RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 05/05/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Câmpus de Botucatu INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Zoologia Tese de Doutorado A análise interdisciplinar comparativa entre os camarões Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) e Macrobrachium pantanalense Dos Santos, Hayd & Anger, 2013 suporta a diferenciação interespecífica? Caio dos Santos Nogueira Orientador: Prof. Dr. Rogerio Caetano da Costa Coorientador: Prof. Dr. João Alberto Farinelli Pantaleão Botucatu – SP 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Câmpus de Botucatu INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Zoologia A análise interdisciplinar comparativa entre os camarões Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) e Macrobrachium pantanalense Dos Santos, Hayd & Anger, 2013 suporta a diferenciação interespecífica? Caio dos Santos Nogueira Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas – Zoologia do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Câmpus de Botucatu, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas – Zoologia. Orientador: Prof. Dr. Rogerio Caetano da Costa Coorientador: Prof. Dr. João Alberto Farinelli Pantaleão Botucatu – SP 2023 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA ANDRADE CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Nogueira, Caio dos Santos. A análise interdisciplinar comparativa entre os camarões Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) e Macrobrachium pantanalense (Dos Santos, Hayd & Anger, 2013) suporta a diferenciação interespecífica? / Caio dos Santos Nogueira. - Botucatu, 2023 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Rogerio Caetano da Costa Coorientador: João Alberto Farinelli Pantaleão Capes: 20402007 1. Hibridização. 2. Morfometria. 3. Reprodução animal. 4. Larvas - Anfíbios (Crustáceos, peixes, invertebrados, etc.) 5. Zoologia - Classificação. Palavras-chave: Desenvolvimento larval; Hibridização; Morfometria geométrica; Sistema reprodutor; Taxonomia integrativa. Agradecimentos Gostaria de expressar minha gratidão ao Prof. Dr. Rogerio Caetano da Costa por confiar em mim e ter me concedido a oportunidade de desenvolver esse trabalho. Além disso, agradeço sinceramente pelos seus valiosos conselhos e orientações ao longo dos últimos seis anos. Estou confiante de que essa experiência será fundamental para o meu desenvolvimento profissional no futuro. Gostaria de agradecer ao meu coorientador, Prof. Dr. João Alberto Farinelli Pantaleão, por sua ajuda desde a época do mestrado e por ter me ensinado muito sobre o mundo dos crustáceos e do mundo científico em geral. Obrigado por ter aceitado coorientar minha Tese e por ter concordado com a ideia da temática. Sem sua ajuda, este trabalho não teria sido concluído. Gostaria de expressar minha gratidão ao Prof. Dr. Fernando José Zara, que mais uma vez aceitou colaborar comigo em outro projeto. Muito obrigado pelos conselhos e dicas, não só no capítulo do qual teve participação direta, mas também por todas as discussões que tivemos sobre minha pesquisa. Sua contribuição foi essencial para a conclusão deste trabalho. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), a qual financiou a execução minha Tese diretamente pelo processo 2019/00661-3, e também pelo Projeto Temático Biota INTERCRUSTA, processo 2018/13685-5. Ao Ministério do Meio Ambiente e ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) por conceder a licença para coleta de material nas áreas de estudo. Ao Instituto de Biociências – IB e à Pós-Graduação em Ciências Biológicas Zoologia da UNESP de Botucatu e ao Departamento de Biodiversidade e Bioestatística. Ao Departamento de Ciências Biológicas, da Faculdade de Ciências da UNESP de Bauru, o qual o Laboratório de Biologia de Camarões (LABCAM) é vinculado. A toda minha família, e em especial à minha mãe e meu irmão, por todo o apoio e suporte nas minhas decisões desde que decidi trilhar esse caminho. A minha namorada Natalia, por toda paciência, apoio e conselhos que me concedeu ao longo desses longos anos de pós-graduação, muito obrigado por tudo. Sem você nada seria possível. Aos meus irmãos de vida, Isabela e Rafael. Muito obrigado por sempre estarem ao meu lado nesses últimos anos, vocês tiveram um papel fundamental no desenvolvimento desse trabalho. Espero que nossa amizade perdure e que todos nós consigamos atingir nossos objetivos de vida. Ao meu grande amigo e parceiro de pesquisa, Alexandre (Dino). Muito obrigado por toda a ajuda nesses últimos quatro anos. Espero que continuemos animados, e trabalhando juntos com nossa empolgação pelas “armas”. A segunda família que ganhei nesses últimos anos graças a Rep. do Amor. Abner, Bruno (Sushi), Gabriel, Milena, Rafael e Victor, vocês são muito especiais para mim. Aos amigos que ganhei durante esses anos de pós-graduação, Alexandre (Seu Jorge), Bruno Tayar, Gabriel, Giovana, Júlia, Lizandra, Lucas (Marginal), Mariana (Magrela) e Régis, por todos os momentos que passamos juntos, fazendo com que meus dias fossem mais alegres. A todos os integrantes do Laboratório de Biologia de Camarões (LABCAM - UNESP/FC), desde os antigos aos mais novos, vocês foram fundamentais durante todos esses anos. A todos os integrantes do Laboratório de Morfologia de Invertebrados (IML - UNESP/FCAV), Barbara, Camila, Fernanda, Lucas, Marcia e Maria Alice, por me acolherem tão bem e pela grande ajuda no desenvolvimento do meu mestrado e doutorado. Aos integrantes do Laboratório de Bioecologia e Sistemática de Crustáceos (LBSC – USP/FFCLRP), por me recepcionarem tão bem nas minhas visitas ao laboratório durante o meu doutorado. Mais uma vez, muito obrigado a todos. Sumário Resumo ........................................................................................................................... 1 Considerações iniciais ................................................................................................... 2 Referências ..................................................................................................................... 4 CAPÍTULO I: Hybridization experiments between the freshwater prawns Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) and M. pantanalense Dos Santos, Hayd & Anger, 2013 (Decapoda: Palaemonidae) Artigo: Hybridisation experiments between freshwater prawns Macrobrachium amazonicum and M. pantanalense (Decapoda: Palaemonidae), and the effects of geographical isolation …………………………………………………………….….…. 9 CAPÍTULO II: Variation in body structure shape as a tool for discriminating between the freshwater prawns Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) and M. pantanalense Dos Santos, Hayd & Anger, 2013 (Caridea: Palaemonidae) Artigo: Elucidating taxonomic problems of two closely related freshwater prawn lineages of the genus Macrobrachium (Caridea: Palaemonidae): A geometric morphometrics approach …………………………………………………….….………………………10 CAPÍTULO III: Male reproductive system of Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) and M. pantanalense Dos Santos, Hayd & Anger, 2013: new insights into the analysis of sperm morphology in crustaceans Abstract ......................................................................................................................... 11 Introduction .................................................................................................................. 12 Material and methods .................................................................................................. 14 Anatomy and histology of the male reproductive system ................................... 15 Ultrastructure of the spermatozoa ...................................................................... 16 Linear and geometric morphometrics of spermatozoa ....................................... 16 Results ........................................................................................................................... 18 Anatomy of the male reproductive system .......................................................... 18 Spermatozoa ultrastructure under TEM ............................................................. 20 Histological and histochemical analyses ............................................................ 21 Spermatozoa morphometrics .............................................................................. 25 Micrographic documentation ............................................................................. 27 Discussion ...................................................................................................................... 48 Anatomy and histochemistry of the male reproductive system ........................... 48 Morphology, morphometry, and ultrastructure of spermatozoa ......................... 51 References ..................................................................................................................... 55 CAPÍTULO IV: Morphology and morphometrics of larvae of Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) and M. pantanalense Dos Santos, Hayd & Anger, 2013: a comparative approach among different lineages and phenotypes Abstract ......................................................................................................................... 65 Introduction .................................................................................................................. 66 Material and methods .................................................................................................. 69 Sampling of ovigerous females and cultivation of larvae ................................... 69 Description and comparison of larval morphology ............................................ 70 Larval morphometrics ........................................................................................ 71 Results ........................................................................................................................... 72 Larval morphology ............................................................................................. 74 Larval morphometrics ........................................................................................ 89 Discussion ...................................................................................................................... 90 References ..................................................................................................................... 94 Considerações finais ................................................................................................... 103 NOGUEIRA, C. S. (2023) 1 Resumo Macrobrachium amazonicum e M. pantanalense são duas espécies de camarões dulcícolas proximamente relacionadas que ocorrem no Brasil. Macrobrachium pantanalense é uma espécie endêmica das regiões pantaneiras, e constituía um clado presente dentro do complexo de M. amazonicum. A descrição dessa linhagem como espécie gerou controvérsias quanto a sua validade, principalmente pela alta semelhança morfológica com M. amazonicum e por conta do baixo distanciamento genético entre as espécies. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo avaliar se ferramentas comumente utilizadas na taxonomia integrativa suportam a existência de M. pantanalense. Foram utilizadas quatro ferramentas; experimentos de hibridização, morfometria geométrica, descrição da anatomia do sistema reprodutor masculino (SRM) e ultraestrutura do espermatozoide, e morfologia e morfometria larval. Em todas essas abordagens integrativas foram observadas diferenças interespecíficas. Nos experimentos de hibridização, foi constatado um isolamento reprodutivo entre esses organismos, portanto, essas espécies não copulam naturalmente. A morfometria geométrica evidenciou diferenças no formato em cinco estruturas taxonomicamente relevantes. Não houve diferença na morfologia do SRM, entretanto, ocorreram variações histoquímicas nas secreções que compõem o espermatóforo. O formato do espermatozoide apresentou variações entre as duas espécies. As larvas apresentaram variações heterocrônicas e morfométricas ao longo do seu desenvolvimento. Desse modo, essas análises integrativas demonstram que ocorrem variações entre traços biológicos de M. amazonicum e M. pantanalense, sustentando a separação de ambas as linhagens. Evidentemente, algumas dessas diferenças são sutis, o que pode estar correlacionado ao fato de que o processo de especiação entre esses grupos seja recente. Palavras-chave: Hibridização; Morfometria geométrica; Sistema reprodutor; Desenvolvimento larval; Taxonomia integrativa NOGUEIRA, C. S. (2023) 10 Abstract Macrobrachium amazonicum and M. pantanalense are two closely related freshwater prawn species, the latter having been described from populations that were previously considered M. amazonicum. Distinguishing these two lineages from the available taxonomic description can be a complex task due to the morphological similarity of these organisms. In these cases, the investigation of morphological characters that help in the differentiation of these groups is of great value. Thus, the present study aimed to analyze taxonomically informative structures through geometric morphometrics analyses, evaluating the informative potential of these structures in the separation of these lineages. The selected structures were carapace, dactyl, propodus, scaphocerite and telson. The analyzed dactyl and propodus are from the second pair of pereiopods (chelipeds). Three populations of each species were analyzed. All structures were photographed and marked with landmarks and semilandmarks for the acquisition of shape variables. The shape and size of all structures differed statistically between the two species, regardless of sex. Among the observed morphometric variations, the most evident were in the carapace and telson. In the carapace, the position of the first ventral tooth of the rostrum is different, while the posterior region of the telson is proportionally thinner in M. amazonicum and wider in M. pantanalense. Our results indicate that the carapace and the telson are informative structures that can help distinguish these two groups. Furthermore, our results support the proposal presented in other studies that M. amazonicum and M. pantanalense may be in a relatively recent process of speciation. Keywords: Integrative taxonomy; Macrobrachium amazonicum; Macrobrachium pantanalense; Morphometry; Speciation Link de acesso ao artigo: https://doi.org/10.1016/j.jcz.2023.03.003 https://doi.org/10.1016/j.jcz.2023.03.003 NOGUEIRA, C. S. (2023) 55 We have shown the occurrence of marked differences in several traits of the male reproductive system of M. amazonicum and M. pantanalense, specifically the composition of secretions from some regions of the vasa deferentia and also in the size and shape of the spermatozoa of both species. These results complement the findings on reproductive behavior and geometric morphometrics of taxonomically important structures, reinforcing that M. amazonicum and M. pantanalense are two distinct groups that have undergone a process of speciation. References Alfaro, J., Muñoz, N., Vargas, M., & Komen, J. (2003). Induction of sperm activation in open and closed thelycum penaeoid shrimps. Aquaculture, 216(1-4), 371- 381. Almón, B., Cuesta, J. A., Schubart, C. 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Foram observadas diferenças estatísticas no formato de todas as estruturas analisadas com a ferramenta de morfometria geométrica. Duas delas foram sugeridas como potenciais estruturas para serem utilizadas na identificação dos grupos, i.e., a carapaça e o telson. Porém, como foi retratado no capítulo em questão (Capítulo 2), o presente estudo não possui escopo taxonômico. Portanto, recomendamos que sejam realizadas análises adicionais com mais populações para verificar se o padrão observado nas seis populações aqui analisadas se repete em outras que estão distribuídas ao longo do Brasil. As características do sistema reprodutor masculino e a ultraestrutura do espermatozoide também suportam a separação de M. amazonicum e M. pantanalense (Capítulo 3), sendo evidenciadas diferenças nas secreções que compõem o espermatóforo e no formato do espermatozoide. As diferenças nesses traços reprodutivos foram inesperadas, uma vez que esses caracteres são altamente conservativos. Ainda assim, foi possível elencar algumas características reprodutivas que divergem entre esses organismos, e essas somam-se as características que já foram reportadas na descrição e em outros estudos sobre M. pantanalense. NOGUEIRA, C. S. (2023) 104 A morfologia e a morfometria larval (Capítulo IV) forneceram informações que seguem a mesma tendência exposta nos três primeiros capítulos, ou seja, que M. amazonicum e M. pantanalense são linhagens distintas, com várias diferenças em seus aspectos biológicos. Dentre as diferenças apontadas nesse capítulo, chamamos a atenção para a variação heterocrônica do pereópodo 5, tempo de desenvolvimento e tamanho das larvas das duas espécies. Essas diferenças somam-se aos achados descritos por Marco- Herrero et al. (2019), consolidando que esses dois grupos apresentam variações interespecíficas desde a fase de vida larval. Podemos concluir que essas duas linhagens são duas entidades taxonômicas que apresentam diferenças em sua biologia, todas as ferramentas aqui utilizadas foram eficazes na discriminação desses dois grupos, dando suporte à sua separação. Entretanto, entendemos que a descrição original de M. pantanalense apresenta algumas inconsistências pelo fato de que a maioria das informações descritivas sejam baseadas em proporções de tamanho em relação a M. amazonicum, o que pode gerar problemas na identificação, uma vez que M. amazonicum é uma espécie fenotipicamente plástica, com populações de pequeno e grande porte ocorrendo ao longo do Brasil. Desse modo, algumas das características aqui levantadas podem ser muito úteis em futuros estudos que almejem redescrever M. pantanalense. Finalmente, reforçamos a importância da utilização de ferramentas de taxonomia integrativa em estudos que abordem a discriminação de espécies que são proximamente relacionadas.