ANA JÚLIA BORIM DE SOUZA 

 

 

 

 

 

 

INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DA DISPONIBILIDADE 

HÍDRICA EM PARÂMENTROS FOTOSSINTÉTICOS E NO 

METABOLISMO ESPECIALIZADO DE “PATA-DE-VACA” 

Bauhinia ungulata NA ERA DAS MUDANÇAS CLIMÁTICAS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bauru, SP 

2020 

 

 



2 
 

 
 

ANA JÚLIA BORIM DE SOUZA 

 

 

 

 

 

 

INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DA DISPONIBILIDADE 

HÍDRICA EM PARÂMENTROS FOTOSSINTÉTICOS E NO 

METABOLISMO ESPECIALIZADO DE “PATA-DE-VACA” 

Bauhinia ungulata NA ERA DAS MUDANÇAS CLIMÁTICAS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bauru, SP 

2020 

 

Dissertação apresentada à Universidade Estadual 
Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências, Bauru, para a 
obtenção do título de Mestre em Biociências (Área do 
Conhecimento: Aplicação da Diversidade Biológica). 

 

Orientador: Dr Luiz Leonardo Saldanha 

Co-Orientadora: Dr ª Anne Lígia Dokkedal 

 

 

  
 



3 
 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

De Souza, Ana Júlia Borim. 

   Investigação dos efeitos da disponibilidade hídrica 

em parâmetros fotossintéticos e no metabolismo 

especializado de “pata-de-vaca” Bauhinia ungulata na 

era das mudanças climáticas / Ana Júlia Borim de 

Souza, 2020 

   90 f.: il.  

 

   Orientador: Luiz Leonardo Saldanha 

    

   Dissertação (Mestrado)–Universidade Estadual 

Paulista. Faculdade de Ciências, Bauru, 2020 

 

1. Flavonoides. 2. Metabolômica. 3. Padronização. 

4. Planta Medicinal. I. Universidade Estadual 

Paulista. Faculdade de Ciências. II. Título.  

 

    

 

  

 

 

 



4 
 

 
 

 

 

 

 

 

 



5 
 

 
 

Agradecimentos 

Ao Prof. Dr. Luiz Leonardo Saldanha, mais do que pela orientação, por se 

esforçar ao máximo para se fazer presente durante todo o meu mestrado, 

mesmo que a milhares de quilômetros de distância, por acreditar em mim e ter 

me ensinado tanto sobre algo completamente novo para mim. Tenho o maior 

carinho, respeito e admiração. 

À Profª Dra. Anne L. Dokkedal, que me aceitou em seu laboratório e grupo 

de pesquisa, e contribuiu diversas vezes na elaboração e execução desse 

trabalho. 

À Profª Dra. Inês Cechin, que me concedeu o uso da estufa agrícola, e 

independente de chuva ou sol, me acompanhou durante a realização de todo o 

experimento. 

Ao Dr. Luiz Alberto Colnago, e à Dra. Fernanda M. M. Ocampos que me 

auxiliaram e possibilitaram realizar as análises de RMN. E principalmente à 

Fernanda, que me ensinou muito, e se tornou uma grande inspiração para mim. 

Ao Jardim Botânico Municipal de Bauru, por me cederem as sementes e 

mudas de Bauhinia para possibilitar a execução desse trabalho. 

Aos colegas de laboratório, Fernanda, Beatriz, Matheus e Júlia pela 

constante colaboração, e por tornarem nossos dias de trabalho mais alegres. 

Ao Rafael Catoia, que me ajudou muito nas análises estatísticas, e pela 

paciência com as minhas constantes mudanças de opinião sobre a execução 

dos testes. 

Aos meus pais Júlio e Ana Paula, que me incentivam a correr atrás dos 

meus sonhos, independentemente de qualquer dificuldade, apoiam minhas 

decisões e me servem de exemplo. Eu amo muito vocês. 

A minha vó Ivone, que me recebia todos os dias em sua casa com muito 

amor e carinho. 

Ao André, que renunciou à minha presença diversas vezes, e me incentiva 

a seguir esse caminho que eu escolhi.  

 

 



6 
 

 
 

DE SOUZA, Ana Júlia Borim. Investigação dos efeitos da disponibilidade hídrica 
em parâmetros fotossintéticos e no metabolismo especializado de “pata-de-
vaca” Bauhinia ungulata na era das mudanças climáticas. 2020. 90 f. Dissertação 
(Mestrado Acadêmico em Biociências, Faculdade de Ciências, Bauru, 2020. 

Resumo 

Bauhinia ungulata L. (Fabaceae) é utilizada na medicina tradicional para o 
tratamento de diabetes, pela presença de flavonoides com potencial 
hipoglicemiante e esses metabólitos estão envolvidos na sobrevivência das 
plantas.  Períodos de seca são limitantes da fotossíntese e interferem no 
metabolismo da planta, o que é preocupante dado à previsão de mudanças 
climáticas, e devem ser analisados sob o ponto de vista agronômico para garantir 
material vegetal com qualidade para produção de fármacos. Visando avaliar os 
impactos da variação da disponibilidade hídrica em plantas medicinais, este 
trabalho teve como objetivo avaliar parâmetros fotossintéticos e o metabolismo 
especializado de espécimes de B. ungulata submetidos a três diferentes 
períodos de irrigação: diária (Controle), com interrupções por sete dias (7D) e 
por quinze dias (15D) durante 90 dias. Amostras de folhas foram congeladas, 
liofilizadas e submetidas a extração com MeOH 70% em ultrassom. Numa 
primeira etapa foi realizada análise fitoquímica do extrato por RMN 1D e 2D e 
por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrômetro de massas 
de alta resolução (UHPLC-HRMS). A anotação dos compostos foi realizada por 
comparação de espectros disponíveis na plataforma Global Natural Products 
Social (GNPS) e organizados em uma rede de moléculas. Variações no 
metabolismo especializado foram investigadas por meio de análises em 
espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com abordagem 
metabolômica seguida de análise multivariada. Parâmetros fotossintéticos foram 
investigados in planta através da mensuração de trocas gasosas por meio de um 
analisador de gás infra-vermelho (IRGA). O estudo fitoquímico possibilitou a 
identificação de treze flavonoides derivados de quercetina, canferol, miricetina, 
isorhamnetina e datiscetina, além de 4,4’-dihidroxibibenzil e prolina. A análise 
dos parâmetros fotossintéticos mostrou que a variação da disponibilidade hídrica 
reduziu a condutância estomática, fotossíntese e transpiração nos grupos 7D e 
15D em comparação com o grupo controle (p>0.05). A partir da análise 
multivariada, foi possível observar alterações nos espectros de RMN de 1H na 
região dos sinais 6 a 7 ppm, e na região 1,80-3,9 ppm atribuída à prolina, um 
aminoácido responsável por conferir proteção osmorreguladora em resposta a 
situações de seca severa. Esse aminoácido foi correlacionado positivamente ao 
grupo 15D, diferentemente dos sinais da região dos compostos fenólicos. Esses 
resultados mostram que a diminuição da disponibilidade hídrica induziu 
alterações nos parâmetros fotossintéticos, que reduzem a produção de matéria 
verde e compostos fenólicos de interesse medicinal em B. ungulata. Essas 
alterações têm impactos negativos tanto no fornecimento de material para 
produção de fármacos, quanto para a sua sobrevivência em condições previstas 
nos cenários das mudanças climáticas, que preveem maiores períodos de seca 
num futuro próximo. Entretanto, do ponto de vista agronômico, os resultados 
indicam que apenas uma irrigação por semana, por até 60 dias, não ocorre 
alterações significativas no acúmulo de biomassa e substâncias relevantes no 
ponto de vista medicinal. 

Palavras-chave:  Flavonoides; Metabolômica; Padronização; Planta Medicinal. 

 



7 
 

 
 

DE SOUZA, Ana Júlia Borim. Literature on screen: Investigation of the effects 
of water availability on photosynthetic parameters and on the specialized 
metabolismo of “pata-de-vaca” Bauhinia ungulata under the climate changes. 
2020. 90 p. Dissertation (Masters in bioscience). São Paulo State University 
(UNESP), School of Sciences, Bauru, 2020. 

Abstract 

Bauhinia ungulata L. (Fabaceae) is used in traditional medicine for the treatment 
of diabetes, due to the presence of flavonoids with hypoglycemic potential. Dry 
periods are limiting photosynthesis and interfere with plant metabolism, which is 
worrisome given the prediction of climate change, and should be analyzed from 
an agronomic point of view to ensure plant material with quality for the drugs 
production. In order to evaluate the impacts of the variation in water availability in 
medicinal plants, this study aimed to evaluate photosynthetic parameters and 
specialized metabolism of B. ungulata specimens submitted to three different 
periods of irrigation: daily (Control), with interruptions for seven days (7D) and for 
fifteen days (15D) for 90 days. Leaf samples were frozen, freeze-dried and 
extracted with 70% MeOH on ultrasound. In a first step, phytochemical analysis 
of the extract was performed by 1D and 2D NMR and by ultra efficiency liquid 
chromatography coupled to a high resolution mass spectrometer (UHPLC-
HRMS). A molecular network (MN) was generated using the Global Natural 
Products Social Platform (GNPS) workflow. Compounds in the MN were 
annotated against the GNPS spectral database in level 2. Variations in 
specialized metabolism were investigated by nuclear magnetic resonance (NMR) 
spectrometer analyses with metabolomic approach followed by multivariate 
analysis. Photosynthetic parameters were investigated in planta by measuring 
gas exchange by means of an infra-red gas analyzer (IRGA). The phytochemical 
study allowed the identification of thirteen flavonoids derived from quercetin, 
canferol, myricetin, isorhamnetin and datiscetin, in addition to 4,4'-
dihydroxybibenzand and proline. The analysis of photosynthetic parameters 
showed that the variation in water availability reduced stomatal conductance, 
photosynthesis and transpiration in the 7D and 15D groups compared to the 
control group (p>0.05). From the multivariate analysis, it was possible to observe 
changes in the 1H NMR spectra in the region of signals 6 to 7 ppm, and in the 
region 1.80-3.9 ppm attributed to proline, an amino acid responsible for conferring 
osmorregulatory protection in response to drought situations. This amino acid 
was positively correlated to the 15D group, differently from the signals of the 
phenolic compounds region. These results show that the decrease in water 
availability induced changes in photosynthetic parameters, which reduce the 
production of green matter and phenolic compounds of medicinal interest in B. 
ungulata. These changes have negative impacts on the supply of material for 
drug production and on plant survival under conditions predicted in climate 
change scenarios, which predict longer periods of drought in the near future. 
From the agronomic point of view, our results indicate that only one irrigation per 
week, for up to 60 days, dont cause significant changes in the accumulation of 
biomass and substances relevant from the medicinal point of view.  

Keywords: Flavonoids; Medicinal Plant; Metabolomics; Standardization. 

 

 

 



8 
 

 
 

Sumário 

 

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 8 

1.1 BAUHINIA UNGULATA L. ............................................................................................................ 11 
1.2. FLAVONOIDES ................................................................................................................................. 15 
1.3. MUDANÇAS CLIMÁTICAS ................................................................................................................. 16 
1.4 EFEITOS DO DÉFICIT HÍDRICO .......................................................................................................... 17 
1.5   ANÁLISE FITOQUÍMICA COM ABORDAGEM METABOLÔMICA ........................................................... 20 
1.6. PRODUÇÃO AGRONÔMICA DE PLANTAS MEDICINAIS ...................................................................... 22 

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................................... 25 

3 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 28 

3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................... 28 

4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 29 

4.1. PROPAGAÇÃO E OBTENÇÃO DAS MUDAS DE BAUHINIA UNGULATA ............................................... 29 
4.2. ACLIMATAÇÃO DAS PLANTAS EM ESTUFA AGRÍCOLA ..................................................................... 30 
4.3. DESENHO EXPERIMENTAL PARA ESTUDO DE DISPONIBILIDADE HÍDRICA ....................................... 31 
4.4. ANÁLISES DE PRODUÇÃO DE BIOMASSA, CONDUTÂNCIA ESTOMÁTICA E DE TROCAS GASOSAS ... 31 
4.5. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ............................................................................................................ 32 
4.6 ANÁLISE DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR ........................................................................ 32 
4.7 ANÁLISE UHPLC-ESI-HRMS ........................................................................................................ 33 
4.8 PROCESSAMENTO DE DADOS OBTIDOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA-EFICÊNCIA 

ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS (UHPLC-HRMS) ........................................................... 34 
4.9 ANÁLISE DE REDES DE MOLÉCULAS ............................................................................................... 35 
4.10. ANÁLISES ESTATÍSTICAS .............................................................................................................. 35 

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 36 

5.1. ANÁLISE FITOQUÍMICA DO EXTRATO DE BAUHINIA UNGULATA ....................................................... 37 
5.1.1.  Identificação de metabólitos majoritários por RMN ....................................................... 38 
5.1.2. Análise do extrato por UHPLC-HRMS e desreplicação por rede de moléculas ......... 57 

5.2. ANÁLISE DOS EFEITOS INDUZIDOS PELA VARIAÇÃO DA DISPONIBILIDADE HÍDRICA ....................... 62 
5.2.1. Análise dos parâmetros fotossintéticos ............................................................................ 62 
5.2.2. Estudo de metabolômica por RMN ................................................................................... 70 

5.3 APLICAÇÃO AGRONÔMICA ............................................................................................................... 73 
5.4 MUDANÇAS CLIMÁTICAS .................................................................................................................. 74 

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 76 

7. REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 78 

 

 



8 
 

 
 

1. INTRODUÇÃO  
 

Uma vez que o Brasil detém extensa e diversificada flora, concebendo 

aproximadamente um terço da biodiversidade do mundo, é interessante estudos 

fitoquímicos para exploração do ambiente e a descoberta de novos produtos 

naturais ativos (YUNES; PEDROSA; CECHINEL FILHO, 2001). A partir disso, 

há possibilidade de somar para o crescimento do país, uma vez que gera 

conhecimentos botânicos e químicos, e de matérias prima naturais e 

comercializáveis (BRAZ FILHO, 2010). 

A utilização de plantas como forma de tratamento contra inúmeras 

doenças vem ganhando cada vez mais espaço no mercado mundial, em que os 

fitoterápicos movimentam, aproximadamente, 60 bilhões de dólares anualmente 

(HAWKINS, 2008), com uma taxa de aumento de 15% ao ano no Brasil (CATI, 

2017). Esta é também, a forma mais antiga utilizada para prevenções e curas de 

doenças, inicialmente na forma de chás e de emplastros. E com o avanço obtido 

ao longo dos anos, extratos vegetais têm o uso como matéria-prima, a fim de 

obter compostos ativos para o desenvolvimento racional de medicamentos ou de 

fitoterápicos em sua forma bruta ou fracionada (YUNES; PEDROSA; CECHINEL 

FILHO, 2001; NEWMAN; CRAGG, 2016).  

  O espaço crescente adquirido pelos fitoterápicos pode ser explicado pela 

revalorização dos medicamentos naturais, uma vez que grande parte da 

população os consome por acreditar que são mais baratos, menos tóxicos, além 

de promoverem baixas ou nenhuma dependência no uso (CRAGG; NEWMAN; 

SNADER, 1997).  Em alguns países industrializados, como Canadá, França, 

Itália e Alemanha, o uso de produtos da medicina natural atende de 70 a 90% de 

sua população, que opta por essa forma de tratamento sobre a denominação de 

complementar, alternativa ou não convencional (WHO, 2011). Essa tendência é 

explicada pela busca de opções naturais e adoção de estilos de vida saudáveis 

para prevenir e remediar doenças (BRASIL, 2012).  

E essa revalorização por plantas medicinais levou grandes companhias 

farmacêuticas a investirem em pesquisas que viabilizem o uso de extratos de 

plantas, uma vez que os compostos em mistura apresentam ação sinérgica e, 



9 
 

 
 

portanto, vantagens comparadas a uma substância pura, como por exemplo, a 

redução de efeitos colaterais (HOSTETTMAN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003).  

 A Organização Mundial da Saúde OMS (1998), define planta medicinal 

como sendo todos os vegetais que apresentarem, em um ou mais órgãos, 

substâncias com fins terapêuticos, ou percursores de fármacos semissintéticos. 

Sua transformação em fitoterápico ocorre a partir de estudos multidisciplinares, 

validação e padronização, e esse processo conta com pesquisas étnica, 

botânica, química e farmacológica (PEREIRA; CARDOSO, 2012). 

Comunidades tradicionais desempenham importante função para a 

etnofarmacologia, ao transmitir por séculos a tradição do consumo de plantas 

como forma de remediar ou prevenir doenças. Esses conhecimentos estimulam 

pesquisadores a iniciar suas investigações sobre o potencial medicinal e como 

garantir se há ou não uso seguro e eficaz dessas plantas (GOTTLIER; BORIN, 

2003; BALBINO; DIAS, 2010).  

Na América do Sul, espécies de Bauhinia L. são exemplos de plantas 

utilizadas na medicina popular. Povos indígenas utilizavam chás de suas folhas 

como forma de remédios para diabetes, dores, inflamações ou infecções 

microbianas (GUPTA, 1995; CAVALCANTI; FAVORETO; LINK, 2005; MALI et 

al., 2007; CECHINEL FILHO, 2009). Porém, são poucas as espécies de plantas 

desse gênero que foram estudadas fitoquímica e farmacologicamente. Todavia, 

a partir dessas poucas variedades em questão é que se identificou compostos 

naturais de interesse, como lactonas, terpenoides, esteroides, taninos e 

principalmente os compostos fenólicos (SILVA; CECHINEL FILHO, 2002). 

Estudos farmacológicos confirmaram experimentalmente as atividades 

antioxidantes e hipoglicemiantes de algumas espécies de Bauhinia, e atribuíram 

essa atividade farmacológica aos compostos fenólicos, dentre eles os 

flavonoides (AHMED, et al, 2012).  

Um estudo com Bauhinia variegata L., demonstrou melhoria no 

metabolismo de carboidratos atribuído aos menores níveis de glicemia no 

sangue de camundongos diabéticos (PEPATO, et al., 1998). Em Bauhinia 

cheilantha (Bong.) Steud, foi comprovada atividade hipoglicemiante (ALMEIDA; 



10 
 

 
 

XAVIER; GUEDES, 1997), bem como em Bauhinia monandra Kurz. em estudos 

in vivo (MENEZES, et al., 2007). 

Estudos realizados com Bauhinia holophylla (Bong) Steud, identificaram 

diferentes cianoglicosídeos não-cianogênicos, dentre eles o composto 

litospermosídeo. Esse metabólito apresentou forte atividade hipoglicemiante 

observada por meio de testes de tolerância à glicose e avaliação da glicemia em 

camundongos diabéticos, quando comparado com Metformina® (SALDANHA, 

2017; CAMAFORTE, et al., 2019).  

Bauhinia forficata L., é a espécie do gênero mais difundida na medicina 

tradicional considerada como a pata-de-vaca “verdadeira” por ser a espécie mais 

efetiva no tratamento do diabetes, segundo as comunidades, e com maior 

quantidade de trabalhos científicos publicados sobre suas propriedades. Além 

das atividades antifúngica e diurética (LUZ, et al., 1996), seu potencial 

hipoglicemiante tem sido muito pesquisado ao longo dos anos (JULIAN, 1929; 

RUSSO, et al., 1990; MARMITT; REMPEL, 2016), o que a tornou disponível no 

mercado farmacêutico para o tratamento de diabetes (SILVA; CECHINEL 

FILHO, 2002) e a colocou na lista de interesse do SUS (BRASIL, 2009). 

A partir dessas informações, é nítido que Bauhinia possui diversas 

espécies com potencial para descoberta de produtos naturais 

farmacologicamente ativos. No entanto, espécies do gênero carecem de estudos 

que viabilizem seu uso racional e sustentável (VAZ; TOZZI, 2003; FARAG, et al., 

2015). Por isso, a investigação de espécies desse gênero, se faz extremamente 

importante, uma vez que já foi apresentado o seu potencial no controle de índices 

glicêmicos em geral. 

 Os principais constituintes químicos identificados em B. forficata são 

flavonoides presentes em relativa abundância, sendo a kaempferitrina, descrita 

como o principal composto responsável pela atividade hipoglicemiante 

(MENDES; MACHADO; FALKENBERG, 2006; MARMITT; REMPEL, 2016). 

Outros flavonoides com atividade hipoglicemiante, são Canferol e Quercetina 

(COPP, 2003). Já identificados em Bauhinia ungulata L. anteriormente 

(GANIKO-DUTRA; SALDANHA; DOKKEDAL, 2018), essas substâncias 

presentes na folha podem, portanto, indicar que a espécie seja uma potencial 

planta medicinal com propriedades antidiabéticas. 



11 
 

 
 

 Segundo Morais et al. (2005), B. ungulata é utilizada por índios Tapebas 

no Ceará, por causa da sua ação hipoglicemiante no tratamento do diabetes e 

para casos de diarreia (BIESKI, et al., 2012). Alguns trabalhos apontam a 

presença de diferentes flavonoides nas folhas de B. ungulata que apresentam 

uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo ação antioxidante, anti-

inflamatória, antitrombótica, antialérgica, além de conseguirem inibir enzimas 

relacionadas à tumurogênese, e induzir sistemas enzimáticos desintoxicantes 

(MIEAN; MOHAMED, 2001). 

 

1.1 Bauhinia ungulata L. 
 

Bauhinia ungulata, também conhecida popularmente como “pata-de-

vaca” ou “mororó”, é uma espécie nativa do Brasil, com distribuição geográfica 

centralizada principalmente nas regiões: Norte (Acre, Amazonas, Amapá, Pará, 

Rondônia, Roraima e Tocantins); Nordeste (Ceará, Maranhão e Piauí); Centro-

Oeste (Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso do Sul e Mato Grosso); Sudeste 

(Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo), e Sul (Paraná), com domínios 

fitogeográficos evidentes na Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica (VAZ, 2014). 

Apresenta-se como arbusto ou arvoreta, que pode variar de 2-6m de 

altura. Têm flores actinomorfas, noturnas, brancas e nectaríferas. Polinização 

noturna dada por morcegos, uma vez que florescem no período de seca (abril a 

agosto), sendo a única fonte de alimento para esses animais durante esses 

meses. Frutifica em julho a outubro, e é, portanto, uma angiosperma, cujos 

frutos, em forma de vagem, envolvem e protegem suas sementes, e esta é uma 

característica da família Fabaceae (ou Leguminosae), na qual é pertencente 

(DUTRA, et al., 2009). 

As folhas são unifoliadas, bilobadas (Figura 1), de tamanho aproximado 

de 1,2 a 3,3 por 2,2 a 5,8 cm, 9 a 11 nervuras, estípulas com 2 mm de 

comprimento, lanceoladas; folíolos divididos de um terço à metade, lobos 

subreniformes a elípticos, margem inteira, face abaxial purulenta, com tricomas 

glandulares, face adaxial glabra; nectário rudimentar. Inflorescência 

pseudoracemosa, pluriflora, terminal; cálice de 5 a 9,3 cm de comprimento, 

tubuloso, ferrugíneo, purulento externamente; corola 2,3 a 3,8 cm de 



12 
 

 
 

comprimento, pétalas brancas, linear-lanceoladas; estames heterodínamos com 

3,8 a 6 cm de comprimento, filetes irregularmente unidos na base formando uma 

coluna, anteras de 0,8 a 1,2 cm de 40 comprimento; estaminódios ausentes; 

ovário com 1,5 cm de comprimento, estipitado, purulento, estilete com 3,3 cm de 

comprimento, glabro, estigma oblíquo, clavado. Legume planocompresso, 13 a 

15,5 por 1,5 cm, apiculado, puberulento; 9 a 14 sementes, 1 por 0,5 cm, 

obviadas, esverdeadas (DUTRA; GARCIA; LIMA, 2008). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1. Folhas bilobadas A) Face adaxial e B) Face abaxial de Bauhinia 
ungulata. 

 

 A espécie B. ungulata foi escolhida para esse estudo por ser nativa e com 

ampla distribuição no Cerrado da região de Bauru (CAVASSAN; WEISER, 2015). 

Além disso, o gênero Bauhinia é similar tanto morfologicamente como 

fisiologicamente (VAZ; TOZZI, 2003), apresentando importantes metabólitos de 

interesse farmacológico, como os apresentado na já distribuída comercialmente 

B. forficata (SILVA; CECHINEL FILHO, 2002). Por fim, estudos recentes 

apontam a presença de diferentes flavonoides nas folhas de B. ungulata que 

apresentam ação antioxidante, anti-inflamatória, antitrombótica, antialérgica e 

hipoglicemiantes (Tabela 1). 

 

 

 

 

A B 



13 
 

 
 

Tabela 1. Flavonoides encontrados em Bauhinia ungulata. 

Composto Estrutura Referência 

Quercetina 

 

GANIKKO-DUTRA; 

SALDANHA; DOKKEDAL, 

2018. 

DE SOUSA, et al., 2016. 

MAIA NETO, et al., 2008. 

PAULA, et al., 2014. 

Canferol 

 

GANIKKO-DUTRA; 

SALDANHA; DOKKEDAL, 

2018. 

MAIA NETO, et al., 2008. 

PAULA, et al., 2014. 

Miricetina 

 

GANIKKO-DUTRA; 

SALDANHA; DOKKEDAL, 

2018. 

 

Naringenina 

 

DE SOUSA, et al., 2016. 

Eriodictiol 

 

DE SOUSA, et al., 2016. 

Liquiritigenina 

 

DE SOUSA, et al., 2016. 



14 
 

 
 

Guibourtinidol 

 

DE SOUSA, et al., 2016. 

Fisetinidol 

 

DE SOUSA, et al., 2016. 

Avicularina 

 

MAIA NETO, et al., 2008. 

 

Quercitrina 

 

MAIA NETO, et al., 2008. 

 

Astilbina 

 

PAULA, et al., 2014. 



15 
 

 
 

Engelatina 

 

PAULA, et al., 2014. 

Afzelina 

 

PAULA, et al., 2014. 

 
 

 1.2. Flavonoides 
 

Estudos preliminares demonstraram a presença de diferentes flavonoides 

nas folhas de B. ungulata (Tabela 1).  Esses compostos desempenham diversas 

funções nas plantas como pigmentos naturais com principal função na proteção 

contra danos produzidos por raios ultravioletas e visíveis, poluição ambiental e 

períodos de seca (MARTÍNEZ-FLÓREZ; et al., 2002). Além de proteção contra 

herbívoria e ataques patogênicos, atuam também como meio de atração de 

polinizadores, hormônios vegetais, e inibidores de enzimas (ZUNAZZI; 

MONTANHA, 2003).  

Os flavonoides, em sua maioria, apresentam um esqueleto estrutural 

formado pela presença de dois anéis aromáticos A e B, e um heterocíclico 

oxigenado, o anel C (WILHELM FILHO; DA SILVA; BOVERIS, 2001). Os átomos 

de carbono possuem numeração ordinária para o anel A, C e B, como é 

apresentado na Figura 2. 



16 
 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2. Estrutura molecular básica dos flavonoides.  

Portanto, a presença de flavonoides nas folhas de B. ungulata, favorece 

a ocorrência de manutenções nos seus sistemas, permitindo-as se estabelecer 

frente a estresses do ambiente, garantindo a sua sobrevivência e perpetuando 

sua espécie (HARBORNE; WILLIAMS, 2000). 

 

1.3. Mudanças climáticas 
 

 Correntemente, nas duas décadas que se passaram, o termo “mudanças 

climáticas” tem sido uma das mais importantes preocupações globais para 

pesquisadores e governantes (GUPTA, et al., 2019). Isso porque, as previsões 

das alterações climáticas para os anos a seguir têm apontado condições críticas 

devido ao aquecimento global, tais como aumento do nível do mar; alterações 

no regime de suprimento de água continental; tempestades de neve e de chuvas 

fortes e mais frequentes; além de forte e rápido ressecamento do solo devido a 

períodos secos mais intensos e longos (MARENGO, 2006). 

 Tais mudanças tem impacto em diferentes níveis, como a saúde humana, 

umidade do ar, composição do solo, comunidades microbianas, plantas com 

seus componentes farmacologicamente ativos e segurança alimentar, florestas 

e biodiversidade, bem como o funcionamento de todo o ecossistema (LEPERTZ, 

et al., 2009). 

  Fatores abióticos são importantes para o crescimento e desenvolvimento 

de plantas, e cada espécie precisa de condições ambientais especiais para o 

seu estabelecimento. Mudanças extremas nessas condições promovidas pelas 



17 
 

 
 

alterações climáticas, podem acarretar a extinção de uma espécie, ou estimular 

processos fisiológicos para enfrentar a adversidade ocasionada (ARBONA, et 

al., 2013).  

Estudos demonstraram a ação de metabólitos especializados na proteção 

contra estresses abióticos (MILLAR, et al., 2007). Já em situação de seca severa, 

condição prevista devido ao aquecimento global, é analisada em diversos 

trabalhos que demonstram no conteúdo de metabólitos especializados de 

plantas, como terpenoides, compostos fenólicos, alcaloides e outros, pode 

aumentar (KLEINWÄCHTER; SELMAR, 2014).  

No entanto, em condições de disponibilidade hídrica extremamente baixa, 

indaga-se sobre a existência de condições à todas as espécies em sobreviver 

nas novas situações em que estarão submetidas, e caso consigam se 

estabelecer, quais serão os ajustamentos que as permitirão a manutenção de 

seus processos fisiológicos. Por isso, entender as alterações metabólicas e 

bioquímicas induzidas pelo déficit hídrico causado pela variação na 

disponibilidade hídrica é essencial para avaliar como as plantas de interesse 

medicinal, responderão sob esse estresse, como isso influenciará em seu 

crescimento e desenvolvimento, e se essas respostas alterarão o teor de 

substâncias de interesse farmacológico com potencial prejuízo às propriedades 

medicinais.  

 

 1.4 Efeitos do déficit hídrico 
 

O estresse em plantas pode ser definido como qualquer alteração que 

ocorra durante o desenvolvimento, que atrapalhe a homeostasia do vegetal, e o 

faça recorrer a diferentes mecanismos de resistência que promovam a 

aclimatação. O déficit hídrico reduz a disponibilidade de água para os processos 

associados ao transporte de solutos, conduz mudanças nas concentrações de 

muitos metabólitos, além de ocasionar distúrbios nos hidratos de carbono, no 

metabolismo de aminoácidos, e até a destruição das membranas celulares 

(SANTOS; LIMA; MORGADO, 2010). 

Essa deficiente disponibilidade hídrica na planta, pode comprometer a 

germinação e seu estabelecimento (HARRIS, et al, 2002), promover a redução 



18 
 

 
 

da produção e o tamanho das folhas (NONAMI, 1998), dificultar a taxa de 

exportação de sacarose para órgãos superiores, e assim, afetar o 

desenvolvimento reprodutivo (FAROOQ, et al, 2009). 

A exposição de plantas a certos estresses ambientais, leva a geração de 

espécies reativas de oxigênio (ERO’s), como ânion superóxido (O2), radicais 

hidroxila (OH) e peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual pode elevar a 

concentração de malonildialdeído, substância essa, caracterizada por ser 

produto secundário da lipoperoxidação (MUNNÉ-BOSCH; PENUELAS, 2003). 

As ERO’s podem reagir com proteínas e lipídios, causando danos oxidativos e 

prejudicando as funções normais das células (FOYER; FLETCHER, 2001). 

A planta responde ao estresse ocasionado pela seca, a partir do 

fechamento de estômatos, o que evita a perda de água por transpiração. Com 

isso, ocorre uma diminuição na difusão do CO2 para o mesófilo foliar, acarreta 

na redução da taxa fotossintética, e diminui o acúmulo de fotoassimilados, o que 

reduz a produtividade das culturas (SOUSA, R.; SOUSA, J., 2017).  

Uma das respostas para a manutenção da sobrevivência das plantas em 

ambientes secos, é o ajustamento osmótico, via o acúmulo ou compartilhamento 

de solutos, e a sinalização para demais áreas da planta repetir a ação de defesa 

(BRITO et al., 2008). Essa é a resposta mais comum dada pela planta frente ao 

estresse ocasionado pelo déficit hídrico, uma vez que a superprodução de 

diferentes tipos de solutos orgânicos como a prolina, glicinabetaína e ácidos 

orgânicos (SUBBARAO, et al, 2000), são compostos de baixo peso molecular e 

altamente solúveis, tornando-os não-tóxicos mesmo em altas concentrações 

(SERRAJ; SINCLAIR, 2002). 

Em situações de déficit hídrico, ocorre um aumento dos fitohormônios 

como o etileno e o ácido abscísico (NILSEN; ORCUTTE, 1996), que são 

sinalizadores dos mecanismos de indução do acúmulo de prolina (SADIQOV, et 

al, 2002). Esse aminoácido protege a planta através de ajuste osmótico, 

desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, estabilização de membranas e 

estruturas de enzimas e proteínas (FAROOQ, et al, 2009). 

Devido à ampla distribuição da espécie B. ungulata, sugere-se que esta 

disponha de mecanismos fisiológicos e bioquímicos, baseados no acúmulo de 



19 
 

 
 

compostos, como os já mencionados osmorreguladores, sinalizadores de 

estresse, e polifenóis, que permite, sua ocorrência e sobrevivência sob 

condições de déficit hídrico (SANCHES; SILVA, 2013).  

Flavonoides são amplamente descritos como agentes redutores, 

sequestrantes de radicais livres, o que lhes permite proteger a parede celular da 

planta estressada, por exemplo, por altas temperaturas, grande incidência de 

raios UV, e também, a deficiência hídrica (TAIZ; ZEIGER, 2013).  

Selmar e Kleinwachter (2013), afirmam que as concentrações de 

metabólitos especializados aumentam expressivamente nas plantas em 

condições de seca, e também, afirmam que a combinação entre esse estresse, 

promovido pela deficiência hídrica, e o aumento no acúmulo desses metabólitos, 

provocam uma redução significativa no crescimento de várias espécies vegetais. 

Outro estudo realizado com capim-limão (Cymbopogon citratus DC) pertencente 

à Poaceae, em diferentes lâminas de irrigação sobre o efeito em seu rendimento 

e a composição de seu óleo essencial, permitiram confirmar que quanto maior o 

valor da lâmina de irrigação, menor o valor do rendimento do óleo, indicando que 

o déficit hídrico pode favorecer maior produção de óleo (PINTO et al., 2014).  

Segundo Aleman (2015), as técnicas de manejo de irrigação podem ser 

empregadas em diferentes culturas, dentre as quais se devem destacar o cultivo 

de plantas medicinais. Em virtude de existirem poucos estudos relacionados à 

demanda hídrica de plantas medicinais, torna-se importante quantificar essa 

disponibilidade, e determinar qual a linha tênue entre melhor produção de 

biomassa, e melhor produção de princípios ativos de interesse; além de garantir 

economia dos recursos hídricos disponíveis.  

Descobrir quais são as mudanças que ocorrem no perfil químico, e 

determinar como as estimular, permitirá auxiliar na domesticação e padronização 

da sua produção, e responderá a um dos requisitos para entrar na lista de 

fitoterápicos do SUS, onde a “Comissão de Seleção de Plantas” instituída pela 

Portaria Ceme nº 093, de 07 de dezembro de 1982, exige a partir do “Critério 

botânico-econômico”, que haja ampla distribuição geográfica, disponibilidade 

atual, facilidade de cultivo, produtividade e identificação botânica, fazendo 

necessário o investimento na área de desenvolvimento de técnicas de 

propagação de plantas medicinais em geral (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). 



20 
 

 
 

1.5   Análise fitoquímica com abordagem metabolômica 
 

Abordagens como a metabolômica vêm modificando a forma de análise 

fitoquímica de processos que envolvem sistemas biológicos. Também 

conhecidas como “omics”, tais abordagens fazem uso de tecnologias analíticas 

com eficiente resolução, e fornece conjuntos de dados complexos sobre 

determinado fenômeno biológico, que são processados, tratados e 

correlacionados por análises estatísticas multivariadas para identificação de 

substâncias de importância biológica (WOLFENDER, et al., 2009). 

Alguns dados demonstram que o metabolismo especializado das plantas 

sofre maior influência de fatores ambientais, do que variações genéticas, ou seja, 

o fenótipo está mais relacionado a um padrão do meio ambiente, do que à 

estruturas genéticas, onde o perfil de metabólitos está diretamente associado às 

condições do plantio (MATSUDA, et al., 2012). Estudos metabolômicos 

viabilizam analisar o fenótipo funcional de indivíduos, e fornece dados precisos, 

bem como, respostas fisiológicas a alterações bióticas e abióticas em diferentes 

níveis (FIELD, et al., 2011). 

A metabolômica, seguida de análise multivariada de dados, surge como 

uma ferramenta robusta para a análise de metabólitos especializados relevantes 

em sistemas biológicos (CANUTO et al., 2018). Vários estudos têm obtido 

sucesso na identificação de alterações metabólicas ocasionadas em plantas em 

resposta a diferentes tipos de estresse físico (luz UV, calor, desidratação etc.); 

químico (como fármacos e agrotóxicos) ou biológico (patógenos, entre outros) 

(FUNARI et al., 2013). Tradicionalmente as aquisições de dados em estudos de 

metabolômica têm sido realizadas por meio de técnicas analíticas como a 

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e ou gasosa (CG) acopladas a 

espectrômetro de massas, ou ainda por ressonância magnética nuclear (RMN) 

(ABDELNUR, 2017). 

O objetivo principal da metabolômica é detectar o maior número possível 

de metabólitos (quali- e quantitativamente) de uma amostra, o que pode fornecer 

uma imagem metabólica de um organismo vivo sob diferentes condições num 

determinado momento. Para viabilizar tal análise, é comum o uso de diferentes 



21 
 

 
 

plataformas para se obter uma ampla gama de substâncias de uma amostra 

(KIM; CHOI; VERPOORTE, 2010). 

A ressonância magnética nuclear (RMN) tem sido aplicada na ciência 

química das plantas, podendo ser utilizada para distinguir as diferentes 

condições impostas aos vegetais partir de análises de seu perfil químico. Apesar 

da baixa sensibilidade quando comparada com a espectrometria de massas, a 

análise por RMN possibilita a detecção simultânea e quantitativa de diversos 

grupos de metabólitos, já que seus sinais são proporcionais à concentração 

molar real de substâncias presentes no extrato. Outra vantagem da RMN é a 

possibilidade de elucidação estrutural sem a necessidade de fracionamento do 

extrato e do uso de padrões (KIM; CHOI; VERPOORTE, 2010). 

 Já a espectrometria de massas (MS) é uma técnica que detecta a razão 

massa sobre a carga (m/z) de íons, gerados a partir de moléculas neutras ou 

carregadas em uma fonte de ionização, e para diversos tipos de substâncias 

passíveis de ionização, até mesmo voláteis, graças aos avanços nas fontes de 

ionização (ABDELNUR, 2017). Técnicas metabolômicas baseadas em MS 

oferecem excelente combinação de sensibilidade e seletividade, sendo uma 

plataforma indispensável para análises do perfil químico de plantas medicinais 

(LEI; HUHMAN; SUMMER, 2011). 

 A parte das vantagens e desvantagens de cada técnica, estas plataformas 

geram um alto volume de dados muitas vezes complexos de difícil interpretação. 

Uma estratégia é o pré-tratamento desses dados e posterior avaliação através 

de análises multivariadas. Técnicas como regressão por mínimos quadrados 

parciais PLS (Partial Least Squares), regressão por componentes principais PCR 

(Principal Regression Components), além das técnicas de reconhecimento de 

padrões PCA (Principal Components Analysis) e aglomeração HCA (Hierarquical 

Cluster Analysis). Essas técnicas possibilitam a identificação de variáveis de 

importância biológica para determinado processo biológico (ARAÚJO, et al, 

2006). 

A PCA é uma técnica útil para o reconhecimento de padrões, não 

supervisionada, que fornece informações sobre tendência a formação de grupos 

no conjunto de dados. A técnica reduz o número de variáveis presentes, de modo 

a expressar as informações relevantes contidas nas primeiras variáveis em um 



22 
 

 
 

menor número possíveis de variáveis, descrevendo as principais variações da 

matriz de dados (BRERETON, 2007). OPLS análise ortogonal discriminante por 

mínimos quadrados parciais, e é um método supervisionado e usado para 

discriminar duas ou mais componentes (TRYGG; WOLD, 2002).  

Uma vez identificadas as variáveis de importância, é necessária a 

identificação de sua estrutura química. Atualmente, uma das formas de 

identificação de substâncias é através da comparação de espectros de massas 

com bancos espectrais disponíveis on-line, que tem possibilitado a anotação 

massiva de compostos com alto grau de confiança.  Após esta etapa, a 

plataforma online, Global Natural Products Social (GNPS), tem possibilitado a 

organização desses metabólitos, com base em íons comuns em seus espectros, 

em grupos de substâncias com similaridade estrutural por meio de redes 

moleculares (ALLARD, et al., 2016; KIM; CHOI; VERPOORTE, 2010; 

WOLFENDER, et al., 2019).  

 

1.6. Produção agronômica de plantas medicinais 
 

  O Brasil é o décimo mercado farmacêutico mundial, no entanto ainda 

importa cerca de 80% da matéria-prima utilizada na produção de fitoterápicos, 

tornando o país altamente dependentes do mercado externo para garantir o 

abastecimento. Isso prejudica o desenvolvimento tecnológico e científico para 

produção de fármacos, e encarece o preço do produto, dificultando a 

concorrência comercial de medicamentos (ADAME; JACCOUD, COBRA, 2005; 

COSTA, et al., 2014).  

Haja vista, há a necessidade de contínuo fornecimento da matéria-prima 

de qualidade para viabilizar o seu uso medicinal de maneira segura e eficaz, 

sendo necessário estudos que forneçam subsídio a diferentes maneiras de 

domesticação¸ tendo em vista sua sobrevivência, garantindo um menor número 

possível de sua extração do meio natural, evitando assim a extinção, e 

permitindo maior independência frente ao mercado externo (AMARAL et al., 

2017).   

  O extrativismo, além de não ser recomendável para a manutenção da 

planta, uma vez que os coletores responsáveis podem não possuir treinamento 



23 
 

 
 

sobre técnicas que permitam a rebrota, e também não terem conhecimento sobre 

as características diagnósticas da espécie a ser extraída, podendo levar a 

identificação da espécie errada (ALVEZ; SANTOS; AZEVEDO, 2012).  

Esse problema atinge as espécies de Bauhinia, já que possuem uma alta 

similaridade botânica (VAZ; TOZZI, 2003). Todas as espécies nomeadas 

popularmente como pata-de-vaca, apresentam folhas bifoliadas, nervura central 

com um único feixe e pecíolo caliculado com projeções laterais. Essa 

uniformidade morfológica de seus órgãos vegetativos, dificulta a distinção 

principalmente de amostras estéreis (COSTA-SILVA, et al., 2018). Em relação a 

composição química, estas espécies compartilham heterosídeos de flavonoides 

derivados principalmente de canferol e quercetina (CECHINEL, 2009; FARAG, 

et al, 2015).  

A alta similaridade morfológica das espécies de Bauhinia, resulta num 

grupo taxonômico de difícil identificação e a alta frequência de adulteração de 

seus fitoterápicos, por conta da identificação errônea das espécies, o que tem 

causado variação ou até mesmo ausência da atividade farmacológica esperada, 

como é destacada por diferentes estudos (VAZ; TOZZI, 2003; FERRERES et al., 

2012; CAMAFORTE, et al., 2019).   

Altas concentrações de diferentes flavonoides são determinantes para 

explicar as atividades biológicas de Bauhinia (FERRERES, et al, 2012), como 

por exemplo, em B. forficata, cujo extrato foliar apresenta maiores concentrações 

de canferol e derivados, o que justifica sua atividade hipoglicemiante 

(PINHEIRO, et al., 2006). Por isso, ao estabelecer correta identificação da 

espécie, reproduzir e desenvolvê-las agronomicamente, atendendo suas 

necessidades, garante material final com segurança e alta qualidade (ALVEZ; 

SANTOS; AZEVEDO, 2012). 

Os metabólitos secundários, apresentam importante função na interação 

das plantas com o meio ambiente, uma vez que permitem sua sobrevivência 

frente a estresses bióticos e abióticos, permitindo que mantenham seu pleno 

desenvolvimento, até a fase de reprodução, que lhe habilite transmitir seus 

genes e manter sua espécie ativa ao longos dos anos (PEREIRA; CARDOSO, 

2012).  



24 
 

 
 

Dado o papel específico dessas substâncias para a sobrevivência das 

plantas, Arimura e Maffei (2017), propõem que é mais pertinente a utilização do 

termo “especializados” ao invés de “secundários”.  

O estudo fenotípico da planta medicinal permite elaborar técnicas que 

auxiliem na sua reprodução, tanto no seu desenvolvimento vegetativo, 

garantindo um maior número de biomassa por planta, quanto no 

desenvolvimento de situações e ambientes, que potencialmente estimulem a 

produção de um maior número de metabólitos especializados aumentando a 

concentração do princípio ativo de interesse. São diversos os fatores que 

influenciam o conteúdo desses metabólitos, como por exemplo, sazonalidade, 

ritmo circadiano, desenvolvimento, temperatura, radiação ultravioleta, nutrientes, 

poluição atmosférica, altitude, indução por estímulos mecânicos ou ataques de 

patógenos, além de disponibilidade hídrica (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). 

Uma etapa inicial importante à produção de qualquer planta medicinal em 

escala comercial, é pesquisar o seu comportamento a partir das características 

climáticas da região em que será inserida, aos tratos culturais e às condições 

biológicas que interferem em seu desenvolvimento de biomassa, e acúmulo de 

metabólitos especializados, para garantir a padronização de seu cultivo, uma vez 

que é possível reproduzir essas características estimulantes a produção de seus 

princípios ativos de interesse, sem diminuir seu crescimento de massa verde 

(SCHWERZ, 2013).  

Promover a produção agrícola de B. ungulata e plantas medicinais em 

geral, permite também, viabilizar a conservação das espécies, já que são plantas 

cada vez mais prejudicadas pelas mudanças climáticas, as quais tendem a 

mudar as características do meio ambiente em que estão inseridas, 

inviabilizando sua homeostasia, e até a sua continuidade (GUPTA, et al., 2019). 

Dado esse fator, é interessante também, analisar a capacidade das plantas em 

geral, frente aos fatores alterados pelas condições climáticas, a fim de predizer 

se há a possibilidade de sobrevivência delas em um futuro não tão distante.  

 

 



25 
 

 
 

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 

Desde a industrialização mundial, gases como CO2, CH4 e N2O, 

aumentaram de maneira exorbitante, preocupando muito a comunidade 

cientifica, uma vez que estes são os responsáveis por promover o aquecimento 

global (LEPERTZ, et al., 2009). Apesar de acordos para reduzir a emissão 

desses gases, o clima continuará a mudar por pelo menos as próximas centenas 

de anos, dado a inércia da circulação oceânica e os sistemas atmosféricos 

(IPCC, 2014). As projeções para futuro próximo e distante indicam mudanças na 

precipitação, aumentando os períodos de seca (SILVA; PAULA, 2009). 

O déficit hídrico tem sido bastante investigado na produção agrícola 

brasileira; são várias pesquisas que estudam respostas de diversas cultivares 

frente a baixa disponibilidade hídrica, bem como o trabalho de Zandalinas et al. 

(2017) que demonstrou alteração na produção de flavonoides  em Citrus spp. 

que atuam como fotoprotetores e antioxidantes, com função de mitigar os efeitos 

nocivos do estresse; ou Gava et al (2018), que teve sua pesquisa focada em 

estresse hídrico e a produção de soja, e demonstrou que a resposta da cultura 

à irrigação está relacionada principalmente às características genéticas de cada 

cultivar. 

Porto, Klar e Vasconcellos (1998), que estudaram o efeito do déficit hídrico 

no sorgo, o qual apresentou resultados a variação no status de água na folha 

observado através do potencial e do teor relativo de água nas folhas. Isso pode 

ser utilizado para indicar o momento de irrigar, e ainda indicar as plantas ou 

cultivares de sorgo que mostram maior tolerância à seca.  

Em contrapartida, muitas plantas nativas com potencial medicinal recém 

comprovado experimentalmente, como B. ungulata, não apresentam estudos 

frente aos fatores abióticos que podem alterar a produção de substâncias de 

interesse bem como viabilidade de produção de biomassa para produção de 

fitoterápicos, ou suas adaptações frente a baixa disponibilidade hídrica prevista. 

Observa-se que plantas medicinais com uso popular, encontra-se próximo ao 

estado silvestre, submetidas a diversas condições ambientais, e as informações 

sobre o impacto destes fatores na produção de metabólitos especializados 



26 
 

 
 

provém principalmente de esforços de pesquisa para aumentar a produção de 

princípios ativos de espécies medicinais aromáticas (MORAIS, 2009).  

As possíveis variações de solo e clima nos ambientes onde espécies de 

interesse ocorrem, demostram dificuldades na padronização de extratos 

vegetais para o uso seguro, já que o metabolismo vegetal tem grande influência 

pela variação de nutrientes no solo e pelo clima, como mostrado por Saldanha 

(2017), em seu estudo com espécimes de Myrcia bela, (Myrtaceae) localizados 

em diferentes regiões de Cerrado no Brasil. As propriedades do solo têm grande 

influência no conteúdo de taninos e flavonoides nas populações de M. bela em 

diferentes regiões.   

Por isso, o estudo agronômico em condições controladas pode garantir 

novos conhecimentos para viabilizar padronizações na produção de plantas 

medicinais, e também pode permitir um maior número de opções para o pequeno 

e médio produtor garantir sua renda, e assegurar a qualidade nos extratos a 

partir destas plantas, e pode até ser disponibilizado a indústrias farmacêuticas 

que trabalham com os metabólitos de interesse medicinal (ALVEZ; SANTOS; 

AZEVEDO, 2012). O estudo agronômico se faz importante principalmente para 

o grupo Bauhinia, onde a similaridade morfológica, discutida anteriormente, pode 

levar a erros na identificação das espécies e gerar adulteração e variação do 

conteúdo de metabólitos e prejudicar a atividade medicinal (COSTA-SILVA, et 

al., 2018). 

Os flavonoides são importantes compostos por serem capazes de afetar 

vários sistemas enzimáticos e funções biológicas dos mamíferos, sendo a 

capacidade antioxidante uma das ações mais estudadas desses compostos. 

Isso, porque são substâncias capazes de retardar as reações de degradação 

oxidativa, a qual é ocasionada pelo próprio metabolismo humano, e formar 

naturalmente espécies reativas ao oxigênio (ERO’s), ou também chamados, 

radicais livres (BARREIROS; DAVID, 2006).  

O excesso de radicais livres no organismo tem ação deletéria, uma vez 

que consegue alterar as estruturas celulares quando ligadas às mesmas, e, 

possui vida longa, e potencial para atravessar membranas das células, 

apresentando elevada toxicidade (BARBOSA, et al., 2010). Estes excedentes 

podem ser impedidos pelos flavonoides, uma vez que realiza o sequestro direto 



27 
 

 
 

de espécies reativas de oxigênio (ROS) ao doar átomos de hidrogênio, ativa 

enzimas antioxidantes, retira substâncias, como o cobre e o ferro, ou algumas 

enzimas responsáveis por ativar esses radicais, entre outras atividades que 

diminuam ou impeçam essa oxidação (AMIC, et al., 2014).  

Estudos que avaliem a produção e acúmulo de substâncias de interesse 

medicinal são importantes para elaboração de estratégias de conservação para 

garantir a produção contínua da planta (SCHWERZ, 2013).  As ciências “ômicas” 

buscam o entendimento do funcionamento celular dos organismos e suas 

alterações biológicas, e a metabolômica trata-se, portanto, do estudo das 

alterações dos metabólitos (CANUTO, et al., 2018). 

Os metabólitos gerais são produtos do metabolismo, encontrado na 

maioria dos sistemas vivos e essenciais ao crescimento e a vida. Metabólitos 

secundários (especializados), também são produtos com função na 

diferenciação de grupos taxonômicos restritos, e biossintetizados a partir de um 

ou mais metabólitos gerais, não correlacionados ao crescimento do organismo 

(VERPOORTE, 2000). Metabolismo consiste em toda a matéria e energia em 

organismos que permite os considerar fisicamente como seres-vivos. São 

associados a outras definições da “vida”, como organização, emergência, 

autonomia, crescimento, desenvolvimento, reprodução, adaptação, capacidade 

de respostas e até evolução (BODEN, 1999). 

O conjunto de todos os metabólitos de baixa massa molecular, presentes 

ou alterados em um sistema biológico é chamado de metaboloma. Pesquisas 

relacionadas a metabólitos, que é definida como metabonômica, consiste na 

medida quantitativa da resposta metabólica de um sistema biológico após 

estímulos fisiopatológicos ou modificações genéticas (OLIVER, et al., 1998). Já 

a metabolômica é a análise abrangente e quantitativa do metaboloma de um 

sistema biológico (FIEHN, 2001). 

Monitorar as reações de um organismo sob diferentes estresses abióticos, 

como situações de déficit hídrico, permitirá criar situações ou espaços que 

garantam sua sobrevivência e alta produção, tanto de biomassa, quanto de 

metabólitos especializados (PORFIRIO et al, 2014).   



28 
 

 
 

3 OBJETIVOS  
 

Investigar os efeitos induzidos pela variação da disponibilidade de água 

nos parâmetros fotossintéticos e no metabolismo especializado de B. ungulata, 

e demonstrar se haverá impacto em seu cultivo e sua sobrevivência em períodos 

secos promovidos pelas mudanças climáticas 

 

3.1. Objetivos específicos  
 

Para isso, espécimes de B. ungulata foram submetidas a diferentes 

períodos de irrigação, e os seguintes parâmetros foram analisados: 

 Trocas gasosas e biomassa seca; 

 Perfil fitoquímico do extrato foliar por UHPLC-HRMS2 e RMN; 

 Análise metabolômica por RMN. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



29 
 

 
 

4. MATERIAL E MÉTODOS 

 

4.1. Propagação e obtenção das mudas de Bauhinia ungulata 

 

 Os espécimes de B. ungulata foram obtidos por meio de propagação de 

sementes coletadas em agosto/2015, de árvores matrizes localizadas no Jardim 

Botânico Municipal de Bauru (JBB) às margens da Rodovia Comandante João 

R. de Barros – SP 225 (22°20’30’’ S e 49°00’30’’ W). As sementes foram 

propagadas em setembro de 2015 após tratamento com ácido sulfúrico (H2SO4 

concentrado a 98%) por um período de cinco minutos, e em seguida rinçadas 

em água (Figura 3).  

 

Figura 3. Sementes de Bauhinia ungulata A) mergulhadas em ácido sulfúrico 
para quebra de dormência, B) à esquerda antes do beneficiamento e à direita 
após o beneficiamento para estimular a germinação (2017). 

 

Posteriormente, as sementes foram dispostas em bandejas com substrato 

estéril (Figura 4), e permaneceram alocadas em casa de vegetação semicoberta, 

recebendo irrigação três vezes ao dia, além da aplicação de fertilizantes NPK 

(10:10:10) e calda bordalesa, mensalmente, visando promover seu pleno 

crescimento e prevenir possíveis ataques de patógenos até a data do 

experimento. 

 

 



30 
 

 
 

 

 

 

 

 

Figura 4. Sementes de Bauhinia ungulata dispostas em bandeja para 
propagação (2017). 

 

4.2. Aclimatação das plantas em estufa agrícola 
 

Assim que as mudas completaram três anos de idade, foram 

acondicionadas em vasos de 8 L, com substrato “Carolina” composto por turfa, 

vermiculita, resíduo orgânico agroindustrial classe A e calcário. Foram 

aclimatadas por 30 dias, além de mantidas durante todo o experimento em estufa 

agrícola Van der Hoeven, em parceria com a professora Dra. Inês Cechin, 

localizada na Faculdade de Ciências, Bauru, São Paulo, Brasil (22°21’28’’ S, 

49°01’37’’ W) (Figura 5). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5. Mudas de B. ungulata com mesmo período fisiológico, alocadas na 

estufa agrícola Van der Hoeven (2018). 

 



31 
 

 
 

A irrigação foi controlada por gotejamento sob fotoperíodo natural de 

outubro a dezembro de 2018, sendo a radiação fotossintética ativa dentro da 

casa de vegetação igual a 70% das condições à céu aberto. A variação da 

temperatura dentro da estufa foi controlada com sistema de ventilação e 

monitorada por um termômetro. As temperaturas obtidas durante o experimento 

foram médias máximas de 30,7°C e as médias mínimas de 22,0 °C. 

 

4.3. Desenho experimental para estudo de disponibilidade hídrica 
 

As plantas foram divididas em três grupos experimentais, de modo casual 

com irrigação controlada, e descrita abaixo:  

 Irrigação contínua (Grupo Controle);  

 Irrigação interrompida por sete dias (Grupo 7D);  

 Irrigação interrompida por quinze dias (Grupo 15D).  

As avaliações de trocas gasosas in planta e coletas de amostras de folhas 

para análise metabolômica foram realizadas com três repetições por tratamento 

por coleta (n=3), a cada quinze dias ao longo de três meses, num total de seis 

coletas (SANCHES; SILVA, 2013). A irrigação nos grupos 7D e 15D eram 

retomadas por 24 h após a coleta de folhas e análises de parâmetros 

fotossintéticos. 

 

4.4. Análises de produção de biomassa, condutância estomática e de trocas 
gasosas 
 

A produção de biomassa, foi avaliada através da massa de matéria seca 

das folhas (MSF). As folhas coletadas foram congeladas em -80°C e 

posteriormente secas a frio por meio de liofilização. A massa obtida foi 

apresentada em g planta-1. 

As análises de trocas gasosas foram realizadas utilizando um Analisador 

de Gás Infravermelho (IRGA), modelo LCpro (ADC, Hoddesdon, UK). Os dados 

de condutâncias estomática (gs) foram apresentados em mol m-2 s-1, taxa de 

assimilação de CO2 (A) em μmol m-² s-¹, os de transpiração (E) em mmol de H2O 



32 
 

 
 

m-² s-¹, e os da concentração de CO2 na cavidade subestomática (Ci) em mol m-

2 s-1. A eficiência instantânea do uso da água (EUA) foi calculada a partir dos 

dados de trocas gasosas (A/E) e é dada pela função (μmol m-² s-¹) (mmol H2O m-

² s-¹)-¹. 

As mensurações foram feitas entre 8 e 10 horas da manhã, dentro da 

estufa agrícola, sob luz natural e temperatura ambiente, com pressão parcial de 

dióxido de carbono e pressão do vapor de água do ar de 1000 μmol m-² s-¹, e as 

folhas foram mantidas sob esse valor até que estado estacionário fosse 

alcançado.  

 

4.5. Obtenção dos extratos 
 

Após a coleta das folhas, o material vegetal foi imediatamente 

armazenado em freezer a -80°C e seco a frio por meio de liofiização. Após 

completa secagem, o material vegetal foi triturado em moinho de facas e uma 

alíquota de  50 mg foi separada. A extração foi realizada em ultrassom por 20 

minutos utilizando 1,5 ml de metanol e água deuterados (CD3OD:D2O) na 

proporção 7:3 (v/v). Em seguida os tubos foram centrifugados a 6585,6 g por 20 

minutos, o sobrenadante coletado e eluído em cartucho de extração em fase 

sólida C-18 (SPE) (500 mg/3mL), para remoção de substâncias lipofílicas.  Uma 

alíquota de 600 μL dos extratos obtidos foram depositados em tubos de 5 mm 

para posterior análise em espectrômetro de ressonância magnética nuclear 

(RMN) (KIM; CHOI; VERPOORTE, 2010).  

  

 

4.6 Análise de Ressonância Magnética Nuclear  
 

 

As análises de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foram realizadas 

na Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias - EMBRAPA 

Instrumentação, localizada em São Carlos, SP, sob a responsabilidade do 

Professor Dr. Luiz Alberto Colnago. Os extratos foram analisados em 

espectrômetro AVANCE III HD 600, operando a 14,1 T, observando os núcleos 

de 1H e 13C a 600,13 e 150.90 MHz respectivamente, de detecção multinuclear 



33 
 

 
 

de 5mm com gradiente z. Todos os deslocamentos químicos foram observados 

em relação ao sinal do tetrametilsilano (TMS), em 0,00 ppm, como referência 

interna. Os espectros de 1H foram adquiridos com uma janela espectral de ~20 

ppm, 32 k pontos, utilizando a sequência de pulsos Bruker noesygppr1d, para 

eliminação do sinal da água. Os preenchidos com zeros para 64 k pontos e 

ampliação da linha exponencial de 0,3 Hz foi aplicada. Após a transformada de 

Fourier, a fase e a linha de base foram ajustadas. Os mapas de correlação 

heteronuclear 1H-13C a uma ligação (HSQC) e a longa distância (HMBC) foram 

otimizados para uma média de constantes de acoplamento 1J(H,C) e LRJ(H,C) de 

140 e 8 Hz, respectivamente. 

 

4.7 Análise UHPLC-ESI-HRMS  
 

A análise de cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada a 

espectrômetro de massas de alta resolução (UHPLC-HRMS) foi realizada em 

cromatógrafo Waters Acquity UPLC IClass acoplado a espectrômetro de massa 

Q-Exactive Focus (Thermo Scientific, Bremen, Germany), utilizando-se de uma 

fonte ionizada por electrospray aquecido (HESI-II). As separações foram 

realizadas em coluna Acquity UPLC BEH C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm X 150 mm 

mantida a 60°C. A fase móvel consistiu em 0,1% de ácido fórmico em água 

ultrapura (solvente A) e em Acetonitrila (solvente B) grau massas. A vazão foi de 

0,75 mL/min; o gradiente desenvolvido foi: 5% B para 50% B em A em 4 min; 50-

95% B em A em 3 min; 95% B em 1 min; 5% B em 2 min com tempo total de 10 

min. O volume de injeção foi de 2 µL.  

Os parâmetros otimizados da fonte de ionização (HESI-II) foram: 

voltagem da fonte 3,5 kV; fluxo de gás (N2), 48 unidades; fluxo de gás auxiliar, 

11 unidades; fluxo de gás sobressalente, 2,0 unidades; temperatura do capilar, 

300°C, S-Lens RF Level, 55. O analisador de massa foi calibrado usando uma 

mistura de cafeína, acetato de metionina, arginina, fenil alanina (MRFA), sulfato 

de dodecil de sódio, taurocolato de sódio, e Ultramark 1621 em uma solução de 

acetonitrila/metanol/água contendo 1% de ácido fórmico por injeção direta.  



34 
 

 
 

Os eventos de MS/MS dependentes foram realizados nos três íons mais 

intensos detectados na verificação completa da MS (Experimentos Top 3). A 

largura da janela do MS/MS foi de 2 Da, e a energia de colisão normalizada 

(ECN) foi colocada em 35 unidades. Nos experimentos MS/MS dependentes de 

dados, varreduras completas foram adquiridas em uma resolução de 35.000 

fwhm (a m/z 200) e MS/MS em a 17.500 fwhm, ambos com tempo máximo de 

injeção de 50 ms. Depois de serem adquiridas na varredura MS/MS, os pares de 

íons foram alocados na lista de exclusão dinâmica por 3,0 s. 

As análises de UHPLC-HRMS foram realizadas em parceria com os 

Professores Dr. Jean-Luc Wolfender e Dr. Emerson Ferreira Queiroz da 

Universidade de Genebra, Suíça.  

4.8 Processamento de dados obtidos por cromatografia líquida de ultra-eficência 
acoplada a espectrometria de massas (UHPLC-HRMS) 
 

 Os dados brutos obtidos do UHPLC-HRMS foram convertidos para 

mzXML usando o software MS converter (Proteowizard) e analisados no 

programa MZmine 2.10 para detecção de picos, filtração de picos, construção do 

cromatograma, deconvolução do cromatograma, agrupamento isotrópico de 

pico, alinhamento do cromatograma e preenchimento de lacunas (gap filling).  

Os parâmetros usados para processamento dos dados foram: nível de 

ruído a 1 x 106 para MS1 e 0 para MS2. Os cromatogramas foram construídos 

usando o modelo ADAP com os seguintes parâmetros: tamanho mínimo de 

grupo de 5, altura mínima de 1 × 106, e tolerância m/z de 0,001 Da (ou 10 ppm). 

A deconvolução do cromatograma foi realizada usando modelo wavelets (ADAP) 

como o algoritmo para reconhecimento de picos, m/z e a faixa de RT para o 

emparelhamento de varredura MS2 foi de 0,3 Da e 0,1min, o limite S/N foi 50, 

altura mínima do recurso foi 5 × 105, limite de coeficiente/área foi 90, intervalo de 

duração de pico foi 0,02-1,5 min, e o intervalo da RT wavelets foi de 0,02-0,05.  

Os cromatogramas foram então de-isotopados por um algoritmo de 

agrupamento de picos isotópicos com uma tolerância m/z de 0,001 Da e uma 

tolerância RT de 0,05 min. O alinhamento dos picos foi realizado usando um 

alinhador, com tolerância m/z ajustada a 0,001 Da, tolerância absoluta RT a 0,05 



35 
 

 
 

min, e peso para m/z e RT a 30. A lista de picos ausentes pós o alinhamento foi 

preenchida pelo preenchimento das lacunas de mesmo módulo de 

preenchimento de intervalos RT e m/z com uma tolerância m/z de 0,001 Da. 

Após o preenchimento das lacunas, todas as listas de picos foram feitas com a 

identificação dos adultos. Esse tratamento resultou em uma lista de picos de 

1579 íons (features) que foi posteriormente filtrado para uma lista de picos de 

704 íons que possuíam espectro de MS² dependentes. Essa lista resultante de 

704 íons foi exportada como entrada para geração da rede de moléculas (dados 

MS¹ e MS²). 

 

4.9 Análise de Redes de Moléculas 
 

A rede de moléculas (RM) com espectros MS² da Bauhinia ungulata foi 

gerada usando o fluxo de trabalho da plataforma online da Global Natural 

Products Social Molecular Networking (GNPS). Os espectros MS² foram então 

agrupados com o MS-Cluster com uma tolerância de massa em 0,02 Da para 

criar espectros de consenso, e espectros de consenso contendo menos de dois 

espectros foram descartados. Uma rede foi então criada onde as arestas foram 

filtradas para ter um valor de cosseno acima de 0,7 e mais de 6 picos 

correspondentes. As arestas mais distantes entre dois nós foram mantidas na 

rede se e somente se cada um dos nós apareceu nos respectivos top 10 nós 

mais semelhantes. Os espectros na rede foram então pesquisados nas 

bibliotecas espectrais disponíveis no GNPS. Todas os hits com pontuação acima 

de 0,7 e pelo menos 6 picos coincidentes foram mantidos na anotação. 

 

4.10. Análises estatísticas 

  
Os dados dos parâmetros ecofisiológicos foram submetidos à análise de 

variância (ANOVA), e pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o 

programa estatístico R. Testes de normalidade foram realizados anteriormente. 

E os dados foram submetidos a análises de correlação de Pearson entre os 

parâmetros avaliados. 



36 
 

 
 

Para as análises metabolômicas, espectros de RMN de 1H das amostras 

obtidas, foram tratados a partir da correção de fase e da linha de base, 

submetendo-os a transformações e pré-tratamentos, com o auxílio do software 

da Amix (Bruker Biospin GmbH). Desta forma os espectros foram inicialmente 

divididos em pequenos intervalos (buckets) de 0,04 ppm. A região do espectro 

correspondente à região de saturação do sinal da água/metanol e outras 

possíveis regiões indesejáveis foram excluídas das análises multivariadas. Em 

seguida, foram realizados diferentes pré-tratamentos estatísticos, visando 

enfatizar os compostos em baixa concentração, entre outras possibilidades.  

Os dados foram submetidos à análise estatística pelo método de Análises 

dos componentes Principais (PCA), a partir do software SIMCA (Umetrics, Umeå, 

Sweden), que gera gráficos scores e loadings, e possibilitou identificar os 

principais metabólitos alterados em cada tipo de tratamento.  

 

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 

Para avaliar os efeitos induzidos pela variação da disponibilidade hídrica no 

metabolismo de Bauhinia ungulata, várias espécies foram distribuídas em estufa 

agrícola a fim de serem aclimatadas, e posteriormente, submetidas a diferentes 

regimes de irrigação. Os efeitos do déficit hídrico foram avaliados a cada quinze 

dias, durante um período total de noventa dias, através de análises de 

parâmetros fotossintéticos, produção de biomassa e perfil químico por 

ressonância magnética nuclear, e cromatografia líquida de ultra eficiência 

acoplado a espectrômetro de massas de alta resolução. 

Para viabilizar o estudo de metabolômica, numa primeira etapa, foi realizado 

o estudo fitoquímico do extrato foliar por RMN e UHPLC-HRMS, como descrito 

nas seções seguintes. 

 
 

 

 

 



37 
 

 
 

5.1. Análise fitoquímica do extrato de Bauhinia ungulata 
 

Através das análises por UHPLC-HRMS e por RMN, foi possível a 

identificação de 15 substâncias no extrato MeOH 70% das folhas de B. ungulata. 

As estruturas das substâncias são apresentadas na Figura 6. 

Figura 6. Estrutura das substâncias identificadas no extrato MeOH 70% das 

folhas de Bauhinia ungulata por meio de RMN direto do extrato e desreplicação 

por UHPLC-HRMS. 



38 
 

 
 

5.1.1.  Identificação de metabólitos majoritários por RMN 
 

A partir da análise direta do extrato CD3OD:D2O 70% de B. ungulata 

(Figura 7), foram identificados quatro compostos em B. ungulata, previamente 

descritos na literatura em espécies de Bauhina, sendo dois flavonoides (1 e 2), 

um aminoácido (14) e um 4,4’-dihidroxibibenzil (15). 

Figura 7. Expansão do espectro de 1H RMN (de 0,5 a 8,0 ppm), e região de 
sinais caracterísiticos: 1 a 3 ppm para alifáticos; 3,5 a 5,9 ppm para açúcares e 
6 a 8 ppm para aromáticos.  

 

Foram identificados no espectro de RMN de 1H (Figura 8) dois flavonoides 

diferentes (1 e 2). O sistema de spins do dubleto  6,19 (d; J = 2,2 Hz; H-6) 

corresponde aos hidrogênios do anel A das duas moléculas, uma vez que 

apresentaram deslocamento químico semelhante, e integrais superiores (~1,5) 

quando comparadas aos sinais de hidrogênios dos outros sistemas de spins das 

duas moléculas. Já em  6,40 (d; J = 2,2 Hz; H-8), notamos se tratar do 

deslocamento químico para o hidrogênio 8, também do anel A, referente a 

estrutura 1, uma vez que o valor de sua integral (0,5), é equivalente às integrais 

dos demais sinais de hidrogênios presentes na molécula, e se apresentando 

menos intensa quando comparada a integral da estrutura 2, posicionada em  

6,38 (d; J = 2,2 Hz; H-8), cujo valor foi igual a 1, e também equivale as integrais 

dos demais sinais referentes a sua molécula. 

 



39 
 

 
 

A diferença entre as duas estruturas pode ser observada no anel B, que 

apresenta na primeira molécula uma hidroxila no carbono 4’, enquanto na 

segunda molécula, há duas hidroxilas nos carbonos 3’ e 4’. 

Na primeira estrutura molecular (1), são observados dois dubletos de 

diferentes intensidades na região dos aromáticos. São eles:  7,68 (d; J = 8,8 Hz; 

H-2’ e H-6’) e  6,90 (d; J = 8,8 Hz; H-3’ e H-5’), cujas constantes de acoplamento 

e integrais possibilitaram afirmar que é um anel parassubstituído, conformando 

simetria ao anel B. 

Figura 8. Expansão do espectro de RMN de 1H (de 6,0 a 7,8 ppm) de B. 
ungulata, com as integrais e deslocamentos químicos da molécula 1 
(CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27 °C). 

 



40 
 

 
 

O mapa de correlação HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation) 

(Figura 9 e Tabela 2), indica as correlações diretas entre hidrogênios e carbono, 

demonstra que para o 1H em  7,68, há correlação com o carbono em  130,9. 

O hidrogênio  6,90 se correlaciona com o carbono em  115,6. O 1H em  6,40, 

há correlação com o carbono em  94,1. Por fim, para o hidrogênio  6,19, a 

correlação com o carbono é em  99,0. 

 

Figura 9. Expansão do mapa de correlação HSQC (de 6,1 a 7,9 ppm e 30 a 170 
ppm) do extrato de B. ungulata da substância 1 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 
27 °C). 

 

O mapa de correlação à longa distância entre hidrogênios e carbonos 

dada pelo experimento HMBC (Heteronuclear Multiple-Bonde Correlation) 

(Figura 10, Figura 11 e Tabela 2) possibilitou a observação apenas das 

moléculas mais abundantes. O hidrogênio em  7,68, demonstra correlação com 

os carbonos  130,9 (C-2’; C-6’) e 159,4 (C-4’). Já em  6,90, há a correlação 

com os carbonos em  121,7 (C-1’);  144,5 (C-2) e  115,6 (C-3’; C-5’). Para o 

1H em  6,40, as correlações com os carbonos ocorrem em  99,0 (C-6);  164,2 



41 
 

 
 

(C-7);  157,2 (C-9) e  104,7 (C-10). E por fim, o hidrogênio em  6,19, se 

demonstra correlacionado com os carbonos em  161,3 (C-5);  164,2 (C-7);  

94,1 (C-8) e  104,7 (C-10); .  

Figura 10. Expansão do mapa de correlação HMBC (de 6,1 a 7,9 ppm e 30 a 
170 ppm) de B. ungulata da substância 1 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27 
°C). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 11. Correlações entre hidrogênios e carbonos a longa distância à partir 
de HMBC de B. ungulata para a substância 1 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 
27 °C) (setas indicam as correlações observadas). 



42 
 

 
 

A partir dos dados obtidos por Bachheti et al. (2011) a estrutura da 

molécula pôde ser comparada a partir dos deslocamentos químicos, 

multiplicidades, constantes de acoplamento referentes aos hidrogênios, além 

dos deslocamentos químicos dos carbonos evidenciados nos mapas de 

correlação, confirmando-a como canferol. 

 

Tabela 2. Deslocamentos químicos do canferol (1). 

Posição Canferol (CD3OD:D2O – 7:3 v/v) Canferol Literatura (CD3OD) 

δH, mult. 
(J em Hz) 

δC HMBC δH, mult. 
(J em Hz) 

δC 

2  144,5 C   148,1 C 

3  n.d.   137,1 C 

4  n.d.   177,3 C 

5  161,9 C   162,4 C 

6 6,19 (d; 2,2) 99,0 CH 5, 7, 8, 10 6,18 (d; 1,5) 99,2 CH 

7  164,2 C   165,5 C 

8 6,40 (d; 2,2) 94,1 C 6, 7, 9, 10 6,39 (d; 1,5) 94,4 C 

9  157,4 C   158,2 C 

10  104,7 C   104,5 C 

1’  121,7 C   123,7 C 

2’ 7,68 (d; 8,8) 130,9 CH 2’, 4’, 6’ 8,08 (d; 8,8) 130,6 CH 

3’ 6,90 (d; 8,8) 115,6 CH 2, 1’, 3’, 5’ 6,90 (d; 8,8) 116,3 CH 

4’  159,4 C   160,5 C 

5’ 6,90 (d; 8,8) 115,6 CH 2, 1’, 3’, 5’ 6,90 (d; 8,8) 116,3 CH 

6’ 7,68 (d; 8,8) 130,9 CH 2’, 4’, 6’ 8,08 (d; 8,8) 130,6 CH 
n.d: Não detectados pelos mapas de correlação heteronuclear 

 

 

Para a segunda molécula de flavonoide (2), o espectro de RMN de 1H a 

seguir (Figura 12), apresenta dois dubletos na região dos aromáticos. São eles 

 7,26 (d; J = 2,2 Hz; H-2’);  6,64 (d; J = 8,4 Hz; H-5’), além dos anteriormente 

citados, referentes ao anel A. Há, nessa mesma região, um duplo dubleto em  

7,23 (dd; J = 8,4 Hz; 2,2 Hz; H-6’), demonstrando estar acoplado em orto com o 

hidrogênio em  6,64, e acoplado em meta com o hidrogênio em  7,26.  

 

 



43 
 

 
 

Figura 12. Expansão do espectro de RMN de 1H (de 6,1 a 7,8 ppm) de B. 
ungulata, com as integrais e deslocamentos químicos da molécula 2 
(CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27 °C). 

 

O mapa de correlação HSQC (Figura 13 e Tabela 3), indica que o 

hidrogênio em  7,26, há correlação com o carbono em  116,1. O hidrogênio  

7,23 se correlaciona com o carbono em  122,0. O hidrogênio em  6,64, 

demonstra correlação com o carbono em  115,3. Para o 1H em  6,38, a 

correlação com o carbono ocorre em  94,1. E Por fim, para o hidrogênio  6,19, 

há a correlação com o carbono em  99,0. 

 

 

 

 

 

 

 



44 
 

 
 

 

Figura 13. Expansão do mapa de correlação HSQC (de 6,1 a 7,9 ppm e 30 a 
170 ppm) de B. ungulata da substância 2 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27 
°C). 

 

A correlação à longa distância entre hidrogênios e carbonos dada pelo 

experimento HMBC (Figura 14, Figura 15 e Tabela 3), apresenta o hidrogênio 

em  7,26, correlacionado com os carbonos  144,9 (C-3’);  148,2 (C-4’) e  

122,0 (C-6’). Já em  7,23, há a correlação com os carbonos em  116,1 (C-2’) 

e  148,2 (C-4’). No hidrogênio  6,64, as correlações com os carbonos foram 

apresentadas em  122,6 (C-1’) e  143,1 (C-3). Para o 1H em  6,38, as 

correlações com os carbonos ocorrem em  99,0 (C-6);  164,2 (C-7);  157,2 

(C-9) e  104,7 (C-10). Por fim, o hidrogênio em  6,19, se demonstra 

correlacionado com os carbonos em  161,3 (C-5);  164,2 (C-7);  94,1 (C-8) e 

 104,7 (C-10);.   

 

 



45 
 

 
 

Figura 14. Expansão do mapa de correlação HMBC (de 6,1 a 7,9 ppm e 30 a 
170 ppm) de B. ungulata da substância 2 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27°C). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 15. Correlações entre hidrogênios e carbonos a longa distância à partir 
de HMBC de B. ungulata para a substância 2 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 
27 °C) (setas indicam as correlações observadas). 

 

 



46 
 

 
 

A partir dos dados obtidos por Kalegari et al. (2011) a estrutura da 

molécula pôde ser comparada a partir dos deslocamentos químicos, 

multiplicidades, constantes de acoplamento referentes aos hidrogênios, além 

dos deslocamentos químicos dos carbonos evidenciados nos mapas de 

correlação, confirmando-a como quercetina. 

 

Tabela 3. Deslocamentos químicos da quercetina (2). 

Posição Quercetina (CD3OD:D2O – 7:3 v/v) Quercetina Literatura (CD3OD) 

δH, mult. 
(J em Hz) 

δC HMBC δH, mult. 
(J em Hz) 

δC, mult. 

2  n.d.   147,7 C 

3  n.d.   137,1 C 

4  n.d.   177,4 C 

5  161,9 C    162,6 C  

6 6,19 (d; 2,2) 99,0 CH 5, 7, 8, 10 6,18 (d; 2,0) 99,3 CH 

7  164,2 C   165,6 C 

8 6,38 (d; 2,2) 94,1 CH 6, 7, 9, 10 6,39 (d; 2,0) 94,3 CH 

9  157,4 C   158,4 C 

10  104,7 C    104, 4 C 

1’  121,4 C   124,1 C 

2’ 7,26 (d; 2,2) 116,1 CH 3’, 4’, 6’ 7,73 (d; 2,2) 116,0 CH 

3’  144,9 C   146,2 C 

4’  148,2 C   148,8 C 

5’ 6,64 (d; 8,4) 115,3 CH 1’, 3’ 6,8 (d; 8,5) 116,0 CH 

6’ 7,23 (dd; 8,4; 2,2) 122,0 CH 2’, 4’ 7,60 (dd; 8,5; 2,2) 121,8 CH 
n.d: Não detectados pelos mapas de correlação heteronuclear 

 

 

O espectro de RMN de 1H da Figura 16 apresenta seis multipletos 

encontrados na região dos compostos alifáticos, sendo estes  3,93 (m; H-2);  

2,22 (m; H-3);  1,98 (m; H-3);  1,89 (m; H-4);   3,29 (m; H-5) e  3,19 (m; H-5) 

referentes a estrutura da molécula 14. 

 



47 
 

 
 

Figura 16. Expansão do espectro de RMN de 1H (de 1,8 a 4,1 ppm) de B. 
ungulata com as integrais e deslocamentos químicos da molécula 14 
(CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27°C). 

 

O mapa de correlação HSQC (Figura 17 e Tabela 4), indica que o 

hidrogênio em  3,93 é correlacionado com o carbono em  61,3. O hidrogênio 

de  3,29, se correlaciona com o carbono em  46,1. Para o hidrogênio em  

3,20, o carbono correlacionado, está também em  46,1. O 1H em  2,22, 

apresenta correlação com o carbono em  29,2, assim como o hidrogênio em  

1,98. Por fim, o CH2 apresenta seus hidrogênios em  1,89 correlacionados com 

o carbono em  23,9. 

 

 

 

 



48 
 

 
 

Figura 17. Expansão do mapa de correlação HSQC (de 1,6 a 4,2 ppm, e 0 a 130 
ppm) de B. ungulata da substância 14 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27°C). 

 

A correlação a longa distância entre os hidrogênios e carbonos 

apresentada por HMBC (Figura 18, Figura 19 e Tabela 4), apresenta o 1H em  

3,93, correlacionado com os carbonos em  173,5 (C-1);  29,2 (C-3);  23,9 (C-

4) e  46,1 (C-5). Para os hidrogênios posicionados em  3,29 e  3,19, as 

correlações com os carbonos ocorrem em  61,3 (C-2);  29,2 (C-3) e  23,9 (C-

4). Nos hidrogênios  2,22 e  1,98, as correlações foram em  173,5 (C-1);  

61,3 (C-2);  23,9 (C-4) e  46,1 (C-5). Por fim, os hidrogênios de  1,89, foram 

correlacionados com os carbonos em  61,3 (C-2);  29,2 (C-3) e  46,1 (C-5). 

 

 

 

 



49 
 

 
 

 

 

Figura 18. Expansão do mapa de correlação HSQC (de 1,6 a 4,2 ppm, e 10 a 
190 ppm) de B. ungulata da substância 14 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 
27°C). 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 19. Correlações entre hidrogênios e carbonos a longa distância à partir 
de HMBC de B. ungulata para a substância 14 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 
27 °C) (setas indicam as correlações observadas). 

 

 



50 
 

 
 

 

A partir dos dados obtidos por Shintu, Ziarelli e Caldarelli (2004) a 

estrutura da molécula pôde ser comparada a partir dos deslocamentos químicos, 

multiplicidades, constantes de acoplamento referentes aos hidrogênios, além 

dos deslocamentos químicos dos carbonos evidenciados nos mapas de 

correlação, confirmando-a como prolina. 

 

Tabela 4. Deslocamentos químicos da Prolina (14). 

Posição Prolina (CD3OD:D2O – 7:3 v/v) Prolina Literatura (D2O) 

δH, mult. 
 

δC HMBC δH, mult. 
 

δC 

1  173,5 C  - - 

2 3,93 m 61,3 CH 1, 3, 4, 5 4,11 m 58,0 CH 

3 1,98 m – 2,22 m 29,2 CH2 1, 2, 4, 5 2,03 m – 2,32 m 29,0 CH2 

4 1,89 m 23,9 CH2 1, 3, 5 1,95 m 24,0 CH2 

5 3,19 m – 3,29 m 46,1 CH2 1, 3, 4, 5 3,32 m – 3,39 m 46,0 CH2 

 

 

O espectro de RMN de 1H da Figura 20 representa os deslocamentos 

químicos da estrutura da molécula 15. Este apresenta dois dubletos encontrados 

na região dos compostos aromáticos, sendo estes  7,00 (d; J = 8,2 Hz; H-2; H-

2’; H-6; H-6’) e  6,60 (d; J = 8,2 Hz, H-3; H-3’; H-5; H-5’), demonstrando a partir 

de suas constantes de acoplamento, a proximidade entre eles. Há ainda dois 

multipletos situados na região dos alifáticos, em  2,88 (m; H2-7) e em  2,94 (m; 

H2-8). 

 

 

 



51 
 

 
 

Figura 20. Expansão do espectro de RMN de 1H (de 2,0 a 7,5 ppm) de B. 
ungulata com as integrais e deslocamentos químicos da molécula 15 
(CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 27°C). 

 

O mapa de correlação HSQC (Figura 21 e Tabela 5), indica que o 

hidrogênio em  7,00 é correlacionado com o carbono em  131,5. O hidrogênio 

de  6,60 se correlaciona com o carbono em  114,6 (Figura 21 A). E os dois 

hidrogênios apresentados em  2,88 e  2,94, são correlacionados com o 

carbono em  39,7 (Figura 21 B). 

A correlação a longa distância entre os hidrogênios e carbonos 

apresentada pelo HMBC (Figura 22, Figura 23 e Tabela 5), apresentada na figura 

22 A o 1H em  7,00, correlacionado com os carbonos em  39,7 (C-7; C-8);  

114,6 (C-4; C-5; C-3’; C-5’);  131,5 (C-1; C-2; C-2’; C-6’) e  154,8 (C-4; C-4’). 

Para o hidrogênio posicionado em  6,60, as correlações com os carbonos 

ocorrem em  114,6 (C-4; C-5; C-3’; C-5’);  128,8 (C-1; C-1’) e  154,8 (C-4; C-

4’). Nos hidrogênios  2,88 e  2,94 (Figura 22 B), as correlações foram em 128,8 

(C-1; C-1’) e  131,5 (C-1; C-2; C-2’; C-6’).  



52 
 

 
 

 

Figura 21. Superior (A): Expansão do mapa de correlação HSQC para os sinais 
na região dos aromáticos; Inferior (B): Expansão do mapa de correlação HSQC 
para os sinais na região dos alifáticos da substância 15 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 
600 MHz, 27°C). 

  



53 
 

 
 

 

Figura 22. Superior (A): Expansão do mapa de correlação HMBC para os sinais 
na região dos aromáticos; Inferior (B): Expansão do mapa de correlação HMBC 
para os sinais na região dos alifáticos, da substância 15 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 
600 MHz, 27°C). 



54 
 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 23. Correlações entre hidrogênios e carbonos a longa distância à partir 
de HMBC de B. ungulata para a substância 15 (CD3OD:D2O – 7:3 v/v, 600 MHz, 
27 °C) (setas indicam as correlações observadas). 

 

A partir dos dados obtidos por Waibel, et al. (2004) a estrutura da molécula 

pôde ser comparada a partir dos deslocamentos químicos, multiplicidades, 

constantes de acoplamento referentes aos hidrogênios, além dos deslocamentos 

químicos dos carbonos evidenciados nos mapas de correlação, confirmando-a 

como 4,4’-dihidroxibibenzil, ou também nomeado 1,2-Bis-(4-hidroxifenil)-etano. 

 

Tabela 5. Deslocamentos químicos de 1,2-Bis-(4-hidroxifenil)-etano (15). 

Posição Dihidroxiestilbeno (CD3OD:D2O – 7:3 v/v) 1,2-Bis-(4-hidroxifenil)-etano 
literatura (CD3COCD3) 

δH, mult. 
(J em Hz) 

δC HMBC δH, mult. 
(J em Hz) 

δC 

1  128,8 C    

2 7,00 (d; 8,2) 131,5 CH 2, 3, 4, 5, 6, 7 7,01 (d; 8,6) 133,57 CH 

3 6,60 (d; 8,2) 114,6 CH 1, 3, 4, 5 6,72 (d; 8,6) 115,80 CH 

4  154,8 C  8,06 (d; 8,0; OH) 156,31 C 

5 6,60 (d; 8,2) 114,6 CH 1, 3, 4, 5 6,72 (d; 8,6) 115,80 CH 

6 7,00 (d; 8,2) 131,5 CH 2, 3, 4, 5, 6, 7 7,01 (d; 8,6) 133,57 CH 

7 2,88 (m) 39,7 CH2 1, 2, 6, 8 2,74 (s) 38,17 

8 2,94 (m) 39,7 CH2 7, 1’, 2’, 6’ 2,74 (s) 38,17 

1’  128,8 C    

2’ 7,00 (d; 8,2) 131,5 CH 8, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ 7,01 (d; 8,6) 133,57 CH 

3’ 6,60 (d; 8,2) 114,6 CH 1’, 3’, 4’, 5’ 6,72 (d; 8,6) 115,80 CH 

4’  154,8 C  8,06 (d; 8,0; OH) 156,31 C 

5’ 6,60 (d; 8,2) 114,6 CH 1’, 3’, 4’, 5’ 6,72 (d; 8,6) 115,80 CH 

6’ 7,00 (d; 8,2) 131,5 CH 8, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ 7,01 (d; 8,6) 133,57 CH 

 



55 
 

 
 

O estresse oxidativo ocorre como um desequilíbrio entre o balanço pró-

oxidante/antioxidante, sendo que a pró-oxidação é favorecida, e promove dano 

potencial. Esse dano oxidativo que as biomoléculas sofrem é relacionado a 

alguma adversidade biótica ou abiótica (MORAIS, et al., 2009). A partir do 

momento em que a planta sofre estresse oxidativo, pode haver um aumento nos 

radicais livres, fazendo-se necessário recorrer aos antioxidantes, como uma 

forma de promover equilíbrio no sistema fisiológico da planta (BURDA; 

OLESZEK, 2001). 

Substâncias fenólicas são importantes antioxidantes, uma vez que 

possuem esqueleto carbônico propício para a estabilização de radicais livres. É 

notável que a posição e o grau de hidroxilação, são fatores importantes para a 

atividade antioxidante dos metabólitos nas plantas (KWAK, et al, 2017). E os 

flavonoides são moléculas reconhecidas por realizar essa proteção à oxidação 

nas células das plantas (BILIA, et al., 2002). 

Canferol e quercetina são flavonoides que podem ser encontrados na 

forma conjugada a carboidratos, representando uma estratégia de adaptação e 

sobrevivência das plantas, relacionadas a proteção contra radiação UV-B e 

antioxidante como em condições de déficit hídrico, uma vez que fatores como 

esses, promovem o aumento de estresse oxidativo na planta (HARBORNE; 

WILLIAMS, 2000). Para a saúde humana, a quercetina é um importante 

fitoantioxidante (GIL, et al, 2005), que têm sido avaliado no campo terapêutico, 

por conta da sua ação contra radicais livres (KWAK, et al, 2017) e por apresentar 

propriedades hepatoprotetoras (KUMAR; PANDEY, 2013). 

Muitas espécies criam adaptações frente à perda de água via transpiração 

quando a absorção é interrompida. Assim, as estratégias de fechamento 

estomático, possuem grande importância para a manutenção hídrica na planta. 

Após essa resposta inicial admitida por ela, ocorre a síntese de solutos 

osmoticamente ativos, como a do aminoácido prolina (CARVALHO, 2005; 

CORDEIRO, et al., 2017). 

Esse aminoácido, presente em pequenas quantidades na planta, têm sua 

concentração elevada sob condições de estresse, permitindo a osmoproteção 

celular como tampão, evitando efeitos deletérios nas membranas e preservando 

a integridade de compostos como proteínas e enzimas (JALEEL, et al., 2007). E 



56 
 

 
 

a sua forma de ação consiste em promover o seu acumulo nos vacúolos da 

planta, de maneira não nociva ao metabolismo, que estimula a pressão osmótica 

no interior das células, que induz a maior absorção de água, e possibilita assim 

a continuidade nos processos fisiológicos, ainda que em níveis menores 

(MARIJUAN; BOSCH, 2013; MONTEIRO, et al., 2014). 

Sua síntese nas folhas com baixo potencial hídrico é estimulada a fim de 

garantir uma biossíntese aumentada e lenta oxidação nas mitocôndrias. 

Promove estabilização de macromoléculas, e se torna uma alternativa para o 

excesso de agentes redutores, além de ser uma fonte de carbono e nitrogênio 

para serem utilizados após o fim do estresse por déficit hídrico (ZHU, 2002). 

Diversos trabalhos relatam a prolina como marcador bioquímico em 

culturas submetidas a diferentes condições de estresse ocasionado pelo déficit 

hídrico, como a mangabeira (SANTOS, et al., 2016), no açaizeiro (CORDEIRO, 

et al., 2017), no girassol (ARAUJO, et al., 2018) e no feijão (AVILA, et al., 2006).  

Trabalhos anteriores identificaram a presença de diferentes bibenzis em 

folhas de B. ungulata (DE SOUSA, et al, 2016; RODRIGUES, 2019), em que foi 

avaliada e comprovada a sua citoxicidade frente a quatro linhagens tumorais. 

Outros trabalhos identificaram o então 4,4’-dihidroxibibenzil, e a sua importância 

desta substância como agente potencial anticâncer (WITTMAN, 1962; 

NICULESCU-DUVĂZ, et al., 1966). 

O 4,4’-dihidroxibibenzil também tem sido utilizado como fitoestrogênio, 

uma vez que os receptores apresentam capacidade seletiva e sensível a estes 

estrógenos naturais. Estrógenos em geral, são responsáveis por regular o 

sistema reprodutor feminino, manter a densidade mineral óssea, regular perfis 

lipídicos no sangue, e apoiar funções cerebrais, entretanto, seu acúmulo no 

organismo, pode aumentar o risco de câncer de mama e no útero. Todavia, é 

interessante que mulheres no período da menopausa realizem a reposição 

hormonal com estes estrogênios, para evitar os sintomas ocasionados por esta. 

E a fim de evitar quaisquer prejuízos a saúde das mulheres, há a necessidade 

de moduladores seletivos de receptores de estrogênios, que evitem o seu 

excesso e consequentemente, qualquer reprodução de células cancerígenas, 

tornando vantajoso o uso dos fitoesteróis, como 1,2-Bis-(4-hidroxifenil)-etano 

(WAIBEL, et al., 2009; YONEKUBO, et al., 2016). 



57 
 

 
 

O estilbeno é conhecido por elevar a quantidade de High Density 

Lipoprotein (HDL) e ApoA-I, gene codificador da apolipoproteína-A1, a qual 

solubiliza lipídios no plasma sanguíneo. O HDL é responsável por transportar o 

colesterol dos tecidos periféricos ao fígado, onde serão excretados como 

esteróis fecais e ácidos biliares, prevenindo o acúmulo de placas aterosclerótica. 

ApoA-I, é um crítico componente das partículas de HDL, e o aumento de seus 

níveis, demonstrou significativa redução dessas placas, agindo como importante 

protetor cardiovascular (NISSEN, et al., 2003). Análogo ao estilbeno, o 1,2-Bis-

(4-hidroxifenil)-etano, apresentou também habilidade de induzir a expressão do 

gene ApoA-I, demonstrando que a dupla ligação que os diferencia, não é 

essencial para essa atividade biológica (HANSEN et al., 2010). 

 Para a planta, a presença dessa substância, mostra função antioxidante 

para situações com extrema intensidade de raios UV-B, podendo ter seu 

acúmulo também em situações de déficit hídrico (XIAO, et al., 2011), ou até como 

defensor ao ataque de patógenos (DE SOUSA, et al., 2016). 

 

 

5.1.2. Análise do extrato por UHPLC-HRMS e desreplicação por rede de 
moléculas 
 

A identificação dos compostos no extrato MeOH 70% de B. ungulata foi 

obtido através de análises em cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplado 

à espectrômetro de massas de alta resolução (UHPLC-HRMS2) e desreplicação 

por rede de moléculas (Figura 24).  

 

 

 

 

 

 



58 
 

 
 

 

Figura 24. Cromatograma analítico do extrato MeOH 70% de Bauhinia ungulata 
obtido por UHPL-HRMS em modo positivo, com aproximação da região até 3 
minutos do tempo de retenção e picos identificados pelo número de cada 
molécula respectiva. Condições cromatográficas em MM. 

 

Uma vez que foi realizado um gradiente de eluíção exploratório genérico 

para análise cromatográfica do extrato (ver condições do gradiente em MM no 

tópico 4.7), há a possibilidade de acontecer a coeluição de diferentes 

substâncias no mesmo tempo de retenção. A etapa de deconvolução, um 

algoritmo desenvolvido recentemente, permite separar todas as massas 

detectadas que ocorrem em um único pico, e analisar as intensidades nas 

diferentes amostras. 

Após o processamento dos dados (m/z, tempo de retenção e intensidade 

do sinal), foi criada uma lista de picos com 1579 (MS1) íons que posteriormente, 

foi filtrada em uma segunda lista de picos com 823 íons contendo espectros de 

segunda ordem (MS1 e MS2). Essa segunda lista foi então organizada na forma 

de uma única rede de moléculas através da plataforma Global Natural Products 

Social Molecular Networking (GNPS) (Figura 25).  

 



59 
 

 
 

Figura 25. Rede de moléculas do extrato MeOH 70% de Bauhinia ungulata. A) 
Molecular network contendo 64 clusters. B) Cluster selecionado com os 
compostos majoritários do extrato com base na intensidade do sinal, 
representada no tamanho dos nodos.  

 

A partir da rede de moléculas construída (Figura 25A), foi possível 

organizar os espectros de massas de segunda ordem por similaridade e agrupar 

estruturas de uma mesma família de compostos. A intensidade do sinal do 

massas foi representada no tamanho do nodo, o que nos permitiu selecionar 

clusters de compostos com alta intensidade no cromatograma obtido. Neste 

trabalho, selecionamos clusters contendo anotação de compostos de uma 

mesma família com alta intensidade. Seguindo este critério, um cluster contendo 

flavonoides foi selecionado e a identificação dos compostos investigada (Figura 

25B). 

A comparação entre os espectros experimentais obtidos do extrato com 

bibliotecas espectrais disponíveis na plataforma GNPS, possibilitou a anotação 

de doze metabólitos presentes no cluster 1. Na Tabela 6 são apresentadas as 

substâncias desreplicadas de acordo com a base de dados e suas estruturas 

relativas na forma de InChi Key. 

 



60 
 

 
 

Tabela 6. Substâncias identificadas em extrato MeOH 70% de Bauhinia ungulata 
obtido por UHPL-HRMS em modo positivo. 

*DB = Base de dados **InChiKey = International Chemical Identifier Key 

 

Seguindo esta abordagem, foi possível identificar diferentes flavonoides 

glicosilados derivados das agliconas miricetina, quecetina, canferol, 

isorhamnetina e datiscetina (Tabela 7).  

Dentre as 12 substâncias identificadas, apenas quatro delas já haviam 

sido reportadas em folhas de B. ungulata anteriormente, sendo elas a miricetina 

(3) (GANIKKO-DUTRA; SALDANHA; DOKKEDAL, 2018); quercetina-3-O-

ramnosídeo (7) (MAIA NETO, et al., 2008), canferol-3-ramnosídeo (9) (PAULA, 

et al., 2014), e quercetina (2) (MAIA NETO, et al., 2008; PAULA, et al., 2014; DE 

SOUZA, et al., 2016; GANIKKO-DUTRA; SALDANHA; DOKKEDAL, 2018). 

Já os compostos Miricetina-3-O-ramnosídeo (4); Miricetina-3-

galactosídeo (5); Miricetina-3- xilosídeo (6); Quercetina-3-O-xilosídeo (8); 

Canferol-3-O-rutinosídeo (10); Canferol-3-O-alpha-L- arabinosídeo (11); 

ID Composto 
correspondente na DB* 

Fórmula 
molecular 

tR (min) m/z [M+H]+ InChi Key** 
da estrutura relativa 

3 Miricetina  C15H11O8 1,39 319,0438 IKMDFBPHZNJCSN 

4 Miricetina-3-O-ramnosídeo  C21H21O12 1,39 465,1013 DCYOADKBABEMIQ 

5 Miricetina-3-galactosídeo  C21H21O13 1,24 481,0966 FOHXFLPXBUAOJM 

6 Miricetina-3- xilosídeo  C20H19O12 1,36 451,0856 SBEOEJNITMVWLK 

2 Quercetina  C15H1107 1,61 303,0483 REFJWTPEDVJJIY 

7 Quercetina-3-O-ramnosídeo  C21H21O11 1,61 449,1056 OXGUCUVFOIWWQJ 

8 Quercetina-3-O-xilosídeo  C20H19O11 1,56 435,0897 PZZRDJXEMZMZFD 

9 Canferol-3-ramnosídeo  C21H21O10 1,81 433,1127 SOSLMHZOJATCCP 

10 Canferol-3-O-rutinosídeo  C27H31O15 1,47 595,1625 RTATXGUCZHCSNG 

11 Canferol-3-O-alpha-L- 
arabinosídeo 

C20H19O10 1,74 419,0966 RNVUDWOQYYWXBJ 

12 Isorhamnetina-3-O-
rutinosídeo  

C28H33O16 1,55 625,1730 UIDGLYUNOUKLBM 

13 Datiscetina  C15H11O6 1,82 287,0546 WCNLFPKXBGWWDS 



61 
 

 
 

Isorhamnetina-3-O-rutinosídeo (12) e Datiscetina (13) foram identificados pela 

primeira vez em B. ungulata. 

 

Tabela 7. Substâncias já reportadas nas folhas de outras espécies de Bauhinia.  

 

Os resultados obtidos demonstram que a desreplicação por meio de rede 

de moléculas se mostrou eficiente na identificação de compostos já reportados 

em B. ungulata além de outros compostos previamente identificados em outras 

espécies do genêro. 

Portanto, após a etapa de identificação das substâncias presentes no 

extrato de B. ungulata, foram realizados estudos para avaliar possíveis 

alterações no acúmulo dessas substâncias além de parâmetros fotossintéticos 

responsáveis pelo desenvolvimento vegetal. 

 

 

 

 

 

 

Nome do composto Espécie Referência 

Miricetina B. longifolia SALATINO, et al., 1999 

Miricetina-3-galactosídeo B. longifolia DOS SANTOS, et al., 2014 

Miricetina-3-O-ramnosídeo B. longifolia; B. forficata; B. 

variegata; B. affins 

AQUINO, 2018 

Quercetina B. longifolia; B. variegata. AQUINO, 2018 

Quercetina-3-O-ramnosídeo B. longifolia DOS SANTOS, et al, 2014 

Canferol-3-ramnosídeo B. uruguayensis IRIBARREN; POMÍLIO, 1989 

Canferol-3-O-rutinosídeo B. forficata EL-DONDAITY, et al., 2005 

Isorhamnetina-3-O-rutinosídeo B. variegata FARIAS; MENDEZ, 2014 



62 
 

 
 

5.2. Análise dos efeitos induzidos pela variação da disponibilidade hídrica 
 

5.2.1. Análise dos parâmetros fotossintéticos 
 

a) Análise da condutância estomática 
 

A análise dos valores médios de condutância estomática ao CO2 (gs) 

durante o período do experimento, não mostrou aumento significativo da 

abertura estomática dos grupos 7D e 15D a partir da 4ª coleta, quando 

comparados com o grupo controle (Figura 26). 

Figura 26. Média da condutância estomática média ao CO2 (gs), dos espécimes 
de B. ungulata, nos diferentes grupos: irrigação diária (controle) e submetidos a 
7 e 15 dias sem irrigação, durante as seis coletas no experimento. (Teste de 
Tukey; n=3; p<0,05). 

 

O processo de abertura e fechamento dos estômatos é determinado pelo 

balanço entre o teor de água presente no solo e nas folhas das plantas (COSTA; 

MARENGO, 2007). Em situações de baixa disponibilidade hídrica a resposta 

inicial da planta é impedir que haja perda de água nos seus tecidos e prevenir 

dessecação (SILVA, et al., 2009).  

Assim que as raízes notam menor disponibilidade hídrica no solo, o ácido 

abscísico induz o fechamento dos estômatos para evitar perda de água por 

transpiração (TURNER, et al, 2001). Analisar a condutância estomática, é o 

parâmetro mais frequentemente usado para avaliar o grau de seca (CORNIC; 

MASSACCI, 1996). As plantas dos grupos 7D e 15D, ao se encontrarem em 



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situação deficitária ao longo de 60 dias com a irrigação descontínua, respondeu 

de forma imediata a situação imposta, evitando a sua abertura estomática e a 

desidratação. 

 

 b) Análise da taxa de transpiração 

 

Em paralelo, a condutância estomática ao CO2, a transpiração dada em 

mmol de H2O.m-².s-1, apresentou redução significativa entre os tratamentos 7D 

e 15D, quando comparadas ao grupo controle a partir da quarta coleta (Figura 

27). Essa redução na taxa transpiratória permite que a planta não perca água de 

seus tecidos para o ambiente, viabilizando manter seu metabolismo ativo, 

mesmo que de forma mais lenta (KARTHIKA, et al, 2019). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 27. Média da Transpiração (E), dos espécimes de B. ungulata, nos 
diferentes grupos: irrigação diária (controle) e submetidos a 7 e 15 dias sem 
irrigação, durante as seis coletas no experimento. (Teste de Tukey; n=3; p<0,05). 

 

c) Concentração de CO2 na cavidade subestomática 
 

 Foi determinado anteriormente por Yokota, et al. (2002), que o resonsável 

principal da diminuição da fotossíntese é o fechamento estomático em situações 

de seca moderada. O estresse por déficit hídrico prolongado induz limitações 

relacionadas ao metabolismo do mesófilo, sendo uma limitação fotossintética 



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não-estomática. Outro exemplo, é em condições de seca muito severa, ocorre a 

diminuição da fotossíntese líquida devido a um declínio na atividade de rubisco, 

ou então, diminuição na adenosina trifosfato, principal fator limitante da atividade 

fotossintética (BOTA; FLEXAS; MEDRANO, 2004). 

 Para determinar se valores obtidos pela análise da assimilação de gás 

carbônico foi alterada por limitações estomáticas ou não-estomáticas, é 

necessário que seja analisada também a concentração de CO2 na cavidade 

subestomática (Figura 28), a fim de responder se, caso houver um aumento de 

gás carbônico nessa região, qual outra área da planta não está com seu 

funcionamento normal, prejudicando então a atividade fotossintética (CECHIN, 

et al., 2008). 

Figura 28. Concentração de CO2 (Ci), dos espécimes de B. ungulata, nos 
diferentes grupos: irrigação diária (controle) e submetidos a 7 e 15 dias sem 
irrigação, durante as seis coletas no experimento. (Teste de Tukey; n=3; p<0,05). 

  

Bem como é apresentado na Figura 28, é possível analisar que não houve 

alterações na concentração de CO2 na cavidade subestomática ao longo do 

experimento em todos os tratamentos. Isso leva a crer, que qualquer alteração 

que surgiu na atividade fotossintética nos espécimes de B. ungulata, teve como 

responsável à sua limitação, apenas fatores estomá