UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química Investigação Química e Biológica dos Metabólitos Secundários Derivados de Macroalgas Marinhas e Microrganismos Associados Teresinha de Jesus Aguiar dos Santos Andrade Departamento de Química Orgânica Araraquara 2014 TERESINHA DE JESUS AGUIAR DOS SANTOS ANDRADE Investigação Química e Biológica dos Metabólitos Secundários Derivados de Macroalgas Marinhas e Microrganismos Associados Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Doutor em Química Orientadora: Prof Dra Dulce Helena Siqueira Silva Araraquara 2014 DADOS CURRICULARES TERESINHA DE JESUS AGUIAR DOS SANTOS ANDRADE (aguiarte10@gmail.com)  DADOS PESSOAIS Nascimento: 02/07/1983 Nacionalidade: brasileira Naturalidade: Teresina-Piauí Filiação: Maria de Jesus Aguiar dos Santos  ENDEREÇO PROFISSIONAL Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Maranhão-IFMA Campus São Raimundo das Mangabeiras  FORMAÇÃO ACADÊMICA 2009-2014 Doutorado em Química no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista. Título do trabalho: “Investigação Química e Biológica dos Metabólitos Secundários Derivados de Macroalgas Marinhas e Microrganismos Associados". Orientação: Prof. Drª. Dulce Helena Siqueira Silva Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES 2012 Estágio de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE): Marine Biodiscovery Centre, Department of Chemistry, University of Aberdeen- Scotland-UK (Orientador: Prof. Drº Marcel Jaspars) Bolsista: PDSE (Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior) 2006-2008 Mestrado em Genética e Toxicologia Aplicada, Área de concentração Biotecnologia, Universidade Luterana do Brasil- ULBRA- Canoas Rio Grande do Sul. Título da Dissertação: “Avaliação da atividade antioxidante do líquido da castanha do caju (LCC) in natura e industrial”. Orientação: Prof. Drº Alexandre de Barros Falcão Ferraz 2008-2009 Especialização em Saneamento Ambiental, Faculdade Integrada, Brasil. Título: Estações de Tratamento de Efluentes: Características e Processos da Destinação dos Resíduos. Orientadora: Prof. Drª Ivani Souza Mello. 2002-2007 Licenciatura em Química e Bacharelado em Química com Atribuições Tecnológicas. Universidade Federal do Piauí Bacharelado. Bolsista de iniciação científica: Determinação de metais pesados por espectroscopia de absorção atômica e espectrofotometria no ultravioleta – visível em pólen apícola da região de Teresina-PI, UFPI-Teresina-PI. Orientador: Prof Drº Sebastião Barros Araújo  FORMAÇÃO COMPLEMENTAR: 1. Ressonância Magnética em alimentos e sistemas biológicos, Sociedade Brasileira de Química. 2. Organic Structure Analysis, University of Aberdeen, ABDN, Escócia. 3. Química Farmacêutica, Instituto de Química Unesp. 4. Química dos Alcaloides, Instituto de Química Unesp. 5. Interpretation of Cid Mass Spectra, Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massa. 6. Altos Estudos em Toxicologia, Universidade Estadual de São Paulo. 7. Atualização Tecnológica em Estresse Oxidativo. Centro Federal de Educação Tecnologica do Piauí, CEFETPI, Brasil. 8. Metrologia Básica. Rede Metrológica do Piauí, REMPI, Brasil. 9. Elaboração do Manual de Qualidade de Laboratórios, Rede Metrológica do Piauí, REMPI, Brasil. 10. Toxicologia x Qualidade de Vida, Associação Brasileira de Química, ABQ, Brasil. 11. Práticas de Auditoria Laboratórios NBR ISO 17025, Rede Metrológica do Piauí, REMPI, Brasil. 12. Sistema de Qualidade Laboratórios ISO/IEC 17025, Associação Rede de Metrologia e Ensaios do Rio Grande do Sul, REDE METROLOGICA, Porto Alegre, Brasil. 13. Educação Popular em Saúde, Sociedade brasileira para o progresso da Ciência, SBPC, Brasil. 14. Nomenclatura e Estereoquímica Compostos Orgânicos, Universidade Federal do Piauí, UFPI, Teresina, Brasil.  EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL 1. Técnica de Laboratório do IFPI no período de junho de 2004 a junho 2013. 2. Professora de Ensino Básico Técnico e Tecnológico do IFMA desde julho 2013.  PUBLICAÇÕES: 1. Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos; Araújo, Bruno Quirino; Citó, Antonia Maria das Graças Lopes; Da Silva, Juliana; Saffi, Jenifer; Richter, Marc François; Ferraz, Alexandre de Barros Falcão. Antioxidant properties and chemical composition of technical Cashew Nut Shell Liquid (tCNSL). Food Chemistry, v. 126, p. 1044-1048, 2011. 2. Carvalho, Ivana M. C. M. M.; Dantas, Alisson F.; Pereira, Danilo L.A.; Costa Rocha, Francisco C.; Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos; Da Silva, Juliana. Genotoxicity of sodium metabisulfite in mouse tissues evaluated by the comet assay and the micronucleus test. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, v. 720, p. 58-61, 2011. 3. Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos, Moita, G. C., Alves, E. A. J. Análise do teor de cafeína em refrigerantes tipo cola por análise espectrofotometrica UV-vis. Cadernos temáticos. Brasil, p.5-96, 2007.  PUBLICAÇÕES EM CONGRESSOS DURANTE O PERÍODO DE DOUTORADO 1. Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos, SILVA, D. H. S., Lopes, M, N. Identificação de alcaloides quinolactínicos derivados de microrganismos associados à alga marinha Dichotomaria marginata usando LC-PDA-MS e LC-MSn. In: 36° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2013 (RASBQ), Água de Lindóia-São Paulo. 2. Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos, BOLZANI, V. S., SILVA, D. H. S. Identificação de arseno-açúcares nas algas marinhas Dichotomaria marginata e Padina gymnospora por LC-ICP-MS e LC-ESI-MS. In: 36° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (RASBQ), 2013, Água de Lindóia-São Paulo. 3. Andrade, T. J. A. S; Bolzani, V. S.; Jaspars, M.; Folmer, F.; Silva D. H. S. ENDOPHYTIC FUNGI MARINE IN SEARCH OF BIOACTIVE MOLECULES. In: Advanced School on Bioorganic Chemistry, 2013, Araraquara –São Paulo. 4. Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos, Arwa, Phanuel S., SILVA, D. H. S., Lopes, M, N., BOLZANI, V. S. Identificação de triterpenos e esteróides de macroalgas marinhas Sargassum cymosum, DADina gymnospora e Dichotomaria marginata usando CG-FID, 2011. In: 34ª. Reuniao Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2011, Florianópolis-SC. 5. Arwa, Phanuel S., Andrade, T. de J. Aguiar dos Santos, Silva, D. H. S., Bolzani, V. S. Biflavones from Garcinia brasiliensis Mart. as inhibitors of HIVprotein, 2011. In: 34ª. Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2011, Florianópolis- SC. 6. Teresinha de Jesus Aguiar dos Santos Andrade; Phanuel Soroni Arwa, Dulce Helena Siqueira Silva; Marcia Nascer; Vanderlan Silva Bolzani. Screening by HPLC-UV-DAD, LC-MS and TLC red macroalgae Dichotoma marginata. In: Advanced School on Bioorganic Chemistry, 2011, Campinas –São Paulo. 7. Silva, A. L., Pinto, C, E. M, Andrade, T. De J. Aguiar Dos Santos, Pinto, M. E. F. Atividade Antioxidante de Diferentes Extratos das Folhas de Vitex agnus- castus L. In: 33ª. Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2010, Água de Lindóia-São Paulo. 8. Pinto, M. E. F., Andrade, T. De J. Aguiar Dos Santos, Bolzani, V. S., Tavares, J. F, Silva, M. S. CONTITUENTS OF Nanuna plicata (MART.) L. B. SM & AYENSU AND ACTIVIT ANTIOXIDANT. In: 33ª. Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2010, Água de Lindóia-São Paulo.  PARTICIPAÇÕES EM EVENTOS DURANTE O PERÍODO DE DOUTORADO 1. 36º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (RASBQ), 2013, Água de Lindóia-São Paulo. 2. International Symposium on Bioactive Marine Natural Products, 2012. Aberdeen-Scotland-UK. 3. Advanced School on Bioorganic Chemistry, 2011, Campinas –São Paulo. 4. Workshop on Marine Biodiversity, setembro, 2010. FAPESP-SP, São Paulo-SP 5. Current Advances on Bioprospecting, Biogeography and Phylogeography, 2010. São Carlos- SP. 6. "Interfaces entre a Química e a Biologia nas áreas de Produtos Naturais e Química", 2010. Água de Lindóia-São Paulo. 7. Fórum de Ciências do Mar, 2010. São Paulo-SP. 8. Biota Fapesp Internacional Workshop on Metabolomics in the Context of Systems Biology: A Racional Approach to Search for Lead Molecules from Nature, 2010. São Paulo-SP. 9. 33 º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (RASBQ), 2010. Água de Lindóia-São Paulo. 10. 3º Congresso Brasileiro de Espectometria de Massas-BrMASS, 2009. Campinas-SP.  CO-ORIENTAÇÕES – INICIAÇÃO CIENTÍFICA 1. Fernanda Cardoso. Perfil dos metabólitos da alga parda Padina gymnospora. 2011. Iniciação Científica - INSTITUTO DE QUIMICA-UNESP. 2. Angelika Kroemer. Estudo fitoquímico de Bauhinia forficata visando substâncias bioativas. (estágio IAESTE). 2011. 3. Marija Pavlovic. Estudo de metabólitos da macroalga vermelha Dichotomaria marginata. (estágio IAESTE ). 2011. A minha querida família por SER sempre a família que preciso Ter, dedico. Sinfonia Dos Sonhos Marcus Viana Os planos E os sonhos que ardem em nós De amantes no fundo De um rio a rolar Cometas pelo céu Os sonhos são assim Essência à luz das constelações A plenitude, e o fim. Segue a nave-vida Pelo azul E os nossos desejos vão além. [....] Um novo mundo vem Nós estaremos lá Nas praias de um futuro bom Grãos de areia à brilhaar. Agradecimentos A DEUS, Deus é a minha fortaleza e a minha força e Ele perfeitamente desembaraça o meu caminho. II Samuel 22:23 A orientadora, Profª. Drª. Dulce Helena Siqueira Silva, por confiar e acreditar em mim, pela orientação, receptividade e oportunidades de aprendizagem me mostrando sempre as opções e me apoiando nas minhas decisões. A minha mãe querida, Maria de Jesus Aguiar, minha gratidão será eterna, as palavras não são suficiente para descrever tudo que aprendi com você. Obrigada por todos os esforços que fez para dar a mim e minha irmã a possibilidade de aproveitar todas as oportunidades para crescer e chegar onde sonhamos. Muito obrigada por acreditar em mim. A minha irmã, Vanessa Aguiar, Flor, sua força foi essencial para que eu pudesse chegar até aqui, sem você nada “disso” faz sentido, Obrigada pelo amor, carinho amizade e compreensão nos momentos em que minha presença não foi possível e quando minha preocupação e atenção pareciam voltar exclusivamente para este trabalho. Ao meu namorado, Aurélio Lima, Muito obrigada pela preocupação e incentivos constantes que me fortaleceram nos momentos críticos. A grande família Aguiar: meus avôs/mãe/pai (Maria José e José Ribamar), que me ensinaram a viver com dignidade; eu consegui pai sou Drª sim! Rss. Minhas tias, em especial minha tia Mazé (ainda bem que você é como elefante, não sabe a força que tem), madrinha, tios, primos (as), sobrinhos (as), cunhado, vocês com certeza estavam sempre comigo em todos os momentos. Amo vocês! Ao meu sobrinho Biel (“Titia tu vai ser doutora é?”), por encher a minha vida de alegria. As queridas companheiras da república, Viviane Raissa Sipowo Tala e Aline Santana, teria sido muito difícil e entediante se eu não tivesse tido a oportunidade de ter contado com o carinho, amizade sincera e apoio de vocês, Saudades! “Gente que merece o que de mais bonito a vida tem a oferecer. A esse tipo de gente: amor e oração." As eternas amigas, Rute e Dani. Gente que pensa e repensa jeitos de nos fazer bem, que se preocupa e demonstra. Gente que é abraço, mesmo de longe e a certeza que tudo vai dar certo. Que empresta coração pra gente morar, que planta pensamentos bonitos nos dias da gente. Aos amigos da Militância PJ, Timon-MA. Saudades das risadas gostosas! "Tem gente que Deus coloca na nossa vida só pra nos dar paz. Que nos empurra pro melhor de nós, que nos guia para o caminho do bem. Gente que é sorriso em dia feio, que é suporte quando parece faltar o chão”. Aos amigos Queila Ozório, Pe. Brites, Ricardo Oliveira, Aureste Lima, Adélia Leal e Lidia Cristina obrigada pela amizade tão especial e por sempre se fazerem presente. Ao amigo, Alexander Alves, muito obrigada pela imensa contribuição nas análises do CG-EM e todas as conversas sobre a vida. Estarei sempre na torcida por você! A querida Lidi Gasparetto, obrigadão por todo incentivo de sempre e esclarecimentos nas configurações relativas. A minha querida aluna de Iniciação científica, Fernanda Cardoso, muito obrigada pelas colaborações científicas, amizade e confiança. Ao friend Nerilson Marques, por sempre estar disponível para sanar minhas dúvidas de RMN e conversas de “alto nível” Adoro você ! Aos amigos em especial, Juliana Gubiane, Isabela Valadão, Meri Emili, Phanuel Saroni, Tiago Paz e Isabel Duarte muito obrigada pelos momentos de amizade, companheirismo, sorrisos sinceros e pelas nossas discussões em grupos de estudos durante as disciplinas, convivência, descontração e ensinamentos. Aos companheiros de laboratório do NuBBE: Amauri Alves, Fê Cotinguiba, Gabriel Mazzi, Vaninha, Vanessa Chapla, Frera, Alessandra Dametto, Andressa, Carol, Paty, Marcos Marçal, Rebeca, Christiann Tosta, Gislaine, Bruna, Renato Abe. Muito obrigada pelos momentos de alegria compartilhados que fizeram a rotina do laboratório e no Instituto ainda mais agradável. Prof. Dr. Marcel Jaspar and Dr. Rainer Ebel, for having given me an education of excellence in Marine Natural Products (I wish to express my deep feeling of gratitude, great indebtedness and sincere appreciation, for his admirable supervision, guidance directions, valuable support, directions and comments). Staff Department of Chemistry, University of Aberdeen: Dr. Andrea Raab, (I am greatly thankful for her continuous help and support, training me on the OrbiTrap Mass spectrometer, as well as doing high-resolution mass analysis of my compounds); Mr. Russell Gray (I would like extend my sincerest gratitude to for his patience in teaching me the NMR machines and for accepting my endless requests to use the NMR machine) and Dr. Jioji Tabudravu (Special gratitude for his guidance, fruitful discussions, encouragement, advices, and particularly for sharing his expertise in isolation techniques and elucidations of natural products). Friends (Marine Biodiscovery Centre): Kojo Acquah, Anil Sazak, Flo Andriessen, Kwaku Kyeremeh, Fredryk Mandey, Herdayanto Putro, Mohammad Shoeb, Somayah Sameer, Morag Douglas, Patrycja Golinska, Andreia Pais, Isabel Spínola, Rita Afonso, Chris Larch, Vittoria Delbono, Candice Bromley, Quin, Xalin, (Many thanks for all of you, who by infinite ways contribute for my success during this journey. Best wishes. You left my most colorful days in the Granite City, Aberdeen-UK). Kety Leggate who welcomed me in Aberdeen-UK (Many thanks for making that even more special this period). Ao corpo técnico do Instituto de Química-Unesp Araraquara, Dr. Alberto Camilo Alécio, Dr. Nivaldo Boralle e Marquinho pelo apoio na colaboração com o trabalho científico. Aos professores de pós-graduação do IQ-UNESP, em especial à Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro e a Prof. Dra. Ângela R. Araújo, obrigado pelas inúmeras dicas, discussões pertinentes e valiosos ensinamentos que colaboraram para a realização deste trabalho. A professora Dra. Isabele Rodrigues Nascimento pelo aprendizado durante meu Estágio a Docência. Muitíssimo grata! A Drª Nair Yokoga do Instituto de Botânica Secretária do Meio Ambiente do Estado de São Paulo pela colaboração na coleta das algas. Ao grupo da Dra. Jenifer Saffi (Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) - Departamento de Ciências Básicas da Saúde/Bioquímica, Laboratório de Genética Toxicológica), equipe da Dra Alexandra Ivo (Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-(UNESP) - Departamento de Ciências, Laboratório de Imunologia), e ao grupo do Dr Luciano Puzer (Universidade Federal do ABC Centro de Ciências Naturais e Humanas, Laboratório de Biologia-Química) por terem me recebido tão bem no laboratório para realização dos bioensaios. Ao Instituto Federal de Educação Tecnológica do Piauí-IFPI, pela liberação durante o doutorado, sem dúvida, mudou minha história. Serei eternamente grata. As secretarias da Pós-Graduação - que não poupam esforços para auxiliar e facilitar a nossa vida. Às funcionárias da Biblioteca, sempre à disposição para ajudar e pela dedicação. Ao Instituto de Química da UNESP de Araraquara e ao Departamento de Química Orgânica, pela oportunidade, acolhimento excelência acadêmica e pela possibilidade do desenvolvimento deste trabalho e por ter sido cenário de uma etapa muito importante da minha vida. A CAPES, pelo suporte financeiro, imprescindível para execução desse trabalho. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, seja de forma direta ou indireta. Muito Obrigada! “Viajar é melhor do que chegar” Miguel de Cervantes RESUMO As macroalgas Dichotomaria marginata e Padina gymnospora foram coletadas no litoral paulista e seus microrganismos associados, Penicillium citrinum (Dm1) e Penicillium chrysogenum (Pg1), respectivamente, foram isolados e identificados. Os microrganismos foram cultivados em arroz parboilizado estéril e as culturas obtidas foram extraídas com acetato de etila e submetidas a partição. A fração FMeCN de cada extrato foi submetida às técnicas cromatográficas a fim de isolar os metabólitos secundários. Os extratos das macroalgas foram submetidos a partição e as frações resultantes submetidas a estudo químico por CLAE-DAD, CLAE-DAD/EM- IES e RMN 1H. A comparação dos perfis cromatográficos das frações obbtidas das macroalgas permitiu uma abordagem qualitativa dos constituintes por gerar informações sobre a composição química das macroalgas em estudo. Os ácidos graxos foram analisados nas frações apolares das macroalgas e microrganismos associados por CG-EM e resultou na identificação de 27 substâncias nas frações hexânicas das macroalgas, sendo 19 da D. marginata e 8 da P. gimnospora, enquanto para os microrganismos, 32 substâncias foram identificadas, sendo 16 de P. citrinum e 16 de P. chrysogenum. A fração em MeCN de P. citrinum forneceu 17 substâncias, sendo 4 alcaloides quinolizidínicos: citrinadina A (1), citrinadina B (2), 18- desidroxi-citrinadina B (3), chrisogenamida (4); 4 alcaloides quinolactínicos: quinolactinas A (11), B1/B2 (12), B (13) e D (14) e 9 policetídeos: dicitrinina A (5), 1,5-dihidroxi-2-metil-3-(1-metil-2-hidroxi)-propilbenzeno (6), esclerotinina A (7), descarboxidihidrocitrinona (8), 1-carboxi-8-hidroxi-6-metilxantona éster metílico (9), ácido linoléico (10), ácido italícico (15), citrinina (16), e 1,3,8-tri-hidroxi-6- (hidroximetil)antraceno-9,10-diona (17). Adicionalmente, 9 substâncias foram obtidas a partir de P. chrysogenum, sendo 3 nucleotídeos: adenosina (18), 3’-O- acetiladenina (19) e 3’-O-acetiluracila (21), o éster 1,5-diacetil-2,3,4-tri- hidroxipentila (20), 3 peptídeos e/ou derivados: dicetopiperazinas, ciclo PRO-LEU (22), ciclo PRO-VAL (23) e hirsutatina A (26), e os policetídeos griseofulvina (24) e 7-desclorogriseofulvina (25). A identificação dos metabólitos secundários foi realizada, principalmente, através de EM-IES, RMN 1De 2D e busca nos bancos de dados Antimarin2011®, MarinLit®, e ChemSpider®. Investigaram-se as atividades anti-inflamatória, antioxidante e inibição enzimática, e os resultados mostraram que a superprodução de NO foi inibida de maneira dose-dependente pela ação da FMeCNDm e das substâncias citrinina (16) e hirsutatina A (26). Nas concentrações de 500 μg/mL, 250 μg/mL, 100 μg/mL da mistura de esclerotinina A (7), descarboxidihidrocitrinona (8); 1-carboxi-8-hidroxi-6-metilxantona éster metílico (9); 1,3,8 tri-hidroxi-6-(hidroximetil)antraceno-9,10-diona (17) protegeram todas as linhagens, mostrando um maior efeito antioxidante do que FMeCNDm e a citrinina (16), frente aos danos induzidos pelo oxidante H2O2 em linhagens de S. cerevisiae. No ensaio de inibição enzimática, os resultados mostraram que a citrinina (16) inibiu mais eficientemente a atividade enzimática tanto das calicreínas como da papaína e tripsina do que a hirsutatina A (26). Palavras-chave: Macroalgas, Microrganismos associados, Penicillium, Produtos naturais marinhos, Bioatividade ABSTRACT Macroalgae Dichotomaria marginata and Padina gymnospora were collected at Sao Paulo State shore and their associated microrganisms, Penicillium citrinum (Dm1) and Penicillium chrysogenum (Pg1), respectively, were isolated and identified. The microorganisms were cultivated in sterile parboilized rice and the resulting cultures were extracted with ethyl acetate and submitted to partitioning. Fraction FMeCN of each extract was submitted to chromatography aiming at the isolation of secondary metabolites. The macroalgae extracts were submitted to partitioning and the resulting fractions were analyzed by HPLC-DAD, HPLC-DAD-MS/ESI and 1H NMR. The chromatographic profile comparison for the resulting fractions from macroalgae allowed the qualitative assessment of the chemical constituents, and afforded information on the chemical composition of the macroalgae. Fatty acids were analysed in the low polarity fractions of the macroalgae and microrganisms extracts by GC-MS and resulted in the identification of 27 compounds from the hexane fractions of macroalgae, including 19, from D. marginata, and 8, from P. gimnospora, whereas 32 fatty acids were identified from the microorganisms, including 16 from P. citrinum and 16, from P. chrysogenum. Fraction in MeCN from P. citrinum afforded 17 compounds: 4 quinolizidine alkaloids: citrinadin A (1), citrinadin B (2), 18-dehydroxy-citrinadin B (3), chrysogenamide (4); 4 quinolactin alkaloids: quinolactins A (11), B1/B2 (12), B (13) and D (14), and 9 poliketides: dicitrinin A (5), 1,5-dihydroxy-2-methyl-3-(1-methyl-2-hydroxy)-propylbenzene (6), esclerotinin A (7), decarboxydihydrocitrinone (8), de 1-carboxy-8-hydroxy-6- methylxanthone methyl ester (9), linoleic acid (10), italicic acid (15), citrinin (16), e 1,3,8-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)antracene-9,10-dione (17). Aditionally, 9 compounds were obtained from P. chrysogenum, 3 nucleotides: adenosine (18), 3’- O-acetyladenine (19) and 3’-O-acetyluracil (21), the ester 1,5-diacetyl-2,3,4- trihydroxypentyl (20), 3 peptides and/or diketopiperazine derivatives: cycle PRO- LEU (22), cycle PRO-VAL (23) and hirsutatin A (26), and the polyketides griseofulvin (24) and 7-dechlorogriseofulvin (25). The secondary metabolites identification was carried out mainly by MS-ESI, 1D and 1D NMR analyses and search in Antimarin2011®, MarinLit®, e ChemSpider® databanks. The antiinflammatory and antioxidant activities were investigated as well as the enzimatic inhibition towards kallikreins, papain and trypsin. The results evidenced the dose-dependent inhibition of NO overproduction by FMeCNDm, and compounds citrinin (16) and hirsutatin A (26). At 500 μg/mL, 250 μg/mL, and 100 μg/mL of the mixture of esclerotinin A (7) and decarboxydihydrocitrinone (8); in addition to 1- carboxy-8-hydroxy-6-methylxanthone methyl ester (9); and 1,3,8-trihydroxy-6- (hydroxymethyl)antracene-9,10-dione (17) protected all cell lines and evidenced higher antioxidant effect than the observed for FMeCNDm and citrinin (16), towards pro-oxidant H2O2 induced damage in S. cerevisiae cell lines. The enzymatic assay showed that citrinin inhibited kallikreins activity more efficiently than hirsutatin A, and similar behaviour was also observed towards papain and trypsin. Keywords: Macroalgae, Associated microorganismos, Penicillium, Marine natural products, Bioactivity ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1- Novos compostos derivados de microrganismos marinhos, até meados de 2010, dividido por fontes de microrganismos. 57 Figura 2- A filogenia consenso dos eucariontes. 58 Figura 3- Crescimento das colônias a 25 °C e morfologia do fungo do gênero Penicillium (HOUBRAKEN et al., 2010). 61 Figura 4- Alguns metabólicos derivados do gênero Penicillium. 63 Figura 5- Espécies de macroalga Dichotomaria marginata (vermelha) e Padina gymnospora (parda) (Fotos do arquivo pessoal). 66 Figura 6- Localização geográfica do ponto de coleta: Costão Direito da Praia da Fortaleza-UBATUBA-SP (23º24´93´´S e 45º03´41´´W). 70 Figura 7- Esquema de fracionamento dos extratos das macroalgas em estudo. 72 Figura 8- Procedimento para isolamento e crescimento por 21 dias dos microrganismos obtidos das macroalgas P. gymnospora e D. marginata. 73 Figura 9- Esquema de partição do extrato bruto para os microrganismos Penicillium citrinum e Penicillium chrysogenum. 74 Figura 10- Mecanismo geral da reação de sililação. 76 Figura 11- Cromatograma analítico de FMeCNDm, no modo gradiente MeOH:H2O, 5-100% MeOH em 55 min., solução 1 mg/mL, fluxo 1 mL/min, C18, λ = 254 nm. 78 Figura 12- Cromatograma obtido em CLAE-DAD, C18, para FDm2Se, MeOH:H2O gradiente linear 20-80% (251 nm, 3,0 mL/min). 79 Figura 13- Cromatograma obtido em CLAE-DAD, C18, semi preparativo para SF5Dm3Se, MeOH:H2O gradiente não linear (280 nm, 2 80 mL/min, demais condições descritas no texto). Figura 14- Cromatograma obtido em CLAE-DAD, C18, semi preparativo para SF2Dm8Se, MeOH:H2O gradiente não linear, 254 nm, 1 mL/min. 81 Figura 15- Cromatograma obtido em CLAE-DAD fase reversa semipreparativo para SF4Dm8Se, MeOH:H2O gradiente não linear, detecção a 275 nm, 1 mL/min. 82 Figura 16- Fracionamento cromatográfico da fração MeCN do microrganismo Penicillium citrinum isolado da macroalga Dm. 83 Figura 17- Cromatograma analítico de FMeCNPg, via CLAE-DAD no modo gradiente MeOH:H2O, 5-100% MeOH em 55 min., solução 1 mg/mL, fluxo 1 mL/min, coluna Phenomenex C-18, 5µL, 250 x 4,6 mm, λ = 254 nm, injeção de 20µL. 84 Figura 18- Cromatograma obtido em CLAE-DAD fase reversa semi preparativo para FPg1C18, MeOH:H2O gradiente linear, 254 nm, 1,5 mL/min. 85 Figura 19- Cromatograma obtido em CLAE-DAD, C18, semi preparativo para FPg7C18, MeOH:H2O gradiente não linear (detecção a 254 nm, 1 mL/min). 86 Figura 20- Fracionamento cromatográfico da fração MeCN do microrganismo Penicillium chrysogenum isolado da macroalga Padina gymnospora. 87 Figura 21- Processo de elucidação estrutural das substâncias isoladas. 91 Figura 22- Esquema do ensaio do Disco Central em S. cerevisiae. 95 Figura 23- Esquema de reação de Abz-X-X-X-X-X-X-X-EDDnp na presença da enzima. 96 Figura 24- Cromatograma da FBuDm em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+). 99 Figura 25- Espectro de RMN de 1H da fração butanólica de Dichotomaria marginata (FBuDm) (500 MHz, DMSO-d6). 100 Figura 26- Cromatograma da FBuPg em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+). 101 Figura 27- Cromatogramas da fração diclorometano (FDCMDm) em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+). 102 Figura 28- Espectro de RMN de 1H da fração diclorometano de Dichotomaria marginata (FDCMDm) (500 MHz, CDCl3). 103 Figura 29- Cromatograma da FDCMPg em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+). 104 Figura 30- Espectro de RMN de 1H da fração diclorometano da Padina gymnospora (FDCMPg) (500 MHz, CDCl3). 105 Figura 31- Cromatograma da FMDm em em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+). 106 Figura 32- Espectro de RMN de 1H da fração metanólica de Dichotomaria marginata (FMDm) (500 MHz, CD3OD). 107 Figura 33- Cromatogramas da FMPg em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+). 108 Figura 34- Espectro de RMN de 1H da fração metanólica de Padina gymnospora (FMPg) (500 MHz, DMSO). 109 Figura 35- Cromatogramas obtidos para frações hexânicas das macroalgas FHDm e FHPg analisados por CG-EM. 111 Figura 36- Cromatogramas obtidos para frações hexânicas dos microrganismos P. citrinum e P. chrysogenum analisados por CG-EM. 112 Figura 37- Intermediários biossintéticos da L-lisina e L-ornitina (DEWICK, 2001, p. 328). 116 Figura 38- Núcleos de alcaloides derivados da L-lisina e L-ornitina (ANISZEWSKI, 2007, p.69). 117 Figura 39- Biossíntese de intermediários universais, de alcaloides 118 derivados de L-lisina (BUNSUPA et al., 2012). Figura 40- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância (1). 120 Figura 41- Principais correlações do COSY e conectividades dos fragmentos da citrinadina A. 124 Figura 42- Espectro de RMN 1H da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 128 Figura 43- Expansões do espectro de RMN 1H da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 129 Figura 44- Espectro de RMN 13C da substância 1 (125 MHz, MeOD). 130 Figura 45- Expansões do espectro de RMN 13C da substância 1 (125 MHz, CD3OD). 131 Figura 46- Espectro de HSQC da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 132 Figura 47- Expansões do espectro de HSQC da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 133 Figura 48- Mapa de contorno de gHMBC da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 134 Figura 49- Expansão do mapa de contorno de gHMBC da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 135 Figura 50- Espectro de COSY da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 136 Figura 51- Expansão do espectro de COSY da substância 1(500 MHz, CD3OD). 137 Figura 52- Expansão do espectro de COSY da substância 1(500 MHz, CD3OD). 138 Figura 53- Espectro de ROESY 1D da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 139 Figura 54- Expansão do espectro de ROESY 1D da substância 1 (500 MHz, CD3OD). 140 Figura 55- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e íons fragmentos EM2 das substâncias 2 e 3. 142 Figura 56- Espectro de RMN 1H das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 146 Figura 57- Expansão do espectro de RMN 1H das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 147 Figura 58- Continuação da expansão do espectro de RMN 1H das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 153 Figura 59- Espectro de RMN 13C das substâncias 2 e 3 (125 MHz, CD3OD). 154 Figura 60 Expansão do espectro de RMN 13C das substâncias 2 e 3 (125 MHz, CD3OD). 155 Figura 61- Continuação da expansão do espectro de RMN 13C das substâncias 2 e 3 (125 MHz, CD3OD). 156 Figura 62- Espectro de HSQC das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 157 Figura 63- Expansões do espectro de HSQC da substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 158 Figura 64- Expansões do espectro de HSQC das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 159 Figura 65- Mapa de contorno de gHMBC da substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 160 Figura 66- Expansão do mapa de contorno de gHMBC das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 161 Figura 67- Continuação expansão do mapa de contorno de gHMBC das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 162 Figura 68- Continuação expansão do mapa de contorno de gHMBC das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 163 Figura 69- Continuação expansão do mapa de contorno de gHMBC das 164 substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). Figura 70- Espectro de COSY das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 165 Figura 71- Principais correlações gHMBC e COSY da substância 3 166 Figura 72- Principais interações observadas pelo experimento ROESY 1D (1H↔1H) para 2. 167 Figura 73- Continuação da expansão do espectro de COSY das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 168 Figura 74- Continuação da expansão do espectro de COSY das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 169 Figura 75- Espectro de ROESY 1D das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 170 Figura 76- Expansão do espectro de ROESY 1D das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD) 171 Figura 77- Continuação da expansão do espectro de ROESY 1D das substâncias 2 e 3 (500 MHz, CD3OD). 172 Figura 78- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 4. 174 Figura 79- Principais correlações COSY e conectividades dos fragmentos da chrisogenamida. 176 Figura 80- Principais interações observadas pelo experimento ROESY 1D (1H↔1H) para chrisogenamida. 177 Figura 81- Espectro de RMN 1H da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 181 Figura 82- Expansões do espectro de RMN 1H da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 182 Figura 83- Espectro de HSQC da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 182 Figura 84- Expansões do espectro de HSQC da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 183 Figura 85- Mapa de contorno de gHMBC da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 184 Figura 86- Expansão do mapa de contorno de gHMBC da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 185 Figura 87- Expansão do mapa de contorno de gHMBC da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 186 Figura 88- Espectro de COSY da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 187 Figura 89- Expansão do espectro de COSY da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 188 Figura 90- Continuação da expansão do espectro de COSY da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 189 Figura 91- Espectro de ROESY 1D da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 190 Figura 92- Expansão do espectro de ROESY 1D da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 191 Figura 93- Expansão do espectro de ROESY 1D da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 192 Figura 94- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e EM2, da quinolactina A (11). 195 Figura 95- Espectro de RMN 1H da substância 11 (500 MHz, CD3OD). 196 Figura 96- Proposta de fragmentação da substância quinolactina A (11). 197 Figura 97- Proposta de fragmentação das substâncias quinolactinas B1/B2 (12) e B (13). 198 Figura 98- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e EM2 da quinolactina B1/B2 (12) e B (13). 200 Figura 99- Espectro de RMN 1H da substância 13 (500 MHz CD3OD). 199 Figura 100- Proposta de fragmentação da quinolactina D (14). 201 Figura 101- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e EM2 da quinolactina D (14). 202 Figura 102- Espectro de RMN 1H da substância 14 (500 MHz CD3OD). 203 Figura 103- Extensão da cadeia durante biossíntese de policetídeos (DEWICK, 2001). 205 Figura 104- Biossíntese de xantonas em fungos e li uens T et al., 2012). 206 Figura 105- Principais correlações do gHMBC da citrinina (16) 208 Figura 106- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 16. 209 Figura 107- Espectro de RMN 1H da substância 16 (400 MHz, CDCl3). 211 Figura 108- Espectro de RMN 13C da substância 16 (100 MHz, CDCl3). 212 Figura 109- Espectro de HSQC da substância 16 (400 MHz, CDCl3). 213 Figura 110- Mapa de contorno de gHMBC da substância 16 (400 MHz, CDCl3). 214 Figura 111- Espectro de COSY da substância 16 (400 MHz, CDCl3). 215 Figura 112- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 5. 217 Figura 113- Principais correlações observadas pelo COSY e gHMBC para substância 5 218 Figura 114- Espectro de RMN 1H da substância 5 (500 MHz, CDCl3). 220 Figura 115- Espectro de RMN 13C da substância 5 (125 MHz, CDCl3). 221 Figura 116- Mapa de contorno de gHMBC da substância 5 (500 MHz, CDCl3). 222 Figura 117- Extensão do mapa de contorno de gHMBC da substância 5 (500 MHz, CDCl3). 223 Figura 118- Extensão do mapa de contorno de gHMBC da substância 5 (500 MHz, CDCl3). 224 Figura 119- Expansão do espectro de COSY da substância 5 (500MHz, CDCl3). 225 Figura 120- Expansão do espectro de COSY da substância 5 (500MHz, CDCl3). 226 Figura 121- Espectro de ROESY 1D da substância 5 (500MHz, CDCl3). 227 Figura 122- Proposta de íons fragmentos para o substância 6. 229 Figura 123- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e íons fragmentos EM2 da substância 6. 230 Figura 124- Espectro de RMN 1H da substância 6 (400 MHz, CD3OD). 231 Figura 125- Espectro de RMN 13C da substância 6 (100 MHz, CD3OD). 232 Figura 126- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) das substâncias 7 e 8. 234 Figura 127- Correlações observadas do espectro de gHMBC para as substâncias 7 e 8. 235 Figura 128- Espectro de RMN 1H das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 237 Figura 129- Expansão do espectro de RMN 1H das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 238 Figura 130- Espectro de RMN 13C das substâncias 7 e 8 (100 MHz, CDCl3). 239 Figura 131- Espectro de HSQC das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 240 Figura 132- Extensão do espectro de HSQC das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 241 Figura 133- Mapa de contorno de gHMBC das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 242 Figura 134- Extensão do mapa de contorno de gHMBC das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 243 Figura 135- Continuação da extensão do mapa de contorno de gHMBC das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 244 Figura 136- Espectro de COSY das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 245 Figura 137- Sugestão biossintética das unidades monoméricas da citrinina (CLARK et al., 2006a). 246 Figura 138- Proposta biossintética para a unidade dimérica dicitrinina A (CLARK et al., 2006a). 247 Figura 139- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 10. 249 Figura 140- Espectro de RMN 1H da substância 10 (400 MHz, CDCl3). 250 Figura 141- Proposta de íons fragmentos para o ácido italícico (15). 251 Figura 142- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e (-) e íons fragmentos EM2 da substância 15. 252 Figura 143- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 9. 254 Figura 144- Correlações apresentadas no espectro de gHMBC da substância 9. 255 Figura 145- Espectro de RMN 1H da substância 9 (400 MHz, DMSO-d6). 257 Figura 146- Espectro de RMN 13C da substância 9 (100 MHz, DMSO-d6). 258 Figura 147- Espectro de HSQC da substância 9 (400 MHz, DMSO- d6). 259 Figura 148- Mapa de contorno de gHMBC da substância 9 (400 MHz, DMSO-d6). 260 Figura 149- Expansões do mapa de contorno de gHMBC da substância 9 (400 MHz, DMSO-d6). 261 Figura 150- Espectro de COSY da substância 9 (400 MHz, DMSO-d6). 262 Figura 151- Expansão do espectro de COSY da substância 9 (400 MHz, DMSO-d6). 263 Figura 152- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 17. 268 Figura 153- Espectro de RMN 1H da substância 17 (400 MHz, DMSO-d6). 268 Figura 154- Espectro de RMN 13C da substância 17 (100 MHz, DMSO-d6). 269 Figura 155- Espectro de HSQC da substância 17 (400 MHz, DMSO-d6). 270 Figura 156- Mapa de contorno de gHMBC da substância 17 (400 MHz, DMSO-d6). 271 Figura 157- Espectro de COSY da substância 17 (400 MHz, DMSO-d6). 272 Figura 158- Expansão do espectro de COSY da substância 17 (400 MHz, DMSO-d6). 273 Figura 159- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) das substâncias 18 e 19. 276 Figura 160- Espectro de RMN 1H da substância 18 (400 MHz, CD3OD). 278 Figura 161- Principais correlações do experimento gHMBC para 3’O- acetiluracila (21). 278 Figura 162- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm), massas EM-IES (+) e íons fragmentos da substância 21. 279 Figura 163- Espectro de RMN 1H da substância 21 (400 MHz, CD3OD). 280 Figura 164- Espectro de HSQC da substância 21 (400 MHz, CD3OD). 281 Figura 165- Mapa de contorno de gHMBC da substância 21 (400 MHz, CD3OD). 282 Figura 166- Espectro de COSY da substância 21 (400 MHz, CD3OD). 283 Figura 167- Principais correlações do gHMBC para o 1,5-diacetil-2,3,4-tri- hidroxipentila (20). 286 Figura 168- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 20. 287 Figura 169- Espectro de RMN 1H da substância 20 (400 MHz, CD3OD). 287 Figura 170- Espectro de RMN 13C da substância 20 (100 MHz, CD3OD). 288 Figura 171- Espectro de HSQC da substância 20 (400 MHz, CD3OD). 289 Figura 172- Mapa de contorno de gHMBC da substância 20 (400 MHz, CD3OD). 290 Figura 173- Expansão do mapa de contorno de gHMBC da substância 20 (400 MHz, CD3OD). 291 Figura 174- Espectro de COSY da substância 20 (400 MHz, CD3OD). 292 Figura 175- Proposta de fragmentação dos íons fragmentos para ciclo PRO-LEU (22) e ciclo PRO-VAL (23). 294 Figura 176- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) e íons fragmentos das substâncias 22 e 23. 295 Figura 177- Espectro de RMN 1H da substância 23 (400 MHz, CD3OD). 296 Figura 178- Cromatograma analítico, em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) da substância 26. 298 Figura 179- Espectro vibracional na região do IV da substância 26. 299 Figura 180- Principais correlações COSY e sequenciamento dos aminoácidos da Hirsutatina A (26). 303 Figura 181- Espectro de RMN 1H da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 306 Figura 182- Expansões do espectro de RMN 1H da substância 26 (500 MHz, CH3OD). 307 Figura 183- Continuação de expansões do RMN 1H da substância 26 (500 MHz, CH3OD). 308 Figura 184- Espectro de RMN 13C da substância 26 (125 MHz, CD3OD). 309 Figura 185- Expansões do espectro de RMN 13C da substância 26 (125 MHz, CD3OD). 310 Figura 186- Espectro de HSQC da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 311 Figura 187- Expansões do espectro de HSQC da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 312 Figura 188- Expansão do espectro de HSQC da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 313 Figura 189- Mapa de contorno de gHMBC da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 314 Figura 190- Expansão do mapa de contorno de gHMBC da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 315 Figura 191- Expansão do mapa de contorno de gHMBC da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 316 Figura 192- Espectro de COSY da substância 26 (500 MHz, CH3OD). 317 Figura 193- Expansão do COSY da substância 26 (500 MHz, CH3OD). 318 Figura 194- Espectro de ROESY 1D da substância 26 (500 MHz, CH3OD). 319 Figura 195- Expansão do espectro de ROESY 1D da substância 26 (500 MHz, CH3OD). 320 Figura 196- Cromatograma analítico em CLAE-DAD-EM, espectros de UV (254 nm) e massas EM-IES (+) das substâncias 24 e 25. 322 Figura 197- Espectro de RMN 1H da substância 24 (400 MHz, CD3OD). 325 Figura 198- Espectro de RMN 13C da substância 24 (100 MHz, CD3OD). 326 Figura 199- Espectro de RMN 1H da substância 25 (100 MHz, CD3OD). 327 Figura 200- Espansão do espectro de RMN 13C da substância 25 (100 MHz, CD3OD). 328 Figura 201- Efeito das diferentes concentrações das amostras (C1)- FMeCNDm, (C3)-dicitrinina A (5), na viabilidade celular pelo ensaio do MTT e na inibição da produção de óxido nítrico (NO) em culturas de células de macrófagos da linhagem RAW 264.7 de camundongos. 330 Figura 202- Efeito das diferentes concentrações das amostras (C6)-1,3,8- tri-hidroxi-6-(hidroximetil)antraceno-9,10 diona (17), (C7)- citrinina (16), (C8)-8-hidroxi-6-metilxantona-1-ácido carboxílico éster metilico (9) e (C13)-mistura de substâncias esclerotinina A (7) e descarboxidihicitrinona (8) na viabilidade celular pelo ensaio do MTT e na inibição da produção de óxido nítrico (NO) em culturas de células de macrófagos da linhagem RAW 264.7 de camundongos. 331 Figura 203- Continuação do efeito das diferentes concentrações das amostras (C16) 7-descloro-griseofulvina (25), (C17) griseofulvina (24) e (C19)-hirsutatina A (26) na viabilidade celular pelo ensaio do MTT e na inibição da produção de óxido nítrico (NO) em culturas de células de macrófagos da linhagem RAW 264.7 de camundongos. 332 Figura 204- Ensaio do disco central com diferentes linhagens de S. cerevisae. 334 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1- Rendimentos do fracionamento dos extratos das macroalgas. 71 Tabela 2- Rendimento dos extratos brutos e frações obtidas dos microrganismos em estudo. 75 Tabela 3- Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas: Fonte E.B.Gralla, Los Angeles. 94 Tabela 4- Identificação das substâncias encontradas nas frações FH das macroalgas D. marginata e P. gymnospora analisadas por CG-EM. 113 Tabela 5- Identificação das substâncias encontrados nas frações FH dos microrganismos P. citrinum e P. chrysogenum analisados por CG-EM. 114 Tabela 6- Dados de RMN de 1H RMN, 13C, gHMBC e COSY da substância 1 (500 MHz , CD3OD,). 125 Tabela 7- Dados de RMN de 1H RMN, 13C, gHMBC e COSY da substância 2 (500 MHz, CD3OD). 148 Tabela 8- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 3 (500 MHz, CD3OD). 151 Tabela 9- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 4 (500 MHz, CD3OD). 178 Tabela 10- Dados do EM-IES dos alcaloides quinolactínicos. 201 Tabela 11- Dados de RMN de 1H RMN 13C gHMBC e COSY da substância 16 (400 MHz, CDCl3). 210 Tabela 12- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 5 (500 MHz, CDCl3). 219 Tabela 13- Dados de RMN de 1H, 13C, da substância 6 (400 MHz, CD3OD). 229 Tabela 14- Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC das substâncias 7 e 8 (400 MHz, CDCl3). 236 Tabela 15- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 9 (DMSO, 400 MHz). 256 Tabela 16- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 17 (400 MHz, DMSO). 267 Tabela 17- Dados de RMN de 1H, gHMBC e COSY da substância 21 (400 MHz, CD3OD). 278 Tabela 18- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 20 (400 MHz, CD3OD) 285 Tabela 19- Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e COSY da substância 26 (500 MHz, CD3OD). 304 Tabela 20- Dados de RMN de 1H, 13C das substâncias 24 e 25 (400 MHz, CD3OD). 324 Tabela 21- Efeito protetor de diferentes substâncias em leveduras estacionárias contra a toxicidade do H2O2 (ensaio disco central). 335 Tabela 22- Valores de IC50 na inibição enzimática. 337 LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS ACN- Acetonitrila AcOEt- Acetato de etila BDA- Batata Dextrose Agar CC- Cromatografia em coluna CCD- Cromatografia em camada delgada CG–EM- Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas CLAE- Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-DAD - cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos CLAE-PDA-ESI/MS - cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de fotodiodo acoplado a espectrometria de massas COSY– Correlated Spectroscopy dd- Duplo dubleto d- Dubleto dl- Dupleto largo DBE- Double Bond Equivalent DCM- Diclorometano Dm- Dichotomaria marginata EM-IES- Espectroscopia de massas de alta resolução com ionização por electrospray EMAR- Espectroscopia de massas de alta resolução FBuOH- Fração butanólica FDCM- Fração diclorometano FM- Fração metanólica gHMBC- Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HSQC- Heteronuclear Single Quantum Coherence HMQC- Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation IR- Índice de retenção IV – Infravermelho J- Constante de acoplamento KLKs- Calicreínas LPS- Lipopolissarídeo m- Multipleto MeOH- Metanol PA- Para Análise Pc- Penicillium citrinum Pg- Padina gymnospora Qd-quadrupletos ROESY- Rotating-frame Overhauser SpectroscoPY RMN- Ressonância magnética nuclear s- Singleto sl- Singleto largo st- Sexteto t- Tripleto TMS- Tetrametilsilil UV- Ultravioleta u.m.a Unidade de massa atômica YEL- Yeast Extract Liquid YEPD- Yeast Extract-Peptone-Dextrose SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 45 1.1 Produtos Naturais Marinhos 46 1.2 Por que a Química de Produtos Naturais Marinhos? 51 1.3 Microrganismos Marinhos como Fonte de Metabólitos Secundários 53 1.4 Espécies Estudadas 57 1.4.1 Macroalgas 57 1.4.1.1 Ácidos Graxos das Macroalgas 59 1.4.2 Microrganismos Associados 60 2. OBJETIVO 64 3. MATERIAIS E MÉTODOS 66 3.1 MATERIAIS 66 3.1.1Macroalgas e Microrganismos Associados 66 3.1.2 Solventes Gerais e Equipamentos Básicos 66 3.2 INSTRUMENTOS E TÉCNICAS 67 2.1.1 3.2.1 Cromatografia Líquida 67 3.2.2 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 68 3.2.3 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM) 69 3.3 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DAS MACROALGAS: Dichotomaria marginata, Padina gymnospora 69 3.3.1 Obtenção do Extrato Bruto, Fases de Partição das Macroalgas 71 3.3.2 Isolamento e Identificação dos Microrganismos Associados das Macroalgas 72 3.3.3 Obtenção do Extrato Bruto e Fracionamento da Cultura de Microrganismos 73 3.3.4 Screening das Frações Obtidas dos Extratos de Macroalgas D. marginata, P. gymnospora e Microrganismos Associados P. citrinum e P. chrysogenum 75 3.4 ESTUDO QUÍMICO 76 3.4.1 Identificação de Ácidos Graxos nas Macroalgas e Microrganismos Associados por CG-EM 76 3.4.2 Microrganismos Associados às Macroalgas 77 3.4.2.1 Penicillium citrinum 77 3.4.2.1.1 FDm2Se (49 mg) 78 3.4.2.1.2 FDm3Se (198 mg) 79 3.4.2.1.3 FDm8Se (156 mg) 80 3.4.2.1.4 FDm9 Se (78 mg) 82 3.4.2.1.5 FDm11Se (8,9 mg) 82 3.4.2.2 Penicillium chrysogenum 84 3.4.2.2.1 FPg1C18 (97 mg) 85 3.4.2.2.2 FPg7C18 (100 mg) 85 3.4.2.2.3 FPg18C18 (89 mg) 86 3.5 ESTUDOS ESPECTROSCÓPICOS PARA ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS ISOLADOS 88 3.5.1 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 88 3.5.2 Espectrometria de Massas (EM) 89 3.5.2.1 Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray 90 3.6 ESTUDO BIOLÓGICO 92 3.6.1 Avaliação da Atividade Imunomoduladora – anti-inflamatória 92 3.6.1.1 Manutenção de linhagens celulares 92 3.6.1.2 Estimulação celular em cultura de macrófagos e dosagem do oxido nítrico 92 3.6.1.3 Atividade Citotóxica 93 3.6.1.4 Análise estatística 93 3.6.2 Avaliação da Atividade Antioxidante 94 3.6.2.1 Ensaio do Disco Central com linhagens de Saccharomyces cerevisiae 94 3.6.3 Atividade Inibitória Enzimática Frente às Calicreínas Teciduais Humanas, Papaína e Tripsina. 96 4-RESULTADOS E DISCUSSÃO 97 4.1 Screening das Frações de Macroalgas Dichotomaria marginata e Padina gymnospora 97 4.2 Análises dos Ácidos Graxos das Frações Hexânicas das Macroalgas e Microrganismos Associados. 110 4.3 Identificação e Elucidação Estrutural das Substâncias Isoladas 115 4.4 Substâncias do Isoladas do Microrganismo Penicillium citrinum Associado a Macroalga Dichotomaria marginata 116 4.4.1 Alcaloides 116 4.4.1.1 Quinolizidínicos 119 4.4.1.1.1 Citrinadina A (1) 119 4.4.1.1.2 Citrinadina B (2) e 18-desidróxi-citrinadina B (3) 141 4.4.1.1.3 Chrisogenamida (4) 173 4.4.1.2 Quinolactínicos 193 4.4.1.2.1 Quinolactina A (11) 194 4.4.1.2.2 Quinolactinas B1/B2 (12) e B (13) 198 4.4.1.2.3 Quinolactina D (14) 201 4.4.2 Derivados de Policetídeos de Penicillium citrinum 204 4.4.2.1 Citrinina (16) 207 4.4.2.2 Dicitrinina A (5) 216 4.4.2.3 1,5-dihidroxi-2-metil-3-(1-metil-2-hidroxi)-propilbenzeno (6) 228 4.4.2.4 Esclerotinina A (7), Descarboxidihicitrinona (8) 233 4.4.2.5 Ácido linoléico (10) 250 4.4.2.6 Ácido italícico (15) 253 4.4.2.7 1-carboxi-8-hidroxi-6-metilxantona éster metilico (9) 255 4.4.2.8 1, 3, 8 tri-hidroxi-6-(hidroximetil)antraceno-9,10 diona (ω-Dihidroxiemodina ) (17) 266 4.5 Substâncias Isoladas do Microrganismo Penicillium chrysogenum isolado da macroalga Padina gymnospora 276 4.5.1 Ácidos nucléicos 276 4.5.1.1 Adenosina (18) e 3’-O-acetiladenina (19) 276 4.5.1.2 3’-O-acetiluracil (21) 279 4.5.2 Éster 1,5 di-acetil-2,3,4-tri-hidroxipentila (20) 286 4.5.3 Peptídeos e/ ou Derivados 295 4.5.3.1 Dicetopiperazinas Biciclo PRO-LEU (22) e Biciclo PRO-VAL (23) 295 4.5.3.2 Hirsutatina A (26) 299 4.5.4 Derivados de policetídeos de Penicillium chrysogenum 323 4.5.4.1 Griseofulvina (24) e 7-Descloro-griseofulvina (25) 323 4.6 Considerações sobre os bioensaios realizados com extratos e substâncias isoladas das espécies em estudo 331 4.6.1 Dosagem de óxido nítrico produzido por macrófagos e ensaio de citotoxicidade 331 4.6.2 Atividade antioxidante em linhagens S. cerevisae 335 4.6.3 Atividade inibitória enzimática 338 5-CONSIDERAÇÕES FINAIS 341 6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 346 Introdução ~ 45 ~ INTRODUÇÃO Introdução ~ 46 ~ 1.1 Produtos Naturais Marinhos Nos últimos anos houve um aumento na investigação na área da biotecnologia de ecossistemas marinhos como uma fonte de valor incomensurável para a obtenção de moléculas com extraordinárias propriedades que podem ser utilizadas no desenvolvimento de medicamentos, cosméticos e outros produtos de alto valor agregado para fins específicos (LIMA et al., 2004). Como resultados destes estudos, a produção bibliográfica a respeito de produtos naturais marinhos vem crescendo de maneira notável (LHULLIER, 2006). Ao contrário das plantas terrestres, os organismos marinhos têm uma história recente do ponto de vista medicinal para o tratamento e/ou prevenção de doenças humanas, com algumas poucas exceções. Na medicina tradicional marinha algumas aplicações foram relatadas. Os fenícios ainda no século 12 a. C. usavam secreção de moluscos para tingir tecidos de lã e algas marinhas para fertilizar o solo (NEWMAN & CRAGG, 2000). As algas vermelhas Chondrus crispus e Mastocarpus stellatus eram bebidas como fontes de “Sobriedade”, e usadas popularmente para constipações, tosse, dores de garganta, peito e doenças pulmonares, incluindo tuberculose. As algas eram cozidas em água ou leite, coadas e bebidas a quente (MOLONEY, 1919; VICKERY, 1995). O suco da alga vermelha Porphyra umbilicalis Kützing (Linnaeus), encontrada nos oceanos do Ártico, Atlântico Norte e mar do Mediterrâneo, era tomado em jejum por três semanas contra o câncer (BORLASE, 1758). Os Astecas consumiam a cianobactéria espirulina como fonte de proteínas ainda no sec. XIV. Fonte:(http://www.newcastle.edu.au/research-and-innovation/centre/science-and-it/marine-natural- products-and-chemical-ecology) Introdução ~ 47 ~ O interesse acadêmico pela pesquisa de substâncias oriundas do mar foi manifestado pela primeira vez em 1960, na cidade de Nova Iorque, numa Conferência Internacional sobre Bioquímica e Farmacologia de Substâncias de Origem Marinha. A partir desse encontro científico, químicos, biólogos e farmacólogos, em conjunto, concentraram esforços no sentido de se estabelecer um estudo mais racional sobre as substâncias (metabólitos secundários) presentes em organismos marinhos. Com os avanços das técnicas de isolamento e elucidação estrutural, tornou-se possível a identificação de inúmeras moléculas, algumas delas dotadas de importantes atividades químicas e biológicas (IOANNOU et al., 2007). Apesar da investigação do ambiente marinho ser recente, novas tendências na descoberta de medicamentos a partir de fontes naturais tem enfatizado a investigação do ecossistema marinho por explorar uma variedade de novas entidades químicas. A maioria dos produtos naturais descobertos a partir de fontes marinhas foi isolada a partir de esponjas, celenterados, tunicados, moluscos, equinodermos (estrela do mar, pepinos do mar) e briozoários (musgo) e também a partir de microrganismos marinhos (KIJJOA & SAWANGWONG, 2004). Dos cerca de 163.000 produtos naturais conhecidos que foram caracterizados de diferentes fontes biológicas, até agora, cerca de 25.000 são de origem marinha (Dictionary of Natural Products, 2011). Esse número é significativo, pois a investigação de produtos naturais marinhos tem uma história muito mais recente do que os seus homólogos, descobertos a partir de organismos vivos microbianos e terrestres (BLUNT et al., 2011). A partir da década de 50, estudos mais completos e frequentes deram novo impulso à investigação química de organismos marinhos, levando à descoberta de novas substâncias bioativas. A citarabina (arabinosídeo de citosina, Ara-C, (I) é um análogo semi-sintético do nucleotídeo pirimidina e foi desenvolvido a partir da espongotimidina (II), um nucleosídeo, originalmente isolado em 1950 da esponja caribenha Tethya crypta (BERGMANN & FEENEY, 1951). A citarabina é um agente antineoplásico citotóxico, e é um antimetabólito, convertido em meio intracelular em trifosfato de Citarabina (Ara-CTP), competindo assim com o trifosfato de desoxicitidina (substrato fisiológico) e inibindo a síntese do DNA. Citarabina recebeu a aprovação da FDA em 1969 para o tratamento de leucemias linfóide Introdução ~ 48 ~ aguda e mielóide crônica (NEWMAN et al., 2009). A espongouridina (III) é outro nucleosídeo, originalmente isolado em 1950 em conjunto com a espongotimidina a partir da mesma esponja, e é atualmente obtido através da fermentação de Streptomyces antibioticus (MAYER et al., 2010). A espongouridina foi usada como um modelo para o desenvolvimento do nucleosídeo sintético vidarabina (arabinofuranosil adenina, Ara-A, (IV), que sob ação das quinases celulares é rapidamente convertido em sua forma de fosfato ativo, e então, incorporado ao DNA viral, provocando a inibição da síntese de DNA. A vidarabina é um fármaco utilizado como antiviral e recebeu a aprovação do FDA em 1976 para o tratamento de conjuntivite aguda, ceratite epitelial recorrente, e ceratite superficial causada pelo vírus do herpes tipo 1 e 2 (BAHRING-KUHLMEY, 1977). O O N HN NH2 N ON HO OH O HO OH O HO HO N N N N NH2 O O N HN HO OH O HO HO OH O HO I II III IV No entanto, apenas após a descoberta de grandes quantidades de prostaglandinas (Va e Vb) no octocoral Plexaura homomalla, em 1978, por Alfred J. Weinheimer e Robert L. Spraggins (Universidade de Oklahoma, E.U.A.), foi que o interesse e o investimento de indústrias farmacêuticas em laboratórios de pesquisa de produtos naturais na busca de novos fármacos de origem marinha foram despertados (COSTA-LOTUFO et al., 2009). Pelos 20 anos que se seguiram, o estudo de produtos marinhos respondeu com uma excitante explosão de moléculas peculiares, com estruturas complexas até então desconhecidas potentes atividades biológicas e interações com alvos celulares inusitados (FAULKNER, 2000; NEWMAN & CRAGG, 2006). Nos últimos anos algumas empresas foram fundadas sob a prerrogativa inovadora de prospecção de fármacos a partir de microrganismos marinhos como é o caso da Nereus Pharmaceuticals, com experiência em microbiologia marinha. A PharmaMar, fundada em 1986, é hoje uma divisão do grupo Zeltia, que nos últimos 20 anos investiu mais de 1,2 bilhão de reais (420 milhões de euros) na pesquisa Introdução ~ 49 ~ em fármacos de origem marinha com potencial para tratamento do câncer. A PharmaMar conta com uma coleção de mais de 65.000 organismos marinhos, de onde já foram isoladas 700 novas entidades químicas e 30 novas famílias de substâncias já foram descritas (COSTA-LOTUFO et al., 2009). O Va R= H; 5V R=Ac CO2Me OR Vários metabólitos biologicamente ativos têm sido descobertos anualmente a partir de organismos marinhos e vem servindo como base para o desenvolvimento de novos medicamentos. O ziconotide (VI) é uma versão sintética do peptídeo ω-conotoxina MVIIA (25-aminoácido natural) que foi isolado do molusco marinho Conus magnus e aprovado pelo FDA e pela Comissão Européia em 2005 para o tratamento da dor crônica severa em pacientes com câncer e/ou AIDS (SCHROEDER et al., 2004). O ziconotide é um analgésico não-opióide cerca de 100-1000 vezes mais potente do que a morfina e com um novo mecanismo de ação, bloqueando reversivelmente os canais de cálcio tipo N) (WALLACE et al., 1997). H2N-CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC-CONH2 VI A ecteinascidina ET-743 (VII), isolada em 1969 a partir do tunicato Ecteinascidia turbinata, é uma potente droga antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário (CARTER & KEAM, 2007). Introdução ~ 50 ~ N N HO O OH H O O S HO O O VII A ecteinascidina 743 é um produto natural (alcaloide tetrahidroisoquinolínico), que pode ser considerado como o primeiro agente derivado de marinhos depois de mais de 35 anos da aprovação de Ara-C (1), em 2007 pelo FDA e União Europeia (CARTER & KEAM, 2007). O mesilato de eribulina (E-7389) é um análogo sintético do policetídeo natural halicondrina B (VIII) isolado em 1986 da esponja marinha Halichondria okadai, amplamente distribuída na costa do Pacífico no Japão (HIRATA & UEMURA, 1986). OHO O O O O O O O O O O O O O O O O HO H H H H H H H H H H H H H VIII Introdução ~ 51 ~ Em meados de novembro de 2010 a eribulina (IX) foi aprovada pelo FDA para o tratamento de pacientes com câncer de mama em estado metastático. O discodermolido (X) é um policetídeo isolado da esponja marinha Discodermia dissoluta em 1990 por Gunasekera e colaboradores. É o agente estabilizante de microtúbulos mais potente já descrito, apresentando seus efeitos via parada do ciclo celular seguida de morte por apoptose (HUNG et al., 1996; PATERSON et al., 2000). O O HO OHO OHO H2N HO X 1.2. Por que a Química de Produtos Naturais Marinhos? Mundialmente, a procura de novos fármacos vem sendo cada vez mais intensa, principalmente por metabólitos ativos provenientes de fontes naturais. E durante vários anos a química das substâncias derivadas de plantas tem recebido uma atenção muito grande dos químicos de produtos naturais. No entanto com crescente necessidade de se obter substâncias de interesse econômico e/ou biologicamente ativas os organismos marinhos se tornaram uma importante fonte de novos fármacos (MOLINSKI et al., 2009). Por que a química de produtos naturais marinhos? A resposta tem sido respondida não só devido à riqueza extraordinária de estruturas químicas destacando-se pela singularidade estrutural e pela possibilidade de se obter produtos patenteáveis, mas também do largo espectro de atividades biológicas e farmacológicas dos compostos de origem marinha (CRAGG & NEWMAN, 2006). O O O O O O O O O O H H H H H H2N OH IX Introdução ~ 52 ~ O mar é fonte original de vida na Terra, abriga mais de 300000 espécies de plantas e animais (HAEFNER, 2003), dos 34 filos fundamentais de seres vivos, 17 ocorrem na terra enquanto 32 filos aparecem no mar (com algumas sobreposições) (KIJJOI & SAWANGWONG, 2004). Do ponto de vista evolucionário os seres humanos estão ligados aos organismos marinhos, levando a concluir que não é surpreendente que muitas moléculas do ambiente marinho tenham pronunciada atividade nas células e tecidos dos seres humanos (WALLACE, 1997). “É no azul dos oceanos ue pode estar a última fronteira da vida” HAEFNER, 2003) e representa um recurso rico e ainda largamente inexplorado (BLUNT et al., 2009). Os metabólitos secundários derivados de organismos marinhos tornaram- se atrativos, portanto, por serem estruturalmente complexos com combinações de esqueletos carbônicos pouco comuns e ainda possuírem funcionalidades únicas e potencial atividade biológica) (KOBAYASHI, 1999). A arte pela qual elaboram moléculas bioativas é fascinante devido, em parte ao ambiente marinho, que oferece condições biossintéticas extremas para muitos dos organismos que lá vivem: altas concentrações iônicas, alta pressão, temperaturas variáveis, falta de luz, bem como baixa disponibilidade de nutriente (BHAKUNI & RAWAT, 2005). Portanto, devido às condições nos oceanos serem bastante diferentes daquelas encontradas em Terra, a química produzida por seus habitantes também é bastante variada. Além disso, os organismos marinhos geralmente vivem em associação simbiótica e o caminho de transferência de nutrientes entre o parceiro e o simbionte é de muita importância e levanta questões sobre a verdadeira origem de substâncias produzidas por associação, contribuindo também para a grande diversidade estrutural de metabólitos encontrado nos organismos marinhos (JIMENO et al., 2004). Por exemplo, as altas concentrações de haletos na água do mar, permitem que as espécies que ali vivem incorporem facilmente esses elementos em seus processos de metabolização, sob a forma de ligações covalentes e tomam parte na biossíntese de terpenos, acetogeninas e compostos fenólicos halogenados, o que contribui para o aumento da diversidade e da complexidade estrutural (CABRITA, 2010). Além de constituir defensivos químicos ou venenos irritantes que Introdução ~ 53 ~ permitem assegurar a sobrevivência, exercem ainda papel de mensageiros de um sistema exócrino, provendo vantagem adaptativa aos organismos marinhos. A produção de derivados halogenados por algas marinhas, por exemplo, pode ser explicada por reações envolvendo haloperoxidases vanádio-dependente (OHSAWA et al., 2001). As haloperoxidases catalisam a oxidação de haletos na presença de peróxido de hidrogênio, resultando na halogenação de compostos orgânicos (HAY, 1997). São também numerosas as substâncias sulfatadas isoladas de organismos marinhos que parecem estar envolvidas na transferência de enxofre inorgânico para orgânico, em função das elevadas concentrações de enxofre no mar, principalmente na forma de sulfato. Assim, o grupo sulfato poderia ter o papel químico de estabilizador de grupos hidroxílicos fenólicos e grupos nitrogenados. A sulfatação é também um modo efetivo de tornar determinadas substâncias solúveis em água, favorecendo, assim, sua excreção (HELL & LEUSTEK, 2005). O Brasil possui uma grande biodiversidade marinha que permanece praticamente inexplorada na busca de novos produtos naturais biologicamente ativos (BERLINCK et al., 2004). Considerando que os organismos marinhos têm se mostrado uma das fontes mais promissoras de novos compostos bioativos, o litoral brasileiro representa um grande potencial para a descoberta de novos metabólitos secundários farmacologicamente ativos, úteis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. 1.3. Microrganimos Marinhos como Fonte de Metabólitos Secundários Os microrganismos marinhos tornaram-se uma fonte importante de metabólitos farmacologicamente ativos. Mais especificamente, os fungos da ambiente marinho têm mostrado grande potencial pela diversidade de metabólitos secundários (BUGNI & IRELAND, 2004). Os fungos marinhos são considerados um grupo ecológico e não um grupo taxonômico de fungos e compreendem cerca de 1500 espécies excluindo aqueles que formam os líquens. Eles podem ser agrupados de acordo com sua distribuição Introdução ~ 54 ~ biogeográfica em espécies de clima temperado, tropical, subtropical e cosmopolita (ABDEL-RAHEEM & SHEARER, 2002). Os fungos marinhos obrigatórios crescem e esporulam exclusivamente na água do mar e os facultativos, a partir de ambientes de água doce ou terrestres, são capazes de crescer e, possivelmente, também de esporular no meio marinho, depois de algumas adaptações fisiológicas (RAGHUKUMAR, 2008; RATEB & EBEL, 2011). Em termos práticos, no entanto, é um desafio separar espécies fúngicas marinhas obrigatórias e facultativas de "contaminantes" (espécies terrestres ou de água doce que estão adormecidos nos ambientes marinhos, por exemplo, sob a forma de esporos ou de hifas) (RATEB & EBEL, 2011). O isolamento de um fungo a partir de uma amostra marinha não prova que este fungo está ativo no ambiente marinho. No ambiente terrestre ou marinho os fungos são intermediários ecologicamente importantes em cadeias de energia que flui dos dentritos ao maior nível trófico, desempenhando um importante papel no ciclo da geração de nutrientes como decompositores de matéria orgânica (BUGNI & IRELAND, 2004; PRASANNARAI & SRIDHAR, 2001). Historicamente, o primeiro metabólito secundário isolado a partir de um fungo marinho foi a cefalosporina C (XI), que é produzida por uma cultura de Cephalosporium sp. e foi obtido em 1949. OH OH XI Essa foi uma descoberta acidental e levou mais de 30 anos, até derivados fúngicos marinhos serem analisados de forma mais sistemática. Apenas na década de 90 é que quantidades consideráveis de metabólitos secundários foram descobertas a partir desta fonte, que por muito tempo foi negligenciada (BUGNI & IRELAND, 2004; RATEB & EBEL, 2011). Introdução ~ 55 ~ Os microrganismos marinhos habitam todos os tipos de nichos disponíveis, desde águas geladas a aberturas hidrotermais, florestas de mangue, águas costeiras poluídas e areias da praia, e um nicho ecológico particularmente atraente para muitos microrganismos é a superfície de algas, peixes, esponjas e corais (IMHOFF et al., 2011). Acredita-se inclusive que devido a essa endosimbiose entre microrganismos marinhos e diversos macrorganismos marinhos, que os produtos naturais isolados destes últimos não sejam possivelmente produzidos apenas pelos mesmos, mas por endossimbiose associando ambos (macro e microrganismos) (PIEL et al., 2004; KÖNIG et al, 2006). Por definição, os endossimbiontes são microrganismos capazes de colonizar tecidos vivos de seus hospedeiros, normalmente sem causar prejuízos (BANERJEE, 2011). A relação mútua entre os microrganismos e seus hospedeiros endossimbiontes conduz frequentemente à produção de muitos metabólitos bioativos, incluindo novas substâncias, que podem possuir uma ampla variedade de atividades biológicas (FIRÁKOVÁ et al., 2007). As dificuldades associadas com a coleta de macrorganismos marinhos, bem como a pouquíssima quantidade de substâncias bioativas isoladas motivaram muitos grupos de pesquisas a investigar os microrganismos a eles associados (KÖNIG & WRIGHT, 1996). Além disso, as vantagens na investigação de microrganismos, em comparação com os macrorganismos são óbvias: permitem fermentações biotecnológicas sem exploração ecológica, seus compostos podem ser re-isolados após recultivo em grandes quantidades, o que é quase impossível para macrorganismos marinhos. Adicionalmente, os microrganismos podem ser mais facilmente manipulados geneticamente (KÖNIG & WRIGHT, 1996). Estudos relatam que macrorganismos marinhos, como as esponjas ou algas, são fontes ricas de fungos biologiamente ativos (ZHANG et al, 2009; PAZ et al, 2010; RATEB & EBEL, 2011; WIESE et al, 2011). Fungos marinhos isolados de algas são responsáveis pela produção de uma proporção considerável de 21% dos novos compostos isolados a partir de fungos marinhos seguidos por aqueles obtidos a partir de esponjas (19%) como mostrado na Figura 1 (RATEB & EBEL, 2011). Ao longo do ano de 1992 apenas 15 metabólitos de fungos foram relatados (FENICAL & JENSEN, 1993), enquanto cerca de 270 compostos foram descritos até Introdução ~ 56 ~ 2002 (BUGNI & IRELAND, 2004). Confirmando o expressivo crescimento das pesquisas com fungos marinhos, focando o período de 2006 até meados de 2010, Rateb & Ebel, (2011), apresentaram 690 produtos naturais a partir de fungos isolados de habitats marinhos. Alguns compostos derivados a partir de fungos marinhos estão em ensaios pré-clínicos e/ou clínicos, por exemplo, a plinabulina (XII), o análogo sintético da dicetopiperacina halimida (XIII), isolado do fungo Aspergillus sp. obtido a partir de macroalgas verdes Halimeda copiosa em 1999 (FENICAL et al., 2000), estava em fase II de estudos clínicos como um agente antitumoral de células em estado avançado de câncer (MAYER et al., 2010). O O NH NNH HN XII NH HN N NH O O XIII Os estudos de Rateb & Ebel (2011) demonstraram ainda, que a maioria dos novos compostos (quase 50%) pertence à classe de policetídeos e isoprenóides híbridos, terpenóides (15%), alcaloides (20%) e peptídeos que contribui em 14- 20%. Os policetídeos e os seus isoprenóides híbridos desempenham, portanto um papel dominante nos novos produtos naturais derivados de fungos marinhos e compreendem uma grande família de estruturas diversas e são medicinalmente importantes produtos naturais (RATEB & EBEL, 2011). Introdução ~ 57 ~ Figura 1- Novos compostos derivados de fungos marinhos, até meados de 2010, dividido por fontes de fungos (RATEB & EBEL, 2011). 1.4. Espécies estudadas 1.4.1 Macroalgas O termo algas compreende um agrupamento artificial de organismos (Figura 2) que têm poucas características em comum a não ser o fato de serem predominantemente aquáticos e desprovidos de um tecido constituído de células estéreis envolvendo os órgãos de reprodução e um de um sistema diferenciado para condução de água. Por esta razão são grupos polifiléticos (possui táxons com ancestrais distintos) e não constituem uma classe taxonômica definida, mas sim um amontoado de classes díspares, tão diversas que chegam a ser classificadas em dois ou três reinos diferentes (BHATTACHARYA & MEDLIN, 1998). Elas habitam os oceanos, os corpos de água doces, os solos e até as árvores (VAN DE HOECK, 1995). Introdução ~ 58 ~ Figura 2- A filogenia consenso dos eucariontes (BALDAUF, 2003). As espécies de macroalgas em estudo incluem as espécies Dichotomaria marginata e Padina gymnospora. A espécie Dichotomaria marginata é uma macroalga vermelha que pertence à ordem Nemaliales, classe Florideophyceae e família Galaxauraceae. Em pesquisa feita em banco de dados por meio da ferramenta SciFinder verificou-se poucos estudos químico-farmacológicos para esta espécie, geralmente limitados a estudos taxonômicos para esta alga. Rozas et al. (2008) estudaram a atividade neurotóxica de uma fração polar por meio de ensaios farmacológicos, mas não concluíram quais substâncias eram responsáveis por tal atividade. Sheu et al. (1997) isolaram da fração hexânica e estudaram a atividade citotóxica de esteróides oxigenados do tipo demosterol (24-hidroperoxi-6β-hidroxicolesta-4,25-dien-3-ona, 25- hidroperoxi-6β-hidroxicolesta-4,23(E)-dien-3-ona, 24-hidroperoxicolesta-4,25- diene-3,6-diona e 25-hidroperoxicolesta-4,23(E)-diene-3,6-diona. Liao et al. (2003) relataram que lectinas de D. marginata apresentam forte inibição para a bactéria V. vulnificus, que está associada com patologias como a celulite e septicemia. Ainda do gênero Dichotomaria, Vázquez et al. (2011) estudaram as atividades anti-inflamatória e analgésica de extrato bruto aquoso da alga D. Introdução ~ 59 ~ obtusata e a análise química qualitativa clássica revelou a presença de compostos lactônicos, triterpenos, esteróides, carboidratos, fenóis, taninos e polissacarídeos. As macroalgas pardas do gênero Padina são amplamente distribuídas em todo o trópico e são facilmente reconhecidas (GERALDINO et al., 2005). A espécie P. gymnospora, pertence à ordem Dictyotales, classe Phaeophyta e família Dictyotaceae. Sousa et al. (2007) estudaram a atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados na diminuição de radicais superóxido e inibição da lipoperoxidação em células de fígado de ratos. Enquanto Silva et al. (2005b) caracterizaram parcialmente heterofucanas sulfatadas e avaliaram a atividade anticoagulante de P. gymnospora e Perez-Lorenzo et al. (1998) descreveram que o extrato de P. gymnospora apresentou alto teor de polifenois. Estudos sobre espécies do gênero padina incluem a obtenção de bromofenois de P. arborescens (CHUNG et al., 2003); diterpenos e norditerpenos (xenicanos) citotóxicos de P. pavonia (AWAD et al., 2008); esteróides de P. vickersiaec (COMBAUT et al., 1985); fucanas sulfatadas de P. tetrastromatica (KARMAKAR et al., 2009) e terpenoides halogenados (PARAMESWARAN et al., 1996). 1.4.1.1 Ácidos Graxos das Macroalgas Nos últimos anos, os ácidos graxos das macroalgas marinhas têm despertado interesse entre os pesquisadores (GILL & VALIVETY, 1997; KHOTIMCHENKO et al., 2005; GRESSLER et al., 2010), já que têm se evidenciado nas áreas de biotecnologia, alimentos, cosméticos e farmacêutica, além de serem precursores da biossíntese dos eicosanoides, considerados biorreguladores importantes de muitas processos celulares (KHOTIMCHENKO, 2005). Os ácidos graxos são cadeias de hidrocarbonetos, que terminam em um grupo carboxila. As algas podem produzir ácidos graxos saturados (AGS) ou insaturados se contiverem pelo menos um carbono com ligação dupla de carbono (AGM) e/ou poli-insaturados quando contêm múltiplas ligações duplas (AGPI, do inglês PUFA poli-unsaturated fatty acid). Estes contêm cadeias maiores do que 18 átomos de carbono, sendo essenciais para nutrição humana e devem ser obtidos a Introdução ~ 60 ~ partir de fontes alimentares (VAN GINNEKEN et al., 2011). Em geral os ácidos graxos de algas têm cadeias lineares, número par de átomos de carbono e uma ou mais ligações duplas (SHAMEEL, 1990). Estudos relatam que o perfil de ácidos graxos em macroalgas marinha é específico para determinado subgrupo de espécies (KHOTIMCHENKO et al., 2005; KUMARI et al., 2010), sugerindo seu uso potencial em quimiotaxonomia. A composição de ácidos graxos também varia entre diferentes áreas geográficas e pode-se dizer que o perfil de ácidos graxos varia de acordo com a classe taxonômica, estação, localização e condições de crescimento tanto em macroalgas como em microalgas (TERASAKI et al., 2009; VAN GINNEKEN et al., 2011). Vários autores sugerem que as diferentes atividades biológicas como antimicrobiana (ROSELL & SRIVASTAVA, 1987), antioxidante (HANG & WANG, 2004), anti-inflamatória (CALDER, 2013) e alelopáticas das macroalgas (PULZ & GROSS, 2004; GUEDES et al, 2011) estejam relacionadas com a presença das substâncias como os ácidos graxos insaturados e poli-insaturados (CARDOZO et al., 2007; PEREIRA et al., 2012). 1.4.2 Microrganismos Associados Os fungos isolados das macroalgas foram identificados como Penicillium citrinum e Penicillium chrysogenum. Os fungos do gênero Penicillium pertencem ao filo Ascomycota, à ordem Eurotiales e família Trichomaceae. O filo Ascomycota possui 2000 gêneros, e aproximadamente 30.000 espécies descritas, com grande importância econômica (MOORE-LANDECKER, 1996). Os membros dos gêneros Penicillium e Aspergillus produzem a maior parte dos novos produtos naturais derivados de fungos (RATEB & EBEL, 2011). O gênero Penicillium é dividido em quatro subgêneros: Penicillium, Furcatum, Biverticillium e Aspergilloides. Estes fungos são amplamente estudados em vários ramos da ciência tendo ênfase na toxicologia, alimentícia e farmacêutica. Entre eles, o subgênero Penicillium tem sido muito mais estudado do que os outros Introdução ~ 61 ~ três (AMAGATA et al., 1998; BUGNI et al., 2003), representa então uma promissora fonte na produção de metabólitos. Os fungos do gênero de Penicillium são filamentosos e de crescimento rápido, suas colônias podem ter aspecto algodonoso ou pulverulento. São constituídos por estruturas multicelulares, em forma de tubo, denominadas hifas. As hifas são septadas, e ao conjunto de hifas dá- se o nome de micélio como mostrado na Figura 3. Figura 3- Crescimento das colônias a 25 °C e morfologia do fungo do gênero Penicillium (HOUBRAKEN et al., 2010). Introdução ~ 62 ~ Diversos metabólitos secundários bioativos, do gênero Penicillium, que vão desde policetídeos macrocíclicos a diterpenos indólicos são relatados na literatura (STIERLE et al., 2000; CLARK et al. 2006a; RUKACHAISIRIKUL et al., 2007; ZHU, et al. 2009). Fazendo uma busca no banco de dados Marinlit®2011 com o gênero “Penicillium” 1794 hits são apresentados. A seguir são apresentados alguns exemplos que citam as diversas classes de metabólitos isolados de algumas espécies de fungos do gênero Penicillium (Figura 4). Em 1993 Stierle et al. (2000) relataram que o fungo endofítico do gênero de Penicillium também sintetiza o taxol (importante agente quimioterápico) e por um processo biossintético diferente do que já tinha sido descrito para as plantas do gênero de Taxus. Em meados de 2000, o metabólito coruscol A foi isolado de uma espécie de Penicillium sp do molusco Mytilus coruscus (KAGATA et al., 2000). A compactina, potente inibidor na biossíntese do colesterol (ENDO et al., 1976); os ácidos tanzawaicos E e F isolados de P. steckii (MALMSTROM et al., 2000). Vários outros metabólitos tem sido descritos para espécies do gênero Penicillium incluindo os alcaloides paraherquamidas H e I, isolados de P. cluniae, com atividade inseticida e pironas, que exibem um largo espectro de atividades que incluem antibióticos, antifúngicos, citotóxicos, neurotóxicos e fitotóxicos (LÓPEZ-GRESA et al., 2006; GUIMARÃES et al., 2008), brevicompanina A isolada de P. brevicompactum e ativa contra o parasita causador da malária (DU et al., 2009). Alguns derivados do ácido tetrâmico, que possuem atividades antivirais e antibióticas, também foram isolados, além da mevastatina isolada do Penicillium citrinum, que é um potente agente redutor de colesterol (BUTLER, 2004; LIN et al., 2008b); ciclopiamina A de P. cyclopium; dihidroaustina de P. brasilianum (SCHÜRMANN et al., 2010) entre as quinocitrininas (KOZLOVSKIĬ et al., 2005), quinolactacinas (KIM et al., 2001), quinolactacida (ABE et al., 2005), perinadina A de P. citrinum (SASAKI et al. 2005), ciclocitrinols (AMAGATA et al., 2003). Introdução ~ 63 ~ Figura 4- Alguns metabólitos derivados de fungos do gênero Penicillium O O HO HO H NH OO O O O O OO O OH O O OH HO H O OHO HO H O OH OHH H O O HO OH H H taxol ácido tanzawaico E ácido tanzawaico F compactina coruscol A N N+ N O -O O O O H H N N H NH O O H HH brevicompanina A ciclopiamina A O O O O O O O O O dehidroaustina N O O O O O HO OH H H H perinadina A O OO HO actinopirona C Objetivo ~ 64 ~ OBJETIVO O objetivo da presente tese foi investigar, isolar e caracterizar produtos naturais derivados dos organismos marinhos (macroalgas) Dichotomaria marginata e Padina gymnospora e dos microrganismos associados, visando contribuir com o conhecimento químico e biológico destas espécies. Objetivos específicos: 1. Isolar e caracterizar metabólitos secundários dos microrganimos associados P. citrinum obtido da macroalga D. marginata, P. chrysogenum obtido da P. gymnospora; 2. Avaliar potencial atividade biológica (anti-inflamatória, antioxidante e inibição enzimática) dos metabólicos secundários isolados das espécies em estudo; 3. Identificar os ácidos graxos majoritários da fração de baixa polaridade (fração hexânica) das macroalgas e fungos associados em estudo, através de índice de retenção e comparação com padrões usando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Materiais e Métodos ~ 65 ~ MATERIAIS E MÉTODOS Materiais e Métodos ~ 66 ~ 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 MATERIAIS 3.1.1 Macroalgas e Microrganismos Associados As macroalgas D. marginata (Dm) e P. gymnospora (Pg) foram coletadas no Litoral Paulista e os microrganismos associados P. citrinum (isolado da Dm) e P. chrysogenum (isolado da Pg) foram investigados nesse estudo (Figura 5). Figura 5- Espécies de macroalga D. marginata (vermelha) e P. gymnospora (parda) (Fotos do arquivo pessoal). 3.1.2 Solventes gerais e equipamentos básicos Foram utilizados solventes padrões analíticos (PA) das marcas Synth, Dinâmica, Vetec, Merck, Ecibra: Diclorometano (DCM), clorofórmio, metanol (MeOH), etanol, acetato de etila, n-hexano, sec-butanol, acetonitrila (MeCN). Estes solventes foram usados para extração, fracionamento e obtenção de perfil por cromatografia em camada delgada (CCD). Os extratos e frações foram concentrados em evaporador rotatório da Buchi R-114, sob pressão reduzida com auxílio de bombas de vácuo D. marginata P. gymnospora Materiais e Métodos ~ 67 ~ FABBE; Autoclave vertical Quimis Aparelhos Científicos Ltda; Câmara de Fluxo laminar vertical – Panchane; Incubadora otatória “ haker”) arconi. Foi utilizado no auxílio à dissolução dos extratos e frações um equipamento de ultrassom modelo Unique, sendo as massas medidas em balança Kern 410 e Digimed KN5000L, ambas da Marconi. Para as separações cromatográficas em coluna aberta foram utilizadas as seguintes fases estacionárias: Sílica gel (SiO2), para cromatografia de baixa pressão (0,035 – 0,070 mm, diâmetro de poro 6 nm) ACROS Organics; Sephadex LH-20 Sigma-Aldrich, colunas flash Biotage Charlottesville, USA (Si 40M & C- 18 HS 40M) e para cromatografia em camada delgada foram utilizadas as seguintes fases estacionárias: placas comerciais de sílica gel 60 com indicador de fluorescência (UV254) 0,20 mm de espessura; e placas comerciais C18. Para isolamento e crescimento dos microrganismos foram utilizados os meios sólidos: Arroz parboilizado (Marcon®) e BDA (Batata Dextrose Agar-Sigma®). 3.2 INSTRUMENTOS E TÉCNICAS 3.2.1Cromatografia líquida: Os cromatógrafos utilizados foram: (a) Analítico e preparativo sistema binário Shimadzu LC-10AD, com auto injetor Shimadzu SIL-10A e detector UV-Diodo Array; (Laboratório- NuBBE - Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia); (b) Semipreparativo Agilent HP 1090M, sistema binário equidado com detector UV- Diodo Array (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) (Marine Biodiscovery Centre- University of Aberdeen- Scoltland-UK); (c) Cromatógrafo Líquido acoplado ao espectrômetro de massas (CLAE-PDA/EM- IES) Thermo Instruments MS system (LTQ XL/ LTQ Orbitrap Discovery acoplado a sistema de CLAE, binário-Thermo Fisher Scientific, detector PDA, injetor automático. As análises foram realizadas com voltagem do capilar 45V, Materiais e Métodos ~ 68 ~ temperatura do capilar 260°C, gás de arraste (N2), fluxo 10-20 (unidades arbitrárias). O software Xcalibur (Thermo Scientific®) foi utilizado durante a aquisição e processamento dos dados espectrométricos (Marine Biodiscovery Centre; University of Aberdeen- Scoltland-UK). Um sistema padrão de análise foi utilizado: Preparou-se uma solução de 1 mg/mL em metanol 95% de cada fração em estudo (macroalgas e microrganismos), seguido de filtração em membrana de teflon (0,20 ou 0,45 µm), realizou-se a análise em CLAE-PDA-EM usando C18 Sunfire 150 x 4,6 mm (Waters), sistemas de solventes A (água com 0,1% ácido fórmico) e B (metanol com 0,1% ácido fórmico), com a seguinte programação: 0-25 min: 0-100% B 25-30 min: 100% B Foi usado fluxo de 1 mL/min e volume de injeção de 20 μL, detecção por UV 200-600 nm. Os espectros EM-IES bem como IES/EM/IES foram extraídos no modo positivo e negativo e faixa de m/z 100 a 2000. Para análises via CLAE foram usados solventes J. T. Baker (acetonitrila, metanol) e água ultra pura (18 M) obtida no sistema Milli-Q Plus. Foram utilizadas colunas Phenomenex Gemini C18 analítica (250 mm x 4,60 mm, 5 μm), Jupiter C4, 300A (250 mm x 10 mm, 10 μm), SunFire C18 (250 mm X 10 mm, 10 μm). O clean-up das amostras para injeção em CLAE foi realizado em cartucho preenchido com sílica de fase reversa (C18), seguido de filtração em membrana de teflon (0,20 ou 0,45 µm) e as soluções das amostras foram acondicionadas em vials de 2,0 mL. (d) Sistema cromatográfico Biotage Flash 65i (colunas: KP-SIL, 40 x 7,5 mm e KP- C18-HSTM, 40 x 15 cm) (Marine Biodiscovery Centre; University of Aberdeen- Scoltland-UK). 3.2.2 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) Os espectros de RMN foram obtidos em espectrômetro Bruker Avance DRX-500 e Varian Inova, operando a 500 MHz e 400 MHz na frequência de 1H e 13C e os solventes utilizados na dissolução das amostras para obtenção dos espectros foram D2O (Acros- Materiais e Métodos ~ 69 ~ organics) e CD3OD (CIL e Isotec-INC), CDCl3, DMSO-d6 (CIL e Isotec-INC), sendo utilizado TMS ou o solvente residual não deuterado como referência interna. 3.2.3 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM) Foi utilizado cromatógrafo a gás Shimadzu QP – 5000, com injetor automático 5000, e coluna capilar SPB – 5 (5% fenil polimetil siloxano) Supelco de 30 m x 0,25 mm x 0,1 m acoplado ao espectrômetro de massas quadrupolar, faixa de massas: 50 a 500 daltons, e base de dados NIST 62™ Library. 3.3 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DAS MACROALGAS: Dichotomaria marginata, DADina gymnospora A coleta das espécies foi realizada por mim em costa rochosas em dezembro de 2009 na região norte do estado de São Paulo no Costão Direito da praia da Fortaleza, no município de Ubatuba (23º24´93´´S e 45º03´41´´W), (Figura 6), durante período de maré baixa. Imediatamente após a coleta, as macroalgas foram identificadas pela Drª Nair Yokoga do Instituto de Botânica Secretária do Meio Ambiente do Estado de São Paulo e as exsicatas encontram-se depositadas no Herbário do Instituto de Botânica- São Paulo (Dichotomaria marginata - SP 40126, Padina gymnospora - SP 400960). Materiais e Métodos ~ 70 ~ Figura 6- Localização geográfica do ponto de coleta: Costão Direito da Praia da Fortaleza- UBATUBA-SP (23º24´93´´S e 45º03´41´´W) (Fotos do arquivo pessoal e Google Earth). Após a coleta, as macroalgas foram triadas para remoção de sedimentos e organismos associados, sendo posteriormente acondicionadas em sacos plásticos e transportadas para o laboratório NuBBe de Produtos Naturais do Instituto de Química- UNESP e armazenadas sob refrigeração até o momento da preparação dos extratos. Materiais e Métodos ~ 71 ~ 3.3.1 Obtenção do Extrato Bruto e Fases de Partição das Macroalgas O mesmo procedimento básico de extração foi aplicado às duas espécies em estudo (D. marginata e P. gymnospora). As macroalgas foram lavadas rapidamente com água destilada para ajudar a remover areia, sal e outras impurezas. Depois foram trituradas em almofariz, na presença de nitrogênio líquido e submetidas à extração com metanol a 100% (3 x com pelo menos, 24 h, em cada caso), seguido por extração com 100% de DCM (3 x com pelo menos, 24 h, em cada caso). Após cada extração, o extrato obtido foi filtrado em papel de filtro, concentrado em rotaevaporador sob pressão reduzida (em temperatura inferior à 40 °C), obtendo-se assim os extratos brutos em metanol e diclorometano). Para fracionamento dos extratos utilizou-se uma modificação da metodologia descrita por Kupchan (HOUSSEN & JASPARS, 2005). Os extratos brutos MeOH e DCM (extrato orgânico) foram combinados e submetidos a partição entre água e DCM. Em seguida a fase orgânica foi evaporada e o extrato resultante foi dissolvido em MeOH:H2O (90:10) e submetido a partição com n-hexano. A fração hidrometanólica restante foi ajustada até MeOH 50% aquoso e submetida a partição com DCM, obtendo- se as frações hidrometanólicas e em diclorometano. A fase aquosa foi submetida a partição com igual volume de sec-BuOH, obtendo-se assim as frações em sec-butanol e aquosa. O esquema modificado por Kupchan está mais claramente demostrado na Figura 7 e os rendimentos dos extratos e frações estão mostrados na Tabela 1. Tabela 1- Rendimentos do fracionamento dos extratos das macroalgas. Macroalga Peso fresco FH2O FBuOH FH FDCM FM D.marginata 2097 g 21,60 g 2,55 g 2,97 g 0,87 g 10,11 g P. gymnospora 627 g 8,65 g 1,43 g 2,78 g 0,57 g 1,99 g Materiais e Métodos ~ 72 ~ Figura 7- Esquema de fracionamento dos extratos das macroalgas em estudo. 3.3.2 Isolamento e Identificação dos Microrganismos Associados às Macroalgas O isolamento dos organismos associados foi realizado pela aluna de doutorado Vanessa Chapla no NuBBE-IQ-UNESP. Para isso, tecidos jovens e saudáveis coletados das espécies de macroalgas foram sobmetidos a processo de esterilização segundo MAIER et al., (1997). Em seguida os tecidos foram cortados e incubados em placas de Petri contendo BDA e antibiótico clorafenicol (1 mg/mL), para evitar o crescimento bacteriano. Repiques utilizando outras placas de Petri contendo BDA foram realizados sucessivamente e resultaram na obtenção de três linhagens puras, as quais estão sendo preservadas em frascos com água esterilizada (SILVA, 2005a), conforme pode ser visualizado na Figura 8. MAIS POLAR 1. Evaporação do solvente. 2. Suspensão com MeOH/H2O. 3. Extração com hexano. EXTRATO ORGÂNICO Partição com sec-butanol 1. Suspensão em H2O 2. Extração com DCM Fase Aquosa Fase Orgânica Ajuste MeOH:H2O para 50:50. Extração com DCM . Hexano DCM MeOH:H2O sec - BuOH H 2 O MENOS POLAR Materiais e Métodos ~ 73 ~ Figura 8-Procedimento para isolamento e crescimento por 21 dias dos microrganismos obtidos das macroalgas P. gymnospora e D. marginata. As linhagens dos microrganismos estão depositadas na micoteca do NuBBE, Departamento de Química Orgânica-IQ-Ar-SP. O microrganismo codificado como Dm1 foi classificado como Penicillium citrinum, pela empresa Genotyping Biotecnologia Ltda, (Botucatu, SP) e o Pg1 foi identificado como Penicillium chrysogenum pela profª Drª nil azak da Ondokuz ayıs UniversitI Fen debiyat FakultI iyoloji olumu Kurupelit/Samsun Turkey. Os microrganismos foram identificados a partir de extração de DNA seguido de sequenciamento. 3.3.3 Obtenção do Extrato Bruto e Fracionamento da Cultura de Microrganismos As linhagens dos microrganismos isolados Penicillium citrinum e Penicillium chrysogenum foram repicadas para placas de Petri em PDA, e posteriormente Materiais e Métodos ~ 74 ~ Solubilização em AcOEt EXTRATO BRUTO Fase Orgânica FMeCN FHexano Partição com Hexano Partição com H2O Fase Aquosa Solubilização com MeCN FMeCN FHexano Partição com Hexano Partição com H2O Fase Aquosa Solubilização com MeCN inoculados. Cada linhagem foi distribuída em seis frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo cada um 90 g de arroz parboilizado e 75 mL de água destilada, por 21 dias (Figura 8) Após este período, as culturas foram trituradas e extraídas com AcOEt (7 x 350 mL). O solvente foi evaporado em rotaevaporador fornecendo 10 g e 36 g respectivamente, de cada extrato bruto. Os extratos brutos foram re-solubilizados em AcOEt e submetidos a partição com água Milli-Q. A fase em AcOEt foi rota-evaporada e re-solubilizada em MeCN e submetida a partição com hexano (Figura 9). Figura 9- Esquema de partição do extrato bruto para os microrganismos P. citrinum e P. chrysogenum. Os solventes orgânicos foram eliminados utilizando evaporador rotatório, fornecendo os respectivos extratos brutos. Os solventes recuperados foram adequadamente descartados em frascos previamente rotulados e encaminhados à recuperação ou descarte conforme Normas Gerais de Gerenciamento de Resíduos Químicos do IQ/UNESP presente no site www.iq.unesp.br/APOIO-TECNICO/normas- rIESduos.pdf. Materiais e Métodos ~ 75 ~ Os rendimentos obtidos para cada fração estão descritos na Tabela 2. Tabela 2- Rendimento dos extratos brutos e frações obtidas dos microrganismos em estudo. 3.3.4 Screening das Frações Obtidas dos Extratos de Macroalgas D. marginata, P. gymnospora e Microrganismos Associados P. citrinum e P. chrysogenum Todas as frações obtidas a partir das macroalgas e a fração MeCN dos microrganismos foram submetidas ao screening por CLAE-DAD-EM/IES, pois considerando a polaridade de cada fração em estudo, foi possível verificar a adequação desta técnica cromatográfica ao trabalho experimental, visando a avaliação preliminar da natureza química das substâncias presentes. Os dados espectrais coletados foram analisados em programa Therm Xcalibur 2.2 buscando o pico da molécula protonada/íon base e padrões de fragmentação, e comparados com informações dos bancos de dados ChemFinder®, Antimarin® e Marinlit®. No screening por RMN 1H, cerca de 10 mg de cada fração em estudo foi dissolvida em 600 μL de solvente deuterado, considerando a polaridade de cada fração, e em seguida, realizada a análise de RMN 1H. Esta análise inicial forneceu indicação sobre a natureza química dos hidrogênios presentes nos metabólitos produzidos por cada macroalga e seu microrganismo associado. Microrganismos Extrato bruto FA FH FMECN P. citrinum 10 g 1,51g 2,4 g 5,3 g P. chrysogenum 36 g 31 g 1,6g 1,3 g Materiais e Métodos ~ 76 ~ 3.4 ESTUDO QUÍMICO 3.4.1 Identificação de Ácidos Graxos nas Macroalgas e nos Microrganismos Associados por CG-EM Uma alíquota de 1 mg da fração hexânica das macroalgas D. marginata, P. gymnospora e do extrato hexânico dos microrganismos associados P. citrinum e P. c. foi submetida a reação de derivatização. Para isso 80 μL de reagente N-metil-N- trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) foi adicionado a cada amostra, mantida por 30 min. a 37 °C. Após esse período, cada amostra foi analisada em triplicata por CG-EM. A reação de derivatização com MSTFA é também chamada de sililação por acrescentar um grupo trimetilsilil ao composto em análise tornando o composto menos po