evaluation for Fasciola 36 hepatica in beef cattle from the municipalities evaluated in this study, as well as from 37 other regions of the federation. 38 - The use of molecular tests, especially qPCR, was an effective diagnostic tool for the 39 identification of parasitized animals. 40 - The distribution based on the cases showed that fascioliasis is widely disseminated in 41 the evaluated municipalities and suggests an alert for the implementation of sanitary 42 programs in search of improving the health of the beef cattle herd. 43 44 mailto:simone.b.lucheis@unesp.br 68 1. Introduction 45 Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758), is a parasite of the Phylum Plathelminth, Class 46 Trematoda (leaf-shaped), Order Digenea and Family Fasciolidae. It has an indirect cycle, 47 that is, the sexual or asexual generations parasitize alternate hosts (Bowman, 2010). Its 48 main intermediate host are snails, especially those of the genus Lymnaea, Galba, 49 Fossaria and Pseudosuccinea (CDC, 2019). 50 This parasite affects different organs, but mainly the liver and bile ducts of several 51 species of mammals, such as sheep, buffaloes, horses, swine and camelids (WHO., 52 OIE., FAO., 2021). 53 The parasite is distributed in more than 70 countries, especially in places where sheep 54 or cattle are raised. Human cases have been reported in Latin America, the Middle East, 55 the Caribbean, Asia, Africa, parts of Europe and rare cases in Australia. There are two 56 species capable of infecting people, Fasciola hepatica and Fasciola gigantica 57 (F.gigantica), the latter being more commonly identified in Africa and Asia. The disease 58 is considered more common in animals, however, the number of records of human cases 59 living in developing nations is considered of great importance and must be taken into 60 account (CDC, 2019). 61 The first report on the circulation of this parasite in Brazil was made by Adolfo Lutz in 62 1921, who detected it when observing the altered liver of slaughtered sheep and cattle, 63 in addition to the presence of a species of Lymnaea. These animals came from Barra do 64 Piraí, on the Vale do Paraíba between São Paulo and Rio de Janeiro. 65 Regarding the life cycle, adult F. hepatica establishes itself in the bile ducts and liver of 66 mammals, which are the definitive hosts. The eggs are carried by the bile to the lumen 67 of the intestine and are then eliminated in the feces. These eggs, in turn, only become 68 infective in the form of ciliated larvae (miracidia), when in contact with water (Bowman, 69 2010).The miracidium, when finding an intermediate host, penetrates the snail of the 70 genus Lymnaea, where it loses its ciliated surface, and migrates to the digestive glands 71 of the same, establishing itself in the form of a sporocyst. 72 The sporocysts transform into rediae on the tissues of the snail. The young forms, called 73 cercariae, are the next evolutionary phase of F. hepatica. The cercariae leave the reins 74 and abandon the snail to live free in the water, swimming in search of plants where they 75 can settle in the water. At this stage, they lose their tail and become the infective form for 76 people and animals, the metacercariae, which is ingested in contaminated water or 77 during grazing. Under suitable conditions, the life cycle of F. hepatica can be considered 78 complete in three to four months (Bowman, 2010). 79 Given the large number of definitive hosts, it is possible to observe how adaptable and 80 ecologically versatile this helminth is, which explains its incredible geographic 81 dispersion (Oliveira; Resende, 2017). 82 Article types 83 2. Materials and Methods 84 This study was approved by the Ethics Committee (CEUA) of the Botucatu School of 85 Veterinary Medicine and Animal Science of the São Paulo State University 86 (FMVZ/UNESP), under registration number 0047/2021. 87 One hundred and forty samples of liver from cattle previously slaughtered were evaluated 88 in a slaughterhouse located in the Midwest region of São Paulo. The choice of animals 89 69 was random, without discrimination of sex, race or age, considering only animals from 90 properties in the State of São Paulo, Brazil, located in fourteen different municipalities. 91 2.1 Collection and storage of biological samples 92 The liver samples were collected with scissors and metal tweezers sterilized in 70% 93 alcohol at the time of each collection, and the tissue fragments were identified with the 94 animal's record and wrapped in aluminum foil, being packed in a refrigerated thermal box 95 and sent to the laboratory for the analyses. 96 2.2 Processing of biological samples 97 From the tissue sample, aliquots of 1 gram of liver were weighed on an analytical balance 98 and, in a laminar flow hood, the samples were aliquoted into microtubes containing 200 99 microliters of PBS pH 7.6 and stored in a freezer at -20°C until its processing. 100 In a laminar flow hood, the next step in sample processing was the preparation of 101 inoculum for subsequent DNA extraction. Thus, the liver fragments were removed from 102 the microtubes and macerated. After maceration, 2 mL of Buffered Saline Solution (SST) 103 pH 7.6 were added, pipetting 1,000 microliters of the supernatant into two microtubes 104 free of DNAse and RNAse (1 mL for each one), identified and kept in a freezer at - 20 °C 105 until DNA extraction was performed. 106 2.3 PCR Assays 107 Two pairs of primers were tested in conventional PCR. Primers of the first pair were 108 described by Cucher et al., (2006), which amplify the 405 bp region of the cytochrome c 109 oxidase subunit 1 gene (gene position corresponds to nucleotides 1888-3420 of 110 X15613.1), as follows: FhCO1F (5`TATGTTTTGATTTTACCCGG-3`) and FhCO1R 111 (5`ATGAGCAACCAAACCATGT-3`) R. 112 The second pair of primers was described by Sarkari et al., (2018) and was composed 113 of 438 bp fragments of the mitochondrial gene COX1 and a 535 bp fragment of the 114 mitochondrial gene nad1, described below: 5'-ACGTTGGATCATAAGCGTG-3' F & 5′-115 CCTCATCCAACATAACCTCT-3′ R. PCR reactions were performed in 0.2 mL 116 microtubes with total volumes of 25 μl, with 2.5 μl of MgCl2 (1.5 mM), 0.5 μl of dNTP 117 solution (0.2 mM), 0 .5 μl of Taq Platinum DNA