Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus de Araçatuba – Faculdade de Odontologia Departamento de Ciências Básicas Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas Ricardo de Paula de Almeida Análise da expressão de proteínas autofágicas e microestrutura do colo do fêmur de ratas no período do envelhecimento após treinamento de força ARAÇATUBA 2017 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus de Araçatuba – Faculdade de Odontologia Departamento de Ciências Básicas Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas Análise da expressão de proteínas autofágicas e microestrutura do colo do fêmur de ratas no período do envelhecimento após treinamento de força ARAÇATUBA 2017 Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas para obtenção do título de mestre em Ciências Fisiológicas Área de concentração: Fisiologia Orientado: Ricardo de Paula de Almeida Orientadora: Profª Drª Rita Cássia Menegati Dornelles Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Catalogação da Publicação (CIP) Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - FOA/ UNESP Almeida, Ricardo de Paula de Análise da expressão de proteínas autofágicas e microestrutura do colo do fêmur de ratas no período do envelhecimento após treinamento de força/ Ricardo de Paula de Almeida. – Araçatuba, 2017 78 f.: il. + 1 CD-ROM. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profª Rita Cássia Menegati Dornelles 1. Envelhecimento, 2. Exercício físico, 3. Treinamento de força, 3. Periestropausa, 4. Microarquitetura óssea, 5. Osteoporose, 6. Autofagia FOLHA DE APROVAÇÃO Ricardo de Paula de Almeida Análise da expressão de proteínas autofágicas e microestrutura do colo do fêmur de ratas no período do envelhecimento após treinamento de força Aprovado em: 12/07/2017 Banca Examinadora: Prof. Dr. Eduardo Kokubun Instituição: Instituto de Biociências de Rio Claro/ UNESP Prof. Dr. Edilson Ervolino Instituição: Faculdade de Odontologia de Araçatuba/ UNESP Prof (a). Dr (a): Rita Cássia Menegati Dornelles Instituição: Faculdade de Odontologia de Araçatuba/ UNESP Dissertação de mestrado apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas para obtenção do título de mestre em Ciências Fisiológicas Área de concentração: Fisiologia Orientado: Ricardo de Paula de Almeida Orientadora: Profª Drª Rita Cássia Menegati Dornelles DADOS CURRICULARES Nascimento: 18/01/1989, Birigui - SP Filiação: Valdei Dias de Almeida Jaci de Paula de Almeida 2007/2011: Curso de Graduação em Bacharelado para Educação Física Centro Universitário Toledo de Araçatuba – UNITOLEDO – Araçatuba – SP. 2015/2017: Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Fisiológicas, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP. DEDICATÓRIA A minha família por me darem suporte em todos os momentos AGRADECIMENTOS À UNESP – Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade de realizar este curso. Ao diretor da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP Prof. Titular Wilson Roberto Poi e ao vice-diretor Prof. Titular João Eduardo Gomes Filho pelo apoio. Ao apoio financeiro da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela concessão da bolsa de mestrado. À FUNDUNESP (Fundação para Desenvolvimento da UNESP) e a Pró-Reitoria de Pósgraduação da UNESP (PROPG-UNESP) pelo apoio financeiro durante as viagens para realização de disciplinas e conclusão dos experimentos. A todos os funcionários da UNESP, que de acordo com suas funções, prestaram sua importante parcela de contribuição nos diferentes estágios de realização desta pesquisa. À Profª Drª Sandra Helena Penha de Oliveira da UNESP/ FOA pelos pareceres semestrais do projeto e também pela concessão de uso de micrótomo para cortes de tecidos ósseos. Ao Prof. Dr. Edilson Ervolino do Laboratório de Osteobiologia aplicada à Odontologia da UNESP/ FOA por toda a ajuda disponibilizada na realização deste projeto. Ao Prof. Dr. Mário Jefferson Quirino Louzada do Laboratório de Biofísica da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba - FMVZ - UNESP pela disponibilização de materiais necessários à realização deste projeto. Ao Prof. Dr. Antônio Hernandes Chaves-Neto do Departamento de Ciências Básicas da UNESP/FOA pela colaboração durante a realização deste projeto. À Professora Drª Ándrea Machado Leopoldino do Departamento de Análises Clínicas, Toxicologia e Ciências Alimentares, Escola de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo pela colaboração no uso de técnicas utilizadas neste projeto. À Professora Drª Titular Mariz Vainzof do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva (Centro de Estudos do Genoma Humano e Células – Tronco/ Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo) por gentilmente disponibilizar material utilizado neste projeto. À administração do Laboratório Multiusuário para realização de análises de microtomografia óssea computadorizada. Aos colegas de laboratório e de departamento que sempre se mostraram solidários nos momentos de necessidade. À todos os docentes do Departamento de Ciências Básicas: Sandra Helena Penha de Oliveira, Ana Cláudia Stevanato Nakamune, Antônio Hernandes Chaves Neto, Cristina Antoniali Silva, Dóris Hissako Sumida, João Carlos Callera, João César Bedran de Castro e Wilson Galhego Garcia, por somarem seus conhecimentos durante meu aprendizado. Aos Professores da banca: Prof. Titular João César Bedran de Castro, Profª Drª Sandra Helena Penha de Oliveira e Profª Drª Rita Cássia Menegati Dornelles, pela estimada contribuição intelectual para este trabalho. A todos os funcionários da biblioteca e da seção de pós-graduação da FOA, por me auxiliarem em todos os momentos. A todos que direta ou indiretamente fizeram parte das novas descobertas aqui relatadas. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À minha família que sempre soube me entender e incentivar durante este período de dedicação ao estudo e pesquisa. Aos meus amigos e colegas pela compreensão e motivação que me deram duram este tempo Aos colegas de laboratório e do departamento de Ciências Básicas da UNESP pelo suporte quando necessário e por tudo que me ensinaram Aos colegas e amigos de outras instituições pelo trabalho e disponibilidade que tiveram na conclusão deste projeto À minha orientadora Drª Rita Cássia Menegati Dornelles, que me proporcionou a oportunidade de crescer profissionalmente sob sua orientação e aconselhamento, sempre compreendendo as dificuldades encontradas neste trabalho “Não é na ciência que está a felicidade, mas na aquisição da ciência”. (Edgar Allan Poe) RESUMO ALMEIDA, R. P. Análise da expressão de proteínas autofágicas e microestrutura do colo do fêmur de ratas no período do envelhecimento após treinamento de força. 77 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2017. RESUMO A diminuição de massa óssea concomitante à progressão da idade resulta em maior incidência de fraturas, devido a mudanças microarquiteturais que são determinantes importantes para a qualidade óssea. Concomitantemente, mecanismos moleculares que agem na manutenção celular como a autofagia podem estar relacionados ao “turnover” ósseo no período do envelhecimento, sendo estes mecanismos relacionados ao processo de osteopenia/osteoporose. Neste estudo foram avaliados os efeitos do treinamento de força (TF) na microestrutura do colo do fêmur de ratas Wistar adultas (7 meses) e velhas (21 meses) submetidas ou não ao programa de exercício físico e distribuídas nos grupos: adultas não exercitadas (A/NEX); adultas exercitadas (A/EX); velhas não exercitadas (V/NEX) e velhas exercitadas (V/EX). O treinamento de força foi realizado utilizando-se escada com carga atrelada à cauda dos animais; 3 vezes por semana durante período de 120 dias. Resultados obtidos por microtomografia computadorizada (μCT) após este período demonstraram que o TF foi capaz de aumentar a espessura (Ct. Th (mm); V/EX vs A/EX p = 0,7863), momento polar de inércia médio (pMOI (mm4); A/NEX vs A/EX p = 0,0362; V/NEX vs V/EX p = 0,0032) e reduzir a porosidade da região cortical do colo do fêmur (Ct. Po (%); V/NEX vs V/EX p = 0,0406), causando aumento na área cortical total (Tt.Ar (mm²); V/NEX vs V/EX p = 0,0406). No osso trabecular notou-se maior fração do volume ósseo (BV/TV (%); V/NEX vs V/EX p = 0,006); espessura trabecular (Tb.Th (mm); V/NEX vs V/EX p = 0,0069; V/EX vs A/EX p<0,0001); número de trabéculas (Tb.N (1/mm) V/NEX vs V/EX p = 0,0004) e grau de anisotropia ( DA V/NEX vs V/EX p = 0,0088). Estas modificações resultaram em redução do espaçamento trabecular (Tb.Sp (mm) V/EX vs A/EX p = 0,0382) e porosidade trabecular (Tb.Po (%) V/NEX vs V/EX p = 0,0006). Além destes parâmetros da estrutura cortical e trabecular, foram avaliados: capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM); peso corporal, do útero e do tecido adiposo retroperitoneal; biomarcadores para fosfatase alcalina plasmática (FAL) e fosfatase ácida resistente à tartarato sérica (TRAP); densidade mineral óssea areal (DMOa), Western blot para beclina-1, LC3, sequestossoma-1/p62 (SQSTM-1/p62), AKT, ERK1//2, pAKT (Ser473), pERK (Thr202/ Tyr204); e imunoistoquímica (IHQ) para RUNX-2, FAL, TRAP, Osteocalcina (OCN) e beclina-1. As dosagens plasmáticas evidenciaram aumento na atividade da FAL após a realização do TF (A/NEX vs A/EX p = 0,0002). Concentrações plasmáticas de TRAP não apresentaram alterações significantes. Análises de marcadores autofágicos mostraram maior expressão para beclina-1 em A/EX e V/EX. LC3 também obteve elevada expressão em A/EX, mas em V/EX sua expressão foi menor. A expressão de SQSTM1/p62 foi reduzida após a realização do TF nas ratas A/EX e V/EX. AKT total (t-AKT) e AKT fosforilada (pAKT-Ser473) demonstrou expressão mais alta em A/EX comparados à A/NEX. Por outro lado, em V/EX, a fosforilação foi reduzida em Ser473 quando comparados à V/NEX, mas t-AKT permaneceu inalterada em ambos. Resultados para ERK1/2 demonstraram redução na expressão em A/EX comparados à A/NEX, mas em V/EX sua expressão foi melhorada comparados à V/NEX. A fosforilação de ERK em Thr202 foi aumentada em A/EX em relação à A/NEX, mas em ratas velhas não houveram modificações. No sítio Tyr204 também houve elevada fosforilação em A/EX comparados à A/NEX, mas foi reduzida em V/EX comparados à V/NEX. A imunomarcação de RUNX-2, FAL, OCN e beclina-1 foi menor em V/NEX mas em V/EX a marcação aumentou assemelhando -se à A/EX. TRAP, elevada em V/NEX, mostrou -se reduzida em V/EX. Em suma, neste estudo nós demonstramos a atuação do TF no metabolismo ósseo de ratas no período da periestropausa com resposta integrada entre exercício e idade. Este estudo também demonstrou que proteínas importantes relacionadas à regulação autofágica e metabolismo ósseo podem ser potencialmente alteradas pelo TF. Nossos resultados evidenciam atuação do TF na manutenção da massa óssea mostrando que essa modalidade de exercício pode prevenir e/ou diminuir danos causados pela osteoporose durante o estágio do envelhecimento. PALAVRAS – CHAVE: Envelhecimento, exercício físico, treinamento de força, periestropausa, microarquitetura óssea, osteoporose, autofagia. ABSTRACT ALMEIDA, R. P. Analysis of autophagic proteins expression and femoral neck bone microstructure of female rats in the aging period after strength training. 2016. f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2017. Abstract The decrease in bone mass concomitant with the progression of age results in a higher incidence of fractures, due to microarchitectural changes that are important determinants of bone quality. Concomitantly, molecular mechanisms that act in cellular maintenance such as autophagy may be related to bone turnover in the aging period, and these mechanisms are related to the osteopenia/osteoporosis process. In this study were evaluated, the effects of strength training (ST) on the femoral neck microstructure of adult (7 months) and old (21 months) female Wistar rats submitted or not to the physical exercise program and distributed in the following groups: non- exercised adult groups (A/NEX); exercised adults (A/EX); non-exercised old (O/NEX) and old exercised (O/EX). Strength training was performed using a ladder with load attached to the tail of the animals; 3 times a week for a period of 120 days. Results obtained by computerized microtomography (μCT) after this period demonstrated that the ST was able to increase the thickness (Ct.Th (mm), O/EX vs A/EX p = 0.7863), mean polar moment of inertia (mm4), A/NEX vs A/EX p = 0.0362, O/NEX vs O/EX p = 0.0032) and reduce the porosity of the cortical region of the femoral neck (Ct Po (%); O/NEX vs O/EX p = 0.0406), causing increase in the total cortical area (Tt.Ar (mm²); O/NEX vs O/EX p = 0.0406). In trabecular bone, a higher fraction of bone volume was observed (BV / TV (%), O/NEX vs O/EX p = 0.006); (Tb.Th (mm); O/NEX vs O/EX p = 0.0069; O/EX vs A/EX p <0.0001); number of trabeculae (Tb.N (1/mm) O/NEX vs O/EX p = 0.0004) and degree of anisotropy (DA O/NEX vs O/EX p = 0.0088). These changes resulted in a reduction in trabecular spacing (Tb.Sp (mm) O/EX vs A/EX p = 0.0382) and trabecular porosity (Tb.Po (%) O/NEX vs O/EX p = 0.0006 ). In addition to these parameters of the cortical and trabecular structure, the following were evaluated: maximum voluntary carrying capacity (MVCC); body weight, uterus and retroperitoneal adipose tissue; biomarkers for plasmatic alkaline phosphatase (ALP) and serum tartrate resistant acid phosphatase (TRAP); Western blot for beclin-1, LC3, sequestosome-1/p62 (SQSTM-1 / p62), AKT, ERK1/2, pAKT (Ser473), pERK (Thr202/Tyr204) and immunohistochemistry (IHC) for RUNX-2, ALP, TRAP, osteocalcin (OCN) and beclin-1. Plasma dosages showed an increase in ALP activity after ST (A/NEX vs A/EX p = 0.0002). Plasmatic concentrations of TRAP did not show significant alterations. Analyzes of autophagic markers showed higher expression for beclin-1 in A/EX and O/EX. LC3 also had higher expression in A/EX, but in O/EX its expression was lower. Expression of SQSTM1/p62 was reduced after ST in the A/EX and O/EX rats. Total AKT (t-AKT) and phosphorylated AKT (pAKT-Ser473) demonstrated higher expression in A/EX compared to A/NEX. On the other hand, in O/EX, phosphorylation was reduced in Ser473 when compared to O/NEX, but t-AKT remained unchanged in both. Results for ERK1/2 demonstrated reduction in A/EX expression compared to A/NEX, but in O/EX their expression was improved compared to O/NEX. ERK phosphorylation in Thr202 was increased in A/EX relative to A/NEX, but in old rats there were no changes. At the Tyr204 site there was also high A/EX phosphorylation compared to A/NEX, but was reduced in O/EX compared to O/NEX. Immunostaining of RUNX-2, FAL, OCN and beclin-1 was lower in O/NEX but in O/EX the labeling increased resembling A/EX. TRAP, high in O/NEX, was reduced in O/EX. In summary, in this study we demonstrated the action of ST in bone metabolism of rats in periestropause period with integrated response between exercise and age. This study also demonstrated that important proteins related to autophagic regulation and bone metabolism may be potentially be altered by ST. Our results demonstrate the role of ST in maintaining bone mass, showing that this exercise modality can prevent and/or reduce osteoporosis damage during the aging stage. Keywords: Aging, bone microarchitecture, exercise, periestropause, strength training, osteoporosis, autophagy LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Vias de sinalização envolvidas na autofagia; Figura 2 - Representação gráfica das fases do ciclo estral durante dias de coleta do esfregaço vaginal; Figura 3ª - Escada utilizada para treinamento de força e testes de capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM); Figura 3b - Periodização do treinamento de força; Figura 4 - Peso do tecido adiposo e útero de ratas adultas e periestropausadas que fizeram ou não treinamento de força; Figura 5 - Concentração de fosfatase alcalina; Figura 6 - Densidade mineral óssea areal; Figura 7 - Dados da microarquitetura cortical do colo do fêmur de ratas adultas e periestropausadas; Figura 8 - Dados da microarquitetura trabecular do colo do fêmur de ratas adultas e periestropausadas; Figura 9 - Dados de análise por Western blot de marcadores autofágicos e proteínas relacionadas ao metabolismo ósseo e exercício físico; Figura 10 - Dados de análise de imunoistoquímica. Figura 11 - Marcadores metabólicos. Determinação das proteínas AKT, pAKT, ERK1/2, pERK1/2. Figura 12 - Marcadores autofágicos. Determinação das proteínas Beclina -1, LC3 1/2 e SQSTM-1/p62. Figura 13 - Análise por Western blot. Gráficos em barra representam valores de intensidade de banda. LISTA DE ABREVIATURAS UPS- sistema ubiquitina-proteassoma CMA- autofagia mediada por chaperonas RE- retículo endoplasmático PAS- estrutura pré - autofagossomal ATG- proteínas relacionadas à autofagia ULK1- uncoordinated-51-like kinase 1 PtdIns3K- Complexo 1 classe III fosfatidilinositol 3 quinase Vps- vacuolar protein sorting mTORC1- alvo mamífero do complexo da rapamicina 1 FIP200- Focal adhesion kinase Family interacting protein of 200 KD AMBRA1- Activating molecule in Beclin 1-regulated autophagy TRAF6- TNF receptor associated factor 6 AKT- AKT serine/ threonine kinase EGFR- Epidermal growth factor receptor DFCP1- Double FYVE – domain containing protein 1 WIPI- WD repeat domain, phosphoinositide interacting LC3- Microtubule associated protein 1 light chain 3 NDP52- Nuclear dot protein 52 KDa NBR1- Neighbor of BRCA1 gene 1 (autophagy cargo receptor) Alfy- Autophagy- linked FYVE protein p62/ SQSTM1- sequestossoma 1 RC- Restrição calórica IGF- Fator de crescimento semelhante à insulina V/NEX- Ratas velhas não exercitadas V/EX- Ratas velhas exercitadas A/NEX- Ratas adultas não exercitadas A/EX- Ratas adultas exercitadas CCVM- Capacidade de carregamento voluntário máximo DEXA- densitometria por dupla emissão de raios – X μCT- microtomografia computadorizada FAL- fosfatase alcalina TRAP- fosfatase ácida resistente ao tartarato pNPP- p-nitrofenil fosfato DMOa- Densidade mineral óssea areal DICOM- Digital imaging and communications in medicine Tt.Ar- área cortical total CT.Ar- área óssea cortical V/TV- Fração da área cortical C/Th- Espessura cortical média Ct/Po- porosidade cortical Po.N- número de poros corticais pMOI- momento de inércia polar médio BV/TV- Fração do volume ósseo Tb.Th- espessura trabecular Tb.N- número de trabéculas Tb.Sp- Separação trabecular DA- grau de anisotropia Tb.Po- porosidade trabecular ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay ROI- region of interest Sumário 1. Introdução............................................................................................................ 2. Materiais e Métodos............................................................................................. 2.1 Modelo animal..................................................................................................... 2.2 Capacidade de carregamento voluntário máximo (MVCC) e treinamento de força.................................................................................................................... 2.3 Peso corporal, do tecido adiposo e útero............................................................. 2.4 Avaliação dos biomarcadores do turnover ósseo................................................ 2.5 Análise de densitometria por absorção de raios – X de dupla energia............... 2.6 Microtomografia computadorizada...................................................................... 2.7 Western blot........................................................................................................ 2.8 Imunoistoquímica................................................................................................ 2.9 Análise estatística............................................................................................... 3. Resultados.......................................................................................................... 3.1 Treinamento de força reduz a massa corporal em ratas periestropausadas e aumenta ganho de força nos três primeiros meses de treinamento......................................................................................................... 3.2 Biomarcadores do turnover ósseo....................................................................... 3.3 Densitometria por absorção de raios-X de dupla energia.................................... 3.4 Osso trabecular e cortical do colo do fêmur demonstra responsividade à tensão mecânica causada pelo treinamento de força em 120 dias..................................................................................................................... 3.5 TF não modifica a quantidade de t-AKT mas reduz pAKT (Ser473), sendo que aumenta a expressão de t-ERK1/2 reduzindo pERK (Tyr204) mas não pERK(Thr202)..................................................................................................... 3.6 A expressão de Beclina-1 é maior após TF em ratas velhas, mas não de LC3- I/II e SQSTM-1/p62............................................................................................. 4. Marcação para RUNX-2, beclina-1, FAL e OCN é aumentada no colo do fêmur após TF no período do envelhecimento............................................................... 5. Discussão............................................................................................................ 6. Conclusão............................................................................................................ Referências.......................................................................................................... Anexos ................................................................................................................ INTRODUÇÃO 1 INTRODUÇÃO O envelhecimento é caracterizado por crescente incapacidade para responder ao estresse e elevado desequilíbrio homeostático o qual poderá levar à maior incidência de doenças que poderão resultar em morte ou morbidade (Johnson et al., 1999; Pal e Tyler, 2016). Dados das Nações Unidas relatam que a expectativa de vida em 2045/2050 pode atingir 83 anos de idade em regiões desenvolvidas e 75 anos de idade em regiões menos desenvolvidas (UNITED NATIONS, DEPARTMENT OF ECONOMIC AND SOCIAL AFFAIRS, 2013). Com o crescimento da população idosa, há possibilidade de aumento significativo na incidência de osteoporose e prevalência de fraturas osteoporóticas (Becker et al., 2010; Cauley, 2013). Dados revelam que a quantidade de fraturas em 2050 irá atingir 6.3 milhões e representa custos anuais de 20 bilhões nos EUA e 30 bilhões na União Europeia. Na América Latina, o número de fraturas para mulheres e homens entre 50-64 anos de idade irá aumentar 400% até 2050 se comparados à 1990. Para pessoas mais velhas do que 65 anos o aumento irá atingir surpreendentes 700% (Cooper et al., 1992). A osteoporose também traz consigo problemas variados. Esta doença tipicamente condiciona às pessoas afetadas, que tenham cuidado excessivo com as atividades diárias, o que por sua vez reduz dramaticamente sua independência e sociabilidade. Em alguns casos mais extremos, é até mesmo possível que ao se curvar, tossir ou levantar ocorra o colapso de uma vértebra. Situações assim são ainda mais agravadas por quedas, que são a maior causa de fraturas do punho e quadril. O osso é formado por osteoblastos e osteócitos (células formadoras de osso), osteoclastos (células de reabsorção óssea) e osteóide (matriz óssea). Uma vez que o equilíbrio entre a quantidade de osso formado e reabsorvido seja modificado por reabsorção excessiva, ocorrerá perda óssea precursora da osteoporose. A taxa de remodelamento ósseo é reduzida por estrógeno, o qual aumenta a apoptose de osteoclastos através de dois receptores: receptor de estrógeno α (ERα) e receptor de estrógeno β (ERβ). A deficiência de estrógeno tem função essencial na osteoporose sendo associada à aumentada reabsorção óssea e prejudicada formação óssea. Mesmo sob indução de carga mecânica, a formação de tecido ósseo é reduzida na deficiência de estrógeno, o que sugere tanto uma função catabólica quanto anabólica (Lee et al., 2003). A distribuição e grau de mineralização do osso estão intimamente ligados à frequência de ativação do remodelamento ósseo, sendo este influenciado pela idade, status hormonal, patologia e terapias (Boivin e Meunier, 2002; Roschger et al., 2008). O hipoestrogenismo em mulheres, carga mecânica reduzida, hiperparatireoidismo, deficiência de cálcio e/ou vitamina D, a associação do envelhecimento e estresse oxidativo são fatores-chave que contribuem para osteoporose (Manolagas, 2010; Sorpreso et al., 2015; Stringhetta-Garcia et al., 2016). O risco aumentado de fratura está intimamente relacionado à deterioração da competência mecânica do osso, que é determinada pela sua composição estrutural como um todo (ex. tamanho ósseo, geometria óssea, orientação trabecular e porosidade cortical) e de propriedades de materiais intrínsecos [ex. composição química e tamanho dos cristais de hidroxiapatita] (Augat e Schorlemmer, 2006). Várias estratégias têm sido utilizadas para tratar ou amenizar os danos causados pela osteoporose. Múltiplas drogas têm sido elaboradas na pretensão de evitar fraturas, mas boa parte destas tem demonstrado pouca eficácia, pobre adequação e efeitos colaterais. Além disso, a maioria das drogas com exceção da teriparatida, tem ação sobre a inibição da reabsorção óssea e não agem estimulando a formação óssea. Elas também não reparam a arquitetura trabecular danificada e nem fortalecem o osso cortical (Bandeira, 2017; Khosla et al., 2017; Villiers, 2017). Recentemente, também foi aprovado uso de abaloparatida para o tratamento de osteoporose pós-menopausa (Shirley, 2017). Apesar do tratamento farmacológico ser padrão, seus resultados apresentam limitações potenciais, como modesto incremento da densidade mineral óssea. Somado a isso, não exercem influência sobre os fatores de risco que levam a fratura, como força muscular reduzida, diminuída flexibilidade articular e agilidade e pobre movimento dinâmico e equilíbrio (Zhao et al., 2015). Contrariamente, estudos desde a década de 1990 demonstram a efetividade do exercício físico na redução da osteopenia/osteoporose (Gleeson et al., 1990; Raab et al., 1990; Silbermann et al., 1990; Newhall et al., 1991; Kerr et al., 1996; Goodship et al., 1998; Humphries et al., 1999; Bergstrom et al., 2008; Hamaguchi et al., 2017; Seidelin et al., 2017). Diferentes modalidades de exercícios já foram utilizadas para avaliar o metabolismo ósseo, dentre elas: corrida (Chen et al., 2016), saltos (Falcai et al., 2015), exercícios proprioceptivos (Stolzenberg et al., 2013; Winkelmann et al., 2015) entre outros. Foi demonstrado por estudos recentes de nosso grupo que o treinamento de força é capaz de aumentar a força óssea e osteoblastogênese, diminuindo a degradação na região do colo do fêmur de ratas hipoestrogênicas intactas e por ovariectomia mesmo quando não conjugado a aplicações de estrógeno, sendo estas atividades resultado de maior atividade de células tronco mesenquimais da medula óssea, causando também reduzida diferenciação adipogênica e concentração de citocinas pró-inflamatórias (Stringhetta-Garcia et al., 2016; Singulani et al., 2017). Adicionalmente, o estímulo mecânico causado pelo treinamento de força pode reverter o funcionamento do microambiente ósseo no período do envelhecimento in vivo e in vitro (Singulani et al., 2017). Outro evento que desempenha ação fundamental na instalação de doenças e pode estar envolvido com a fisiopatologia da osteoporose, é a alteração em fatores moleculares. Vias de sinalização transmitem às células estímulos provenientes do ambiente externo para que estas respondam rápida e adequadamente, garantindo o equilíbrio homeostático e, consequentemente, a sobrevivência celular (Hohmann, 2002; Hersen et al., 2008; Fulda et al., 2010). Alterações relacionadas à idade, como acúmulo de macromoléculas danificadas – DNA, proteínas, lipídios e organelas celulares (mitocôndrias, retículo endoplasmático e peroxissomo), contribuem diretamente para a instauração do envelhecimento (Ravikumar et al., 2010). Entre os mecanismos celulares que agem a favor da defesa/ morte celular está o processo autofágico (Fulda et al., 2010; Zhang et al., 2016). Este processo possui ligações com apoptose, revelando uma função dual, por um lado autofagia degrada mitocôndrias danificadas e caspases, por outro lado, provê uma plataforma intracelular para o processamento de caspases na regulação da autofagia (Mariño et al., 2014). O cross- talk entre autofagia-apoptose envolve a interação de várias proteínas com beclina-1, sendo que Bcl-2 é considerado principal regulador destas interações. Apesar de não completamente definida, já se sabe que a relação autofagia-apoptose envolve várias proteínas apoptóticas como: Noxa, Nix, Bax, PUMA, XIAP e Bim (Pattingre et al., 2005; Marquez e Xu, 2012). Isso caracteriza autofagia tanto como uma via de morte celular e de adaptação ao estresse que promove sobrevivência celular. Resultados de estudos que visam compreender a relação autofagia-apoptose permanecem conflitantes, sendo incerto se autofagia representa um mecanismo para prevenir apoptose ou para decretar morte celular programada não-apoptótica (Denton et al., 2011). Autofagia inicia com a formação de membrana isolada ao redor de estrutura citosólica conhecida como estrutura pré-autofagossomal (PAS) em levedura. A membrana formada é chamada fagoporo, igualmente derivado da bicamada lipídica com contribuição do retículo endoplasmático e/ou o trans-Golgi e endossomos tardios. Intrigantemente, a origem exata do fagoporo ou a formação do PAS em mamíferos permanece controversa. Quatro grandes grupos funcionais de proteínas Atg (autophagy related proteins) são necessárias para a iniciação da formação do autofagossomo: (1) Atg1 (ULK1 em mamíferos) – complexo quinase Atg 13-Atg 17, (2) o complexo 1 classe III fosfatidilinositol 3 – quinase (PtdIns3K), consistindo de Vps (vacuolar protein sorting) 34, Vps15, Atg6 e Atg14, (3) dois sistemas de conjugação semelhante à ubiquitina (Atg12 e Atg8) e Atg9 e seu sistema de ciclagem (Yang e Klionsky, 2010). Em geral, o processo autofágico compreende a interação de mais de 30 proteínas ATG com homologia entre os genomas de leveduras à mamíferos (Ohsumi, 2013). Através da ação de indutores, tais como rapamicina e privação energética, mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) desfosforila ULK1 (uncoordinated 51-like kinase 1). Posteriormente, complexo formado por ULK1, ATG13, ATG101 e FIP200 (focal adhesion kinase (FAK) family interacting protein of 200 kD) dissocia-se do complexo mTORC1. ULK1 é randerizado enzimaticamente fosforilando ATG13 e FIP200, iniciando-se assim o processo autofágico. Em seguida, o complexo ULK1 ativado recruta o complexo Beclina1-Vps34 para local de formação do autofagossomo por meio da fosforilação de AMBRA1 (activating molecule in Beclin- 1-regulated autophagy). Consequentemente, AMBRA1 interage com TRAF6 (TNF receptor associated factor 6), agindo como uma ubiquitina-ligase E3 para ULK1, resultando em autoassociação e estabilização de ULK1 através da ubiquitinação de K63. O complexo ULK1 fosforila diretamente Beclina1 melhorando a atividade do complexo Vps34 contendo ATG14 - L. Adicionalmente, AKT (AKT serine/threonine kinase) e EGFR (epidermal growth factor receptor) modulam a autofagia através da fosforilação de Beclina1 independente de mTORC1 (Fig. 1A). Então, fosfatidilinositol- 3-fosfato produzido por Vps34 recruta DFCP1 (double FYVE-domain containing protein 1) para iniciar a nucleação da vesícula de dupla-membrana. A expansão ou conclusão do autofagossomo é mediada por ATG12-ATG5-ATG16L e ATG8 (LC3 [microtubule associated protein 1 light chain 3]) fosfatidiletanolamina, agregadas em sistemas de conjugação semelhantes à ubiquitina. No primeiro sistema, ATG12 é conjugada para ATG5 através da ação concentrada de ATG7 (enzima de ativação semelhante à ubiquitina E1) e ATG10 (enzima de conjugação semelhante à E2) (Fig. 1B). ATG12-ATG5 conjugados se ligam à ATG16L, formando complexo ATG12-ATG5-ATG16L, o qual então participa na conjugação de LC3-fosfatidiletanolamina. LC3, gerado de ProLC3 por ATG4 protease é conjugado à fosfatidiletanolamina por ATG7, ATG3 (outra enzima semelhante à E2) e o complexo ATG12-ATG5-ATG16L (agindo como um complexo semelhante à E3). Após o processamento, LC3 conjugado à lipídios (LC3-fosfatidiletanolamina ou LC3 II), o qual é localizado nas membranas autofagossomais, participa na formação e alongamento dos autofagossomos (Fig. 1C). A ancoragem de proteínas alvo e organelas destinadas para degradação para um autofagossomo em desenvolvimento ou engolfamento é facilitada por proteínas receptoras ou adaptadoras de autofagia (sequestossoma-1, também chamada p62), optineurina, NDP52, NBR1 e Alfy) agindo analogamente à uma ponte. Autofagossomos maduros se fundem com lisossomos para formar autofagolisossomos (autolisossomos), estruturas onde materiais ou organelas ancoradas por proteínas receptoras de autofagia são digeridas por enzimas lisossomais. Fig. 1 Autofagia é regulada por múltiplas interações moleculares. Indutores autofágicos como jejum e rapamicina ativam o complexo ULK1 aumentando a atividade do complexo Beclina1 – Vps34 por meio da fosforilação de AMBRA1 e Beclina1 (A). Consequentemente, AMBRA1 induz autofagia regulando a atividade quinase e a estabilidade de ULK1 através da interação cm TRAF6. AKT e EGFR induzem autofagia através da fosforilação de Beclina-1 independentemente de mTORC1. Vps34 produz PI3P, o qual recruta proteínas efetoras, tais como DFCP1 e WIPI, promovendo a formação do autofagossomo. (B) Dois sistemas conjugados medeiam o alongamento do autofagossomo: ATG12 – ATG5 – ATG16L e LC3 – PE. (C) Uma vez que as vesículas autofágicas estejam completas, o autofagossomo maduro funde-se ao lisossomo criando autolisossomo, onde moléculas e organelas sequestradas serão degradadas. Adaptado de (Kim e Lee, 2014). Interpretar mecanismos celulares da resposta óssea ao treinamento de força e autofagia pode ser crucial para a compreensão de doenças como a osteoporose. Neste sentido, investigamos alterações causadas pelo treinamento de força na microarquitetura óssea do colo do fêmur utilizando-se técnicas de densitometria óssea e microtomografia computadorizada somadas a análise imunoistoquímica e de ELISA para biomarcadores do turnover ósseo. Western blot foi realizado para avaliar a expressão dos marcadores autofágicos Beclina1, LC3 e p62/SQSTM1 e quinases importantes envolvidas no metabolismo e regulação autofágica como AKT e ERK1/2 (pAKT Ser473; pERK Thr202 e pERK Tyr204) no colo do fêmur de ratas com 21 meses de idade. O colo do fêmur é área de recorrentes fraturas, de fato o risco para estas fraturas se eleva conforme as competências mecânicas do osso se deterioram. Essa competência mecânica compreende todas as propriedades estruturais do osso e suas propriedades materiais intrínsecas. Propriedades estruturais incluem características como geometria óssea, tamanho do osso e propriedades microestruturais tais como orientação trabecular e porosidade cortical. As propriedades materiais intrínsecas correspondem à densidade mineral óssea (DMO), composição química e tamanho de cristais de hidroxiapatita. Setenta e cinco por cento (75%) de todas as fraturas no quadril ocorre em mulheres. É também sabido que a inatividade física e o estilo de vida sedentário comprometem a função neuromuscular, reduzindo força muscular e prejudicando o equilíbrio na qual levará à risco mais elevado de fraturas (Gourlay et al., 2015; Lafleur et al., 2016; Cohen, 2017; Curtis et al., 2017). Por outro lado, atividade física regular pode parar este processo (Nelson et al., 1994; Ryan et al., 1994; Layne e Nelson, 1999; Moreira et al., 2014) bem como alterar a habilidade diminuída da célula para manter suas funções, parâmetro também intimamente ligado à autofagia. Neste trabalho, buscamos averiguar como o colo do fêmur responde ao estresse mecânico causado pelo treinamento de força (conhecido mecanismo para evitar a perda óssea) no envelhecimento de ratas no período da periestropausa. Como objetivo principal, buscamos analisar os efeitos de TF na microarquitetura cortical e trabecular e caracterizar a expressão de proteínas relacionadas à autofagia. A hipótese do presente trabalho é que 120 dias de TF em ratas velhas pode melhorar a microarquitetura óssea e manter ou restaurar a expressão de proteínas relacionadas a autofagia no colo do fêmur, questões ainda não muito exploradas pela literatura. MATERIAIS E MÉTODOS 2. Materiais e Métodos 2.1 Modelo animal Todos os procedimentos realizados com os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética no Uso e Cuidados com Animais (Univ. Estadual Paulista- UNESP, Araçatuba, SP, Brasil, Processo número 2015-00922) e cumpridos de acordo com o Guia para Uso e Cuidado de Animais de Laboratório (Animals, 2011). Quarenta ratas Wistar do Centro de Criação Animal da Faculdade de Odontologia (Univ. Estadual Paulista- UNESP- Araçatuba, SP, Brasil), com idade de 07 e 21 meses foram distribuídas em grupos com 3 a 4 animais por gaiola e mantidas em ambiente com temperatura de 22ºC (±2°C) e ciclo claro/escuro de 12/12 h. Foram alimentadas com dieta pelitizada (Presence® Ratos e Camundongos, Paulínia, SP, Brasil) com acesso ad libitum para comida e água. A vida reprodutiva destes animais ocorre entre o 2º e 8º mês de idade marcando sua maturidade (Gabriel et al., 1992). Entretanto, o envelhecimento nestes animais é caracterizado por ciclo estral progressivamente irregular, quando se observa fase de estro constante e diestro prolongado (Long e Evans, 1922; Finch, 2014). Esta irregularidade pontua a periestropausa em ratas a qual é similar a perimenopausa em mulheres. Baseados nisto, nós validamos a periestropausa nestes animais através de análises diárias de esfregaço vaginal durante quatro meses. Os animais que demonstraram aciclicidade foram arranjados nos grupos de velhas, que são: velhas não exercitadas (V/NEX), n= 10) e velhas exercitadas (V/EX, n= 10) enquanto que as adultas com ciclo estral regular, foram distribuídas nos grupos: adultas não exercitadas (A/NEX, n= 10) e adultas exercitadas (A/EX, n= 10). Após a validação e distribuição dos grupos experimentais, os animais estavam prontos para serem submetidos para o período de familiarização. 2.2 Capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM) e treinamento de força Os grupos selecionados para treinamento foram submetidos à sessões de escalada em escada (Fig. 2 A; 1.13 × 0.18 m, grade de 2 cm, ângulo de 80º, com área de descanso de 20 × 20 × 20 cm diâmetro no topo – fabricada pelo Setor de Manutenção - Faculdade de Odontologia de Araçatuba, UNESP, Araçatuba, SP, Brasil) três vezes por semana em dias não consecutivos efetuando entre 48 e 62 movimentos dinâmicos (isotônicos) por série (Hornberger e Farrar, 2004), durante 120 dias no período que compreende à fase escura, após as 18 horas, a qual é o período ativo dos roedores (Smale et al., 2003). Cada sessão de treinamento consistiu de 6 escaladas e período de descanso de 120 segundos entre cada série. Durante uma semana antes do começo do treinamento, período de familiarização foi realizado sem carga anexada à cauda, em todos os animais. As ratas não respondentes à escalada voluntária foram substituídas por outro animal e realocadas no grupo NEX, animais que respondentes à subida foram inseridos no grupo EX. Posteriormente à familiarização, teste de capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM) adaptado de elegantes estudos de Hornberger e Farrar (Hornberger e Farrar, 2004), Prestes e colaboradores (Prestes et al., 2009) e Sanches e colaboradores (Sanches et al., 2014) foi realizado anexando dois tubos plásticos (BD Falcon 50 mL tubo cônico, BD Biosciences®, Bedford, MA, USA) preenchidos com esferas de aço (Esferas de aço, Cabana S/A, SP, Brasil) anexados à cauda com fita adesiva (Missner, Missner & Missner Ltda, Blumenau, SC, Brasil) nos grupos AEX e VEX. Utilizamos 75% do peso corporal como parâmetro inicial para avaliação da força máxima. Sendo assim, adicionando 30 gramas nos tubos e aumentando deste modo até o animal atingir o CCVM (i.e até a falha). A antepenúltima repetição antes da falha foi considerada o valor de força máxima e usado como base de cálculo percentual para a próxima semana de treinamento. É importante ressaltar que nenhum tipo de estímulo foi dado ao animal para executar a tarefa. Durante o período de treinamento, a carga foi de 60, 70 e 80% a cada semana, sendo mantida em 80% até o fim dos 120 dias. Juntamente, novo teste de CCVM foi realizado em cada mês experimental para reajustar a carga (Fig 2B). Fig. 2. Escada utilizada para realização do treinamento de força (A). Periodização do treinamento de força, após período de familiarização foi realizado teste de capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM) e utilizado 75% da carga máxima obtida (B). Ao início do treinamento, efetuou-se aumento progressivo da carga (60, 70 e 80%) por semana. A carga obtida de 80% foi utilizada como base para os subsequentes testes de CCVM realizados em cada mês do período experimental. 2.3 Peso corporal, do tecido adiposo e útero Após 120 dias de experimentação, todos os animais foram pesados em balança de precisão (Bel Mark 500, Bel Engineering, Bel Equipamentos Analíticos LTDA, Piracicaba, SP, Brasil) e anestesiados (80mg/kg/pc de Cetamina Vetaset®, Fort Dodge Saude Animal Ltda, Porto Feliz, SP, Brasil associado a 10mg/ Kg/ pc/ip de xilazina Coopazine®, Coopers Brasil Ltda, Porto Feliz, SP, Brasil). Após isso, foram sacrificados por decapitação e realizado coleta de sangue, tecido adiposo, útero e fêmures. O tecido adiposo e tecido uterino foram pesados em balança de precisão para checar possíveis alterações causadas pelo treinamento e senescência reprodutiva nestas estruturas. Os fêmures foram usados para medir densidade mineral óssea, microtomografia computadorizada (microCT), DEXA, imunoistoquímica e Western blot. 2.4 Avaliação dos biomarcadores do turnover ósseo As amostras de sangue (3 mL) foram coletadas e centrifugadas. O plasma foi separado por centrifugação (2256 x g; 15 min) e mantidos em temperatura de -20ºC; soro foi separado do sangue total por centrifugação a 1000 x g, durante 10 min, acondicionado em tubos e estocado à temperatura de -20° C. Concentração plasmática de fosfatase alcalina (FAL) e sérica de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) foram determinadas por protocolo adaptado de ensaio colorimétrico (Granjeiro et al., 1997; Janckila et al., 2005). Brevemente, uma alíquota de 25 de µL foi examinada em 0.5 mL da mistura de reação consistindo de 10 mM de p- nitrofenil fosfato (pNPP) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), 100 mM de sódio acetato (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), pH 5.8, 50 mM sódio tartarato (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 1 mM de p-hidroxi mercúrio benzoato (pHMB) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), o último age inibindo fosfatases de baixo peso molecular (Laidler et al., 1982). A reação foi iniciada adicionando o substrato e seguida por 1h em 37ºC em banho- maria. O ensaio foi finalizado adicionando 0.25 mL de 1 M NaOH e a absorbância determinada em 405 nm para determinar a quantidade de p-nitrofenolato (pNP) formado durante a reação. Os controles sem enzima foram incluídos com cada ensaio para ajustar para hidrólise não enzimática de pNPP. Uma unidade da atividade da enzima é definida como a quantidade da enzima que é necessária para hidrolisar 1 μmol de pNPP por min em 37º C. 2.5 Análise de densitometria por absorção de raios-X de dupla energia Os fêmures extraídos foram limpos com tecido leve mantidos congelados em - 20ºC. Para análise subsequente, os fêmures foram lentamente descongelados e mantidos imersos em solução salina até o teste. Para medições de densidade mineral óssea areal (DMOa), os fêmures foram posicionados no plano frontal e ântero- posterior na mesa do scanner, todos orientados da mesma forma, e foram completamente escaneados submersos em uma bacia com 2 cm de água, de acordo com as instruções do fabricante. A DMOa dos fêmures foi amostrada utilizando absorção de raios-X de dupla energia (Lunar DPX Alpha, WI, USA) e software para análise óssea em pequenos animais. O equipamento foi calibrado conforme as instruções do fabricante. O mesmo investigador analisou todos os escaneamentos. 2.6 Microtomografia computadorizada Utilizando dispositivo Skyscan 1172 (Skyscan, Leuven, Bélgica), foram feitas análise de microtomografia (microtomografia computadorizada [μCT] dos fêmures em 50 kV e 800 mA. Então, imagens de cada fêmur com 6 X 6 X 6 μm foram analisadas posicionando-as em orientação craniocaudal. As imagens foram importadas para o software NRecon (Skyscan, Leuven, Bélgica) e convertidos para escala de cinza no formato Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM). O osso cortical e trabeculado do colo do fêmur foram obtidos quantificando o volume de interesse (VOI) de estruturas tridimensionais (3D) de todos os animais e extraindo medições de cada grupo de dados no software CT-Analyzer (Skyscan, Leuven, Bélgica). Utilizando a ferramenta de seleção de polígonos, foram definidos a área do osso cortical e trabeculado circundando a margem externa (cortical) e interna (trabecular) do colo do fêmur. Consequentemente, maior fidelidade para a área selecionada foi adquirida utilizando ferramenta de interpolação dinâmica. Para as imagens binárias, nós asseguramos o uso apropriado do limiar dos valores de osso cortical e trabecular, os quais foram utilizados para todas as análises morfométricas subsequentes. O processamento da imagem foi necessário para a análise 3D dos parâmetros morfométricos que influenciam nas propriedades mecânicas e estruturais. Estes parâmetros foram calculados utilizando o software CT- Analyzer 3D (Skyscan, Leuven, Bélgica) baseado em modelo de volume. A segmentação de cada colo femoral foi realizada utilizando o mesmo software. Os parâmetros de mensuração e abreviações para análise morfométrica 3D do microCT foram: Osso cortical= área cortical total (Tt.Ar [mm²]; área óssea cortical (Ct.Ar [mm2]); fração da área cortical V/TV (Ct.Ar/ Tt.Ar [%]); espessura cortical média (Ct.Th [mm]); porosidade cortical (Ct.Po [%]); número de poros corticais (Po.N [n]) e momento de inércia polar (pMOI [mm4]). Osso trabecular = fração do volume osso (BV/TV [%]); espessura trabecular (Tb.Th [μm]); número trabecular (Tb.N [1/mm]); separação trabecular (Tb.Sp [μm]), grau de anisotropia [DA]) e porosidade trabecular (Tb.Po [%]). 2.7 Extração de proteína do fêmur Os ossos foram macerados em nitrogênio líquido, e em seguida foi adicionado o tampão de extração de proteínas CelLytic (Sigma) contendo inibidores de fosfatases e proteases. Os tecidos foram rompidos com tissue ruptor (Qiagen), e sonicados 5 vezes. Em seguida o lisado foi centrifugado por 30 min a 4°C à 20.000xg. O sobrenadante foi transferido para um tubo novo e as proteínas foram quantificadas por Bradford (Bradford, 1976). 2.8 Western Blot Amostras de proteínas (40 a 100 µg) foram separadas por SDS-PAGE em gel 8 a 15% (Laemmli, 1970). Foi utilizado o sistema vertical de eletroforese Mini-PROTEAN® (Bio-Rad Laboratories) conforme instruções do fabricante. Utilizou - se padrão de massa molecular para proteínas PageRulertm Plus Prestained Protein Ladder (26619, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). As seguintes condições de eletroforese foram configuradas: amperagem constante de 12 mA/gel e voltagem limite de 110 V durante 90 a 120 minutos. A corrida foi realizada em tampão de eletroforese Tris-glicina (Tris 25 mM, glicina 250 mM, SDS 0,1%, pH 8,3). Em seguida as proteínas foram eletrotransferidas para membranas de PVDF (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido), com tampão de transferência de bicarbonato (bicarbonato de sódio 10 mM e carbonato de sódio 3,0 mM, pH 9.9) ou com tampão de eletroforese Tris-glicina com metanol (Tris 12 mM, glicina 96 mM e 20% metanol) para a transferência de proteínas de alta massa molecular, por 90 minutos a 350 mA/gel. Após a transferência, a membrana foi incubada em solução de bloqueio (solução de leite desnatado 5% em solução salina tamponada de Tris-TBS/T-Tris.Cl 25 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, Tween-20 0,1%) por uma hora a temperatura ambiente. Após bloqueio, a membrana foi lavada 3x com TBS/T durante 5 minutos e incubada com o anticorpo primário em TBS/T, na diluição específica para cada anticorpo (Tabela 1) overnight a 4°C. A seguir, a membrana foi novamente lavada 3x com TBS/T durante 5 minutos, três vezes, e incubada por uma hora com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase diluído em solução de bloqueio, seguido de lavagem com TBS/T e visualização de quimioluminescência utilizando o sistema ECL Western Blotting Detection Kit (GE HealthCare). A membrana de PVDF foi exposta a filme para Raio-X Ortho CP-G Plus (AGFA), com auxílio de um cassete para exposição da membrana ao filme. Posteriormente, as intensidades das bandas foram medidas utilizando-se software ImageJ (National Institutes of Health - EUA). Informações sobre os anticorpos utilizados estão dispostas na tabela 1 abaixo. Tabela 1: Descrição dos anticorpos utilizados, origem, diluição e empresas fornecedoras. Anticorpo Código Origem Diluição Fabricante Beclina – 1 (#3495) rabbit 1:1000 BSA 5% Cell Signaling Technology pAKT ser 473 (#4058) rabbit 1:1000 BSA 5% Cell Signaling Technology AKT (#9272) rabbit 1:1000 BSA 5% Cell Signaling Technology pERK1/2 (Thr202/Thr204) (#4377) rabbit 1:1000 BSA 5% Cell Signaling Technology ERK1/2 (M5670) rabbit 1:6000 BSA 5% Sigma-Aldrich Corporation SQSTM/p62 (SC 28359) mouse 1:1000 BSA 5% Santa Cruz Biotechnology LC3 (#3868) rabbit 1:1000 em TBS – T 0,1% Tween TBS Cell Signaling Technology B - actina (sc 47778) mouse 1:4000 em TBS – T1X Santa Cruz Biotechnology 2.9 Imunoistoquímica Para a análise imunoistoquímica os cortes histológicos foram desparafinizados em xilol e hidratados em série decrescente de etanol (100º - 100º - 100º - 90º - 70° GL). A recuperação antigênica foi realizada através da imersão das lâminas histológicas em tampão citrato (Diva decloaker®, Biocare Medical, Concord, CA, EUA), em câmara pressurizada (Decloaking chamber®, Biocare Medical, Concord, CA, EUA) a 95°C, por 20 minutos. No final de cada etapa da reação imunoistoquímica, as lâminas histológicas foram lavadas em PBS 0,1 M, pH 7,4. Posteriormente, as lâminas foram imersas em 3% de peróxido de hidrogênio por 1 hora e 1% de soro albumina bovino por 12 horas para bloqueio da peroxidase endógena e bloqueio dos sítios inespecíficos, respectivamente. As lâminas contendo amostras de cada grupo experimental foram divididas em quatro lotes, e cada lote foi incubado com um dos seguintes anticorpos primários: anti-RUNX-2 do rato gerado em coelho (SC-10758, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-OCN do rato gerado em cabra (SC-18319, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-FAL do rato gerado em cabra (SC-30833, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-TRAP (SC-30833; 1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) e anti-BCN do rato gerado em coelho (D40C5, Cell Signaling, Cell Signaling Technology, 3 Trask Lane Danvers, MA 01923). Os cortes foram incubados com anticorpo secundário biotinilado por 2 horas e subsequentemente tratados com estreptavidina conjugada com peroxidase da raiz forte-HRP por 1 hora (Universal Dako Labeled HRP Streptavidin-Biotin Kit®, Dako Laboratories, CA, EUA). As revelações foram realizadas utilizando como cromógeno o 3,3’-tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB chromogen Kit®, Dako Laboratories, CA, EUA). Foi realizada a contracoloração com Fast Green, para RUNX-2, e com Hematoxilina de Harris, para OCN, ALP e BCN, e em seguida a desidratação em etanol, diafanização em xilol e, recobrimento com meio de montagem (Permount, Fisher Scientific, San Diego, CA, USA) e lamínulas de vidro. Como controle negativo, os espécimes foram submetidos aos procedimentos descritos anteriormente suprimindo-se a utilização do anticorpo primário. 2.10 Análise estatística Os resultados foram apresentados utilizando – se os valores da média ± EPM e as comparações múltiplas foram realizadas por análise de variância (ANOVA) a dois critérios, seguida de pós-teste de Tukey. O nível de significância utilizado foi de p<0,05 para todas as comparações. Para avaliação dos resultados de IHQ, foi realizado teste de Kruskal-Wallis não paramétrico seguida por pós-teste de Newman-Keuls e nível de significância utilizado de p<0,05 para todas as comparações. As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPadPrism (versão 6.01, GraphPad Software, Inc). RESULTADOS 3. RESULTADOS 3.1 Redução da massa corporal e aumento na capacidade de carregamento voluntário de ratas na periestropausa após treinamento de força Para avaliar possíveis alterações nos parâmetros corporais dos animais experimentais foram realizadas pesagens da massa corporal, útero e tecido adiposo. Os animais adultos, exercitados ou não, apresentaram aumento na composição corporal durante o período experimental. Entretanto, ratas velhas NEX demonstraram maior composição corporal em relação aos animais de mesma idade e que realizaram TF (Fig. 3). O teste CCVM realizado com animais dos grupos AEX e VEX demonstrou aumento de carga entre o primeiro e o terceiro mês de teste. Entre o terceiro e quarto, nenhum ganho de carga foi observado (Fig. 1B). Não houve interação significante da idade e TF para o teste de CCVM. Fig.3: Peso corporal e Capacidade de Carregamento Voluntário Máximo (CCVM). O peso corporal de ratas fêmeas adultas e velhas as quais fizeram ou não treinamento de força durante o período experimental (A). Demonstração da progressão da carga de treinamento em teste de capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM) realizado durante os meses de experimento (B). Resultados foram expressos por media ± EPM; Análise estatística foi feita com ANOVA (One-way; GraphPad Prism 6.0), seguido de teste post- hoc de Tukey (p<0.05) para analisar o efeito do treinamento de força (TF) e quaisquer interações (TF § Idade). Abreviações e símbolos: ANEX= adulta não exercitada; AEX= adulta exercitada; VNEX= velha não exercitada; VEX= velha exercitada; 8-10 animais por grupo. *vs VEX no mesmo período experimental; + vs mês anterior no mesmo grupo de animais. Adicionalmente, não foram observadas diferenças significantes no peso do útero entre os animais (p > 0,05). O tecido adiposo extraído da região retroperitoneal demonstrou diferenças significantes entre as ratas velhas e adultas. Ratas VNEX apresentaram maior adiposidade comparadas à ANEX (p = 0,0050) e AEX (p = 0,0036) [Fig. 4]. Não houve interação significante entre idade e TF para composição corporal, útero e tecido adiposo. T e c id o A d ip o s o ( g ) 0 3 6 9 1 2 1 5 N E X * + § : p > 0 .05 E X Ú te r o ( g ) 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0 § : p > 0 .05 A d u lta P e rie s tro p a u s a Fig. 4. Peso do tecido adiposo e útero de ratas adultas e na periestropausa que realizaram ou não treinamento de força. Valores representam média ± SEM. ANEX = adultas não exercitadas; AEX = adultas exercitadas; VNEX = velhas não exercitadas; VEX = velhas exercitadas; *p < 0,05 vs ANEX; +p < 0,05 vs AEX. 3.2 Análise de biomarcadores do turnover ósseo As concentrações plasmáticas e séricas dos biomarcadores ósseos FAL e TRAP foram avaliadas utilizando-se ELISA. Dados obtidos revelam que os animais do grupo A/EX obtiveram maior atividade de FAL quando comparado ao controle (p = 0,0002; Fig. 5A). A interação idade e TF é considerada extremamente significante (p = 0,0005). Diferentemente, as ratas V/EX apresentaram reduzida atividade de FAL quando comparado à do grupo A/EX (p < 0,0001). As medições para TRAP não demonstraram diferenças significantes. F A L ( U /L ) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 N E X E X * + § : p = 0 .0 0 0 5 T R A P ( U /L ) 0 3 6 9 1 2 1 5 § : p = 0 .5 7 A d u lta P e rie s tro p a u s a A B Fig. 5. Concentração de fosfatase alcalina (A) e fosfatase ácida resistente à tartarato (B). Fosfatase alcalina e TRAP de ratas adultas e na periestropausa exercitadas e não exercitadas por treinamento de força durante o período experimental. Os resultados foram expressos por média ± SEM. Análise estatística foi feita com ANOVA (Two-way; GraphPad Prism 6.0), seguido de teste post- hoc de Tukey (p<0,05) para analisar o efeito do treinamento de força (TF) e quaisquer interações (TF § Idade). Abreviações e símbolos: ANEX= adulta não exercitada; AEX= adultas + treinamento de força; VNEX= velhas não exercitadas; VEX= velhas exercitadas; 8-10 animais por grupo. *p=0,0002 vs A/NEX; +p < 0,0001 vs AEX. 3.3 Densitometria por absorção de raios-X de dupla energia Análise total do fêmur por absorção de raios-X de dupla energia foi realizada para analisar DMOa. Os animais alocados no grupo A/EX exibiram DMOa mais alta do que os A/NEX (p = 0,0008). Por outro lado, o grupo V/EX demonstrou perfil oposto, com DMOa mais baixa do que seus controles sedentários (p = 0,0002) e também quando comparado à A/EX (p < 0,0001). Como demonstrado na figura 6, ANOVA two-way demonstrou interação significante entre idade e TF em relação à DMOa (p = 0,0001). D M O a ( m g /c m 2 ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 N E X E X + # § : p < 0 .0 0 0 1 A d u lta P e rie s tro p a u s a * Fig. 6. Densidade mineral ósseo areal ex vivo. Fêmures de ratas adultas e adultas e na periestropausa que fizeram ou não treinamento de força durante período experimental foram analisados utilizando-se absormetria por emissão de raios-X de dupla energia e software para análise óssea em animais pequenos. Análise estatística foi efetuada com ANOVA (Two-way; GraphPad Prism 6.0), seguido por teste post-hoc de Tukey (p<0,05) para analisar o efeito do treinamento de força (TF) e quaisquer interações (TF § Idade). Abreviações e símbolos: ANEX = ratas adultas não exercitadas; AEX = ratas adultas + treinamento de força; VNEX = ratas velhas não exercitadas; VEX = ratas velhas + treinamento de força; 8 – 10 animais por grupo. *p < 0,0001 vs ANEX; + p < 0,0001 vs AEX; # p < 0,0002 vs VNEX. 3.4 Osso cortical e trabecular do colo do fêmur demonstra responsividade à tensão mecânica após o treinamento de força em 120 dias. As imagens da região de interesse (ROI) obtidas por microtomografia computadorizada, demonstrando o osso cortical e trabeculado das ratas adultas e velhas estão representadas na figura 7 (modelo em 2 dimensões) e na figura 8 (modelo em 3 dimensões). Fig.7: Representação em 2D do colo do fêmur de ratas Wistar adultas (1-4) e no período do envelhecimento (5-8). Região cortical e trabecular do colo do fêmur de animais adultos (1 e 3) e na periestropausa (5 e 7) que não realizaram TF; região cortical e trabecular do colo do fêmur após o TF de animais adultos (2 e 4) e na periestropausa (6 e 8). 1 2 3 3 4 5 6 7 8 8 Fig.8: Representação em 3D do colo do fêmur de ratas Wistar adultas (1, 2, 5 e 6) e no período do envelhecimento (3, 4, 7 e 8). Região cortical e trabecular do colo do fêmur de animais adultos (1 e 5) e na periestropausa (3 e 7) que não realizaram TF; região cortical e trabecular do colo do fêmur após o TF de animais adultos (2 e 6) e na periestropausa (4 e 8). 1 2 3 4 5 6 7 8 As análises da microarquitetura óssea cortical e trabecular do colo dos fêmures de ratas Wistar adultas e na periestropausa, após a realização de TF, estão apresentadas graficamente nas figuras 8 e 9, respectivamente. A microarquitetura óssea cortical ex vivo do colo do fêmur (Fig. 9) das ratas adultas que realizaram TF quando comparado com as ratas adultas que não realizaram TF, apresentou diferença significante no momento de inércia polar médio (pMOI). Ressaltamos que nos demais parâmetros analisados (Ct.Ar/Tt.Ar, Tt.Ar, Ct.Ar, Ct.Po e Ct.Th), não foram detectadas diferenças significantes entre os animais adultos. Entretanto, as ratas na periestropausa que realizaram TF apresentaram aumento na área cortical total (Tt.Ar; p = 0,0035) e pMOI bem como diminuição na porosidade cortical (Ct.Po) quando comparado às ratas do grupo V/NEX. A comparação da espessura cortical média (Ct.Th) entre ratas adultas e velhas evidenciou que esse parâmetro é maior nas ratas velhas que realizaram ou não TF. A análise do osso trabecular (Fig.10) de ratas adultas não evidenciou diferenças significantes entre A/NEX e A/EX. Nas ratas velhas foi detectado aumento da fração óssea (BV/TV; p = 0,0033), número trabecular (Tb.N; p = 0,0004) e espessura trabecular (Tb.Th; p = 0,0069) em comparação às ratas do grupo V/NEX. O maior número de trabéculas nas ratas V/EX resultou em menor separação trabecular (Tb.Sp), a qual também contribuiu para diminuir a área medular óssea. Destacamos a menor porosidade trabecular (Tb.Po) nas ratas velhas após o TF comparadas as ratas VNEX (p = 0,0006). Quando comparamos as ratas adultas e velhas não exercitados, verificamos menor BV/TV e Tb.N e maior Tb.Po e Tb.Sp nas ratas velhas (Fig. 10). Estes resultados foram revertidos nas fêmeas velhas após a realização do TF. Two- way ANOVA demonstrou interação significante entre idade e TF em relação à BV/TV (p = 0,0009), Tb.Th (p = 0,0003), Tb.N (p = 0,0011), Tb.Po (p = 0,0010) e DA (p = 0,0179). Fig 9. Microarquitetura óssea cortical ex vivo. A área cortical total (Tt.Ar), área óssea cortical (Ct.Ar), fração da área cortical (Ct.Ar/Tt.Ar), espessura cortical média (Ct.Th), porosidade cortical (Ct. Po) e momento de inércia polar médio (pMOI) do colo do fêmur de ratas adultas e velhas que fizeram ou não treinamento de força durante período experimental foram obtidos por microtomografia computadorizada. Análise estatística foi feita com ANOVA (Two-Way; GraphPad Prism 6.0), seguido por teste post-hoc de Tukey (p<0.05) paa analisar o efeito do treinamento de força (TF) e quaisquer interações (TF § Idade). Abreviações e símbolos: ANEX= ratas adultas não exercitadas; AEX= ratas adultas + treinamento de força; VNEX = ratas velhas não exercitadas; VEX= ratas velhas + treinamento de força; 8-10 animais por grupo. *p < 0,05 vs ANEX; #p < 0,05 vs VNEX; +p < 0,05 vs AEX; Fig. 10 Microarquitetura óssea trabecular ex vivo. O volume da fração óssea (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N), separação trabecular (Tb.Sp), porosidade trabecular (Tb.Po) e grau de anisotropia (DA) do colo do fêmur de ratas adultas e velhas que fizeram ou não treinamento de força durante período experimental foram obtidos por microtomografia óssea. Análise estatística foi feita com (Two-way; GraphPad Prism 6.0), seguido por teste post-hoc de Tukey (p<0.05) para analisar o efeito do treinamento de força (TF) e quaisquer interações (TF § Idade). Abreviações e símbolos: A/NEX= ratas adultas não exercitadas; A/EX= ratas adultas + treinamento de força; V/NEX = ratas velhas não exercitadas; V/EX= ratas velhas + treinamento de força; 8-10 animais por grupo. *p < 0,05 vs A/NEX; +p < 0,05 vs A/EX; #p < 0,05 vs V/NEX. 3.5 Quantificação, por western blotting, de proteínas envolvidas na via de sinalização de AKT total, pAKT, ERK 1/2 total, pERK (Tyr202) e pERK(Thr204) de ratas após a realização do TF Foram amostradas através de análise por Western Blot as atividades de proteínas-chave como AKT e ERK1/2 e suas porções fosforiladas p-AKT (Ser473), p- ERK (Thr202/Tyr204) respectivamente (Fig. 11). As intensidades das bandas para cada proteína amostrada foram medidas utilizando-se software específico Image-J (National Institutes of Health). A influência do TF foi suficientemente capaz de modular a expressão de AKT e p-AKT em ratas adultas submetidas à treinamento de força quando comparadas à A/NEX, aumentando a sua expressão. Nas ratas em periestropausa, não foi detectada modificação em AKT na sua forma total após a realização do TF. Entretanto, a porção fosforilada da AKT (Ser473) apresentou quantificação maior nas ratas peristropausadas quando comparada com as ratas adultas e após a realização do TF foi detectado redução na fosforilação de AKT em Ser473 se comparados à A/EX e V/NEX. A análise da expressão ERK 1/2, por Western blot, demonstrou a não ocorrência de alteração expressiva na quantidade de ERK1/2 total avaliada entre os grupos experimentais adultos. Nos animais velhos, a quantificação evidenciou maior expressão de ERK 1/2 após a realização do TF em relação à V/NEX. Em relação aos resíduos passíveis de fosforilação de ERK 1/2, houveram alterações diferentes das observadas em seu perfil total e entre os grupos experimentais. Em ratas adultas exercitadas em ambos resíduos Thr202 e Tyr204 houve aumento da fosforilação, quando se compara ratas as quais não fizeram TF. O que se contrapõe à tendência de redução em sua forma total. Contrariamente, em V/EX a fosforilação dos resíduos analisados foi expressivamente reduzida em comparação à V/NEX e A/EX (Fig. 11-12). Fig.11: Marcadores metabólicos. Determinação das proteínas AKT, pAKT, ERK1/2, pERK1/2, do fêmur de ratas adultas e velhas que realizaram (A/EX; V/EX) ou não treinamento de força (A/NEX; V/NEX) durante 120 dias. 3.6 Quantificação, por western blotting, das proteínas Beclina-1, LC3-I/II e SQSTM-1/p62 envolvidas na via de sinalização da autofagia das células ósseas de ratas após a realização de TF Foram analisadas também os marcadores autofágicos beclina-1, LC3-I/II e SQSTM-1/ p62. Em nosso estudo, a expressão de beclina-1 foi maior em ratas adultas que realizaram TF em comparação as que não realizaram treinamento. Também em ratas na periestropausa e que fizeram TF, houve elevação de sua expressão quando comparada à ratas que não fizeram TF, de modo que suas expressões ficaram próximas ao observado nas ratas do grupo A/EX. Analisando os resultados representativos para LC3 I (citoplasmática) e II (conjugada a membrana do autofagossomo ou lipidada), pode-se observar que tanto em sua forma citoplasmática quando em sua forma lipidada, houve maior expressão em A/EX quando comparadas à A/NEX. Em V/EX pode-se observar redução na expressão desta proteína em relação à A/EX e V/NEX. De maneira geral, grupos A/NEX e V/EX possuem menor expressão de LC3 I/II do que grupos A/EX e V/NEX. Em p62 foi possível amostrar redução de sua expressão quando comparando A/NEX e V/NEX, sendo a redução mais acentuada após a realização do TF tanto em ratas adultas quanto nas periestropausadas. Fig.12: Marcadores autofágicos. Determinação das proteínas Beclina -1, LC3 1/2 e SQSTM-1/p62 do fêmur de ratas adultas e velhas que realizaram (A/EX; V/EX) ou não treinamento de força (A/NEX; V/NEX) durante 120 dias. Q u a n ti fi c a ç ã o (i n te n s id a d e d a s b a n d a s ) A K T p A K T (S e r4 7 3 ) B e c lin a - 1 L C 3 - I L C 3 - I I S Q S T M -1 / p 6 2 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 A /N E X A /E X V /N E X V /E X E R K 1 /2 p E R K 1 /2 Fig. 13: Análise por Western blot realizado para avaliar a expressão e atividade representativa de proteínas do fêmur de ratas adultas e velhas que realizaram (A/EX; V/EX) ou não treinamento de força (A/NEX; V/NEX) durante 120 dias. Gráficos em barra representam valores de intensidade de banda. 4. Imunomarcação para RUNX-2, FAL, OCN e beclina-1 no colo do fêmur após TF no período do envelhecimento Para verificar as alterações no colo do fêmur das ratas que realizaram ou não TF foram realizadas marcações imunoistoquímicas para RUNX-2, FAL, TRAP, OCN e beclina-1 (Fig. 13). As imunomarcações para RUNX-2 não demonstraram alterações significantes quando analisadas entre os grupos de ratas adultas. Por outro lado, nas ratas no período da periestropausa apresentaram imunomarcação reduzida deste fator de transcrição, o qual é fundamental para a diferenciação de osteoblastos. A análise realizada nos fêmures das ratas periestropausadas e que realizaram o TF, evidenciou aumento de imunomarcação de RUNX-2, equivalente à detectada no animal adulto. Similarmente, o grupo A/EX quando comparadas às que não fizeram TF (A/NEX) possuíram marcação elevada para FAL no colo do fêmur. Resposta similar foi constatada para ratas periestropausadas que realizaram TF em relação à V/NEX, o que sugere maior mineralização no colo femoral do grupo V/EX. Visto que marcação elevada para RUNX-2 e FAL foram observadas, o que constata perfil pró- formação óssea, nós hipotetizamos que possivelmente o TF também pudesse influenciar a marcação para OCN, importante regulador da mineralização e da homeostase de íons cálcio. Nossos resultados demonstram que o hipoestrogenismo causado pelo avanço da idade reduziu as concentrações de OCN quando observados comparativamente entre A/NEX e V/NEX. Após a intervenção do TF, observou-se que A/EX foi mais responsivo para a marcação de OCN no colo do fêmur quando comparada à A/NEX, mas o TF também participou no aumento da imunomarcação em ratas do grupo VEX em relação à V/NEX. Adicionalmente, como descrito previamente no início deste trabalho, foi objetivado também avaliar o comportamento molecular possivelmente alterado pelo TF na autofagia. Para tal averiguação, foi feita marcação para beclina-1, proteína esta que está envolvida na regulação autofágica e morte celular. Os resultados obtidos mostram que em ambos os grupos EX independentemente da idade, o TF elevou as marcações para beclina-1 de maneira muito significativa. Fig 13: Imunoistoquímica para TRAP, RUNX-2, FAL, OCN e Beclina-1. Gráficos demonstrando valores obtidos por imunomarcação para TRAP, RUNX-2, OCN e Beclina-1 na região óssea cortical e trabecular do colo do fêmur de ratas adultas e na periestropausa que não realizaram TF (barras claras) e que realizaram TF no período de 120 dias (barras escuras). Cada coluna representa media ± erro padrão da média (EPM). Análise estatística realizada com teste não-paramétrico Kruskal-Wallis, seguido por pós-teste de Newman-Keauls. Fotomicrografias mostrando osteoclastos TRAP-positivos (A), osteoblastos RUNX2-positivos (B), osteoblastos FAL-positivos (C), osteoblastos OCN-positivos (D) e osteócitos BCN-positivos (E). Indicações acima das barras representam comparações entre os grupos experimentais e seus valores de significância estatística. * = p<0,05, ** p= 0,01, *** = p<0,001. Discussão O propósito deste estudo foi avaliar as propriedades da microestrutura cortical e trabecular juntamente com marcadores autofágicos no colo do fêmur de ratas no período da periestropausa após realização de treinamento de força. Nossa hipótese é de que a carga aumentada durante o exercício em ratas velhas atue como estímulo e potencialize resposta osteogênica melhorando sua estrutura cortical e trabecular além de aumentar autofagia. Os resultados indicaram que 12 semanas de treinamento de força com aumento progressivo de cargas contribuiu para aumento significante na área, espessura e número trabecular, além de redução da porosidade trabecular nos animais do grupo V/EX comparados aos animais do grupo V/NEX. A importância deste estudo é demonstrar como o treinamento de força pode ser relevante alternativa para evitar condições de baixa qualidade óssea, possivelmente contribuindo para a redução da incidência de fraturas no colo do fêmur que é a causa da maior parte de morbidade e mortalidade (Karlsson e Rosengren, 2012). A osteoporose, além de seus componentes genéticos (Huang et al., 2003; Huang e Kung, 2006; Makovey et al., 2007; Ralston, 2007), tem sido associada com a falta de atividade física, a qual agrava os efeitos do envelhecimento em mulheres (Bainbridge et al., 2004; Heidari et al., 2015; Huovinen et al., 2016). Neste estudo, nós utilizamos modelo em envelhecimento de ratas como descrito em estudos anteriores de nosso grupo (Ferreira et al., 2015; Nicola et al., 2016), sendo que este modelo não está ligado a qualquer tipo de tratamento ou procedimento, como a ovariectomia para determinar perfil hipoestrogênico, diferente disso, o animal passou pelo processo fisiológico do envelhecimento até alcançar a idade de 21 meses. Com base nos resultados obtidos em estudos anteriores (Ferreira et al., 2015; Nicola et al., 2016; Singulani et al., 2017), nós utilizamos ratas naturalmente envelhecidas, modelo com escassa descrição na literatura, considerando a avaliação do ciclo estral para validar o período de periestropausa nestes animais, período semelhante a perimenopausa em mulheres. A maior parte dos estudos que investigam a influência do exercício na massa óssea tanto em humanos quanto em animais envolvem atividades como natação (Gómez-Bruton et al., 2016), corrida (Kirk et al., 1989), ciclismo (Nagle e Brooks, 2011), corrida em roda (Newhall et al., 1991), saltos (Notomi et al., 2000) e corrida em esteira (Peng et al., 1994). Como tal, compreender como a microarquitetura óssea se adapta à tensão causada pelo treinamento de força é altamente relevante, sendo que a habilidade do osso em resistir à fratura é dependente de sua distribuição espacial (macro e microarquitetura) e não somente de sua massa óssea (Brandi, 2009). A acumulação de microdanos e alterações na morfologia causadas pelo envelhecimento são típicas do remodelamento prejudicado (Karim e Vashishth, 2011). Nossa avaliação por DEXA de todo o osso demonstrou reduzida DMOa em V/EX a qual de fato não significa que o TF não fora capaz de melhorar a massa óssea nestes animais. Em concordância com isto, já é conhecido que a resistência à fratura depende da quantidade de tecido mineralizado presente (tamanho e densidade, algumas vezes referidos como DMO) e vários outros fatores que estão relacionados à “qualidade óssea”. Estes fatores incluem composição (porcentagem de peso de cada componente), mineralização (organização do mineral e seu tamanho e perfeição dos cristalitos), ligações cruzadas de colágeno, conteúdo de colágeno, microarquitetura, presença de micro rachaduras e morfologia (Ruppel et al., 2008). A composição heterogênea do osso formado por estes fatores pode variar com o estado de saúde, doença e terapias farmacológicas. Entre outras alterações, o envelhecimento diminui a heterogeneidade desta composição induzindo o aumento dos tipos de ligações cruzadas de colágeno (enzimáticas e não enzimáticas) resultando em melhora da força mecânica (osso mais quebradiço) (Boskey, 2013). Portanto, para usar DMOa como único índice para se predizer o risco de fratura pode não ser adequado, tendo em vista que este inter-relacionamento pode ser desproporcional (Häussler et al., 2007; Seeman et al., 2008). As estimulações das tensões causadas pelo exercício estão ligadas ao envolvimento de moléculas de adesão celular como integrinas e caderinas. A primeira transduz sinais da matriz extracelular (MEC) para componentes extracelulares e vice- versa, o último agindo através de suas interligações com citoesqueletos de células vizinhas. A deformação da membrana celular e também o estresse de cisalhamento mediado pelo fluxo fluido nos canalículos dos osteócitos resulta em alterações nas ligações entre integrinas e MEC/ caderinas e células vizinhas, modificando a organização do citoesqueleto e a adesão de proteínas nas adesões focais e junções aderentes (Carvalho et al., 2003; Amizuka, 2016; Li et al., 2016). De fato, o citoesqueleto parece estar diretamente envolvido na regulação celular das concentrações de Ca2+. Quando força é aplicada, há acumulação de actina no córtex da submembrana sendo que este processo está profundamente ligado ao influxo de Ca2+. A ativação de canais de cálcio mecanossensíveis (Tipo ativado por alongamento, tipo AS) e voltagem sensíveis (tipo- L) antecipam a resposta das células ósseas para o estímulo mecânico (Laino et al., 2005; Robinson et al., 2010; Wen et al., 2012). Estes processos de influxo de Ca2+ e mobilização de estoques internos também tem a ativação de vias de sinalização envolvendo proteínas quinase como proteína quinase ativada por mitôgenio (AMPK), fosfosinositol-3-quinase (PI3K), proteína quinase A (PKA) e proteína quinase C (PKC) (Danciu et al., 2003; Ramage et al., 2009). A ativação destas proteínas converte força mecânica em sinal bioquímico. A regulação de genes envolvidos na mecanotransdução tem a ação de complexos multiproteicos chamados mecanossomos. Movendo-se entre os complexos de adesão e o núcleo, eles podem se ligar a sequências especificas nos genes promotores mecanossensíveis, regulando sua expressão (Pavalko, Gerard, et al., 2003; Pavalko, Norvell, et al., 2003; Bidwell e Pavalko, 2010b; a). Em nosso estudo, nós utilizamos o treinamento de força feito em escada adaptada para ratos, estratégia que já tem sido utilizada em outros estudos associados com junções neuromusculares de machos adultos e velhos (Deschenes et al., 2015), hipertensão (Anunciação et al., 2016), perda óssea em ratos obesos (Tang et al., 2016) ou perda óssea devido ao hipoestrogenismo/ envelhecimento (Stringhetta- Garcia et al., 2016; Singulani et al., 2017). Nosso programa de treinamento induziu melhoras na capacidade de carregamento voluntário máximo (Fig.1A), o qual resultou em peso corporal final mais baixos (Tabela – 1), similarmente com os resultados de Stotzer e colaboradores (Stotzer et al., 2015) em estudo com ratas ovariectomizadas que efetuaram sessões de escalada em escada. É importante notar as diferenças de resposta entre osso cortical e trabecular ao treinamento de força. Menor porosidade cortical e momento de inércia polar foram verificados nas ratas velhas que realizaram TF. A análise da porosidade cortical e a constatação de maior porcentagem deste parâmetro nos animais V/NEX evidencia aumento no número e tamanho dos poros pela aderência de cavidades de remodelamento adjacentes (como por exemplo, canais Haversianos), aumento na superfície disponível para remodelamento do córtex resultando em menor força e resistência óssea à compressão (Seeman, 2008). Sendo que esta perda óssea é reconhecida como processo de “trabecularização” do osso cortical, o TF surge como agente para evitar este processo no período do envelhecimento (Bala e Seeman, 2015; Bala et al., 2015). Adicionalmente, no processo do envelhecimento há menor momento de inércia polar (medida geométrica da resistência à compressão/ torsão), o qual resulta em força óssea cortical menor (Burstein et al., 1976; Augat e Schorlemmer, 2006; Malo et al., 2013). Nosso estudo demonstra que o momento de inércia polar foi reestabelecido em ratas velhas após TF. Tomados juntos tanto a melhora na porosidade cortical e no momento de inércia polar resulta em osso cortical mais fortalecido. Nossos resultados demonstram aumento na área cortical total, a qual pode estar relacionado à maior resposta do periósteo do que endocortical ao TF como similarmente observado em estudo com ratas ovariectomizadas (Notomi et al., 2003). Mais estudos investigando as propriedades do córtex ósseo são necessários, sendo que neste sítio ocorre significante diminuição óssea na idade avançada (Bala et al., 2015). Após o TF foi possível verificar respostas significantes para a maior parte dos parâmetros avaliados no osso trabecular. Os animais que realizaram TF apresentaram, na região do colo do fêmur, maior volume de tecido ósseo, maior número e espessamento de trabéculas. Isto resultou em menor separação entre trabéculas e elevado grau de anisotropia. É importante notar também, que a porosidade trabecular foi menor, a qual assegura que o osso possa ser mais resistente à fratura. O osso trabecular obteve maior volume ósseo do que o osso cortical, sendo assim exposto à maior remodelamento o qual resulta em perda óssea mais rápida do que o osso cortical (Seeman, 2008). É altamente importante ressaltar que as respostas analisadas para osso trabecular neste estudo tiveram interação predominante entre idade e treinamento na maior parte da avaliação. A melhora óssea em animais de 7 meses não é tão visível quanto em animais velhos. Animais adultos, que não têm seu turnover ósseo afetado pelo hipoestrogenismo, apresentam manutenção da massa óssea causada pelo TF. Por outro lado, em animais velhos, TF pode evitar a perda óssea durante o envelhecimento algumas vezes retornando alguns aspectos similarmente aos observados em animais adultos, o qual nos permite acertar que quanto mais precoce a aplicação do TF menos massa óssea será reduzida durante o período do envelhecimento. A realização do exercício físico, mais especificamente do TF, é das mais importantes intervenções para retardar a sarcopenia/ osteopenia e os eventos relacionados à esta condição como por exemplo, a osteoporose. Cada vez mais é possível associar os benefícios deste tipo de treinamento não somente aos parâmetros ósseos e musculares esqueléticos, mas também a melhora cognitiva e social de pessoas idosas. AKT é uma proteína reguladora mestre da longevidade, sendo estimulada por fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-1) e insulina (Houtkooper et al., 2010). Nossos resultados mostram que a quantidade total de AKT não foi modificada pelo treinamento mas reduziu a fosforilação de AKT em Ser473 em V/EX. AKT em Ser473 é fosforilada por mTORC2 e após sua ativação, transloca-se para o núcleo afetando a atividade de vários fatores transcricionais (Vadlakonda et al., 2013). Tem sido demonstrado que reduzir, mas não obliterar a atividade de AKT aumenta o tempo de vida de leveduras à mamíferos (O' Neill, 2013). Suas funções no envelhecimento relacionam-se inclusive a doenças como Alzheimer (Lee et al., 2009). AKT elevada em osteoblastos e osteoclastos demonstrou também levar à osteopenia por baixo turnover em ambas as células (Kawamura et al., 2007). Outros demonstraram que AKT pode prejudicar a transativação de BIM (potente pró-apoptótico em osteoblastos) pela fosforilação de FOXO3a (Tran et al., 2003). A ablação total de AKT também reduz a fertilidade e torna o animal menor em tamanho, além de diminuir a massa cortical e trabecular. Em osteoblastos, a deficiência de AKT causa três anormalidades celulares autônomas: aumentada susceptibilidade à apoptose, diferenciação e função suprimida e expressão reduzida de RANK-L para suportar a osteoclastogênese (Kawamura et al., 2007). O treinamento de força não sendo capaz de reduzir totalmente AKT, mas sim, de atenuar sua expressão no osso de ratas velhas demonstra ser benéfico, especificamente evitando os efeitos osteopênicos tanto de supressão como de sua amplificação elevadas. Agindo sinergisticamente com AKT está ERK1/2, ambos ativam mTORC1 o qual tem função inibitória sobre a autofagia (Winter et al., 2011). Em nosso estudo, ERK1/2 foi elevada em ratas velhas que fizeram treinamento de força, mas sua fosforilação foi reduzida em seu resíduo Tyr204, mas não reduziu a fosforilação em Thr202. ERK1/2 assim como AKT, estimula a proliferação celular sob influência de fatores de crescimento e, adicionalmente, sua sinalização regula autofagia e a expressão de genes lisossomais (Dibble e Manning, 2013). Tem sido demonstrado que ERK1/2, LC3 e p62 possuem interrelação, sugerindo crosstalk bidirecional entre ERK e autofagia, além de ERK se localizar na face extraluminal do autofagossomo (Kim et al., 2014; Kim e Lee, 2014). Adicionalmente, avaliamos por imunoistoquímica região do colo do fêmur que demonstrou que o TF aumentou a marcação para beclina-1, OCN e FAL em ambos os grupos adultas e velhas que realizaram TF. Também se constatou aumento da marcação para RUNX-2 em V/EX. As marcações para OCN e RUNX-2 corroboram com resultados de trabalho prévio de nosso grupo (Stringhetta-Garcia et al., 2016). Estes resultados demonstram que especificamente o colo do fêmur foi estimulado pelo TF, demonstrando a importância deste estímulo para maior atividade osteogênica nessa região, além de possivelmente estimular o início da atividade autofágica baseada na elevada marcação de beclina-1. Baseados nisso, visão clara sobre os benefícios do TF é importante para a população geral. Este estudo contribui para a compreensão de como o osso se adapta ao TF. Sem precedentes, nossos resultados demonstram respostas interessantes que o osso pode desenvolver para este tipo de estimulação no período da periestropausa/ perimenopausa. Em suma, nossos dados demonstram que o treinamento de força no modelo de ratas velhas foi efetivo na melhora da massa e estrutura óssea no colo do fêmur. Os resultados indicam que o TF é estratégia válida para manutenção da massa óssea no envelhecimento e previne essa perda temporal se aplicado precocemente. Essa redução na diminuição óssea pode estar intrinsicamente ligada à manutenção autofágica, de modo que a intervenção do TF foi capaz de regular positivamente a autofagia no tecido ósseo. Essas modificações parecem ser, pelo menos em parte, resultado da remodelação óssea mais equilibrada em ratas velhas. A utilização deste modelo em ratas pode levar à maior compreensão de como o exercício de força pode ser efetivo em aumentar a massa óssea e em mitigar a diminuição óssea associada à deficiência hormonal e a idade. CONCLUSÃO 4 CONCLUSÃO A compreensão dos mecanismos celulares responsáveis pela mecanotransdução no osso é essencial para o desenvolvimento de estratégias de exercício e farmacêuticas voltadas para o aumento e/ou prevenção da diminuição de massa em tecidos críticos no envelhecimento e hipoestrogenia. Com base nos resultados obtidos, redução da diminuição óssea pode estar intrinsicamente ligada à manutenção autofágica, de modo que a intervenção do TF foi capaz de regular a autofagia no tecido ósseo. Essas modificações parecem ser, pelo menos em parte, resultado da remodelação óssea mais equilibrada em ratas velhas. A utilização deste modelo em ratas pode levar à maior compreensão de como o exercício de força pode ser efetivo em aumentar a massa óssea e em mitigar a osteopenia durante o período de envelhecimento. Nosso estudo não só contribui, mas também confirma o potencial do treinamento de força como meio extremamente importante e estrategicamente exequível não somente como tratamento, mas como prevenção da osteoporose. Mostrando assim, que os efeitos do exercício físico, especialmente o treinamento de força não limitados pela idade. Além disso, adiciona e abre questionamentos de como é regulado o metabolismo ósseo a nível molecular pós – exercício através de importante meio de proteção e sobrevivência celular como a autofagia. REFERÊNCIAS AMIZUKA, N. 1. Morphological Implication on Cellular Response to Mechanical Stress in Bone. J Orthop Trauma, v. 30, n. 8, p. S2, Aug 2016. ISSN 1531-2291. Disponível em: < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27441762 >. ANIMALS, N. R. C. U. C. F. T. U. O. T. G. F. T. A. U. O. L., Ed. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: National Academies Press (US)ed. 2011. ANUNCIAÇÃO, P. G. et al. Blood pressure and autonomic responses following isolated and combined aerobic and resistance exercise in hypertensive older women. Clin Exp Hypertens, v. 38, n. 8, p. 710- 714, 2016 2016. ISSN 1525-6006. Disponível em: < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27936947 >. AUGAT, P.; SCHORLEMMER, S. The role of cortical bone and its microstructure in bone strength. 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