RESSALVA 

Atendendo solicitação do(a) 
autor(a), o texto completo desta tese 
será disponibilizado somente a partir 

de 31/01/2021. 



1 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP 

CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP 

O papel do Amh na diferenciação sexual e 

na gametogênese de peixes teleósteos 

Marcos Antonio de Oliveira 

Doutorando 

Jaboticabal, São Paulo 

2019



2 
 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP 

CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP 

 

 

 

 

 

 

O papel do Amh na diferenciação sexual e 

na gametogênese de peixes teleósteos 

 

 

 

 

Marcos Antonio de Oliveira 
Doutorando 

 
 
 

Prof. Dr. Rafael Henrique Nóbrega 
Orientador 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Jaboticabal, São Paulo 

2019

Tese apresentada ao Programa de 
Pós-graduação em Aquicultura do 
Centro de Aquicultura da UNESP -        
CAUNESP, como parte dos requisitos 
para obtenção do título de Doutor. 
 



3 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
  

Oliveira, Marcos Antonio de 
O48p O papel do Amh na diferenciação sexual e na gametogênese de 

peixes teleósteos / Marcos Antonio de Oliveira. – – Jaboticabal, 2019 
  x, 92 p. : il. ; 29 cm 
  
 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de 

Aquicultura, 2019 
 Orientadora: Rafael Henrique Nóbrega 

Coorientador: Manfred Schartl 
Banca examinadora: Arielle C. Arena, Fausto Foresti, Luiz 

Renato de França, Renata G. M. Whitton 
 Bibliografia 
  
 1. Amh. 2. Gônada indiferenciada. 3. Mutação 4. Reversão 

sexual. 5.Peixe Medaka. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de 
Aquicultura. 

  
CDU 639.3 

  
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP 

Campus de Jaboticabal/SP - Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 



4 
 

SUMÁRIO 



5 
 

SUMÁRIO 

 

Dedicatória                                                                                       6 

Agradecimentos                                                                              7 

Apoio Financeiro                                                                           10 

Resumo                                                                                           11 

Abstract                                                                                          12 

I. Introdução geral                                                                          13 

1. Sistemas de determinação e diferenciação sexual em vertebrados     13 

2. Genes “masters" na determinação e diferenciação sexual em peixes 19 

3. Desenvolvimento gonadal nos peixes                                              20 

4. Dmrt1 na determinação e diferenciação sexual                                 23 

5. O Amh e seu papel na determinação e diferenciação sexual              27 

6. Amh como regulador do processo de espermatogênese                    35 

7. Oryzias latipes como modelo experimental                                       38 

8. CRISPR/Cas9 como técnica para edição genômica                             39 

II. Justificativa                                                                                42 

III. Objetivos                                                                                   44 

IV. Material e Métodos                                                                   45 

1. Animais                                                                                         45 

2. amh-KO por CRISPR/Cas9                                                               45 

3. Identificação dos animais mutantes (amh-KO) por PCR                     47 

4. Caracterização da mutação (amh-KO)                                               49 

5. Sexagem molecular e análise de reversão sexual                              50 

6. Análises do padrão de expressão dos genes envolvidos na cascata 

 de diferenciação sexual                                                                     51 

7. Análise Estatística                                                                          52 

V. Resultados                                                                                 53 

1. CRISPR/Cas9: eficiência e detecção das mutações por PCR              55 

2. Caracterização da mutação e fenótipo                                              59 

3. Análise do padrão de expressão de genes envolvidos na cascata de 

diferenciação sexual                                                                           60 

VI. Discussão                                                                                 70 

VII. Conclusão                                                                                76 

VIII. Literatura citada                                                                     77 

 



6 
 

DEDICATÓRIA 

 

Aos meus pais Juarez & Luzia; 

Meus irmãos Márcio, Márcia & Zélia; 

Meus sobrinhos Arthur, Davi & 

Heitor 

Meus tios e tias; Minhas avós 

Madalena e Sabina “in memorian” por 

todo, amor, carinho e dedicação 

para comigo! 

 
“Você não escolhe sua família. Eles são 

um presente para você, assim como você é 

para eles. ” 
 

 

Com muito carinho e amor, dedico! 
 

 

 

À minha amada namorada Natália 

Bertoni e seus pais, dona Lia e 

Wagner, que sempre me apoiam, 

nos momentos de alegria 

e tristeza... 
 

 

Com todo amor, carinho e sinceridade 
Ofereço!



7 
 

Agradecimentos 
 

Á Universidade Estadual Paulista, ao Centro de 
Aquicultura da UNESP – CAUNESP- pela oportunidade 

oferecida e ao Instituto de Biociências de Botucatu; 
 

A todos docentes do CAUNESP, pelos ensinamentos; 
 

Ao Prof. Dr. Claudio de Oliveira, Prof. Dr. Fausto Foresti e Prof. 
Dr. Cesar Martins, pelo espaço fornecido e 

uso de equipamentos; 
 

A Profa. Dr. Adriana Fernandes de Barros, por seus ensinamentos 
e amizade; 

 
Aos secretários David, Veralice e Luciana, por toda ajuda; 

 
Aos funcionários Zé, Keila e Ricardo (IBB) por toda a ajuda; 

 
Aos amigos e companheiros de 

trabalho: Arno, Matheus, Juliana, Andres, Lucas, Aldo, Maira, 
Ivana, Daniel, Camila, Zé, Anabel e Bia; 

 
Aos meus amigos, Fabrício, Bruno Castilho, Sol e Piá, Mano, Prof. 
Luiz Renaro de França, Kallede, Danilo Jacu, Camila, Zé Vicente 

e Larissa, Dona Célia e Dinovan, Vado e Dona Gorete, Daniel 
gordão e Ana, Cris e Angela, João “amiguinho”, Rogério e Muza e 

Du Kang; 
 

Aos membros avaliadores da banca, prof. Dr. Luiz Renato de 
França, prof.Dr. Fausto Foresti, Profa. Dra. Arielle Cristina 
Arena e Profa. Dra. Renata Guimarães Moreira Whitton por 

dedicar seu tempo na avalição deste trabalho; 



8 
 

 
Á UNIVERSITY OF WÜRZBURG, na Alemanha pelo 

acolhimento; 
 

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Manfred Schartl e ao 
colaborador Mateus Adolfi; 

 
Ás técnicas, Monika, Luiza, Briguita, Conny, Petra e Anitta por 

toda ajuda durante minha permanência na Alemanha 
 
 
 

E principalmente ao meu orientador e amigo,  
 

Prof. Dr. Rafael Henrique Nóbrega, 

pela orientação e principalmente por 

sua confiança na realização deste 

projeto, e na conquista deste sonho, 

agradeço também pela 

oportunidade, atenção e amizade. 

 

São poucas palavras, mas sinceras, onde quero lhe dizer:  

“Obrigado por fazer do aprendizado não um trabalho, mas 

um contentamento. Por fazer com que me sentisse uma 

pessoa de valor. Por me ajudar a descobrir o que fazer de 

melhor e, assim, fazê-lo cada vez melhor. Obrigado por 

afastar o medo das coisas que pude não compreender, 

levando-me, por fim, a compreendê-las. Obrigado por me 

convencer de que sou melhor do que suspeitava. ”  
 

 



9 
 

A todos, o meu muito obrigado! 

 
O mestre disse a um dos seus alunos: Queres 

saber em que consiste o conhecimento? Consiste 
em ter consciência tanto de conhecer uma coisa 

quanto de não a conhecer. Este é o conhecimento. 
(Confúcio) 

 
 
 

Hakuna Matata 

What a wonderful phrase 

Hakuna Matata! 

Ain't no passing craze 

It means no worries 

For the rest of your days 

It's our problem-free philosophy 

Hakuna Matata! 

It means no worries 

For the rest of your days 

It's our problem-free philosophy 

Hakuna Matata! 

(Walt Disney) 

 

 

 

 



10 
 

APOIO FINANCEIRO 
 
 
 

O presente trabalho foi realizado com apoio da FAPESP, 
através do convênio FAPESP/CAPES, PROCESSO nº 
2014/25313-4, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado 
de São Paulo (FAPESP). 
 
O presente trabalho também teve o apoio da FAPESP, 
através do convênio FAPESP/CAPES, PROCESSO nº 
2015/15631-1, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado 
de São Paulo (FAPESP). 
 
O presente trabalho também teve o apoio da FAPESP, 
através do auxílio SPRINT/BAYLAT, PROCESSO n° 
2014/50602-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado 
de São Paulo (FAPESP). 
 
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação 
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil 
(CAPES) - Código de Financiamento 001. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



11 
 

RESUMO 
 

A decisão se a gônada indiferenciada irá se desenvolver em um testículo ou um 
ovário é uma etapa crítica na diferenciação sexual dos vertebrados. Este 
processo consiste em uma complexa cascata gênica que culmina na 
diferenciação das células somáticas presente na gônada indiferenciada. Neste 
sentido, o hormônio anti-Mülleriano é um importante efetor nesta decisão. 
Estudos com o peixe medaka mutante hotei, no qual o receptor do Amh tipo 2 
(amhrII) é mutado, mostram elevado índice gonadossomático, e reversão sexual 
de macho para fêmea. Com base nestas informações, acredita-se que o Amh 
possa regular o número de células germinativas e diretamente ou indiretamente 
este fato pode influenciar na decisão da gônada bipotencial em se tornar um 
testículo ou ovário. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi de se avaliar 
a sinalização do Amh durante a diferenciação sexual no medaka. Para tanto, 
estudos de perda de função gênica foram empregados, no qual o gene amh foi 
deletado através do sistema CRISPR/Cas9. Também foi avaliada a expressão 
dos genes que atuam na janela de diferenciação sexual por RT-qPCR. 
Inicialmente, identificamos dois tipos de mutação nos animais heterozigotos 
(amh (-/+) da F1. A mutação mais interessante foi a deleção de 759 pares de 
base entre os exons 6 e 7 que compreende parte dos domínios Amh_N e TGF-
β. Na geração F2, os mutantes homozigotos amh (-/-) machos XY apresentaram 
100% de reversão sexual para fêmeas fenotípicas. Além disso os animais amh 
(-/-) apresentaram hipertrofia gonadal. Não foi realizado nenhum tipo de análise 
histológica, porém, considerando-se os dados da literatura, sugere-se que a 
ausência do Amh em nossos mutantes também tenha levado à uma proliferação 
excessiva das células germinativas. Assim, é sugerido em nosso trabalho que o 
Amh está envolvido na proliferação das células germinativas, sendo um efetor 
crucial para a formação do testículo. Esse resultado corrobora os dados de 
expressão temporal do amh e de alguns genes chaves do processo de 
diferenciação durante diferentes estágios de desenvolvimento de medakas 
selvagens. A expressão do amh foi maior em machos do que em fêmeas durante 
todos os estágios de desenvolvimento. Sua expressão diferencial inicia-se no 
estágio 34 que precede a janela de diferenciação sexual em medaka. 
Interessantemente, a expressão de outros genes envolvidos na cascata de 
diferenciação sexual masculina como dmrt1, amhrII e gsdf foi posterior à do amh. 
Este dado sugere que o Amh atue como efetor upstream da cascata de 
diferenciação masculina, sendo responsável, direta ou indiretamente, por ativar 
genes como dmrt1 e gsdf. Estes resultados estão alinhados com os dados 
encontrados neste trabalho para os medakas mutantes amh (-/-), onde na 
ausência do Amh, todos os machos XY se diferenciam em fêmeas. Na ausência 
do Amh, os efetores downstream da cascata não seriam ativados, o que levaria 
à diferenciação gonadal feminina. De maneira geral, o presente estudo 
demonstra que o Amh desempenha um papel crucial no processo de 
diferenciação sexual do medaka. Além disso, o Amh atua como efetor da cascata 
de diferenciação sexual masculina e também regula a proliferação das células 
germinativas nesta espécie. 

 

Palavras-chave: Amh, gônada indiferenciada, mutação, reversão sexual, peixe 
medaka. 



12 
 

ABSTRACT 

 

The decision whether the undifferentiated gonad will develop in a testicle or an 
ovary is a critical step in the sexual differentiation of vertebrates. This process 
consists of a complex genetic cascade that culminates in the differentiation of the 
somatic cells present in the undifferentiated gonad. In this context, the anti-
Müllerian hormone is an important effector in this decision. Studies with the 
medaka hotei fish, in which the Amh type 2 receptor (amhrII) is mutated, show 
high gonadosomatic index, and sexual reversion from male to female. Based on 
this information, it is postulated that the Amh regulates the number of germ cells, 
and directly or indirectly this fact may influence the decision of the bipotential 
gonad to become a testicle or ovary. Therefore, the objective of the present study 
was to evaluate the signaling of Amh during sexual differentiation in medaka. For 
that, studies of loss of gene function were employed, in which the amh gene was 
deleted through the CRISPR / Cas9 system. We also evaluated the expression 
of genes that act in the window of sexual differentiation by RT-qPCR. We initially 
identified two types of mutation in F1 heterozygous (amh -/+) animals. The most 
interesting mutation was the deletion of 759 base pairs between exons 6 and 7 
which comprises part of the Amh_N and TGF-β domains. In the F2 generation, 
the homozygous amh (-/-) mutants XY males presented 100% of sexual 
reversion. In addition, the amh (-/-) animals presented gonadal hypertrophy. We 
did not perform any histological analysis, but considering the literature data, it is 
suggested that the absence of Amh in our mutants also led to an excessive 
proliferation of germ cells. Thus, our work shows that Amh is involved in the 
proliferation of germ cells, being a crucial effector for testicular formation. This 
result corroborates the temporal expression data of the amh and some key genes 
of the differentiation process during different stages of development of wild 
medakas. amh transcripts were highly expressed in males than in females during 
all stages of development. Its differential expression begins in stage 34 that 
precedes the window of sexual differentiation in medaka. Interestingly, the 
expression of other genes involved in the cascade of male sexual differentiation, 
as dmrt1, amhrII and gsdf was later than amh. This data suggests that Amh acts 
as an upstream effector of the male differentiation cascade, being responsible, 
directly or indirectly, for activating genes such as dmrt1 and gsdf. These results 
are in line with the data found in this work for the amh (-/-) mutant medakas, 
wherein the absence of Amh, all XY males undergone sex reversal to females. In 
the absence of Amh, the downstream cascade effectors would not be activated, 
which would lead to female gonadal differentiation. In general, this work 
demonstrates that Amh plays a crucial role in the process of sexual differentiation 
of medaka fish. In addition, Amh acts as an effector of cascade of male sexual 
differentiation and also regulates the proliferation of germ cells in this species. 

 

Key words: Amh, undifferentiated gonada, mutation, sex reversion, medaka fish

 

 



13 
 

I. INTRODUÇÃO GERAL 

 

1. Sistema de determinação e diferenciação sexual em 

vertebrados 

 

No reino animal, a reprodução sexual é a forma de propagação mais 

antiga e universal utilizada pelos vertebrados. Os mecanismos que controlam a 

determinação e diferenciação sexual nestes animais são diversos e dependem 

de uma grande variedade de fatores genéticos bem como em alguns casos de 

fatores ambientais (VON HOFSTEN e OLSSON, 2005; TRUKHINA et al., 2013). 

O sexo genético pode ser definido por fatores genéticos hereditários 

(XX/XY e ZZ/ZW, dentre outros) que são determinados na fecundação. Por outro 

lado, a diferenciação gonadal depende da ativação de fatores transcricionais que 

são expressos durante a janela de diferenciação sexual. Tais fatores podem ter 

sua expressão alterada por condições ambientais como a temperatura e a 

osmolaridade dentre outros. Estes processos sexuais são classicamente 

divididos em determinação e diferenciação sexual, respectivamente (VON 

HOFSTEN e OLSSON, 2005; MATSON e ZARKOWER, 2012; KIKUCHI e 

HAMAGUCHI, 2013; TRUKHINA et al., 2013; HERPIN et al., 2013; HEULE et al., 

2014).  

A determinação sexual pode ser definida como um fator herdado, 

geralmente associado a um gene “master”. Este gene inicia e ativa a cascata 

gênica/bioquímica que culmina na diferenciação das células somáticas 

presentes na gonada indiferenciada (DEVLIN e NAGAHAMA, 2002; GRAHAM et 

al., 2003; HERPIN et al., 2013). Apesar de conservados, uma diversidade de 

genes “masters", cruciais para a determinação sexual são encontrados em 

diferentes organismos e todos estes genes são duplicados ou parálogos aos seu 

ancestral (Tabela 1) (GRAHAM et al., 2003; HERPIN e SCHARTL, 2015).  

 



14 
 

Tabela 1. Genes “master" de determinação sexual nos vertebrados. Dados modificados a partir de Herpin e Schartl (2015). SD: 
Sistema de determinação sexual. 

 

Gene 
“master” 

Organismo SD 
sexual 

Gene 
ancestral 

Função do gene Ancestral 

SRY Mamíferos XY Sox3 
Fator de transcrição, requerido na formação do eixo hipotálamo-hipófise; 
expresso no desenvolvimento das gônadas. 

Dmrt1 Galinha WZ Dmrt1 
Fator de transcrição, importante na determinação e diferenciação sexual 
masculinas 

dm-y Xenopus laevis WZ Dmrt1 
Fator de transcrição, importante na determinação e diferenciação sexual 
masculinas 

dmrt1bY 
Medaka (Oryzias latipes, O. 

curvinotus) 
XY Dmrt1 

Fator de transcrição, importante na determinação e diferenciação sexual 
masculinas 

sdY 
Truta arco-íris (Oncorhynchus 

mykiss) 
XY Irf9 Fator de resposta do interferon. Função gonadal desconhecida 

gsdfY 
Medaka luzonensis (O. 

luzonensis) 
XY Gsdf Fator TGF-β. Importante papel no desenvolvimento gonadal em peixes 

sox3Y Medaka Indiano (O. dancena) XY Sox3 
Fator de transcrição, requerido na formação do eixo hipotálamo-hipófise; 
expresso no desenvolvimento das gonadas 

amhY 
Perjerrey (Odontesthes 

hatcheri) 
XY Amh Fator TGF-β. Hormônio anti-Mülleriano. Fator de crescimento 

amhrIIY Fugu (Takifugu rubripes) XY AmhrII 
Fator TGF-β. Receptor tipo II para o Amh. Função no desenvolvimento 
gonadal 

dmrt1 
Linguado chinês (Cynoglossus 

semilaevis) 
WZ Dmrt1 

Fator de transcrição, importante na determinação e diferenciação sexual 
masculinas 

gsdfY 
Peixe-carvão-do-pacífico 

(Anoplopoma 
fimbria) 

XY Gsdf Fator TGF-β. Importante papel no desenvolvimento gonadal em peixes 



15 
 

Uma vez ativa, esta cascata será responsável pela regulação de 

diferentes genes, produção e liberação de hormônios esteroides que culminará 

na diferenciação da gônada indiferenciada. O fato da gônada indiferenciada vir 

a se tornar um testículo ou um ovário é uma etapa crítica no processo de 

diferenciação sexual dos vertebrados (MUNGER e CAPEL 2012; HERPIN et al., 

2013). 

Em alguns vertebrados, principalmente os mamíferos, a determinação e 

diferenciação inicia-se na gônada com a ação de fatores de crescimento e 

hormônios. Em muitos mamíferos, sabe-se que o processo de determinação 

sexual envolve o cromossomo Y, o qual contém em seu braço curto o gene 

responsável pela determinação sexual, conhecido como SRY. Este gene regula 

positivamente a transcrição de genes masculinos específicos (SOX9 e DMRT1) 

nas células somáticas da gônada XY (KOOPMAN et al., 1991). A ausência do 

gene SRY induz à feminilização, ativando genes ovarianos específicos (RSPOL, 

WNT4 e FOXL2) (KOOPMAN et al., 1991). Em relação a este caso 

paradigmático, uma vez que o sexo foi determinado, segue-se o caminho de 

diferenciação, produzindo testículo ou ovário (CAPEL, 1998; TEMEL et al., 2007) 

(Fig.1). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1. Genes responsáveis pela diferenciação sexual em mamíferos. Em animais vertebrados 

XX/XY, o gene SRY é responsável pela determinação sexual masculina. Quando na ausência 

do SRY, ocorre à ativação do gene DAX-1, o qual será responsável pela diferenciação da gônada 



16 
 

feminina. A presença do SRY resulta na ativação de uma cascata gênica que leva ao 

desenvolvimento do testículo. O gene SF-1 apresenta um importante papel na esteroidegênese 

e o AMH desempenha papel chave na diferenciação sexual. A aromatase atua inibindo a 

expressão do AMH e DMRT1. Setas em preto indicam estimulação. Linhas em vermelho com 

barra indicam inibição. Modificado a partir de VON HOFSTEN e OLSSON (2005). 

Em anfíbios, o sistema de determinação sexual é complexo, pois espécies 

como a Rana rugosa, apresentam dois sistemas de determinação sexual, XX/XY 

e ZZ/ZW (NISHIOKA et al, 1993 TRUKHINA et al., 2013). Por outro lado, em 

Xenopus tropicalis, Rocco e colaboradores (2015) mostraram a existência de 

três tipos de cromossomos sexuais (Y, W e Z). Neste sistema, três tipos de 

machos podem ser encontrados, YZ, YW e ZZ, enquanto que as fêmeas podem 

ser ZW ou WW. 

No entanto, a diferenciação sexual em anfíbios pode acontecer das 

seguintes maneiras: desenvolvimento direto da gônada bipotencial em testículo 

ou ovário; desenvolvimento da gônada bipotencial passando por um 

hermafroditismo sequencial e animais com intersexo (TRUKHINA et al., 2013). 

Em relação aos genes “masters”, o gene dmrt1 em Xenopus laevis, surge 

como um potencial candidato envolvido na determinação e diferenciação sexual. 

Nestes animais, uma duplicação do gene no cromossomo W atua como 

determinante sexual feminino (YOSHIMOTO et al., 2008; TRUKHINA et al., 

2013).  

Em aves, o mecanismo de determinação sexual é ligado a cromossomos 

sexuais e neste caso o sistema predominante é o ZZ/ZW. O sistema sexual é 

homogamético para machos (ZZ) e heterogâmico nas fêmeas (ZW) (NANDA et 

al.; 2000). Nestes vertebrados, uma região conservada no cromossomo Z é 

responsável pela determinação sexual masculina e diferenciação testicular, pela 

regulação do gene DMRT1, que aparentemente não é o gene “master” nesta 

espécie (SMITH et al., 2009 AYERS, et al.; 2013).  

No campo da biologia reprodutiva, a elucidação dos vários aspectos 

envolvidos nos mecanismos de determinação e diferenciação sexual sempre 

despertou o interesse dos pesquisadores. Neste campo, um grupo em especial 

de vertebrados chama bastante a atenção, os peixes teleósteos. 



17 
 

Os peixes apresentam uma grande variedade de mecanismos de 

determinação sexual. Neste sentido, muitas espécies apresentam o sistema de 

determinação ligado a cromossomos sexuais/heteromórficos (XX/XY e ZZ/ZW) 

(DEVLIN e NAGAHAMA, 2002; GUERRERO-ESTÉVEZ e MORENO-

MENDOZA, 2010). Algumas espécies de arraias, como Potamotrygon aff. 

Motoro e P. falkneri apresentam um sistema múltiplo de cromossomos sexuais, 

X1X1X2X2/X1X2Y. Neste estudo ficou evidenciado uma heterogeneidade dos 

arranjos cromossômicos (CRUZ et al 2011). 

Por outro lado, em espécies de peixes como Oryzias latipes (MATSUDA 

et al., 1998), Oncorhynchus mykiss (THORGAARD, 1977; ITURRA et al., 2001) 

e Oreochromis niloticus (BAROILLER et al., 1996), os machos são 

heterogâmicos (XY). Já em Oreochromis aureus (MAIR et al. 1991), Xiphophorus 

maculatus, e Gambusia affinis (VOLFF e SCHARTL 2001), as femêas são 

heterogâmicas, ZW. Além disso, os peixes apresentam ainda uma grande 

variedade de mecanismos que podem atuar na diferenciação do sexo. Esta 

variedade pode ser considerada como estratégias sexuais para reprodução, tais 

como: animais gonocorísticos (apresentam os sexos separados); animais 

unissexo (todos são fêmeas ou todos são machos); animais hermafroditas, que 

podem ser classificados em: hermafrodita sequencial, serial ou simultâneo 

(SCHARTL, 2004; HEULE et al., 2014; ADOLFI et al., 2018) (Fig.2). 

 



18 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2. Alguns peixes podem ser: gonocoristícos (apresentam os sexos separados, macho ou 

fêmea); hermafroditas, que podem ser classificados em hermafrodita serial (primeiro o animal é 

uma fêmea, ao longo da vida se tornam machos e, outros permanecem fêmeas), sequencial 

(podendo ser protândrico, em que o animal nasce macho e transforma em fêmea e, protogínico, 

em que o animal nasce fêmea e se torna macho) e hermafroditismo simultâneo onde ocorrem a 

auto-fecundação e ou cruzamento normal. Também existem animais unissexo (todos são fêmeas 

ou todos são machos). Adaptado de HEULE et al., 2014. 

 

Esta variedade de mecanismos de diferenciação sexual, podem ser 

influenciados tanto por fatores extrínsecos tais como a temperatura, exposições 

a hormônios, pH da água, concentração de oxigênio, densidade de estocagem 

e poluentes, bem como por fatores intrínsecos à exemplo do status social e 

crescimento (VALENZUELA et al., 2003; SCHARTL, 2004; BAROILLER et al. 

2009; HAYASHI et al., 2010; YAMAGUCHI et al., 2010) (Fig.3).  

Diferenciação sexual nos peixes 



19 
 

 

 

Figura 3. Balança dos fatores que podem influenciar na diferenciação sexual em peixes. Uma 

grande variedade de fatores ambientais e sociais podem regular o fenótipo sexual dos peixes e 

muitas vezes ocasionar reversão sexual. Alguns fatores como por exemplo a temperatura, pode 

reverter animais fêmeas para machos em várias espécies. Em outros casos, a densidade e o 

status social podem fazer com que animais machos se tornem fêmeas e vice-versa. Figura: 

Desenho pessoal. 

 

2. Genes “masters" na determinação e diferenciação sexual 

em peixes 

 

Nos últimos anos, pesquisadores ao redor do mundo não mediram 

esforços para encontrar genes responsáveis pela determinação e diferenciação 

sexual nos peixes. Neste sentido, uma notável diversidade de genes “masters” 

determinantes do sexo, que governam as hierarquias genéticas tornou-se visível 

(HERPIN e SCHARTL, 2015). 

Em truta arco-íris (Oncorhynchus myskiss) o gene sdY foi descoberto 

como sendo o gene responsável pela determinação sexual nesta espécie (YANO 

et al. 2012). Em fugu (Takifugu rubripes), foi descrito o receptor tipo 2 do amh 

(amhrII) como o gene responsável pela determinação sexual. Neste trabalho os 

autores mostram que o polimorfismo em apenas um nucleotídeo é responsável 



20 
 

pela determinação do sexo nesta espécie (KAMIYA et al. 2012). O estudo 

realizado por Hattori e seus colaboradores em 2012 mostra evidencias 

funcionais da duplicação do gene amh, o amhy em Odontesthes hatcheri. Os 

autores sugerem que o amhy é o gene “master" responsável pela determinação 

sexual masculina nesta espécie. Já em Oryzias luzonensis, Myosho e 

colaboradores (2012) identificaram o gene gsdfy como sendo o gene “master” de 

determinação sexual masculina (TABELA 1). 

Ao considerar conjuntamente os genes “master” de determinação sexual 

acima, é notória a importância de fatores de crescimento pertencentes a 

sinalização da superfamília TGF-β (amh, amhrII, amhy e gsdfy) nos mecanismos 

de determinação e diferenciação sexual em peixes. Ademais estes dados 

sugerem que os mecanismos de determinação sexual em peixes não são 

conservados e nem dependentes de fatores de transcrição. Porém, os 

componentes moleculares da via que determina o sexo são bastante 

conservados em relação aos mecanismos desencadeadores no topo da cascata 

(GRAVES, 2013; TRUKHINA et al., 2013; HERPIN e SCHARTL, 2015). 

Em medaka (Oryzias latipes) o macho apresenta o sexo heterogâmico 

(XY) (MATSUDA et al., 1998; MATSUDA et al., 2002). Estes peixes apresentam 

na região de determinação sexual do cromossomo Y, o gene responsável pela 

determinação sexual masculina, o dmy/dmrt1bY (NANDA et al., 2002; 

MATSUDA et al., 2002). 

 

3. Desenvolvimento gonadal nos peixes 

 

Conforme se observa nos demais vertebrados, noss peixes teleósteos, a 

gônada indiferenciada é composta por células somáticas e células germinativas, 

sendo as últimas responsáveis pela formação dos gametas na após a 

puberdade. No estágio de diferenciação sexual, as células somáticas se 

diferenciam em células de Sertoli e Leydig nos machos, ou em células da 

granulosa e da teca nas fêmeas (DEVLIN e NAGAHAMA, 2002). 

Os componentes germinativos são derivados muito precocemente das 

células germinativas primordiais (PGC), as quais migram para a gônada primitiva 



21 
 

(RAZ, 2003; RAZ e REICHMAN-FRIED, 2006) conforme nota-se na Figura 4. No 

momento do desenvolvimento da gônada, as células germinativas precursoras 

irão se diferenciar na linhagem masculina ou feminina. Após esta etapa, estas 

células continuam a proliferar ou entram em meiose. Este último passo é muitas 

vezes sexo-específico; por exemplo, células germinativas femininas entram em 

meiose primeiro que as células da linhagem masculina (KIMBLE e PAGE, 2007). 

Esta observação é claramente descrita em estudos envolvendo o peixe medaka 

(SAITO et al., 2007). Saito e colaboradores (2007) mostram que o número de 

PGCs é independente do sexo durante a embriogênese final. No entanto, as 

PGCs começam a proliferar primeiramente nos embriões do sexo feminino, 

entrando em meiose mais precocemente do que nos machos (próximo do estágio 

de eclosão). Nos embriões do sexo masculino, a proliferação das PGCs ocorre 

tardiamente, porém se estende por um período maior após a eclosão (15 a 20 

dias pós-eclosão) (SAITO et al.,2007).



22 
 

 

 



23 
 

 

Figura 4. Diagrama representando a diferenciação sexual. Primeiramente a gônada bipotencial 

que apresenta células germinativas primordiais e células somáticas é determinada 

geneticamente (XX ou XY). Após esta etapa a gônada indiferenciada nos machos XY passam 

por uma baixa taxa de proliferação das células germinativas enquanto que nas fêmeas XX, ocorre 

o oposto. Neste momento, a gônada está sujeita a sinais ambientais (temperatura, hormônios 

etc) e também moleculares, como a expressão de genes relacionados a diferenciação sexual 

(por exemplo o amh) tanto para macho como para fêmeas que atuam na diferenciação gonadal. 

Ainda na diferenciação gonadal, os animais machos XY apresentam um atraso na entrada da 

meiose enquanto a fêmeas XX dão início a meiose e oogênese e assim então, ocorre a 

diferenciação do sexo fenotípico nos animais com a formação de testículo nos machos e ovário 

nas fêmeas. Adaptado a partir de Allais-Bonnet e Pailhoux, 2014. Imagem: Desenho pessoal. 

 

Estudos in vitro e in vivo mostram que a expressão do gene dmrt1bY inibe 

a proliferação das PGCs no estágio de diferenciação sexual, mais precisamente 

durante a fase G2 do ciclo celular (HERPIN et al., 2007). Desta forma, pode-se 

dizer que o número de PGCs é influenciado pelo genótipo (XX ou XY) da espécie 

em questão.  

Se avaliarmos a questão de que os genes “masters" de determinação 

sexual, gsdfy em O. luzonensis (MYOSHO et al., 2012), amhrII em fugu (KAMIYA 

et al. 2012) e amhy em O. hatcheri (HATTORI et al. 2012) são genes de ação 

direta na proliferação e diferenciação das células germinativas nos peixes 

(GAUTIER, et al., 2011), é possível que a quantidade de células germinativas 

possa interferir no processo de diferenciação sexual gonadal em peixes 

(HERPIN et al., 2007; NAKAMURA et al., 2012).  

 

4. Dmrt1 na determinação e diferenciação sexual  

 

O gene Dmrt1 (Doublesex and mab-3 related transcription factor 1) é um 

fator de transcrição, conservado entre os vertebrados que desempenha 

importante papel durante a determinação e diferenciação sexual (RAYMOND et 

al., 1998; MATSON e ZARKOWER, 2012) e são caracterizadas por um padrão 

de ligação de DNA com domínio rico em cisteína, o domínio DM (Doublesex and 

Mab-3 related) (RAYMOND et al., 1998 GAMBLE e ZARKOWER, 2012).. O 



24 
 

Dmrt1 é expresso nas gônadas dos vertebrados, desempenhando importante 

papel na diferenciação testicular (Fig.5) (RAYMOND et al., 1998; KOOPMAN, 

2009; MATSON e ZARKOWER, 2012).  

 

 

Figura 5. Dmrt1 na diferenciação sexual em vertebrados. Em azul é mostrada a função 

masculinizante e em rosa a feminilizante. (A) Em mamíferos, o DMRT1 é expresso na gônada 

fetal após a determinação sexual e requerido após o sexo determinado. (B) Em peixe, no caso 

medaka, primeiramente após o sexo genético determinado, ocorre a expressão do dmY, também 

chamado dmrt1bY e posteriormente, ocorre a diferenciação sexual masculina com a expressão 

do dmrt1 autossomal. (C) Nas aves, a expressão do DMRT1 é ligada ao cromossomo Z e sendo 

assim, os machos possuem duas cópias e as fêmeas uma, sugerindo assim que um efeito de 

dose de DMRT1 é requerida para a diferenciação testicular. (D) Em anfíbios, o gene dmrt1 é 

duplicado e truncado e, é encontrado no cromossomo W, que é específico de fêmeas. Assim o 

dm-w passa a participar do desenvolvimento ovariano. Retirado de MATSON e ZARKOWER, 

(2012). 

 

Em mamíferos, a determinação sexual ocorre com a expressão do gene 

“master" SRY. Após a expressão do SRY a cascata gênica de diferenciação 

sexual é ativada em que o DMRT1 é expresso na gônada indiferenciada e é 



25 
 

responsável pela diferenciação testicular (Fig.5 A) (RAYMOND et al., 1998; 

MELLO et al., 2005). 

Em aves, a expressão do DMRT1 é ligada ao cromossomo Z. Portanto os 

machos possuem duas cópias e as fêmeas uma, sugerindo assim, que a 

expressão do DMRT1 é essencial para diferenciação testicular e sua alta 

expressão pode determinar o sexo (Fig.5 C) (SMITH et al., 2009). Já em anfíbios, 

no caso Xenopus laevis, uma duplicação do dmrt1 no cromossomo W é 

responsável pela diferenciação ovariana (Fig.5 D) (YOSHIMOTO et al., 2010). 

Em alguns peixes o dmrt1 é expresso nas gônadas de várias espécies 

(Fig.5 B). Em truta arco-íris, o dmrt1 é expresso nas gônadas masculinas e atua 

na diferenciação sexual masculina (MARCHAND et al. 2000). Em tilápia, o 

padrão e expressão do dmrt1 sugere que este gene seja responsável pela 

diferenciação testicular (IJIRI et al. 2008). Já em zebrafish, Guo e colaboradores 

(2005), mostraram que o dmrt1 não apresenta dimorfismo sexual quanto à sua 

expressão em gônadas indiferenciadas. Os autores sugerem que este gene 

desempenha um papel importante durante o desenvolvimento gonadal de 

machos e fêmeas (GUO et al. 2005). No entanto, Webster e colaboradores 

(2017) demonstraram em zebrafish que o dmrt1 é necessário para o 

desenvolvimento testicular. Além disso, estes autores também mostraram que o 

dmrt1 é requerido para a manutenção e auto-renovação das células germinativas 

masculinas iniciais de zebrafish (WEBSTER et al., 2017). Corroborando estas 

evidências, a deleção do gene dmrt1 em zebrafish alterou o desenvolvimento 

das células germinativas, levando à regressão dos testículos (LIN et al., 2017).  

Um dos casos mais interessantes em que o gene dmrt1 atua no processo 

de determinação sexual em peixes ocorre em medaka (O. latipes) (Fig.5 B). O 

medaka é uma espécie com o sistema de determinação sexual genética XX/XY. 

Uma região específica do cromossomo Y apresenta o gene dmY (MATSUDA et 

al. 2002) ou também conhecido como dmrt1bY (NANDA et al. 2002). Este gene 

é formado a partir da duplicação do dmrt1 autossômico. Desta forma, o 

dmY/dmrt1bY assume o papel primordial de gene “master" de determinação 

sexual masculina e é necessário para o desenvolvimento testicular (MATSUDA 

et al. 2002; NANDA et al. 2002). 



26 
 

 

5. O Amh e seu papel na determinação e diferenciação sexual 

 

O Hormônio Anti-Mülleriano (Amh) é uma glicoproteína membro da família 

TGF-β (transforming growth factor-beta), que tem um papel importante na 

regressão do ducto de Müller durante a diferenciação sexual masculina em 

vertebrados tetrápodes (JOSSO et al., 2006). 

Durante a formação embrionária, a gônada indiferenciada é composta 

pelos ductos paramesonéfricos (Müller) e ductos mesonéfricos (Wolf). Os ductos 

de Müller serão responsáveis pela formação do útero, tubas uterinas e pela 

formação de partes superiores da vagina. Já os ductos de Wolf formam o 

epidídimo, os canais deferentes e as vesículas seminais (GOODFELLOW e 

LOVELL-BADGE, 1993; JOSSO et al., 2006). A gônada indiferenciada irá 

diferenciar-se em um testículo ou ovário através da ativação de uma cascata 

gênica. Em humanos, esta cascata é bem descrita e primeiramente ocorre pela 

ativação do SF-1 (Steroidogenic factor 1) e WT1 (Wilms’ tumor 1), que por sua 

vez irão ativar a expressão do SRY (Sex determining Region Y) (Fig.6). Na 

presença do SRY, as células de Sertoli iniciam a produção do AMH. O AMH 

produzido será responsável pela regressão dos ductos de Müller levando assim 

a diferenciação masculina com o desenvolvimento dos testículos. Na ausência 

do SRY ocorre a expressão do gene WNT4 (Wingless-type MMTV integration 4) 

e DAX-1 (Dosage-sensitive sex reversal - Adrenal hypoplasia congenita critical 

region on the X chromosome 1) que serão responsáveis pela ativação da cascata 

de diferenciação feminina (GOODFELLOW e LOVELL-BADGE, 1993; HAQQ et 

al., 1994; LEE et al., 1996; REY, 1998; BIASON-LAUBER e KONRAD, 2008; 

TANAKA e NISHINAKAMURA, 2014) (Fig.6). 

 



27 
 

 

 

FIGURA 6. Diferenciação sexual em mamíferos. Os genes WT1 e SF-1 atuam na crista gonadal 

e são responsáveis por ativar o gene de determinação sexual SRY. O gene SRY é responsável 

pela determinação sexual masculina. A presença do SRY determina a diferenciação da gônada 

bipotencial em testículo. Uma das funções desse gene é a de iniciar a diferenciação das células 

de Sertoli que passa a produzir o AMH. O AMH atua na regressão do ducto de Müller levando à 

diferenciação testicular. Na ausência do SRY ocorre a ativação dos genes WNT4 e DAX-1, os 

quais serão responsáveis pela diferenciação do sexo feminino. Modificado a partir de BIASON-

LAUBER e KONRAD, (2008). 

 

Em relação à sua estrutura, o Amh apresenta-se como um gene de cópia única 

nos vertebrados. Porém, em duas espécies de peixes teleósteos, peixe-rei da 

Patagônia (HATTORI et al., 2012) e tilápia do Nilo (ESHEL et al., 2014), o amh 

é duplicado, neste caso esta segunda cópia, denominada amhY, atua como 

determinante sexual (Fig.7). 

 



28 
 

 

FIGURA 7. Ilustração mostrando a estrutura do gene amh e amhY em peixe-rei da Patagônia. 

Os exons são representados pelas caixas laranjas. Segmentos abertos representam os introns. 

Na caixa em cinza é possível observar a localização da inserção de 557 pares de base na 

sequência do amhY. A linha azul representa o domínio TGF-β. Retirado de HATTORI et al., 

(2012). 

 

O gene Amh apresenta 5 exons em mamíferos e aves. Em humanos e 

camundongos, a proteína formada contém 554 e 560 resíduos de aminoácidos, 

respectivamente. Já em galinhas, o AMH possui 644 resíduos de aminoácidos. 

Em peixes teleósteos, o gene amh consiste de 7 exons que codificam uma 

proteína de 500 resíduos de aminoácidos. Diferentemente dos demais peixes, o 

gene amh de truta arco-íris possui somente 6 exons que codificam uma proteína 

de 571 resíduos de aminoácidos (RODRIGUEZ-MARI et al., 2005; HALM et al., 

2007; KLUVER et al., 2007; JAMIN et al., 2008; HATTORI et al., 2012).  

O AMH é secretado como um precursor homodimérico com tamanho de 

140-kDa, o qual consiste em dois monômeros de 70-kDa cada. O AMH é 

composto por uma região C-terminal madura com 25-kDa. Esta região se torna 

bioativa após sofrer uma clivagem proteolítica e se ligar ao receptor do AMH tipo 

2 (AMHRII), induzindo assim sinais intracelulares através de proteínas Smads 

(PEPINSKY et al., 1988; di CLEMENTE et al., 2010). A região N-teminal é 

chamada de pró-região. Esta parte é importante para a síntese e transporte do 

AMH extracelular. O precursor do AMH é clivado entres estes dois domínios (pró-

região e C-terminal). Em seguida, uma segunda clivagem ocorre na pró-região 

dando origem a três regiões diferentes: região pró-semi-madura, semi-madura e 



29 
 

madura (Fig.8) (JOSSO e di CLEMENTE, 2003; di CLEMENTE et al., 2010, 

MAMSEN et al., 2015).  

A região C-terminal se torna biologicamente ativa quando se associa de 

maneira não-covalente com a pró-região. Uma nova clivagem resulta na 

dissociação da pró-região com a região C-terminal madura. Desta forma o AMH 

maduro é liberado na matriz extracelular. A porção N-terminal é importante para 

a manutenção da atividade biológica da porção C-terminal do AMH (Fig.8) 

(WILSON et al., 1993; JOSSO e di CLEMENTE, 2003; di CLEMENTE et al., 

2010). As sequencias da proteína deduzida do AMH mostram características 

bem conservadas entre as espécies de vertebrados, tais como o domínio TGF-

β na região C-terminal e o domínio Amh_N na região N-terminal. No entanto, 

vale ressaltar as diferenças no sitio de clivagem entre os vertebrados. Em 

mamíferos e aves, a região onde ocorre o reconhecimento pelas proteases para 

a clivagem é simples (R-X-X-R), enquanto que em peixes teleósteos a região é 

dupla (R-X-X-R-X-X-R). Esta clivagem é necessária para o processamento do 

AMH. 



30 
 

 

 

FIGURA 8. Diagrama mostrando o processamento do AMH. O AMH é produzido como um 

precursor covalente não ativo homodimérico, que precisa ser clivado para se tornar ativo. O 

precursor do AMH é clivado entres os dois domínios por ação de proteases dando origem a uma 

pró-região (região pró-madura) não covalente. Neste momento, ocorre a formação de três 

regiões diferentes: região pró-semi-madura, semi-madura e madura. A dissociação das duas 

regiões (pró-região e região madura C-terminal), libera a região madura C-terminal que é a forma 

ativa do hormônio. Retirado de MAMSEN et al., (2015). 

 

Na matriz extracelular o AMH maduro se liga à um complexo de 

receptores de membrana serina/tirosina quinase do tipo I e tipo II. Os receptores 

tipo II possuem domínio extracelular para associação específica com os ligantes 

(MASSAGUÉ et al., 2000; TEN DIJKE et al., 2002; FAN et al., 2012; SPILLER et 

al., 2017). A partir da formação do complexo ligante/receptor II e I ocorre uma 

cascata de fosforilações, iniciada com o receptor tipo II fosforilando o receptor 

tipo I que também por fosforilação, ativa proteínas mediadoras citoplasmáticas 

chamadas Smads (Fig.9) (MIYAZAMA et al., 2002). 

As Smads são divididas em 3 grupos de acordo com sua função. As R-

Smads estão associadas aos receptores tipo I e realizam a mediação de sinal da 

membrana em direção ao núcleo; são elas Smads 1, 2, 3, 5 e 8. A Co-Smad 

(Smad 4) se associa às R-Smads no citoplasma e as translocam para o núcleo 

celular. Por fim, as I-Smads (Smads 6 e 7) que são antagonistas das R-Smads 



31 
 

e que apresentam atividade inibitória sob estímulos específicos (Fig.9) 

(MIYAZAMA et al., 2002; SPILLER et al., 2017). As R-Smads são ativadas pelo 

complexo ligante/receptor tipo I e II de acordo com uma distribuição que nos 

permite agrupar a via TGF-β em duas grandes subfamílias (Vogt el al., 2011, 

Spiller et al., 2017). O AMH tem como mediadores as R-Smads (1,5 e 8). A Smad 

4 transporta as R-Smads fosforiladas (1, 2, 3 ,5 e 8) do citoplasma para o núcleo 

celular. Esse conjunto de proteínas Smads é levado ao DNA e atuam na 

regulação da expressão gênica, em associação à Co-ativadores, Co-repressores 

e demais reguladores transcricionais (Fig.9) (MASSAGUÉ et al., 2000; TEN 

DIJKE et al., 2002; MIYAZAMA et al., 2002; FAN et al., 2012; SPILLER et al., 

2017). 

 



32 
 

 



33 
 

FIGURA 9. Via de sinalização do AMH.  A clivagem do AMH por proteases resulta numa alteração 

conformacional no domínio C-terminal, que permite a ligação não covalente do AMH ao receptor 

tipo II do AMH (AMRHII). O AMH se liga ao AMRHII e recruta o receptor tipo I levando à formação 

de um complexo e à fosforilação do receptor tipo I. Após a ativação, o receptor tipo I fosforila as 

SMADs 1/5/8 (R-Smads), permitindo que essas proteínas se associem com a Smad4 e migrem 

para o núcleo. No núcleo, o complexo SMAD se associa com co-fatores, e o complexo formado 

se liga a regiões regulatórias específicas em genes-alvo, ativando assim a transcrição. Retirado 

de di Clemente e colaboradores (2010). 

 

Em mamíferos, a expressão do Amh é muito importante para a 

diferenciação testicular, onde seus níveis elevados são produzidos pelas células 

de Sertoli no início da diferenciação testicular e diminuem com a puberdade 

(REY, 1998). Em fêmeas adultas de mamíferos, o Amh inibe a formação dos 

folículos ovarianos primordiais (NILSSON et al., 2011). 

O fato do Amh estar ligado à diferenciação sexual foi observado em 

estudos realizados em peixes teleósteos, mais especificamente num mutante do 

peixe medaka, chamado hotei (MORINAGA et al., 2007). O fenótipo hotei é 

causado pela mutação no gene que codifica o receptor do Amh tipo II (AmhrII) 

(MORINAGA et al., 2007). Nestes mutantes, a ausência do AmhrII levou a uma 

hipertrofia gonadal e 50% dos machos XY reverteram para fêmeas (Fig.10) 

(MORINAGA et al., 2007). Estes resultados sugerem que o AmhrII desempenha 

relevante papel na diferenciação sexual desta espécie. Além disso, também é 

sugerido que a sinalização do Amh regula a atividade proliferativa das células 

germinativas (Fig.10). 



34 
 

 

 

Figura 10. Fenótipo apresentado pelo mutante medaka hotei. Os fenótipos sexuais primários 

dos peixes hotei feminino são indicados pela letra F, enquanto o sexo genético por XX, ou M 

para o fenótipo dos machos e XY para o sexo genético. (A) fêmea selvagem (XX). (B) macho 

selvagem (XY). Os machos apresentam as bordas das nadadeiras ásperas e maiores. (C) Fêmea 

hotei XY. (D) Macho hotei XY. (E) Fêmea hotei XX, mostrando uma expansão abdominal. (F) 

Macho hotei XY também com uma expansão abdominal pronunciada. (G) Ovário de fêmea 

selvagem. (H) Testículo de macho selvagem. (I) Cavidade abdominal de fêmeas hotei XX 

totalmente ocupado por ovário hipertrófico. (J) Testículo hipertrófico em machos hotei XY. (K) 

Comparação entre as gônadas isoladas de animais selvagens e hotei após 6 meses. (L) 

Mudanças no índice gonadossomático de animais selvagens e hotei aos 2, 3, 5 e 8 meses após 

eclosão. (M) Genótipos/Fenótipos dos hotei homozigotos 6 meses após eclosão. Retirado de 

MORINAGA et al., (2007). 

 



35 
 

Nos peixes teleósteos, a expressão do amh é maior em machos do que 

em fêmeas, como por exemplo, em linguado (YOSHINAGA et al.2004), tilápia do 

Nilo (IJIRI et al. 2008) e zebrafish (RODRÍGUEZ-MARÍ et al. 2005). Já em 

hermafroditas, como no pargo preto (Acanthopagrus schlegeli), por exemplo, 

níveis elevados de amh estão associados com o início da diferenciação testicular 

(WU et al., 2010; WU e CHANG, 2013), e seu padrão de expressão é mantido 

durante o período de reversão sexual de fêmea para macho. Por outro lado, na 

reversão de macho para fêmea, seus níveis diminuem drasticamente (WU et al., 

2010; WU et al., 2012; WU e CHANG, 2013).  

Em Odontesthes hatcheri, Hattori e colaboradores (2012) mostraram que 

machos apresentam uma cópia duplicada do gene amh, o amhy, que está ligado 

ao cromossomo Y e é requerido para a determinação sexual desta espécie. 

Neste sentido, o Amh e seu receptor devem desempenhar um papel importante 

na diferenciação sexual masculina, assim como no desenvolvimento testicular 

dos vertebrados de uma maneira geral.  

 

6. Amh como regulador do processo de espermatogênese 

 

Em peixes adultos, a expressão diferencial do amh é observada entre os 

sexos. O amh é mais expresso em testículos do que em ovários (SKAAR et 

al.,2011; OLIVEIRA, 2014). No entanto, pouco se sabe sobre o papel do Amh na 

espermatogênese e função testicular de peixes machos adultos.  

Durante a puberdade de zebrafish, o Amh inibe a produção e secreção de 

andrógenos pelas células de Leydig (Fig.11) (SKAAR et al., 2011). Os 

andrógenos são importantes para estimular a proliferação espermatogonial e a 

entrada da meiose pelas células germinativas. Nas células de Sertoli de 

zebrafish, o Amh neutraliza os efeitos dos fatores de crescimento estimulatórios 

da espermatogênese, como o Igf3 (insulin-like growth factor 3) (MORAIS et al., 

2017). Por outro lado, o Amh aumenta a produção de fatores de crescimento 

inibitórios produzidos pelas células de Sertoli, como a inibina-a (inha), inibidor do 

fator de transcrição da ligação ao DNA (id3) e prostaglandina E2 (PGE2). Juntos, 

estes mecanismos levam a inibição da proliferação e diferenciação celular e 



36 
 

também atuam na manutenção das espermatogonias em seu estado 

indiferenciado (SKAAR et al.,2011; ADOLFI et al., 2018).  

 

 

Figura 11. Papel do Amh na espermatogênese de zebrafish. As células de Sertoli produzem 

Amh que através de uma via autócrina estimula a produção de fatores de crescimento pelas 

células de Sertoli. Estes fatores de crescimento atuam no nicho espermatogonial, bloqueando a 

diferenciação e a proliferação das espermatogônias indiferenciadas (Aund). O Amh também inibe 

a função das células de Leydig na produção e liberação de andrógenos. O hormônio folículo 

estimulante (Fsh) diminui a expressão do amh criando uma condição permissiva para a 

diferenciação e proliferação espermatogonial. O Fsh estimula a produção de andrógenos (11-

Ketotestosterona) pelas células de Leydig, que induz a produção de fatores de crescimento pró-

diferenciação pelas células de Sertoli. O quadro a direita ilustra os genes que têm sua expressão 

diminuída na presença do Amh. As diferentes gerações espermatogôniais também estão 

mostradas na figura: espermatogônia indiferenciada (Aund), espermatogônia diferenciada (Adiff), 

e espermatogônia do tipo B (B). Retirado de SKAAR et al., (2011). 

 

Em algumas espécies, como Lateolabrax japonicas, o gene amh possui 

elevados níveis de expressão em testículos imaturos (CHI et al., 2014). No 

entanto, estes níveis são diminuídos quando as espermatogônias entram em 

proliferação e diferenciação (CHI et al., 2014). Em Oncorhynchus mykiss, a 

expressão do amh é inibida pela presença de testosterona e 11- 

Ketotestosterona (principal andrógeno nos peixes) (ROLLAND et al., 2013). A 

testosterona e 11-Ketotestosterona são produzidas pelas células de Leydig, e 



37 
 

induzem a proliferação e diferenciação espermatogonial através da produção de 

fatores de crescimento pelas células de Sertoli (ROLLAND et al., 2013). No 

entanto, pouco se conhece acerca da via de sinalização do Amh na 

espermatogênese e função testicular em machos adultos de peixes teleósteos. 

Em Salmo salar, os níveis de expressão do amh são dependentes dos 

estágios do ciclo reprodutivo dos machos (MAUGAR e SCHMITZ, 2008). Em 

estágios em que os testículos possuem epitélio germinativo composto 

primeiramente por espermatogônias (estágio imaturo), os níveis de expressão 

de amh apresentam-se elevados e diminuem gradativamente a medida que os 

testículos entram em maturação (MAUGAR e SCHMITZ, 2008). Além disso, 

estudos recentes demonstram que níveis elevados de expressão de amh 

coincidem com baixas taxas de proliferação (espermatogonial e de células de 

Sertoli) avaliadas pela detecção do antígeno nuclear de proliferação celular 

(PCNA) em Cyprinus carpio. (MIURA et al., 2002; OLIVEIRA, 2014). Assim, é 

sugerido que em carpa comum, os níveis baixos de expressão de amh sejam um 

fator permissivo para a proliferação espermatogonial (OLIVEIRA, 2014).  

Mais recentemente, a fim de se investigar o papel do Amh nos 

mecanismos de regulação das células germinativas masculinas, Lin e 

colaboradores (2017) realizaram a deleção do amh pela tecnologia 

CRISPR/Cas9 em zebrafish. Os autores mostraram que a perda da função do 

Amh levou a uma desregulação na proliferação das células germinativas e 

consequente hipertrofia gonadal em zebrafish (LIN et al., 2017). Além disso, os 

autores relataram aumento na proporção de fêmeas nos animais homozigotos 

(71%) enquanto que nos animais heterozigotos, esta porcentagem foi de apenas 

46% (LIN et al., 2017).  

Com base em estudos na enguia japonesa (MIURA et al., 2002), acredita-

se que o efeito inibitório do Amh sobre a espermatogênese de zebrafish/carpa 

possa estar associado à diminuição de andrógenos e também por fatores 

inibitórios produzidos pelas células de Sertoli (SKAAR e NÓBREGA et al.,2011).  

Informações a respeito dos mecanismos de ação do Amh na 

espermatogênese, bem como na determinação e diferenciação sexual ainda não 

foram completamente elucidados. Neste sentido, estudos sobre o papel do Amh 

poderão gerar conhecimentos para mediar a puberdade precoce e/ou tardia 



38 

exibida por espécies de interesse comercial em cativeiro, bem como a 

masculinização de outras, como por exemplo, a utilização de linhagens 100% 

masculinizadas. 

7. Oryzias latipes como modelo experimental

O peixe medaka (Oryzias latipes) (Fig.12) é comumente utilizado como 

modelo experimental em vários mecanismos biológicos, como desenvolvimento 

embrionário, determinação sexual e diferenciação gonadal (KIRCHMAIER et al., 

2015). Isto se deve, principalmente pelo fato desta espécie apresentar 

características vantajosas tais como, rápido período de desenvolvimento, 

genoma disponível e de pequeno tamanho, e por apresentar sistema de 

determinação sexual XX/XY, onde o macho mostra-se heterogamético 

(MATSUDA et al., 2002). Em relação ao fenótipo, diferenças entre características 

secundárias atribuídas ao sexo são claramente distintas entre machos e fêmeas. 

As diferenças são particularmente em relação a forma do corpo; a cor, forma e 

tamanho das nadadeiras dorsal e anal. Os machos apresentam as nadadeiras 

dorsal e anal maiores e mais largas com cor opaca. As fêmeas apresentam 

nadadeiras menores e uma coloração amarelada (MATSUDA et al 2007). 



39 
 

 

 

Figura 12. Oryzias latipes – Medaka. Fêmea (XX) (parte superior) com ovos aderidos na região 

ventral, na saída do canal urogenital. O macho (XY) (parte inferior) apresenta as bordas das 

nadadeiras maiores. Imagem: Arquivo pessoal. 

 

O medaka foi o primeiro vertebrado no que foi evidenciado a ocorrência 

de crossing-over entre os cromossomos X e Y (AIDA et al., 1921), sendo um dos 

primeiros organismos utilizados em estudos de indução a reversão sexual 

(YAMAMOTO et al., 1955). Em relação à determinação sexual, foi nesta espécie 

de peixe que o primeiro gene “master” da determinação sexual, o dmy ou 

dmrt1bY, foi descrito e caracterizado (MATSUDA et al., 2002; NANDA et al., 

2002; SCHARTL, 2004). 

 

8. CRISPR/Cas9 como técnica para edição genômica 

 

O sistema CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e 

Regularmente Interespaçadas) foi descoberto em 1987 por Ishino e 

colaboradores da Universidade de Osaka (Japão). Estes pesquisadores 

identificaram um locus peculiar no genoma de Escherichia coli, constituído por 

uma configuração incomum: sequências repetidas e sequências espaçadoras 

intercaladas ("spacer") de função desconhecida. Apenas em 2005 foi sugerido 

que o sistema CRISPR-Cas9 seria um sistema imune adaptativo de procariotos, 



40 
 

no qual os espaçadores serviriam como “memória de invasões anteriores” por 

bacteriófagos (MOJICA et al., 2005). Assim, RNAs derivados desses 

espaçadores serviram como moléculas complementares aos patógenos 

invasores, permitindo combatê-los de maneira sequência-específica. Somente 

em 2012/13 foi descoberto que essa técnica poderia ser utilizada no meio 

científico. Duas publicações merecem destaque nesse quesito, a primeira, que 

introduziu o conceito e evidenciou seu potencial (JINEK et al., 2012) e uma 

segunda, onde foi mostrado o amplo sucesso, fácil acessibilidade e versatilidade 

da técnica (CONG et al., 2013). 

A técnica baseia-se na síntese de uma molécula de RNA complementar à 

uma sequência genômica alvo na qual pretende-se deletar (3 à 4 pares de base). 

Para tal, o RNA se associa à uma endonuclease que guia o mesmo até o alvo 

complementar a ele. Quando há complementariedade do RNA para com o alvo 

e a endonuclease reconhece a sequência PAM (Fig.13), ocorre a clivagem dos 

nucleotídeos. Essa enzima com atividade nucleásica é a Cas-9, pertencentes à 

família das enzimas Cas (Fig.13). Com a mutação, a sistema de reparo de DNA 

da célula é ativado e inserções ou deleções de pares de bases acabam por abolir 

a expressão do gene alvo. 

 

Figura 13. CRISPR-Cas9 e seus componentes básicos que em conjunto, inibem a expressão de 

um gene de interesse. No DNA genômico encontra-se o gene alvo, onde a Cas9 endonuclease 

irá produzir uma mutação indel (inserção-deleção). O crRNA (CRISPR-derived RNA) juntamente 

com o tracrRNA (trans-activating RNA) são responsáveis por guiar e ativar o sistema, 



41 

respectivamente. Atualmente, ambos RNAs são sintetizados numa única molécula, chamada de 

gRNA ou sgRNA (single guide RNA). A sequência 5´-NGG-3´ é necessária estar presente 

adjacentemente ao alvo, para que a atividade endonucleásica da Cas-9 funcione 

adequadamente. Tal sequência é conhecida como PAM, ou Protospacer adjacent motif. REC – 

lobo de reconhecimento e NUC – lobo nucleásico da Cas9. RuvC e HNH são dois domínios da 

Cas9, cada qual responsável por “cortar” uma fita da molécula de DNA. Imagem retirada de 

http://www.ozbiosciences.com/content/58-transfection-reagents-for-genome-editing. 

Em relação as demais técnicas de edição genômica, como ZFN (Zinc 

Fingers Nucleases) e TALENs, (Transcription Activator–like Effector Nucleases), 

o CRISPR-Cas9 apresenta algumas vantagens tais como: rápida e fácil

metodologia, onde em apenas dois dias é possível sintetizar o gRNA, baixo custo 

e principalmente alta taxa de sucesso devido a sua alta sensibilidade para o 

reconhecimento de sequências específicas presentes no DNA (CENCIC e 

HISASHI, 2014). 

http://www.ozbiosciences.com/content/58-transfection-reagents-for-genome-editing


76 
 

VII. Conclusão 

 

 Este estudo demonstrou que o sistema CRISPR/Cas9 foi eficiente para 

deletar genes relacionados com a diferenciação sexual de medaka. Assim, 

conseguimos gerar animais mutantes homozigotos para o gene amh (-/-). 

Obtivemos uma deleção de 759 pares de base entre os exons 6 e 7 do gene amh, 

o que corresponde à parte do domínio Amh_N e TGF-β, ambas cruciais para o 

funcionamento do hormônio. 

 As principais conclusões obtidas a partir dos resultados gerados com a 

utilização deste interessante modelo foram: 

1) Todos os animais amh (-/-) XY sofreram reversão sexual. Neste 

sentido, o Amh pode ser considerado um fator crucial para a 

diferenciação sexual masculina em medaka. Na ausência do Amh, os 

machos XY revertem para fêmea.  

2) Todos os mutantes (machos e fêmeas) apresentaram hipertrofia 

gonadal. Este fato indica que o Amh regula a proliferação das células 

germinativas. A ausência do Amh promove por tanto intensa 

proliferação excessiva das células germinativas. 

3) A expressão do amh é maior em machos do que em fêmeas durante 

todos os estágios de desenvolvimento avaliados nos medakas 

selvagens e sua expressão diferencial precede a janela de 

diferenciação e a expressão de efetores downstream da cascata de 

diferenciação, como dmrt1 e gsdf, dentre outros. Este fato corrobora 

os dados encontrados para os mutantes amh (-/-), sugerindo que o 

Amh é um efetor upstream da cascata de diferenciação sexual e é 

responsável por regular direta ou indiretamente a expressão dos 

efetores downstream (dmrt1 e gsdf).  

4)  Finalmente, demonstramos a importância da sinalização TGF-β na 

diferenciação sexual de vertebrados, assim como também sua 

influência nos processos de regulação do crescimento/proliferação e 

diferenciação das células germinativas. 



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