Eliane Papa Ambrosio Perfil Genômico do Carcinoma de Células Escamosas de Laringe e seu Fronte de Invasão Botucatu Março/ 2010 Eliane Papa Ambrosio Perfil Genômico do Carcinoma de Células Escamosas de Laringe e seu Fronte de Invasão Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas (Genética) da UNESP-Botucatu como pré-requisito para obtenção do título de doutor em Genética Orientadora: Dra. Silvia Regina Rogatto Botucatu Março/ 2010 A vida é fruto da decisão de cada momento Talvez seja por isso que a idéia de plantio seja tão reveladora sobre a arte de viver. Viver é plantar É atitude de constante semeadura, de deixar cair na terra de nossa existência as mais diversas formas de sementes Cada escolha, por menor que seja, é uma forma de semente que lançamos sobre o canteiro que somos Um dia tudo o que agora silenciosamente plantamos ou deixamos plantar em nós, será plantação que poderá ser vista de longe Para cada dia, o seu empenho Felicidade talvez seja isso: alegria de recolher da terra que somos nós, frutos que sejam agradáveis aos olhos! Infelicidade talvez seja o contrário... O que não podemos perder de vista é que a vida não é real fora do cultivo Sempre é tempo de lançar sementes Sempre é tempo de recolher frutos Tudo ao mesmo tempo Sementes de ontem, frutos de hoje Sementes de hoje, frutos de amanhã! Pe Fábio de Melo RESUMO O câncer de laringe ocorre em 25% dos carcinomas de cabeça e pescoço e compreende 2% de todas as doenças malignas. É comum o aparecimento de segundos tumores primários e, aproximadamente, 5% dos pacientes apresentam cânceres sincrônicos. Há várias evidências indicando que a população celular presente no fronte de invasão possui características moleculares diferentes das áreas tumorais superficiais, tornando esta região importante para avaliação prognóstica. Neste estudo foram investigadas por CGH cromossômico de alta resolução (HR-CGH) as alterações genômicas na área superficial e no fronte de invasão de carcinomas de laringe e selecionadas regiões específicas para serem avaliadas por outras metodologias para a confirmação dos resultados. O componente superficial e o fronte de invasão de 33 carcinomas de laringe fixados em formalina e em blocos de parafina foram avaliados por HR-CGH. Foram detectadas alterações comuns aos dois componentes assim como alterações exclusivas a cada um deles. Adicionalmente, foi investigada e confirmada a expressão aumentada da proteína ciclina D1 o gene CCND1 esta mapeada em 11q13) por análise de expressão em plataformas de microarranjos de tecidos contendo as areas do tumor e do fronte de invasão. Foi realizada também a análise de marcadores polimórficos de microssatélites mapeados em 3q e 18q em um grupo independente de 33 amostras (DNA tumoral e do sangue periférico) cujos resultados confirmaram as perdas encontradas nestas regiões cromossômicas. A expressão do gene CTTN (mapeada em 11q13) e de sua proteína foram avaliadas e revelaram que os altos níveis de expressão proteica foram correlacionados com invasão perineural nas células do fronte de invasão, sugerindo que esta área pode ser considerada como ferramenta prognóstica em carcinomas de laringe. Foram investigados os ganhos detectados em 2q24. A análise por FISH confirmou os ganhos genômicos sendo também detectado o consequente aumento de expressão do transcrito ACVR1, os quais revelaram uma associação com sobrevida aumentada em carcinomas de laringe. Os resultados apresentados indicam que ocorrem diferenças genômicas entre a área superficial e o fronte de invasão e revelam regiões genômicas e ou genes particulares que tem relevância prognóstica em carcinomas de laringe. 5 ABSTRACT Laryngeal cancer occurs in 25% of head and neck carcinomas and comprises 2% of all malignant diseases. The appearance of secondary tumors is common and approximately 5% of patients present concurrent cancers. Preliminary evidence indicates that the cell population present at the source of the invasion front possesses distinct molecular characteristics to surface tumor areas, making this an important region for prognostic evaluation. In this study, genomic alterations in superficial areas and the invasion front of laryngeal carcinomas were investigated by high resolution chromosomal comparative genomic hybridization (HR-CGH) and specific areas were selected for evaluation by other methodologies to confirm the results. The superficial and invasion front components of 33 laryngeal carcinomas fixed in formalin and embedded in paraffin blocks were analyzed by HR-CGH. Alterations common to both components and those exclusive to each area were detected. Additionally, increased ciclin D1 (gene is mapped at 11q13) protein expression was confirmed through immunohistochemistry analysis of tissue microarray platforms containing superficial tumor and invasion front tissues. Polymorphic microsatellites markers mapped at 3q and 18q was also performed on an independent group of 33 samples (tumor and peripheral blood DNA); the results confirmed the losses verified in these chromosomal regions. Expression of the gene CTTN (mapped at 11q13) and its protein were evaluated revealing that high levels of protein expression were correlated with perineural invasion in invasion front cells, suggesting that this area could be considered a prognostic tool in laryngeal carcinomas. The gains detected at 2q24 by HR-CGH were confirmed by FISH and transcript analysis by qRT-PCR. It was found an association between copy number gains of ACVR1 and its overexpression with increased overall survival in laryngeal carcinomas. Analysis of the results obtained indicate that genomic differences occur between the superficial area and the invasion front and revealed candidate genomic regions and/or specific genes that have prognostic relevance in laryngeal carcinomas. 6 INTRODUÇÃO O carcinoma de laringe é o 110 câncer mais freqüente entre homens de todo o mundo e o segundo mais comum entre os carcinomas de cabeça e pescoço (American Cancer Society, 2007). Em uma revisão recente, Curado et al (2009) relataram que a Espanha é o país com maior incidência de cânceres de laringe e o Brasil aparece em 8º colocação, sendo São Paulo a cidade de maior incidência. A estimativa na população brasileira é que os carcinomas de laringe representam 25% dos tumores de cabeça e pescoço e 2% das doenças malignas (INCA, 2009). O consumo de tabaco e álcool são os fatores de risco melhor estabelecidos para carcinomas de cabeça e pescoço, sendo reconhecido que a laringe é o órgão mais suscetível a ação da fumaça do cigarro (Hashibe et al, 2007). Apesar da exposição ao tabaco e álcool ser a causa etiológica de aproximadamente 75-80% dos cânceres de cabeça e pescoço, a infecção pelo papilomavirus humano (HPV) tem sido etiologicamente correlacionada aos 20-25% dos casos restantes (Ragin et al, 2007). Recentemente, Gallo et al (2009) avaliaram o HPV em lesões benignas e malignas de laringe e todos os carcinomas e displasias foram negativos para HPV. Entretanto, outros mostraram uma associação positiva entre a infecção pelo HPV e carcinomas de laringe (Bozdayi et al, 2009; Baumann et al, 2009). Baumann et al, (2009) relataram que 10 de 38 casos de tumores de laringe T1-T2 eram HPV positivo (tipos 16, 26, 31, 39 e 52). Neste estudo, os pacientes com carcinomas de laringe HPV- positivos eram mais jovens e não apresentavam, em geral, história de consumo de tabaco. Histologicamente, mais de 95% das neoplasias de laringe são classificadas como carcinomas de células escamosas (CCEL) (European Network of Cancer Registries, 1997; Almadori et al, 2005). Neste subtipo uma característica comum é a ocorrência de segundos tumores primários (STP). Além disso, 10% dos casos possuem história prévia de outros cânceres e em aproximadamente 5% dos casos há relatos de tumores sincrônicos (Shah et al, 1997). A classificação TNM que considera as características de extensão local do tumor (T), disseminação regional (N) e metástase à distância (M), é a mais aceita e tem contribuída para a avaliação prognóstica (Hermanek et al, 1997). Entretanto, vários estudos têm mostrado que além do sistema TNM outros parâmetros são úteis na avaliação da agressividade tumoral em CCEL, como o antígeno proliferativo de célula nuclear (PCNA), o índice de proliferação Ki-67, expressão da proteína TP53 e gradação de acordo 7 com a morfologia do fronte de invasão (Morawski et al, 1999; Baatenburg et al 2001; Costa et al, 2002; O'Sullivan, 2003). Especificamente em carcinomas epidermóides orais há evidências de que a sobrevida dos pacientes diminui devido à recorrência local ou metástase precoce em gânglios linfáticos. A gradação histológica das partes mais profundas do carcinoma epidermóide oral influencia diretamente na sobrevida dos pacientes, já que as células neoplásicas nesse local mostram-se indiferenciadas e de grande valor prognóstico. As células invasivas freqüentemente possuem características diferentes quando comparadas a outras áreas em neoplasias humanas. Geralmente as partes invasivas são pobremente diferenciadas em relação às partes superficiais, que são as primeiras avaliadas (Bryne, 1998). Bryne (1998) utilizou um sistema de gradação multifatorial do potencial maligno, denominado ICG (Gradação de Células Invasivas), em margens invasivas em 61 casos de carcinoma epidermóide oral. Nessas áreas há populações de células heterogêneas com comportamento biológico variável, evidenciando assim o alto valor prognóstico desse sistema comparado ao sistema TNM. O fronte de invasão tem importância biológica nas neoplasias epiteliais pelo acúmulo de células proliferativas presentes nessa região (Piffkó et al, 1996). Relatos em literatura indicam que as células tumorais do fronte de invasão diferem substancialmente das demais células tumorais (Bryne et al 1992, Bànkfalvi and Piffkò 2000, Graflund et al 2002, Noguchi et al 2002, Po et al 2002, Sawair et al 2003). Além das características histológicas também foram relatados vários eventos moleculares relevantes no desenvolvimento tumoral como aumento e/ou diminuição da expressão de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas, aumento da proliferação celular e iniciação da angiogênese (Ivkié et al, 2002). Em carcinomas de laringe, há três formas histológicas principais de invasão: vegetante, infiltrativa e ulcerada. Acredita-se que a doença possa evoluir diferentemente em cada uma delas (Loyo et al, 2008). Para o nosso conhecimento, não há relatos de estudos que consideraram o fronte de invasão em associação com o prognóstico e a sobrevida em carcinomas de laringe. Há um grande empenho em detectar marcadores moleculares de detecção precoce da doença, de progressão e risco de metástase, da doença residual mínima nas margens tumorais após cirurgia, da capacidade de diagnosticar recorrências em tempo mínimo assim como marcadores de resposta a terapia em carcinomas humanos (Sidransky, 2002; Almadori et al, 2005). Entretanto, vários obstáculos dificultam este processo: as vias 8 relacionadas com o processo tumoral, assim como a biologia destes tumores não são completamente compreendidas; os modelos pré-clínicos nem sempre refletem a doença humana e não predizem de forma correta os procedimentos clínicos; há heterogeneidade de genes alvos e de suas funções entre os diferentes indivíduos com tipos de tumores similares e podem ocorrer efeitos clínicos variáveis e não previsíveis dos alvos terapêuticos; os fármacos muitas vezes acometem células normais além das neoplásicas; e a eficiência do tratamento pode estar limitada a outros fatores, como resistência intrínseca (Osborne et al, 2004). O marcador ideal para a caracterização de um tumor não precisa estar constantemente presente nas células malignas, mas invariavelmente associado a fatores biológicos precisos e ser facilmente detectável por critérios confiáveis, com o uso de pequenas frações de amostra, como biópsias. Até o presente, não foi descrito um ou mais marcadores que preencham todos estes pré-requisitos, entretanto, ferramentas como a análise de uma grande quantidade de genes (CGH-arrays e arrays de expressão) têm sido utilizadas como tentativas iniciais para classificação molecular, baseados na identificação de seqüências genômicas envolvidas em perdas e ganhos consensos ou no padrão de expressão gênica global (Belbin et al, 2002; Rogatto e Rainho, 2004). Além disso, a grande busca dos pesquisadores têm sido marcadores que complementem o sistema atual (TNM) utilizado para delineamento de tratamentos e que sejam potenciais alvos terapêuticos. Gold et al (2009) relataram em classes os marcadores que têm sido mais explorados em carcinomas de cabeça e pescoço: 1. Reparo a danos no DNA (TP53, ERCC1); 2. Angiogênese (VEGF, VEGFR, PDGF), 3. EGFR e ligantes (EGFR, AREG, TGFA), 4. HPV, 5. IGF-1R e ligantes (IRS-1, INSR), 6. Genes relacionados a apoptose (BCL-XL, BAX), 7. Regulação do ciclo celular (CCND1, TP16), 8. Atividade telomerásica (h-TERT), 9. Metaloproteinases, 10. Adesão celular (CDH1, a-catenina), 11. Transição epitélio-mesênquima (NBS-1, SNAI1), 12. Via mTor (AKT, MTOR), 13. Fatores de transcrição (NFkB, MYC) e 14. Mediadores Inflamatórios (COX-2). Os eventos moleculares que levam a carcinogênese da laringe e os associados à iniciação e progressão são ainda desconhecidos. Os CCECP, em geral, são caracterizados por alta heterogeneidade cariotípica, resultante do acúmulo seqüencial de alterações genéticas. Estes resultados levaram a investigação de avaliação prognóstica baseados em perfis moleculares (Estilo et al, 2003). O advento do screening genômico global baseado na hibridação genômica comparativa (CGH) tem contribuído significativamente na caracterização molecular de diversos cânceres. Esta técnica permite a detecção de ganhos e perdas genômicas e tem sido utilizada na 9 análise de genomas tumorais desde que foi descrita, em 1992 por Kallioniemi e colaboradores. Pela CGH, o DNA obtido da amostra teste e referência são marcados por fluorocromos distintos e co-hibridados na presença de DNA Human Cot-1 em lâminas contendo metáfases. A razão da fluorescência entre O DNA teste e de referência é determinada em diferentes posições ao longo dos cromossomos e fornece a informação da alteração do número de cópias em relação ao genoma diplóide normal (Albertson e Pinkel, 2003). A maioria dos relatos publicados utilizando CGH cromossômico considera os carcinomas de cabeça e pescoço como um todo, entretanto, sabe-se que a laringe tem várias peculiaridades clínicas e moleculares. Contudo, há relatos evidenciando diferenças no padrão cromossômico e progressão tumoral entre os carcinomas de laringe e os demais carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (Patmore et al, 2007; Keser et al, 2008; Bauer et al, 2008). Bérgamo et al (2005) avaliaram por métodos de citogenética clássica e molecular 67 tumores de cabeça e pescoço, entre os quais 18 casos de CCEL. A alteração numérica mais comumente observada em carcinomas de laringe foi a trissomia do cromossomo 20. A perda do cromossomo Y foi verificada em cinco casos e em seis foram observadas alterações estruturais no cromossomo 22. A perda em 13q foi freqüentemente observada em tumores de laringe. As alterações cromossômicas mais freqüentes relatadas em laringe envolvem: 1p, 3p, 3q, 5q, 7p, 9p, 11p, 11q, 13q, 14q, 15q, 17p e 18q. Técnicas de citogenética molecular, como FISH (hibridação in situ fluorescente) e CGH, aplicadas também em materiais fixados e em blocos de parafina tem permitido uma melhor compreensão das alterações genéticas em carcinomas de laringe. Ganhos em 3q, 5p, 8q e 11q13 e perdas em 3p e 9p aparecem como alterações consistentes quando comparadas às demais. Estudos moleculares têm sido realizados nessas regiões para identificar genes candidatos associados aos carcinomas de laringe (revisão em Keser et al, 2008). Quinze relatos utilizaram a técnica de CGH para descrever as alterações cromossômicas em carcinomas de laringe (total 248 casos) (Tabela 1. O presente estudo abrangeu a análise 33 amostras de carcinomas de laringe por CGH cromossômico de alta resolução (HR- CGH) nos dois componentes, as células do fronte de invasão e da superfície tumoral. A abordagem deste estudo é inédita em carcinomas de laringe. Em carcinomas orais, temos conhecimento de seis relatos publicados em literatura considerando o fronte de invasão (Kurokawa et al, 2006, 2005; Franz et al, 2007; de Oliveira et al, 2009; Kawashiri et al, 2009; Wang et al 2009). 10 Tabela 1. Estudos descritos em literatura utilizando a técnica de hibridação genômica comparativa (CGH) cromossômico em carcinomas de laringe. Autores Número de casos de CCE de laringe Validação 1. Bockmühl et al, 2002 41 - 2. Bérgamo et al, 2000 04 LOH 3. Huang et al, 2002 23 - 4. Kujawski et al, 2002 20 - 5. Jin et al, 2002 06 - 6. Tremmel et al, 2003 05 - 7. Ashman et al, 2003 21 - 8. Schwerer et al, 2003 01 IHQ 9. Patmore et al, 2004 11 - 10. Juhász et al, 2005 14 FISH 11. Schlade-Bartusiak et al, 2005 52 - 12. Patmore et al, 2007 35 - 13. Keser et al, 2008 15 - 14. Freier et al, 2010 04 FISH, IHQ Total de casos analisados 252 casos FISH: Hibridação in situ por fluorescência, IHQ: imunoistoquímica A metodologia de CGH-array permite a detecção quantitativa em alta resolução das alterações no número de cópias genômicas. Os microarrays foram inicialmente desenvolvidos para estudar expressão gênica diferencial usando populações complexas de RNA. Os refinamentos deste método permitiram a análise de alterações no número de cópias do DNA. O princípio metodológico é semelhante ao da CGH cromossômico, entretanto, supera suas limitações de 11 resolução pelo uso de clones imobilizados em uma lâmina de vidro em posição bem definida. Alvos de DNA para microarray podem ser derivados de clones genômicos incluindo YACs (0,2 a 2 Mb em tamanho), BACs (300 kb), P1s (~70-100 kb), PACs (~130-150 kb) e cosmídeos (~30-45 kb) ou contendo sequencias de oligonucleotídeos sendo, portanto, de várias ordens de magnitude menores do que os cromossomos alvo. Esta diminuição no tamanho do alvo aumenta o poder de detecção de desequilíbrios genômicos em comparação com o CGH cromossômico. O DNA teste diferencialmente marcado (tumoral) e o de referência (controle) são co-hibridados em fragmentos genômicos clonados e fixados em posições definidas formando um chip. Os DNAs aos marcados com dois fluorocromos distintos e então hibridados em lâminas contendo as sequências plotadas. Diferenças na intensidade digitalizada dos padrões de hibridação do DNA podem ser interpretadas como diferenças no número de cópias entre os genomas teste e de referência. Sondas de DNA/cDNA clonadas, bem definidas e imobilizadas sobre a superfície de uma lâmina de vidro como alvos de hibridação permitem a análise automatizada de alterações cromossômicas equilibradas, como microdeleções, ganhos e amplificações. Em adição, uma vantagem do DNA aCGH sobre o os arrays de expressão é a maior uniformidade na hibridação e subseqüente fidelidade do sinal porque os alvos de DNA tem uma maior complexidade, contendo seqüências intrônicas e outras não transcritas (Beheshti et al, 2002). Estudos utilizando esta tecnologia têm permitido a identificação alterações em genes específicos associados ao início e progressão tumoral, assim como resposta a terapia (Kallioniemi, 2008, Bell, 2010). A Tabela 2 resume os estudos publicados em literatura que usaram CGH array em CCECP. Temos conhecimento apenas do relato de Giefing et al (2008) que utilizaram a plataforma 4x44K (Agilent Technologies) para avaliar perdas e ganhos genômicos, especificamente deleções homozigotas, em 12 linhagens celulares de carcinomas de laringe. Os autores identificaram 31 prováveis regiões de deleção homozigótica, destas 19 foram investigadas pela PCR, com iniciadores flanqueando pelo menos um dos alvos possivelmente perdidos. Por este ensaio foram encontradas 5/19 regiões candidatas a deleção homozigótica: 3q25, 9p21.3, 7p13, 9p21.3 e Xq21.33. Além disso, os autores demonstraram que a deleção homozigota é um freqüente mecanismo de inativação do gene CDKN2A. Também foram identificados quatro genes perdidos em homozigose, incluindo o potencial gene supressor tumoral STK17A, que pode estar implicado no desenvolvimento de CCEL. Devido a escassez de dados moleculares relacionados aos CCELs, bem como de informações biológicas associadas ao fronte de invasão, são necessários estudos adicionais que permitam identificar potenciais marcadores prognósticos em carcinomas de laringe. 12 Tabela 2. Relatos em literatura utilizando CGH arrays em CCECP. AUTORES PLATAFORMA AMOSTRAS VALIDAÇÃO Redon et al, 2002 BAC/PAC array (CMT-GAPS coated slides / Corning) Linhagens celulares de carcinomas de cabeça e pescoço CAL 27 (CRL- 2095), FaDu (HTB-43) e linhagens celulares de fibroblastos de língua Hs677.Tg (CRL-7408) CGH cromossômico, FISH, PCR genômica semiquantitativa e RT-PCR quantitativa Cromer et al, 2004 12.600 seqüências (HG-U95A, Affymetrix, Santa Clara, CA) 38 (0 CCEL) PCR quantitativa Garnis et al, 2004a BAC array (Versaria ChipWriter Pro- Bio-Rad) 14 (0 CCEL) - Garnis et al, 2004b 165 BAC array (Versaría ChipWriter Pro- Bio-Rad) 22 (0 CCEL) PCR em tempo real Jeon et al, 2004 Clones (Incyte Genomics, Palo Alto, CA) foram espotados pelo National Cancer Institute (Gaithesburg, MD) 25 linhagens celulares de cabeça e pescoço e 1 linhagem celular imortalizada de queratinócito PCR em tempo real Baldwin et al, 2005 32.433 clones de BACs em triplicata (nd) 20 (0 CCEL) - Kornberg et al, 2005 10.599 seqüências (HG-U95A-2 / HG-UI33A, Affymetrix (Santa Clara, CA) 7 (0 CCEL) PCR em tempo real e imunoistoquímica Snijders et al, 2005 2.464 clones de BACs em triplicata (HumArray2.0, UCSF Comprehensive Cancer Center Microarray Core) 60 (0 CCEL) PCR em tempo real e sequenciamento Liu et al, 2006 GenoSensor Array 300 (Vysis, Downers Grove, IL) 25 (0 CCEL) Imunoistoquímica 13 O’regan et al, 2006 287 clones de BACs e PACs em triplicata (GenoSensor array 300 system, Vysis,Downer’s Grove, IL) 20(0 CCEL) - Sparano et al, 2006 4,134 BAC array em duplicata (plataforma caseira) 21 OSCC (0 CCEL) - Suzuki et al, 2007 Plataforma caseira 18 linhagens celulares de cavidade oral Metilação Giefing et al, 2008 Plataforma de 44K (Agilent Technologies) 12 linhagens celulares de carcinomas de laringe PCR Nakamura et al, 2008 Plataforma de BACs caseira 21 linhagens celulares de cavidade oral Imunoistoquímica Bauer et al, 2008 3,400 BAC clones espotados em duplicatas em lâminas aminoreativas (CodeLink, GE Healthcare, Buckinghamshire, England) 5 (0 CCEL) FISH Roman et al, 2008 4549 BAC/PAC array (Norwegian Microarray Consortium) 26 HNSCC (3 CCEL) - Smeets et al, 2009 Plataforma de BACs caseira 39 CCE orais e de orofaringe (0CCEL) MSI (-) validação não realizada, nd: não determinado. 14 OBJETIVOS GERAIS � Delinear o perfil de ganhos e perdas genômicas detectados por HR-CGH em CCEL nas células da superfície e do fronte de invasão; � Selecionar marcadores putativos presentes nas seqüências genômicas envolvidas em perdas e ganhos consensos e confirmar seu envolvimento em carcinomas de laringe por análises de expressão gênica e ou protéica; � Comparar os achados com características clínicas (incluindo segundo tumor primário, resposta a terapia e sobrevida) e dados histopatológicos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS � Analisar perdas e ganhos genômicos por HR-CGH na superfície e fronte de invasão dos carcinomas de laringe para obter o padrão de alterações genômicas comuns e exclusivas a cada região. Em adição, confirmar o envolvimento de alterações específicas em regiões selecionadas. � Avaliar a expressão do transcrito CTTN (qRT-PCR) e da proteína cortactina (imunoistoquímica em microarranjos de tecidos contendo a superfície tumoral e o fronte de invasão) para confirmar o papel biológico e prognóstico deste gene nos CCEL. � Investigar ganhos em 2q24 por FISH e correspondente expressão em tempo real do transcrito ACVR1 em tumores de cabeça e pescoço, incluindo carcinomas de laringe. Artigo 1 – CGH Cromossômico 13 REFERÊNCIAS Albertson DG, Pinkel D. Genomic microarrays in human genetic disease and cancer. Hum Mol Genetics; 12:145-152, 2003. Almadori G, Bussu F, Cadoni G, Galli J, Paludetti G, Maurizi M. 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Artigo 1 – CGH Cromossômico 19 Artigo 1 Artigo 1 – CGH Cromossômico 20 Análise de hibridação genômica comparative de alta resolução revela regiões distintas de desequilíbrios cromossômicos no fronte de invasão e superfície tumoral de carcinomas de laringe Ambrosio EP1,2, Sacomano VS1, Coelho MM 1,2, Villacis RAR2, Domingues MAC3, Coudry R4, Tagliarini JV5, Kowalski LP6, Rogatto, SR2,7. 1 Instituto de Biociências – UNESP, Botucatu, SP, Brasil 2 Laboratório NeoGene, Hospital AC Camargo, São Paulo, Brazil 3Departmento de Patologia, FMB– UNESP, Botucatu, SP, Brasil 4Departmento de Patologia, Hospital AC Camargo, São Paulo, Brasil 5Departmento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia, FMB– UNESP, Botucatu, SP, Brasil 6Departmento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia, Hospital AC Camargo, São Paulo, Brasil 7Departmento de Urologia, FMB– UNESP, Botucatu, SP, Brasil * Correspondência para: Silvia Regina Rogatto, PhD NeoGene Laboratório Fundação Antonio Prudente, Hospital A.C. Camargo, Rua Professor Antonio Prudente, 211, São Paulo, Brasil CEP: 01509-010 Telefone: 55-11-21895163 Fax: 55-11-21895163 e-mail: rogatto@fmb.unesp.br ou silvia.rogatto@hcancer.org.br Palavras-chave: carcinomas de laringe, HR-CGH, fronte de invasão, marcadores moleculares, desequilíbrios cromossômicos Artigo 1 – CGH Cromossômico 21 RESUMO Carcinoma de células escamosas de laringe (CCEL) é um tumor sólido maligno que exibe fenótipos agressivos, altas taxas de recorrência e risco de desenvolvimento de segundos tumores primários. Há evidências sugerindo que as células presentes no fronte de invasão dos carcinomas possuem perfis moleculares diferentes em comparação às áreas superficiais. A hibridação genômica comparativa de alta resolução (HR-CGH) é uma ferramenta de triagem para desequilíbrios cromossômicos onde é possível investigar componentes celulares distintos. Neste estudo, células do fronte de invasão e superfície tumoral foram obtidas por microdissecção a laser de 33 CCEL e analisadas por HR-CGH. Como esperado, em ambas as áreas de todos os casos foram detectados desequilíbrios cromossômicos comuns. As perdas cromossômicas foram mais freqüentes que os ganhos. As alterações cromossômicas mais freqüentes observadas somente nas células do fronte foram ganhos em 2p12, 2q13e perdas em 12q23-12q24.2. A área superficial apresentou como regiões freqüentes de ganhos 11q12, 13q33 e perdas envolvendo 12q21- 12q24.1 e Xq22-Xq25. Perdas em 3q e 18q23 foram detectadas em ambas as áreas. Em adição, ganhos em 11q13 encontrados nas células do fronte foram confirmados pelo aumento de expressão da ciclina D1. A análise de perda de heterozigose (LOH) foi aplicada em um subgrupo de casos utilizando seis marcadores de microsatélites localizados em 3q26.2 (D3S1614), 3q28 (D3S1601), 3q29 (D3S1311), e 18q23 (D18S70, D18S1122 e D18S461) com objetivo de confirmar as perdas encontradas por HR-CGH. A freqüência de LOH variou de 15 a 31% dos casos, confirmando as perdas cromossômicas encontradas por HR-CGH. Perda de heterozigose em 3q26.2 (D3S1614) foi significativamente associada com envolvimento de linfonodos (P=0.0460). Perdas cromossômicas em 3q26 foram detectadas em 9 casos pareados; cinco deles tiveram envolvimento de linfonodos. Perdas em 18q23 foram associadas com pior prognóstico. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relato indicando a presença de diferentes alterações cromossômicas no fronte de invasão e na superfície tumoral de CCEL. Nossos resultados confirmam a hetererogeneidade tumoral e revelam regiões genômicas candidatas que podem ser úteis como marcadores moleculares em carcinomas de laringe. Artigo 1 – CGH Cromossômico 22 INTRODUÇÃO Carcinomas de células escamosas de laringe (CCEL) abrangem a maioria dos carcinomas de cabeça e pescoço. Apesar da qualidade de vida dos pacientes acometidos por esta doença ter melhorado com a recente abordagem de preservação de órgãos, a sobrevida permanece a mesma em quase 30 anos (Almadori et al, 2005). Em geral, ao diagnóstico os pacientes apresentam doença localizada no sítio primário (42%), linfonodo metástase (47%) e menos frequentemente, metástase (7%) (Ries et al, 2007). Adicionalmente, há um alto risco destes pacientes desenvolverem segundos tumores primários, especialmente os com longo tempo de sobrevida (Gao et al, 2003). No presente, o estadiamento TNM e a graduação histopatológica permanecem as melhores ferramentas de diagnóstico em carcinomas de laringe. Contudo, uma graduação histológica de malignidade tem sido considerada pelo Sistema de Classificação de Broders (Broders, 1927), que é baseado na proporção de células diferenciadas (Kurokawa et al, 1998; Sawair et al, 2003). Um sistema de graduação bifatorial que engloba o grau de diferenciação celular e o crescimento do fronte de invasão foi subseqüentemente introduzido, o escore que considera o grau do fronte de invasão (IGF) (Bryne et al, 1992). Tem sido sugerido que características morfológicas e moleculares do fronte de invasão de vários carcinomas podem refletir o prognóstico tumoral melhor do que outras partes do tumor (Bryne et al 1992, Bànkfalvi and Piffkò 2000, Graflund et al 2002, Noguchi et al 2002, Po et al 2002, Sawair et al 2003, Kurokawa et al, 2005). Avaliações imunoistoquímicas realizadas no fronte de invasão e nas áreas centrais do tumor de carcinomas de células escamosas orais (CCEO) tem dados suporte adicional sugerindo uma associação com prognóstico (Piffko et al 1996, Kurokawa et al 2005). Wang et al (2009) avaliando a expressão de e-caderina nas áreas do fronte e superfície de CCEO relataram que os níveis de expressão proteica e do transcrito foram Artigo 1 – CGH Cromossômico 23 menores no fronte. A e-caderina no fronte foi estatisticamente associada com o escore IGF, tamanho e espessura tumorais e sobrevida diminuída. Os autores relataram ainda uma diferença significativa na sobrevida em 5 anos entre expressão positiva e negativa de e-caderina no fronte de invasão. Em biópsias de carcinomas glóticos, bryne et al (1995) aplicaram um sistema de graduação de malignidade baseado nas características do fronte de invasão em 95 T1-2/N0 (todos tratados por radiação), e encontraram uma associação significativa com recorrência local e baixa resposta ao tratamento (P=0.001). Os autores concluíram que as características histológicas no fronte provaram ser melhores indicadores de prognóstico do que a categoria T (tamanho tumoral). O advento da hibridação genômica comparativa (CGH) propiciou uma descoberta no campo das bases genéticas tumorais pelo rastreamento completo dos cromossomos humanos (ganhos e perdas) em um único experimento (Kallioniemi et al, 1992). Um número relativamente grande de alterações cromossômicas foi descrito em carcinomas de cabeça e pescoço por CGH (Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer, 2009). Entretanto, há ainda poucos estudos relatando dados por CGH de acordo com a localização tumoral (Kujawski et al, 2002; Schwerer et al, 2003; Sclade-Bartusiak, 2005; Stembalska et al, 2006; Fu et al, 2006; Kesser et al, 2008). Por esta metodologia, as alterações mais freqüentes descritas em carcinomas de laringe incluem ganhos em 3q. 5p. 8q e 11q13 e perdas em 3p e 9p (Tremmel et al, 2003; Juhász et al, 2005; Hermsen et al, 2005, Patmore et al, 2007; Kesser et al, 2008; Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer, 2009). No presente estudo, utilizamos uma combinação de microdissecção a laser (LCM) em amostras fixadas em parafina (FFPE), HR-CGH e análise de LOH utilizando marcadores de Artigo 1 – CGH Cromossômico 24 microssatélite polimórficos para identificar alterações nas células do fronte de invasão e da superfície tumoral de CCEL. MATERIAL AND MÉTODOS Casuística. As amostras de CCEL foram obtidas do Departamento de Patologia da UNESP- Botucatu, SP e do Hospital AC Camargo, São Paulo-SP, Brasil. Trinta e três amostras parafinadas foram utilizadas na análise de HR-CGH. Um grupo independente de 33 amostras foi utilizado na investigação de LOH. O critério de elegibilidade inclui pacientes sem tratamento prévio à cirurgia, submetidos ao tratamento curativo na instituição. Os prontuários dos pacientes incluídos neste estudo foram examinados para obtenção de dados como idade, gênero, raça, informações sobre o estilo de vida (consumo de álcool e tabaco) e dados clinicopatológicos (estadio clínico, envolvimento de linfonodos, grau histológico, invasão angiolinfática e perineural), na tabela 1 presente no suplemento. O sistema de classificação histológica para CCECP é baseado no grau de diferenciação celular: bem diferenciado, moderadamente e pobremente diferenciado. A classificação do fronte de invasão é baseada no padrão de crescimento, de acordo com Bryne et al (2005). A invasão angiolinfática foi classificada de acordo com a presença ou ausência de células neoplásicas, localizadas na parede e considerando o exame de vasos sanguíneos ou linfáticos; a infiltração perineural foi considerada presente quando o tecido adjacente ao nervo peri e/ou intratumoral estava envolto por células neoplásicas. Todos os pacientes foram informados dos procedimentos e forneceram consentimento informado por escrito aprovado pelo comitê de ética da instituição. Artigo 1 – CGH Cromossômico 25 HR-CGH. O isolamento dos CCEL em duas diferentes áreas: fronte de invasão e superfície tumoral foi obtido através da microdissecção a laser. O DNA contido no cap sure foi preparado por digestão com proteinase K e extraído pela metodologia de fenol/clorofórmio, precipitado com etanol 100% e estocado a 20oC. O DNA foi amplificado e marcado por SCOMP (Single Cell Comparative Genomic Hybridization), como descrito por Stoecklein et al (2002). Linfócitos normais estimulados por fitohemaglutinina foram preparados como alvo para os experimentos de HR-CGH utilizando o protocolo padrão. As hibridações e lavagens foram realizadas como descrito por Kallioniemi et al (1992). Resumidamente, os DNAs alvo e referência normal foram marcados com biotina 14-dATP (Invitrogen, USA) e digxigenina-11-dUTP (Roche, USA), respectivamente. Ambos DNAs marcados e DNA Cot1 foram hibridados em lâminas contendo cromossomos metafásicos normais. A hibridação ocorreu por 72 horas, após foi realizada a lavagem, detecção e contracoloração com DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). As imagens provenientes das lâminas de HR-CGH foram capturadas com o microscópio de fluorescência Olympus BX61 (Olympus Optical, Hamburg, Germany), equipado com uma câmera CCD (Photometrics CH 250, Huntington Beach, CA). O programa utilizado para análise das imagens foi o Applied Spectral Imaging CGH View 3.0. Em cada caso, 12-20 metáfases foram analisadas. As alterações cromossômicas foram detectadas por intervalos de referencia padrão, como descrito por Kirchhoff et al (1998). Foram excluídos da análise cromossomos superpostos e padrões de hibridação heterogêneos. Uma biblioteca com amostras normal diferencialmente marcadas foi construída para seleção dos limites superior e inferior de ganhos e perdas (intervalos de referência padrão). A razão média de cada perfil (intervalo de confiança de 95%) foi comparada ao intervalo de referência padrão (99.5%) correspondente, baseado na média de 15 casos normais (140 células). O intervalo de referência padrão foi escalado automaticamente Artigo 1 – CGH Cromossômico 26 para o ajuste de cada caso teste individual. A descrição de alterações no número de cópias foi baseada na recomendação do ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) 2009. Análise de Microsatélite. Os loci de microssatélites D3S1614 (3q26.2), D3S1601 (3q28), D3S1311 (3q29), D18S70 (18q23), D18S1122 (18q23) e D18S461 (18q23) foram estudados para LOH. A amplificação dos marcadores de microssatélites foi realizada utilizando os seguintes grupos de iniciadores: F: 5’-ttccaagatatgtgtgacttacag-3’ e R: 3’-gatatttaagccttgaccctga- 5’; F:5’-atgtttctagggctggc-3’ e R:3’-cttatggtcaattctggga-5’; F:5’-gaagtttcagccaacg-3’ e R:3’- ttagtcccactgatgttacattt-5’; F:5’-aaggctganctctaccg-3’ e R:5’-ggaatgtcaagaagtacctaccata-3’; F:5’- taataactgcctggatggg-3’ e R:5’-aaccctgtgcaagtccc-3'; F:5’-caccctgtccatgctc-3' e R:5’- cacatatcactttgggtttg-3’, respectivamente. A reação em cadeia da polimerase foi realizada em 15uL de volume, contendo 100ng de DNA molde, 10mM de Tris-HCl, 50mM de KCl, 2,5mM de MgCl2,, 200µM de each dNTPs, 0,5µM de cada iniciador e 1 unidade da DNA polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) no termociclador automático PTC- 200 (Pettier Thermal Cycler-MJ Research). A reação ocorreu nas seguintes condições: 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 45 segundos, anelamento a 60oC por 45 segundos e extensão final a 72oC por 1 minuto. Os produtos resultantes da PCR foram visualizados em gel de agarose 1% e coloração com brometo de etídeo (0,5µg/mL) e em gel de uréia-poliacrilamida 5% (Long Ranger Singel Packs/FMC) no seqüenciador automático ABI Prism 377 (Applied Biosystems). As imagens digitais para os géis de fluorescência foram adquiridas utilizando o programa Data Collection e analisadas utilizando o programa Genescan (ambos da Applied Biosystems). Cada pico de fluorescência foi quantificado pelo seu tamanho (em pares de base), altura e área. Os resultados foram importados para o programa Genotyper (Applied Biosystems) para análises Artigo 1 – CGH Cromossômico 27 adicionais e impressos. Para avaliar a LOH, um fator de alteração foi definido usando como parâmetros as áreas dos picos (Cawkwell et al, 1993) e alturas dos dois alelos nas amostras normais e tumorais. A razão de ≤0.60 foi considerada indicativa de LOH. Perdas alélicas foram atribuídas somente após os resultados serem consistentemente encontrados em três experimentos. Immunohistoquímica: Dois TMAs foram construídos contendo células do fronte de invasão e da superfície tumoral, respectivamente, de 151 amostras em parafina (101 pareadas, 17 da superfície e 33 do fronte). Os cortes foram extraídos de áreas previamente definidas utilizando um Tissue Microarrayer (Beecher Instruments®, Silver Springs, USA). Os cortes de tecidos com dimensão de 1.0mm de cada amostra foram colocados e organizados em duplicata em blocos de parafina. Cada corte foi colocado com espaçamento de 0.2mm. Após a inserção de todos os casos os blocos foram cortados na espessura de 3µm e montados em lâminas convencionais com organisilane (3-aminopropyl trithoxy-silane) (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA). As reações de imunoistoquímica foram realizadas utilizando o anticorpo primário anti-CCND1 (BD, Becton, Dickinson and Company Bisciences, Franklin Lakes, NJ, USA, pronto para uso). Após 30 min de incubação foi realizada a lavagem em PBS (phosphate-buffered saline), incubado por 30 min com o anticorpo secundário (Advanced TM HRP Link, Dako Cytomation, K0690, Denmark), e seguido pela incubação com o sistema de detecção de polímeros (Advanced TM HRP Link, Dako Cytomation, K0690, Denmark) por 30 min. As reações ocorreram com solução contendo 0.6mg/ml of 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma, St Louis, MO) e 0.01% H2O2. Controles positivo e negativo foram incluídos em todas as reações de acordo com especificações do fabricante. Artigo 1 – CGH Cromossômico 28 As reações de IHQ foram realizadas em diferentes níveis do TMA, sendo que cada caso foi representado quatro vezes. As segundas lâminas foram 25 seções mais profundas que as primeiras, resultando em pelo menos 250µm de distância entre as duas seções com amostras celulares diferentes para cada tumor. O IHQ escore foi lido às cegas em relação aos aspectos clínicos de cada amostra. Cada amostra foi analisada em todos os campos para escolha da área mais corada. A presença de precipitação marrom escura claramente visível foi considerada imunopositividade. O padrão de coloração para este anticorpo foi citoplasmático; o escore representou a intensidade estimada de coloração (0: reação não visível, 1: fraca, 2: moderada, e 3: intensidade de imunocoloração forte) e extensão (1: ≤ 1/3, 2: 1/3 to 2/3, 3: >2/3 da área total). As reações foram adicionalmente analisadas de acordo com a localização de imuno depósitos tanto na membrana como no citoplasma. Análise Estatística. Associações entre variáveis e fatores de risco foram identificadas com 5% de significância usando Qui-quadrado e teste exato de Fisher, testes de Kruskal-Wallis ou Mann- Whitney foram aplicados para comparar a expressão da ciclina D1 e os dados clinicopatológicos. As amostras foram adicionalmente agrupadas de acordo com o tipo de fronte (infiltrativo, expansivo e misto) e coloração de membrana (positiva ou negativa) para comparações com dados clinicopatológicos e expressão proteica. A correção de Bonferoni para múltiplas comparações foi aplicada para ajuste do valor de P. A sobrevida global foi definida como o intervalo entre o começo do tratamento (cirurgia) e a data de morte ou última informação do paciente. A sobrevida livre de doença foi medida a partir da data do tratamento até a data do diagnóstico de recorrência. As probabilidades de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan–Meier e o teste log-rank foi aplicado para avaliar a significância da diferença entre as curvas de sobrevida, com intervalo de confiança de 95%. Todas as análises foram realizadas Artigo 1 – CGH Cromossômico 29 utilizando o Graph Pad Prism 2.01 (Graph Pad Software Inc., USA) e SPSS Statistics 17.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). RESULTADOS A área do fronte e da superfície de 33 CCEL foram microdissecados e avaliados por HR-CGH. As perdas cromossômicas foram mais frequentemente detectadas do que os ganhos em ambos, fronte (ganhos: 373; perdas: 1278) e supefície (ganhos: 232; perdas: 1071) (Figura 1). Um grande número de desequilíbrios cromossômicos foram encontrados em comum (>70% em cada caso). Além disso, ambas as áreas apresentaram também alterações cromossômicas diferentes (Figura 1; Tabela 2). As mais freqüentes alterações observadas somente em células do fronte envolvem ganhos em 2p12 (60%), 2q13 (51%) e perdas em 12q23-12q24.2 (96%). As mais freqüentes alterações na superfície tumoral foram ganhos em 11q12, 13q33 (ambos em 36%) e perdas em 12q21-12q24.1 (60%) e Xq22-Xq25 (67%). Um amplicom bem estabelecido descrito em carcinomas de cabeça e pescoço está mapeado em 11q13. Por HR-CGH, ganhos em 11q13 foram verificados em 33% nas células do fronte em baixas freqüências (<20% dos casos) na superfície tumoral. O gene CCND1 está mapeado em 11q13 e sua proteína foi avaliada por imunoistoquímica. Foi detectado que em 39% e 31% das células do fronte e da superfície, respectivamente, apresentaram imunocoloração moderada a forte (Figura 2). Imunocoloração da membrana citoplasmática foi verificada em 9- 10% dos casos em ambas as áreas de carcinomas de laringe. Os padrões de imunocoloração nuclear e citoplasmática das amostras pareadas (dados não mostrados) e não pareados (Tabela 3) foram comparados com dados clínicos e histopatológicos, nenhuma associação foi verificada. Artigo 1 – CGH Cromossômico 30 Perdas cromossômicas em 3q e 18q23 foram detectadas nos dois components. Perdas em 3q26.2 foram detectadas em 9 casos pareados e em 7 foram encontrados exclusivamente nas células do fronte. Similarmente, perdas em 3q28 e 3q29 foram observados em 2 casos pareados, 9 e 10 casos exclusivamente no fronte, respectivamente. Perdas em 18q23 foram encontradas em 10 casos pareados e em 8 casos nas células do fronte. Estas regiões cromossômicas comunmente deletadas verificadas por HR-CGH foram avaliadas por LOH utilizando 6 marcadores de microsatélites. O DNA genômico obtido de sangue periférico foi utilizado como referência normal. Todos os 33 tumores foram informativos em um ou mais loci. Um total de 17 amostras apresentaram LOH em pelo menos um dos seis marcadores investigados (Tabela 3). Utilizando estes marcadores, a frequencia de LOH (número de casos com LOH/ número de casos informativos) variou de 15 a 31% dos caos, como mostrado na Figura 3A. Três casos mostraram LOH para ambos marcadores D3S1614 (3q26.2) e D3S1601 (3q28); um caso para D3S1601 e D3S1311 (3q29), e um caso para todos os marcadores mapeados em 3q. Todos os marcadores de microsatelites mapeados em 18q23 apresentaram LOH: 7 de 28 casos informativos para D18S70, 4 de 26 para D18S1122, 3 de 19 para D18S461. Dois casos apresentaram LOH concomitante para dois marcadores de microsatelites mapeados em 18q23 (Tabela 4). Não foi verificada correlação entre LOH e os dados histopatológicos para todos os marcadores (dados não mostrados). Exceto para o marcador D3S1614, onde a alta frequencia de casos com envolvimento de linfonodos foi estatisticamente associada com LOH (4 de 6 casos: 67%) comparado com casos sem envolvimento de linfonodos (2 de 11: 15%) (P=0.0460; Figura 3B). Interessantemente, 3 de 5 casos apresentaram metástase mostrando concomitante LOH em ambos marcadores (D3S1614 e D3S1601) mapeados em 3q. Eletroferogramas representativos de 2 casos mostrando retenção alélica e perda alélica para o marcador D3S1614 estão mostrados na Artigo 1 – CGH Cromossômico 31 Figura 3C-D, respectivamente. Como resultados adicionais, DNA de tecidos pareados (normal e tumoral) foram analisados para instabilidade de microsatélites (MSI). MSI foi observada em um caso para os marcadores D3S1614, D3S1601, e D18S461 e em dois casos para os marcadores D3S1311 e D18S70. DISCUSSÃO Hibridação genômica comparativa foi utilizada neste estudo como ferramenta para caracterizar desequilíbrios cromossômicos no fronte de invasão e na superfície tumoral de carcinomas de laringe. As alterações cromossômicas comuns encontradas no fronte de invasão e na superfície tumoral dos CCEL revelaram, em geral, concordância com ganhos em 3q, 5p, 8q e 11q13 e perdas em 3p e 9p previamente descritos em amostras não microdissecadas (Bérgamo et al, 2000; Kujawski et al, 2002; Hermsen et al 2005; Juhás et al 2005; Schlade-Batusiak et al, 2005; Stembaslka et al, 2005; Bauer et al, 2008; Keser et al, 2008). Ganhos cromossômicos em 11q13 foram significativamente encontrados nas células do fronte. A análise de CGH é suscetível a contaminação por células não-neoplásicas, as quais podem mascarar a perda de sequências genômicas de populações tumor específicas. Sabe-se que a significância dos dados obtidos por ensaios de CGH depende estritamente da composição da amostra biológica a ser analisada e aumenta na inclusão de um passo pré-processamento (microdissecção), que permite ao pesquisador distinguir e isolar populações celulares indesejadas ao redor do material. Deste modo, o elevado número de desequilíbrios genômicos, especialmente perdas de sequências, detectadas no presente estudo refletem a heterogeneidade tumoral e as complexas alterações genéticas em CCEL. Artigo 1 – CGH Cromossômico 32 Ganhos cromossômicos em 11q13 foram significativamente encontrados nas células do fronte. Recentemente, Freier et al (2010) avaliaram 20 linhagens celulares (4 delas derivadas de carcinomas de laringe) por CGH cromossômico e relataram que 9 delas mostraram amplificação em 11q13. Os autores demonstraram uma associação entre ganhos nesta região e expressão aumentada dos transcritos CCND1 e CTTN (cortactina) (ambos mapeados em 11q13), por qRT- PCR. Adicionalmente, amplificações e correspondente expressão gênica e protéica foram encontradas em 4 linhagens celulares (nenhuma de laringe) avaliadas por FISH, imunoistoquimica e qRT-PCR. CCND1 e CTTN são considerados os melhores genes candidatos para guiar a amplificação em 11q13 com base em seus papéis biológicos e sua freqüente co- amplificação e expressão aumentada em vários tumores (Rodrigo et al, 2009). Recentemente, nós avaliamos a expressão da cortactina no fronte e superfície de carcinomas de laringe (Ambrosio et al, 2010, submetido). Foi detectado que a expressão aumentada da proteína citoplasmática cortactina (80% de 151 casos em ambas as áreas) e do transcrito CTTN (30% de 47 amostras, avaliadas por qRT-PCR). Em mais de 20% dos casos, foi verificada imunocoloração da membrana no fronte e superfície. Pacientes apresentando invasão perineural foram significativamente associados com estadio N e recorrência. Altos níveis protéicos foram correlacionados com invasão perineural nas células do fronte, sugerindo que esta área pode ser considerada como ferramenta prognóstica em carcinomas de laringe (Ambrosio et al, 2010, submetido). No presente estudo, ganhos genômicos em 11q13 (33% das células do fronte) foram traduzidos em expressão aumentada de ciclina D1 nuclear (39% das células do fronte). Ciclina D1 cuja função como sensor mitogênico e ativador alostérico de CDK4/CDK6 para formar um pRB quinase, que é um dos mais frequentemente alterados reguladores do ciclo celular em Artigo 1 – CGH Cromossômico 33 câncer. Após fosforilação, perda de pRB é uma atividade repressiva para o fator de transcrição E2F, cuja atividade de transcrição de muitos genes é requerida para a transição das fases G1 para S e para replicação do DNA (Tashiro et al, 2007; Kim and Diehl, 2009). Alterações genômicas (como translocações e amplificações em 11q13) levando a expressão alterada de ciclina D1 tem sido encontradas em uma variedade de tumores por causa de seu papel preferencial pela desregulação da ciclina D1 abundante. Aumento de expressão de ciclina D1 resultando em amplificação de 11q13 tem sido relatada em carcinomas de cabeça e pescoço (Izzo et al, 1998; Rodrigo et al, 2009) e linhagens celulares de carcinomas de laringe (Freier et al (2010). A expressão aumentada da ciclina D1 pode ser atribuída a diversos fatores, incluindo transcrição aumentada, tradução e estabilidade protéica. Tem sido proposto que embora a expressão aumentada da ciclina D1 seja claramente implicada no processo carcinogênico, sua expressão aumentada não é suficiente para conduzir a transformação oncogênica. Além disso, evidências sugerem que a retenção nuclear da ciclina D1 resultante do tráfico nuclear alterado e proteólise é crítico para manifestação de sua oncogenicidade (Diehl et al, 1998; Alt et al, 2000). Perdas em 3q e 18q foram selecionadas para análise de LOH em um grupo independente de carcinomas de laringe com o objetivo de confirmar as perdas em baixas freqüências encontradas por HR-CGH, presentes em ambas as áreas analisadas, fronte de invasão e superfície tumoral. Variações no número de cópias (CNV- ganho ou perda de cópias) e LOH (desequilíbrio alélico) podem resultar na inativação de genes supressores tumorais e ativação de oncogenes, os quais podem levar ao crescimento celular descontrolado e metástase. A presença de CNV e/ou LOH tem o potencial para serem usados como indicadores prognósticos isolados ou em combinação com outros marcadores, para identificação de pacientes com carcinomas de laringe com alto risco de recorrência ou morte. Contudo, neste estudo os marcadores de microsatélites Artigo 1 – CGH Cromossômico 34 usados, exceto D3S1311 que contém o gene DLG1 (Homo sapiens discs, large homolog 1 – Drosophila, transcript variant 2) e D3S1614 que contém o C3orf50, estão mapeados downstream ou upstream de genes prováveis ou candidatos. O DLG humano pertence a uma família de proteínas guanilato quinase membrana associada (MAGUK) e mostra domínios estruturais característicos, incluindo PDZ, um domínio SH3 e uma região como guanilato quinase (GUK) (Lue et al, 1994). A proteína conservada Dlg1 regula a polaridade celular. Em células epiteliais, a Dlg colocaliza-se com E-caderina nos sítios de interação célula-célula, onde são considerados ter papéis estrutural e de sinalização em associação com o citoesqueleto (Reuver et al, 1998). A Dlg humana se liga via domínio PDZ associado ao terminal carboxi do supressor tumoral APC e tem sido mostrado que o complexo APC-Dlg é importante para a supressão do crescimento mediado por APC(Ishidate et al, 2000).Gardiol et al (2006) relataram que em lesões neoplásicas de cólon, alterações na distribuição de Dlg e aumento de Scrib durante a progressão tumoral, e a baixa regulação de ambas proteínas foram associadas com a completa falta de polaridade celular epitelial e arquitetura tecidual desorganizada. Os autores sugerem que a expressão retida de ambas hDlg e hScrib foi correlacionada com a manutenção da polaridade celular e arquitetura tecidual, e que isto é provavelmente ligado a supressão tumoral no epitélio colônico. Tem sido demonstrado que diferentes oncoproteinas humanas virais, incluindo o adenovirus tipo 9 E4-ORF1, envolvem o alvo de Dlg1. Apesar da crença geral que tal interações funcionais unicamente para inativar essa suspeita proteína supressora tumoral humana, Frese et al (2006) demosntraram que a E4=ORF1 requer especificamente a Dlg1 endógena para provocar ativação oncogência de P13K (phosphatidylinositol 3-kinase) nas células. Os autores propuseram um modelo onde E4-ORF1 ligado aos gatilhos da Dlg1 resulta num complexo para translocar para a membrana plasmática e, neste sítio, promover a ativação de P13K mediada por Artigo 1 – CGH Cromossômico 35 Ras. Estes achados estabelecem a primeira função conhecida para Dlg1 de tranformação celular mediada por vírus e também surpreentemente expõe uma atividade oncogêncica previamente não reconhecida codificada por este suspeito gene supressor tumoral. A associação do adenovirus tipo 9 tem sido descrita em modelos animais e em lesões de mama humanas (Javier, 2008). Nossos resultados sugerem o envolvimento de DLG1 em carcinomas de laringe pela perda de função em um subgrupo de casos. Estudos adicionais são necessários para investigar o envolvimento do adenovirus tipo 9 E4-ORF1 em carcinomas de laringe e sua associação com a patobiologia da doença. Perdas em D13S1614 (mapedo em 3q26.2) foram verificadas em 31% dos casos em concordância com as perdas cromossômicas da mesma região detectada em 45% dos casos 9incluindo casos pareados e não pareados em ambas as áreas, fronte e superfície). Interessantemente, LOH envolvendo esta região foi significativamente associada com envolvimento de linfonodos. O marcados de microsatélite D3S1614 sobrepõe o C3orf50 em 3q26.2. Inicialmente, esta orf foi predita como um domínio como EGFR, entretanto, este transcrito é um RNA não codificante. Estudos recentes demosntram que a maioria do genoma humano é transcrito e somente uma pequena proporção (~1%) é traduzido (Amaral et al, 2008). Estes transcritos, os quais não são traduzidos, incluem uma grande série de RNAs, assim como um número de RNA não codificantes (ncRNA) curtos e longos. Micro RNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica pela ligação com mRNAs alvos complementares e promovendo seu decaimento ou inibindo sua tradução. Novos estudos são claramente necessários para determinar o efeito funcional deste RNA não codificante em células normais e tumorais. Artigo 1 – CGH Cromossômico 36 Perdas em 18q23 foram observadas em freqüências similares em grupos de casos independentes por HR-CGH (55%) e LOH (50% dos casos informativos em pelo menos um marcador de microsatelite), confirmando o envolvimento desta região em carcinomas de laringe. Pearlstein et al (1997) relataram LOH em 18q na avaliação de 30 pacientes com estadio III e sobrevida de < 1.5 anos (19 pacientes) ou > 5 anos (11 pacientes). Os autores encontraram que LOH em 18q foi observada em 11 de 30 dos pacientes. Somente 1 de 11 pacientes com mais de 5 anos de sobrevida apresentou LOH. Em contraste, 10 de 19 dos pacientes com menos de 1.5 anos de sobrevida tinham LOH em 18q, sugerindo que LOH nesta região é um fator prognóstico em CCECP. Subsequentemente, o mesmo grupo (Pearlstein et al, 1998) verificou que pacientes que tinham LO hem 18q apresentaram uma sobrevida significativamente diminuída em 2 anos comparada aqueles sem LOH em 18q (30% vs. 63%; P=0.008). No presente estudo, 7 de 12 pacientes com LOH em 18q em pelo menos um marcador foram a óbito pela doença em um curto período de tempo (<2 anos); 4 deles apresentaram metástase. Até o presente, não há genes conhecidos ou prováveis que sobrepõem os microsatélites avaliados. Contudo, os presentes achados fornecem fortes evidências de que há prováveis genes supressores tumorais mapeados em 18q23 e envolvidos com pior prognóstico em carcinomas de laringe. Tem sido aceito que fatores histológicos e alterações moleculares podem diferir amplamente de área para área no mesmo tumor (Odell et al, 1994; Kurokawa et al, 2000). Neste estudo, foi demosntrado que desequilíbrios cromossômicos comuns para o fronte de invasão e superfície tumoral, assim como aqueles exclusivos detectados nas células do fronte. Foi encontrado um grande número de alterações, as quais, em geral, são similares aos estudos prévios em carcinomas de laringe e de linhagens celulares derivadas destes tumores. As regiões específicas encontradas no fronte podem revelar genes associados com pior prognóstico. Além Artigo 1 – CGH Cromossômico 37 disso, utilizando marcadores de microsatélites nós confirmamos as perdas observadas em 3q e 18q, sugerindo genes que podem se úteis como marcadores moleculares na conduta de pacientes com carcinomas de laringe. Em adição, ganhos em 11q13 foram traduzidos em expressão aumentada da proteína ciclina D1, confirmando os resultados de HR-CGH. Financiamento Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil. Agradecimentos Os autores hostariam de agradecer a Francine Blumental de Abreu por sua ajuda nas análises Estatísticas. Os autores também expressam sua gratidão a Dra Sandra A Drtigo, Dra. Fabiola Encinas Rosa e Dra Claudia Rainho, por suas preciosas sugestões na preparação deste manuscrito. Os autores declaram que não há conflito de interesse. Artigo 1 – CGH Cromossômico 38 REFERÊNCIAS Almadori G., Bussu G.F., Cadoni G., Galli J., Paludetti G. & Maurizi M. (2005) Molecular markers in laryngeal squamous cell carcinoma: towards an integrated clinicobiological approach. Eur. J. Cancer. 41, 683–693. Alt J.R., Cleveland J.L., Hannink M. & Diehl J.A. (2000) Phosphorylation-dependent regulation of cyclin D1 nuclear export and cyclin D1-dependent cellular transformation. Genes Dev. 14, 3102–3114. Amaral P.P., Dinger M.E., Mercer T.R. & Mattick J.S. 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Artigo 1 – CGH Cromossômico 42 Tabela 1.Fatores clinicopatologicos dos pacientes com carcinomas de laringe avaliados por HR- CGH, imunoistoquímica (IHQ) e perda de heterozigose (LOH). NA: informação não disponível Fatores clinicopatologicos HR-CGH IHQ LOH Idade (anos) ≤ 60 23 77 15 >60 10 74 18 Sexo Msculino 25 141 29 Feminino 8 10 4 Tamanho tumoral T1-T2 8 45 4 T3-T4 23 106 21 NA 2 0 8 Envolvimento de linfonodos N+ 9 38 9 N- 22 113 16 NA 2 0 8 Metástase Sim 0 18 5 Não 31 133 20 NA 2 0 8 Infiltração Perineural Sim 8 33 0 Não 12 48 0 NA 13 70 33 Embolização vascular Sim 7 44 0 Não 12 38 0 NA 14 69 33 Recorrência Sim 6 51 2 Não 18 100 27 NA 9 0 4 Tabaco + 29 139 22 - 2 12 4 NA 2 0 7 Álcool + 12 92 19 - 18 59 6 NA 3 0 8 Total 33 151 33 A rt ig o 1 – C G H C ro m o ss ô m ic o 43 C hr om os om e D ee p Fr on t C el ls (c as es ) T um or S ur fa ce (c as es ) G ai ns L os se s G ai ns L os se s 1 1p 21 (7 ) 1p 22 (1 2) ; 1 p3 2 (2 6) ; 1 p3 5- 1p 36 .2 (1 9) ; - 1p 21 (1 3) ; 1 p3 1 (1 4) ; 1 p3 4. 2 (1 4) ; 1p 36 .1 (1 3) ; 1 q3 1 (1 1) ; 2 2p 12 (2 0) ; 2 q1 3 (1 7) ; 2 q2 1 (9 ); 2q 24 (7 ) 2p 24 (2 3) ; 2 q3 7 (2 1) - 2p 16 (1 3) ; 2 p2 2 (1 6) ; 2 q2 1 (1 0) ; 2 q3 1 (1 1) ; 3 3p 21 (1 2) ; 3 p2 5- 3p 26 (2 3) ; 3 q2 6. 2- 3q 27 (2 3) 3p 14 (1 0) 3p 12 (1 2) ; 3 p1 4 (1 3) ;3 q2 5 (1 9) 4 4q 21 (1 1) ; 4 q2 5 (1 1) 4q 28 (1 2) ; 4q 13 (9 ) 4q 13 (1 2) ; 4 q3 1. 3 (1 4) ; 4 q3 3 (1 2) 5 5p 12 (8 ); 5q 13 (1 1) 5p 15 .2 (1 5) ; 5 q1 4 (1 1) ; 5 q2 3- 5q 31 (1 9) ; 5q 35 (2 0) 5p 13 (8 ); 5q 22 (7 ) 5p 14 (1 4) ; 5 q3 1 (1 6) ; 5 q3 4 (1 9) 6 6p 12 (1 1) ; 6 q2 1 (7 ) 6p 24 (1 7) 6q 13 (8 ); 6q 27 (1 0) 6p 12 (1 2) ; 6 q1 4- 6q 15 (1 2) ; 7 7q 32 -7 q3 5 (1 8) 8 8p 23 (7 ); 8q 12 (1 2) 8p 21 (1 3) ; 8 q2 2 (1 3) ; 8 q2 4. 1- 8q 24 .2 (2 7) 8q 13 (7 ) 8p 12 (1 7) ; 8 p2 2 (1 5) ; 8 q2 3 (2 0) 9 9p 13 (1 1) ; 9 q2 1 (9 ) 9p 23 (2 4) ; 9 q2 2 (2 0) ; 9 q3 4 (2 2) - 9q 21 (1 2) ; 9 q3 2- 9q 33 (2 1) 10 10 q2 1 (7 ) 10 p1 2 (1 6) ; 1 0q 23 (2 4) - - 11 11 p1 1. 2 (1 0) ; 1 1q 13 (1 2) 11 p1 4 (1 8) ; 1 1q 24 (1 7) 11 q1 2 (1 2) - 12 12 q1 3 (9 ) 12 p1 2- 12 p1 3 (1 9) ; 1 2q 15 (1 4) ; 1 2q 23 - 12 q2 4. 2 (3 2) - 12 p1 2- 12 p1 3 (1 2) ; 1 2q 21 -1 2q 24 .1 (2 0) 13 - 13 q2 1 (1 5) ; 1 3q 31 (1 4) 13 q3 3 (1 2) 13 q1 2- 13 q2 2 (1 9) 14 - 14 q2 4 (1 8) ; 1 4q 32 (1 3) 14 q3 1 (1 1) 15 - 15 q1 3- 15 q1 4 (1 6) ; - 15 q1 5- 1 5q 1 6 (1 3) ; 16 - - - 17 - 17 q2 2 (2 2) - 17 p1 1. 2 (1 0) ; 1 7q 12 (1 2) ; 1 7q 24 (1 5) 18 - 18 q1 2 (2 0) ; - 18 q1 1. 2 (1 6) ; 19 - 19 q1 3. 1 (1 9) ; 1 9q 13 .2 (2 5) - - 20 - 20 q1 3. 2 (2 6) - 20 p1 1. 2 (2 6) ; 2 0q 12 (1 8) 21 - - - 22 - 22 q1 1. 2 (2 2) ; 22 q1 2 (1 9) ; X X p1 1. 2 (7 ); X q1 2 (1 1) X p2 1( 15 ); X q2 6- X q2 7 (2 4) X p2 2. 3 (1 0) ; X q1 3 (7 ) X p1 1. 3 (1 4) ; X q2 2- X q2 5 (2 2) Y - Y q1 1. 2 (1 6) - T ab el a 2. G an ho s e p er da s c ro m os sô m ic as d ife re nc ia is d et ec ta do s n as c él ul as d o fr on te d e in va sã o e su pe rf íc ie tu m or al d e 33 C C EL a va lia do s p or H R -C G H . U m m ín im o de 7 c as os p ar a ga nh os e 1 0 pa ra p er da s f oi c on si de ra do c om o si gn ifi ca tiv o Em n eg rit o es tã o as re gi õe s a lte ra da s n o fr on te c om m ai or fr eq üê nc ia . (-) m en os c as os q ue o c ut of f e st ab el ec id o Artigo 1 – CGH Cromossômico 44 Tabela 3. Comparação entre a expressão da ciclina D1 em amostras não pareadas (fronte e superfície) e dados clinicopatológicos. (F: fronte; T: superfície). Variáveis CCND1/F N (%) P CCND1/T N (%) P Negativo Positivo Negativo Positivo Idade (anos) 0,047 0,665 ≤60 30 (46,2%) 30 (65,2%) 33 (51,6%) 15 (46,9%) >60 35 (53,8%) 16 (34,8%) 31 (48,4%) 17 (53,1%) Sexo 0,493 0,434 Masculino 55 (84,6%) 41 (89,1%) 60 (93,8%) 28 (87,5%) Feminino 10 (15,4%) 5 (10,9%) 4 (6,3%) 4 (12,5%) Consumo de tabaco 0,702 0,284 Não 5 (8,1%) 2 (5,0%) 5 (8,3%) 5 (17,2%) Sim 57 (91,9%) 38 (95,0%) 55 (91,7%) 24 (82,8%) Consumo de álcool 0,242 0,550 Não 22 (36,1%) 10 (25,0%) 20 (33,9%) 8 (27,6%) Sim 39 (63,9%) 30 (75,0%) 39 (66,1%) 21 (72,4%) Grau tumoral 1,000 0,267 G1-2 58 (92,1%) 40 (90,9%) 59 (93,7%) 26 (86,7%) G3-4 5 (7,9%) 4 (9,1%) 4 (6,3%) 4 (13,3%) T 0,938 0,765 T1-2 9 (15,0%) 7 (15,6%) 9 (15,0%) 5 (17,2%) T3-4 51 (85,0%) 38 (84,4%) 51 (85,0%) 24 (82,8%) N 0,337 0.191 Não 40 (61,5%) 23 (52,3%) 40 (62,5%) 15 (48,4%) Sim 25 (38,5%) 21 (47,7%) 24 (37,5%) 16 (51,6%) Metástase 0,340 0,445 Não 53 (84,1%) 33 (76,7%) 47 (77,0%) 26 (83,9%) Sim 10 (15,9%) 10 (23,3%) 14 (23,0%) 5 (16,1%) Recorrência 0,860 0,758 Não 49 (75,4%) 34 (73,9%) 44 (68,8%) 21 65,6%) Sim 16 (25,6%) 12 (26,1%) 20 (31,3%) 11 (34,4%) 2o Tumor primário 0,296 0,768 Não 57 (87,7%) 37 (80,4%) 54 (84,4%) 28 (87,5%) Sim 8 (12,3%) 9 (19,6%) 10 (15,6%) 4 (12,5%) Invasão perineural 0,087 0,233 Não 43 (71,7%) 22 (55,0%) 42 (66,7%) 15 (53,6%) Sim 17 (28,3%) 18 (45,0%) 21 (33,3%) 13 (46,4%) Invasão angiolinfática 1,000 0,070 Não 56 (93,3%) 38 (95,0%) 61 (968%) 24 (85,7%) Sim 4 (6,7%) 2 (5,0%) 2 (3,2%) 4 (14,3%) Imunocoloração nuclear 1,000 0,087 Não 48 (92,3%) 30 (90,9%) 36 (83,7%) 20 (100,0%) Sim 4 (7,7%) 3 (9,1%) 7 (16,3%) 0 (0,0%) Artigo 1 – CGH Cromossômico 45 Tabela 4. Análise de microsatellites utilizando marcadores mapeados em 3q (D13S1601, D3S1614 e D3S1311) e 18q (D18S70 e D18S461) em CCEL. Caso 3q26.2 3q28 3q29 18q23 D3S1614 D3S1601 D3S1311 D18S70 D18S1122 D18S461 1 - - - - - ○ 2 - ● - - - - 3 ○ - ● ● ○ ○ 4 ● - - - - ● 5 ● ● MSI ○ - ○ 6 - - - ○ - - 7 - ○ - - - - 8 ○ - - - - ○ 9 ● - - ● - ○ 10 ○ - - - - - 11 - - - ● ● ○ 12 ○ ○ ○ - - - 13 - ○ ○ ● - - 14 ○ ○ - - ○ - 15 - - - - - ○ 16 ● ● - ● ○ ○ 17 ● ● - MSI - ● 18 - - ○ - ○ - 19 - - - ○ ○ - 20 - - ● - ● ○ 21 - ● ● - - ○ 22 - - - - - - 23 - ○ - - - ○ 24 MSI - - MSI ● MSI 25 - - - - ○ ○ 26 ○ - - - - - 27 - - ● - - - 28 - ○ - - - - 29 ● MSI ● ○ - ● 30 ● ● ● ● - ○ 31 - ○ ○ ○ ○ ○ 32 ○ - ○ ● ● - 33 ● - MSI - - - (-) retenção alélica; (○) não informative; (●) LOH; (MSI) instabilidade de microsatélites Artigo 1 – CGH Cromossômico 46 Figura 1. Ideograma de desequilíbrios cromossômicos detectados por HR-CGH em todas as amostras avaliadas. Barras do lado esquerdo dos cromossomos indicam perda e barras no lado direito indicam ganhos. As barras escuras indicam fronte de invasão e as claras superfície tumoral. Figura 2. Análise de imunoistoquimica da ciclina D1. A-B. Imunocoloração negative e forte nas céluas do fronte, respectivamente. B. Imunocoloração nuclear e da membrane citoplasmática; C- D. Imunocoloração fraca e forte nas células da superfície, respectivamente. Figura 3. Análise de perda de heterozigose (LOH) usando marcadores em 3q e 18q. A. Frequencia de casos mostrando LOH para os marcadores D3S1614, D13S1601, D3S1311, D18S70, D18S1122 e D18S461; B. Associação significativa entre a presença de LOH e envolvimento de linfonodos. Valor de P mostrado; C e D. Eletroferogramas ilustrando um caso com padrão normal e uma amostra tumoral apresentando LOH para o marcador D3S1614, respectivamente. Artigo 1 – CGH Cromossômico 47 Figura 1 Figura 2 Artigo 1 – CGH Cromossômico 48 Figura 3 Artigo 2 - CTTN 49 Artigo 2 Artigo 2 - CTTN 50 Cortactina está associada com invasão perineural no fronte de invasão de carcinomas de laringe Eliane Papa Ambrosio, MSc 1,2, Fabíola Encinas Rosa, PhD1,2, Maria Aparecida Custódio Domingues, MD, PhD3; Rolando André Rios Villacis2, Renata de Almeida Coudry, MD, PhD4, José Vicente Tagliarini, MD, PhD5, Fernando Augusto Soares, MD, PhD 4; Luiz Paulo Kowalski, MD, PhD6; Silvia Regina Rogatto, PhD 2,7. 1 Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista-UNESP, Botucatu, SP, Brasil 2 Neogene Laboratório, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, SP, Brasil 3 Departamento of Patologia, Universidade Estadual Paulista-UNESP, Botucatu, SP, Brasil 4 Departamento de Anatomia Patológica, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, SP, Brasil 5 Departamento de Oftalmologia e Otorrinolaringologia, Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista-UNESP, Botucatu, SP, Brasil 6 Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, SP, Brasil 7Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista-UNESP, Botucatu, SP, Brasil * Correspondência: Silvia Regina Rogatto, PhD NeoGene Laboratório Fundação Antonio Prudente, Hospital A.C. Camargo, Rua Professor Antonio Prudente, 211, São Paulo, Brasil CEP: 01509-010 Telefone: 55-11-21895163 Fax: 55-11-21895163 e-mail: rogatto@fmb.unesp.br ou silvia.rogatto@hcancer.org.br Esta pesquisa foi financiada pela Fapesp e CNPq Não há conflito de interesses declarado por parte dos autores. Artigo 2 - CTTN 51 Resumo O gene cortactina (CTTN), mapeado em 11q13, tem sido associado ao curso clínico agressivo em muitos cânceres, devido a sua função relacionada a invasividade. O propósito deste estudo foi avaliar os níveis de expressão gênica e proteica da CTTN, assim como seu valor prognóstico, no fronte de invasão e na superfície tumoral de carcinomas de células escamosas de laringe (CCEL). Expressão aumentada da proteína CTTN citoplasmática (80% dos casos em ambas as áreas, fronte e superfície) e do transcrito (30% das amostras) foi detectada em um número significativo de casos. Em mais de 20% dos casos foi observada imunocoloração da membrana tanto no fronte como na superfície. Pacientes que apresentaram invasão perineural foram significativamente associados com presença de linfonodos e recorrência (P=0.0058 e P=0.0037, respectivamente). Altos níveis de expressão proteica foram correlacionados com invasão perineural (P=0.004) nas células do fronte, sugerindo que esta área pode ser considerada como ferramenta prognóstica em carcinomas de laringe. Enquanto a maioria dos casos apresentou expressão moderada a intensa na superfície tumoral, no fronte de invasão alguns casos mostraram um padrão de expressão diferencial. Em um grupo de casos com expressão ausente ou fraca da CTTN no fronte foram observados bons parâmetros de prognóstico, e no segundo grupo com expressão moderada a intensa da CTTN foi observado uma associação com prognóstico desfavorável, sugerindo uma associação com seguimento agressivo. Juntos, estes resultados sugerem que o fronte de invasão pode ser considerado no sistema de graduação em carcinomas de laringe e que a CTTN é um provável marcador de agressividade no fronte de invasão destes tumores. Palavras-chave: fronte