HHosana Gomes Rodriguesosana Gomes Rodrigues MMOODDUULLAAÇÇÃÃOO DDOOSS PPAARRÂÂMMEETTRROOSS NNUUTTRRIICCIIOONNAAIISS,, MMOORRFFOOMMÉÉTTRRIICCOOSS,, BBIIOOQQUUÍÍMMIICCOOSS SSÉÉRRIICCOOSS EE CCAARRDDÍÍAACCOOSS,, PPEELLAA SSAAPPOONNIINNAA,, EEMM RRAATTOOSS AALLIIMMEENNTTAADDOOSS CCOOMM DDIIEETTAASS RRIICCAASS EEMM LLIIPPÍÍDDIIOOSS,, CCOOLLEESSTTEERROOLL EE SSAACCAARROOSSEE Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica, da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Professora Titular Dra. Ethel Lourenzi Barbosa Novelli Botucatu – SP 2007 OORRIIEENNTTAADDOORR Profa. Dra. Ethel Lourenzi Barbosa Novelli Estudo realizado no Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista - UNESP - Botucatu. DDedicatóriaedicatória Aos meus pais Wellynton e Maria Auxiliadora, pelo exemplo de vida, amor... por existirem. AAgradecimentos Especiaisgradecimentos Especiais À Profª Drª Ethel Lourenzi Barbosa Novelli À minha orientadora e amiga, pelos conhecimentos profissionais e humanos. À minha família, Fernanda, Cláudio, Catarina, Alexandre, Nordana, Raquel, Izzy, Cecília, Milton e Therezinha por tornarem a minha vida ainda mais feliz. Ao Fabio, meu companheiro, amigo e anjo de todas as horas, pelo amor, dedicação... por fazer parte da minha história. Ao CNPq pelo apoio financeiro e incentivo ao desenvolvimento deste trabalho AAgradecimentosgradecimentos Ao Seu Ivair, Dona Maria, Felipe, Cláudia, Raílson, Mariana, Juliana, Renata, Marcelo, Lucca e Igor por me acolherem com tanto carinho. Aos meus amigos, Luciane, Jeane, Yeda, Regina, Cristiano, Geovana, Katiucha, Fábio, Gisele e Juliana pela dedicação à realização deste trabalho, pela amizade e pelos momentos compartilhados. Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Padovani do Departamento de Bioestatística, UNESP, Botucatu, pelos cuidados estatísticos. A Profa. Dra. Léa Silvia Sant’Ana, do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP, Botucatu, pela preciosa colaboração no desenvolvimento deste trabalho. À secretária da Pós-Graduação da Clínica Médica Ana Maria Mengue, aos funcionários do Laboratório Experimental da Clínica Médica Mário Baptista Bruno e José Carlos Georgette e aos funcionários da sessão de Pós-graduação da UNESP- Botucatu, Regina Célia Spadin, Nathanael P Salles, Lílian Cristina B Nunes e Janete Herculano Nunes, pela atenção e carinho que sempre demonstraram. Ao Fabio Henrique Fava e Lurdes Ribeiro de Lemos e Maria A. N. de Oliveira do Departamento de Química e Bioquímica – IB, pela dedicação e auxílio técnico. SSumárioumário CCAAPPÍÍ TTUULLOO 11 .... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. 11 AAÇÇÃÃOO DDAA SSAAPPOONNIINNAA SSOOBBRREE PPAARRÂÂMMEETTRROOSS NNUUTTRRIICCIIOONNAAIISS EE MMOORRFFOOMMÉÉTTRRIICCOOSS EEMM RRAATTOOSS AALLIIMMEENNTTAADDOOSS CCOOMM DDIIEETTAASS RRIICCAASS EEMM LLIIPPÍÍDDIIOOSS,, CCOOLLEESSTTEERROOLL EE SSAACCAARROOSSEE .... .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. 11 RESUMO ....................................................................... 2 INTRODUÇÃO................................................................... 3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................... 8 RESULTADOS.................................................................. 11 DISCUSSÃO ................................................................... 22 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS* ................................................ 30 CCAAPPÍÍ TTUULLOO 22 .... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .. 4422 PPEERRFFIILL LLIIPPÍÍDDIICCOO EE EESSTTRREESSSSEE OOXXIIDDAATTIIVVOO:: AAÇÇÃÃOO DDAA SSAAPPOONNIINNAA EEMM AANNIIMMAAIISS AALLIIMMEENNTTAADDOOSS CCOOMM DDIIEETTAASS RRIICCAASS EEMM LLIIPPÍÍDDIIOOSS,, CCOOLLEESSTTEERROOLL EE SSAACCAARROOSSEE .... .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. ..4422 RESUMO ...................................................................... 43 INTRODUÇÃO.................................................................. 44 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................... 48 RESULTADOS.................................................................. 51 DISCUSSÃO ................................................................... 65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS* ................................................ 74 CCAAPPÍÍ TTUULLOO 33 .... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .. 8899 MM OODDUULLAAÇÇÃÃOO DDOO MMEETTAABBOOLLIISSMMOO EENNEERRGGÉÉTT IICCOO EE EESSTTRREESSSSEE OOXXIIDDAATT IIVVOO MM IIOOCCÁÁRRDDIICCOO,, PPEELLAA SSAAPPOONNIINNAA,, EEMM AANNIIMMAAIISS AALLIIMMEENNTTAADDOOSS CCOOMM DDIIEETTAASS RRIICCAASS EEMM LLII PPÍÍ DDIIOOSS,, CCOO LLEESSTTEERROO LL EE SSAACCAARROOSSEE........ .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .. 8899 RESUMO ...................................................................... 90 INTRODUÇÃO.................................................................. 91 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................ 92 RESULTADOS.................................................................. 98 DISCUSSÃO .................................................................. 108 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS* ............................................... 114 CCAAPPÍÍ TTUULLOO 44 .... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. 112200 CCOONNSSIIDDEERRAAÇÇÕÕEESS FFIINNAAII SS ........ .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. .... .. .... .. .... .. ...... .. .... .. 112200 CCAAPPÍÍTTUULLOO 11 AAÇÇÃÃOO DDAA SSAAPPOONNIINNAA SSOOBBRREE PPAARRÂÂMMEETTRROOSS NNUUTTRRIICCIIOONNAAIISS EE MMOORRFFOOMMÉÉTTRRIICCOOSS EEMM RRAATTOOSS AALLIIMMEENNTTAADDOOSS CCOOMM DDIIEETTAASS RRIICCAASS EEMM LLIIPPÍÍDDIIOOSS,, CCOOLLEESSTTEERROOLL EE SSAACCAARROOSSEE Capítulo I 2 RESUMO O presente trabalho teve por objetivo determinar os efeitos da administração de saponina em ratos alimentados com dietas de diferentes proporções de lipídios, colesterol e sacarose sobre parâmetros morfométricos e nutricionais. Para tanto, 36 ratos, Wistar, 240g, foram divididos em 6 grupos com 6 ratos cada. O grupo P foi considerado controle recebendo dieta padrão. O grupo L recebeu dieta padrão acrescida de óleo de soja, colesterol e ácido cólico. O grupo S recebeu dieta padrão enriquecida com sacarose e óleo de soja. O grupo FP recebeu dieta padrão e saponina (4g/L) na água de beber. Animais do grupo FL receberam a mesma dieta do grupo L e saponina (4g/L) na água. O grupo FS recebeu a mesma dieta do grupo S e saponina (4g/L) na água. O experimento teve duração de 35 dias. Os resultados demonstraram que as dietas não elevaram o peso corporal, porém induziram alterações nos parâmetros nutricionais como eficiência alimentar e ingestão de líquidos. A administração de saponina induziu elevação no ganho de peso por aumentar a eficiência alimentar. Palavras chave: saponina, lipídios, colesterol, sacarose, parâmetros nutricionais e morfométricos. Capítulo I 3 INTRODUÇÃO A obesidade constitui uma alteração metabólica de grande prevalência nas populações atuais. Quando associada com resistência à insulina, diabetes, hiperlipidemia ou hipertensão pode levar ao aumento substancial na morbi-mortalidade (Leonhardt et al., 1999). Diversos fatores são responsáveis pela epidemia da obesidade incluindo, estilo de vida sedentário, dietas ricas em lipídios, e o consumo de “fast-food” (Grundy, 1998). Embora inúmeros estudos tenham sido desenvolvidos sobre o tema, ainda não foi identificada uma maneira eficaz para reduzir esta tendência. Hábitos alimentares são apontados como fatores que contribuem para o desenvolvimento da obesidade. Ao longo de poucas décadas, tem sido observada elevação na ingestão calórica (Putman & Allshouse, 1999), com ampla variação na proporção dos nutrientes consumidos. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a ingestão de dietas ricas em lipídios e colesterol está associada com elevação na obesidade (Seidell, 1998). A ingestão de dietas com elevada concentração de lipídios e colesterol pode predispor à obesidade, desde que o elevado consumo de lipídios estimula o apetite e induz hiperfagia (Friedman, 1998). O excessivo ganho de peso resultante é conseqüência do aumento na ingestão energética (Prentice, 1998). Além disso, algumas espécies animais oxidam ácidos graxos de forma mais lenta e possuem elevada capacidade de estocar lipídios (McGarry, 1998). As recomendações dietéticas atuais indicam que o consumo de colesterol acima de 300mg/dia tem influência negativa nos Capítulo I 4 lipídios séricos, podendo levar a distúrbios nos metabolismos de lipídios e carboidratos. Estas recomendações baseiam-se na suposição de que todas as pessoas apresentam flutuações plasmáticas nas concentrações de colesterol após sua ingestão, e que elevação no colesterol total induz diretamente aumento no risco de desenvolvimento de aterosclerose e doenças cardiovasculares (Herron et al., 2004). A recomendação atual, como medida preventiva de conseqüências adversas, tem sido a diminuição no conteúdo de lipídios, colesterol e calorias das dietas, porém na maioria das vezes, a mudança alimentar resulta no elevado consumo de carboidratos. Em 1993, Park & Yetley estimaram que o consumo individual médio de frutose em adolescentes e adultos era de 40g/dia, variando entre 29-54g/dia. Treze das 40g de frutose foram estimadas como sendo de fontes naturais, como frutas e legumes, e 27g como vindas de outras fontes de frutose. A ingestão de sacarose e, conseqüentemente, frutose tem crescido, principalmente pelo aumento no consumo de refrigerantes, cereais matinais, condimentos e sobremesas adoçadas com sacarose e xarope de milho (Elliot et al., 2002). No passado, a frutose era considerada benéfica no gerenciamento dietético do diabetes mellitus e na resistência à insulina, uma vez que a ingestão desse carboidrato resulta em menor circulação pós-prandial de glicose e insulina (Glismann & Bowman, 1993). À luz dos conhecimentos atuais, observações contraditórias foram comprovadas. Em termos de “feedback” para o sistema nervoso central (SNC), o consumo de frutose resulta em Capítulo I 5 diminuição na produção e, assim, menor sinalização da insulina e leptina no SNC. A insulina e a leptina estão envolvidas na regulação, à longo prazo, da homeostasia energética e adiposidade corporal (Havel, 2002). Brand-Miller et al. (2002) sugeriram que as recomendações dietéticas de elevação no consumo de alimentos ricos em carboidratos são ineficientes para o controle do peso. Segundo esses autores, dietas contendo alimentos ricos em carboidratos, que promovem elevada resposta glicêmica, alteram o apetite e a utilização da energia promovendo o ganho de peso. Elevada ingestão de carboidratos está geralmente associada com aumento no efeito glicêmico da dieta. Tanto a quantidade como a qualidade dos carboidratos influenciam a glicemia pós- prandial, e a interação entre os dois pode ser sinérgica (Brand- Miller et al., 2002). Na tentativa de reduzir os efeitos da ingestão de dietas desbalanceadas, tem sido observado aumento no consumo de alimentos funcionais. Alimentos funcionais são definidos, segundo o International Food Information Council Foundation (1998), como aqueles que proporcionam benefícios à saúde além da nutrição básica. Segundo a Americam Dietetic Association (2004) os alimentos não devem ser analisados apenas em termos de macro e micronutrientes. A análise das substâncias fisiologicamente ativas e a avaliação do papel dessas substâncias na promoção da saúde tornam-se necessárias. Os flavonóies pertencem a um grupo de compostos naturais com grande variedade de estruturas fenólicas, sendo encontrados em frutas, grãos, sementes, chás e vinhos (Middleton, 1998). Uma Capítulo I 6 “substância fenólica ou polifenólica” é aquela que possui um ou mais núcleos aromáticos contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados funcionais (ésteres, éteres, glicosídeos) (Simões et al., 2004). Mais de 4000 variedades de flavonóides tem sido identificadas (de Groot & Rauen, 1998). O esqueleto básico dos flavonóides, composto por dois anéis aromáticos ligados por uma ponte de três átomos de carbono, resulta de rotas biossintéticas separadas: a do ácido chiquímico e a do acetato, via ácido malônico. A primeira origina fenilalanina, o precursor do ácido cinâmico que, por sua vez, origina o ácido cumárico, responsável por um dos anéis aromáticos (anel B) e a ponte de 3 carbonos. A segunda, resulta no outro anel aromático (anel A) do esqueleto básico dos flavonóides (Simões et al., 2004). A B O Figura 1. Estrutura geral de um flavonóide. Pesquisas com flavonóides receberam impulso adicional com a descoberta do “Paradoxo Francês”, isto é, o baixo nível de mortalidade cardiovascular observado nas populações do Mediterrâneo em associação ao consumo de vinho tinto e a elevada ingestão de gordura saturada (Nijveldt et al., 2001). Capítulo I 7 Os flavonóides são divididos em várias classes, baseado na estrutura molecular. Saponinas são flavonóides, formados por glicosídeos de esteróides, presentes em grande diversidade de plantas. Originalmente o termo saponina (sapon = sabão) foi atribuído a um grupo de substâncias que se dissolviam em água diminuindo a tensão superficial. São substâncias de elevada massa molecular e, de modo geral, ocorrem em misturas complexas devido à presença concomitante de estruturas com número variado de carboidratos, ou ainda devido à presença de diversas agliconas (Simões et al., 2004). Ao longo do tempo, esse grupo de substâncias tem apresentado grande interesse farmacêutico, seja como adjuvante em formulações, componentes ativos em drogas vegetais, ou ainda, como matéria-prima para a síntese de esteróides (Simões et al., 2004). Diversas ações são atribuídas à saponina como atividade antioxidante (Huong et al., 1998), emulsificante (Cheeke, 1999), hipocolesterolêmica (Thompson, 1993) e hipoglicêmica (Shimizu et al., 1997). Embora muito tenha sido estudado sobre os efeitos adversos associados ao consumo de dietas hipercalóricas, os efeitos da ingestão de dietas isocalóricas contendo diferentes proporções de lipídios, colesterol e sacarose ainda não foram estabelecidos. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo determinar os efeitos da administação de saponina, sobre parâmetros nutricionais e morfométricos, em ratos alimentados com dietas ricas em lipídios, colesterol e sacarose. Capítulo I 8 MATERIAL E MÉTODOS 1. ANIMAIS Foram utilizados 36 ratos machos adultos Wistar, de peso médio 240 gramas. Os animais eram provenientes do Biotério Central da UNESP "campus de Botucatu" e foram transferidos para o “Laboratório de Bioquímica na Experimentação Animal” do Departamento de Química e Bioquímica, Instituto de Biociências, UNESP/Botucatu, onde permaneceram durante todo o período experimental, à temperatura de 23 ± 2°C, período claro/escuro de 12 horas. Os animais foram mantidos em gaiolas de plástico individuais, recebendo dieta e água destilada ad libitum. Para permitir a aclimatação dos animais, os ratos permaneceram nas condições acima citadas por um período de 15 dias antes do início do experimento. Diariamente as gaiolas foram limpas. 2. GRUPOS EXPERIMENTAIS Os animais foram divididos em 6 grupos (P, L, S, FP, FL e FS) com 6 ratos cada. O grupo P foi considerado controle (n=6), recebendo dieta padrão, Purina – Labina (Campinas, SP, Brasil). Os animais do grupo L (n=6) receberam dieta padrão acrescida de óleo de soja, colesterol e ácido cólico (Duarte et al., 1998). O grupo S (n=6) recebeu dieta padrão enriquecida com sacarose e óleo de soja (Chicco et al., 1991). O grupo FP (n=6) recebeu dieta padrão e saponina (4g/L) na água de beber. Animais do grupo FL (n=6) receberam dieta padrão acrescida de óleo de soja, colesterol e ácido cólico e saponina (4g/L) na água. O grupo FS (n=6) recebeu dieta padrão enriquecida com sacarose, óleo de soja e saponina (4g/L) na água. Capítulo I 9 As diferentes rações foram preparadas a partir do farelo da ração basal em concentrações que permitiram garantir o suprimento adequado de vitaminas, sais minerais, ácidos graxos e aminoácidos essenciais (Bieri et al., 1977). 3. DIETAS No preparo da ração contendo elevada concentração de lipídios, colesterol e ácido cólico, foram adicionadas ao farelo da ração basal, 120g de óleo de soja, 10g de colesterol cristalino e 1g de ácido cólico para cada 1 Kg de ração (Duarte et al., 1998). A ração enriquecida com sacarose foi preparada a partir do farelo da ração basal, sendo adicionadas 600g de sacarose e 60g de óleo de soja para cada 1Kg de ração (Chicco et al., 1991). Todas as misturas foram homogeneizadas com 2300mL de água quente (inferior a 60 ºC). A seguir, as rações foram colocadas em máquina específica para formação de "pellets". Estes foram secos em estufa com ar circulante por um período de 24h, em temperatura inferior a 70°C. Após secagem as rações foram deixadas à temperatura ambiente para esfriar durante 24h, e conservadas em câmara fria à 6°C. A validade das rações preparadas era de 3 meses. 4. PARÂMETROS NUTRICIONAIS E MORFOMÉTRICOS O consumo alimentar e a ingestão de líquidos foram determinados diariamente, no mesmo horário (9:00-10:00hs). Diariamente foi ofertada 50g de ração e 75mL de líquido por animal. O consumo alimentar diário foi obtido pela subtração da dieta ofertada e o peso da dieta restante, após o consumo “ad libitum” em 24 horas. A ingestão de líquidos foi obtida pela Capítulo I 10 subtração da água ou solução ofertada e quantidade restante, após o consumo “ad libitum” em 24 horas. Os animais foram pesados antes do início do experimento e semanalmente durante todo o período de tratamento. Tendo como base o consumo alimentar diário médio, a energia da ração, as porcentagens de proteínas, lipídios e carboidratos e o ganho de peso, foram calculados os parâmetros nutricionais (Faine et al., 2002; Diniz et al., 2005; Burneiko et al., 2006; Ebaid et al., 2006): • Energia Ingerida (EI; Kcal/dia) = consumo diário médio de ração X energia metabolizável de ração em Kcal/g • Eficiência Alimentar (EA; %) = [Ganho de peso (g)/energia ingerida no período total (Kcal)] X 100. • Consumo de proteínas (CP; g/dia) = consumo diário médio de ração X porcentagem de proteínas da ração. • Consumo de lipídios (CL; g/dia) = consumo diário médio de ração X porcentagem de lipídios da ração. • Ingestão de carboidratos (IC; g/dia) = consumo diário médio de ração X porcentagem de carboidratos da ração. Após 35 dias de tratamento, os animais foram anestesiados para determinação do comprimento corporal (cabeça ao ânus, exceto a cauda). Como parâmetros morfométricos foram utilizados o índice de massa corporal (IMC) (Diniz et al., 2006) e o índice de Lee (Bernardis, 1970). O IMC foi calculado dividindo-se o peso dos animais (g) pelo seu comprimento ao quadrado (cm2). O índice de Lee foi obtido através da raiz cúbica do peso corporal (g) dividida pelo comprimento (cm) dos ratos. Capítulo I 11 5. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados obtidos foram expressos como média ± desvio padrão. A comparação entre os grupos foi realizada pela técnica de análise de variância (ANOVA) para o esquema de três fatores (colesterol, sacarose e saponina) com dois níveis (ausência e presença) no experimento completamente casualizado (Zar, 1994). O nível de significância foi de 5% para a discussão dos resultados (Norman & Streiner, 1994). As letras utilizadas nas tabelas e figuras são referentes as seguintes comparações: (a) Indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (b) Indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) Indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. RESULTADOS Pode-se observar, nas Tabelas 1 e 2 e Figura 2, que as dietas utilizadas eram isocalóricas. Uma vez que o colesterol não fornece calorias adicionais, utilizou-se óleo de soja nas dietas experimentais, para obtenção de valores energéticos similares. As concentrações de fibra neutra, umidade, sais minerais e vitaminas foram suficientes para a manutenção normal das atividades orgânicas dos animais. As dietas apresentaram diferente distribuição energética entre os macronutrientes sem, entretanto, haver modificação no conteúdo calórico total. Capítulo I 12 Não houve diferença significante no peso inicial, peso corporal final, índice de massa corporal (IMC) e índice de Lee entre os grupos. O ganho de peso foi semelhante entre os animais que não consumiram saponina, bem como entre os grupos FP e FS. O grupo FL apresentou elevação no ganho de peso, quando comparado aos animais do grupo FP. Foi observado aumento no ganho de peso quando comparados os grupos que receberam saponina com seus respectivos controles (Tabela 3). Não foi observada diferença estatística na ingestão alimentar (IA) e na energia ingerida (EI) entre a maior parte dos grupos estudados. O grupo FL elevou a IA e a EI em relação ao grupo L. Os grupos FS e FL apresentaram aumento na EI em relação ao grupo FP. Houve elevação da EI nos ratos do grupo L em relação aos do grupo P (Tabela 4) Não houve modificação na eficiência alimentar (EA) na ausência de saponina. Animais que receberam saponina apresentaram elevação na EA e no ganho de peso em relação aos seus controles, sem saponina (Tabela 4 e Figura 3). Os grupos P e L, FP e FL não apresentaram alteração significante na ingestão de líquidos (IL). Nos grupos que receberam saponina foi observada elevação na IL em relação aos seus controles, sem saponina. Os grupos S e FS reduziram a IL em relação aos animais dos grupos P e FP, respectivamente (Tabela 4). Não foi observada diferença significante no consumo de proteínas (CP) entre os grupos que receberam saponina e os seus controles sem saponina. Os grupos L e S apresentaram diminuição Capítulo I 13 no CP em relação aos ratos do grupo P. Animais do grupo FL e FS reduziram o CP em relação aos animais do grupo FP (Tabela 5). Não houve alteração no consumo de lipídios (CL) quando comparados os grupos FP e FS com seus controles P e S, respectivamente. Houve elevação no consumo de lipídios nos grupos L e S em relação ao grupo P, e nos grupos FL e FS em relação ao grupo FP. Ratos do grupo FL apresentaram aumento no CL em relação ao grupo L (Tabela 5). A ingestão de carboidratos (IC) não variou de maneira significante entre os grupos P e L, bem como entre FP e FL. A análise, entre os grupos que receberam saponina com seus controles, não indicou diferença significante na IC. Os grupos S e FS apresentaram elevação na IC em relação aos animais P e FP, respectivamente (Tabela 5). Na Figura 4, pode-se observar que os animais dos grupos S e FS aumentaram a IC e diminuíram a ingestão de líquidos. Capítulo I 14 Tabela 1. Composição centesimal das dietas padrão (P), rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L) e com elevada concentração de sacarose (S) Componentes C L S Proteína bruta (g/100g de ração) 23,54 19,77 14,00 Lipídio (g/100g de ração) 1,87 9,57 3,27 Carboidrato (g/100g de ração) 43,88 40,91 59,85 Fibra neutra (g/100g de ração) 13,85 13,26 9,39 Outros* 16,86 16,49 14,29 Determinações realizadas no Laboratório de Tecnologia de Produtos Agropecuários da Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA) da UNESP/Botucatu. (*) Outros: Umidade, sais minerais e vitaminas. Sais minerais (mg/Kg de ração): manganês 50 mg; iodo 2mg; ferro 65mg; zinco 35 mg, cobre 26 mg. Vitaminas: (A) retinol 20.000 UI; (D3) 6.600 UI; (E) 30 UI; (K) 6mg; (B12 ) 10 mg; (B2) 8 mg; pantotenato de cálcio 24 mg; niacina 95 mg; tiamina 4 mg; colina 2.000 mg; piridoxina 6 mg; biotina 0,1 mg; ácido fólico 0,5 mg. Composição bás ica do produto: milho, farelo de trigo, farelo de soja, farinha de carne, farelo de arroz cru, carbonato de cálcio, fosfato bicálcico, sal. Valores obtidos com base na composição da ração Purina-Labina. Capítulo I 15 Proteína Lipídios Carboidratos Figura 2. Porcentagem calórica proveniente de cada macronutriente das dietas padrão (P), rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L) e rica em sacarose (S). P Proteína Lipídio Carboidrato L Proteína Lipídio Carboidrato S Capítulo I 16 Tabela 2. Porcentagem calórica proveniente de cada componente das dietas padrão (P), rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L) e com elevada concentração de sacarose (S) Componentes (% calórica) P L S Proteína (% calórica) 32,86 24,04 16,83 Lipídios (% calórica) 5,87 26,19 9,10 Carboidratos (% calórica) 61,26 49,74 74,06 Energia (Kcal/g) 2,86 3,28 3,23 Capítulo I 17 Tabela 3. Peso inicial, ganho de peso, peso final, índice de massa corporal (IMC) e índice de Lee dos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS) GRUPOS SEM SAPONINA GRUPOS COM SAPONINA P L S FP FL FS Peso inicial (g) 239,0±14,8 242,2±13,1 242,9±28,5 217,9±25,5 221,3±17,4 223,5±24,0 Ganho de peso (g) 136,4±22,7 160,5±18,8 148,2±20,5 170,2±27,6c 207,1±32,3bc 202,4±43,5c Peso final (g) 375,5±24,1 402,7±27,5 391,2±41,5 388,2±23,0 428,4±47,8 425,9±55,7 IMC (g/cm2) 0,69±0,02 0,67±0,03 0,70±0,04 0,70±0,006 0,71±0,006 0,71±0,007 Índice de Lee 0,30±0,005 0,30±0,006 0,30±0,008 0,31±0,01 0,30±0,008 0,30±0,01 Valores expressos como média±desvio-padrão. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. Capítulo I 18 Tabela 4. Ingestão alimentar (IA), energia ingerida (EI), eficiência alimentar (EA) e ingestão de líquidos (IL) dos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS) GRUPOS SEM SAPONINA GRUPOS COM SAPONINA P L S FP FL FS IA (g/dia) 24,18±1,75 23,83±1,45 23,88±0,87 25,59±1,43 26,69±3,4c 25,48±2,87 EI (Kcal/dia) 69,17±5,02 78,19±4,76b 77,15±2,83 73,20±4,10 87,57±11,19bc 82,30±9,27a EA (%) 5,76±0,41 5,85±0,45 5,47±0,59 6,82±0,94c 6,94±0,54c 7,16±0,88c IL (ml/dia) 36,08±4,71 32,61±2,13 28,08±2,96a 47,12±3,60c 44,20±2,75c 33,06±1,84ac Valores expressos como média±desvio-padrão. (a) indica diferença significante entre os grupos: Px S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. Capítulo I 19 0 50 100 150 200 250 300 P L S FP FL FS G a n h o d e p e s o ( g ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 E A ( % ) Ganho de peso Eficiência Alimentar Figura 3. Ganho de peso e eficiência alimentar (EA) nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. c bc c c c c Capítulo I 20 Tabela 5. Consumo de proteínas (CP), consumo de lipídios (CL) e ingestão de carboidratos (IC) dos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS) GRUPOS SEM SAPONINA GRUPOS COM SAPONINA P L S FP FL FS CP (g/dia) 5,69±0,41 4,71±0,28b 3,24±0,11a 6,02±0,33 5,27±0,67b 3,46±0,39a CL (g/dia) 0,45±0,03 2,28±0,13b 0,78±0,02a 0,47±0,02 2,55±0,32bc 0,83±0,09a IC (g/dia) 10,61±0,77 9,75±0,59 14,29±0,52a 11,23±0,63 10,92±1,39 15,25±1,71a Valores expressos como média±desvio-padrão. (a) indica diferença significante entre os grupos: Px S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. Capítulo I 21 0 5 10 15 20 P L S FP FL FS Grupos In g es tã o d e ca rb o id ra to s (g /d ia ) 0 10 20 30 40 50 60 In g e s tã o d e l íq u id o s (m L /d ia ) Ingestão de carboidratos Ingestão de líquidos Figura 4. Ingestão de carboidratos e ingestão de líquidos nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. a c c ac a a Capítulo I 22 DISCUSSÃO O conhecimento dos efeitos biológicos dos componentes alimentares tem modificado a importância dada à alimentação na manutenção da saúde. Atualmente, a ingestão de dietas inadequadas, ricas em colesterol e carboidratos, tem aumentado na maioria das populações (Schauwen et al., 2000), podendo estar associada ao aparecimento de obesidade e inúmeras repercussões sistêmicas como dislipidemias (McNamara, 2000; Matos et al., 2005) e alterações cardiovasculares (Novelli et al., 2002; Diniz et al., 2002; Faine et al., 2002). Tem sido demonstrado que o desequilíbrio alimentar constitui uma das principais causas do desenvolvimento e perpetuação de diversas doenças crônico- degenerativas (Neves, 1997; Balkan et al., 2004). Inúmeros estudos comprovam a importância do controle da ingestão de determinados nutrientes como, colesterol, lipídios saturados e carboidrato refinado, em relação à ingestão total de calorias, na prevenção de patologias (Danforth, 1985; Flatt, 1987; Prewitt et al., 1991; Storleien et al., 2000; Achesson, 2004). Entretanto, a despeito do grande número de estudos sobre o tema, os efeitos da variação dos componentes das dietas, sobre parâmetros nutricionais e morfométricos ainda não estão claramente definidos. Estudos recentes têm indicado que mudanças nos hábitos alimentares podem representar medidas iniciais na prevenção e tratamento de várias patologias (Costa et al., 2000; Kaur & Kapoor, 2001; Battino et al., 2002). A atribuição de efeitos benéficos à ingestão de componentes naturais, e substâncias com Capítulo I 23 propriedades antioxidantes, como os flavonóides, tem levado ao aumento da ingestão destes compostos, na maioria das populações. Embora, as reais conseqüências do elevado consumo destes compostos, ainda não estejam efetivamente estabelecidas. Neste estudo, foram evidenciados os efeitos da administração de saponina sobre parâmetros morfométricos e nutricionais de ratos mantidos com dietas contendo diferentes proporções de lipídios, colesterol e sacarose. Desde que as dietas utilizadas foram isocalóricas (Tabelas 1 e 2 e Figura 2) (Matsuo et al., 1995), é evidente, que os efeitos da ingestão das diferentes dietas foram decorrentes da modificação nos seus componentes, e que as conseqüências da ingestão de lipídios, colesterol e sacarose foram estudadas, sem a interferência da quantidade calórica das dietas. O consumo de proteínas (CP) foi diminuído nos animais que ingeriram as dietas ricas em colesterol ou sacarose em relação à dieta padrão (Tabela 5). Segundo Reeves (1997) ratos adultos necessitam de 14% de proteína para a manutenção do peso e desenvolvimento normais. A Tabela 1 mostra que todas as dietas apresentavam mais de 14% de proteína, não sendo, portanto, hipoproteícas. O consumo de lipídios (CL) e a ingestão de carboidratos (IC) comprovam que as dietas ofertadas foram eficientes para variar a ingestão destes nutrientes. Animais alimentados com dieta rica em óleo de soja e colesterol apresentaram elevado consumo de lipídios. Ratos alimentados com dieta rica em sacarose apresentaram aumento na ingestão de carboidratos. Como esperado, a administração de saponina não alterou o CP, CL e IC (Tabela 5). Capítulo I 24 Após 5 semanas de tratamento o ganho de peso, o peso corporal final, o índice de massa corporal (IMC) e o índice de Lee foram semelhantes nos animais que não receberam saponina (Tabela 3). Desde que elevação no IMC (Diniz et al., 2006) e no índice de Lee (Bernardis, 1970) é utilizada para caracterizar obesidade em ratos, está claro que as dietas utilizadas não induziram obesidade. Resultados concordantes foram obtidos por Mudallal et al. (1995) e Sória et al. (2001), que não observaram alterações significantes no peso corporal final, de ratos alimentados com dietas ricas em carboidratos. Embora possa haver concordância entre alguns autores quanto à manutenção do peso corporal, após ingestão de diferentes tipos de dietas, o mecanismo através do qual os componentes da dieta atuam no peso corporal tem demonstrado inúmeras controvérsias. A conversão de glicose em lipídio, através da lipogênese, só ocorre após a reposição dos estoques teciduais de glicogênio. Este processo consome quantidade considerável de energia, dificultando dessa forma o ganho de peso (Flatt, 1992). Lammert et al. (2000) afirmaram que dietas com conteúdos de sacarose de 15 a 30% induziam elevação na eliminação de energia através das fezes, o que contribuiria para a manutenção do peso corporal. Archer et al. (2003), observaram redução no peso de indivíduos alimentados com dieta contendo elevada concentração de carboidratos. Segundo estes autores, não houve alteração no consumo de energia durante o período experimental. Entretanto, foi observada importante variabilidade individual nas mudanças do peso corporal, em resposta à elevada ingestão de carboidratos. Indivíduos que iniciaram o estudo com peso Capítulo I 25 corporal mais elevado foram os que apresentaram a maior redução no peso final. A resposta ao consumo elevado de sacarose pode também depender da espécie animal estudada. Enquanto ratos Osborne- Mendel respondem com acúmulo de lipídios e ganho de peso, outras espécies (como a S5B/PI) apresentam perda de peso (Schemmel et al., 1982). A ação da sacarose dietética na manutenção, redução, ou ganho de peso corporal, também é dependente da forma na qual ela é administrada. Sacarose pode elevar a ingestão e aumentar o ganho de peso, quando administrada separadamente da ração, como uma solução aquosa (Lawton & Blundell, 1992). Neste caso, o animal pode modular a ingestão de sacarose em relação ao consumo de outras fontes energéticas. Em contraste com uma dieta rica em sacarose, na qual a única forma do animal reduzir o consumo de sacarose é diminuindo a ingestão de ração (Goodson et al., 2001). Em relação aos lipídios, diversos autores não demonstraram elevação no ganho de peso em ratos alimentados com dietas ricas em lipídios (Prewitt et al., 1991; Kim et al., 2000; Iossa et al., 2003). Ratos que ingeriram elevadas quantidades de lipídios preveniram a obesidade através do aumento no gasto energético corporal e pela oxidação lipídica (Iossa et al., 2000). Estas adaptações estão relacionadas com modificações na atividade metabólica de órgãos e tecidos, especialmente fígado e músculos (Cleary et al., 1985). Entretanto, estudos demonstram que a adaptação metabólica à mudanças na ingestão de lipídios é lenta, e se existir predisposição genética para o acúmulo de tecido Capítulo I 26 adiposo, a elevação no conteúdo lipídico da dieta pode aumentar a probabilidade do desenvolvimento da obesidade (Abbot et al., 1988; Hill et al., 1991; Thomas et al., 1992; Astrup et al., 1994). Blundell & Mcdiarmid (1997) observaram que indivíduos alimentados com dieta rica em lipídios (45% das calorias) apresentaram aumento no IMC em relação ao grupo que ingeriu dieta de baixa concentração de lipídios (menos de 35% das calorias). Entretanto, grande número de indivíduos que consumiram elevada quantidade de lipídios não apresentaram alteração no IMC. No presente trabalho, não foram observadas alterações no IMC, bem como no índice de Lee. Feoli et al. (2003) não observaram variação no ganho de peso e peso corporal final, quando estudaram os efeitos da adição de 1% de colesterol à ração de ratos. A elevação na energia ingerida pelos animais que receberam dieta rica em lipídios e colesterol (grupos L e FL), comparados aos grupos com dieta padrão (grupos P e FP) e a manutenção no peso corporal (Tabela 3 e Figura 3), foram associadas à característica não-energética do colesterol. Desde que a estrutura em anel do colesterol não pode ser metabolizada a CO2 e H2O, não ocorre liberação de energia quando este nutriente é degradado (Champe et al., 2006). A análise do peso corporal dos animais que receberam saponina permitiu observar, que a elevação no ganho de peso nos animais do grupo FL em relação aos animais do grupo FP foi associada á elevada ingestão energética destes animais (Tabelas 3 e 4). Kim et al. (2005) demonstraram que a saponina reduziu a Capítulo I 27 concentração de leptina em ratos alimentados com dietas de elevado conteúdo lipídico. A leptina constitui importante fator na regulação da ingestão alimentar e estimulação do gasto energético (Maffei et al., 1995), sendo considerada o sinal da saciedade. Administração de leptina em ratos geneticamente obesos reduz a ingestão alimentar e conseqüentemente o ganho de peso (Houseknecht et al., 1998). A deficiência congênita de leptina em humanos está associada com início precoce da obesidade. Desta forma, o aumento no ganho de peso e na ingestão alimentar dos animais mantidos com dieta rica em lipídios e colesterol e que receberam saponina, poderia estar associado à alteração na resposta metabólica à leptina. Independente da manutenção do consumo alimentar e da energia ingerida, animais que receberam saponina apresentaram elevação no ganho de peso, quando comparados aos controles, sem saponina (Tabela 3 e Figura 3). Segundo Harbone (1986), os flavonóides representam importantes constituintes não-energéticos da dieta. Este fato indicou claramente, que a elevação no peso corporal esteve associada à elevação na eficiência alimentar induzida pela saponina (Tabela 4). É evidente que a saponina proporcionou melhor aproveitamento dos componentes calóricos das dietas. Vários processos podem estar associados ao mecanismo da ação da saponina sobre os componentes dietéticos. A saponina afeta o sistema enzimático e os mecanismos de transporte localizados nas membranas celulares da mucosa intestinal (Onning et al., 1996). Embora reduzindo o transporte ativo de galactose Capítulo I 28 em ratos, a saponina aumenta a captação de nutrientes pelo transporte passivo (Johnson et al., 1986). Na digestão e absorção dos lipídios, estão envolvidas a emulsificação e a formação de micelas. A saponina apresenta atividade surfactante e detergente, podendo influenciar a emulsificação de substâncias solúveis em lipídios no intestino, incluindo a formação de micelas contendo ácidos biliares, ácidos graxos, diacilgliceróis e vitaminas lipossolúveis (Cheeke, 1999). Segundo Oakenfull & Sidhu (1989) a saponina estabiliza a interface óleo/água das micelas. A ingestão de grãos, como trigo e aveia que contém ß glucanas, ou gomas viscosas pouco solúveis em água reduz a absorção de compostos pela mucosa intestinal, devido a elevada viscosidade. Tem sido demonstrado que a saponina pode aumentar a solubilidade destes compostos, através da ação surfactante, levando ao melhor aproveitamento destes grãos (Cheeke, 1999). Francis et al. (2002) observaram que peixes tratados com saponina apresentaram elevação na eficiência alimentar e aumento no crescimento corporal. Segundo estes autores, os efeitos da saponina estavam associados ao aumento da absorção de nutrientes, através das membranas intestinais, cuja permeabilidade era elevada pela saponina. Neste mesmo estudo, foi verificado que a saponina também atua reduzindo o catabolismo, indicando que na presença de saponina, ocorre aumento no conteúdo energético disponível para estoque. Deste modo, por aumentar a emulsificação e a digestão de lipídios, a saponina melhora o aproveitamento dos componentes dietéticos, elevando a eficiência alimentar. Capítulo I 29 A propriedade emulsificante da saponina pode estar associada ao aumento na ingestão de líquidos pelos animais que receberam o flavonóide. Independente da dieta, a administração de saponina elevou consideravelmente a ingestão de líquidos (IL) (Tabela 4). Silva et al. (2005) atribuíram a saponina importante efeito diurético. Desta forma, a saponina pode aumentar o fluxo urinário, com elevação compensatória na IL. Estudos recentes demonstram que a saponina exerce atividade antiinflamatória (Sur et al., 2001; Kim et al., 2006). Segundo estes autores, a saponina reduz o edema causado por drogas indutoras de inflamações. Estes fatos constituem evidências favoráveis à observação que o ganho de peso nos grupos com saponina foi decorrente do aumento na eficiência alimentar, embora tenha havido elevação na IL, nestes animais. É notório o fato que elevada ingestão de carboidratos induz aumento na síntese hepática de ácidos graxos (Novelli, 2005). Também é conhecido o fato que a metabolização da glicose à acetil coenzima-A e a síntese de ácidos graxos a partir de acetil coenzima-A libera quantidade considerável de água. Estes fatos podem estar associados à redução na ingestão de líquidos pelos animais, que consumiram dieta rica em sacarose (Tabela 4 e Figura 4). Desta forma, animais que receberam dieta rica em sacarose utilizaram o excesso de glicose, proveniente da ração, para a formação de lipídios, liberando suficiente quantidade de água. Os resultados deste estudo permitiram concluir que alterações nos componentes das dietas induziram modificações no consumo de macronutrientes, afetaram o consumo alimentar e a Capítulo I 30 ingestão de líquidos sem, entretanto afetar o peso corporal. A administração de saponina induziu elevação no peso corporal, aumentando a eficiência alimentar, permitindo assim, melhor aproveitamento dos componentes da dieta. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS* * International Committee of Medical Journal Editors. Uiform requirements for manuscripts submittd journal. N Engl J Med 1997; 336: 309-315. Abbot WGH, Howard BV, Christin L, et al. Short-term energy balance: relationship with protein, carbohydrate and fat balances. Am J Physiol 1988; 255:E332-E337. Achesson KJ. Carbohydrate and weight control: wheredo we stand? 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Grupo FL recebeu a mesma dieta do grupo L e saponina (4g/L) na água. O grupo FS recebeu a dieta do grupo S e saponina (4g/L) na água. O experimento teve duração de 35 dias. Os resultados demonstraram que as dietas utilizadas induziram diferentes tipos de dislipidemias e EO. O consumo de saponina foi eficaz na normalização da lipidemia e na redução do EO, através de suas propriedades antioxidantes. Palavras chaves: Dietas inadequadas, flavonóides, estresse oxidativo, dislipidemias. Capítulo II 44 INTRODUÇÃO As doenças cardiovasculares (DC) representam a principal causa de mortalidade prematura e de invalidez permanente. (Americam College of Cardiology, 2003). A alteração cardiovascular tem sido reconhecida como a ponta de um iceberg, no qual a parte submersa representa o conjunto de anormalidades metabólicas precedentes (Americam College of Cardiology, 2003). Este fato estaria relacionado à ocorrência de danos cardíacos em indivíduos aparentemente saudáveis, o que aumenta substancialmente o risco de eventos cardiovasculares subseqüentes. Existe, portanto, grande interesse no controle das alterações metabólicas que podem ocorrer em indivíduos assintomáticos. Hábitos alimentares inadequados constituem importantes fatores associados ao aparecimento de dislipidemias e, conseqüentemente, DC. A recomendação freqüente, como medida preventiva de conseqüências adversas, tem sido a diminuição no conteúdo de lipídios e calorias das dietas, porém na maioria das vezes, a mudança alimentar resulta no elevado consumo de carboidratos. Acrescentam-se ainda ingestão de dietas ricas em colesterol, que contribui consideravelmente para o aparecimento de dislipidemias e aterosclerose (Costa et al., 2000). Dietas suplementadas com frutose e sacarose induzem alterações metabólicas em animais, semelhantes às observadas em indivíduos diabéticos, incluindo anormalidades vasculares na retina e esclerose glomerular renal (Poulson, 1986). Elevada ingestão de frutose induziu hipertrigliceridemia, hipertensão e elevada resistência à insulina em ratos (Bezerra et al., 2001). Capítulo II 45 A hipertrigliceridemia está freqüentemente associada ao aumento na resistência à insulina (Seboková et al., 1996) e repetidos episódios de hiperglicemia pós-prandial, decorrente da elevação na resistência à insulina, podem induzir alterações vasculares resultando disfunção pancreática (Svensson et al., 1996). Dietas ricas em gorduras saturadas e colesterol são consideradas aterogênicas por elevarem os níveis plasmáticos de colesterol e triacilgliceróis, elevando, portanto, fatores de risco na etiologia da doença isquêmica cardiovascular (Neves, 1997). Schwab et al. (2000) verificaram que a adição de colesterol em dietas com óleo de milho resultou em aumento na susceptibilidade à oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL-colesterol). Também tem sido demonstrado que ingestão de dietas ricas em colesterol é responsável pela elevação na concentração sérica do colesterol e da LDL em humanos (Gaw et al., 2001). Duarte et al. (1998), observaram aumento de 57% no colesterol sérico de ratos alimentados com dietas ricas em colesterol e contendo ácido cólico. Ratos tratados com dietas ricas em colesterol apresentaram elevação na concentração de triacilglicerol (TG) (Balkan et al., 2004). Vários trabalhos têm demonstrado o papel aterogênico dos triacilgliceróis (Bloongarden 2002; Brizzi et al., 2003). É notória a associação entre elevação na colesterolemia, aterosclerose e a doença arterial coronariana (Naderali et al., 2004). A dislipidemia induz anormalidades na função arterial e acúmulo de LDL-colesterol no endotélio vascular (Naderali & Capítulo II 46 Williams, 2001). Fatores de risco para a doença cardiovascular incluem elevações nas concentrações de triacilglicerol, colesterol, ácidos graxos livres, LDL-colesterol e diminuição na lipoproteína de elevada densidade (HDL-colesterol) (Abuja & Albertini, 2001). Dislipidemias e estresse oxidativo constituem evidências da maior predisposição à formação de LDL-oxidada e aparecimento de aterosclerose. Estresse oxidativo denota a diferença entre a produção de espécies oxidantes e seus respectivos mecanismos de defesa. Oxidantes podem ser gerados através de radiação iônica, reações químicas, reações enzimáticas, através de catalisação de oxido- redução envolvendo íons de metais de transição, ou ligações de íons a enzimas (Novelli, 2005). Durante o estresse oxidativo, radicais livres tais como o radical superóxido (O2 -), radical hidroxil (OH-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) podem produzir danos, como a peroxidação de lipídios insaturados das membranas celulares. A lipoperoxidação é uma reação em cadeia, desde que se propaga continuamente, levando a formação de lipoperóxidos e à destruição celular. Para evitar esta situação o meio biológico dispõe de vários sistemas antioxidantes. Na diminuição destes sistemas, ou no excesso da produção de radicais livres, ou na conjugação das duas situações, o meio celular fica sujeito ao estresse oxidativo que conduzirá o dano oxidativo de macromoléculas celulares (Ferreira & Matsubara, 1997; Nishiyama et al., 1998; Biesalki, 2000). Não há dúvidas que a alimentação exerce papel fundamental na manutenção da saúde, e que dietas ricas em sacarose e Capítulo II 47 colesterol podem contribuir consideravelmente para o aparecimento de dislipidemias, resistência à insulina e estresse oxidativo. Prevenir e tratar doenças cardiovasculares em geral, por meio da terapia dietética são medidas claramente demonstradas na literatura (Costa et al., 2000). Nos últimos anos, o interesse sobre a nutrição tem estimulado o estudo do papel da dieta na prevenção de patologias degenerativas e manutenção da saúde. Os alimentos têm assumido o status de "alimentos funcionais", os quais podem promover efeitos fisiológicos benéficos prevenindo o aparecimento de doenças crônico-degenerativas (Kaur & Kapoor, 2001). Os polifenóis são compostos que incluem flavonóides e ácidos fenólicos entre outros metabólitos (Manach et al., 1997). Flavonóides são compostos que apresentam propriedades antioxidantes. Ocorrem naturalmente em frutas, vegetais e bebidas como chás, vinho e sucos e são parte integrante da dieta humana. Este grupo de polifenóis exibe grande variedade de efeitos biológicos como antimicrobiano, antialérgico ou vasodilatador. Estudos epidemiológicos têm demonstrado correlação inversa entre o consumo de dietas ricas em flavonóides e a mortalidade por doenças degenerativas (Johns et al., 1999). Saponinas são flavonóides estruturalmente formados por glicosídeos triterpenóides, ou esteróides. Shimizu et al. (1997), observaram que a saponina inibiu a elevação do nível sérico de glicose. Capítulo II 48 Segundo Thompson (1993) a saponina pode apresentar efeitos hipocolesterolêmicos em animais, e em humanos. Huong et al. (1998), observaram efeito antioxidante da saponina, em cérebro e fígado de ratos. A observação que dietas inadequadas, ricas em lipídios, colesterol e sacarose, têm sido consumidas pela maioria das populações, indica a necessidade de estudos dos efeitos destas dietas no estresse oxidativo e na dislipidemia. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi evidenciar a influência do consumo de dietas ricas em lipídios, colesterol e sacrose, bem como da adminstração de saponina, no perfil lipídico e nos marcadores do estresse oxidativo séricos em ratos. MATERIAL E MÉTODOS 1. ANIMAIS Foram utilizados 36 ratos machos adultos Wistar, de peso médio 240 gramas. Os animais eram provenientes do Biotério Central da UNESP "campus de Botucatu" e foram transferidos para o “Laboratório de Bioquímica na Experimentação Animal” do Departamento de Química e Bioquímica, Instituto de Biociências, UNESP/Botucatu, onde permaneceram durante todo o período experimental, à temperatura de 23 ± 2°C, período claro/escuro de 12 horas. Os animais foram mantidos em gaiolas de plástico individuais, recebendo dieta e água destilada ad libitum, sendo divididos em 6 grupos (P, L, S, FP, FL e FS) com 6 ratos cada. O grupo P foi considerado controle (n=6), recebendo dieta padrão, Purina – Labina (Campinas, SP, Brasil). Os animais do grupo L Capítulo II 49 (n=6) receberam dieta padrão acrescida de óleo de soja, colesterol e ácido cólico (Duarte et al., 1998). O grupo S (n=6) recebeu dieta padrão enriquecida com sacarose e óleo de soja (Chico et al., 1991). O grupo FP (n=6) recebeu dieta padrão e saponina (4g/L) na água de beber. Animais do grupo FL (n=6) receberam dieta padrão acrescida de óleo de soja, colesterol e ácido cólico e saponina (4g/L) na água. O grupo FS (n=6) recebeu dieta padrão enriquecida com sacarose, óleo de soja e saponina (4g/L) na água. As diferentes rações foram preparadas a partir do farelo da ração basal, como descrito por Rodrigues (2007, Capítulo 1, página 10). As concentrações de glicose (Boehringer Mannhein, Eli Lilly do Brasil, SP, Brasil) e corpos cetônicos (Optimum, MediSense, Abbott Laboratories, Bedford, MA, USA) foram determinadas após jejum de 12-14h, no sangue total, coletado através da veia caudal após 35 dias dos tratamentos. 2. OBTENÇÃO DE AMOSTRAS Após 35 dias de tratamento, os animais foram anestesiados e sacrificados por decapitação. O sangue foi coletado em tubos de ensaio, com auxílio de funil. O soro foi separado por centrifugação a 4.500 rpm. As concentrações de proteínas totais, albumina, triacilglicerol, colesterol total e lipoproteína de densidade elevada (HDL-colesterol) foram determinadas no soro pelo método enzimático (CELM diagnóstico, Companhia de Equipamentos de Laboratório Moderno, São Paulo, Brasil). Capítulo II 50 As concentrações de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-colesterol) foram determinadas através do cálculo de Friedewald et al (1972). A lipoproteína de densidade baixa (LDL- colesterol) foi isolada através da precipitação (CELM diagnóstico, Companhia de Equipamentos de Laboratório Moderno, São Paulo, Brasil) e suspensão do precipitado em hidróxido de sódio (Scoccia et al., 2001). A lipoproteína LDL-colesterol foi determinada através da quantificação do colesterol e a LDL- oxidada pela quantificação do hidroperóxido de lipídio na mistura ressuspensa (Jiang et al., 1991). A apolipopreteína B (apo B) foi quantificada na mistura ressuspensa (CELM diagnóstico, Companhia de Equipamentos de Laboratório Moderno, São Paulo, Brasil). O hidroperóxido de lipídio (HP) foi determinado através da oxidação do Fe2+ (sulfato ferroso amoniacal). O Fe3+ formado reage com alaranjado de xilenol formando composto colorido (Jiang et al., 1991). As substâncias antioxidantes totais (SAT) foram calculadas através da porcentagem de inibição na formação de HP (Mehmetcik et al., 1997). As leituras espectrofotométricas foram realizadas no espectrofotômetro Pharmacia Biotech com temperatura controlada (U/V visible Ultrospec 5000, software Swift II, 974213, Cambridge, England, UK). As atividades enzimáticas foram analisadas a 25 °C usando leitor de microplaca (µQuant-MQX 200, software Kcjunior, Bio-Tec Instruments, Winooski, Vermont, USA). Todos os reagentes eram de procedência Sigma (St. Louis, MO, USA). 3. ANÁLISE ESTATÍSTICA Capítulo II 51 Os resultados obtidos foram expressos em média ± desvio padrão. A comparação entre os grupos foi realizada pela técnica de análise de variância (ANOVA) para o esquema de três fatores (colesterol, sacarose e saponina) com dois níveis (ausência e presença) no experimento completamente casualizado (Zar, 1994). O nível de significância foi de 5% para a discussão dos resultados (Norman & Streiner, 1994). As letras utilizadas nas tabelas e figuras são referentes as seguintes comparações: (a) Indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (b) Indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) Indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. RESULTADOS Após 35 dias de período experimental não foram observadas alterações significantes nas concentrações sanguíneas de glicose entre os grupos P e L, bem como entre os grupos FP, FL e FS. O grupo FS elevou a glicemia de jejum em relação ao seu controle, S. Animais do grupo S mostraram redução na glicemia quando comparados ao grupo P (Tabela 1). Não foram observadas alterações significantes nas concentrações sanguíneas de corpos cetônicos (CC) entre os animais dos grupos P e L, FP e FL, bem como entre os grupos FL e L. Não houve diferença significante na cetonemia entre os grupos P e FP, S e FS. Houve elevação no CC nos grupos S e FS em Capítulo II 52 relação aos animais dos grupos P e FP, respectivamente. O grupo FP apresentou diminuição na cetonemia quando comparado aos animais do grupo P (Tabela 1). Nas Figuras 1 e 2 pode-se observar que, com o aumento na ingestão de carboidratos houve elevação nas concentrações sanguíneas de triacilglicerol (TG) e CC. Não houve diferenças significantes nas concentrações de colesterol total (CT) entre os grupos FP e FL, bem como entre S e FS. Animais dos grupos L e S apresentaram elevação no CT em relação ao grupo P. Houve hipercolesterolemia nos animais do grupo FP em relação ao seu controle, P. Ratos do grupo FL reduziram a colesterolemia em relação ao grupo L (Tabela 1). Não foi observada diferença estatística nas concentrações de HDL-colesterol entre os grupos estudados (Tabela 1). Não houve modificação significante nas concentrações de LDL-colesterol entre os grupos P e S, FP e FS, bem como entre P e FP, S e FS. Foi observada elevação na LDL entre os animais dos grupos F e FL em relação aos grupos P e FP, respectivamente (Tabela 1). Animais do grupo S apresentaram elevação na VLDL e no TG em relação ao grupo P. Animais do grupo FS aumentaram a VLDL e o TG em relação ao grupo FP e ao seu controle, S. O grupo FP reduziu as concentrações de VLDL e TG em relação ao grupo P (Tabela 1). Quando analisada a relação colesterol total/HDL (CT/HDL), não foram observadas diferenças significantes entre os grupos P e S, FP e FL, FP e FS, bem como entre os grupos que receberam saponina com seus controles, sem saponina. Animais do grupo L elevaram a CT/HDL em relação ao grupo P (Figura 3). Na Figura 3 Capítulo II 53 pode-se observar que o grupo FP elevou as concentrações de CT, mas não modificou a relação CT/HDL quando comparado ao grupo P. O grupo FP apresentou elevação na relação HDL/LDL quando comparado ao grupo P. Animais do grupo L reduziram a HDL/LDL em relação ao grupo controle. Os grupos FL e FS apresentaram diminuição na relação HDL/LDL quando comparados aos ratos do grupo FP (Figura 4). Animais do grupo FP apresentaram elevação na relação HDL/TG quando comparados ao grupo P. Ratos que receberam dieta rica em sacarose (grupos S e FS) apresentaram redução na razão HDL/TG em relação aos seus respectivos controles, P e FP (Figura 5). A Tabela 2 apresenta as concentrações séricas de proteína, albumina e de marcadores do estresse oxidativo. Não houve diferença significante nas concentrações de proteína total (PT) entre os grupos P e S, bem como entre os animais que receberam saponina, quando comparados entre si. O grupo L apresentou elevação na PT em relação ao grupo P. Animais do grupo FL apresentaram redução na PT em relação ao seu controle, L. Na Figura 6, pode-se observar que a redução no consumo de proteínas não diminuiu as concentrações séricas de PT. Não foi observada correlação significante (r2 = 0,008 e p>0,05) entre o consumo de proteínas e as concentrações séricas de proteína total (Figura 7). As concentrações de albumina foram semelhantes entre os grupos estudados (Tabela 2). O grupo FS elevou a SAT em relação ao grupo FP. Entretanto, ratos do grupo FP apresentaram redução na SAT em relação aos animais do grupo P (Tabela 2). Capítulo II 54 Não houve diferença significante nas concentrações de LDL- oxidada (LDL-ox) e de apolipoproteína B (Apo B) entre os grupos P e S, P e FP, S e FS. Não foi observada diferença significante na LDL-ox entre o grupo FS quando comparado aos animais do grupo FP. O grupo L apresentou elevação na LDL-ox e na ApoB em relação ao grupo P. Ratos do grupo FL elevaram a LDL-ox em relação ao grupo FP e, apresentaram redução na LDL-ox em relação aos animais do grupo L. Foi observada elevação na Apo B, quando o grupo FL foi comparado aos animais do grupo FP (Tabela 2). Na figura 8, pode-se observar que houve correlação positiva e significante (r2 = 0,71, p<0,0001) entre as concentrações de LDL- colesterol e de LDL-oxidada. Capítulo II 55 Tabela 1. Concentrações de glicose e corpos cetônicos (CC) no sangue total e de colesterol total (CT), lipoproteína de densidade elevada (HDL-col), lipoproteína de densidade baixa (LDL-col), lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-col) e triacilglicerol (TG) no soro dos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS) GRUPOS SEM SAPONINA GRUPOS COM SAPONINA P L S FP FL FS Glicose (mg/dL) 75,66±7,36 75,16±6,13 64,44±1,08a 71,16±4,21 71,91±2,97 71,66±1,96c CC (mg/dL) 0,58±0,14 0,65±0,05 1,16±0,18a 0,58±0,16 0,51±0,22 1,18±0,47a CT (mg/dL) 72,89±9,50 133,25±13,58b 89,29±10,91a 103,63±9,12c 110,02±14,86c 88,76±7,13a HDL-col (mg/dL) 46,71±7,96 55,10±19,74 44,01±7,35 56,70±8,13 47,66±5,45 42,81±3,86 LDL-col (mg/dL) 7,22±3,41 32,61±6,64b 7,84±1,39 4,12±1,52 12,55±2,69bc 5,94±2,09 VLDL-col (mg/dL) 20,13±1,55 18,05±1,78 27,98±2,41a 15,88±2,78c 16,37±1,03 31,64±3,27ac TG (mg/dL) 100,69±7,76 90,28±8,93 139,90±12,09a 79,43±13,98c 81,89±5,15 158,21±16,36ac Valores expressos como média±desvio-padrão. (a) indica diferença significante entre os grupos: Px S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. Capítulo II 56 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 P L S FP FL FS Grupos In ge st ão d e C ar bo id ra to s (g /d ia ) 0 30 60 90 120 150 180 210 C on ce nt ra çõ es sa ng uí ne as d e tr ia ci lg lic er ol ( m g/ dL ) Ingestão de carboidratos Concentraçõs de TG Figura 1. Ingestão de carboidratos e concentrações séricas de triacilglicerol (TG) nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacaros e (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. a c ac a a Capítulo II 57 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 P L S FP FL FS Grupos In g es tã o d e ca rb o id ra to s (g /d ia ) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 C o n ce n tr aç õ es sa n g u ín ea s d e co rp o s ce tô n ic o s (m g /d L ) Ingestão de carboidratos Concentraçõs de CC Figura 2. Ingestão de carboidratos e concentrações sanguíneas de corpos cetônicos (CC) nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. a a a a Capítulo II 58 0 50 100 150 200 P L S FP FL FS Grupos C o n c e n tr a ç ã o d e c o le s te ro l to ta l (m g /d L ) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 R e la ç ã o C T /H D L Colesterol total Relação CT/HDL Figura 3. Concentrações séricas de colesterol total (CT) e relação colesterol total/HDL (CT/HDL) nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. a b c c a b Capítulo II 59 0 5 10 15 20 25 30 P L S FP FL FS Figura 4. Relação HDL/LDL nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. b c b a Relação HDL/LDL Capítulo II 60 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P L S FP FL FS Figura 5. Relação HDL/TG nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. c a Relação HDL/TG a Capítulo II 61 Tabela 2. Proteína total (PT), albumina, hidroperóxido de lipídio (HP), substâncias antioxidantes totais (SAT), LDL-oxidada e apolipoproteína B (Apo B) no soro dos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS) GRUPOS SEM SAPONINA GRUPOS COM SAPONINA P L S FP FL FS PT (g/dL) 6,08±0,81 7,36±1,52b 5,97±0,24 6,09±0,49 6,46±0,48c 6,03±0,37 Albumina (g/dL) 5,31±0,29 5,38±0,83 5,86±0,94 5,67±0,40 5,43±0,46 5,27±0,29 HP (nmol/mL) 6,32±0,26 6,37±0,23 6,38±0,38 6,52±0,17 6,46±0,14 6,30±0,17 SAT (%) 61,61±3,61 60,10±2,22 60,09±3,73 57,61±3,46c 59,25±1,32 60,75±1,70a LDL-ox (mmol/L) 13,10±4,45 65,54±20,10b 20,21±4,32 10,79±4,69 29,69±8,32bc 17,28±2,00 Apo B (g/dL) 0,46±0,25 3,4±055b 0,53±0,17 0,32±0,15 1,16±0,25bc 0,46±0,18 Valores expressos como média±desvio-padrão. (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. Capítulo II 62 0 1 2 3 4 5 6 7 P L S FP FL FS C on su m o de p ro te ín as (g /d ia ) 0 2 4 6 8 10 C on ce nt ra çõ es s ér ica s de pr ot eí na s to ta is (g /d L) Consumo de proteínas Proteínas séricas Figura 6. Consumo de proteínas e concentrações séricas de proteínas totais nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). (a) indica diferença significante entre os grupos: P x S; FP x FS. (b) indica diferença significante entre os grupos: P x L; FP x FL. (c) indica diferença significante entre os grupos: P x FP; L x FL; S x FS. b c b a b a Capítulo II 63 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 Ingestão de proteínas (g/dia) P T (g /d L) Figura 7. Relação linear entre a ingestão de proteínas e as concentrações séricas de proteína total nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). r2 = 0,008 p>0,05 Capítulo II 64 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 LDL-colesterol (mg/dL) L D L -o xi d a d a (m g /d L ) Figura 8. Relação linear entre as concentrações séricas de lipoproteína de baixa densidade (LDL- colesterol) e LDL-oxidada nos animais alimentados com dieta padrão (P), com dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico (L), dieta rica em sacarose (S), dieta padrão, recebendo saponina na água de beber (FP), dieta rica em óleo de soja, colesterol e ácido cólico, recebendo saponina (FL) e dieta rica em sacarose, recebendo saponina na água de beber (FS). r2 = 0,71 P< 0,0001 Capítulo II 65 DISCUSSÃO Como prevenção primária para o tratamento das doenças cardiovasculares (DC) tem sido enfatizada a mudança no estilo de vida, a qual inclui adoção de hábitos alimentares saudáveis, e pratica de exercícios físicos. Neste contexto, tem sido observada a busca por alimentos, que contém substâncias capazes de reduzir os fatores de risco para as DC. Entretanto, os reais efeitos do consumo destas substâncias, associado à dietas inadequadas ainda não foram estabelecidos. Fatores dietéticos, como o consumo de dietas ricas em lipídios ou carboidratos simples, podem reduzir a secreção insulina. Embora curta exposição (<6 h), in vitro, a grandes quantidades de ácidos graxos potencialize a secreção de insulina, longas exposições (24-48 h) podem inibir a secreção de insulina em células de ratos (Zhou & Grill, 1994). No presente trabalho, após 35 dias de tratamento, não foram observadas alterações nas concentrações de glicose e corpos cetônicos em animais que receberam dieta hiperlipídica, na ausência ou presença de saponina (Tabela 1). Alguns pesquisadores não observaram alterações na glicemia em ratos alimentados com dieta rica em lipídios, apesar da indução de resistência à insulina (Kraegen et al., 1991; Storlien et al., 1991; Oakes et al., 1997). O papel causal da hipercolesterolemia na gênese da aterosclerose e suas seqüelas clínicas está bem estabelecido. Hábitos alimentares inadequados, como a ingestão de grandes quantidades de colesterol, lipídios e sacarose são importantes Capítulo II 66 fatores de risco para o desenvolvimento de anormalidades no metabolismo do colesterol e das lipoproteínas. Como esperado, a dieta rica em lipídios e colesterol elevou significantemente a colesterolemia e as concentrações de LDL (Tabela 1). Foi observado aumento na relação CT/HDL, redução na HDL/LDL, mas não houve modificação na relação HDL/TG (Figuras 3, 4, 5). Resultados semelhantes foram obtidos por Feoli et al. (2003) e Balkan et al. (2004). Ginsberg et al. (1994) observaram que as concentrações séricas de colesterol aumentavam em 1,47mg/dL para cada 100mg de colesterol adicionado à dieta, em humanos. Entretanto, segundo Nicolosi et al. (2003) a ingestão de colesterol pode ser menos aterogênica que o consumo de lipídios saturados, dependendo das concentrações séricas de LDL, VLDL, IDL. Os lipídios dietéticos podem afetar a absorção e a síntese hepática de colesterol, a síntese de ácidos biliares, bem como o número e a atividade dos receptores da LDL (Garg & Blake, 1997; Ros, 2000; Bisschop et al., 2004). Alteração na resposta à insulina é a principal anormalidade metabólica no diabetes mellitus tipo 2. Experimentalmente, é possível induzir um estado metabólico similar através da manipulação dietética. Diversos estudos com animais têm demonstrado que dietas ricas em sacarose induzem dislipidemias e resistência à insulina no fígado, e em tecidos periféricos, incluindo o músculo esquelético (Pagliassotti et al., 1994; Bernal et al., 1995; Montes et al., 2000; Soria et al., 2001; Chicco et al., 2003). Estes distúrbios são caracterizados por hiperinsulinemia precoce, com normoglicemia em curto prazo (3-5 semanas), normoinsulinemia e moderada hiperglicemia quando o Capítulo II 67 consumo da dieta rica em sacarose é estendido por 15-40 semanas (Gutman et al., 1987; Chicco et al., 2003). No presente trabalho, após 35 dias de ingestão de dieta rica em sacarose, foi observada redução na glicemia de jejum. Entretanto, houve aumento significante nas concentrações de CC (Tabela 1 e Figuras 1 e 2). Daly et al. (1998), ao estudarem o efeito agudo de uma sobrecarga de sacarose, observaram variações cíclicas de picos e quedas nas concentrações de glicose e insulina. A redução na glicemia nos animais do grupo S (Tabela 1) pode ser devida a este tipo de comportamento. Sória et al. (2001) observaram normoglicemia e hiperinsulinemia, em ratos, após três semanas de ingestão de dietas ricas em sacarose. Segundo estes autores, houve aumento moderado na lipólise e redução na ação antilipolítica da insulina nos adipócitos. Deste modo, a resistência à insulina não esteve associada com elevação na adiposidade. Não houve alterações no tamanho, bem como, aumento na massa adiposa dos animais. Estes dados corroboram com os achados do nosso estudo. Animais alimentados com dieta rica em sacarose não se tornaram obesos (Rodrigues, Capítulo 1, página 19), contudo, a modificação dietética induziu alterações metabólicas relacionadas à resistência à insulina. Interessante efeito da elevada ingestão de sacarose, na presença ou ausência da saponina, foi o aumento na concentração de CC. Corpos cetônicos são importantes fontes de energia para os tecidos periféricos porque são solúveis em solução aquosa, e, assim, não necessitam ser incorporados em lipoproteínas ou Capítulo II 68 transportados pela albumina como os outros lipídios. Os CC são produzidos no fígado durante períodos em que a quantidade de acetil CoA presente excede a capacidade oxidativa do fígado. Quando a velocidade de formação de CC é maior que a sua taxa de utilização, seus níveis elevam-se no sangue (cetonemia), diminuindo assim o pH sanguíneo, caracterizando, desta forma, a cetoacidose (Champe et al., 2006). Corpos cetônicos são os principais substratos energéticos em condições de jejum prolongado e no diabetes mellitus não controlado, quando os intermediários metabólicos do ciclo do citrato são direcionados para a neoglicogênese hepática, para manutenção da glicemia (Berg et al., 2004). É evidente que animais do grupo S não foram expostos a períodos de jejum diferentes dos outros grupos. Deste modo, a cetonemia observada nestes animais sugere que a dieta estaria elevando a glicemia pós-prandial sem, entretanto, induzir hiperglicemia de jejum. É notória a associação entre cetonemia, hipertrigliceridemia e diabetes (Berg et al., 2004). Animais do grupo S apresentaram cetonemia e hipertrigliceridemia. Diversos estudos comprovam que o consumo de deitas ricas em sacarose altera o metabolismo do triacilglicerol ocasionando a hipertrigliceridemia (Gutman et al., 1987; Bernal et al.,1995; Lombardo et al., 1996). No entanto, poucos estudos avaliaram a ação da sacarose na colesterolemia. Merat et al. (2004) demonstraram que a ingestão de dieta rica em frutose induziu importante hipercolesterolemia e, foi mais aterogênica que a ingestão de dieta tipicamente ocidental, com 42% das calorias provenientes de lipídios, em ratos deficientes no receptor de Capítulo II 69 LDL (LDL R-/-). A dieta rica em frutose ainda teria efeitos aterogênicos independente da hipercolesterolemia. Em ratos, o elevado consumo de frutose induz elevação na pressão arterial e aderência de leucócitos na parede arterial (Hwang et al., 1987; Dai et al., 1994). Em nosso estudo, verificou-se que o grupo S apresentou aumento na colesterolemia sem alterar as concentrações de LDL, bem como as relações CT/HDL e HDL/LDL (Tabela 1 e Figuras 3 e 4). Entretanto, foi observada significante redução na relação HDL/TG (Figura 5). Desta forma, podemos afirmar que a hipercolesterolemia foi associada ao aumento nas concentrações de VLDL e triacilglicerol (Tabela 1). Tem sido demonstrado que a concentração de TG é um fator de risco independente, permanecendo, entretanto, intensa discussão se sua ação se faz de modo direto ou indireto (Bertolami & Martinez, 1999). Estudos demonstraram que a incidência de aterosclerose correlaciona-se melhor com as concentrações de triacilglicerol do que com as concentrações de colesterol (Gotto, 1998; Sprecher, 1998). No presente estudo, animais que receberam dieta rica em sacarose apresentaram aumento nas concentrações de TG e VLDL (Tabela 1). A elevação nas concentrações de triacilglicerol tem sido atribuída ao conteúdo de frutose presente na sacarose. A frutose promove a síntese hepática de triacilglicerol e sua liberação no plasma na forma de VLDL. Diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar o impacto da sobrecarga de frutose no metabolismo dos triacilgliceróis, como elevação na síntese “de novo” de ácidos graxos (AG), aumento na disponibilidade dos AG não esterificados liberados do tecido adiposo, e/ou alteração no Capítulo II 70 direcionamento metabólico da oxidação para a esterificação de ácidos graxos (Kok et al.,1996). Outros autores sugerem a redução na hidrólise das lipoproteínas ricas em triacilglicerol como um importante fator na relação entre ingestão de frutose e hipertrigliceridemia (Frayn & Kingman, 1995). Tem sido demonstrado que a dieta rica em sacarose, além de induzir maior produção de VLDL-colesterol no fígado, aumenta a expressão das apoliproteínas A e E e reduz a atividade da enzima triacilglicerol lipase hepática (Radosavljevic et al., 1992). A ingestão de saponina, nos grupos FP e FL, não alterou as concentrações de glicose e CC em relação aos animais dos grupos P e L, respectivamente. Entretanto, o consumo de saponina na presença de sacarose elevou a glicemia aos níveis normais e não alterou a concentração de CC (Tabela 1). Petiti et al. (1995) não verificaram efeito hipoglicêmico em ratos tratados com saponina. Em estudo prévio, também não observamos alterações significantes no teste oral de tolerância à glicose (TOTG) em ratos que receberam saponina (Rodrigues et al., 2005). Diversos estudos têm demonstrado que a saponina reduz as concentrações séricas de colesterol em muitas espécies animais, incluindo o homem (Southon et al., 1988; Harwood et al., 1993; Potter et al., 1