RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 27/02/2021. GIOVANA CAROLINA DOURADO CRUCIOL CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DO Groundnut ringspot virus EM JILÓ E CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE Bemisia tabaci EM CULTIVARES DE PIMENTÃO Botucatu 2019 GIOVANA CAROLINA DOURADO CRUCIOL CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DO Groundnut ringspot virus EM JILÓ E CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE Bemisia tabaci EM CULTIVARES DE PIMENTÃO Tese apresentada a Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Agronomia (Proteção de Plantas). Orientador: Prof. Dr. Marcelo Agenor Pavan Coorientadora: Profª. Dra. Renate Krause Sakate Coorientadora: Dra. Mônika Fecury Moura Botucatu 2019 C955c Cruciol, Giovana Carolina Dourado Caracterização biológica e molecular do Groundnut ringspot virus em jiló e características biológicas de Bemisia tabaci em cultivares de pimentão / Giovana Carolina Dourado Cruciol. -- Botucatu, 2019 65 p. : tabs., fotos Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu Orientador: Marcelo Agenor Pavan Coorientadora: Renate Krause Sakate 1. GRSV. 2. Solanum aethiopicum L.. 3. Orthotospovirus. 4. Inseto-vetor. 5. Capsicum. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Agradeço a Deus e Nossa Senhora Aparecida. Dedico aos meus pais, Pedro e Helena. Ao meu irmão, Pedro Gabriel. Ao meu amado namorado, Cleyton. AGRADECIMENTOS A Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Agronômicas – Campus de Botucatu e ao Departamento de Proteção Vegetal, pela oportunidade da realização do curso de doutorado. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES), - Código de Financiamento 001, pela bolsa de estudos concedida. Ao Prof. Dr. Marcelo Agenor Pavan, pela orientação e ensinamentos que foram essenciais para o meu crescimento profissional. A Prof. Dra. Renate Krause Sakate, também pela coorientação, sugestões e contribuições nesta pesquisa, por toda simpatia, educação e ensinamentos prestados. A Coorientadora Dra. Mônika Fecury Moura, pelos momentos de conversa, pela paciência em me ensinar e me ouvir, pelos estímulos e contribuições nos ensaios. A Prof. Dra. Márcia Maria Pereira Sartori, Prof. Dra Tatiane Maria Rodrigues e MSc. Stefany Cristina de Melo Silva, pela atenção e ideias que enriqueceram esse trabalho. Aos integrantes do Laboratório de Virologia Vegetal: Késsia Pantoja, Felipe Barreto, Luís Watanabe, Bruno de Marchi, Vinícius Bello, Eduardo Gorayeb, Eduardo Vicentim, Eduardo de Souza, Viviane Egawa, Rafaela Ruschel, Isabela Gonçalves, Isabela Morcilo, Bianca Ito, Yago Alexandre, Leonardo Dovigo. Em especial ao Marcos Roberto pela amizade, companheirismo e ajuda nos trabalhos. Aos colegas de Pós-Graduação pela agradável convivência. Em especial aos alunos do laboratório de Bacteriologia Vegetal: Daniele do Nascimento, João César, Marcelo Soman, Tadeu Fernandes, Luana Melo e Letícia Nogueira. Aos professores do Programa de Pós-graduação - Proteção de Plantas, pelos ensinamentos. Aos produtores que nos receberam em suas propriedades e gentilmente nos cederam as amostras necessárias para realização de nosso estudo. Aos meus pais, Pedro Edivaldo Cruciol e Helena M. Dourado Cruciol, por terem me educado e incentivado em todas as minhas decisões. Por todo apoio prestado, me fazendo acreditar que eu era capaz de realizar esse sonho. As minhas amigas Marli Koyanagui, Adriana Hernandes, Gabriela Christal e Paula Leite, pelos momentos de conversa, descontração e por toda a amizade. Ao amado Cleyton, pela motivação nos momentos difíceis, pela paciência nas horas de estresse, pela cumplicidade, carinho e amor. Ao meu irmão Pedro Gabriel D. Cruciol e minha cunhada Lara Lobregat, pela compreensão, auxílio e participação em todos os momentos de minha vida. A toda minha família. “Existe um momento na vida de cada pessoa que é possível sonhar e realizar nossos sonhos... E esse momento tão fugaz chama-se presente e tem a duração do tempo que passa”. Mario Quintana “No momento que você pensar em desistir, lembre-se de todos os motivos que levaram você aguentar firme por tanto tempo”. desconhecido RESUMO A família Solanaceae é uma das mais importantes na agricultura, pois engloba culturas economicamente expressivas no Brasil e no mundo. Dentre os fatores que podem prejudicar a produção de solanáceas, destacam-se as viroses e a infestação por insetos. Diante dos aspectos de grande importância descritos acima a tese foi dividida em dois capítulos. O capítulo 1, trata-se do primeiro relato de groundnut rigspot virus em jiló Brasil, na qual, anormalidades foram observadas em campos de produção de jiló (Solanum aethiopicum L.) no interior de São Paulo região de Itápolis. Sintomas de anéis necróticos e concêntricos foram observados em folhas e frutos, típicos da infecção por vírus. As plantas foram submetidas a extração de RNA total e RT-PCR. Os amplicons foram purificados e sequenciados, confirmando a identidade de 99% com GRSV vírus foi identificado como groundnut ringspot virus (GRSV). Testes biológicos foram realizados em Solanum melongena cv. Napolitana, S. melongena cv. Napoli, S. melongena cv. Roma, S. aethiopicum cv. Morro Grande, S. aethiopicum cv. Comprido Verde Claro, Datura stramonium, S. lycopersicum Mariana, Nicotiana tabacum “TNN”, N. tabacum Virgínia, Capsicum annuum ‘Magali R’ e S. americanum. Ao final de 30 dias, todas as espécies testadas apresentaram sintomas sistêmica, evidenciando a infecção viral. No capítulo 2 foi abordado o desempenho de espécies crípticas de Bemisia tabaci em cultivares de pimentão. Com a introdução da espécie Mediterranean no Brasil, também conhecida por biótipo Q, e tendo a informação de que ela é muito adaptada a cultura do pimentão e apresenta baixa suscetibilidade a diferentes inseticidas, foram testados genótipos de pimentão quanto ao desempenho e atratividade das espécies MEAM1 e MED. Os acessos IAC 1549, IAC 1551 e IAC 1544 apresentaram tolerância a espécie Mediterranean, por exibirem baixa eclosão de ovos, pouca emergência de adultos, e menor sobrevivência de insetos. Além disso, IAC 1549 e IAC 1551 foram pouco atrativos para MED. A espécie Mediterranean possui maior preferência e atratividade diante de MEAM1 em pimentão. A cultivar ‘Dahra R’ se destacou por apresentar baixa preferência por oviposição, pouca emergência de adultos e menor sobrevivência de MEAM1 e MED, além de, baixa eclosão de ninfas de MED. Dessa forma, conclui-se que existem materiais tolerantes a mosca-branca, ressaltando que o emprego de cultivares tolerantes podem ser uma alternativa aos produtores no manejo de mosca-branca, além disso, há genótipos com potencial de serem integrados em programas de melhoramento, buscando o desenvolvimento de novas cultivares tolerantes a mosca- branca. Palavras chave: GRSV, Solanum aethiopicum L., Orthotospovirus, inseto-vetor, Capsicum, não-preferência. ABSTRACT The Solanaceae family is one of the most important in agriculture, since it encompasses economically expressive cultures in Brazil and in the world. Among the factors that may impair the production of solanaceous we can cite the viruses and the insect infestations. Faced with the aspects of great importance the thesis was divided into three chapters. Chapter 1, we describe the first report of groundnut rigspot virus in scarlet eggplant Brazil, in which abnormalities were observed in fields of scarlet eggplant (Solanum aethiopicum L.) in the interior of São Paulo region of Itápolis. Symptoms of necrotic and concentric rings were observed on leaves and fruits, typical of virus infection. The plants were submitted to extraction of total RNA and RT-PCR. The amplicons were purified and sequenced, confirming the 99% identity with groundnut ringspot virus (GRSV). Biological tests were performed in Solanum melongena cv. Napolitana, S. melongena cv. Napoli, S. melongena cv. Roma, S. aethiopicum cv. Morro Grande, S. aethiopicum cv. Comprido Verde Claro, Datura stramonium, S. lycopersicum Mariana, Nicotiana tabacum “TNN”, N. tabacum Virgínia, Capsicum annuum ‘Magali R’ e S. americanum. At the end of 30 days, all species tested had systemic infection. In chapter 2, the performance of critical species of Bemisia tabaci in sweet pepper cultivars was addressed. With the introduction of the Mediterranean species in Brazil, also known as Q biotype, and having the information that it is very adapted to the pepper crop and has low susceptibility to different insecticides, pepper genotypes were tested for the performance and attractiveness of MEAM1 species. and MED. The accessions IAC 1549, IAC 1551 and IAC 1544 showed tolerance to Mediterranean species, because they exhibit low hatching of eggs, little adult emergence, and lower insect survival. In addition, IAC 1549 and IAC 1551 were unattractive to MED. The Mediterranean species has greater preference and attractiveness over MEAM1 in sweet pepper. The cultivar ‘Dahra R’ stood out for its low preference for oviposition, low emergence of adults and lower survival of MEAM1 and MED, besides low hatching of MED nymphs. Thus, it is concluded that there are tolerant species to whitefly, emphasizing that the use of tolerant cultivars may be an alternative to producers in the management of whitefly, and there are genotypes with potential to be integrated in breeding programs. seeking the development of new whitefly tolerant cultivars. Keywords: GRSV, Solanum aethiopicum L., Orthotospovirus, insect-vector, Capsicum, no-preference SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 17 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 19 CAPÍTULO 1 - FIRST REPORT OF GROUNDNUT RINGSPOT VIRUS IN SCARLET EGGPLANT IN BRAZIL ............................................................................................ 30 Acknowledgements ................................................................................................... 31 References ................................................................................................................ 31 CAPÍTULO 2 - DESEMPENHO DE ESPÉCIES CRÍPTICAS DE BEMISIA TABACI EM CULTIVARES DE PIMENTÃO ........................................................................... 32 Resumo ..................................................................................................................... 32 1. Introdução ............................................................................................................. 33 2. Material e métodos ................................................................................................ 34 2.1. Identificação e criação de espécies de mosca-branca ....................................... 34 2.2. Teste com livre escolha para MEAM1 e MED .................................................... 35 2.3. Teste sem chance de escolha para MEAM1 e MED .......................................... 35 2.4. Densidade de tricomas em microscópio eletrônico de varredura ...................... 36 2.5. Análise estatística .............................................................................................. 36 3. Resultados .......................................................................................................... 36 3.1. Desempenho e atratividade de MED em genótipos de Capsicum ................... 36 3.2. Desempenho e atratividade de MEAM1 e MED em cultivares comerciais de pimentão. ................................................................................................................... 37 3.2.1. Número de ovos ........................................................................................... 37 3.2.2. Eclosão ........................................................................................................ 38 3.2.3. Número de adultos emergidos ..................................................................... 38 3.2.4. Sobrevivência ............................................................................................... 38 3.3. Atratividade de Bemisia tabaci (MEAM1 e MED) ............................................ 40 3.4. Densidade de tricomas .................................................................................... 41 4. Discussão ........................................................................................................... 44 Agradecimentos ........................................................................................................ 46 5. Referências ........................................................................................................... 47 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 52 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53 17 INTRODUÇÃO GERAL A família Solanaceae ocorre em diversas partes do mundo e tem como centro de diversidade a América Central e do Sul, onde se tem a maior riqueza de espécies (D’ARCY, 1991). É um dos grupos de plantas mais importantes na agricultura e engloba espécies cultivadas como o tomate, berinjela, jiló, batata, pimentão e pimentas. Diversas doenças causadas por fungos, bactérias, nematoides e vírus podem comprometer a produção de solanáceas, assim como também podem ser acometidas por diferentes insetos-praga, gerando grandes prejuízos aos produtores (KIMATI et al., 2005; GALLO et al., 2002). Uma doença de grande importância no Brasil e que ocorre em solanáceas é o vira-cabeça do tomateiro, causada pelo gênero Orthotospovirus, pertencente à família Tospoviridae, que apresenta o genoma RNA negativo. A doença foi relatada em 1915 na Austrália (BRITTLEBANK, 1919). E em 1930 foi nomeado o agente etiológico tomato spotted wilt virus (TSWV) que desde então é considerada a espécie tipo (SAMUEL et al., 1930; FAUQUET et al., 2005). As infecções por Orthotospovirus geram prejuízos, principalmente em se tratando de hortaliças e plantas ornamentais. Dependendo da espécie, o espectro de hospedeiros inclui um grande número de plantas de interesse econômico, além de plantas daninhas. As perdas são geradas não somente pela redução da produtividade, mas também pela deformação dos frutos refletindo diretamente na qualidade (PAPPU et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2011; ZHOU et al., 2011). O Groundnut ringspot virus é uma das espécie de Orthotospovírus prevalentes no Brasil tendo como importante vetor a espécie de tripes Frankliniella schultzei nas regiões produtoras e a alta eficiência de transmissão (NAGATA et al., 2004). Leão et al. (2014) identificaram a espécie GRSV infectando plantas comerciais de melancia (Citrullus lanatus) no estado de São Paulo. Camelo-Garcia et al. (2014) registraram a ocorrência de GRSV em plantas de amendoim forrageiro e Spadotti et al. (2014) publicaram o primeiro relato de GRSV em frutos de pepino no Brasil. A mosca-branca Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemptera: Aleyrodidae) é um dos insetos-praga mais prejudiciais e invasivos e está difundido ao redor do mundo, causando perdas a várias culturas (De BARRO et al., 2011; LAPIDOT et al., 2014). Causa dano direto, por meio da alimentação no floema da planta e danos indiretos 18 pela excreção do honeydew na superfície das folhas e dos frutos, que favorece o crescimento do fungo Capnodium sp., sendo responsável por diminuição do potencial fotossintético das plantas, além disso, é um excelente vetor de vírus (NAVAS- CASTILLO et al., 2011). Atualmente, B. tabaci é composta por um complexo de espécies crípticas, no qual há ao menos 44 espécies descritas em todo o mundo. Estas espécies englobam populações que são morfologicamente idênticas, podendo apresentar características biológicas e ecológicas diferentes, além de poderem ser diferenciadas pela análise do DNA mitocondrial do inseto (De BARRO et al., 2011; KANAKALA e GHANIM, 2019). As espécies invasivas pertencentes a este complexo são: Middle East-Asia Minor 1 - MEAM1 (também referida por biótipo B) relatada no Brasil na década de 1990 (LOURENÇÃO e NAGAI, 1994) e a espécie Mediterranean, MED (conhecida como biótipo Q), identificada em 2014 no Brasil (BARBOSA et al. 2015). B. tabaci MEAM1 é atualmente a espécie predominante e responsável por perdas de até 100% em diversas culturas. A espécie MED foi detectada até o momento nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minas Gerais e mais recentemente em Goiás, Mato Grosso e Espírito Santo (dados não publicados). Este inseto está muito relacionado a plantas ornamentais, coletadas em produções comerciais ou em floriculturas (MORAES et al., 2018; MORAES et al., 2017; BARBOSA et al., 2015). A identificação da espécie críptica MED de B. tabaci no Brasil traz novas preocupações quanto aos problemas relacionados a este inseto e transmissor de vírus. Sabe-se que MED é muito adaptada a cultura do pimentão, tendo deslocado a espécie MEAM1 em áreas de cultivo desta espécie (SUN et al. 2013). E também, têm menor suscetibilidade às doses dos inseticidas imidacloprid, tiametoxam, pyriproxifen, entre outros, quando comparado à espécie MEAM1 (SUN et al. 2013). Bemisia tabaci é uma vetora de vírus em diversas culturas. Atualmente no Brasil os problemas relacionados a vírus transmitidos por mosca-branca são mais graves na cultura do tomate, uma vez que predomina a espécie MEAM1 de mosca- branca, altamente adaptada a esta cultura (MARUBAYASHI et al. 2013). Porém, com a identificação da espécie MED e preferência por pimentão, faz-se necessário procurar fontes alternativas de controle da praga nesta cultura. Diante dos aspectos de grande importância descritos acima a tese foi dividida em dois capítulos intitulados: 1) “First report of Groundnut rigspot virus in scalet 52 CONSIDERAÇÕES FINAIS Capítulo 1 - Trata-se do primeiro relato de groundnut rigspot virus infectando jiló no Brasil. O isolado causou infecção sistêmica em berinjela cvs. Napolitana, Napoli e Roma, em jiló cvs. Morro Grande e Comprido Verde Claro, em tomateiro cv. Mariana, em pimentão cv. Magali R, Datura stramonium, Nicotiana tabacum “TNN”, N. tabacum Virgínia, e S. americanum. Capítulo 2 - A cultivar comercial ‘Dahra R’ destacou-se por apresentar baixa preferência por oviposição, pouca emergência de adultos e menor sobrevivência de Bemisia tabaci MEAM1 e MED, além de, baixa eclodibilidade de ninfas de MED. Verificou-se potencial dos acessos IAC 1549, IAC 1551 e IAC 1544 para integrarem programas de melhoramento, buscando o desenvolvimento de novas cultivares tolerantes à mosca-branca. 53 REFERÊNCIAS BARBOSA, L. DA F., YUKI, V.A., MARUBAYASHI, J.M., DE MARCHI, B.R., PERINI, F.L., PAVAN, M. A., DE BARROS, D.R., GHANIM, M., MORIONES, E., NAVAS- CASTILLO, J. First report of Bemisia tabaci Mediterranean (Q biotype) species in Brazil. Pest Manag. Sci. 71, 501–504. 2015. BARBOSA, J. C. et al. Occurrence of Tomato chlorosis virus in tomato crops in five Brazilian states. Tropical Plant Pathology, v. 36, n. 4, p. 256-258, 2011. BRITTLEBANK, C.C. Tomato diseases. Journal of the Departament of Agriculture in Victoria, Victoria, v.17, p. 1348-1352, 1919. BROWN, J. K.; FROHLICH, D. R.; ROSELL R. C. The sweetpotato or silverleaf whiteflies: biotypes of Bemisia tabaci or a species complex? Annu Rev Entomol 40: 511-534 1995. BRUNNER, P. C.; FLEMING, C.; FREY, J. E. A molecular identification key for economically important thrips species (Thysanoptera: Thripidae) using direct sequencing and a PCR-RFLP-based approach. Agric. For. Entomol. 4:127–136. 2002. BYRNE, F. J.; CASTLE, S.; PRABHAKER, N. TOSCANO, N.C. 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Magali R (I), Datura stramonium (J), S. americanum (K). 64 APÊNDICE B - Árvore filogenética construída com base na sequência do gene N do isolado de groundnut ringspot virus de Itápolis e outros isolados de GRSV 65 APÊNDICE C – Características de cultivares e híbridos de pimentões comerciais Cultivares Frutos Empresa Cascadura (cv) Verde/ vermelho Horticeres Magali R (híbrido) Verde Sakata Rubia R (híbrido) Verde/vermelho Sakata Dahra R (híbrido) Verde/vermelho Sakata Barão (híbrido) Amarelo Feltrin Beti R (híbrido) Vermelho Sakata Amarelo (híbrido) Amarelo Feltrin Rubi Gigante (cv) Verde/vermelho Feltrin Yolo Wonder (cv) Verde/vermelho Isla All Big (cv) Verde Horticeres