UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL QUALIDADE DE BRÓCOLIS E CAJU SUBMETIDOS A ATMOSFERAS HIPERBÁRICAS Emmanuel Moreira Pereira Engenheiro Agrônomo 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL QUALIDADE DE BRÓCOLIS E CAJU SUBMETIDOS A ATMOSFERAS HIPERBÁRICAS Discente: Emmanuel Moreira Pereira Orientador: Dr. Ben-Hur Mattiuz Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Agronomia (Produção vegetal) 2019 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal. Dados fornecidos pelo autor. Essa ficha não pode ser modificada. Pereira, Emmanuel Moreira Qualidade de brócolis e caju submetidos a atmosferas hiperbáricas / Emmanuel Moreira Pereira. -- Jaboticabal, 2019 88 p. : tabs., fotos Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal Orientador: Ben-Hur Mattiuz 1. Pós-colheita. 2. Anacardium occidentale L. 3. Brassica oleracea var. itálica. 4. Pressão hiperbárica. I. Título. P436q DADOS CURRICULARES DO AUTOR Emmanuel Moreira Pereira, nascido em Alexandria, Rio Grande do Norte, no dia 07 de janeiro de 1990. Filho de Flamaliel Fábio Pereira e Joaquina Ionete Fernandes Moreira Pereira. Em 2009, ingressou no curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de Campina Grande, câmpus de Pombal. Durante toda a graduação realizou estágio na área de Pós-colheita, sendo bolsista de Iniciação Científica do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), no período de 2010 a 2012. Com defesa da monografia em fevereiro de 2014, recebeu o título de Engenheiro Agrônomo. Em março de 2014 ingressou no curso de mestrado em Engenharia Agrícola, na área de concentração de Processamento e Armazenamento de Produtos Agrícolas, da Universidade Federal de Campina Grande de Campina Grande/UFCG. Em fevereiro de 2016 obteve o título de mestre em Engenharia Agrícola (Processamento e Armazenamento de Produtos Agrícolas) pela Universidade Federal de Campina Grande, com a dissertação intitulada “Produção de farinha obtida de brotos de palma”. Em Agosto de 2016 iniciou o curso de Doutorado em Agronomia (Produção Vegetal) na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, localizada na cidade de Jaboticabal - São Paulo, na linha de pesquisa em Pós-colheita, sendo bolsista da CAPES. Em Março de 2018 iniciou o curso de especialização em Ciências dos Alimentos, pela Universidade Federal de Pelotas de Pelotas-RS, com trabalho de conclusão de curso intitulado “Conservação de goiaba vermelha ‘Pedro Sato’ pelo uso de recobrimento à base de quitosana e gelatina pela técnica layer-by-layer”, recebendo o título de especialista em Ciência dos Alimentos em Março de 2019. Atualmente é servidor público da Universidade Federal da Paraíba, Câmpus Bananeiras – Paraíba. Se cheguei até aqui foi porque me apoiei no ombro dos gigantes. Isaac Newton Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz somente até onde os outros foram. Alexandre Graham Bell Tudo é do Pai, toda honra e toda glória; é Dele a vitória alcançada em minha vida Padre Fábio de Melo Primeiramente a Deus, pois sempre foi meu pilar nos momentos mais difíceis, dando-me força e perseverança. A meus pais, Flamaliel e Joaquina, a meu irmão Ivo Lucas por serem as pessoas mais importantes para mim e os que me ensinaram os valores da vida, sinônimos de honestidade, humildade e amor. Obrigado por serem exemplo de perfeição e dedicação a nossa família. In memória do meu avô, Gregório Moreira, minha tia avó Maria de Lurdes, ao meu padrinho João Benicio e meu tio Ricardo, pois sempre encontrei apoio e dedicação. Eternas Saudades Aos meus amigos e familiares que acreditaram em mim e me incentivaram para a realização deste trabalho. DEDICO AGRADECIMENTOS À Deus, que sempre esteve presente em minha vida, possibilitando esta conquista. À minha família, que sempre apoiaram e dedicaram suas vidas à minha educação não medindo esforços para que pudesse conclui-la. Ao meu orientador Prof. Ben-Hur Mattiuz e sua esposa Profa Claudia Mattiuz, pela oportunidade e que sempre me deu apoio me orientando a traçar os melhores caminhos, o meu muito obrigado. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, pela infraestrutura. À Comissão do Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal), pela realização do curso de doutorado. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. À empresa Val frutas pelo fornecimento dos frutos. À toda equipe do Laboratório de Tecnologia Pós-Colheita da Unesp/FCAV, em especial a Anderson Formiga, José Pinsetta Junior, Isabela Cordeiro, Karolayne Emiliano e Ariadne Marino pela amizade e as valiosas contribuições durante essa jornada e aos demais membros do grupo de Pós-colheita que de forma direta ou indireta contribuíram na realização deste trabalho. Aos colegas de trabalho Hemmannuella Costa, Leandro Firmino, Welliton Barros, Suziane Regis, Kilma Silva, Richelita Casali e Daniel Mendes aos quais tenho imensa admiração e estima. Aos amigos da república toca fogo que foram minha família durante esse período de pós-graduação. E a todos que contribuíram de alguma maneira para a conclusão deste trabalho, e desta etapa da minha vida. vii SUMÁRIO Página CAPÍTULO 1 - Considerações gerais ....................................................................... 3 1. Introdução ............................................................................................................ 3 2. Revisão de literatura ............................................................................................ 5 3. Referências ........................................................................................................ 10 CAPÍTULO 2 - Altas pressões na conservação pós-colheita de brócolis ......... xiii 1. Introdução .......................................................................................................... 16 2. Material e métodos ............................................................................................. 17 3. Resultados e discussão ..................................................................................... 22 4. Conclusões ........................................................................................................ 36 5. Agradecimentos ................................................................................................. 36 6. Referências ........................................................................................................ 37 CAPÍTULO 3 - Tratamentos hiperbáricos no aumento da vida útil de caju ........ xli 1. Introdução .......................................................................................................... 43 2. Material e métodos ............................................................................................. 44 3. Resultados e discussão ..................................................................................... 51 4. Conclusões ........................................................................................................ 78 5. Agradecimentos ................................................................................................. 78 6. Referências ........................................................................................................ 78 APÊNDICE ............................................................................................................. 87 1 Qualidade de brócolis e caju submetidos a atmosferas hiperbáricas Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade pós-colheita de caju e brócolis ‘Legacy’ após diferentes períodos de altas pressões. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Tecnologia Pós-colheita da FCAV-UNESP, Câmpus de Jaboticabal, utilizando inflorescências e cajus provenientes de produções comerciais da região de Taiuva e Taquaritinga-SP. O primeiro experimento submeteu-se as inflorescências aos níveis de pressão hiperbárica aplicados foram 100 (controle), 200, 400, 600 e 800 kPa a temperatura de 22±1°C, durante 1, 2 e 3 dias. O segundo experimento consistiu em submeter os cajus às condições de pressão anteriormente durante 1, 2 e 4 dias, e por mais 2 dias em condição de ambiente (22°C, 50% UR). Foram realizadas análises para avaliar a qualidade pós-colheita (perda de massa, firmeza, coloração da casca, teor de sólidos solúveis, acidez titulável, taxa respiratória, produção de etileno ácido ascórbico, atividade antioxidante total, teor de taninos, peroxidacão de lipídeos e atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POD). A pressão de 800 kPa a 22°C diminuiu a perda de massa. A mesma tendência foi observada para a firmeza. As altas pressões (400, 600 e 800 kPa) influenciaram a menor taxa respiratória dos brócolis e cajus. Observou-se uma relação diretamente proporcional entre a pressão aplicada e a diminuição do teor de taninos nos cajus, ocorrendo a redução da síntese desse composto fenólico. Por outro lado, as maiores pressões (400, 600 e 800 kPa) também influenciaram aumento da atividade enzimática da CAT e diminuição das POD, enzimas relacionadas com a senescência dos frutos. As pressões hiperbáricas no intervalo de 400 a 800 kPa mostraram ser eficazes na conservação pós-colheita dos brócolis e cajus. Palavras chave: Anacardium occidentale L., Brassica oleracea var. itálica, altas pressões, conservação, amadurecimento. 2 Quality of broccoli and cashew submitted to hyperbaric atmospheres Abstract - The objective of this work was to evaluate the postharvest quality of cashew and broccoli 'Legacy' stalks after different periods of high pressure. The experiments were carried out at the Post Harvest Technology Laboratory of FCAV- UNESP, Jaboticabal Campus, using inflorescences and cashews from commercial productions from Taiuva and Taquaritinga-SP. The first experiment submitted inflorescences to hyperbaric pressure levels of 100 (control), 200, 400, 600 and 800 kPa at 22 ± 1 ° C for 1, 2 and 3 days. The second experiment consisted of subjecting the cashews to pressure conditions previously for 1, 2 and 4 days, and for 2 more days at ambient conditions (22 °C, 50% RH). Analyzes were performed to evaluate postharvest quality (mass loss, firmness, peel color, soluble solids content, titratable acidity, respiratory rate, ethylene ascorbic acid production, total antioxidant activity, tannin content, lipid peroxidation and activity of the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) .The pressure of 800 kPa at 22 °C decreased the mass loss. The same tendency was observed for the firmness. The high pressures (400, 600 and 800 kPa) influenced the lower respiratory rate of broccoli and cashews, and a directly proportional relationship was observed between the pressure applied and the reduction of tannin content in the cashews, reducing the synthesis of this phenolic compound. Pressures (400, 600 and 800 kPa) also influenced increased CAT enzymatic activity and decreased POD, enzymes related to fruit senescence. The pressures from 400 to 800 kPa have been shown to be effective for postharvest conservation of broccoli and cashews. Keywords: Anacardium occidentale L., Brassica oleracea var. italica, high pressures, conservation, ripening. 3 CAPÍTULO 1 - Considerações gerais 1. Introdução Frutas e hortaliças são importantes fontes de vitaminas, minerais, fibras, e outros compostos bioativos, além de apresentarem baixos valores energéticos, fazendo de seu consumo em níveis adequados um importante fator protetor para morbidade (doenças cardiovasculares, hipertensão, diabetes e alguns tipos de câncer) e mortalidade (Brasil, 2014; Resende et al., 2016). As frutas e hortaliças possuem tempo de prateleira é curto, deteriorando-se rapidamente e sua estocagem por longos períodos é tecnicamente inviável, fato que exige rapidez no seu processo de comercialização, desde a sua produção até o consumidor final (Martins, Margarido, Bueno, 2007). Dentre as frutas e hortaliças que mais são comercializadas no estado de São Paulo, destaca-se o brócolis de cabeça única e o caju, que possuem tempo de vida útil curto e alto valor agregado, com técnicas caras de conservação para aumento da vida de prateleira, como a refrigeração que encarece o custo do produto. O brócolis (Brassica oleracea var. italica) é uma hortaliça pertencente à família Cruciferaceae atual Brassicaceae, que apresenta-se como boa fonte de betacaroteno, vitamina C, selênio, fibra, luteína, zeaxantina, vitamina K, ácido fólico e minerais como cálcio, potássio, fósforo e enxofre, que contribuem para os efeitos promotores da saúde (Carvalho et al., 2006, Agte et al., 2000). O brócolis possui alta perecibilidade, apresentando vida útil restrita a apenas 2 dias em temperatura ambiente (23 ºC) (Gioppo, 2011). O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é originário da região Amazônica brasileira. A fruta do cajueiro é formada por um pseudofruto, sendo esse o pedúnculo desenvolvido e suculento, e pela castanha, que é o fruto verdadeiro do tipo aquênio reniforme com pericarpo rígido e coloração verde-cinza (Lima, 1988; Vaughan e Geissler, 1997), com uma vida útil restrita a 48 horas após a colheita em temperatura ambiente (23 ºC). 4 O tratamento hiperbárico é um tratamento físico que consiste em armazenar o produto vegetal em um ambiente com pressão parcial de oxigênio artificialmente elevada para valores acima de 21 kPa. Pesquisas recentes demostram a possibilidade do uso de pressões hiperbáricas para retardar os mecanismos fisiológicos de amadurecimento e senescência em vegetais. Inestroza-Lizardo et al. (2018) verificaram que aplicações de pressão hiperbárica possibilitaram retardo no amadurecimento de tomate cv. ‘Débora’, evidenciado pela redução da taxa respiratória e pela pouca mudança na coloração dos frutos, quando comparados ao controle. Além disso, autores observaram a manutenção da massa fresca e da firmeza, em frutos tratados com alta pressão quando comparados aos frutos de tomates sem esse tratamento (Vigneault et al., 2012; Liplap et al., 2013). Esta técnica visa também a economia de energia, pois este processo utiliza apenas entre 2-6% da energia necessária na refrigeração, visto que a pressurização não precisa ser instantânea e é necessário pouca energia para manter a pressão ao longo do armazenamento (Vigneault et al., 2012). Além disso, há indícios que a técnica pode provocar um estresse específico no vegetal, dando origem a respostas biológicas benéficas (hormesis), como o aumento da síntese de licopeno em tomates, evidenciado por Goyette et al. (2012b) e Liplap et al. (2013), e da produção de fitoalexinas, induzindo resistência contra patógenos, como o Botrytis cinerea (Romanazzi, Nigro, Ippolito, 2008). Apesar de resultados promissores terem sido publicados em relação ao uso de pressões hiperbáricas na conservação pós-colheita de frutas e hortaliças, as pesquisas geradas ainda são de caráter exploratório, com limitações sobre o conhecimento dos efeitos fisiológicos e de sistema antioxidante. Aliado a isso, não há pesquisas desenvolvidas desta tecnologia, com caju e brócolis, limitando o desenvolvimento da técnica como uma alternativa na pós-colheita de frutas e hortaliças. Neste sentido, este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da aplicação de pressões hiperbáricas em temperatura de ambiente (22 °C), na qualidade pós- colheita de brócolis e caju. 5 2. Revisão de literatura 2.1 O brócolis O brócolis (Brassica oleracea var. itálica), é uma hortaliça que pertence à família das Brassicaceaes, possui cor verde escura e inflorescência central compacta ou inflorescências laterais (tipo ramoso) (Filgueira, 2005). É originária da Costa do Mediterrâneo e cresce de forma satisfatória na maioria das regiões do mundo. O cultivo durante os meses de temperatura amena proporciona a planta melhor desenvolvimento e melhor aparência (Tavares, 2000). No Brasil, seu cultivo é realizado em todo país, principalmente nos cinturões verdes dos estados de São Paulo e Minas Gerais. A maior parte da produção é destinada ao mercado in natura em feiras livres, quitandas e supermercados. Somente no primeiro semestre de 2017 a Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP), comercializou o equivalente a 8,4 toneladas de brócolis no estado de São Paulo (Agrinual, 2018). O brócolis possui alta perecibilidade, apresentando vida útil restrita a apenas 2 dias em temperatura ambiente (Gioppo, 2011), após esse período perde massa fresca, assim como a perda da coloração verde. Sua senescência é rápida devido à elevada produção de etileno e da taxa respiratória, fazendo-se necessário o uso da refrigeração para prolongar a vida útil deste vegetal; contudo essa é uma tecnologia cara, que onera o processo de produção. Como explicam Raghavan et al. (2004), a refrigeração é uma tecnologia que requer um alto consumo energético, além de não permitir sua implementação em regiões não servidas pela energia elétrica. Outras técnicas são utilizadas para o prolongamento da vida útil desse vegetal, como diferentes concentrações de O2 e de CO2 na atmosfera, conseguiram diminuição da taxa respiratória e prolongamento da vida de prateleira de até 4 dias quando comparados com o tratamento controle (Kader et al. 1989). Redução da temperatura (Salveit, 1999) que proporciona o aumento na vida de prateleira. Able et al. (2003) e Ku e Wills (1999) com aplicação de 1-Metilciclopropeno (1-MCP) no escuro e na temperatura de armazenamento de 10 e 8 ºC, obtiveram aumento no tempo de armazenamento de 21 e 67% respectivamente, quando comparados com 6 os vegetais não tratados. Contudo, na utilização de atmosfera controlada necessita- se de refrigeração, tornando-se uma tecnologia cara com os custos da implantação da atmosfera modificada além da refrigeração, assim como a aplicação de 1-MCP. 2.2 O caju O caju é constituído por uma parte denominada castanha (fruto), a qual é processada industrialmente (torrada) e apresenta maior relevância econômica; e o pseudofruto ou pedúnculo carnudo, botanicamente denominado de hipocarpo também conhecido como maçã de caju, cuja polpa é consumida in natura ou utilizada no preparo de sucos, compotas, doces, etc. O caju desempenha papel importante na economia da região nordeste (Souza et al., 2016). O Brasil lidera o ranking com 1,7 milhões de toneladas, seguido por Madagascar (75 mil toneladas), Mali (70 mil toneladas) e Guiana (5 mil toneladas) (Faostat, 2018). Dentre os estados brasileiros produtores de caju com destino in natura (pedúnculo), destaca-se São Paulo, com um volume de comercialização de 673 toneladas de caju por ano, movimentando cerca de 12,3 milhões de reais por ano, o que corresponde preço médio de R$ 18,23 por quilo da fruta (Agrinual, 2019). O caju possui teores significativos de ácido ascórbico e carotenoides e alto potencial antioxidante (Lopes et al., 2012). Compostos fenólicos como ácidos fenólicos, flavonoides e taninos também foram identificados no caju (Brito et al., 2007, Michodjehoun-Mestres et al., 2009). O caju é classificado como não-climatérico, com baixa produção de etileno, porém, alta atividade respiratória, resultando em período de vida útil curta, em torno de 48 horas após colhido e armazenado a temperatura ambiente (22 ºC) (Moura et al., 2010). Apresenta acentuada perda de massa fresca e firmeza, além de elevado índice de podridões. Há falta de técnicas de manejo pós-colheita adequadas que, juntas, contribuem para quase 80% de perda de produção, além da grande fragilidade do 7 caju, a estação de crescimento/produção é restrita ao segundo semestre do ano no país (Souza et al., 2016). Tecnologias têm sido empregadas para manter a qualidade pós-colheita do caju, bem como estender o tempo de armazenamento da fruta. Moura et al. (2010), utilizaram temperatura baixa, em torno de 3 ºC, umidade relativa de 85%, sob atmosfera modificada, e obtiveram aumento da vida útil dos cajus, chegando a 14 dias de vida util. Moura et al. (2009), utilizaram filmes de PVC na conservação dos cajus com refrigeração à temperatura de 7 ºC, chegando a uma vida útil de aproximadamente 14 dias. 2.3 Atmosfera hiperbárica Na pós-colheita, o uso de pressões hiperbáricas tem sido considerado um método físico promissor para a conservação de frutas e hortaliças. Esta técnica consiste em submeter os produtos frescos a pressão de 100 a 1000 kPa, utilizando- se para isto um fluxo constante de ar comprimido, por um período de algumas horas ou dias (Goyette et al., 2012a). Trabalhos recentes demonstram a possibilidade do uso de pressões hiperbáricas para retardar os mecanismos fisiológicos de amadurecimento e de senescência em vegetais. Pesquisas de Inestroza-Lizardo et al. (2018) verificaram que aplicações de pressão hiperbárica (200, 400, 600 e 800 kPa) possibilitaram retardo no amadurecimento de tomate cv. ‘Débora’, evidenciado pela redução da taxa respiratória e pela pouca mudança na coloração dos frutos, quando comparados ao controle. Além disso, esses autores observaram a manutenção da massa fresca e da firmeza, em frutos tratados com alta pressão quando comparados aos frutos de tomates do controle. Diversas pesquisas mostram que o uso de pressões hiperbáricas pode influenciar, direta ou indiretamente, a fisiologia pós-colheita e a manutenção da qualidade de algumas frutas e hortaliças. Concretamente, Baba e Ikeda (2003) reportaram a diminuição da taxa respiratória e da produção de etileno de frutos de umezeiro (Prunus mume L.), quando submetidos a pressões de 0,5 a 5 MPa durante 10 min e mantidos a 0,5 MPa durante 5 dias. O tratamento hiperbárico foi proposto 8 como alternativa para alfaces armazenadas por um curto período sem refrigeração (Liplap et al., 2014). Os autores observaram que alfaces submetidas a 850 kPa durante 5 dias à 20 °C, apresentaram taxas respiratórias estáveis, maior turgescência, conteúdo de clorofila e qualidade visual, em relação aquelas não tratadas (100 kPa a 20 °C). Pesquisas de Goyette et al. (2012a, b) verificaram que aplicações de pressão hiperbárica em tomates possibilitaram retardo no amadurecimento dos frutos tratados, demonstrado pela redução da taxa respiratória de até 22% e da coloração quando comparado ao controle; pela perda da massa fresca diária dos tomates armazenados a 1 atm que foi de 2,73% e de apenas 0,47% nos armazenados a 5 atmabs. Além disso, os autores observaram retardo da coloração e firmeza, quando comparados aos frutos sob pressão ambiente. As pressões hiperbáricas diferem dos tratamentos de alta pressão em alimentos (100000 e 1200000 kPa) (Goyette et al., 2007), as quais são consideradas elevadas para frutas e hortaliças frescas, pois ocasionariam danos irreversíveis nos tecidos, sendo utilizados em alimentos processados (Ahmed e Ramaswamy, 2006; Yi et al., 2016). Estes resultados demostraram que o tratamento hiperbárico aplicado a diferentes frutas e hortaliças pode ter uma complexa diversidade de respostas fisiológicas e as condições ideais para preservá-las podem ser diferentes, dependendo do produto, induzido a produção/manutenção de compostos antioxidantes, durante e/ou após o período de pressão. Pesquisas têm sido conduzidas sobre a possível influência desta técnica no sistema antioxidante enzimático e não enzimático das frutas e hortaliças, o que daria origem a respostas biológicas benéficas (hormesis) como o aumento na produção de compostos antioxidantes (Inestroza-Lizardo, 2017). Goyette (2010) verificou retardo da síntese de licopeno de tomates submetidos a diferentes níveis de pressão hiperbárica, quando comparados aos frutos controle. Entretanto, após a retirada dos tomates da condição de pressão, e deixados completar o amadurecimento, os pesquisadores constataram aumento significativo de 26% do teor de licopeno dos frutos tratados, em relação aos frutos à pressão ambiente. 9 Isso indica que mudanças no metabolismo antioxidante em plantas ocorrem geralmente em resposta a mudanças nas condições ambientais. Por exemplo, baixas temperaturas e altas concentrações de O2 em torno da fruta podem resultar no acúmulo de peróxido de hidrogênio (Prasad; Anderson; Stewart, 1994). Este composto é reativo e causa peroxidação lipídica e desnaturação protéica (Halliwell; Gutteridge, 1989). Dessa forma, para minimizar os efeitos danosos resultantes da ação desses compostos há ativação do sistema de defesa antioxidante enzimático, que envolve oxirredutases como a superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) e do sistema antioxidante não enzimático, que promove a síntese de compostos como GSH (glutationa reduzida), ácido ascórbico, α-tocoferol, betacaroteno, licopeno e polifenóis (Mallick; Mohn, 2000). Segundo Gill e Tuteja (2010) os estresses abióticos levam à superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROS) nos vegetais. Esses compostos são altamente reativos e tóxicos, causando danos às proteínas, lipídios, carboidratos e DNA, resultando em estresse oxidativo. Dessa forma, para prevenir lesões devido a esse tipo de estresse, a célula vegetal desenvolve mecanismos de defesa que envolvem alguns compostos metabólicos não enzimáticos (flavonoides, ligninas, ácido ascórbico, α-tocoferol, betacaroteno, licopeno e polifenóis) e algumas enzimas como a superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) (Gonzalez-Aguilar et al., 2010). O aumento da síntese desses compostos bioativos, especialmente em caju e brócolis, se reveste de importância dada a associação destes com a prevenção de importantes doenças humanas, melhorando a funcionalidade desses alimentos (Chen et al., 2007). Contudo este é o primeiro relato do uso de atmosferas hiperbáricas na qualidade pós-colheita de caju e brócolis ‘Legacy’ após diferentes períodos de altas pressões. 10 3. Referências Able AJ, Wong LS, Prasad A, O'Hare TJ (2003) The effects of 1-methylcyclopropene on the shelf life of minimally processed leafy Asian vegetables. Postharvest Biology and Technology, 27:2, 157-161. Agte VV, Tarwadi KV, Mengale S, Chiplonkar SA (2000) Potential of traditionally cooked green leafy vegetables as natural sources for supplementation of eight micronutrients in vegetarian diets. Journal of Food Composition and Analysis, 13(6), 885-891. https://doi.org/10.1006/jfca.2000.0942 Ahmed J, Ramaswamy HS (2006) High pressure processing of fruits and vegetables. Stewart Postharvest Review, London, 1, 8,1-10. AGRIANUAL (2019) Goiaba In: AGRIANUAL (23 ed.) Anuário da agricultura brasileira. São Paulo: FNP Consultoria & Comércio, p. 285–287. Brasil, Ministério da Saúde (BR), Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Básica. Guia alimentar para a população brasileira. 2.ed. Brasília (DF); 2014 [citado 29 mar 2019]. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_alimentar_populacao_brasileira_2ed .pdf Brito ES, Araujo MCP, Lin LZ, Harnly J (2007). Fermentation of cashew (Anacardium occidentale l.)“apple” into wine. Determination of the flavonoid components of cashew apple (Anacardium occidentale) by LC-DAD-ESI/MS. Food Chemistry, 105, 1112-1118. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.02.009. Carvalho PG, Machado, CMM, Moretti CL, Fonseca MDN (2006) Hortaliças como alimentos funcionais. Embrapa Hortaliças-Artigo em periódico indexado. Chen L, Vigneault C, Raghavan GV, Kubow S (2007) Importance of the phytochemical content of fruits and vegetables to human health. Stewart Posthar Rev, 3:2. Faostat (2018). Food and Agricultural Organization Statistics. Filgueira, F. A. R. Novo manual de olericultura: agrotecnologia moderna na 11 produção e comercialização de hortaliças. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 2003. 412 p. Gill SS, Tuteja N (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant physiology and biochemistry, 48:12, 909-930. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2010.08.016. Gioppo M (2011). Pós-colheita de brócoliss, repolho roxo e alface sob diferentes ambientes e reguladores. Dissertação de Mestrado. UEPG. Ponta Grossa-PR. Gonzalez-Aguilar GA, Villa-Rodriguez JA, Ayala-Zavala JF, Yahia EM (2010) Improvement of the antioxidant status of tropical fruits as a secondary response to some postharvest treatments. Trends in Food Science & Technology, 21:10, 475- 482. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2010.07.004. Goyette B (2010) Hyperbaric treatment to enhance quality attributes of fresh horticultural produce. 180 f. Thesis (Doctoral) - Department of Bioresource Engineering McGill University, Montreal Quebec. Goyette B, Charles MT, Vigneault C, Raghavan GV (2007) Pressure treatment for increasing fruit and vegetable qualities. Stewart Postharvest Review, 3:3, 1-6. Goyette B, Vigneault C, Raghavan V, Charles M T (2012) Hyperbaric treatment on respiration rate and respiratory quotient of tomato. Food and bioprocess technology, 5:8, 3066-3074. https://doi.org/10.1007/s11947-011-0671-y.a Goyette B, Vigneault C, Charles MT, Raghavan VG (2012). Effect of hyperbaric treatments on the quality attributes of tomato. Canadian Journal of Plant Science, 92:3, 541-551. https://doi.org/10.4141/cjps2011-168.b Halliwell B, Gutteridge J (1989) Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon Press. 245 p. Inestroza-Lizardo CO (2017) Pressão hiperbárica e temperatura na qualidade pós-colheita de tomate ‘Débora’. Tese de Doutorado. Unesp. Jaboticabal-SP Inestroza-Lizardo C, Mattiuz BH, Silva JP, Galati VC, Voigt V (2018) Hyperbaric 12 pressure at room temperature increases post-harvest preservation of the tomato cultivar ‘Débora’. Scientia Horticulturae, 228, 103-112. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2017.10.013. Kader AA, Zagory D, Kerbel EEL (1989) Modified atmosphere packaging of fruits and vegetables. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 38:1, 1-30. Ku VVV, Wills RBH (1999) Effect of 1-methylcyclopropene on the storage life of broccoli. Postharvest Biology and Technology, 17:2, 127-132. Lima VDPMS (1988) A cultura do cajueiro no Nordeste do Brasil. BNB: Estudos Econômicos e Sociais, p. 107-117. Liplap P, Vigneault C, Toivonen P, Charles MT, Raghavan GV (2013) Effect of hyperbaric pressure and temperature on respiration rates and quality attributes of tomato. Postharvest biology and technology, 86, 240-248. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2013.07.002. Liplap P, Boutin J, LeBlanc DI, Vigneault C, Vijaya Raghavan GS (2014). Effect of hyperbaric pressure and temperature on respiration rates and quality attributes of B oston lettuce. International Journal of Food Science & Technology, 49:1, 137- 145. https://doi.org/10.1111/ijfs.12288. Lopes MMDA, Miranda MRAD, Moura CFH, Enéas Filho J (2012) Bioactive compounds and total antioxidant capacity of cashew apples (Anacardium occidentale L.) during the ripening of early dwarf cashew clones. Ciência e Agrotecnologia, 36:3, 325-332. http://dx.doi.org/10.1590/S1413-70542012000300008. Mallick N, Mohn FH (2000) Reactive oxygen species: response of algal cells. Journal of Plant Physiology, 157:2, 183-193. https://doi.org/10.1016/S0176- 1617(00)80189-3. Martins VA, Margarido MA, Bueno CRF (2007) Alteração no perfil de compras de frutas, legumes e verduras nos supermercados e feiras livres na cidade de São Paulo. Informações econômicas. São Paulo, 37:2. Michodjehoun-Mestres L, Souquet JM, Fulcrand H, Bouchut C, Reynes M, Brillouet JM (2009). Monomeric phenols of cashew apple (Anacardium occidentale L.). Food 13 Chemistry, 112:4, 851-857. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.06.056. Moura CFH, Figueiredo RWD, Alves RE, Silva EDO, Araújo PGLD, Maciel VT (2010) Increasing shelf life of early dwarf cashew tree peduncle through reduction of storage temperature. Ciência e Agrotecnologia, 34:1, 140-145. http://dx.doi.org/10.1590/S1413-70542010000100018. Moura CFH, Alves RE, Silva EDO, Araújo PGL, Maciel V, Figueiredo RW (2009) Conservação pós-colheita de pedúnculos de clones de cajueiro anão precoce (Anacardium occidentale L.) BRS 189 e END 189. Embrapa Agroindústria Tropical-Artigo em periódico indexado (ALICE). Proc. Interamer. Soc. Trop. Hortic. p. 119-121. Oliveira VH, Crisóstomo LA, Santos FJS, Raij BV, Bernardi ACC, Silva CA, Soares I (2002) Cultivo do cajueiro anão-precoce. Fortaleza: Embrapa Agroindústria Tropical. Prasad TK, Anderson MD, Stewart CR (1994) Acclimation, hydrogen peroxide, and abscisic acid protect mitochondria against irreversible chilling injury in maize seedlings. Plant Physiology, 105:2, 619-627. https://doi.org/10.1104/pp.105.2.619. Rezende LFM, Azeredo CM, Canella DS, Luiz OC, Levy RB, Eluf Neto J (2016) Coronary heart diseasemortality, cardiovascular disease mortality and all-cause mortality attributable to dietary intake over 20 years in Brazil. Int J Cardiol. 217:64-8. https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2016.04.176. Romanazzi G, Nigro F, Ippolito A (2008) Effectiveness of a short hyperbaric treatment to control postharvest decay of sweet cherries and table grapes. Postharvest Biology and Technology, 49:3, 440-442. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2008.01.021. Souza KO, Viana RM, Siqueira OL, Moura CFH, Miranda MRA (2016) Preharvest treatment of growth regulators influences postharvest quality and storage life of cashew apples. Scientia Horticulturae, 209, 53-60. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2016.06.006. Tavares CAM (2000) Brócolos: O cultivo da saúde. Revista Cultivar HF. Ano 1, n. 14 2, 20- 22. Vaughan J, Geissler C (1997) The new Oxford book of food plants. Nordic Journal of Botany, 18, 2, 222. Vigneault C, Leblanc DI, Goyette B, Jenni S (2012). Invited review: Engineering aspects of physical treatments to increase fruit and vegetable phytochemical content. Canadian Journal of Plant Science, 92:3, 373-397. https://doi.org/10.4141/cjps2011-222. Yi J, Feng H, Bi J, Zhou L, Zhou M, Cao J, Li J (2016). High hydrostatic pressure induced physiological changes and physical damages in asparagus spears. Postharvest Biology and Technology, 118, 1-10. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2016.03.015. xv CAPÍTULO 2 - Altas pressões na conservação pós-colheita de brócolis Resumo - O brócolis é uma hortaliça de alto valor nutritivo, rica em compostos bioativos, contudo a sua conservação pós-colheita é limitada a poucos dias. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação de pressões hiperbáricas, em temperatura ambiente, na pós-colheita de brócolis. Os tratamentos consistiram em submeter os brócolis às pressões hiperbáricas de 100 (controle), 200, 400, 600 e 800 kPa por 1, 2 e 3 dias a 22 °C e 95% RH. Nosso estudo determinou que as pressões de 400, 600 e 800 kPa obtiveram os melhores resultados na manutenção da qualidade dos brócolis. A taxa respiratória, a produção de etileno, o teor de sólidos solúveis e a peroxidação lipídica diminuíram nas maiores pressões. Houve também a manutenção da massa fresca, da coloração verde, do teor de ácido ascórbico e da firmeza do receptáculo nos tratamentos com maiores pressões. Os tratamentos hiperbáricos de 600 e 800 kPa propiciaram o aumento da atividade enzimática da catalase e a redução da atividade da peroxidase, resultado da diminuição do estresse oxidativo e o atraso da senescência dos brócolis. Palavras-chave: Brassica oleracea var. itálica, atmosfera hiperbárica, qualidade, inflorescência. xv CHAPTER 2 - High pressures on post-harvest conservation of broccoli Abstract - Broccoli is a vegetable of high nutritional value, rich in bioactive compounds, however, its postharvest conservation is limited to a few days. The objective of this work was to evaluate the effect of hyperbaric pressures application, at room temperature, on broccoli postharvest. Treatments consisted in applying hyperbaric pressures of 100 (control), 200, 400, 600, and 800 kPa for 1, 2 and 3 days at 22 °C and 95% RH on broccoli. Our study determined that the pressures of 400, 600 and 800 kPa showed the best results in maintaining broccoli quality. Respiratory rate, ethylene production, soluble solids content and lipid peroxidation decreased at higher pressures. Also, the fresh weight, the green color, the ascorbic acid content and firmness of the receptacle were maintained in treatments with higher pressures. The hyperbaric treatments 600 and 800 kPa promoted increase of enzymatic activity of catalase and reduced peroxidase activity, as a result of decreased oxidative stress and delayed broccoli senescence. Keywords: Brassica oleracea var. italic, hyperbaric atmosphere, quality, inflorescence. 16 1. Introdução A produção mundial de hortaliças vem aumentando em torno de 5 milhões de toneladas por ano (Faostat, 2018), esse crescimento pode ser atribuído à busca de uma vida saudável. Dentre estas hortaliças, o brócolis vêm ganhando destaque, graças a seu alto valor nutritivo e propriedades nutracêuticas, como elevados teores de betacaroteno, vitamina C, selênio, fibra, luteína, zeaxantina, vitamina K, ácido fólico e minerais como cálcio, potássio, fósforo (Kristal e Lampe, 2002; Carvalho et al., 2006; Xiaofeng et al., 2015). No Brasil, o cultivo de brócolis (Brassica oleracea var. itálica ‘Legacy’) é realizado em todo país, sendo cultivado principalmente nos cinturões verdes dos estados de São Paulo e Minas Gerais. A maior parte da produção é destinada ao mercado in natura em feiras livres, quitandas e supermercados. Somente no primeiro semestre de 2017 a Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP), comercializou o equivalente a 8,4 toneladas de brócolis no estado de São Paulo (Agrinual, 2018). O brócolis (Brassica oleracea var. itálica) possui alta perecibilidade, apresentando vida útil restrita a apenas 2 dias em temperatura ambiente (Gioppo, 2011). Sua senescência é rápida devido a elevada produção de etileno e da taxa respiratória, fazendo-se necessário o uso da refrigeração para prolongar a vida útil deste vegetal, tecnologia cara que onera o processo de produção. Trabalhos recentes demostram a possibilidade do uso de pressões hiperbáricas para retardar os mecanismos fisiológicos de amadurecimento e de senescência em vegetais. Aplicações de pressão hiperbárica retardaram o amadurecimento em tomates, evidenciado pela redução da taxa respiratória e pela manutenção da coloração e da firmeza (Inestroza-Lizardo et al., 2018; Liplap et al., 2013; Vigneault et al., 2012). Inestroza-Lizardo et al. (2019) evidenciaram alterações bioquímicas em tomates submetidos a pressões de 600 e 800 kPa, a temperatura ambiente, com o aumento da atividade da enzima catalase e redução da peroxidase. Autores relatam que a aplicação de tratamento por pressão em temperatura ambiente, pode induzir efeitos positivos na atividade fisiológica dos vegetais, 17 similares ou muito próximos ao armazenamento sob refrigeração (Baba e Ikeda, 2003; Goyette, 2010; Vigneault et al., 2012; Liplap et al., 2013). Esta técnica visa também a economia de energia, visto que este processo usaria apenas 3% da energia necessária à refrigeração, uma vez que a pressurização não precisa ser instantânea e é necessário pouca energia para manter a pressão ao longo do armazenamento (Vigneault et al., 2012). Neste sentido, este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da aplicação de pressões hiperbáricas, em temperatura ambiente, na pós-colheita de brócolis ‘Legacy’. 2. Material e métodos 2.1 Material vegetal Foram utilizados brócolis (Brassica oleracea var. itálica) ‘Legacy’, provenientes de produções comerciais do município de Taiúva (21º7’24.87” S, 48º27’8.83” W, altitude de 634m), localizadas no Estado de São Paulo, Brasil. As inflorescências foram colhidas em ponto comercial (em torno de 80 dias após a semeadura, no período de inverno de 2018) e transportadas ao laboratório em 30 minutos. Utilizou-se inflorescências homogêneas quanto à forma, coloração e ausência de doenças, com peso médio de 630  60 g. Todas as inflorescências foram sanitizadas em solução de Dicloro S. Triazinatriona Sódica Dihidratada (Sumaveg®) a 200 mg L-1, por cinco minutos e deixados secar por 2 h no local onde foram aplicados os tratamentos, em câmara fria a 22 ºC. 2.2 Sistema hiperbárico Os experimentos foram conduzidos em sistema hiperbárico conforme o descrito em Inestroza-Lizardo et al. (2019) e demonstrado na Fig. 1. Brevemente, o sistema consistiu de 5 câmaras de aço com volume de 10,75 L, interligadas a um circuito fechado pelo qual circulava um fluxo constante de ar comprimido, mantendo constante as pressões parciais de oxigênio (21 kPa) e de nitrogênio (78 kPa). O CO2 foi adsorvido pela passagem prévia do ar em uma câmara contendo óxido de cálcio. 18 As câmaras de tratamento são equipadas com regulador de pressão no ponto de entrada e válvula de agulha no ponto de saída de cada vaso para regular a pressão do ar e o fluxo de ar, respectivamente, além de uma válvula de segurança. O sistema foi conectado a um compressor de ar comprimido de 250 L (Schulz, modelo MSV 20 MAX, Joinville, Santa Catarina, Brasil) para suprimento de ar comprimido. O fluxo de ar foi medido usando um flowmeter uma faixa de medição de 5-2000 mL min-1 (Bronkhorst™, Ruurlo, Holanda). A concentração de CO2 foi medida usando analisador de gás infravermelho (Guardian® Plus, Kirkton Campus, Livingston, Inglaterra). O medidor de vazão, e o analisador de CO2 foram conectados ao cartão de aquisição e controle (PersonnelDAQ 3000, Cleveland, OH, EUA) e a um computador. Pressão, taxa de fluxo de ar e nível de CO2 foram registrados usando o software DasyLab® (Measurement Computing Corporation, Norton, MA, EUA). Figura 1. Esquema do sistema hiperbárico. 1. Compressor de ar comprimido; 2. Gerador de pressão; 3. Válvula de segurança; 4. Câmaras de 400 kPa, 600 kPa e 800 kPa; 5. Câmara de pressão do compressor (100 kPa); 6. Válvula de saída; 7. Coletor do ar das válvulas; 8. Medidor de fluxo de ar; 9. Analisador de gás infravermelho; 10. Placa de aquisição de dados e computador (Liplap et al. 2013). 2.3 Procedimento experimental Foram utilizadas 12 inflorescências por repetição, sendo 2 utilizadas para determinar a qualidade inicial (dia 0) (Tabela 1) e as demais 10 inflorescências, foram distribuídas nas 5 câmaras do sistema (2 inflorescências/câmara). Em seguida 19 as câmaras foram fechadas e pressurizadas com as pressões de 100 (controle), 200, 400, 600 e 800 kPa por períodos de 1, 2 e 3 dias. A temperatura (22 ± 1 °C) e umidade relativa do ar (95 ± 2,0%) dentro das câmaras foi monitorada a cada 30 min utilizando registradores de dados (HOBO Prov2 U-23-001), colocados dentro de cada câmara. Ao final de cada tempo de tratamento determinado, as câmaras foram despressurizadas automaticamente por 2h. As inflorescências foram retiradas das câmaras e avaliadas em seguida. Sendo realizado em triplicata todo esse procedimento, totalizando 36 inflorescências para cada período (1, 2 e 3 dias) de pressão, e 108 inflorescências ao total. Tabela 1. Caracterização inicial de brócolis ‘Legacy’ Características Valores Massa (g) 630 ± 60 Índice de cor da epiderme -1,04 ± 0,10 Firmeza do receptáculo (N) 13,3 ± 1,02 Produção de etileno (µL C2H4 kg-1 h-1) 5,2 ± 1,2 Sólidos solúveis (%) 6,17 ± 0,05 Acidez titulável (% ácido cítrico) 0,14 ± 0,07 Ácido ascórbico (mg de ácido ascórbico 100 g-1 MF) 99,6 ± 2,40 Atividade antioxidante (μmol de Trolox 100 g-1 MF) 0,23 ± 0,20 Peroxidação lipídica (nMol 100g−1 MF) 19,22 ± 1,6 Atividade da CAT (U kg-1 pt) 1,12E-10 ± 0,1 Atividade da POD (U kg-1 pt) 0,03 ± 0,01 Valores representam a média ± desvio padrão. MF = massa fresca. CAT = Catalase. POD = Peroxidase. pt = proteína 2.4 Análises 2.4.1 Perda de massa: foi calculada pela diferença entre o peso inicial e final das inflorescências, dividido pelo peso inicial, utilizando uma balança eletrônica com faixa de medição de 50-6000g ± 2g (Filizola, BP6, São Paulo, Brasil). Os resultados foram expressos em porcentagem. 2.4.2 Índice de cor (IC): foi determinado de acordo Mazzuz (1996), pelos parâmetros Luminosidade L*, a* e b* (colorímetro Minolta CR-400, Konica Minolta, New Jersey). 20 As leituras foram realizadas em cinco pontos em cada inflorescência e o IC foi calculado por meio da equação 1: IC = (100 x a*) / (L* x b*) (1) 2.4.3 Firmeza do receptáculo: foi medida por meio de um penetrômetro digital com ponta de 8 mm (5–200 N ± 1N; Impac, IP-90DI, São Paulo, SP, Brasil), avaliada na base do receptáculo, sendo os resultados expressos em Newton (N). 2.4.4 Taxa respiratória: as concentrações de CO2 foram medidas ao longo do experimento com um intervalo de 10 minutos por leitura, totalizando 720 leituras por pressão, calculada automaticamente em tempo real durante todo o período experimental (72 horas), como descrito por Goyette et al. (2011), de acordo com a equação 2: TR= (ΔCO2 x Q) / W (2) Onde: ΔCO2 é a diferença entre a concentração de CO2 na entrada da câmara e a concentração de CO2 na saída da câmara, Q é a taxa de fluxo de ar e W é a massa dos brócolis. Os resultados foram expressos em mg CO2 kg-1 h-1. 2.4.5 Produção de etileno: as inflorescências após os períodos de pressão foram acondicionadas em recipientes herméticos com capacidade de 5 L e fechados. Posteriormente a 1 hora, amostras de 200 L da composição gasosa interna dos recipientes (head space), foram coletadas dos recipientes através de um septo de silicone, com auxílio de seringa de cromatografia gasosa (SGE, Analitical Science). As amostras foram injetadas em cromatógrafo a gás (Trace GC Ultra, Thermo Scientific) equipado com detector de ionização de chama (FID), coluna capilar Porapack N, com 2 m de comprimento e regulada para 80 °C, com hidrogênio como gás de arraste (35 mL min-1). As temperaturas de trabalho do aparelho foram de 110 ºC para a coluna, 250 ºC para o detector, 200 ºC para o injetor. A produção de etileno foi determinada após a retirada das inflorescências das câmaras e foi expressa em µL C2H4 kg-1 h-1. 2.4.6 Sólidos solúveis (SS), acidez titulável (AT) e ácido ascórbico (AA): foram determinados a partir do suco celular conforme metodologia da AOC (1997), e os resultados expressos em porcentagem, em %, % de ácido cítrico, mg de ácido ascórbico 100 g-1 MF, respectivamente. 21 2.4.7 Peroxidação de lipídica: O método seguiu o procedimento de Heath e Packer (1968). As amostras foram congeladas em N2 líquido, maceradas, combinadas com 4 mL de tampão TCA (1% p / v), homogeneizadas e centrifugadas a 10.000 x g por 10 min a 4 °C (Biofuge Stratos model, Heraeus, Hanau, Alemanha). A partir do sobrenadante, 1 mL foi pipetado e transferido para o tubo de ensaio, adicionando 3 mL de ácido tiobarbitúrico a 0,5% (p / v) em 20% (p / v) de TCA e incubando em banho-maria a 95 °C por 60 min. Os tubos foram mantidos por 10 min em banho de gelo para interromper a reação. As amostras foram então novamente centrifugadas durante 10 min a 10.000 x g. A absorbância do sobrenadante foi medida usando um espectrofotômetro UV-vis (Femto 700 plus, São Paulo - SP, Brasil) a 535 nm e 600 nm. Os resultados foram expressos como o conteúdo de malondialdeído (MDA) por 100 g de massa fresca (nmol MDA 100g−1 MF). 2.4.8 Atividade antioxidante total: foi realizada pelo método de DPPH, proposto por Brand-Williams, Cuvelier e Berset (1995). A solução de DPPH foi preparada a 2x10-4 g mL-1 (0,0100 mg de DPPH em 50 mL de etanol a 99,8%). Para a extração, as amostras foram maceradas em N2 líquido, pesadas e diluídas em 10 mL de etanol a 99,8% em tubo para centrífuga, e centrifugadas a 2.000 x g por 10 min a 5 ºC. Alíquotas de 500 µL do sobrenadante foram combinadas com 3 mL de etanol P.A. Após a adição de 300 µL de DPPH 2x10-4 g mL-1, homogeneização, os tubos de ensaios foram armazenados no escuro por 60 min. O controle negativo foi preparado com o DPPH a 0,3 mM em etanol para observar o decaimento do radical contra os antioxidantes doadores. A determinação foi realizada mediante leitura da absorbância a 517 nm e os resultados foram convertidos em porcentagem de atividade antioxidante (% DPPH reduzido = Abs branco – Abs amostra), os resultados foram expressos em μmol de Trolox equivalente por 100 g-1 MF. 2.4.9 Atividade da Catalase (CAT) (EC 1.11.1.6): foi determinada pela adaptação do método de Kar e Mishra (1976). A reação foi obtida pela combinação de 150 μL da amostra extraída em tampão fosfato de potássio + EDTA + DTT + PVPP 100 mmol L−1 (pH 7,5). Um total de 1950 μL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1 (pH 7,5) foi usado como tampão de determinação, 150 μL de tampão fosfato de potássio + EDTA + DTT + PVPP 100 mmol L−1 (pH 7,5) como tampão de extração e 750 µL de solução de peróxido de hidrogênio 50 mM como substrato enzimático. As leituras 22 foram feitas usando um espectrofotômetro UV-vis a 240 nm de absorbância. A atividade específica da CAT foi expressa como proteína U kg−1. 2.4.10 Atividade das Peroxidases (POD) (EC 1.11.1.7): foi determinada conforme Lima et al. (1999). O sistema de reação compreendeu 1 mL de extrato enzimático com 0,5 mL de peróxido de hidrogênio a 30% em tampão fosfato de potássio 0,2 M (pH 6,7) e 0,5 mL de solução de fenol e aminoantipirina. O sistema reacional foi colocado num banho de água a 30 ºC durante 5 min. Foi adicionado álcool etílico absoluto (2 mL) para parar a reação, e a absorbância foi lida com um espectrofotômetro UV-vis a 505 nm de absorbância. A atividade específica da POD foi expressa como proteína U kg−1. Para o cálculo da atividade específica da CAT e POD, o teor de proteína solúvel total foi medido usando o método de Bradford (Bradford, 1976). 2.5 Delineamento experimental Foi utilizado um delineamento de blocos casualizados (DBC), num esquema de fatorial duplo (tempos de exposição x pressões aplicadas). Os tratamentos constituíram de 3 períodos de exposição a pressão 1, 2 e 3 dias e 5 níveis de pressão (100, 200, 400, 600 e 800 kPa) para cada período de exposição, todos os períodos de exposição foram repetidos 3 vezes, totalizando 9 experimentos ao total. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o software AgroEstat, versão 2014 (Barbosa e Maldonado, 2014). Quando diferenças significativas foram encontradas, uma análise de regressão foi realizada. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P ≤ 0.01). 3. Resultados e discussão 3.1 Perda de massa (PM) Ocorreu a diminuição da perda de massa dos brócolis com o aumento das pressões aplicadas (Fig. 2). Nas inflorescências mantidas a 100 kPa verificaram-se as maiores PM, proporcionais ao tempo de exposição. Após 3 dias de tratamento, os 23 brócolis a 100 kPa perderam 3% de massa, ao passo que aqueles da pressão de 800 kPa apenas 1,2%. Segundo Inestroza-Lizardo et al. (2018) a modificação da pressão atmosférica é um dos principais fatores que influenciam na pressão de vapor do ambiente. A velocidade de perda de água (massa) de um vegetal fresco é controlada principalmente pela diferença entre a pressão de vapor do ar úmido nos espaços intercelulares do tecido vegetal e do ar que o circunda. Assim, uma diferença menor na pressão de vapor entre o ar do produto e o ar ambiente, tem como resultado menor perda de água do vegetal (Kader, 2002). Isto explica as maiores perdas de massa terem ocorrido no tratamento controle (100 kPa) quando comparado com os tratamentos de 400, 600 e 800 kPa (Fig. 2). Esse comportamento também foi evidenciado por outros autores ao trabalharam com uso de altas pressões na conservação de frutas e hortaliças (Baba e Ikeda, 2003; Goyette, 2012; Liplap et al, 2014; Inestroza-Lizardo et al, 2018). Os resultados obtidos nesta pesquisa permitem afirmar que a modificação da pressão atmosférica, ao redor do produto, a partir de 200 kPa são eficazes na redução da perda de massa do brócolis ‘Legacy’. Figura 2. Perda de massa de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de 1 (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. 24 3.2 Índice de cor (IC) e acidez titulável (AT) De um modo geral, o índice de cor aumentou com tempo de exposição à pressão, tornando os brócolis mais amarelados (Fig. 3A). Isto pode ser atribuído à degradação das clorofilas pela atuação da enzima clorofilase, como também a alteração de pH que consecutivamente altera da acidez titulável e oxidação, induzindo a produção de etileno (Fig. 6). Nas pressões de 400, 600 e 800 kPa a cor verde inflorescências foi preservada, apresentando índice de cor menor que das inflorescências submetida às pressões de 100 e 200 kPa (Fig. 3A). Ao relacionar o IC com a AT, ao 3º dia de pressão, ver-se uma relação inversamente proporcional, com a diminuição do IC e o aumento da AT (Fig. 3), esse comportamento pode ser atribuído a degradação das clorofilas devido a atividade enzimática, provocando o amarelecimento das inflorescências e a liberação de ácidos orgânicos no meio celular elevando os valores de AT. Os teores de AT nos brócolis variaram de 0,14 a 0,26 % de ácido cítrico (Fig. 3B). A pressão hiperbárica proporcionou maior preservação dos ácidos orgânicos nos brócolis em relação as inflorescências controle, com destaque para a pressão de 800 kPa que, após 3 dias, apresentou os maiores teores de AT em relação as inflorescências do controle (100 kPa). Esse mesmo comportamento foi evidenciado por Silva (2016), ao avaliar o efeito de atmosferas hiperbáricas na conservação de mangas, onde os teores de AT foram menores na pressão do controle (100 kPa). Padula et al. (2006) avaliando a qualidade e conservação de brócolis cv. Itália em diferentes embalagens encontraram valores de AT superiores ao deste estudo, chegando a 0,53 a 0,77 mg 100-1g polpa. Essa divergência pode ser atribuída as condições de cultivo, como explica Beckles (2012), onde a qualidade dos vegetais é dependente da interação de fatores genéticos, agronômicos, climáticos e de manejo pós-colheita. A redução da acidez durante a pós-colheita está relacionada com o amadurecimento ou a senescência devido ao maior consumo dos ácidos orgânicos no processo respiratório e/ou com a conversão de ácidos em açúcares na glicogênese. Isso pode ser verificado nos brócolis do controle (100 kPa) pois, além de apresentarem menor acidez (Fig. 3B), tiveram maior taxa respiratória (Fig. 5), 25 maior produção de etileno (Fig. 6) e maiores teores de SS (Fig. 7), indicando maior atividade metabólica que os demais tratamentos. Figura 3. Índice de cor (A) e acidez titulável (B) de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de 1 (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. Índice de cor: 0 = amarelo; - 2,0 = verde. M=3. 3.3 Firmeza Os brócolis do controle (100 kPa) apresentaram uma redução média de 11,4% na firmeza em relação aos valores iniciais (Tab. 1) (Fig. 4). A manutenção da firmeza foi proporcional ao aumento das pressões aplicadas. A pressão de 800 kPa por 1 dia manteve a firmeza dos brócolis em 12,2 N, valor superior ao controle (9,5 26 N) e muito próximo ao valor inicial de 13,3 N (Tab. 1). Os brócolis não submetidos às pressões (controle) apresentaram menor firmeza após 1 dia (9,5 N) de armazenamento quando comparados com 2 e 3 dias (Fig. 4). A manutenção da firmeza nas frutas e hortaliças depende, principalmente, de fatores como a turgescência dos tecidos e a degradação da parede celular (Fagundes et al., 2015), que influencia diretamente a perda de massa do vegetal. Neste experimento, foi observado que a diferença de firmeza dos brócolis está relacionada com a perda de massa, pois os brócolis com maior firmeza apresentaram menor perda de massa (Fig. 2). Essa tendência também foi evidenciada por autores como Inestroza-Lizardo et al, (2018) ao avaliarem tomates cv. ‘Debora’ submetidos a diferentes pressões e dias sob pressões. Liplap et al. (2014) ao avaliarem a firmeza em alfaces submetidas a 850 kPa por 5 dias, a 20 °C, apresentaram maior firmeza em relação às alfaces controle (100 kPa a 20 °C). Padula et al. (2006), ao avaliarem a firmeza em brócolis ninja var. Itálica minimamente processado encontraram um valor médio de 13,8 N, considerado satisfatório para a comercialização, visto que o mesmo não perdeu a característica visual de turgescência. Com base nestes autores, pode-se afirmar que os brócolis armazenados sob as pressões de 400, 600 e 800 kPa apresentaram a firmeza adequada para comercialização, até 3 dias a 22 ºC (Fig. 4). 27 Figura 4. Firmeza do receptáculo de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de 1 (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. 3.4 Taxa respiratória Os brócolis submetidos as pressões hiperbáricas por 72 horas registraram taxa respiratória média de 11 mg CO2 kg-1 h-1, enquanto que os brócolis a 100 kPa (controle) apresentaram taxas respiratórias médias de 13,5 mg CO2 kg-1 h-1, sendo superiores aos demais tratamentos, durante o mesmo período (Fig. 5). A taxa respiratória dos brócolis na pressão de 800 kPa foi 18,5% menor que a média registrada pelos brócolis do controle (100 kPa). Baba et al. (1999) relataram a redução de 74% na produção de CO2 de frutos de umezeiro (Prunus mume) submetidos à pressão de 200 MPa por 10 min. Liplap et al. (2014), ao avaliarem a taxa de respiração de alface também descrevem a diminuição da taxa de respiração dos vegetais submetidos a tratamentos de alta pressão em relação aos frutos do controle (100 kPa). Inestroza-Lizardo et al. (2019) relata a diminuição de 31% na taxa respiratória de tomates submetidos a pressões de 800 kPa quando comparados com o controle (100 kPa). As menores médias atribuídas às pressões podem ser devido à solubilização do CO2 no interior dos brócolis e à diluição do CO2 nos recipientes, resultado do incremento das pressões parciais dos gases do ar no interior das câmaras hiperbáricas, conforme o verificado por Goyette et al. (2012). Provavelmente, o CO2 gerado pela respiração dos brócolis tenha sido inicialmente solubilizado nos tecidos internos até alcançar a pressão parcial do CO2 do ar que o circundava. Posteriormente, ocorreu a diluição do CO2 no interior da câmara hiperbárica, ocasionando o aumento da pressão parcial do CO2 do ar que circunda o produto com o aumento da concentração do CO2 dentro da câmara e, consequentemente, dos valores das leituras de CO2. Este processo de diluição e solubilização é contínuo, e se estabiliza somente quando a quantidade de CO2 que sai da câmara para o analisador de gases se torna igual à gerada pela taxa respiratória dos tomates (Liplap et al., 2014). Conforme Inestroza-Lizardo et al. (2018) o efeito das pressões hiperbáricas na taxa respiratória dos vegetais é variável a depender do tipo de material utilizado, do tempo de exposição, da intensidade e da temperatura. 28 Em resposta aos resultados obtidos neste trabalho permite-se afirmar que a modificação da pressão atmosférica ao redor do produto, principalmente nas altas pressões, foi eficaz na redução da taxa respiratória dos brócolis ‘Legacy’. Figura 5. Taxa respiratória de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de 72 horas a 22 ºC e 95% de UR. 3.5 Produção de etileno A produção de etileno nos brócolis aumentou em função do tempo de exposição às pressões. Entretanto, manteve-se baixa com o aumento das pressões aplicadas, ocorrendo uma relação funcional quadrática entre as pressões aplicadas e os tempos de pressão (Fig. 6). Os brócolis submetidos às pressões de 600 e de 800 kPa por 1 dia, apresentaram produção de etileno cerca de 16% menor que a do controle e muito próxima aos valores iniciais (5,2 L C2H4 kg-1 h-1). Após 3 dias, os brócolis do controle produziram ainda mais etileno, sendo que a diferença para o melhor tratamento (800 kPa) foi de 33,6% (Fig. 6). A produção de etileno deve ser controlada e mantida baixa para vegetais sensíveis a esse gás, como é o caso dos brócolis, pois o etileno induz à degradação da clorofila com consequente amarelecimento em brócolis (Yamauchi et al., 1999), esse comportamento foi evidenciado nas inflorescências do controle (100 kPa) quando comparadas com as submetidas a 800 kPa, onde foi registrada a menor produção de etileno (Fig. 6) e os 29 maiores valores de índice de cor (Fig. 3A), prejudicando a aparência e diminuindo a vida útil dessas inflorescências (Jones et al., 2006; Moreno et al., 2006). O baixo etileno produzido pode ser atribuído em parte ao efeito inibitório da pressão sobre a atividade ACC oxidase, enzima responsável pela conversão do ACC em etileno. Baba et al. (1999) ao submeter frutos de umezeiro (Prunus mume) à pressão de 5 MPa verificaram uma redução de 75% na atividade da enzima ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em relação ao controle (100 kPa), enquanto que os níveis do substrato (ACC) permaneceram inalterados. Figura 6. Produção de etileno de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de 1 (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. 3.6 Sólidos solúveis (SS) O conteúdo de SS diminuiu com o aumento das pressões, sendo que a média do controle (100 kPa) foi 20% superior as inflorescências submetidas a pressão de 800 kPa (Fig. 7). Comportamento semelhante foi observado por Inestroza-Lizardo et al. (2018), que após 6 dias de pressão, o teor de SS dos tomates submetidos à pressão de 800 kPa foi 13% menor do que o dos tomates controle. Padula et al. (2006) avaliando o teor de SS em brócolis ‘Itália’ armazenados em diferentes tipos de embalagens, constataram que os teores SS em brócolis aumentam durante o 30 período de armazenamento. Assim, pode-se afirmar que houve influência das pressões aplicadas na conservação dos vegetais, visto o menor conteúdo de SS do brócolis em altas pressões, indicando atraso na senescência. Ao relacionar o teor de SS com a produção de etileno (Fig. 6), nota-se que os maiores valores para a produção de etileno assim como para o teor de SS foram evidenciados nas inflorescências do controle (100 kPa), indicando senescência avançada do brócolis do controle (100 kPa) quando comparado com os submetidos a pressão de 800 kPa. O aumento de SS nos brócolis controle pode ser atribuído a maior atividade das enzimas envolvidas no processo de degradação da parede celular (Maftoonazad, Ramaswamy, Marcotte, 2008), com consequente redução da firmeza (Fig. 4) e aumento da taxa respiratória (Fig. 5). Figura 7. Sólidos solúveis de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de 1 (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. 3.7 Teor de ácido ascórbico (AA) e peroxidação lipídica Foi observado uma redução média de até 27% (Fig. 8A) do teor de AA dos brócolis do controle em relação ao valor inicial (99,6 mg AA 100 g-1 MF) (Tab. 1). Independentemente do tempo de pressão, o tratamento de 800 kPa foi considerado o melhor, pois manteve os teores elevados de AA (94 mg AA 100 g-1 MF) muito próximos aos valores iniciais. 31 De acordo com Chitarra e Chitarra (2005), o conteúdo de ácido ascórbico tende a diminuir com a maturação e com o armazenamento. Possivelmente, os valores de AA foram consumidos em reações metabólicas no processo de senescência dos brócolis do controle (100 kPa) quando comparados com os submetidos as altas pressões. Figura 8. Teor de ácido ascórbico (A) e peroxidação lipídica (B) de brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. Esse mesmo comportamento foi evidenciado por Inestroza-Lizardo et al. (2019), ao submeter tomates às altas pressões durante dois e quatro dias, onde os 32 frutos tratados com a pressão de 100 kPa apresentaram os menores valores de AA quando comparados aos frutos submetidos as pressões de 200, 400, 600 e 800 kPa. O ácido ascórbico é um composto antioxidante que tem importante papel na supressão dos radicais livres (Gill e Tuteja, 2010; Kaur et al., 2013), com capacidade de doar elétrons a ampla gama de reações enzimáticas e não enzimáticas (Das e Roychoudhury, 2014). Por isso, seu metabolismo está associado com a defesa ao estresse oxidativo (Tsaniklidis et al., 2014), ou seja, quanto maior o estresse ocorrido no vegetal menor é a concentração deste composto encontrada no vegetal. Neste caso, o estresse foi gerado pela senescência natural do brócolis, que desencadeou reações de degradação/oxidação, reduzindo sua vida útil pós-colheita. As altas pressões exercidas sobre o vegetal atuaram no metabolismo como um todo, retardando o ritmo de senescência, mantendo também, os teores de AA elevados, próximos aos iniciais. Verifica-se que a manutenção dos teores de AA sob altas pressões está de acordo com o aumento peroxidação lipídica (Fig. 8B), onde a pressão de 100 kPa (controle) apresentou os maiores valores de malondialdeído (MDA) independente do período de pressão, com incremento médio de 28% maior em relação a pressão de 800 kPa (12,5 nMol MDA g-1 massa fresca). O estresse oxidativo é fator central em fenômenos de estresses bióticos e abióticos, e ocorre quando há desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) e de defesa antioxidante, em qualquer compartimento da célula vegetal (Foyer e Noctor, 2000). O estresse oxidativo pode ser medido mediante a peroxidação dos lipídeos; processo que é iniciado pela reação de um radical livre com um ácido graxo insaturado e propagado por radicais peroxilas; resultando na formação de hidroperóxidos lipídicos e aldeídos, tais como o malondialdeído, 4hidroxinonenal e isoprostanos (Lima e Abdalla, 2001). Este processo pode ocorrer em todos os organismos vivos, e pode desencadear lesões nas células (Gill e Tuteja, 2010), alterando as membranas e levando a transtornos de permeabilidade e de morte celular. Os menores teores de MDA nos brócolis submetidos as altas pressões independentemente dos dias de aplicação, sugere que o tratamento hiperbárico foi eficiente na redução do estresse oxidativo. Contudo, a influência das pressões 33 hiperbáricas sobre o conteúdo de MDA não está clara, e na literatura, são escassos os relatos do efeito de tratamentos hiperbáricos sobre o conteúdo de MDA em frutas e hortaliças frescas. O tratamento de 3 dias de pressão foi o que apresentou os menores valores de MDA quando submetidos as altas pressões (Fig. 8B). Esse comportamento também foi evidenciado por Kou et al. (2016) e Inestroza-Lizardo et al. (2019), quando trabalharam com aplicação de altas pressões na conservação de tomates, cujo conteúdo de MDA nos frutos tratados com altas pressões diminuíram quando comparados com os frutos do controle (100 kPa). 3.8 Atividade antioxidante total (AAT) Houve aumento progressivo do conteúdo da atividade antioxidante total em função da pressão aplicada, independente do período de exposição (Fig. 9). Os valores de ATT aumentaram de 0,30 a 0,38 para 1 dia, de 0,37 a 0,43 para 2 dias, de 0,25 a 0,32 µmol TEAC 100 g-1 MF para 3 dias de exposição (Fig. 9). Esse comportamento também foi evidenciado por outros autores, como Inestroza-Lizardo et al. (2019) ao submeterem tomates ‘Debora’ ao tratamento hiperbárico por seis dias, indicando uma resposta sinérgica dos tratamentos de 200, 400, 600 e 800 kPa na atividade antioxidante total. Silva (2016) ao avaliar o comportamento de mangas após o período de pressão hiperbárica, observou aumento na AAT em mangas submetidas a 800 kPa. Esse comportamento pode ser atribuído como um efeito de hormese promovido pelo aumento da pressão hiperbárica. 34 Figura 9. Atividade antioxidante total em brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. 3.9 Atividade das enzimas catalase (CAT) e peroxidase (POD) Foi verificada uma relação significativa (P ≤ 0.01) entre a atividade das enzimas CAT e POD dos brócolis e a pressão aplicada (Fig. 10A e B). Os brócolis que permaneceram a 800 kPa por 1 e 2 dias tiveram, em média, a atividade da CAT 2,5 vezes maior que os brócolis a 100 kPa (Fig.10A). A CAT desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase do peróxido de hidrogênio nas células vegetais. A enzima é importante na dismutação do H2O2 gerado nos peroxissomas por oxidases envolvidas na β-oxidação de ácidos graxos, fotorrespiração (Igamberdiev e Lea 2002; Gill e Tuteja, 2010). Por isso, a capacidade em manter a alta atividade da CAT é considerada um mecanismo de defesa contra os fatores de estresse (Boonkorn, 2016). Neste sentido os tratamentos hiperbáricos aplicados nos brócolis são eficazes, cujos resultados demonstram que o estresse ocasionado pelo armazenamento hiperbárico gerou a ativação da CAT. Isso está diretamente relacionado com o processo de desintoxicação dos reativos H2O2 e indiretamente a maior proteção das células. Inestroza-Lizardo et al. (2019) 35 evidenciou comportamento similar da atividade da CAT em tomates submetidos a altas pressões. Figura 10. Atividade das enzimas catalase (CAT) (A) e peroxidase (POD) (B) em brócolis ‘Legacy’ submetidos a tratamentos hiperbáricos por períodos de (1y), 2 (2y) e 3 (3y) dias a 22 ºC e 95% de UR. M=3. Após 2 dias de tratamento, os brócolis controle apresentaram a atividade da POD 2,7 vezes maior que os brócolis submetido à pressão de 800 kPa (Fig. 10B). Inestroza-Lizardo et al. (2019) evidenciou o mesmo comportamento ao avaliar a atividade da POD em tomates ‘Debora’ submetidos a altas pressões por quatro dias. Contudo, as inflorescências tratadas com 3 dias de pressão apresentaram 36 comportamento oposto, cujos maiores valores da atividade da POD foram observados nas inflorescências tratadas com 800 kPa (Fig. 10B). Os elevados níveis de POD das inflorescências do controle após 2 d podem ser atribuídos ao estádio da senescência do vegetal, como explicam Chitarra e Chitarra (2005), pois elevados níveis das POD estão associados com a deterioração oxidativa de frutos que se encontram em estádio avançado de amadurecimento. Neste aspecto as pressões de 600 e 800 kPa foram eficientes em manter a atividade enzimática baixa e propiciar a melhor conservação dos brócolis, quando comparados com as inflorescências do controle (100 kPa) (Fig. 10B). 4. Conclusões Os tratamentos hiperbáricos se mostraram eficientes na conservação pós- colheita de brócolis ninja cv. Legacy, com destaque para as maiores pressões aplicadas. As pressões de 400, 600 e 800 kPa reduziram a taxa respiratória dos vegetais e a produção de etileno, mantiveram a massa fresca, a firmeza e a coloração verde dos brócolis, características importantes para a comercialização. As pressões de 600 e 800 kPa influenciaram a atividade antioxidante, propiciando a redução da peroxidação lipídica e da enzima peroxidase, demonstrando que as pressões exercidas mantiveram a integridade dos tecidos e retardaram a senescência dos brócolis. O melhor tratamento observado foi o de 800 kPa, apresentando manutenção da perda de massa e firmeza, menor produção de etileno, taxa respiratória e produção de MDA, maiores valores de ácido ascórbico e aumento da atividade da CAT. 5. Agradecimentos O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Processo n° 2017/17024-0). 37 6. Referências AGRIANUAL (2018) Anuário da agricultura brasileira. São Paulo: FNP Consultoria & Comércio, p. 285–287. AOAC. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists International.16th ed. Washington: Ed. Patrícia Cunniff, 1997. 2, cap.37. Baba T, Como G, Ohtsubo T, Ikeda F (1999) Effects of high pressure treatment on mume fruit (Prunus mume). Journal of American Society of Horticultural Science, 124, 399-401. https://doi.org/10.21273/JASHS.124.4.399. Baba T, Ikeda F (2003) Use of high-pressure treatment to prolong the postharvest life of mume fruit (Prunus mume). Acta Horticulturae, Leuven, 628, 373-377, DOI: 10.17660/ActaHortic.2003.628.46. Barbosa JC, Maldonado Júnior W (2015) AgroEstat: Sistema para análises estatísticas de ensaios agronômicos. Jaboticabal: Gráfica Multipress LTDA. Disponível em: https://www.agroestat.com.br Beckles DM (2012) Factors affecting the postharvest soluble solids and sugar content of tomato (Solanum lycopersicum L.) fruit. Postharvest Biology and Technology, Oxford, 63, 1, 129-140. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2011.05.016. Boonkorn P (2016) Impact of hot water soaking on antioxidant enzyme activities and some qualities of storage tomato fruits. International Food Research Journal, Serdang, 23, 3, 934-938. Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C (1995) Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, Zurich, 28, 25-30. https://doi.org/10.1016/S0023-6438(95)80008-5. 38 Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3. Carvalho PGB, Machado CMM, Moretti CL, Fonseca MEN (2006) Hortaliças como alimentos funcionais. Horticultura Brasileira. 24, 4, 397-404. http://dx.doi.org/10.1590/S0102-05362006000400001. Chitarra MIF, Chitarra AB (2005) Pós-colheita de frutas e hortaliças: fisiologia e manuseio. 2.ed. Lavras: UFLA. Das K, Roychoudhury A (2014) Reactive oxygen species (ROS) and response of antioxidants as ROS-scavengers during environmental stress in plants. Environmental Science, 2, 53. Doi: 10.3389/fenvs.2014.00053 Fagundes C, Moraes K, Pérez-Gago MB, Palou L, Maraschin M, Monteiro AR (2015) Effect of active modified atmosphere and cold storage on the postharvest quality of cherry tomatoes. Postharvest Biology and Technology, Oxford, 109, 73-81. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2015.05.017. Faostat, 2018. Food and Agricultural Organization Statistics. http://www.fao.org/home/en/ (accessed 28 Octuber 2018). Foyer CH, Noctor G (2000) Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signalling. New Phytologist, London, 146, 359-388. https://doi.org/10.1046/j.1469- 8137.2000.00667.x. Gill SS, Tuteja N (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, New York, 48, 909-930. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2010.08.016. 39 Gioppo M (2011) Pós-colheita de brócoliss, repolho roxo e alface sob diferentes ambientes e reguladores. Dissertação de Mestrado. UEPG. Ponta Grossa-PR. Goyette B (2010) Hyperbaric treatment to enhance quality attributes of fresh horticultural produce. 180 f. Thesis (Doctoral) - Department of Bioresource Engineering McGill University, Montreal Quebec. Goyette B, Vigneault C, Wang N, Raghavan V (2011) Conceptualization, design and evaluation of a hyperbaric respirometer. Journal of Food Engineering, Amsterdam, v.105, n.2, 283-288. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2011.02.033. Goyette B, Vigneaul C, Charles MT, Raghavan VGS (2012) Effect of hyperbaric treatment on quality attribute of tomato. Canadian Journal of Plant Science, Ottawa, 92, 3, 541-551. Doi:10.13031/2013.29768. Heath RL, Packer L (1968) Photoperoxidation in isolated chloroplast: I.Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives in Biochemistry Biophysics, Abingdon, 125, 2141-2145. https://doi.org/10.1016/0003-9861(68)90654-1. Igamberdiev AU, Lea PJ (2002) The role of peroxisomes in the integration of metabolism and evolutionary diversity of photosynthetic organism. Phytochemistry, Madison, 60, 651-674. https://doi.org/10.1016/S0031-9422(02)00179-6. Inestroza-Lizardo C, Mattiuz BH, Silva JP, Galati VC, Voigt V (2018) Hyperbaric pressure at room temperature increases post-harvest preservation of the tomato cultivar ‘Débora’. Scientia Horticulturae, 228, 103-112. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2017.10.013. Inestroza-Lizardo C, Mattiuz BH, Silva JP, Voigt V, Muniz AC, Junior JSP (2019) Effect of hyperbaric pressure on the activity of antioxidant enzymes and bioactive 40 compounds of cv. ‘Débora’tomatoes. Scientia Horticulturae, 249, 340-346. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2019.02.011. Jones RB, Faragner JD, Winkler S (2006) A review of the influence of postharvest treatments on quality and glucosinolate content in broccoli (Brassica oleraceae var. italica) heads. Postharvest Biology and Technology, 41, 1, 1-8. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2006.03.003. Kader AA (2002) Postharvest biology and technology: an Overview. In: KadeR, A.A. Postharvest technology of horticultural crops. Davis: University of California. Kaur C, Walia S, Nagal S, Walia S, Singh J, Singh BB, Saha S, Singh B, Kalia P, Jaggi S, Sarika (2013) Functional quality and antioxidant composition of selected tomato (Solanum lycopersicon L) cultivars grown in Northern India. LWT - Food Science and Technology, Amsterdam, 50, 139-145. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2012.06.013. Kar M, Mishra D (1976) Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiology 57, 315–319. https://doi.org/10.1104/PP.57.2.315. Kristal A R, Lampe JW (2002) Brassica vegetables and prostate cancer risk: a review of the epidemiological evidence. Nutrition and Cancer, 42 ed. 2002: 1-9. https://doi.org/10.1207/S15327914NC421_1 Kou X, Wang Y, Chen Q, Xue Z, Bai Y, Zhou F (2016) Effects of Hypobaric Treatments on the Quality, Bioactive Compounds, and Antioxidant Activity of Tomato. Journal of Food Science, Oxford, 81, 7, H1816-H1824. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13360 41 Liplap P, Boutin J, Leblanc DI, Vigneault C, Vijaya Raghavan GS (2014) Effect of hyperbaric pressure and temperature on respiration rates and quality attributes of Boston lettuce. International Journal of Food Science & Technology, Oxford, 49, 1, 137-145. https://doi.org/10.1111/ijfs.12288 Liplap P, Vigneault C, Toivonenc P, Charles MT, Raghavan GV (2013) Effect of hyperbaric pressure and temperature on respiration rates and quality attributes of tomato. Postharvest Biology and Technology, Oxford, 86, 240-248. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2013.07.002 Lima ES, Abdalla DS (2001) Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, São Paulo, 37, 293-303. Lima GPP, Brasil OG, Oliveira AM (1999) Poliaminas e atividade da peroxidase em feijão (Phaseolus vulgaris L.) cultivado sob estresse salino. Scientia Agrícola, Piracicaba, 56, 1, 21-25. https://doi.org/10.1590/S0103-90161999000100004. Lichtenthaler H K (1987) Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzimology. In: Packer, L., Douce, R. (Eds.), 148. Moreno DA, Carvajal M, López-Berenguer C, García-Viguera C (2006) Chemical and biological characterisation of nutraceutical compounds of broccoli. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 5, 1508-1522. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2006.04.003. Maftoonazad N, Ramaswamy HS, Marcotte M (2008) Shelf-life extension of peaches through sodium alginate and methyl cellulose edible coatings. International Journal of Food Science and Technology, 43, 951–957. https://doi.org/10.1111/j.1365- 42 2621.2006.01444.x. Mazzuz CF (1996) Calidad de frutos cı´tricos: manual para sugestion desde la recoleccion hasta la expedicion. Edicionas de Horticultura, Barcelona, p. 202. Padula ML, Carciofi BAM, Dannenhauer CE, Stringari GB, Monteiro AR (2009) Influência de diferentes tipos de embalagens nas características físico-químicas e composição gasosa de Brócolis (Brassica oleracea L. var Itálica) orgânicos minimamente processados e armazenados sob refrigeração. Alimentos e Nutrição Araraquara, 17, 3, 259-268. Silva JPD (2016) Efeito de atmosferas hiperbáricas na pós-colheita de manga palmer. Tese de Doutorado. Unesp. Jaboticabal-SP Tsaniklidis G, Delis C, Nikoloudakis N, Katinakis P, Aivalakis G (2014) Low temperature storage affects the ascorbic acid metabolism of cherry tomato fruits. Plant Physiology and Biochemistry, New Delhi, 84. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2014.09.009. Vigneault C, Leblanc DI, Goyette B, Jenni S (2012) Invited review: engineering aspects of physical treatments to increase fruit and vegetable phytochemical content. Canadian Journal of Plant Science, Washington, 92, 3. https://doi.org/10.4141/cjps2011-222 Xiaofeng N, Junsoo L, Chungsu H (2015) Drying characteristics and quality of red ginseng using far-infrared rays. Journal Ginseng. 39, 4. https://doi.org/10.1016/j.jgr.2015.04.001. Yamauchi N, Funamoto Y, Kanetsune Y (1999) Involvement of chlorophyll degrading enzimes with chlorophyll degradation in stored broccoli (Brassica oleraceae L.) 43 florets. Food Science of Technology Research. 5, 3. https://doi.org/10.3136/fstr.5.300. xli CAPÍTULO 3 - Tratamentos hiperbáricos no aumento da vida útil de caju Resumo - O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de pressões hiperbáricas na pós-colheita de cajus em temperatura ambiente. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Tecnologia Pós-colheita da FCAV-UNESP, Câmpus de Jaboticabal, utilizando cajus provenientes de produções comerciais da região de Vista Alegre do Alto - SP. Foram utilizados níveis de pressão hiperbárica de 100 (controle), 200, 400, 600 e 800 kPa a temperatura de 22±1°C, durante 1, 2 e 4 dias, e por mais 2 dias em condição de ambiente (22°C, 50% UR, 100 kPa). Foram realizadas análises para avaliar a qualidade pós-colheita (perda de massa, índice de podridão, firmeza, índice de cor, sólidos solúveis, acidez titulável, taxa respiratória e produção de etileno) e a influência no sistema antioxidante dos cajus (ácido ascórbico, clorofila, carotenoides, antocianinas, flavonoides, taninos, atividade antioxidante total, peroxidacão de lipídeos e atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POD)). Os cajus do controle apresentaram perda de massa média 47% maior que aos cajus tratados na pressão de 800 kPa. Nosso estudo determinou que as pressões de 400, 600 e 800 kPa obtiveram os melhores resultados na manutenção da qualidade cajus. As aplicações de pressão melhoraram as características físicas e bioquímicas, refletindo na conservação e redução de podridão dos cajus. As pressões induziram o processo de redução da adstringência dos cajus. Houve incremento da atividade da SOD e redução da atividade da CAT nas pressões 600 e 800 kPa. Palavras-chave: Anacardium occidentalis, qualidade, pressão, taninos, sistema antioxidante. xlii CHAPTER 3 - Hyperbaric treatment improves the shelf life of cashew Abstract - The objective of this work was to investigate the effect of hyperbaric pressures on the postharvest of cashew at room temperature. The experiments were carried out at the Postharvest Technology Laboratory of FCAV-UNESP, Câmpus de Jaboticabal, using cashew from commercial orchard from the region of Vista Alegre do Alto - SP. Hyperbaric pressure of 100 (control), 200, 400, 600 and 800 kPa were applied at a temperature of 22 ± 1 °C for 1, 2 and 4 days, and a further 2 days under ambient conditions (22 °C , 50% RH, 100 kPa). Analyses were carried out to assess the postharvest quality (loss of mass, rot rate, firmness, color index, soluble solids, titratable acidity, respiratory rate and ethylene production) and the influence of an antioxidant system of cashew (ascorbic acid, chlorophyll, carotenoids, anthocyanins, flavonoids, tannins, total antioxidant activity, lipid peroxidation and activity of the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD)). The control presented weight loss 47% higher than the cashew in the pressure of 800 kPa. Our study determined that the pressures of 400, 600 and 800 kPa showed the best results in maintaining the quality of the cashew. Higher pressure applications improve physical and biochemical characteristics, resulting in conservation and reduction of cashew rot. The pressures reduced the astringency of cashew. Induction in SOD activity and reduction of CAT activity were induced at pressures of 600 and 800 kPa. Keywords: Anacardium occidentalis, quality, pressure, tannins, antioxidant system. 43 1. Introdução O cajueiro (Anacardium occidentalis), é uma fruteira tropical originária do Brasil pertencente à família Anacardiaceae (Queiroz, 2011). Tem como principal produção a castanha (Akinhanmi e Atasie 2008), entretanto o pseudofruto (pedúnculo) vem ganhando importância por possuir elevados teores de vitamina C, carotenoides e compostos fenólicos (Zepka et al., 2014). Em 2016 a produção mundial do caju atingiu quase 2 milhões de toneladas. O Brasil lidera o ranking com 1,7 milhões de toneladas, seguido por Madagascar (75 mil toneladas) Mali (70 mil toneladas) e Guiana (5 mil toneladas) (FAOSTAT, 2018). No Brasil, o estado de São Paulo se destaca com um volume de comercialização anual de 673 t ano-1 de pedúnculo de caju, gerando cerca de R$ 12,3 milhões por ano (Agrinual, 2019). O caju é classificado como não-climatérico, apresentando baixa produção de etileno. Entretanto, devido ao metabolismo respiratório acelerado, é uma fruta muito perecível em temperatura ambiente, devendo ser comercializada em até 48 horas após a colheita (Moura et al., 2010). Estima-se que 80% dos cajus são desperdiçados anualmente (Biasoto et al., 2015). A sua alta perecibilidade, a deficiência na armazenagem durante os meses de pico do processamento industrial, associada à limitada capacidade de aproveitamento da indústria, contribuem para esta perda física (Santos et al., 2011). Diante disso, a cadeia de beneficiamento do pseudofruto deve se estabelecer sob condições refrigeradas de 5°C e 85% UR (Pinho et al., 2011). Tratamentos físicos como a refrigeração e atmosferas controladas, reduzem de modo eficiente as taxas respiratórias e retardam o desenvolvimento de podridões, mantendo a qualidade do produto por longos períodos. Entretanto, essas tecnologias são consideradas caras, pois exigem elevado consumo de energia (Raghavan et al., 2005) quando comparadas ao tratamento hiperbárico que demanda entre 2 a 6% do total da energia necessária para a refrigeração (Vigneault et al., 2012). Trabalhos recentes demonstram a possibilidade do uso de pressões hiperbáricas para retardar os mecanismos fisiológicos de amadurecimento e de 44 senescência em vegetais. Os resultados observados demonstram significativa manutenção de massa fresca e firmeza, diminuição da taxa respiratória e da produção de etileno, possibilitando assim, o aumento de vida pós-colheita em produtos como milho verde, abacate, alface e tomate (Baba e Ikeda, 2003; Goyette, 2010; Vigneault et al., 2012; Liplap et al., 2013; Inestroza- Lizardo et al., 2018; Inestroza- Lizardo et al., 2019). Neste sentido, este trabalho teve por objetivo investigar o efeito de pressões hiperbáricas na pós-colheita de cajus em temperatura ambiente. 2. Material e métodos 2.1. Material Vegetal Foram utilizados cajus (clone anão precoce CCP-76) provenientes de produções comerciais do município de Vista Alegre do Alto (21° 9’ 51” S, 48° 38’ 19” W, altitude de 602m), localizada no Estado de São Paulo, Brasil. Os cajus foram colhidos em estádio de maturação comercial e transportados em 30 min até o laboratório. Utilizaram-se cajus homogêneos quanto à forma, coloração e ausência de doenças, com peso médio de 82,410 g. Todos os cajus foram sanitizados em solução de sicloro s. triazinatriona sódica dihidratada (Sumaveg®) a 200 mg L-1 por 5 minutos e deixados secar por 2h no local onde foram aplicados os tratamentos, em câmara fria a 22 ºC. 2.2. Sistema hiperbárico Os experimentos foram conduzidos em sistema hiperbárico conforme o descrito em Inestroza-Lizardo et al. (2019) e demonstrado na Fig. 1. Brevemente, o sistema consistiu de 5 câmaras de aço com volume de 10,75 L, interligadas a um circuito fechado pelo qual circulava um fluxo constante de ar comprimido, mantendo constante as pressões parciais de oxigênio (21 kPa) e de nitrogênio (78 kPa). O CO2 foi adsorvido pela passagem prévia do ar em uma câmara contendo óxido de cálcio. 45 As câmaras de tratamento são equipadas com regulador de pressão no ponto de entrada e válvula de agulha no ponto de saída de cada vaso para regular a pressão do ar e o fluxo de ar, respectivamente, além de uma válvula de segurança. O sistema foi conectado a um compressor de ar comprimido de 250 L (Schulz, modelo MSV 20 MAX, Joinville, Santa Catarina, Brasil) para suprimento de ar comprimido. O fluxo de ar foi medido usando um flowmeter uma faixa de medição de 5-2000 mL min-1 ± 12 mL min-1 (Bronkhorst™, Ruurlo, Holanda). A concentração de CO2 foi medida usando analisador de gás infravermelho (Guardian® Plus, Kirkton Campus, Livingston, Inglaterra). O medidor de vazão, e o analisador de CO2 foram conectados ao cartão de aquisição e controle (PersonnelDAQ 3000, Cleveland, OH, EUA) e a um computador. Pressão, taxa de fluxo de ar e nível de CO2 foram registrados usando o software DasyLab® (Measurement Computing Corporation, Norton, MA, EUA). Figura 1. Esquema do sistema hiperbárico. 1. Compressor de ar comprimido; 2. Gerador de pressão; 3. Válvula de segurança; 4. Câmaras de 400 kPa, 600 kPa e 800 kPa; 5. Câmara de pressão do compressor (100 kPa); 6. Válvula de saída; 7. Coletor do ar das válvulas; 8. Medidor de fluxo de ar; 9. Analisador de gás infravermelho; 10. Placa de aquisição de dados e computador (Liplap et al., 2013). 46 2.4. Delineamento experimental Para cada dia de pressão foi utilizado 60 cajus, sendo que 10 cajus foram utilizados para determinar a qualidade inicial (dia 0) (Tab. 1) e os demais 50 cajus, foram distribuídos nas 5 câmaras do sistema (10 cajus/câmara). Em seguida as câmaras foram fechadas e pressurizadas com as pressões de 100 (controle), 200, 400, 600 e 800 kPa por períodos de 1, 2 e 4 dias. A temperatura de 22 ± 1 °C e umidade relativa do ar (95 ± 2,0%) dentro das câmaras foi monitorada a cada 30 min utilizando registradores de dados (HOBO Prov2 U-23-001), inseridos dentro de cada câmara. Ao final de cada tempo de tratamento determinado, as câmaras foram despressurizadas automaticamente por 2h. Os cajus foram retirados das câmaras sendo 5 avaliados imediatamente e os outros 5 armazenados por mais 2 dias em condição de comercialização, ou seja, em ambiente a 22 ± 1 °C. Para cada período de tratamento de pressão (1, 2 e 4 dias) foram realizadas 3 repetições totalizando 540 cajus no total. Tabela 1. Parâmetros iniciais de qualidade de cajus. Parâmetros Valores Firmeza (N) 10,2 ± 1,02 Sólidos solúveis (%) 9,8 ± 0,2 Acidez titulável (g 100g-1 de MF) 0,44 ± 0,1 Ácido ascórbico (mg 100g-1 de MF) 119,2 ± 3,4 Clorofila total (mg 100g-1 MF) 0,38 ± 0,01 Carotenoides (mg 100g-1 MF) 1,16 ± 0,02 Antocianinas (mg 100g-1 MF) 1,15 ± 0,13 Flavonoides (mg 100g-1 MF) 11,0 ± 1,48 Compostos fenólicos (mg de ác. gálico 100 g-1 MF) 178,4 ± 21 Taninos (mg de ác. tânico 100 g-1 MF) 233,6 ± 11 Atividade antioxidante (μmol TEAC 100 g-1 MF) 3,53 ± 1,15 Valores representam a média ± desvio padrão. MF = massa fresca. 47 2.5. Análises 2.5.1. Perda de massa: foi calculada pela diferença entre o peso inicial e final dos cajus, dividido pelo peso inicial, utilizando uma balança eletrônica com faixa de medição de 50-6000g ± 2g (Filizola, BP6, São Paulo, Brasil). Os resultados foram expressos em porcentagem do valor inicial. 2.5.2 Incidência de podridão: foi realizada por meio de análise visual, sendo os cajus classificados em 5 categorias: 0 = sem podridão; 1 = pouca (1 a 10% da área), 2 = média (11 a 20%), 3 = severa (21 a 30%) e 4 = muito severa (acima de 31%). Os resultados foram expressos em porcentagem. 2.5.3 Firmeza: a firmeza foi realizada na região equatorial dos frutos, após a retirada de uma porção da casca. Utilizou-se um penetrômetro digital com ponta de 6 mm (5–200 N ± 1N; Impac, IP-90DI, São Paulo, SP, Brasil), sendo os resultados expressos em Newton. 2.5.4 Taxa respiratória: as concentrações de CO2 foram medidas ao longo do experimento com um intervalo de 10 minutos por leitura, totalizando 960 leituras por pressão, calculada automaticamente em tempo real durante todo o período experimental, como descrito por Goyette et al Goyette et al. (2011), de acordo com a equação 1: TR= (ΔCO2 x Q) / W (1) Onde: ΔCO2 é a diferença entre a concentração de CO2 na entrada da câmara e a concentração de CO2 na saída da câmara, Q é a taxa de fluxo de ar e W é a massa dos cajus. Os resultados foram expressos em mg CO2 kg-1 h-1. 2.5.5 Produção de etileno: após o período de pressão e armazenamento quatro cajus foram acondicionados em recipientes herméticos com capacidade de 5 L e fechados. Após 1 h, amostras de 200 L da composição gasosa interna dos recipientes (head space), foram coletadas dos recipientes através de um septo de silicone, com auxílio de seringa de cromatografia gasosa (SGE, Analitical Science). As amostras foram injetadas em cromatógrafo a gás (Trace GC Ultra, Thermo Scientific) equipado com detector de ionização de chama (FID), coluna capilar Porapack N, com 2 m de comprimento e regulada para 80 °C, com hidrogênio como 48 gás de arraste (35 mL min-1). As temperaturas de trabalho do aparelho foram de 110 ºC para a coluna, 250 ºC para o detector, 200 ºC para o injetor. A produção de etileno foi determinada após a retirada dos cajus das câmaras e foi expressa em L de C2H4 kg-1 h-1. 2.5.6 Sólidos solúveis: o teor de sólido solúveis foi determinado conforme a AOAC (1997) (met. 932.12), utilizando refratômetro digital (Atago, modelo PR 101), e os resultados expressos em porcentagem. 2.5.7 Acidez titulável: a acidez titulável foi quantificada utilizando-se a metodologia descrita pela AOAC (1997) (met. 981.12), sendo expressa em % de ácido cítrico 100 g-1 MF (massa fresca). 2.5.8 Ácido ascórbico: foi determinado conforme o indicado pela AOAC (1997) (met. 967.21), e os resultados expresso em mg de ácido ascórbico 100g-1 MF. 2.5.9 Índice de cor (IC): foi determinado de acordo Mazzuz (1996), pelos parâmetros Luminosidade L*, a* e b* (colorímetro Minolta CR-400, Konica Minolta, New Jersey). As leituras foram realizadas em quatro pontos na região equatorial em cada caju e o IC foi calculado por meio da equação 2: IC = (100 x a*) / (L* x b*) (2) 2.5.10 Pigmentos: as clorofilas totais e os carotenoides foram extraídos em acetona a 80% gelada, filtrados em papel de filtro de 0,45µm e quantificados por espectrofotometria, como descrito por Lichtenthaler (1987), sendo expressos em mg 100g-1 MF. O teor de antocianinas e flavonoides foram determinados pelo método de Francis (1982), que consistiu na extração das antocianinas e flavonoides com uma solução extratora de etanol e HCl 1,5N (na proporção de 85:15, respectivamente), seguida por uma homogeneização, armazenamento sob refrigeração durante 16 horas e posterior leitura da absorbância em espectrofotômetro UV-vis (Femto 700 plus, São Paulo - SP, Brasil), em comprimento de onda de 374nm para antocianinas e 535nm para flavonoides, sendo expressos em mg 100g-1 MF. 2.5.11 Compostos fenólicos totais: foi determinado conforme o método de Folin- Ciocalteau descrito por Waterhouse (2006), com modificações. Para a extração dos 49 compostos fenólicos, 0,1 g das amostras foram maceradas em N2 líquido, pesadas, diluídas em 10 mL de acetona 80%, colocadas em balões com tampa, deixadas em repouso sob refrigeração durante 24 horas e depois filtradas em papel filtro. Alíquota de 0,200 mL do filtrado foi transferido para tubo de ensaio, adicionando-se 1,925 mL de água e 0,125 mL do reagente Folin-Ciocalteau. Após agitação, a mistura permaneceu em repouso por 5