UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp 
 

 

 

 

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
MICROBIOLOGIA APLICADA 

 

 

 

 

SELEÇÃO DE SÍTIO DE DIVISÃO EM XANTHOMONAS CITRI SUBSP. 
CITRI: CARACTERIZAÇÃO DE MINC. 

 

 

 

 

 

GIORDANNI CABRAL DANTAS 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tese apresentada ao Instituto de 

Biociências do Campus de Rio 

Claro, Universidade Estadual 

Paulista, como parte dos 

requisitos para obtenção do título 

de Doutor em Ciências Biológicas 

. 

Novembro - 2015 



 

Dantas, Giordanni Cabral
       Seleção de sítio de divisão em Xanthomonas citri subsp.
citri : caracterização de minC / Giordanni Cabral Dantas. -
Rio Claro, 2016
       99 f. : il., figs., gráfs.

       Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista,
Instituto de Biociências de Rio Claro
       Orientador: Henrique Ferreira

       1. Biologia molecular. 2. Expressão gênica. 3. Septo. 4.
Divisão celular. 5. GFP. 6. minC. I. Título.

 
574.88
D192s

	 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP



GIORDANNI CABRAL DANTAS 

 

 

 

SELEÇÃO DE SÍTIO DE DIVISÃO EM XANTHOMONAS CITRI 

SUBSP. CITRI:CARACTERIZAÇÃO DE MINC. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Rio Claro – SP 

2016 

Tese apresentada ao Instituto de 

Biociências do Campus de Rio 

Claro, Universidade Estadual 

Paulista, como parte dos requisitos 

para obtenção do título de Doutor 

em Ciências Biológicas 



  



Agradecimentos 

 Primeiramente quero agradecer aos meu pais Taunaí e Wanda, pois sem eles não 

estaria aqui realizando esse trabalho. Agradecê-los por me compreenderem em não 

poder participar das ultimas festas natalinas e por não estar presente em seus 

aniversários e num dos momentos mais difíceis da minha vida, quando descobrimos que 

meu pai estava com câncer. 

 Quero agradecer imensamente ao meu orientador Henrique, pelo grande 

aprendizado que foi esses últimos 3 anos que passamos juntos, pela IMENSA paciência 

que teve comigo e por ter me aceitado como orientando que caiu de para-quedas no 

laboratório dele,  que mais uma vez estava de mudança. Mas o que eu mais agradeço-

lhe foram por todos os puxões de orelhas que levei (alguns extremamente bem 

colocados). 

 Aos meus colegas de laboratórioDaniel e Fernanda (ICs que nunca vou 

esquecer), Abigail (Biga linda do meu S2), Lúcia pelo auxílio com as queridas 

plantinhas da estufa e a Luana por fazerem parte do meu dia a dia, pela conversas e 

pelos cafés na copa em momentos vagos. E um grande agradecimento mais que especial 

a Lilian, que juntos começamos praticamente do 0 pois tivemos que montar o 

laboratório junto com o Henrique, por ter me aturado e me dado conselhos maravilhosos 

que levarei para o resto da minha vida. 

 Ao Vlamir, um grande amigo que me deu a mão. Você, meu amigo, me ajudou 

quando eu não conhecia ninguém aqui em RC e que sempre vai morar aqui no S2. 

 Agradecer ao Paulo Ávila por todas as conversas científicas, pelas discussões de 

metodologias, pelas viagens a Piracicaba para irmos ao shopping só pra bater perna e 

conversar besteiras. Você, Paulo, é mais um que mora aqui no S2. 



  Adriano, obrigado pelos socorros que me deu sobre química, pelos cafés 

já prontos, pelas conversas e pelo natal que passei com sua família. 

 Agradeçobastante aos colegas de departamento Rafinha, Paola, Mariana, 

Viviane,  Mirella, Juliane, Edmara, Vinicius, Luciana, Susan, Dayane, Marina Vitti e 

Marina Turini  por terem me proporcionado momentos felizes e ótimas conversas nessa 

minha estadia. 

 Quero agradecer imensamente ao Igor e Lorena por fazerem parte da minha 

vida, por me alegrarem, por me chamar pra tomar café ou simplesmente para ir bater 

perna só por que estão entediados. 

 Quero agradecer ao Gustavo Keine por ter entrado na minha vida bagunçar tudo 

e ao mesmo tempo deixar tudo organizado, por me ensinar a gostar de gatos pois sem 

você eu não teria o ser mais precioso da minha vida, a Mirri. E agradecer por estar 

comigo nesses 3 anos de relacionamento que temos estado juntos. 

 E por fim agradecer a UNESP-RC pela estrutura de apoio que me serviu para 

realização desse trabalho e sonho, a CAPES e a FAPESP (processo: 2013/19806-5) pelo 

auxílio financeiro que me foi dado. 

 O meu muito obrigado a todos. 

  



Sumário 

Página 

Capítulo 1 
1. Introdução          8 
1.1 A citricultura e o cancro cítrico      8 
1.2 Xanthomonas citri subsp. citri       11 
1.3 Divisão celular bacteriana       12 
1.4 Sistema MinCDE        16 
1.5 Oscilação do sistema Min       18 
Capítulo 2 
2. Hipótese a ser testada        21 
3. Objetivos          21 
3.1 Objetivos específicos        21 
4. Significância e relevância da proposta      21 
5. Material e métodos        22 
5.1 Linhagens bacterianas e cultivo      22 
5.2 Meio mínimo XAM1 para Xac       22 
5.2.1 Preparo das soluções a serem utilizadas     22 
5.2.2 Composição do XAM1 pH=5,4      23 
5.3 Biologia Molecular        23 
5.4 Vetores de expressão        23 
5.5 Knockout gênico         27 
5.6 Amplificação para clonagem e diagnóstico     31 
5.7 SDS-PAGE e Western Blotting       32 
5.8 Microscopia         32 
5.9 Teste de patogenicidade        33 
Capítulo 3 
A Protein Expression System for Tandem AffinityPurification  
in Xanthomonas citri subsp. citri 
Capítulo 4 
6. Resultados e discussão        37 
6.1 Atividade de minCDE em Xac       37 
6.2 Deleção de minC em Xac promove erros de divisão celular   40 
6.3 Mutantes de Xac retém habilidade de colonizar hospedeiro citros  46 
6.4 O gene minC é requerido para uma septação normal em Xac  48 
6.5 Xac∆minC pode ser complementado com GFP-MinC   51 
6.6 GFP-MinC apresenta localização dinâmica em Xac    54 
7. Conclusão          58 
8. Referências         59 
 
 

  



RESUMO 

A citricultura é uma das atividades mais importantes do setor agrícolabrasileiro. A 

incidência de doenças como o cancro cítrico afetasobremaneira a produtividade dos 

pomares. Seu agente etiológico, a bactériaXanthomonas citri subsp. citri (Xac) é capaz 

de infectar todas as espéciescultivadas, não havendo cura para plantas afetadas. O 

controle eficaz para o cancro cítrico constitui a eliminação de plantas infectadas em 

programas rigorosos para conter a propagação da bactéria. No entanto, o relaxamento 

recente nas políticas de combate ao cancro cítrico em áreas como o estado de São Paulo 

– Brasil está contribuindo para uma maior incidência da doença. Neste aspecto, o 

conhecimento da biologia deste patógeno de plantas é de grande importância para o 

desenvolvimento de novas estratégias de controle da doença. No presente 

trabalho,estudamosa função da ORF XAC1226, que apresenta homologia com o gene 

minCde E. coli. Nesta ultima, minCcodifica para uma proteína inibidora da 

polimerização de FtsZ e com função de seleção de sítio de montagem do anel de divisão 

celular. MinCxac demonstrou ter uma função semelhanteque seus homólogos em 

Escherichia coli e Bacillus subtilis.Para fazer a caracterização funcional de minC de 

Xac fizemos sua deleção, que resultou nos fenótipos de filamentação e minicélula, que 

são encontrados em E. colie B. subtilise notamos que o mutante Xac∆minC apresenta 

ramificações que podem estar relacionadas a um posicionamento errôneo do septo. 

Posteriormente investigamos o padrão de localização sub-celular de GFP-MinC em Xac 

e percebemos um padrão de acúmulo da proteína num dos polos e um tempo depois esse 

acúmulo oscilava para o polo oposto demonstrado o mesmo padrão de oscilação como é 

observado em E. coli. Em seguida verificamos se Xac∆minC perdia a capacidade de 

infectar os hospedeiros e inoculamos em folhas de laranja pera. Constatamos que 

Xac∆minC era capaz de induzir o cancro nas folhas. Concluímos que Xac utiliza o 



sistema minCDE como controlador de posicionamento de septo, que a deleção não 

altera a virulência e que MinC apresenta o mesmo padrão de oscilação como em E.coli. 

Palavras chave: GFP-MinC, divisão celular, septo, FtsZ, minC. 

  



ABSTRACT 

Citriculture is one of the most important activities of Brazilian agriculturalsector. The 

incidence of diseases such as citrus canker affectsdrastically the orchards productivity. 

Its etiologic agent, the bacteriumXanthomonas citri subsp. citri (Xac) is able to infect all 

citric cultivars, withoutany treatment to the diseased plants.Effective control for citrus 

canker is the elimination of infected plants in rigorous programs to contain the spread of 

the bacteria. However, the recent relaxation in the policies against the fight of citrus 

canker in areas such as the state of São Paulo - Brazil is contributing to the further 

spread of the disease. The knowledge of the biology of this pathogen and also the 

mechanisms involved in plant-pathogen interactions are great worth in supporting the 

development of new strategies to deal with this disease.In this aspect, the knowledge of 

the biology of the plant pathogen is of great importance for the development of new 

strategies of control of the disease. In this paper, we study the function of ORF 

XAC1226, which has homology to the minC gene of E. coli. minC encodes an inhibitor 

protein of FtsZ polymerization and the cell division ring mounting site selection 

function. MinCxac shown to have a similar function as their counterparts in Escherichia 

coli and Bacillus subtilis. To make the functional characterization of Xac’s MinC we 

made a deletion which resulted in phenotypes of minicell and  filamentation, which are 

found in E. coli and B. subtilis and we noticed that the mutant Xac∆minC has branches 

that may be related to a wrong position of the septum. Subsequently we investigated the 

pattern of sub-cellular GFP-MinC in Xac and noticed a protein accumulation pattern in 

one of the poles and a while after this protein oscillated to the opposite pole showing the 

same pattern of oscillation as observed in E. coli. Then we check if Xac∆minC lost the 

ability to infect the host and we inoculated it in sweet orange leaves. We found that 

Xac∆minC was able to induce cancer in leaves. We conclude that Xac uses minCDE 



system as septum positioning controller, which deletion does not alter virulence and 

MinC has the same oscillation pattern as E. coli. 

Keywords: GFP-MinC, cell division, FtsZ, septum, minC. 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 1 
  



1.INTRODUÇÃO 

 

1.1 A citricultura e o cancro cítrico 

O Brasil é atualmente um dos maiores produtores mundiais de cítricos detendo 

aliderança mundial na produção e exportação de suco de laranja (Neves, 2011). 

Aatividade citrícola brasileira gera mais de 230 mil postos de trabalho, correspondendo 

auma massa salarial de R$ 676 milhões anuais. Pragas e doenças foram responsáveis 

pelaerradicação de 40 milhões de plantas na última década, sendo a sanidade um 

dosmaiores desafios desse setor econômico. Dentre as principais doenças da cultura está 

ocancro cítrico, para a qual não há métodos de controle curativo ou que resultem 

emcontrole efetivo com baixo custo financeiro. 

Vale ressaltar que, o processamento da laranja gera outros subprodutos de valor 

agregado como óleos, pectina, farelo e álcool. A pectina, por exemplo, é um 

polissacarídeo de monômeros de ácido galacturônico que possui propriedades 

geleificante e espessante muito apreciadas nas indústrias alimentícia e farmacêutica 

(Sriamornsak, 2003). Da casca da laranja também se extrai um óleo essencial, do qual é 

separado o D-Limoneno, um monoterpeno monocíclico (hidrocarboneto) com 

propriedades aromatizante e flavorizante de uma ampla gama de aplicações, como 

formulações cosméticas, alimentícias, farmacêuticas, solventes orgânicos 

biodegradáveis e síntese química do mentol e carvona (Demyttenaere &Kimpe , 2001). 

O cancro cítrico é uma doença causada pelas bactérias Xanthomonas citri subsp. 

citri (Xac) (Schaad et al., 2005; Schaad et al., 2006).Dentre estas, Xac é responsável 

pelo cancro cítrico asiático ou cancrose do tipo A, queconstitui a forma mais severa da 

doença e que acomete todas as variedades e espécies decitros, representando um dos 

mais graves problemas para esta cultura ao redor domundo. Introduzida no Brasil em 



1957 na região de Presidente Prudente (Bitancourt,1957), esta bactéria é altamente 

contagiosa, podendo resistir no ambiente como epífita,sendo dispersa naturalmente pelo 

vento ou chuva e podendo penetrar na planta porqualquer tipo de abertura natural 

(estômatos) ou ferimentos (Gottwald et al., 2002). 

Os sintomas do cancro cítrico constituem-se por lesões circulares, corticosas 

esalientes, de coloração marrom e aspecto eruptivo, ocorrendo em folhas, ramos e 

frutos.Nas folhas e frutos é comum o aparecimento de um halo amarelo circundando a 

áreanecrosada. Em estágios mais avançados, pode ocorrer perda de folhas, queda de 

frutos e 

ressecamento dos ramos (Stall & Seymour, 1983; Das, 2003).Os sintomas do cancro são 

lesões nas folhas, frutos e ramos (Figura 1). Nas folhas e frutos ocorrem pequenas 

manchas amarelas e circulares que, com o passar do tempo, aumentam de tamanho 

adquirindo uma coloração parda circundada por um halo amarelado (Gottwald et al., 

2002). Esses sintomas são possivelmente decorrentes da degradação da clorofila e 

pectina (Gottwald et al., 2002). Nos ramos as lesões são em forma de grandes crostas de 

cor parda (Figura 1c). Com o progresso da doença, as lesões podem acelerar a queda de 

folhas e frutos por conta do aumento da produção de etileno em resposta ao estresse 

biótico (Gottwald et al., 2002). 

 

Figura 1. Lesões de cancro cítrico causadas por Xanthomonas citri subsp. citri. 

 

A) folhas, B) fruto e destaque para a lesão corticosa, C) ramo. Fonte: FUNDECITRUS, 2015a. 



 

 A propagação da bactéria se dá através do filme de água que serve como 

caminho entre uma planta e outra. Chuva, em conjunto com ventos, também ajuda na 

penetração da bactéria através dos estômatos de tecidos jovens, sendo considerado o 

principal agente de dispersão a média distância (Galli, 1980; Gottwald et al., 2002). 

Gotículas de água são transportadas pelo vento por uma distância de aproximadamente 

6 metros, carregando a bactéria aderida através de uma mucilagem (goma xantana) 

produzida por ela, motivo pelo qual a doença é mais comum em regiões tropicais do que 

em regiões de clima seco (Milind, 2003). 

 Um dos fatores que pode favorecer a disseminação do cancro cítrico a partir de 

plantasdoentes é a larva minadora dos citros Phyllocnistis citrella Stainton 

(Lepidoptera:Gracillariida), cuja constatação se deu em março de 1996 na região de 

Limeira (SP) eque rapidamente se espalhou pelo país (Chagas et al., 2001). 

A erradicação de plantas sintomáticas e das suspeitas de infecção ainda é 

aprincipal forma de controle no estado de São Paulo (Belasque Jr. et al., 2009). Em 

junho de 2009, houve alteração da legislação para controle da doença neste estado,tendo 

sido revogada a obrigatoriedade de se erradicar a totalidade de plantas de umtalhão 

apresentando índice de contaminação por Xac superior a 0,5%. Comoconseqüência 

disto, já foi verificada um aumento na incidência de cancro cítrico em2010, resultante 

dos menores esforços empregados na supressão da doença (BelasqueJr., et al., 2010). 

Mais recentemente (Resolução SAA - 147, de 31-10-2013), houve nova alteração de 

legislação na qual não é mais obrigatório fazer a erradicação das plantas que estiverem 

em um raio de 30 metros de uma planta contaminada com cancro cítrico. Passa a adotar-

sea eliminação da planta contaminada e pulverização com cobre das plantas no raio de 

30 metros.Assim, estratégias de controle mais eficazes e menos custosastornaram-se 

ainda mais necessárias para a manutenção da competitividade dacitricultura brasileira.  



No estado do Paraná, uma alternativa as medidas de erradicação tem sido o 

manejo integrado para previnir ou diminuir o cancro cítrico (Behlau et al., 2007, 2008, 

2010). O Manejo Integrado envolve três aspectos: 1) determinarcomo o ciclo vital de 

um patógeno precisa ser modificado, de modo amantê-lo em níveis baixos;2) combinar 

o conhecimento biológico com a tecnologia disponível para alcançara modificação 

necessária; 3) desenvolver métodos de controle adaptados às tecnologias disponíveis 

ecompatíveis com aspectos econômicos e ecológico-ambientais (Geier, 1966). 

 

1.2 Xanthomonas citri subsp. citri 

Anteriormente classificada como Xanthomonas axonopodis pv. citri (Vauterin et 

al., 1995) e reclassificada como Xanthomonas citri subsp. citri (Schaad et al., 2006), 

este patógeno de citros é uma Proteobactéria Gram-negativa, bacilóide, aeróbia e possui 

flagelo unipolar (Gali, 1980). A classificação atual está baseada em análises do espaço 

intergênico 16S-23S, AFLP e re-associação DNA-DNA (Schaad et al., 2005). 

As colônias isoladas em placa apresentam coloração amarelo-alaranjado, 

característica do gênero (do Amaral, 2003). Xac, como ainda é citada na literatura, é o 

agente causal do cancro cítrico asiático ou cancrose do tipo A, que representa a forma 

mais generalizada e grave da doença (Gottwald et al., 2002). 

O sequenciamento completo do genoma de Xanthomonas citri subsp. citri 

desvendou a sequência nucleotídica de um cromossomo de 5.17 Mb, com um conteúdo 

de 64.7% de G+C e de dois plasmídeos: pXAC33 (33.699 pb) e pXAC64 (64.920 pb) 

(da Silva et al., 2002). De 4.313 ORFs anotadas, 2.710 apresentaram homologia com 

genes codificando para fatores conhecidos. As 1.603 ORFs restantes foram classificadas 

como hipotéticas, sendo que destas, 1.272 foram consideradas conservadas por 



apresentarem homologia com ORFs de mesma categoria em outros organismos (da 

Silva et al., 2002). 

A disponibilidade do genoma de Xac tem contribuído para estudos funcionais 

diversos nesta bactéria (Li e Wang, 2012; Guzzo et al., 2013; Huang et al., 2013). Além 

das homologias encontradas entre ORFs anotadas no genoma de Xac e fatores em vias 

metabólicas determinadas, grupos têm se valido das informações do genoma para 

estudar candidatos associados à patogenicidade e interação com o hospedeiro citros. O 

conhecimento do genoma também apoia estudos de mutagênese em larga escala 

utilizando-se transposons e viabiliza a identificação de ORFs/genes envolvidos em 

processos diversos em caracterização (Yan e Wang, 2012). 

 

1.3 Divisão celular bacteriana 

A divisão celular é um processo vital que leva à formação de duas células filhasa 

partir de uma célula progenitora, cada uma contendo uma cópia do material 

genéticoinerente ao organismo em questão. Este processo em qualquer ser vivo é 

altamentecontrolado (genética, bioquímica e fisiologicamente) e faz parte de um 

contínuo dereações que constituem o ciclo celular. Numa visão geral, células, em seu 

tempocaracterístico, duplicam seu material genético, segregam cópias deste material 

paracompartimentos definidos (separação espacial) e finalizam o processo com a 

separação 

física da célula mãe (organismos como bactérias, as células filhas são umaparcela da 

célula progenitora). 

Em procariotos, os modelos Escherichia coli e Bacillus subtilis têm 

sidoexplorados com grande sucesso no estudo dos diversos passos, bem como 

dosconstituintes que compõem a divisão bacteriana (Adams & Errington, 2009, de 



Boer, 2010). Neste processo, uma estrutura, semelhante aos microtúbuloseucarióticos, 

organiza uma maquinaria chamada de divisomo (Goehring & Beckwith,2005), que irá 

coordenar a septação com invaginação da membrana citoplasmáticainterna da bactéria 

(constrição da parede septal), e nova síntese de peptidoglicano nosepto com subsequente 

hidrólise deste, permitindo, assim, a separação definitiva dasduas células novas. Em 

Gram-negativos, ocorre ainda a re-estruturação de umamembrana externa (Gerding et 

al., 2007, Yeh, et al., 2010). 

A formação do divisomo tem início com a polimerização da proteína FtsZ, 

umanálogo funcional distante das tubulinas eucarióticas, que ocorre no citoplasma 

dascélulas em divisão na organização de uma estrutura em forma de anel (anel Z), que 

ficará situada na região mediana das células, próximo e internamente à 

membranaplasmática (Lutkenhaus, 2007). A polimerização de FtsZ dependente deGTP 

ocorre através de sua auto-associação em protofilamentos (Mukherjee &Lutkenhaus, 

1994, Lowe & Amos, 1999), que serão posteriormente ancorados àmembrana mediante 

ação de dois outros fatores, FtsA ou ZipA (Hale & de Boer, 1997,Pichoff & 

Lutkenhaus, 2002). O anel Z ancorado à membrana servirá como arcabouçopara o 

recrutamento de uma dezena de outras proteínas (essenciais) durante a progressãoe 

término da divisão bacteriana (Goehring & Beckwith, 2005, Adams & Errington,2009). 

Tais proteínas, constituintes do divisomo, são responsáveis, entre outras funções,pela 

invaginação de membranas, síntese de peptidoglicano e muito provavelmente 

pelaaferição do status de processos associados como a segregação cromossômica (Barre 

etal., 2001, Thanbichler & Shapiro, 2006, Lutkenhaus, 2007). 

Estudos de microscopia utilizando marcação com moléculas fluorescentes, 

bemcomo imuno-marcação, mostraram que em E. coli parece existir uma seqüência 

linearde recrutamento dos constituintes da maquinaria de formação do septo, na 



seguinteordem: FtsZ > [FtsA, ZapA, ZipA] > (FtsE, FtsX)> FtsK > FtsQ > (FtsB, FtsL) 

> FtsW> FtsI > FtsN >AmiC > EnvC (Vicenteet al., 2006; de Boer, 2010). Proteínas 

entre colchetes são independentes uma dasoutras, mas dependentes de FtsZ para sua 

localização na região mediana da célula;proteínas entre parênteses apresentam 

associação simultânea ao complexo. No entanto,esta linearidade de recrutamento não é 

observada em B. subtilis(revisto por Errington et al., 2003), onde as associações 

proteicas parecem ocorrer em dois passos: FtsA,ZapA, SepF (e provavelmente EzrA) se 

localizam com o anel Z e são dependentes deFtsZ para o recrutamento ao sítio de 

divisão; na sequência, as proteínas que se ligam àmembrana DivIB (seu homólogo em 

E. coli é FtsQ ou FtsQEc), DivIC (FtsBEc), FtsL,PBP2B (FtsIEc), e provavelmente 

FtsW, parecem ser recrutadas de forma conjunta oucooperativa, mas não linear, sendo 

todas estas interdependentes para a localização nosepto. Mutações ou depleções de 

qualquer uma dessas proteínas promovem umimpedimento na associação das demais 

(Errington, et al., 2003). Além das 10 proteínasessenciais citadas acima e que operam na 

montagem do anel Z, existem ainda inúmerasoutras que associadas ao divisomo operam 

funções das mais variadas (de Boer, 2010).Como exemplos, proteínas acessórias como 

ZapA (Gueiros-Filho & Losick, 2002), ZapB, ZapC e ZapD (Ebersbach et al., 2008; 

Durand-Heredia et al., 2011; Hale et al., 2011; Durand-Heredia et al., 2012), atuam 

estimulando eestabilizando a formação do anel Z, e EzrA (Levin et al., 1999) em B. 

subtilis tem afunção de inibir a polimerização de FtsZ. Estas e outras proteínas 

acessórias serviriampara modular a formação do anel Z. 

Toda a maquinaria de divisão celular do anel Z émontada na região mediana da 

célula em divisão. Entretanto, como o divisomo éorientado para esta região e nunca é 

formado nos polos? Dizemos isto porque embactérias, de forma simplificada, as células 

filhas são constituídas por metade da célulamãe da geração anterior e que aumentou de 



volume e sofreu um evento de separação aomeio. Nesta visão, sempre uma das 

extremidades de uma célula filha foi septo nageração anterior. Para controlar a 

montagem correta deste anel na região mediana dascélulas, evitando a formação de anel 

Z nos polos, existem sistemas de organizaçãotemporal/espacial e que garantem uma 

perfeita constrição sem fragmentação doscromossomos em processo de separação. Um 

destes é conhecido por sistema Noc/SlmA (Wu & Errington, 2004; Bernhardt & de 

Boer, 2005) que são proteínas que se ligam eprotegem diversos sítios nos cromossomos 

e evitam o guilhotinamento de materialgenético atuando como inibidores da formação 

de anel Z onde haja cromossomo. Outrosistema denominado MinCD opera no 

posicionamento do anel Z exatamente no meiodas células, evitando a formação de septo 

em outras regiões que não no meio (Hu et al.,1999; Raskin & de Boer, 1999a; Hu & 

Lutkenhaus, 2001). Neste ultimo, MinC é uminibidor da polimerização de FtsZ e sua 

localização sub-celular depende de MinD.MinD possui localização polar dependente de 

MinE em E. coli e DivIVA em B. subtilis(Marston et al., 1998; Raskin & de Boer, 

1999b), que, de forma resumida, recruta MinCpara a região polar onde deve haver 

inibição da formação de anel Z.  

Caloubacter crescentus, que não possue o sistema minCDE e DivIVA, possui 

um fatorconhecido como MipZ e que apresenta homologia a proteínas do tipo ParA que 

tem porfunção impedir a formação do anel em regiões diferentes do meio (Thanbichler 

&Shapiro, 2006). MipZ é um inibidor de FtsZ que possui localização sub-

celulardependente de ParB. Por seguir ParB e consequentemente as origens de 

replicação ondeParB se liga durante a progressão do ciclo celular, MipZ gera uma zona 

quecompreende as origens localizadas nos polos celulares e a montagem do anel Z 

ocorre nocentro das células em divisão.Recente estudo de nosso grupo foi observadoa 



existência de semelhanças entre ossistemas de segregação cromossômica e divisão 

celular de Xac eC. crescentus (Ucci, et al., 2014).  

Xac possui em seu genoma ORFs anotadas como minCDEe pelomenos 5 ORFs 

semelhantes a parA (XAC0192, XAC1907, XAC2205, XAC2433 e XAC3905) (da 

Silva, et al., 2002). Proteínas do tipo ParA estão envolvida comsegregação 

cromossômica em bactérias e operam em conjunto com seus pares ParB(Leonard et al., 

2005). Assim, uma das 5 ORFs anotadas como parApoderia ser o parfuncional de parB 

e realmente, XAC3905 esta em formação de operon com parB deXac (XAC3906). 

Dentre as que restam, poderíamos ter o homólogo de MipZ de C. crescentus, que foi 

identificado em processo que demonstrou homologia a proteínas dotipo parA nesta 

bactéria (Thanbichler & Shapiro, 2006). Dada a semelhança observadaem segregação 

cromossômica e divisão celular entre Xac e C. crescentus (Ucci, et al., 2014), Xac 

poderia ter um homólogo de mipZ? Xac utiliza osprodutos das ORFs anotadas como 

minCDE? 

 

1.4 Sistema MinCDE 

O sistema Min é o responsável pelo posicionamento central do anel Z em E. 

coli(Hu et al.,1999; Raskin & de Boer, 1999a; Hu & Lutkenhaus, 2001) e em B. 

subtilis(Edwards e Errington, 1997; Marston et al., 1998).Em E. coli, este sistema 

codifica  três proteínas MinC, MinD e MinE (Lutkenhaus, 2007),as quais já estão bem 

estabelecidas (Figura 2A). MinC é o inibidor de FtsZ; MinD é o ativador de MinC 

recrutando-o para a membrana e MinE é um regulador do complexo MinCD separando-

os através de sua interação com MinD (Hu et al., 1999; Hu & Lutkenhaus, 2003). 

Foi visto que mutações nos lociminCe minDde E. coli levam a célula a 

apresentar alterações morfológicas como filamentação e minicélula, pois sabe-se que 



MinC tem atividade inibidora de FtsZ e MinD recruta MinC para membrana, desta 

forma a célula perde o controle de septação (de Boer et al., 1989; Raskin & de Boer, 

1999a; Raskin & de Boer, 1999b).Enquanto que ausência em MinE leva a célula a 

formação de filamento, devida a presença do complexo MinCD por toda a membrana 

plasmática. Assim a perda do locus por inteiro apenas causaria formação de minicélulas 

e não seria letal.Contudo apenas a perda de MinE seria letal pois ele removeria o 

controle das restrições espaciais do complexo MinCD (Maroto & Monk, 2008).  

O sistema minCD aparenta ser bem conservado em grande parte das bactérias, 

um exemplo disso são os homólogos de minC e minD encontrados em B. subtilis que já 

foram bem caracterizados (Levin et al., 1992; Varley e Stewart, 1992; Lee e Price, 

1993). Um fato interessante é que B. subtilisnão apresenta MinE como regulador 

espacial de MinCD mas sim a proteína DivIVA que desempenha esse papelneste 

organismo (Figura 2B) (Cha e Stewart 1997; Edwards e Errington1997; Marston et al., 

1998). Assim como em E. coli, mutações em MinC e MinD podem levar a célula a 

expressar fenótipos típicos como minicélulas e filamentação (Marston et al., 1998; 

Marston e Errington, 1999). E foi visto também que alterações em DivIVA  leva ao 

mesmo fenótipo que visto em MinE (Marston e Errington, 1999), mesmo essas 

proteínas sendo completamente diferentes tanto em função quanto em localização 

(Marston et al., 1998). 

  



Figura 2. Sistema minCDE em E. colie minCD DivIVA em B. subtilis. 

 

(A) Em E. coli, MinE move-se em direção ao complexo MinC–MinDem um polo e  

estimula a atividade ATPase de MinD, causando que MinC e MinD movam-se para o polo 

oposto. (B) Em B. subtilis, DivIVA localiza-se nos polos celularese liga-se a MinJ, o qual 

recruta o complexo MinC–MinD.Fonte Rowlett e Margolin, 2013. 

 

1.5 Oscilação do sistema Min 

Uma das características mais marcante do sistema Min em E. colié o seu alt 

mecanismo dinâmico de ação, que foi primeiramente descoberto por Raskin e de Boer 

(1999a e1999b). Em células normais de E. coli, as proteínas Min esstão em constante 

movimento no citoplasma bacteriano, oscilando de polo a polocom um gradiente de 

MinC concentrado nos polos e uma baixa concentração no meio da célula.Como MinC 

é inibidor da polimerização deFtsZ, a divisão celular fica restrita na região da célula 

pois onde se encontra a menor concentração de MinC (Varma et al., 2008). MinC 

associa-se com os filamentos helicoidais de MinD que enrolam-se na superfície interna 

da membrana citoplasmática,começando em um polo e extendendo para o centro da 

célula.MinE liga-se ao complexo helicoidal,aciona a hidrólise de MinD-ATP 



paraMinD-ADP e liberando MinC e MinD da membrana, que depois se difunfem e 

acumulam no polo oposto, onde este processo é repetido (Rothfieldet al., 2005;Shih e 

Rothfield, 2006). 

Este comportamento de oscilação do sistema Min foi visto graças a fusões 

funcionais das proteínas com GFP (Hu e Lutkenhaus, 1999; Raskin e de Boer, 1999a; 

1999b) (como podem ser vistos na Figura 2A).As marcações feitas em MinD e MinE 

mostram que essas duas proteínas são os componentes osciladores enquanto que MinC é 

apenas um passageiro. MinD é uma ATPase que dimeriza-se  e liga-se à membrana na 

presença de ATP e MinE é um indutor da atividade ATPásica de MinD e regulador do 

complexo MinCD (Lutkenhaus et al., 2012). O mecanismo oscilatório tem sido 

elaborado e foram feitos vários modelos (Howard and Kruse, 2005;Lutkenhaus, 

2007).Em B. subtilis o regulador do complexo MinCD é a proteína DivIVA (Marston et 

al., 1998). DivIVA é localizada no polo da célula pois ela apresenta afinidade por 

curvatura(Lenarcic R et al., 2009). O recrutamento de MinC e MinD dar através da 

proteína MinJ que se liga a MinD e DivIVA (Bramkamp, et al., 2008, Patrick & Kearns, 

2008; Rowlett e Margolin, 2013). Devido a sua afinidade por curvatura, DivIVA 

ancora-se nas duas extremidades da célula e mantém um gradiente bipolar de MinC sem 

gasto de ATP e evitando a formação de anel Z nos polos (Rowlett e Margolin, 2013) 

(Figura 2B). 

 

 

 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 2 
  



2.Hipótese a ser testada 

O sistema MinCDE de Escherichia coli é responsável pelo posicionamento do 

septo no centro da célula. Verificou-se que Xanthomonas citrisubsp. citritambém 

apresenta ORFs anotadas como minC, minD e minE. Sabendo disto perguntamos se X. 

citriutiliza sistema semelhante a MinCDE de E. coli para posicionamentode septo em 

divisão celular. 

 

3.Objetivo 

Estudar o papel da ORFs XAC1226 (anotada como minC) no processo de 

divisão celular de Xac. 

 

3.1 Objetivos específicos 

1. Promover a deleção gênica da ORF supracitada e verificar se minCé funcional em 

Xac; 

2. Avaliar a morfologia por microscopia em contraste de fase buscando indícios 

dedefeitos na divisão celular; 

3. Marcar produto de ORF de interesse com GFP para estudos de localizaçãosub-celular 

de fatores in vivo- buscar padrões de localização semelhantes aospropostos para MinC 

de outros organismos e que corroborem aexistência de um destes sistemas em Xac; 

4. Avaliar alteração de virulência. 

 

  



5.MATERIAL E MÉTODOS 

5.1 Linhagens bacterianas e cultivo 

A linhagem Xac 306 (Xanthomonas citri subsp. citri) utilizada no presente 

estudo foi asequenciada por da Silva et al., 2002. E. coli DH5α (F- φ80dlacZ∆M15 

∆(lacZYAargF)U169 deoR, recA1 endA1 hsdR17(rk
-
 mk

+
 phoA supE44 λ

-
 thi-1 gyrA96 

relA1) eDH10B (F-
 mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15 DlacX74 recA1 

endA1araD139 D(ara, leu)7697 galU galK l- rpsL (Str
R
) nupG) foram utilizadas para 

as6clonagens. Xac foi cultivada a 30º C em meio NYG com ou sem ágar (Peptona 5 

g/L,extrato de levedura 3 g/L e glicerol 20 mL/L). Linhagens de E. coli foram 

cultivadas emmeio Luria-Bertani (LB) a 30 ou 37ºC, acrescido ou não de ágar e 

contendo antibióticos (canamicina ou gentamicina; 20µg/mL), quandonecessário 

(Sambrook, et al., 1989). 

 

5.2 Meio mínimo XAM1 para Xac 

5.2.1 Preparo das soluções que foram utilizadas 

Foi preparado uma solução estoque de sais 1000 mL de 5,0 g de sulfato de amônio 

(NH4)2SO4(PM=132,14), 22,5 g de fosfato de potássio monobásico KH2PO4 

(PM=136,09), 52,5 gde fosfato de potássio dibásico K2HPO4 (PM=174,18), 2,5 g de 

citrato de sódioNa3C6H5O7.2H2O (PM=294,10) e autoclavado. 

 

Estoques de MgSO4.7H2O 1M e Casaminoácidos (30%) foram preparados e 

autoclavados. Todas soluções estoques foram guardadas à temperatura ambiente. Um 

estoque de solução de BSA a 50 mg/mL foi filtrada em membrana de 0,22 µm e 

guardada em geladeira. 

 



5.2.2Composição do XAM1 pH=5,4 

 Para prepararmos o meio XAM1, adicionamos 100 mL da solução de sais, 1 mL 

de glicerol, 500 µL MgSO4.7H2O 1M, 500 µL casaminoácidos e completado para um 

volume final de 500 mL com H2O destilada  e o pHfoi ajustado para 5,4, em seguida o 

meio foi autoclavado. Depois de autoclavado e antes de usar o XAM1 foi adicionado 10 

mL da solução de BSA. 

 

5.3 Biologia Molecular 

Métodos estabelecidos seguiram Sambrook et al. (1989). Extração de DNA total 

de X. citri e E. coli, bem como, transformação seguiram Ferreira et al. (1995). As 

extrações de DNA plasmidial e purificação de DNA de gel de agarose seguiram as 

instruções dos Kits Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit e Thermo 

Scientific GeneJET Gel Extraction Kit. As reações enzimáticas de digestão, ligação e 

amplificação por PCR seguiram as instruções do fabricante das enzimas utilizadas (New 

England Biologics e Thermo). 

 

5.4 Vetores de expressão 

O vetor integrativo pGCD21 (Figura 3c), que possibilita aexpressão de proteínas 

em fusão com GFP em Xac, teve como base o vetor pHF5Ca(GenBank FJ562210). 

Primeiramente, gfp foi removido do vetor pPM7g (Martins, etal., 2010) por restrição 

utilizando-se as enzimas BamHI/XbaI; o gene isolado foi ligadoao backbone do vetor 

pHF5Ca digerido com as mesmas enzimas dando origem ao vetorpGCD19 (KJ619486; 

ocorre remoção do tap1479 de pHF5Ca). Na sequência, opromotor e repressor de 

arabinose (araC-para) foram removidos do vetor pEB304(Gully, et al., 2003) por PCR 

com os primers: 



pARAF (5´- AAAGAATTCGCATAATGTGCCTGTCAAATG) e 

pARAR (5´- TTTAGATCTTTCCTCCTGCTAGCCCAAAAAAACG) 

O produto deste PCR foi digerido com as enzimas EcoRI/BglII e ligado 

aobackbone do vetor pGCD19 digerido com EcoRI/BamHI (ocorre remoção do 

promotorde xilose de pGCD19) dando origem ao pGCD21. 

 

Ligação dos genes minCaos vetores de expressão: 

Para ligação ao vetor pLAL1, genes foram obtidos por PCR com primers: 

minC_pLAL1F (EcoRI) 

5’- AAAGAATTCACCATGGCAAGTGTGAATGTGGATTTTG 

minC_pLAL1R (HindIII) 

5’- AAAAAGCTTTCAATCAAGCGCAGCGATCTTG 

Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas indicadas e ligados 

aopLAL1/EcoRI/HindIII dando origem ao pGCD1c (Figura 3b). 

 

Para ligação ao pGCD21, genes foram isolados por PCR com os primers: 

minC F (NotI) 

5´- TAAGCGGCCGCGTGGCAAGTGTGAATGTGGATTTTG 

201402minC R (XbaI) 

5´- AAATCTAGATCAATCAAGCGCAGCGATCTTG 

Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas marcadas acima e ligadas 

aopGCD21 preparado com as mesmas enzimas; as construções codificam para GFP-

MinC e deram origem ao pGCD2c (Figura 3d). 

 



Todos os PCRs foram realizados com a enzima Pfu DNA polimerase 

seguindorecomendações do fabricante (Fermentas/Thermo). DNAs foram checados 

porsequenciamento na empresa Macrogen (Korea). 

 

Figura 3. Mapas dos vetores de expressão 

 

Fonte: Gráfico gerado a partir do programa Clone Manager 

 

5.5 Knockout gênico 

Fragmentos upstream e downstream às ORFs/genes queseriam deletados foram 

amplificados com os conjuntos de primers abaixo relacionados: 

Para deleção de minC: 

Fragmento upstream 870pb (BamHI/XbaI): 

minCupF (BamHI) 



5’- AAAGGATCCGTATGACTGAGGTATCCCAACATGTC 

minCupR (XbaI) 

5’- AAATCTAGATGCCACAACTCAGCTCCCCGTCGATG 

Fragmento downstream 929pb (XbaI/HindIII): 

minCdownF (XbaI) 

5’- AAATCTAGAGATTGACGCGGCCCAACCACAGAAATATTC 

minCdownR (HindIII) 

5’- AAAAAGCTTCAATGATGATCTGCAGGCGGTTCTTGG 

Os produtos dos PCRs acima foram tratados com os pares de enzimas 

derestrição indicados e misturados com o vetor suicida pNPTS138/BamHI/HindIII 

(LucyShapiro, vetor não publicado) para tripla ligação da seguinte forma:Exemplo de 

material para a deleção de minC= foram misturados os fragmentos minC-

upstream/BamHI/XbaI + minC-downstream/XbaI/HindIII + pNPTS138/BamHI/HindIII. 

A deleção gênica é mostrada no esquema da Figura6. A construçãofinal foi inserida em 

Xac por eletroporação, onde normalmente é retida apósintegração no genoma por um 

dos dois eventos de recombinação homólogamostrados (Fig. 4, eventos 1 ou 2). 

Mutantes carregando o vetor integrado no genoma foramselecionados em placas de 

meio N-agar contendo canamicina. Subsequentemente,uma colônia derivada do 

primeiro evento de recombinação foi cultivada por 16h emmeio NYG líquido, sem 

canamicina, para que ocorresse o segundo evento derecombinação (troca alélica).Após o 

cultivo, células foram plaqueadas em meio NYG ágarsem canamicina contendo 5% de 

sacarose. Nesta fase, somente células ondetenha ocorrido um segundo crossing-over 

(conclusão da troca alélica ou reversãopara selvagem com a saída do vetor), e que 

tenham perdido o vetor que porta o genesacB, poderão se desenvolver, pois o produto 



deste gene, levanosucrase, metaboliza asacarose em um produto tóxico para Gram-

negativos (Reyrat, et al., 1998). 

 

Figura 4.  Esquema de deleção limpa para minC. 

 
As ORFs minD e XAC 1227 (azul e amarelo, respectivamente) de Xac foram amplificadas 

individualmente por PCR e ligadas conforme o esquema acima em um vetor suicida contendo 

um gene para resistência a canamicina (kan) e o gene sacB de B. subtilis. Este vetor foi inserido 

em Xac e mediante dois eventos de recombinação homóloga (1 e 2) promoveu a retirada da 

região de minC (vermelho) do cromossomo bacteriano. 

 

Para a obtenção da deleção de minCem Xac, o vetor de expressão replicativo 

pGCD1c. Foram feitas várias tentativas de obter um mutante Xac∆minC porém todas 

em vão, pois não se conseguiu resgatar mutantes sem que houvesse a 

complementaçãocom pGCD1c. Após transformação de Xac/pGCD1c com o vetor de 

deleção e seleção decandidatos de recombinação em meio com sacarose, um 

PCRdiagnóstico foi realizado para a presença de minC (Figura5). Nas canaletas 3 e 4, os 

produtos dePCR foram condizentes com a falta da região codificando para MinC 

nestescandidatos (compare com o fragmento contendo minC em 5; controle 

Xacselvagem).Na sequência, três mutantes para minCforam selecionados 

(Xac∆minC/pGCD1c),para análise de viabilidade em curva de crescimento em meio 



complexoNYG e  o mutante de número 24 foi escolhido para prosseguir com as análises 

(Figura 6). 

 

Figura 5. PCR diagnóstico para deleção de minC em Xac. 

 

Gel de agarose mostrando produtos de PCR diagnóstico para deleção de minC. Canaletas 1-4) 

candidatos mutantes, 5) Xac selvagem, 6) branco, 7) marcador de peso molecular. Setas indicam 

produto referente a minC (5) e ausência de minC (3 e 4). 

 

As células foram cultivadas em meio NYG contendo gentamicina e mutante 24 

(linha azul) foi crescido em mesmo meio contendo glicose 1% ocasionando o 

trancamento do promotor no vetor pGCD1c, mas como pode ser observado na figura 8 a 

adição da glicose no meio serviu como uma fonte extra de carbono favorecendo um 

crescimento melhor do que em Xac WT (linha verde na figura 8). 

  



Figura 6. Curva de crescimento do mutante 24. 

 

Curva de fitness do mutante 24 em relação a XAC WT. Células foram cultivadas em meio NYG 

por 30h com amostras retiradas a cada 6h para leitura de D.O.600nm.  

 

5.6 Amplificação para clonagem e diagnóstico 

Para a amplificação das sequências foram usados DNA plasmidial (5 

nanogramas) ou DNA genômico (20ng), tampão da enzima Pfu DNA polimerase para 

1X final (Thermo, contendo 2 mM de MgCl2), 100 µM de cada dNTP, 1U Pfu, 1 µM de 

cada primer e água para 20 µl finais. O ciclo de amplificação para a sequência gfp foi 

“touch down” : desnaturação inicial a 94 ºC/4’30”, seguido de 3 ciclos de 94 ºC/30”, 68 

ºC/30”, 70 ºC/4’30”e depois mais 30 ciclos de 94 ºC/30”, 62 ºC/30” e 70 ºC/4’30”. 

Para amplificação de minC (sequência com alto conteúdo de GC), foi 

acrescentada na reação formamida desionisada na concentração de 5% final. O ciclo de 

amplificação foi “touch down” : desnaturação inicial a 94 ºC/2’30”, seguido de 4 ciclos 

de 94 ºC/30”, 68 ºC/30”, 70 ºC/2’e depois mais 30 ciclos de 94 ºC/30”, 60 ºC/30” e 72 

ºC/2’. 



5.7 SDS-PAGE e Western Blotting 

Para preparação do extrato de proteínas totais, adicionou-se tampão de amostra 

contendo SDS, na proporção de 90 µL para cada 20 mg de massa celular, quando então 

as amostras foram fervidas a 100 ºC por 5 min e centrifugadas para remoção de restos 

celulares (SAMBROOK et al., 1989). SDS-PAGE, coloração com coomassie e 

transferência de proteínas para membrana de PVDF seguiram Sambrook et al., (1989). 

Para detecção de GFP na membrana de PVDF (GE®), foi utilizado anticorpo 

primário anti-GFP (Sigma G1544) produzido em coelho em seguida um anticorpo 

secundário anti-coelho contendo uma peroxidase. Reação de quimioluminescência 

seguiu as recomendações contidas no kit ECL. 

 

5.8 Microscopia 

Linhagens foram cultivadas a 30°C e observadas em D.O600nm ~0,4 após 

imobilização emlâminas contendo agarose 1% em PBS 1X. Preparação das lâminas: 

cerca de 1000µL dasolução de agarose foi dispensada em lâminas de microscopia óptica 

e sobre as quais foicolocada outra lâmina para que o gel de agarose formasse um filme 

fino e de alturahomogênea. As lâminas foram secas a temperatura ambiente, por 

aproximadamente 5min e abertas somente no momento do uso, quando 10µL da 

suspensão de células foramdepositadas no centro destas e cobertos com lamínula. As 

células foram visualizadasutilizando-se o microscópio Olympus BX61, equipado com 

câmera monocromáticaOrcaFlash2 (Hamamatsu). Análises de imagens foram realizadas 

com software CellSens(Olympus). 

 

 

 



5.9 Teste de patogenicidade 

Testes de patogenicidade foram realizados utilizando-se como hospedeiro 

laranja doce cultivar “Pera”. As plantas foram cultivadas em casa de vegetação.As 

células a serem testadas foram cultivadas até que atingissem D.O.600nm ~0,5, seguindo-

se infiltração de aproximadamente 100 µL de suspensão de células (ou diluições) 

emregiões entre nervuras das folhas nas superfícies abaxiais, com a utilização de 

seringashipodérmicas (1mL) contendo agulhas. Os sintomas de lesão foram 

identificados poralterações nos locais de inóculo em comparação com sintomas 

causados pela linhagemselvagem (controle positivo). Observações foram realizadas por 

três semanas. 

 

 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 3 



A Protein Expression System for Tandem AffinityPurification 
in Xanthomonas citri subsp. citri 

G.C. Dantas1, P.M.M. Martins1, D.A.B. Martins2, E. Gomes3, H. 
Ferreira1 

1 Depto. de Bioquimica e Microbiologia, Instituto de Biociências, UniversidadeEstadual Paulista, Av. 
24A,1515, Bela Vista, Rio Claro, SP, 13500-900, Brazil; 

2 Depto. de Bioquímica e Tecnologia Química, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, R. 
Prof. Francisco Degni, 55, Araraquara, SP, 14800-060, Brazil; 

3 Depto. de Biologia, Universidade Estadual Paulista, Rua Cristóvão Colombo, 2265, Jardim Nazareth, 
São Jose do Rio Preto, SP, 15054-000, Brazil 

 

A partir deste artigo foram feitos os vetores integrativos utilizados para expressão de 
GFP-MinC. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 



B

G

A
p

G
H
a

1
b

A
c

1

a

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R

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A

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K

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1
B

ARTICLE IN PRESSJM-67; No. of Pages 9

b r a z i l i a n j o u r n a l o f m i c r o b i o l o g y x x x (2 0 1 6) xxx–xxx

h t tp : / /www.bjmicrobio l .com.br /

enetics and Molecular Microbiology

 protein  expression  system  for tandem  affinity
urification in  Xanthomonas  citri  subsp.  citri

iordanni C. Dantasa,1, Paula M.M. Martinsa,1, Daniela A.B. Martinsb, Eleni Gomesc,
enrique  Ferreiraa,∗

Depto. de Bioquimica e Microbiologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Av. 24A,1515, Bela Vista, Rio Claro, SP
3500-900, Brazil
Depto. de Bioquímica e Tecnologia Química, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, R. Prof. Francisco Degni, 55,
raraquara, SP 14800-060, Brazil
Depto. de Biologia, Universidade Estadual Paulista, Rua Cristóvão Colombo, 2265, Jardim Nazareth, São Jose do Rio Preto, SP
5054-000, Brazil

 r  t  i  c  l  e  i  n  f  o

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eceived 7 May 2015

ccepted 23 October 2015

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ssociate Editor: Solange Ines

ussatto

eywords:

itrus canker

xpression vectors

AP-tag

a  b  s  t  r  a  c  t

Citrus canker, caused by the Gram-negative bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is

one  of the most devastating diseases to affect citrus crops. There is no treatment for citrus

canker; effective control against the spread of Xac is usually achieved by the elimination

of  affected plants along with that of asymptomatic neighbors. An in depth understand-

ing of the pathogen is the keystone for understanding of the disease; to this effect we  are

committed to the development of strategies to ease the study of Xac. Genome sequenc-

ing and annotation of Xac revealed that ∼37% of the genome is composed of hypothetical

ORFs.  To start a systematic characterization of novel factors encoded by Xac, we  constructed

integrative-vectors for protein expression specific to this bacterium. The vectors allow for

the production of TAP-tagged proteins in Xac under the regulation of the xylose promoter. In

this  study, we show that a TAP-expression vector, integrated into the amy locus of Xac, does

not  compromise its virulence. Furthermore, our results also demonstrate that the polypep-

tide  TAP can be overproduced in Xac and purified from the soluble phase of cell extracts. Our

results  substantiate the use of our vectors for protein expression in Xac thus contributing

a  novel tool for the characterization of proteins and protein complexes generated by this

bacterium in vivo.

© 2016 Sociedade Brasileira de Microbiologia. Published by Elsevier Editora Ltda. This is

an open access article under the CC BY-NC-ND license

(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Please cite this article in press as: Dantas GC, et al. A protein expression sy
Braz J Microbiol. (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026

∗ Corresponding author.
E-mail: henrique.ferreira@linacre.oxon.org (H. Ferreira).

1 These authors contributed equally to this work.
ttp://dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026
517-8382/© 2016 Sociedade Brasileira de Microbiologia. Published by E
Y-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

lsevier Editora Ltda. This is an open access article under the CC
.

dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026
dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026
http://www.bjmicrobiol.com.br/
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
mailto:henrique.ferreira@linacre.oxon.org
dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/


ARTICLE IN PRESSBJM-67; No. of Pages 9

 c r o b

lums were cultured for 8 h at 30 C and 180 rpm. At the end of
2  b r a z i l i a n j o u r n a l o f m i

Introduction

Citrus canker, one of the most important diseases affecting cit-
rus crops worldwide, is caused by a Gram-negative bacterium,
Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). The complete genome
sequence of Xac, which was reported more  than a decade ago,1

has significantly contributed to improving our understanding
of the molecular processes of this plant pathogen.2–5 Of the
4313 Xac ORFs that have been annotated, nearly 63% exhibit
homology to genes of known function whereas ∼37% corre-
spond to hypothetical ORFs that could potentially code for
novel polypeptides.1 Such a distribution pattern of ORFs is a
common feature in microbial genomes and it is hypothesized
that a significant amount of information regarding adaptation
and pathogenicity may be encoded within such hypothetical
proteins. The biggest challenge in characterizing these hypo-
thetical ORFs is that the phenotypes generated by them are
usually unknown.

Among techniques that have the potential to be used for
the characterization of hypothetical proteins we cite: two
dimensional (2-D) protein gels allied to mass spectrome-
try, DNA microarrays, and next generation sequencing of
nucleic acids (NGS).6–15 All of these methods allow for high-
throughput processing of candidate genes/proteins and the
data obtained by analyzing patterns of co-expression and co-
repression (exhibited by a particular gene/polypeptide during
different growth or development conditions) in turn helps
in the attribution of function. In addition to the aforemen-
tioned techniques, in vivo protein localization via fluorescence
microscopy has also proven to be a powerful tool for annotat-
ing function to unknown protein factors.16,17 However, the
most promising techniques in this field are those that are
capable of demonstrating a direct contact between hypotheti-
cal proteins and (an) other cellular factor(s). One such method
is the yeast-two-hybrid (YTH) technique and its variant the
bacterial-two-hybrid (BTH) system.18,19 One of the first major
successes of the YTH system was the construction of a com-
plex protein–protein interaction map  of the human pathogen
Helicobacter pylori.20 In Xac this method has been applied for
the identification and characterization of several previously
unknown protein components of the type III and IV secretion
systems.2,3 In spite of the obvious value and utility of the YTH
technique, the methodology suffers from certain serious dis-
advantages such as the need to construct a genomic/cDNA
expression library of the organism under study. Another tech-
nique, an interesting alternative to the YTH/BTH methods,
is the Tandem Affinity Purification strategy (TAP-tagging).21,22

TAP-tagging was developed to aid in the purification of active
macromolecular complexes from yeast; it differs from the
two-hybrid systems in the aspect that it does not require the
construction of protein expression libraries to be screened
with baits. The basis of TAP-tagging is the expression of a
fusion-protein comprising of the protein of interest fused to
a TAP-tag either at the C- or the N-terminus. Expression of
this fusion protein inside a cellular environment wherein the
expression of the protein under study is indigenous causes
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Braz J Microbiol. (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026

the TAP-tagged protein to interact with other cellular fac-
tors in the same fashion as an untagged protein would.
Following cell propagation, protein complexes comprising of
 i o l o g y x x x (2 0 1 6) xxx–xxx

TAP-protein fusion and their associated cellular factors are
to be purified and identified by mass spectrometry. The Tap-
tagging technique has been successfully adapted to a variety
of organisms including the rice pathogen Xanthomonas oryzae
pv. oryzae.23–35

Herein, we  describe a protein expression system for tan-
dem affinity purification in Xac (TAP expression vectors). The
vectors involved in this system have the capability to stably
integrate into a specific genomic region (the amy locus) of
Xac without altering pathogenicity or virulence. Finally, we
expressed and purified the TAP-tag from Xac, corroborating
the use of our expression vectors for protein studies in this
bacterium.

Materials  and  methods

Bacterial  strains  and  growth  conditions

The X. citri subsp. citri used in the study36,37 was the sequenced
strain 306.1 Escherichia coli strain DH10B (F− mcrA �(mrr-
hsdRMS-mcrBC) �80lacZ�M15  �lacX74 recA1 endA1 ara�139
�(ara, leu)7697 galU galK �-rpsL (StrR) nupG) was used for
cloning. DH10B was cultivated at 37 ◦C in LB38 and Xac at 30 ◦C
in NYG (Peptone 5 g/L, yeast extract 3 g/L and glycerol 20 g/L).
For the amylase tests, soluble starch was added to NYG-agar
at a final concentration of 0.2%. During the cloning procedure,
ampicillin (20 �g/mL) and kanamycin (10 �g/mL) were added to
the media to allow for selection of plasmid-carrying colonies.

General  methods

Basic molecular biology experiments were conducted as per
prescribed protocols.38 Electrotransformation of Xac was per-
formed as described previously.39 DNA polymerases and
restriction and modifying enzymes were obtained from Fer-
mentas (Thermo Scientific). The construction of pHF5Ca
(GenBank FJ562210) has been previously described in the
literature40; pHF5Na (GenBank FJ573043) is a variant of pHF5Ca
in which the tap1479 has been replaced by the tap176121

(Fig. 1A). The tap1761 cassette was isolated by PCR using
pBS1761 as template21 and the primer pair PBS1761F 5′-TGA
GGA TCC ATG ATA ACT TCG TAT AGC ATA C and PBS1761R
5′-TCA TTC TAG ACT ATA GGG CGA ATT GGG TAC C. Follow-
ing PCR, the purified fragment was digested with BamHI/XbaI
and ligated to the backbone of pre-digested pHF5Ca. For detec-
ting the presence of pHF5Ca integrated into the Xac genome
diagnostic PCR was performed. The primer pair used for this
purpose was: pxyl 5′-GTA CTT ACT ATA TGA AAT AAA ATG
and 1479R 5′-ATC AAG CTT CAG GTT GAC TTC CCC G.

Protein  expression

Strains of E. coli/pHF5Ca and Xac amy::pHF5Ca were activated
by the inoculation of 2–3 isolated colonies in 3 mL  of LB or NYG,
respectively, along with the required antibiotics. The inocu-

◦

stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

the designated growth period, the cultures were diluted 1:50
(E. coli) or 1:10 (Xac) in Erlenmeyer flasks containing 50 mL  LB
or NYG broth plus antibiotics. Cultures were grown for 14 h at

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 r o b i

3
a
t
L
a
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i
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F
p
r
o
(
t
U
o
(
P
b
P
p

b r a z i l i a n j o u r n a l o f m i c

0 ◦C and 180 rpm. At the end of the time period, strains were
gain diluted 1:50 (E. coli) or 1:10 (Xac) in Erlenmeyer flasks con-
aining 50 mL  LB or NYG broth (for Western blotting) or 500 mL
B or NYG (for protein purification). Cultures were incubated
t 30 ◦C and 180 rpm till an OD600 value of 0.5 was reached.
or induction of protein expression, xylose was added to the
rowth medium to a final concentration of 0.5%; time period
or induction was 1 h (E. coli) and 4 h (Xac) using conditions
dentical to those employed for culture growth. Subsequent to
nduction, cells were harvested by centrifugation at 4000 × g
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or 10 min  followed by washing with cell wash buffer (30 mM
ris–HCl, 200 mM NaCl); cell pellets were stored at −80 ◦C till
se.

EcoRI

xy

Kan

EcoRI

ori

xy

pHF5Na

6651bp
tap1

amy

Xmal

ori

Ap

Kan

Ap

pHF5Ca

A

6583bp
tap1

amy

Xmal

ig. 1 – Expression vectors for Tandem Affinity purification in Xa
rotein expression vectors for TAP-tagging in Xac. Each vector ca
espectively, which produce TAP fusions to either the C- or N-ter
n the pCR2.1-TOPO backbone which carries a pUC replication or

kan) resistance. (B) DNA sequence of the xylose promoter region
he ribosome binding-site (RBS) and the start codon (ATG). (C) Th
nderneath each sequence is the schematic view of the protein f
rganization of the modules that compose the TAP-tags (CBP, TE

see text); for the C-terminal fusions, the TAP1479 has ProtA loca
rotA is at the beginning of the protein in the N-terminal fusions
lack; non-unique sites in gray. CBP, calmodulin binding-protein
rotA, Protein A from Staphylococcus aureus;  and EK, enterokinas
xyl, xylose promoter; xylR, the xylose repressor gene; amy, an 8
 o l o g y x x x (2 0 1 6) xxx–xxx 3

Western  blotting

Total protein extracts were prepared by resuspending 20 mg
of each cell pellet in 100 �L of SDS-sample buffer. Sample
processing, SDS-PAGE, and transfer to PVDF membrane was
conducted using standard methodology.38 For detection of
the immobilized TAP-tag, the PVDF membrane was washed
with PBS-Tween-20 (0.2%) containing 5% skimmed milk and
incubated with a secondary antibody coupled to HRP (rab-
bit Anti-Horse IgG; SIGMA A6917) in a dilution of 1:3000.
stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

The principle underlying this methodology is that Protein
A, which is part of the TAP-tag, is known to bind IgG iso-
types directly. Following incubation with the antibody, the

lR

EcoRI

IR

pxyI

761

Xmal
Xbal

BamHI ClaI
HincII
Sal I
Xhol
EcoO109I
Apal
PspOMI
Acc65I
Kpnl

pxyl
BamHI

479

Xbal
Xmal

c. (A) Schematic representation of pHF5Ca and pHF5Na: the
rries a different TAP-coding DNA, tap1479 and tap1761

minal ends of proteins under study. Both vectors are based
igin and DNA cassettes for ampicillin (Ap) and kanamycin

 common to pHF5Ca and pHF5Na showing the location of
e DNA sequences of the 3′-ends of tap1479 and tap1761.
usion that can be produced using the tag. Note that the
V, and ProtA) differ with respect to TAP1479 and TAP1761
ted at the extreme C-terminus of the polypeptide, while
. Unique restriction sites for DNA cloning are shown in
; TEV, Tobacco Etch Virus Protease recognition sequence;
e recognitions sequence (DDDDK, present only in TAP1761);
00 bp fragment of the alpha-amylase gene from Xac.

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4  b r a z i l i a n j o u r n a l o f m i c r o b i o l o g y x x x (2 0 1 6) xxx–xxx

B

C

pxy1

HindIII

RBS

EcoRI

Test protein

N C

CN

CBP

C-terminal TAP-tag

TEV ProtA

Test proteinCBP

N-terminal TAP-tag

TEVProtA EK

tap1479

tap1761

BamHI

HindIII

HindIII ClaI

sfcI xbal

SaiI
HincII Xhol Apa I Kpn I

xbaI

Fig. 1 – (Continuación )
western blot was developed by immersing the membrane in
ECL detection reagents (Amersham ECL Western Blotting Sys-
tem kit-GE). The chemiluminescence produced was captured
on X-ray film (Hyperfilm, GE) for further analysis.

Protein  purification

Cell pellets obtained from 500 mL  cultures were dissolved in
pre-chilled 10 mL  TST (50 mM Tris–HCl pH 8.0, 150 mM NaCl,
and 0.05% Tween 20) containing a one-fourth of a tablet of
EDTA-free protease inhibitors (Roche 1.873.580). Cells were
lysed by sonication using a Vibra-Cell VCX 130 (Sonics) (10
pulses of 10 s each with intervals of 1 min) and the soni-
cated samples were then centrifuged at 48,000 × g for 30 min
at 4 ◦C. Batch binding of proteins to the affinity resin was
done by incubating the clarified suspensions with 500 �L of
IgG-Sepharose (previously equilibrated in TST; GE 17-0969-
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01) on an ice bath with gentle agitation through a rotary
shaker (120 rpm). After a 2 h incubation, resin was transferred
to a 10 mL  disposable column (Poly-prep BioRad 731-1550)
and washed 3–4 times with 20 column-volumes of TST using
gravity flow. Samples of 100 �L were collected throughout
the process for SDS-PAGE analysis. The TAP-tag was released
from the resin by acid elution using 0.5 M acetic acid (pH
3.4; adjusted with 10 M ammonium acetate). Eluate fractions
of 1 mL  each were precipitated using TCA (3% final) and
centrifuged for 10 min  using a microcentrifuge at maximum
speed; protein pellets were washed once with absolute ethanol
and then dissolved in 100 �L of SDS sample buffer for SDS-
PAGE.

Pathogenicity  tests

The plant host used for this study was the sweet orange
cultivar ‘Bahia’ (Citrus sinensis L. Osbeck). Orange trees were
cultivated under green-house conditions. Cells to be tested
were cultivated in the appropriate medium until OD600

reached ∼0.6 (∼108 CFU/mL). Subsequent to growth, cell sus-
pensions or dilutions were used to inoculate leaves on the
stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

abaxial surface with the help of hypodermic syringes (1 mL)
fitted with needles. Symptoms were observed in the course of
three weeks from the day of inoculation.

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 r o b i o l o g y x x x (2 0 1 6) xxx–xxx 5

R

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b
(
a
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d
i
t
s
o
e
f
m
t

kb

–3.0

–1.0

–0.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 2 – Colony PCR to detect the presence of pHF5Ca
integrated into the chromosomal DNA of Xac. Subsequent
to electrotransformation of Xac with the expression vector
pHF5Ca, six kanR mutants were selected and subjected to
colony PCR using the primers PBS1479F/R specific for the
amplification of the tap1479 (approximately 640 bp). The
PCR amplicons were  visualized after migration through a
0.7% agarose gel. Lane: 1, WT Xac (negative control); 2–7,
the six selected mutants; 8, PCR using pHF5Ca as the DNA
template (positive control); and 9, DNA molecular weight
b r a z i l i a n j o u r n a l o f m i c

esults

he  TAP  expression  vectors  for  Xac

n this study, the two TAP expression vectors used for Xac,
HF5Ca and pHF5Na, carry the xylose promoter (pxyl), the
ylose repressor (xylR), and the TAP encoding sequences
ap1479 or tap1761 (Fig. 1A). These components are separated
y a short stretch of DNA containing a Ribosome Binding Site
RBS) whose sequence is a consensus for both Bacillus subtilis
s well as E. coli41 (Fig. 1B). The xylose promoter used has been
reviously evaluated by our group in Xac and found to func-
ion satisfactorily.17,40 The two TAP sequences, tap1479 and
ap1761, encode for tags used in Tandem Affinity Purification
f protein complexes and are composed of three components

Fig. 1C): (a) Two domains of Protein A (ProtA; Staphylococcus
ureus) that is known to have a strong affinity for IgG; (b)

 peptide that binds calmodulin (CBP); (c) A short peptide
tretch containing the recognition sequence for the protease
EV (Tobacco Etch Virus) separating the above mentioned
omponents.21,22 The expression vectors pHF5Ca and pHF5Na
iffer only in the TAP-tags that they encode; pHF5Ca carries
he tap1479 and is used for the expression of protein fusions
ontaining the peptide TAP1479 at the C-termini whereas the
HF5Na carries the tap1761 and is used to produce fusions of
AP1761 to the N-termini of proteins of interest. Additionally,
oth the vectors used are integrative as they carry the amy106-
14 fragment of Xac which drives their integration into the amy
ocus of the bacterium via a single crossover event. Upon inte-
ration, the amy gene of Xac is disrupted and the bacterium
ecomes incapable of degrading starch.

ac  mutants  harboring  the  TAP  expression  vectors
olonize  citrus

n a previous study, we demonstrated that Xac mutant
trains carrying the GFP expression vectors pPM2a or pPM7g
ntegrated into the amy locus were capable of inducing
isease symptoms in citrus plants.17 Herein, in continua-
ion of the previous study, we  wanted to evaluate if the
resence of the TAP coding DNA altered or affected the
irulence/pathogenicity associated with Xac. To test this
ypothesis, pHF5Ca was electroporated into Xac; and kanR

ransformants (candidates potentially carrying the vector
HF5Ca) were selected for further characterization. To cer-
ify that the TAP expression vector had integrated into amy
ocus, a set of putative mutants were tested for their ability
o degrade starch on a test plate.17 The results clearly demon-
trated that the candidate mutants were deficient in starch
egradation hence proving that pHF5Ca was stably integrated

nto the amy locus of Xac such that these mutants were unable
o produce alpha-amylase (data not shown). Alongside the
tarch degradation test, we also carried out diagnostic PCRs
n a selection of six kanR mutants so as to certify the pres-
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nce of pHF5Ca (Fig. 2). The diagnostic PCRs detected a DNA
ragment of ∼640 bp corresponding to the tap1479 in all the

utants analyzed (compare lanes 2–7 with the positive con-
rol in lane 8 wherein pHF5Ca was used as DNA template). No
marker (1 kb DNA ladder, NEB).

bands were detected in the negative control (lane 1, wild type
Xac).

In order to verify if Xac amy::pHF5Ca was capable of causing
disease symptoms in a susceptible host, two  independently
selected mutants were inoculated into leaves of sweet orange
(Fig. 3A–C). Seven days post-inoculation, the borders of the
area inoculated with Xac clearly exhibited the typical water-
soaking symptom associated with the disease (Fig. 3D–F).
These areas developed brownish canker-like lesions during
the course of the next three weeks (data not shown). A point
to note is that the mutant strains displayed the same dis-
tinct lesion pattern as the wild type. In contrast, the area
inoculated with NYG-medium (negative control) showed only
a mild chlorosis. In summary, the results obtained in this
study clearly demonstrated that the ability to cause dis-
ease remained unaffected following integration of the Xac
amy::pHF5Ca mutants.

TAP-tag  expression

The production of a TAP-tag can be detected in Western blot-
ting assays by exploiting the ability of ProtA to bind to the
IgG antibody.42 A strain of E. coli carrying pHF5Ca (multicopy)
vector and two Xac amy::pHF5Ca mutant strains (harboring a
single copy of the expression cassette integrated into the amy
locus of Xac) were cultivated and induced with xylose. Total
protein extracts were separated by SDS-PAGE (Fig. 4A) and
transferred onto a PVDF membrane so as to facilitate detec-
tion of TAP1479 using antibody reactions. The bands of the size
stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

expected for the TAP1479 (∼21 kDa) were detected for both the
mutant strains of Xac as well as for E. coli transformed with
pHF5Ca (Fig. 4B, lanes 1–2, and 5–8). The results also showed

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A B C

D E F

1 and 2=Xac am y ::pHF5Ca

1
Xac
Wt

NYG
2

Fig. 3 – The integration of the TAP expression system into the chromosome of Xac does not alter its pathogenicity. Two
independently selected mutants of Xac amy::pHF5Ca (1 and 2) were inoculated into leaves of sweet orange Bahia alongside
the wild type strain (Xac wt)  and a sample of NYG-medium (negative control). A map  of the inoculation is shown on the
right-hand side of the figure. Pictures were  taken immediately after inoculation (A–C) and also 7 days post-inoculation (D–F).

The test was conducted in triplicate (A–C).

that the production of TAP1479 was responsive to induction by
xylose (lanes 1 and 2, 5 and 6, 7 and 8). For the negative con-
trol, wild type Xac, no signal corresponding to the band size
of TAP1479 was detected (lanes 3 and 4). It was observed that
E. coli produced more  of the tag than the Xac mutants, a result
that is consistent with the multicopy condition of pHF5Ca in
E. coli. The results obtained clearly show that the expression
system is functional in both bacteria and also that an intact
and active ProtA moiety was produced in Xac.

Purification  of  the  TAP-tag  from  Xac

The TAP-tag detected in the previous section appeared to
be a resilient polypeptide capable of retaining the property
of IgG-binding even after treatment with SDS and boiling
as is mandatory for sample preparation in SDS-PAGE elec-
trophoresis. However, results obtained by western blotting do
not guarantee function, as the positive outcome can easily
be explained as a byproduct of residual IgG binding activity
of ProtA. Additionally, for the protein complexes produced in
Please cite this article in press as: Dantas GC, et al. A protein expression sy
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Xac to be useful, it is essential to check if the TAP1479 could
be produced in larger amounts and in a soluble form. In order
to evaluate this, an attempt was made to purify TAP1479 by
affinity separation. An E. coli strain carrying pHF5Ca and a Xac
amy::pHF5Ca mutant were cultivated and induced with xylose.
Following expression of the TAP-tag, cells were lysed by son-
ication and clarified cell extracts were subjected to affinity
chromatography using IgG-immobilized resin. TAP1479 was
successfully purified from the soluble phase of both extracts
(Fig. 5; see arrows). As observed in the Western blotting exper-
iments, E. coli produced a relatively higher amount of the tag (a
tag concentration of ∼1.4 mg/mL  was estimated for the sam-
ple in lane 8) as compared to the yield from Xac (∼0.2 mg/mL,
lane 7). However, the amount of tag produced by Xac, though
less, should suffice for mass spectrometry identification. The
contaminant bands above the TAP1479 represent denatured
human IgG which was stripped out from the matrix by the
acid elution together with other bacterial proteins that might
be interacting with the resin. These results corroborate the
use of the expression vectors pHF5Ca and pHF5Na as integra-
tion/protein expression systems for TAP-tagging in Xac.

Discussion
stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

In the present work we  characterized a novel protein expres-
sion system intended for high-throughput analysis of protein
complexes in Xac. These vectors are integrative and allow

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kDa

A

B

–27

–20

kDa

–27

–20

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 4 – Western blotting analysis to detect expression of
TAP1479 by Xac amy::pHF5Ca mutants. The functionality of
the TAP expression system was verified by the ability of an
E. coli DH10B strain, with pHF5Ca and Xac kanR mutants,
carrying the vector integrated into the chromosome, to
produce the TAP1479 (approximately 21 kDa) (details of the
induction procedure have been described in “Materials and
methods” section). (A) Coomassie blue-stained 10%
SDS-PAGE showing the separation of proteins from cell
extracts of E. coli and Xac; lanes: 1, E. coli/pHF5Ca; 2,
E. coli/pHF5Ca + 0.5% xylose; 3, Xac (WT); 4, Xac WT  + 0.5%
xylose; 5, Xac amy::pHF5Ca mutant 1; 6, Xac amy::pHF5Ca
mutant 1 + 0.5% xylose; 7, Xac amy::pHF5Ca mutant 2, 8;
Xac amy::pHF5Ca mutant 2 + 0.5% xylose; and 9, protein
molecular weight marker. (B) X-ray film displaying bands
detected by the Western blotting analysis. Proteins in a
replica of the gel shown in A were  transferred to a PVDF
membrane and exposed to a secondary antibody coupled to
HRP. Lanes are the same as in (A). The position of the
TAP1479 is marked with a black arrow on the right hand
s

f
e
t
m
o
n

E. coli/pHF5Ca

Xac amy::pHF5Ca

kDa

A

B

–27

–20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

kDa

–27

–20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fig. 5 – Purification of TAP1479 from E. coli/pHF5Ca and Xac
amy::pHF5Ca. E. coli DH10B carrying pHF5Ca and a kanR

mutant of Xac harboring pHF5Ca integrated into its
chromosome were  induced for the production of the
TAP1479. Following expression, cells were lysed and
protein extracts subjected to affinity chromatography
through IgG-sepharose. (A) E. coli/pHF5Ca; and (B) Xac
amy::pHF5Ca, Coomassie blue-stained 10% SDS-PAGE
showing the separation of proteins from the fractions
collect throughout the process. (A) lane: 1, clarified lysate; 2,
flow through; 3–6, washes (20 column-volumes each); 7,
protein molecular weight marker; 8–14, elution fractions.
(B) Lane: 1, clarified lysate; 2, flow through; 3–5, washes; 6,
protein molecular weight marker; 7–14, elution fractions.
The position of the TAP1479 is marked with black arrows in
ide of the film.

or the production of fusion proteins tagged with the TAP-tag
ither at the C- or at the N-terminal ends.21,22 Integration of
he expression vectors into the chromosome of the bacterium
Please cite this article in press as: Dantas GC, et al. A protein expression sy
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ay occur site-specifically into the amy locus (as shown here)
r into the ORF as demonstrated previously in a prelimi-
ary characterization of pHF5Ca.40 Integration mediated by a
both gels.

crossover between ORFs (ligated in the vector and its chro-
mosomal copy) puts the expression of the TAP-tagged peptide
under the control of the native promoter of the chromosomal
ORF. Hence, use of pHF5Ca is recommended so as to have a
C-terminal TAP-tagged protein. The integration into the amy
locus is the preferable site of integration as it eliminates the
possibility of perturbations of chromosomal regions contain-
ing the ORFs under investigation. Genome integration also
guarantees that the expression cassette will be propagated
as a single copy per cell, allowing for a better control of pro-
tein expression under the xylose promoter.43,44 Finally, in this
study, we  have shown that the introduction of a TAP coding
stem for tandem affinity purification in Xanthomonas citri subsp. citri.

DNA into Xac had no detectable effect on virulence, which
emphasizes and underlines the utility of the TAP-expression
vectors for protein interaction studies in this plant pathogen.

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ARTICLE IN PRESSBJM-67; No. of Pages 9

 c r o b

r

8  b r a z i l i a n j o u r n a l o f m i

Result obtained from this study proved that the TAP-tag
could be stably expressed and purified from the soluble phase
of Xac cell extracts. Currently, we  are in the process of test-
ing a number of TAP-protein fusions (hypothetical, previously
characterized and control factors) in our model organism
in an attempt to conduct functional assignments using the
TAP-tagging strategy. Apart from its use in TAP-tagging exper-
iments, the expression vectors pHF5Ca and pHF5Na can also
be applied for protein expression and purification from Xan-
thomonas spp. thus eliminating the need for heterologous
expression in E. coli. An example of this application is the strat-
egy for expression and purification of TAP1479 outlined above.
Another feasible application would be in genetic comple-
mentation tests in vivo. In such experiments, the TAP coding
DNA may be removed during the cloning steps such that the
polypeptide produced in Xac will not carry any tag.

Although extensively explored in eukaryotes, the utility
of tandem affinity purification for protein–protein interaction
analysis in prokaryotes is limited.24,26,45–49 TAP-tagging was
originally used in E. coli as a tool for exploring the biologi-
cal roles of components of protein complexes involving ACP
and other cellular factors, as well as for the characterization
of YbdB (EntH), a thioesterase produced in E. coli under iron
starvation.26,45,47,48 A broader high-throughput protein inter-
action study using TAP-tag has been reported in E. coli in which
857 proteins were tagged24; more  than six hundred proteins
were successfully purified; of which, 530 were found to be a
part of protein–protein complexes. Protein interactants were
subsequently identified by mass spectrometry and the resul-
tant data were compiled to build a network of protein–protein
associations covering a vast variety of biological activities.
Additionally, the network raised the possibility of annotating
uncharacterized factors with their designated function. More
recently, TAP-tagging has been used to label factors in X. oryzae
pv. oryzae34,35 allowing for the quantitative analyses of pro-
tein expression and secretion. TAP-labeling was also used by
our group, in a previous study, to detect the expression of the
chromosome segregation protein ParB in Xac.40 In conclusion,
the results outlined above have demonstrated the stability of
the TAP moiety and the expression vectors described herein
have the potential to develop into valuable tools for exploring
protein networks in Xac especially where factors of unknown
function may be participants.

Conflicts  of  interest

The authors declare no conflicts of interest.

Acknowledgments

GCD and PMMM  received scholarships from Fundação
Please cite this article in press as: Dantas GC, et al. A protein expression sy
Braz J Microbiol. (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2016.01.026

de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP
2013/19806-5 and 2006/59494-9) and CAPES/Brazil. This work
was funded by FAPESP grant numbers 2004/09173-6, and
2013/50367-8.
 i o l o g y x x x (2 0 1 6) xxx–xxx

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