UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Karen Ingrid Tasca Marcadores de Ativação Imune, Inflamação Crônica e Estresse Oxidativo em Pessoas que Vivem com o HIV/Aids: a Busca do Melhor Prognóstico. Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Doenças Tropicais. Área de conhecimento: Imunologia. Orientadora: Profa. Adjunta Lenice do Rosário de Souza. Coorientadora: Profa. Mara Biasin. Botucatu 2016 Karen Ingrid Tasca Marcadores de Ativação Imune, Inflamação Crônica e Estresse Oxidativo em Pessoas que Vivem com o HIV/Aids: a Busca do Melhor Prognóstico. Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Doenças Tropicais. Área de Conhecimento: Imunologia. Orientadora: Profa. Adjunta Lenice do Rosário de Souza. Coorientadora: Profa. Mara Biasin. Botucatu 2016 “Que a conversa entre nossos silêncios não termine logo, tristonhos olhos castanhos, Rogo de coração que escolhas, dentre as tempestades, só a que te trouxer calmaria, e se por acaso a sorte lhe sorrir... ria! O apego às vezes é como uma parede que impede o corpo de receber um carinho da chuva que cai, e da brisa fresca que nos beija, pós tempestade… Aquela que me tem em verso, prosa e poesia”. Andrey S. Santos (em dedicatória) Tasca Dedicatória À minha família, noivo e amigos... Aos que me mostram, com o brilho de olhares otimistas, que tudo está bem - e como deveria... Aos que me apertam forte com os braços (ou patinhas), me dando forças pra continuar... Aos que me presenteiam com boa companhia e café e, com sorrisos singelos, "saboreiam" a vida comigo... Aos que ouvem meus anseios de coração aberto, ou me fazem/fizeram ouvir palavras serenas e lindas canções... Aos que sentiram comigo, o cheiro de chuva, daquela comida, da maçãzinha ou da mexerica no pé... Enfim, a todos aqueles que tocam minha alma e me inspiram... ...Dedico. (são muitos os sentidos - e sentimentos). Agradecimentos Agradecimentos Especiais... ...ao meu companheiro de todos os dias, Renato, por fazer cada dia da minha vida diferente do anterior. Por me tornar, a cada dia, ainda mais esperançosa, grata, sonhadora e feliz! Obrigada por, muitas vezes, me enxergar melhor do que eu realmente sou, por entender que eu choro porque tenho vontade, mas nem sempre tenho motivo... por me esperar e me entender, por me consolar com teus sorrisos e brincadeiras, e despertar o meu melhor! Espero retribuir seu amor, de toda alma e coração. ... à minha mãe Katia, por ter me entendido enquanto eu crescia e por ter aceitado minhas rápidas mudanças e me apoiado em todas as decisões. Por toda calma, amor e cuidado - com nós três! Obrigada por ter me aplaudido quando fui verdadeira, por ter me compreendido quando eu disse mentiras, apesar de me lembrar que elas maculam nosso caráter. Obrigada por ser “você mesma”, não desistir da felicidade e, com isso, me ensinar a importância de se buscar uma vida alegre, sempre. ...ao meu Pai Nelson e amiga Cris, pela atenção, carinho, elogios, incentivos e ótimos conselhos. Obrigada por terem me falado sobre os seus erros e sobre as coisas que aprenderam com eles, isso fez com que eu aceitasse os meus e, também aprendesse e me perdoasse. Tenho muito orgulho e me espelho muito em vocês, que sempre me fizeram sentir confiante, capaz e feliz com minhas escolhas. Espero poder ser digna da fé que vocês depositaram em mim. ...aos meus irmãozinhos Alan e Alex, por me ensinarem que, não importa onde e com quem estamos, o fato simples de “rir”, contagia e dá cor a qualquer ambiente em qualquer tempo, sem preço algum. Quando criança, sentíamos juntos o fervor das brincadeiras, os ressentimentos das broncas, as fantasias próprias da idade... agora, tudo virou lembrança, pra dar lugar a algo novo. Um sentimento lindo e valioso, de cumplicidade no olhar. Que bom que a gente cresceu e, o que antes eram dois dedos apontados pra mim, hoje são mãos que me levantam! Vocês são meus tesouros! ... à madretia Eneide e tia Tânia, pelo zelo, afeto e por, generosamente, me mostrarem que nossa força interior é tudo o que a gente precisa!.. que, se nada mudar, a gente invente e faça acontecer.. e, se algo mudar antes do tempo, que a gente tenha sabedoria e paciência pra entender!.. que, a dificuldade é pra ser enfrentada e, quando tudo ficar fácil, basta juntarmos as mãos e agradecer! Obrigada por serem exemplos de que, palavras são repletas de vibrações, por isso, não devemos perder nenhuma oportunidade de manifestar bons sentimentos e cativar quem nos cerca. ...aos avôs que nos protegem “lá de cima”... Valdemar, Nelson, Linda e Marlene, por serem meus anjos protetores, meus exemplos, meus amores. Entre as lembranças que gosto de ter, os sorrisos de vocês são “a saudade que gosto de lembrar, todos os dias”... Obrigada por estarem presentes, também, nos sons e nas palavras cheias de ternura que ainda carrego, nos cheirinhos e brisas que sinto, no brilho das estrelas. ...às amigas de infância, Bruna, Roberta e Sarah, pela amizade valiosa, uma planta rara que cultivo com muito carinho. Agradeço muito vocês, por permanecerem em minha vida, mesmo eu estando quase sempre tão distante, seja no telhado, nas dancinhas, no terreno baldio, no parque de diversão, nos conselhos, abraços e conversas longas antes de dormir. Obrigada por TUDO! ...às amigas de república, que tive/tenho a sorte gigante em compartilhar momentos inesquecíveis! Obrigada pelas conversas, segredos e aprendizados. Por me darem atenção e gastarem tão grande parte do tempo de vocês comigo; por me dizerem que devemos sorrir às pessoas que não gostam da gente, para mostrá-las que somos muito diferentes do que elas pensam. ... à minha família “mais nova”, sogros, cunhadas e avós: Sergio, Anabela, Anna, Adriana, Seu Antônio e Miluzinha. Obrigada por me acolherem e me abraçarem forte, e pelas palavra gentis que sempre me trazem: forças pra lutar, paz na alma e alegria pelo simples prazer de viver. Quanta sorte tive de encontrar vocês, e trazê-los pra minha vida! ...à minha orientadora e amiga Lenice, por ter me dado claras respostas às perguntas que eu sempre a levava; por ter considerado meus sentimentos e necessidades, me mostrando que, muitas vezes, eles eram muito semelhantes aos seus; por ter me mostrado que ser gentil e atenciosa é mais importante do que estar certa; por ter reforçado minha confiança, para que eu pudesse continuar revelando e defendendo meus pensamentos e princípios. Seus ensinamentos foram muito além dos conteúdos do currículo. Convivemos e tivemos aprendizados importantes para a vida. Muito obrigado pela sua dedicação e paciência durante estes sete anos. À você, toda minha gratidão e meu carinho! ...à Camila, que me auxiliou muito nesta jornada, segurou minha mão e me dirigiu palavras de otimismo. Uma pessoa que tem o dom em acreditar no bem, e em ajudar todos que a procuram, simplesmente por entender nossas dificuldades e acreditar que a força que define o que vai dar certo ou errado na nossa vida, está no nosso interior, em nossa competência, coragem, esforço, fé. Eu não teria conseguido finalizar esta etapa importante sem você! Obrigada por acreditar em mim, pela profissional competente e determinada e pela pessoinha especial que é! ...aos colaboradores deste trabalho, que moram no meu coração: Juliana, Mari Gatto, Vanessa, Francilene, Mônica e Caio. Agradeço todo esforço e ajuda para que este trabalho ficasse mais bonito, pela amizade que sempre nos ajudou a superar qualquer obstáculo acadêmico ou pessoal, pela confiança, carinho e compreensão sem fim. Por estarem do meu lado, vocês viram de pertinho, como todo este caminho foi percorrido, obrigada pela companhia neste trajeto (não muito fácil, mas compensador) e por me fazerem sentir que sou alguém com quem vocês se importam! ...a Mara Biasin (la “capa del mio cuore”), Fede Gnudi (la mia tata!), Salomè Ibba, Irma Saulle, Mariacristina De Luca, Micaela Garzeano, Sara Yahyaei, Federico Tirabasso, Veronica Rainone, Paolo Cattaneo, Angela Berzi, Daria Trabattoni, e Mario Clerici (Mago). Sono stata molto fortunata ad aver trovato tante persone fantastiche in questo lab, di cui ho fatto parte! E' stato bellissimo conoscervi e aver potuto imparare e lavorare con voi. Siete persone straordinarie, gentili e sempre disponibili. Di parole ne potrei dire tante... ...ma l’unica che racchiude tutto è Grazie di cuore a tutti! ... aos pacientes que aceitaram participar desta pesquisa e muito me ensinaram. Aqueles que não desistem de si mesmos, e que descobriram que a vida é o maior de todos os espetáculos - um espetáculo dado pelo autor da existência. Vou seguir a coragem de vocês, por toda a vida. - ɤ - Agradecimentos Meus sinceros agradecimentos... ...a todos que contribuíram com este trabalho de forma direta ou indireta: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Medicina de Botucatu – FMB/UNESP Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Departamento de Fisiologia Universidade de Milão (Università degli Studi di Milano) – Departamento de Ciências Biomédicas e Clínicas, Hospedale L. Sacco Conselho de Pós-Graduação em Doenças Tropicais Seção de Pós-Graduação da FMB, em especial à Janete A. H. N. Silva, Bruna Q. S. Jorgetto, Diego C. B. Oliveira, Lilian C. N. Bianchi e Solange S. Cagliari Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem e secretários Michele K. L. Nishi, Júlio C. Botari e André Mioni Serviço de Ambulatórios Especializados de Infectologia "Domingos Alves Meira" (SAEI-DAM), em especial ao Prof. Dr Alexandre N. Barbosa Comissão Permanente de Pesquisa (CPP) da FMB/UNESP Laboratórios de Citometria e Carga Viral, Divisão de Hemocentro, FMB/UNESP Membros da banca de Defesa da Tese: Profa. Dra Silvia Gatti (Universidade de Campinas, UNICAMP), Prof. Dr Reinaldo Salomão (Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP), Prof. Dr. Igor O. Minatel, Profa. Dra Alexandrina Sartori, Profa. Dra Marjorie A. Golim (FMB/UNESP), Profa. Dra Karen L. Morejon (Universidade de São Paulo –USP/RP) e Profa. Dra Daniela Moris (UNOESTE). - ɤ - À banca do Exame Geral de Qualificação, Profa. Dra Camila Renata Correa, Prof. Dr João Pessoa de Araújo Júnior, Profa. Dra Alexandrina Sartori (FMB/UNESP) e Dra Susan Pereira Ribeiro (Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, FMUSP), obrigada pela disposição em analisar este trabalho, pela contribuição e valiosas sugestões; Meu agradecimento especial aos Docentes do Departamento de Doenças Tropicais, Profs Dr Rinaldo P. Mendes, Dr Paulo C.M. Pereira e Prof. Dr Carlos Magno C. B. Fortaleza, pelo apoio, ajuda e incentivo durante estes sete anos que compartilhamos; ao Prof. Dr Ricardo A. M. B Almeida, meu supervisor do Estágio Docência, agradeço muito pela oportunidade, conversas e conselhos; à Profa. Dra Sueli Aparecida Calvi, obrigada por toda assistência, contribuição e estímulo... continue forte como sempre, estamos todos torcendo por você! Agradeço o Escritório de Apoio à Pesquisa (EAP), em especial o prof. Dr. José Eduardo Corrente, responsável pela análise estatística do trabalho; Rita de Cássia Athanázio pelo auxílio na pesquisa, ajuda na captação e administração dos recursos e; as secretárias Cinthia Scolástico C. de Souza e Juliana Interdonato; Meu muito obrigada aos amigos (mais amigas) da MI, das diversas “gerações”, pela convivência e ajuda no laboratório: Thaty, Drica, Laura, Paty, Thaysa, Andréia, Lariza, Bia, Jéssica, Elaine, Priscila, Lívia, Raquel, Lina, Mizi, Fernanda, Michely, Maria Fernanda, Miriam, Pananã, Daniela, James, Thales e Talísia; aos PIBICs Jr Christian e Karina e ao responsável pelo laboratório, Rodrigo; Aos colegas do SAEI-DAM (Hospital Dia), sou muito grata pela assistência e ajuda, tanto no recrutamento dos pacientes e coletas de sangue quanto na disposição da lista de medicamentos: Marli, João Paulo, Sebastião, Vânia, Fabiana, Beatriz, Rodrigo, Jéssica, André, Renata L., Gabriela, Luciene, Rosemeire, Adolfo, Reginaldo, Sandra, Rejane, Solange, Luciana, Lilian, Thaís, Kátia, Zezé, Terezinha, Valéria, Renata M., Priscila, Maiara, Vivian, Maria José, Aline, Cleide, Laena, Tassiana, Leticia, Danilo, Victor, Karina e Waldomiro; Obrigada prof. Dr. Luis Fernando Barbisan e pós graduandos Renata, Bruno e Guilherme do Laboratório de Carcinogênese Química e Experimental do IBB/Unesp, pela ajuda e por permitirem a realização da leitura das lâminas do Cometa. Aos colegas do Fiscel - UFRGS, em especial ao professor Paulo Ivo Bittencourt (PIVO) que sempre esteve muito disposto em me ajudar e me recebeu tão bem no seu laboratório, me presenteou com ótimas conversas, com almoço, cafezinhos, ovos e reagentes! Um exemplo de profissional, que ama o que faz, e de pessoa, que cativa quem tem por perto. Agradeço também as pessoas me ajudaram muito durante os 2 meses de “intensivão de westernblots”: obrigada Cinthia (infinitos “obrigadas” pra você!), Patrícia, Rossana, Maurício, Inês, Grazi, Luiz, Helena, Ritinha, Guilherme, Ítalo, Sofia, Fernanada, Thiago, Aline e Hilton. Agradeço imensamente todos os funcionários da UNIPEX-FMB, em especial: Regina, Cilmery e Silvia que me ajudaram com as técnicas de ELISA e HPLC; Carlinhos, Sueli, Paulinho, Danilinho, Zé Georgete, Marta,Florian, Elisete, Igor, Vicky, Elisete, Rogerio, Mara, Elenize, Vitor e Cristina. Meu obrigada, também, aos pós-graduandos da UNIPEX Fabiane, Damiana (Patologia) e Vitor (Clínica Médica), sempre muito solícitos. Agradeço imensamente meu amigo Rafael Gelaleti (Ginecologia), pela ajuda no teste do cometa e pelas boas e produtivas conversas, desde a graduação. Aos amigos de Pós-Graduação, que me acompanharam em vários momentos, de disciplinas às organizações de eventos: Bruna, Gabrielli, Carlos, Mariana, Adriana, Maila e Renata (VI EPG) Gabriel, Nathália, Ingrid, Mariana R, Mariana F, Juliana, Régis, Tatiana, Aline Aki, Natália P, Lígia (VII EPG), Eduardo, Natália, Gustavo Adolfo, Michelle, Vinícius, Marcel, Thaís,Vivian e Tiago (CEVAP) e Daniela (IBB). Aos funcionários da administração da FMB, sempre muito prestativos: Edson (compras), Karina (internacionalização), Josué (almoxerifado), Renato e Lucas (informática), Ana Paula (CPP), Paulo (central de aulas), Kleber e Beto (CEP). Aos profissionais que me ajudaram no recrutamento de pacientes de outras cidades, Ártemis de Americana, Marta de Avaré e Giovana e Cibele de Bauru. Ao Departamento de Biologia e Zootecnia da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, pela minha formação, e por sempre me acolherem de braços abertos professores: Wilma (ex-orientadora e supervisora do estágio docência), Marília, Milton, Jorgito, Sérgio, Conceição, Susumu, Edson, Kiko, Chiquitelli, Kuniko, Haga, Rosicleire, Alexandre, Ana Maria e Kitty – e ao funcionário sempre animado, Joarez. Agradeço, também, alguns amigos de Botucatu, que me fizeram enxergar as coisas de um modo mais tranquilo, sensato e bonito: Lucila (Biopsico), Claudinha (Prana Yoga), Aline (Profa de fotografia - MAC), Helena (Prof de inglês), Tatiana e Luciane (Profas de italiano) , Carol Sasso e Vanessa Ito. Grata aos colegas da UNICAMP, por sempre torcerem por mim: Profa Silvia Gatti, Maria Clara, Profa Ana Maria Guaraldo (IB) e Laboratório de Pesquisa em Aids: Prof Chico Aoki, Ronald, Elaine, Diogo, Ângela, Daiane, Valéria, Giovana, Michely, Marcina, Vera, Manuel, Paulinho e Gaby; Obrigada, também, amigos que moram longe mas são “amigos do peito”: grande amigo físico Cícero, amigos de graduação Aline, Diogenes, Fabinho, Quexada, Flávia, Cecília, Simone, Guará, Bruno, Deise, Thiago, Débora, Zé e Isa (III Turma de Ciências Biológicas), bixetes Helô e Naty; Liana, Andréia e Profa Fátima (Integral);, Paulo Curió, PA, Karen, Dio, Alexandre, Maurício, Pirica, Andrea, Leda, Carolina,Farias, Wilson, José Ricardo e Profs do meu coração, Odila, Xico, Deise, Edi, Clélia, Ana, Clarete, Wagner e Bernadete (Pery) , Marcel (hand) , Rafael Aichinger, Renato, Thiago e Regina, Telcia e Marcel (e PH!),, Roseli, Eduardo, Emerson, Cida, Otávio, Viviane, Rodrigo, Marivani, Edmilson, Gil, Michelle, Américo, Seu Geraldo (Itu), Maria Olivia (Araraquara). E, finalmente, agradeço as pessoinhas especiais, que sempre me deram muito carinho e apoio: Tio Anselmo, primos Newton e Junior; Andrea, Clara, Bruno, Matheus, Tacília; cunhadinhas Mariana e Karina, cunhadinhos Bruno e Rodrigo; Tios Vande e Ivanilda; Damaris, Arnaldo, Fernanda, Rodrigo, Camila, Zeca, Eliana, Janaína, Bruno, Ana, Rosana, Giu, Gabi, André, Reinaldo, Florinha, Kadu, Zezé, Alessandro, Eugênia, Lucinha, Kiko, Kika, César, Fátima, Nilza, Claudia, Leila, Vera, Paola, Zezé, Moisés, Gim, Fabiana, Caio, Luizinho, Márcia e Nina! - ɤ - À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de estudos (DS e PDSE), à Pró-Reitoria de Pós-Graduação (ProPG) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro para participação em congressos. Epígrafe Il buon senso c'era; ma se ne stava nascosto, per paura del senso comune. O bom senso existia; mas estava escondido, por medo do senso comum. Alessandro Manzoni Resumo Resumo Introdução: ao analisar as atuais causas dos óbitos das pessoas que vivem com HIV/aids (PVHA), diferentemente da era pré-cART (terapia antirretroviral combinada), destacam-se doenças típicas do envelhecimento, tais como dislipidemias, doenças cardiovasculares, diabetes mellitus, entre outras, que aparecem de forma muito precoce nesta população. Tal fenômeno ocorre devido às persistentes ativação imune e inflamação crônica em PVHA, que são favorecidas pela interação da HMGB1 - high mobility group box protein-1 - e dos produtos finais de glicação avançada (AGEs), com seu receptor (RAGE), presente na superfície da membrana celular. Em sua forma solúvel, sRAGE é uma provável supressora da ativação imune por sequestrar os ligantes e evitar a interação deles com a forma transmembrana, anulando assim, seus efeitos. Além disso, a translocação microbiana e o estresse oxidativo têm sido estudados como potencializadores dessa cascata inflamatória e, em PVHA, níveis de sCD14 e de produtos de peroxidação lipídica, tais como o malondialdeído (MDA) e 8-isoprostano, estão elevados em relação aos indivíduos não- infectados, enquanto que o sistema antioxidante dos portadores do vírus, incluindo a capacidade antioxidante total (CAT), vitaminas e seus precursores, também é considerada deficiente. Portanto, esses marcadores estão relacionados, tanto com a própria evolução para a doença, quanto com o aparecimento e gravidade das comorbidades não-associadas a aids. Objetivos: avaliar a influência da cART e das contagens de células T CD4+ nos níveis plasmáticos de sRAGE, AGEs, HMGB1, sCD14, citocinas, MDA, 8-isoprostano, CAT, vitaminas, proteína C-reativa (PCR) e variáveis metabólicas, além da relação com os danos genotóxicos induzidos por estresse oxidativo à partir das células mononucleares do sangue periférico das PVHA. Métodos: a abordagem foi realizada em dois estudos, um longitudinal envolvendo 30 PVHA analisadas antes (M0) e cerca de seis a 12 meses após início terapêutico (M1) e, outro estudo de caráter transversal, que dividiu os 92 participantes em cinco grupos, conforme uso ou não da cART e resposta imunológica apresentada, sendo ela, adequada (T CD4+>500) ou inadequada (T CD4+<500 células/mm 3 ). A inclusão dos participantes ocorreu no Serviço de Ambulatórios Especializados de Infectologia “Domingos Alves Meira”, Botucatu/SP. Foram realizadas as seguintes técnicas: cromatografia de alta eficiência (HPLC) para o MDA e vitaminas; total antioxidant performance para o CAT; ensaio imunoenzimático (ELISA) para o sRAGE, AGEs, HMGB1, sCD14 e 8-isoprostano; citometria de fluxo para as citocinas IL-6, IL-8 e IL-10 e ensaio do Cometa para dano no DNA. Demais dados foram coletados de prontuários médicos. Na análise estatística foram utilizados, para as variáveis não paramétricas, os testes Poisson e Distribuição Gamma e, para as paramétricas, Binomial Negativa e Tukey-Kramer. Foram calculadas, também, correlações de Pearson. A análise foi ajustada para idade, gênero, prática de exercícios físicos, uso de tabaco e de antidepressivos. A significância foi considerada para p≤0,05. Resultados: no estudo longitudinal os níveis de triglicérides e PCR aumentaram após terapia e, concentrações de vitaminas e CAT diminuíram neste período. Além disso, houve aumento no dano do DNA pós-cART nos indivíduos que iniciaram a terapia com altas contagens de T CD4+. Naqueles que a iniciaram com baixas contagens destas células, ocorreu aumento de 8- isoprostano e diminuição nos níveis de AGEs. Já no estudo transversal, os grupos sob cART há mais de cinco anos e controle da viremia apresentaram os menores níveis de IL-10, sendo que, entre eles, o grupo de indivíduos com contagens mais altas de T CD4+ mostrou os níveis mais elevados de sCD14 e sRAGE. Ademais, no grupo virgem de tratamento com baixas contagens de T CD4+ houve maior concentração de 8-isoprostano, enquanto que, naquele sem tratamento, mas com altas contagens de T CD4+ e infecção há mais de cinco anos, observou- se os menores danos genotóxicos. Conclusão: o uso da cART influenciou na melhora dos parâmetros relacionados à infecção pelo HIV, porém, não houve benefícios no status inflamatório e de ativação imune, considerando os marcadores escolhidos. A cART parece, também, ter contribuído com o aumento no estresse oxidativo dos indivíduos infectados, tanto nos meses iniciais da terapia quanto seu uso em período prolongado, conforme demonstrado nos dois estudos. Assim, há necessidade de mais investigações, com maior casuística, sobre as alterações metabólicas, imunológicas e oxidativas provocadas pela cART. Além disso, devido à sua indicação cada vez mais precoce e uso prolongado, estratégias para minimizar estes parâmetros devem ser consideradas, tais como, adoção de hábitos saudáveis e acompanhamento periódico em Serviço de Referência. Abstract Abstract Introduction: Analyzing the current causes of deaths of people living with HIV/AIDS (PLWHA), it turns out that, unlike the pre-cART era (combination antiretroviral therapy), the highlights are typical manifestations of aging, such as dyslipidemia, cardiovascular disease and diabetes mellitus, which appear early in this population. This phenomenon occurs because of persistent immune activation and chronic inflammation in PLWHA, which are favored by the interaction of HMGB1 (high mobility group box protein-1) and AGEs (advanced glycation end-products), with the receptor RAGE, present in surface of the cell membrane. In its soluble form, sRAGE competes with the transmembrane receptor sequestering its ligands and preventing the activation of proinflammatory pathways. Furthermore, microbial translocation and oxidative stress have been studied as enhancers of this inflammatory cascade. Compared to the non-infected individuals, in PVHA the sCD14 and product levels of lipid peroxidation, such as malondialdehyde (MDA) and 8-isoprostane are increased, while their antioxidant system, including the total antioxidant capacity (TAC), vitamins and their precursors are deficient. Therefore, these markers are related both to the evolution of the disease itself, as with the onset and severity of non-AIDS comorbidities. Objectives: to evaluate the influence of cART and CD4+ T cells counts on plasma levels of sRAGE, AGEs, HMGB1, sCD14, cytokines, MDA, 8-isoprostane, TAC, vitamins, C-reactive protein (CRP) and metabolic variables, beyond their relationship with genotoxic damage induced by oxidative stress from peripheral blood mononuclear cells of PVHA. Methods: the approach was made through two studies, a longitudinal design enrolled 30 PVHA, analyzed before (M0) and approximately six to twelve months after (M1) therapy initiation; another transverse study, which divided the 92 participants into five groups, as use or not of cART and the presented immune response (adequate when the CD4+ T <500, or inadequate to CD4+ T >500 cells/mm 3 ). The participants included attending the Specialized Ambulatory Service of Infectious Diseases "Domingos Alves Meira", Botucatu/SP. The following techniques were performed: high performance liquid chromatography (HPLC) for the MDA and vitamins; total antioxidant performance for CAT; enzyme immunoassay (ELISA) to sRAGE, AGEs, HMGB1, sCD14 and 8-isoprostane; flow cytometry for IL-6, IL- 8 and IL-10 and comet assay for DNA damage. Other data were collected from medical records. We used Poisson test or Gamma distribution for non-parametric variables and Negative Binomial or One-way ANOVA with subsequent Tukey-Kramer post-hoc test for those parametric data. We also performed Pearson correlations. All calculations were adjusted for age, sex and tobacco use, practice of intense physical activity and use of anxiolytics and/or antidepressants (p≤0.05). Results: In the longitudinal study, after cART initiation triglyceride and CRP levels increased, and vitamin concentrations and CAT decreased. In addition, there was an increase in DNA damage of individuals who initiated therapy with high CD4+ T counts. Those started with low CD4+ T counts, occurred an increase in 8-isoprostane levels and a decrease in AGEs. In cross-sectional study, the groups under cART for more than five years and controlled viremia had lower IL-10 levels, and those with higher CD4+ T cell counts showed higher levels of sCD14 and sRAGE. Moreover, the naïve group with low CD4+ T counts presented the highest concentration of 8-isoprostane, while naïve patients but with a high CD4+ T count and infection for more than five years, it was observed the smallest genotoxic damage. Conclusion: the use of cART improved the parameters related to HIV infection, however, failed to improve the inflammatory and immune activation status, considering the variables analyzed here. The therapy also showed to increase the oxidative stress of infected individuals, both in the initial months as long-term use of cART, as shown in our both studies. Thus, there is need for further research with a larger cohort, about the disturbance in metabolic, immunological and oxidative status, potentiated by cART. In addition, because of the current ever-earlier recommendations to start cART and its prolonged use, strategies to minimize these parameters should be considered, such as adoption of healthy habits and regular monitoring in Reference Service. Sumário SUMÁRIO Resumo /Abstract CAPÍTULO I ....................................................................................................................................... 1 Revisão da Literatura............................................................................................................................. 1 HIV/Aids: Aspectos Gerais .................................................................................................................. 1 Envelhecimento Precoce e Inflamação em PVHA ............................................................................... 5 Estresse Oxidativo na Infecção pelo HIV ........................................................................................... 13 Justificativa do Estudo ........................................................................................................................ 21 Objetivos ............................................................................................................................................. 22 Objetivo Geral ..................................................................................................................................... 22 Objetivos Específicos ......................................................................................................................... 22 CAPÍTULO II ................................................................................................................................... 23 Desenho do Estudo .............................................................................................................................. 23 Sujeitos do Estudo ............................................................................................................................... 23 Delineamento....................................................................................................................................... 24 Marcadores e Técnicas ........................................................................................................................ 25 Referências .......................................................................................................................................... 27 CAPÍTULO III .................................................................................................................................. 35 Artigo nº 1: The initial months of antiretroviral therapy and its influence on AGEs, HMGB1 and sRAGE levels in asymptomatic HIV-infected individuals .................................................................. 36 Artigo nº 2: Antiretroviral therapy initiation alters the redox system of asymptomatic HIV-infected individuals. .......................................................................................................................................... 52 Artigo nº 3: Ativação Imune e Estresse Oxidativo em Indivíduos com Infecção Assintomática pelo HIV ...................................................................................................................................................... 72 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................................. 97 ANEXOS ............................................................................................................................................. 99 I - Termos de Consentimento Livre e Esclarecido .............................................................................. 99 II- Ficha de Entrevista ....................................................................................................................... 101 III- Aprovação do CEP local ............................................................................................................. 102 IV- Alteração de Título de Projeto de Pesquisa, nível doutorado...................................................... 104 Capítulo I Tasca, K. I., 2016 1 Capítulo I Revisão da Literatura  HIV/Aids: Aspectos Gerais A Organização Mundial da Saúde estimou, em 2014, que a epidemia por HIV atingia 36,9 milhões de pessoas no mundo, com prevalência global de 0,8% (figura 01). Há mais de 30 anos a aids se mantém como importante causa de mortalidade, ocupando o 6º lugar no ranking mundial de óbitos, com cerca de 1,5 milhão de mortes em 2012 (1,2) (figura 02). No Brasil, desde o início da epidemia em 1981 até junho de 2014, foram registrados 757.042 casos no país, com prevalência estimada de 0,4%, distribuição concentrada nas regiões Sudeste e Sul e maior incidência em homens (65%) (3) . Só no estado de São Paulo, 228.698 casos foram notificados de 1980 a junho de 2013 e, destes, o município de Botucatu representa 1.551 casos (4) . Figura 01. Taxas de prevalência de adultos infectados pelo HIV no mundo. Fonte: UNAIDS, 2015 (1) . Tasca, K. I., 2016 2 Figura 02. Dez principais causas de morte no mundo no ano de 2012. Siglas: DPOC, doença pulmonar obstrutiva crônica; AVC, acidente vascular cerebral. Fonte: WHO, 2014 (2) . Apesar da infecção por HIV ser considerada, atualmente, uma doença crônica devido aos avanços tecnológicos e de pesquisas relacionadas ao seu diagnóstico precoce e tratamento eficaz, ela ainda é emergente e representa um dos maiores problemas de saúde pública, em função do seu caráter pandêmico e de sua gravidade. Porém, o impacto dessa epidemia seria muito maior se a estratégia de combinação de diferentes drogas na terapia antirretroviral (cART), não tivesse mudado a história natural da doença, reduzindo drasticamente sua morbimortalidade (1) . Em sua história natural, a infecção por HIV inclui as fases aguda (semanas a poucos meses), crônica ou assintomática (anos) e a aids, propriamente dita. O tempo de evolução para a doença após o contágio é de, aproximadamente, 10 anos, em indivíduos considerados “progressores típicos” e na ausência de cART (figura 03). No entanto, uma pequena parcela dos infectados (cerca de 5,0%) (5) permanece sem sintomas ou evidências clínicas de progressão por bem mais de 10 anos, sendo conhecidos como “progressores lentos” - LTNP (long term non-progressors). Esse é um grupo importante que permite o estudo de fatores associados ao controle do ritmo de progressão da doença, tais como, fatores genéticos, eficiência da resposta imune humoral e celular e a presença de fatores antivirais solúveis (6,7) . Tasca, K. I., 2016 3 Figura 03. Progressão da infecção por HIV em progressores típicos (cinza), rápidos (azul) e lentos (verde). Fonte: Poropatich K, Sullivan DJ, 2011 (7) . HIV são retrovírus que podem infectar vários tipos celulares, principalmente os linfócitos T com marcador CD4+ (T CD4+), que apresentam receptores de quimiocinas específicos, CCR5+ ou CXCR4, em sua superfície. Assim, o principal dano causado pelo HIV é a deterioração progressiva do sistema imune celular, levando a grave imunodepressão, o que torna o indivíduo mais suscetível às doenças oportunistas ou certos tipos de neoplasias (3) . Além disso, algumas células infectadas permanecem latentes, mantendo pró-vírus integrados ao seu DNA, mas sem expressar proteínas virais, dando origem aos conhecidos “reservatórios virais”. Essa condição permanece até que esta célula seja estimulada/ativada, o que atrasa o combate do sistema imune contra o vírus ou dificulta a ação dos medicamentos antirretrovirais (ARV) disponíveis (8,9) . A eficácia do primeiro regime terapêutico e qual é o melhor momento para iniciá-lo são tópicos até hoje discutidos em todo o mundo e que geram muitas questões que, ainda, necessitam de respostas consistentes (10) . Alguns estudos mais recentes, sugerem maior sobrevida (11,12) com o início precoce de cART e mais benefícios ao paciente, tais como melhor reconstituição imune (13) . Quanto maior o nadir, cuja expressão é dada à menor contagem de T CD4+ ao longo da infecção, melhor prognóstico dos pacientes. Outros Tasca, K. I., 2016 4 benefícios do tratamento precoce seriam limitação da diversidade viral com redução do reservatório, protegendo os sistemas imunes, inato e adquirido, dos efeitos deletérios da ativação imune crônica (11) e diminuição da replicação do HIV, reduzindo, substancialmente, a sua transmissão (14,15) . Desta forma, o Ministério da Saúde do Brasil que, até dezembro de 2013 indicava início terapêutico aos assintomáticos, apenas quando estes apresentavam T CD4+ inferior a 500 células/mm 3 , passou a recomendar o tratamento para todas as pessoas que vivem com HIV/aids (PVHA), independentemente dos níveis de T CD4+ e sintomatologia (14). Entre as classes de medicamentos disponíveis estão os inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN), inibidores de transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (ITRNN), inibidores de protease (IP), de fusão, de integrase e antagonista do correceptor CCR5, drogas que têm sido utilizadas associadas, compondo diferentes esquemas terapêuticos (14) . Contudo, há um grupo de infectados sob cART e supressão viral completa por um longo período, que continuam apresentando reconstituição imune incompleta, ou seja, a contagem de T CD4+ se estabelece em níveis inferiores a 500 células/mm 3 . Esses são os chamados “não respondedores imunológicos” – NRI (ou INR, immunological non- responders). A patogenia deste fenômeno ainda não está clara, mas sabe-se que há redução na proliferação de células T CD4+ de memória, aumento na susceptibilidade a apoptose em linfócitos T, replicação viral residual e altos níveis de lipopolissacarideo (LPS) e ativação imune (13,16,17) . Estas pessoas apresentam risco maior de morbimortalidade quando comparadas àquelas sob cART que conseguem a recuperação celular durante o curso da infecção (18) . Fato é que, hoje em dia, garantido o acesso à cART e também a bons serviços de assistência à saúde, a expectativa de vida de uma PVHA se assemelha muito à da população geral, tornando a abordagem clínica da infecção pelo HIV muito semelhante à de outras doenças crônicas, com benefícios visíveis, principalmente, nos pacientes que têm adesão à terapia e ao acompanhamento no Serviço de Referência (1,19) . Tasca, K. I., 2016 5  Envelhecimento Precoce e Inflamação em PVHA Apesar das conhecidas vantagens da cART em longo prazo, como os benefícios clínicos que são decorrentes, principalmente, do controle na replicação do HIV, o início terapêutico tem ocorrido cada vez mais cedo na população de infectados. Devido a este fato, têm ocorrido também mais precocemente, eventos adversos causados pelos ARV, tais como, citotoxicidade e transtornos metabólicos (20) . Analisando as causas atuais dos óbitos das PVHA, diferentemente da era pré-cART, as infecções oportunistas são responsáveis apenas por uma pequena parcela deles. Destacam-se agora doenças típicas do envelhecimento, tais como, doença cardíaca isquêmica, acidente vascular encefálico e outras alterações do sistema nervoso central, dislipidemias, hepatopatias, doença renal crônica, diabetes mellitus, alterações ósseas, infecções e cânceres não relacionados à aids, entre outras (21-27) . Estas comorbidades são mais frequentes em indivíduos infectados por HIV, do que os não infectados (28) (figura 04). Essas doenças crônicas, muito comuns em idosos da população geral, acometem mais cedo as PVHA (22) , caracterizando o “envelhecimento precoce”. Exemplo disso é que, uma PVHA de 40 anos apresenta número semelhante de comorbidades ao de um indivíduo não infectado com cerca de 60 anos (22) (figura 05). Figura 04. Distribuição de comorbidades em indivíduos portadores ou não do HIV. Sigla: COPD, chronic obstructive pulmonary disease. Fonte: Schouten J et al., 2012 (28) . Tasca, K. I., 2016 6 Figura 05. Prevalência de “polipatologias” (Pp) entre infectados e não infectados pelo HIV, por faixa etária. Comorbidades: hipertensão, diabetes mellitus, hipotireoidismo, doenças cardiovasculares e fraturas ósseas. Fonte: Guaraldi G et al., 2011 (22). Muitos fatores fisiopatológicos estão envolvidos com o aparecimento deste fenômeno. Os maus hábitos de vida, tais como, tabagismo, sedentarismo, alimentação desbalanceada e estresse, a influência genética e/ou familiar e a presença de alguns patógenos, como citomegalovírus e vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC) podem agravar essas comorbidades (26) . No entanto, o processo inflamatório crônico apresentado por indivíduos infectados pelo HIV, talvez, seja um dos mais importantes mecanismos desencadeadores do envelhecimento precoce. Essa inflamação persistente em PVHA deve-se, principalmente, à constante replicação residual do HIV, à translocação microbiana e à intensa ativação do sistema imune (29,30) (figura 06). De modo mais detalhado, além da desregulação das subpopulações de células T helper (Th)1 e Th2, bem conhecidas na infecção por HIV (31) , outro perfil de respostas é diminuído em PVHA, o Th17. Este tipo de resposta contribui para a homeostase no tecido linfoide associado ao intestino (GALT), pois previne a inflamação local, a perda da integridade e alterações na estrutura e função dessa mucosa ou da flora bacteriana. Como consequência, há menor risco de ruptura da barreira epitelial (32,33) dificultando a translocação microbiana do lúmen intestinal para o sangue periférico (33,34) . Na falha desse processo ocorreria ativação Pp Tasca, K. I., 2016 7 imune sistêmica (29) , promovendo aumento da inflamação e comprometendo ainda mais o status clínico das PVHA. Figura 06. Mudança de cenário das causas de morte em infectados pelo HIV, pré- (azul) e pós- (rosa) cART. Fonte: Adaptado de Hsu et al., 2013 (29) ; Hunt, 2012 (35) . A translocação microbiana é mais intensa em indivíduos PVHA (34,36) e pode ser identificada pelas dosagens plasmáticas de CD14 solúvel (sCD14), que se liga ao LPS e ativa o fator de transcrição nuclear kappa-B (NF-B), com consequente produção intensa de citocinas pró-inflamatórias (34) . Além disso, as respostas adaptativas contra o HIV, principalmente, a de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos, suprimem a replicação viral, mas contribuem igualmente para o aumento da ativação imune crônica (37) . A ativação celular de T CD8+ nos indivíduos infectados tem sido relacionada à diferenciação atípica na população de células T (38) , devido a um processo que envolve a via de sinalização “proteína quinase ativada por mitógenos” (MAPK) (39) . Esta via também contribui com a patogênese da doença, pois é ativada em resposta a estímulos contínuos de estresse e ao ambiente pró-inflamatório. Muitas das etapas do ciclo replicativo do HIV parecem depender desse estímulo de mitógenos, como o desbloqueio da transcrição reversa e integração completa do DNA pró-viral (40) . Tasca, K. I., 2016 8 Outros marcadores estão relacionados à ativação celular. Assim, os produtos finais de glicação avançada (AGEs) são resultados de reações não enzimáticas entre açúcares redutores e componentes celulares, incluindo proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos que se acumulam no tecido vascular durante o envelhecimento (41) . Tais produtos interagem com seus receptores (RAGE), membros da superfamília das imunoglobulinas que estão expressos na membrana de vários tipos celulares (41) . A expressão de RAGE aumenta em consequência do acúmulo de seus ligantes, como AGE, HMGB1 (high mobility group box protein 1) e mediadores inflamatórios (42) . Quando essa ligação entre produtos e receptor acontece, vias celulares pró- inflamatórias e pró-coagulantes são ativadas, o que aumenta a produção de moléculas de adesão, de citocinas inflamatórias como a interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alpha (TNF-α), além da geração de óxido nítrico (NO), que contribuem com várias condições patológicas graves, incluindo o desenvolvimento de aterosclerose, diabetes mellitus, sepse, artrite reumatoide, doenças neurológicas, entre outras (43-47) . A forma solúvel de RAGE (sRAGE), em contrapartida, atua como supressora da ativação e sinalização de RAGE, por sequestrar seus ligantes e impedir a interação ligante-RAGE e seus efeitos (48) (figura 07). Figura 07. Cascata inflamatória decorrente da ativação de RAGE, devido a interação com seus ligantes AGE e HMGB1. Siglas: AGE, produtos finais de glicação avançada; RAGE, receptor de AGE; HMGB1, high mobility group box protein-1. Fonte: Adaptado de Kalea et al., 2009 (48) . Tasca, K. I., 2016 9 Jeonga et al. (45) em estudo realizado com indivíduos infectados pelo HIV concluíram que altos níveis de sRAGE estiveram relacionados ao menor desenvolvimento de aterosclerose e sugeriram o papel protetor deste marcador, que poderia ser utilizado na prática clínica para predizer riscos cardiovasculares nas PVHA. Neste mesmo estudo, não houve diferença entre os grupos de acordo com a classe de ARV utilizada, no entanto, grande parte dos pacientes com altas dosagens de sRAGE estava sob regime de cART composto por ITRNN (46) . Elevados níveis sistêmicos de HMBG1 foram reportados em condições pró- inflamatórias crônicas, incluindo diversas comorbidades (47,49,50) . A HMGB1, considerada uma alarmina, tem sua produção desencadeada por vários tipos celulares a partir de diferentes estímulos, como de LPS, interferons (IFN) e TNF-α (51) ou ela é secretada passivamente, como resultado de processos apoptóticos e de necrose (52) , condições que são comuns em indivíduos infectados pelo HIV. Assim, altos níveis de HMGB1 também foram encontrados em PVHA, em relação à população não infectada e, principalmente, em pacientes com doença avançada (52,53) . Os mesmos autores mostraram associação deste marcador com a carga viral plasmática (CV) dos pacientes e redução de ambos após dois anos de cART (52) . Um achado interessante é que a HMGB1 pode se ligar ao LPS, desagregando-o e facilitando, então, sua ligação com CD14, que ativa a célula via toll like receptor 4 (TLR4) (54) e, por seguinte, NFкB (52,53) . Estímulo de monócitos com LPS e HMGB1 em conjunto resultou em maior produção de TNF-α do que o estímulo apenas com LPS (54) . Isso indica que a HMGB1 pode, inclusive, induzir a reativação de HIV em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de indivíduos sob cART (55) . Como um fator limitante das respostas pró-inflamatórias, a IL-10 tem sido relacionada sob diversos aspectos na patogenia do HIV/Aids e pode induzir resposta do perfil T regulatório (Treg). Alguns autores consideram que a IL-10 pode exercer papel protetor no hospedeiro, em virtude desse papel regulador de vários perfis efetores de células T e devido a sua indução de proteínas supressoras da ativação de T CD4+, como a proteína de morte celular programada (PD-1) (56) . Outros, encontraram correlação negativa entre esta citocina e T CD4+ (57) e a associaram com o perfil Th2 e, consequentemente, com a evolução para aids (58) . Assim, mais estudos são necessários para verificar a ação da IL-10 na condição crônica da infecção pelo HIV. Outros parâmetros de inflamação estão envolvidos na mortalidade desta população, como a proteína C reativa (PCR), IL-6, d-dímero, entre outros (59) . Estes e outros parâmetros têm sido relacionados, também, ao aparecimento de outras patologias, independentemente Tasca, K. I., 2016 10 da infecção pelo HIV ou como consequência do envelhecimento precoce. Exemplos típicos são as citadas no início deste tópico, principalmente doenças cardiovasculares, dislipidemias, hepatopatias, doença renal crônica, diabetes mellitus alterações ósseas e neoplásicas, e doença de Alzheimer e Parkinson (60) . Em relação às neoplasias, atenção especial deve ser dada ao seu diagnóstico precoce, afinal, elas eram responsáveis por menos de 1% dos óbitos dos pacientes HIV na era pré- cART, e hoje alcançam 15% (61) . O câncer, em geral, é relacionado com a instabilidade de mecanismos de reparo do DNA e as PVHA apresentam esse comprometimento (62) , conforme explanado mais adiante. Os mais comuns são os cânceres de pele, pulmão, colo- retal/anal, hepático e linfoma de Hodgkin‟s (61,63) e estão relacionados a estágios avançados da infecção pelo HIV, ao nadir menor que 200 células/mm 3 , uso de cART, idade maior que 45 anos, e vêm acometendo mais o gênero feminino (61,63) . Aliás, de acordo com vários estudos (26,35,64,65) , as persistentes ativação imune e inflamação são fatores potencialmente determinantes de morbidade e mortalidade não associadas à aids, mesmo nos indivíduos sob cART e que apresentam supressão viral adequada. A cART tem mostrado diminuir relativamente os níveis de alguns marcadores de inflamação, no entanto, esses valores continuam significativamente mais elevados nestes indivíduos do que naqueles não-infectados (26,65) . Isso porque a cART, responsável pela lipodistrofia, dislipidemia e resistência da insulina, também desencadeia disfunções endoteliais (26) . A soroconversão por si só, já altera o perfil metabólico dos pacientes (figura 08), mas de uma forma um pouco diferente: está associada à redução dos níveis lipídicos devido à perda de peso e depleção de proteínas. No entanto, com o início e manutenção da cART, em longo prazo, esses níveis se elevam (66-69) . Sabe-se, inclusive, que a dislipidemia encontrada nos pacientes infectados por HIV é maior do que na população de não-infectados e se caracteriza por níveis elevados de triglicérides e colesterol total, e baixos da fração HDL- colesterol (70) . Uma vez iniciada a cART, observa-se que 33,0% a 82,0% dos pacientes desenvolvem hipercolesterolemia e 43,0% a 66,0% hipertrigliceridemia (67) , alterações que contribuem com o aparecimento de doenças cardiovasculares nesses pacientes (27) . Tasca, K. I., 2016 11 Figura 08. Interação entre status nutricional e progressão da infecção por HIV. Fonte: Evans et al., 2011 (69) . É preciso, então, que tais parâmetros sejam minimizados a fim de aumentar a sobrevida dos pacientes. Assim, há necessidade de mais estudos sobre os fatores que resultam e decorrem dessa persistente inflamação e ativação imune crônica, que contribuem com o envelhecimento precoce, inclusive, do sistema imunológico (figura 09) (26,65) . Nesse sentido, a senescência é marcada pela capacidade reduzida de células produtoras de IL-2, aumento na produção de IL-6, resistência a apoptose e encurtamento de telômeros. Uma das explicações é a inibição da telomerase por alguns ARV, afinal, ela é uma transcriptase reversa, e tem a função de adicionar sequências repetitivas de DNA à extremidade 3‟ dos cromossomos. A exaustão clonal também é muito mais intensa em infectados pelo HIV e um exemplo disso é que, mais de metade de todas as células T CD8+ estão ativadas em portadores de vírus e, apenas, 10% ou menos estão ativadas em pessoas sem o HIV, além das células T de um infectado com 56 anos de idade apresentar características semelhantes às de uma pessoa não infectada com 88 anos (65) . Tasca, K. I., 2016 12 Figura 09. Sumário das alterações mais comuns decorrentes da imunossenescência. Siglas: Mo, macrophage; DC, dendritic cell; MHC, major histocompatibility complex; TLR, Toll-like receptors; NK, natural killer; Th, helper T cell; TCR, T-cell receptor; Treg, regulatory T cell. Fonte: Bauer ME & De la Fuente M., 2016 (71) . Para finalizar este tópico que relata a “nova cara da epidemia”, outros fatores explicam o aparecimento das comorbidades não-associadas e o envelhecimento precoce nas PVHA. Como a mortalidade pela infecção por HIV/Aids teve acentuada queda, há também o envelhecimento esperado dessas PVHA, além de um crescente aumento nas taxas de transmissão do HIV em idosos, fruto da baixa adesão aos preservativos e acesso a drogas de combate à disfunção erétil masculina nessa faixa etária (72) . Tasca, K. I., 2016 13  O Estresse Oxidativo na Infecção pelo HIV O conceito de estresse oxidativo, recentemente redefinido, é dado como desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, originando a desregulação da sinalização e controle redox (redução-oxidação), levando a possíveis danos moleculares (73). Como consequências desta disfunção, ocorre acometimento estrutural e funcional de lipídeos, proteínas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas sendo que, a extensão dos danos gerados dependem da natureza, duração e gravidade do estímulo, que são variados entre diferentes espécies e tecidos (74,75) . Em síntese, a figura 10 apresenta alguns dos antioxidantes e oxidantes, fontes geradoras de substâncias reativas e possível resposta celular às condições que resultariam no estresse oxidativo. Figura 10. Relação dos componentes que participam do estresse oxidativo. Siglas: UV, ultravioleta; Cu, cobre; Zn, zinco; Mn, manganês; Se, selênio; Mg, magnésio; SOD, superóxido dismutase; CAT, catalase; GPx, glutationa peroxidase; GST, glutationa s-transferase; EROs, espécies reativas de oxigênio; ERNs, espécies reativas de nitrogênio. Fonte: Adaptado de: Halliwell & Whiteman (76) , Barbosa et al. (77) e Sharma (78) . Tasca, K. I., 2016 14 Os produtos gerados pelo estresse oxidativo desempenham importante papel na gênese de processos metabólicos que culminam na ocorrência de enfermidades crônicas degenerativas. Tal capacidade, torna-os importantes ferramentas na elucidação de mecanismos e implicações biológicas do dano oxidativo, com o objetivo de possibilitar o planejamento de ações eficazes no controle e prevenção desses processos (79,80) . No entanto, as lesões oxidativas são detectáveis sob condições fisiológicas normais em indivíduos saudáveis, o que sugere que a eficácia dos mecanismos antioxidantes e de reparo não podem evitar completamente a reação de oxidação mediada pelas espécies reativas de oxigênio (EROs) (81) . Tais EROs, apesar de contribuírem com a destruição de patógenos e de células tumorais, estão associados ao envelhecimento e aumentam ainda mais o estresse oxidativo e os danos teciduais, que desencadearão a inflamação. Este processo é conhecido como oxi- inflamm-ageing, e que também decorre da imunossenescência, independentemente da presença ou não de patógenos, e pode ser responsável pela indução de DAMPs, comprometendo ainda mais a homeostase local (71) (figura 11). Figura 11. Relação dos componentes que participam do estresse oxidativo. Siglas: ROS, reactive oxigen species; PAMPs, pathogen-associated molecular patterns; DAMPs, damage- asociated molecular patterns. Fonte: Adaptado de: Bauer ME & De la Fuente M., 2016 (71) . Tasca, K. I., 2016 15 Vários métodos são utilizados para avaliar o estado pró-oxidativo, destacando-se as aferições, individualizadas ou em conjunto, que seguem: oxidação das bases púricas e pirimídicas do DNA, peroxidação lipídica (análise da concentração de malondialdeído [MDA] e nível de isoprostanos, por exemplo) e oxidação de proteínas (carbonilação, nitração). Outros ensaios avaliam a capacidade antioxidante, como a análise de enzimas específicas (superóxido desmutase, catalase etc.), glutationas (GSHs), de componentes hidrofílicos (ácido úrico, bilirrubina, albumina, ascorbato, complexo B) e lipofílicos (carotenoides, α-tocoferol). Entretanto, há dificuldade na interpretação dos resultados originados dessas medidas individuais, tanto de compostos antioxidantes, quanto de produtos oriundos das reações oxidativas (76) . Além disso, deve-se considerar que a avaliação do potencial antioxidante de alguns componentes não-enzimáticos, in vivo, depende da absorção e biodisponibilidade do produto em condições fisiológicas; concentração plasmática ideal para desempenhar sua atividade antioxidante; tipos de radicais livres gerados no processo oxidativo; compartimento celular em que foram gerados, entre outros (77) . Na análise de antioxidantes, Beretta et al. (82) desenvolveram um método analítico e específico denominado TAP (total antioxidant performance), capaz de aferir a atividade antioxidante tanto do compartimento lipofílico quanto do hidrofílico. Em relação aos outros marcadores de estresse oxidativo, o TAP apresenta várias vantagens, pois determina a capacidade antioxidante total plasmática de ambos os compartimentos, propicia o nível de oxidabilidade da amostra e possui boa reprodutibilidade. Os carotenoides também vêm sendo estudados ao longo dos anos não somente pela sua comprovada atividade pró-vitamina A, mas também pela evidência de outras propriedades biológicas benéficas à saúde, tais como, fortalecimento do sistema imunológico e diminuição do risco de doenças degenerativas, como certos tipos de neoplasias, doenças cardiovasculares, degeneração ocular etc (83) . Da mesma forma, o α-tocoferol também tem papel essencial na proteção antioxidante. A separação desses compostos é comumente realizada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (84) , uma técnica sensível para a caracterização, sendo que a espectroscopia de massa pode ser a ela acoplada. O MDA é um produto secundário da peroxidação lipídica, considerado um candidato potencial como um biomarcador geral de dano oxidativo em plasma (85) . Para sua análise, a técnica HPLC é a mais indicada por ser capaz de medir unicamente o MDA, pois métodos mais antigos determinados por espectofotometria, como o ensaio de TBARS (thiobarbituric Tasca, K. I., 2016 16 acid reactive substances) medem todas as substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (76) . Outro marcador do estresse oxidativo baseado na peroxidação lipídica, consiste na aferição dos isoprostanos, compostos derivados da ação de radicais livres sobre os ácidos graxos polinsaturados. Entre a subclasse denominada F2-isoprostanos, derivada do ácido araquidônico, o mais abundante é o “PGF2-alfa-8-isoprostano”, que vem sendo proposto como um bom marcador do dano oxidativo de lipídios (79) . Sua medida, tanto na urina quanto no plasma, não é influenciada pela dieta (86) e os isoprostanos seriam um dos melhores marcadores da lipoperoxidação lipídica in vivo, se não fosse por suas concentrações muito baixas em fluidos biológicos, como o soro (87) e se sua formação não fosse influenciada por metabolismos lentos (76) . Entre as técnicas mais utilizadas para sua dosagem, está o ensaio imunoenzimático (ELISA), de fácil execução e que requer pequenos volumes da amostra. E, finalmente, para se analisar os efeitos genotóxicos induzidos por estresse oxidativo, o ensaio do Cometa é um dos mais utilizados, devido ao seu baixo custo e versatilidade. Através desta técnica é possível a avaliação de dano do DNA celular em nível individual, empregando-se amostras celulares extremamente pequenas. Para isso, são utilizadas as enzimas de reparo formanodipirimidina-DNA glicosilase (FPG), que cliva 8-oxi-7- hidrodesoxiguanosina e outras purinas oxidadas, e endonuclease III (END), uma timina glicol-DNA glicosilase que detecta pirimidinas oxidadas. Um fato observado em várias coortes de indivíduos infectados pelo HIV, foi o desequilíbrio redox que eles apresentam em comparação a indivíduos não-infectados, com deficiência do sistema protetor antioxidante e altos níveis de produtos oxidantes em vários tecidos (78) . O próprio HIV é responsável por inibir indiretamente a síntese de alguns antioxidantes (88) e isso é intensificado pelo efeito pró-oxidante de citocinas inflamatórias e/ou da ativação leucocitária de polimorfonucleares, o que leva ao aumento ainda maior na peroxidação lipídica (89) . Com esse desequilíbrio, há o acometimento estrutural/ funcional das organelas e enzimas, bem como da própria célula de defesa, o que acelera ainda mais a progressão para a aids (90,91) . A proteína do HIV tat, devido à geração de ânion superóxido pela mitocôndria, induz a produção intracelular de EROs que, por sua vez, ativa o NFкB, aumentando a transcrição do HIV (92) , além de induzir deficiência no reparo do DNA (62) . Por isso, esses danos celulares podem induzir, também, a reativação dos vírus latentes, aparecimento de neoplasias, além de estimular a produção de algumas citocinas inflamatórias, como TNF-α (62,93) , o que contribui Tasca, K. I., 2016 17 com esse ciclo de “inflamação crônica versus ativação imune persistente versus estresse oxidativo” em pessoas que vivem com o HIV/aids. Tal desequilíbrio leva ao aumento ainda maior da peroxidação lipídica (94) , proteínas oxidadas, sequências de DNA alteradas e ao acometimento estrutural/ funcional das organelas e enzimas, bem como da própria célula de defesa, o que acelera ainda mais a progressão para a aids (81,95) . Afinal, além do aumento na replicação viral, da resposta inflamatória, e a diminuição da proliferação celular, o estresse oxidativo pode contribuir também com o aparecimento de muitas comorbidades não associadas à aids (78) . Assim, considera-se que citocinas inflamatórias e/ou a intensa ativação leucocitária de polimorfonucleares, processos comumente observados na infecção pelo HIV, apresentam efeito pró-oxidante. Para combater os danos oxidativos, induzidos por esse alto nível de EROs, há elevado consumo de moléculas antioxidantes que, em parte, explica a deficiência nos sistemas antioxidantes nestes pacientes (81) . Outras explicações baseiam-se na falta de ingestão de antioxidantes ou seus precursores, na má absorção de nutrientes e no intenso metabolismo da cisteína no tecido periférico, com consequente perda de enxofre, que pode levar à deficiência de glutationa e outros antioxidantes durante a infecção pelo HIV (81) . Foram relatadas na literatura, atividades alteradas de capacidade antioxidante total nesses pacientes (90) e concentrações reduzidas, tanto do sistema enzimático (81,96) , quanto não-enzimatico, como os níveis de vitaminas antioxidantes séricas (A, C e E) (90) e alguns micronutrientes (zinco, ferro e cobre) (90,95,97) . Esta diminuição foi relacionada, ainda, com baixas contagens de T CD4+, podendo acelerar a progressão da infecção para aids e morte (90,98) . Também são encontrados no plasma desses indivíduos infectados pelo HIV, produção elevada de marcadores de estresse oxidativo, como hidroperóxidos totais, EROs, espécies reativas de nitrogênio (ERNs) e produtos da peroxidação lipídica, principalmente o MDA (81) e, apesar de poucos estudos, 8-isoprostano (99) . Quanto aos níveis séricos de MDA, segundo alguns autores (100) , estudo em crianças menores de 10 anos de idade e recém-nascidos infectados pelo HIV mostrou maiores níveis nestes que em crianças saudáveis, apresentando correlação negativa com contagens de células T CD4+ (101) . Em adultos infectados, há dados controversos sobre esse marcador. Enquanto, alguns autores (100) mostraram não haver diferença entre infectados ou não pelo HIV e entre assintomáticos e sintomáticos, outros (81,90) , encontraram concentrações elevadas de MDA naqueles infectados, com e sem sintomas. Em sinergia com a infecção pelo HIV e o estresse oxidativo, a cARV, apesar de melhorar significativamente, os parâmetros clínicos, virais e imunológicos, também parece contribuir potencialmente com esse desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes (91) , sendo Tasca, K. I., 2016 18 que, o aumento dos primeiros e a diminuição dos últimos, têm sido frequentemente associados em PVHA sob terapia (93) (figura 12). Figura 12. Infecção pelo HIV e antirretrovirais induzem o estresse oxidativo na célula do hospedeiro Siglas: NRTIs, nucleotide reverse transcriptase inhibitors; NNRTIs, non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors. Fonte: Sharma B, 2014 (78) A cART pode afetar a morfologia e função mitocondrial em alguns indivíduos (102) e aumentar quimicamente as espécies reativas na circulação, possivelmente pela maior produção de metabólitos oxidados, derivados da interação entre EROs e biomoléculas das células infectadas (92) . No entanto, mecanismos específicos e cronologia destes eventos ainda permanecem incertos (102) . Sabe-se que alguns ARV influenciam na toxicidade da mitocôndria e na ativação do sistema enzimático P450 do citocromo C, o que induz estresse oxidativo (92) . O tratamento também diminui a proteção antioxidante ou contribui com a falha em processos de reparo ao dano oxidativo (91) . Mandas et al. (93) observaram, inclusive, que número significativo de pacientes com ótima adesão à cART, tinham maior status oxidativo do que aqueles não aderentes, o que corrobora com as elevadas concentrações plasmáticas de http://benthamscience.com/journal/render-search-results.php?cx=partner-pub-2685163628273835%3A7983360493&cof=FORID%3A10&ie=UTF-8&q=Bechan%20Sharma Tasca, K. I., 2016 19 peroxidação lipídica, especialmente os F2-Isoprostanos, encontradas por Hulgan et al. (92) e Redhage (99) em PVHAs sob cART e com controle da replicação viral. Assim, este é um dos pontos que poderia ser incluído na abordagem sobre “início precoce ou tardio de cART”. Alguns outros fatores desencadeados pelo uso da cART, tais como, dislipidemia, lipodistrofia e diarréia crônica estão relacionados ao aumento nos danos oxidativos (90) . Nesse sentido, anormalidades do metabolismo lipídico são comuns em PVHA e se relacionam com a resposta inflamatória presente, mediada por citocinas e que pode, por si só, ser pró- aterogênica (103) . Além disso, há cada vez maior evidência científica de que o estresse oxidativo também desencadeia relevantes implicações sobre os mecanismos que culminam com o desenvolvimento da síndrome metabólica (104) e de várias comorbidades não associadas à aids, como a aterosclerose (99) . Sabe-se, inclusive, que a prevalência de doenças cardiovasculares é aumentada em pacientes infectados pelo HIV, em comparação com a população em geral (1,22) e, parece claro que, tanto a própria infecção quanto o uso de cART estão associados com maior risco de acidente vascular cerebral (105) . A desordem neurocognitiva associada ao HIV é comum nos pacientes infectados e, achados de alguns estudos sugerem que a cART é uma das responsáveis pela indução de estresse oxidativo e neurotoxicidade (105) , pois, elevados níveis de oxidação proteica e lipídica são detectados no cérebro destes indivíduos (106) . Nesse sentido, autores sugerem que, devido ao acúmulo persistente de EROs nos neurônios na prolongada exposição aos antirretrovirais, ocorre estresse oxidativo local e a morte neural. Estudo experimental mostrou efeito genotóxico no cérebro de camundongos cronicamente tratados com Efavirenz que podem ser oriundos, em parte, do dano no DNA induzido pelo estresse oxidativo (107) . Assim, de acordo com Cagla et al. (106) , PVHA poderiam ser beneficiadas com terapias adjuvantes que incluíssem estratégias antioxidantes para superar os efeitos deletérios de cART. Contudo, algumas das classes de cART são mais rapidamente associadas com efeitos adversos particulares e toxicidades. Por exemplo, os IP induzem o acúmulo de prelamina A, que causa instabilidade genômica e está diretamente relacionada ao aumento do estresse oxidativo e sintomas associados à lipodistrofia (108) . Além de alterarem o metabolismo lipídico (78,109) , essas drogas desregulam as proteínas UPS (ubiquitin–proteasome system) que contribuem com estresse no retículo endoplasmático, bem como com o acúmulo de lipídeos e aparecimento da resistência à insulina, diabetes mellitus e aumento no risco de aterosclerose (110) . Além disso, os IP ativam vias intracelulares de apoptose e aumentam o status pró- oxidante do ambiente intracelular (110) . Tasca, K. I., 2016 20 Já os ITRN, inibem a transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA, agindo também na diminuição do DNA mitocondrial e danificando sua membrana e levando a menores taxas respiratórias e de fosforilação oxidativa, o que, consequentemente, induz maior produção de EROs e estresse oxidativo (111) . Quanto ao status antioxidante, um estudo brasileiro verificou concentrações deficientes de α-tocoferol foram encontradas em quase 20% dos pacientes estudados, dado mais frequente em regimes não compostos por ITRNN (112) . Estudos são, ainda, controversos quanto aos efeitos de ITRNN nos mecanismos de estresse oxidativo. Alguns mostraram maiores níveis de F2-isoprostanos em pacientes que recebiam Efavirenz (92) , sendo que, houve modesta associação entre colesterol total e F2- isoprostanos entre os indivíduos sem o ITRNN. Outros autores relataram que os níveis deste marcador aumentaram continuamente após 12 meses de terapia baseada em ITRNN, o que não ocorreu naqueles que receberam IP (113) . Ao contrário, estudo de Redhage et al. (99) mostrou que o uso de ITRNN, em particular da Nevirapina, mostrou discreta associação com menor estresse oxidativo, aferido pelo F2-isoprostanos plasmático, mesmo após ajuste com outras variáveis clínicas. Na tentativa de se reduzir a incidência de estresse oxidativo e outras consequências da infecção pelo HIV e de cART, algumas pesquisas têm mostrado benefícios no uso de suplementação com antioxidantes e/ou micronutrientes (114,115) e que isso poderia, inclusive, ter impacto no desenvolvimento de outras doenças. Alguns exemplos são a administração de multivitaminas, exceto vitamina A, nos pacientes antes ou após início de cART (115) e a suplementação com magnésio, que mostrou evidência proteção contra disfunção de óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e estresse oxidativo endotelial mediado por Ritonavir in vitro, e diminuição da expressão de eNOS hepático in vivo (116) , além da intervenção ter sido capaz de suprimir o estresse oxidativo sistêmico e inflamação cardíaca por Zidovudina em ratos (117) . Tasca, K. I., 2016 21  Justificativa do Estudo Um dos atuais desafios na área de HIV/Aids é o melhor entendimento sobre a ativação imune persistente e a inflamação crônica que os infectados pelo vírus apresentam, mecanismos que refletem no envelhecimento precoce observado nesta população. Como efeito deste processo, esses indivíduos se deparam com outro grande desafio atualmente: o de postergar o aparecimento de comorbidades não associadas à aids, tais como distúrbios metabólicos, desenvolvimento de doenças cardiovasculares, comprometimento renal ou hepático, alterações ósseas, neoplasias, entre outros. Apesar dos incontestáveis benefícios da cART ocorre diminuição apenas parcial dos níveis de ativação e inflamação em PVHA, mesmo nas que apresentam supressão viral adequada, quando comparadas aos indivíduos saudáveis, não infectados pelo HIV. Há de se considerar, também, os efeitos deletérios do uso prolongado de cART, sabendo-se que essas drogas induzem dislipidemia, aumento no estresse oxidativo e desequilíbrio de citocinas e podem contribuir com o desenvolvimento das comorbidades acima mencionadas. Assim, a influência da terapia nos parâmetros de inflamação, ativação imune e estresse oxidativo devem ser melhor estudados, principalmente nos dias de hoje, com a indicação para início terapêutico cada vez mais precoce. A participação de alguns parâmetros isolados nestes processos já é bem conhecida, como o envolvimento de MDA, isoprostanos, TAP, vitaminas, dano de DNA no estresse oxidativo e de AGE, sRAGE, HMGB1 e sCD14 e citocinas na ativação imune e inflamação. No entanto, são necessários mais estudos com estes marcadores, tanto na presença quanto na ausência de cART e em indivíduos que apresentam diferentes respostas imunológicas, ie, aqueles que possuem altos e baixos valores de T CD4+ apesar de controle da viremia, para viabilizar a aplicação destes componentes, em estudos de intervenção, modulação ou melhor monitoramento clínico dos pacientes. Desta forma, estudar todos esses parâmetros em um único estudo, discutir a interação entre eles e a possível influência da cART nestes mecanismos seria uma abordagem inédita e poderia esclarecer lacunas e divergências observadas na literatura. Tasca, K. I., 2016 22 Objetivos  Objetivo Geral: Estudar marcadores de ativação imune, inflamação crônica e estresse oxidativo em PVHA assintomáticas e verificar possível influência dos antirretrovirais e contagens de linfócitos T CD4+ nesses parâmetros.  Objetivos Específicos: a) Estudar o perfil inflamatório e de ativação imune pela dosagem plasmática de HMGB1, AGE, sRAGE, sCD14 e citocinas (IL-6, IL-8 e IL-10); b) Aferir o estresse oxidativo por meio da análise do sistema antioxidante (capacidade antioxidante total, vitaminas e seus precursores), pró-oxidante (MDA e 8-isoprostano) e do dano no DNA; c) Analisar dosagens sanguíneas de glicose, triglicérides, colesterol total, PCR, linfócitos T CD4+ e carga viral do HIV. Capítulo II Tasca, K. I., 2016 23 Capítulo II Desenho do Estudo  Sujeitos do Estudo Foram incluídos pacientes adultos, com idade entre 20 e 50 anos, de ambos os sexos, infectados pelo HIV, que frequentam o Serviço de Ambulatórios Especializados em Infectologia “Domingos Alves Meira” (SAEI-DAM). O SAEI-DAM é centro de referência regional para atendimento da infecção pelo HIV/Aids na região de Botucatu, interior do Estado de São Paulo (figura 13). É também palco de ensino e pesquisa, que mantém vínculos com a Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) -UNESP e com o Hospital das Clínicas da FMB (HCFMB). Esse complexo é responsável pelo atendimento de 1,8 milhão de pessoas de 68 municípios do centro-oeste paulista. O Serviço do HCFMB atende pacientes infectados pelo HIV/Aids desde 1985, já tendo acumulado cerca de 3.000 pacientes. Atualmente, cerca de 600 PVHA estão em acompanhamento no Serviço. Figura 13. Microrregião de Botucatu Fonte: Sharma B, 2014 (78) http://benthamscience.com/journal/render-search-results.php?cx=partner-pub-2685163628273835%3A7983360493&cof=FORID%3A10&ie=UTF-8&q=Bechan%20Sharma Tasca, K. I., 2016 24  Delineamento Foram estudados 92 pacientes com infecção confirmada pelo HIV, atendidos no SAEI- DAM. O cálculo para o tamanho amostral (tabela 1) foi realizado com a ajuda do Escritório de Apoio à Pesquisa (EAP) da FMB–UNESP. Tabela 1: Esquema de análise para cálculo do número amostral do estudo CAUSA DE VARIAÇÃO GRAUS DE LIBERDADE Grupos (G) 04 Resíduo 95 Total 99 Número Amostral 100 Estabelecimento G (20 em cada um dos 5 grupos) _______________________________________________________________________________________ Desta forma, foi possível obter um alto valor para os graus de liberdade residual, o que certamente diminui a variabilidade. Foram realizados dois tipos de estudo. A figura 14 ilustra os grupos e características. Figura 14: Delineamento do estudo e características específicas dos grupos infectados pelo HIV VT: virgens de tratamento; cART: terapia antirretroviral combinada; CV: carga viral; M0: pré-cART; M1: pós- cART. Tasca, K. I., 2016 25  O “ESTUDO TRANSVERSAL” teve caráter observacional prospectivo (sem intervenção), envolveu 100 pacientes que foram distribuídos em cinco grupos. - Grupo 1: indivíduos com diagnostico de infecção por HIV há menos de cinco anos, virgens de cART e contagens de T CD4+ inferiores a 500 células/mm 3 ; - Grupo 2: indivíduos diagnosticados há menos de cinco anos, virgens de cART e contagens de T CD4+ superiores a 500 células/mm 3 ; - Grupo 3: indivíduos diagnosticados há mais de cinco anos, virgens de cART e com contagens de T CD4+ superiores a 500 células/mm 3 desde o diagnóstico da infecção; - Grupo 4: PVHA que estão sob cART eficaz e resposta imunológica adequada há pelo menos cinco anos (ou seja, com histórico de supressão viral e contagens T CD4+ maiores que 500 células/mm 3 durante todo este período); - Grupo 5: PVHA sob cART eficaz e resposta imunológica inadequada há pelo menos cinco anos (ou seja, com histórico de supressão viral adequada mas que não restabeleceram, ainda, as contagens de T CD4+ para níveis basais/normais e apresentam contagens de T CD4+ inferiores a 500 células/mm 3 , durante todo este período).  No “ESTUDO LONGITUDINAL”, a intervenção considerada foi o início da terapia antirretroviral. A pesquisa envolveu 30 indivíduos, a princípio virgens de tratamento (os mesmos pacientes do estudo transversal) sendo que, a análise dos marcadores foi realizada em dois momentos: - Momento 0 (M0): antes do início da cART e; - Momento 1 (M1): cerca de seis a 12 meses após início de cART.  Marcadores e técnicas À partir das amostras de sangue colhidas em tubos com EDTA, foram estudados 12 marcadores, além daqueles obtidos através dos prontuários médicos (T CD4+, CV, glicose, triglicérides, colesterol total e proteína C reativa), conforme mostra a figura 15. Tasca, K. I., 2016 26 Figura 15: Marcadores escolhidos para o estudo de estresse oxidativo, inflamação e ativação imune em PVHA, e metodologia utilizada PVHA: pessoas que vivem com HIV/aids; AGEs: produtos finais de glicação avançada; sRAGE: receptores de AGEs; HMGB1: high mobility group box protein-1; sCD14: CD14 solúvel; IL: interleucinas; PCR: proteína C- reativa (resultados fornecidos pelos prontuários eletrônicos); CAT: capacidade antioxidante total; MDA: malondialdeídos; 8-iso: 8-isoprostano; ELISA: ensaio imunoenzimático; HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência; TAP: total antioxidante performance; CBA: cytometric bead array. * técnica desenvolvida à partir de células mononucleares do sangue periférico (nas demais técnicas, utilizou-se o plasma dos sujeitos do estudo). Tasca, K. I., 2016 27 Referências* *Segundo normas de Vancouver: “Uniform Requeriments for Manuscripts to Biomedical Journal” (International Comitte of Medical Journal Editors, 2008. http://www.icmje.org) 1. 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