UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Gabriel Araujo Kurokawa Presença de meningioma e vias metabólicas refletidas em análise de biópsia líquida Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa. Dra. Estela de Oliveira Lima Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Camargo Ferrasi Botucatu 2023 Gabriel Araujo Kurokawa Presença de meningioma e vias metabólicas refletidas em análise de biópsia líquida Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa. Dra. Estela de Oliveira Lima Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Camargo Ferrasi Botucatu 2023 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA A. CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Kurokawa, Gabriel Araújo. Presença de meningioma e vias metabólicas refletidas em análise de biópsia líquida / Gabriel Araújo Kurokawa. - Botucatu, 2023 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Estela de Oliveira Lima Coorientador: Adriana Camargo Ferrasi Capes: 40101045 1. Biópsia Líquida. 2. Marcadores bioquímicos. 3. Meningioma. 4. Metabolômica. 5. Genes p53. Palavras-chave: Biópsia líquida; Biomarcadores; Meningioma; Metabolômica; TP53. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Botucatu ATA DA DEFESA PÚBLICA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE GABRIEL ARAUJO KUROKAWA, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA EM CLÍNICA MÉDICA, DA FACULDADE DE MEDICINA - CÂMPUS DE BOTUCATU. Aos 12 dias do mês de dezembro do ano de 2023, às 14:00 horas, por meio de Videoconferência, realizou-se a defesa de DISSERTAÇÃO DE MESTRADO de GABRIEL ARAUJO KUROKAWA, intitulada Investigação de biomarcadores para biópsia líquida e prognóstico de meningiomas. A Comissão Examinadora foi constituida pelos seguintes membros: Profa. Dra. ESTELA DE OLIVEIRA LIMA (Orientador(a) - Participação Virtual) do(a) Depto. de Clínica Médica / FM/Botucatu - Unesp, Prof. Dr. PEDRO TADAO HAMAMOTO FILHO (Participação Virtual) do(a) Depto. de Neurologia, Psicologia e Psiquiatria / FM/Botucatu - Unesp, Profa. Dra. SOPHIE FRANÇOISE MAURICETTE DERCHAIN (Participação Virtual) do(a) Depto. de Tocoginecologia / FCM/Campinas - Unicamp. Após a exposição pelo mestrando e arguição pelos membros da Comissão Examinadora que participaram do ato, de forma presencial e/ou virtual, o discente recebeu o conceito final:_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ . Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que após lida e aprovada, foi assinada pelo(a) Presidente(a) da Comissão Examinadora. Profa. Dra. ESTELA DE OLIVEIRA LIMA Faculdade de Medicina - Câmpus de Botucatu - Av.: Prof. Mário Rubens Guimarães Montenegro, s/nº, 18618687, Botucatu - São Paulo http://www.fmb.unesp.br/pgclinicamedicaCNPJ: 48.031.918/0019-53. APROVADO Digitally signed by Estela De Oliveira Lima:05989880685 Date: 2023.12.12 14:51:28 -06'00' Registro do Impacto Esperado Espera-se, com o presente estudo, contribuir com a compreensão e elucidação das possíveis vias metabólicas que se encontram alteradas nos pacientes portadores de meningioma quando comparadas a indivíduos saudáveis, através da identificação de moléculas representativas do estado patológico em questão. With the following study, we hope to contribute with the comprehension and elucidation of the metabolic pathways that might be altered in meningioma patients when compared to healthy individuals, through the identification of the representative molecules of the referred pathological state. DEDICATÓRIA Aos meus pais, Raquel e Sergio, por todo apoio incondicional, por sempre acreditarem em mim e nos meus sonhos, pela presença nas derrotas e nas conquistas, pelas conversas e conselhos. Amo vocês acima de tudo! Aos grandes amigos que fiz durante essa jornada, espalhados pelo Brasil e pelo mundo, que choram minhas tristezas e sorriem minhas alegrias. Vocês foram e são fundamentais para que eu possa seguir em frente. A todos os professores que passaram pela minha vida e me ensinaram sobre a importância da educação. Como disse Rubem Alves: “Ensinar é um exercício de imortalidade. De alguma forma continuamos a viver naqueles cujos olhos aprenderam a ver o mundo pela magia da nossa palavra. O professor, assim, não morre jamais.”; por isso, levarei cada um de vocês comigo até meus últimos dias. AGRADECIMENTOS À toda a equipe do Laboratório de Análises Moleculares e Neuro-Oncologia, em especial minha orientadora, Profª. Drª. Estela de Oliveira Lima, e coorientadora, Profª. Drª. Adriana Camargo Ferrasi, por me ensinarem a fazer ciência e por sempre estarem presentes durante minha formação. À Faculdade de Medicina de Botucatu, pela disponibilidade dos excelentes recursos técnicos, acadêmicos e financeiros necessários durante todo o processo. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo financiamento fornecido durante o Mestrado. “Eu não quero acreditar, eu quero saber.” Carl Sagan LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Análise dos marcadores por PLS-DA .................................................. 18 Figura 2 – VIP (Variable Importance in Projection) Score .................................. 19 Figura 3 – Volcano Plot ........................................................................................ 21 Figura 4 – Curva ROC para os metabólitos selecionados .................................... 22 Figura 5 – Amplificação por tetra-primer ARMS-PCR e eletroforese.................. 24 Figura 6 – Análise dos polimorfismos R248Q e R273H em p53 .......................... 25 Figura 7 – Análise da acurácia do metabólito 5-hidroximetiluracil ...................... 27 Figura 8 – Análise da acurácia do metabólito 3-O-sulfogalactosilceramida ......... 29 Figura 9 – Análise da acurácia do metabólito gangliosídeo GA2 ......................... 31 Figura 10 – Análise da acurácia dos metabólitos identificado................................32 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Características epidemiológicas............................................................17 Tabela 2 – Fold Change, Log2(FC) e VIP dos metabólitos selecionados ............. 20 Tabela 3 – Marcadores plasmáticos indicativos de presença de meningioma...... 23 SUMÁRIO 1. Introdução .......................................................................................................... 1 1.1. Meningiomas .................................................................................................... 1 1.2. Metabolômica ................................................................................................... 5 1.3. Metabolismo e TP53......................................................................................... 6 2. Hipótese ......................................................................................................... 10 3. Justificativa ................................................................................................... 11 4. Objetivos ....................................................................................................... 12 4.1. Gerais ............................................................................................................. 12 4.2. Específicos ...................................................................................................... 12 5. Materiais e Métodos ..................................................................................... 13 5.1. Casuística ....................................................................................................... 13 5.2. Critérios de inclusão ...................................................................................... 13 5.3. Critérios de exclusão ...................................................................................... 13 5.4. Preparo da amostra ....................................................................................... 14 5.5. Análise do perfil de metabólitos por espectrometria de massas .................... 14 5.6. Análise estatística ........................................................................................... 15 5.7. Análise de polimorfismos em p53 .................................................................. 15 6. Resultados ..................................................................................................... 16 6.1. Características epidemiológicas .................................................................... 16 6.2. Perfil diferencial de metabólitos .................................................................... 17 6.3. Detecção de polimorfismos em p53 ............................................................... 23 7. Discussão ....................................................................................................... 26 7.1. 5-Hidroximetiluracil....................................................................................... 26 7.2. 3-O-Sulfogalactosilceramida (d18:1/24:0) .................................................... 27 7.3. Gangliosídeo GA2 (d18:1/18:0)..................................................................... 29 7.4. Polimorfismos em p53 .................................................................................... 33 8. Conclusão ...................................................................................................... 34 9. Referências .................................................................................................... 35 10. Anexos ........................................................................................................... 44 10.1. Anexo I...........................................................................................................45 10.2. Anexo II..........................................................................................................55 RESUMO Os meningiomas (MGM) representam o tipo mais comum de tumor primário do SNC, abrangendo cerca de 36% dos casos. Segundo a Organização Mundial da Saúde, são histologicamente classificados em tumores graus 1, 2 e 3 de acordo com seu grau de malignidade, além da incorporação de marcadores moleculares que auxiliam no diagnóstico, prognóstico e graduação dos meningiomas. O presente estudo foi realizado com o intuito de identificar biomarcadores capazes de indicar a presença da doença, bem como complementar as análises metabolômicas através da análise de mutações em p53, visando a identificação de marcadores que possam estar associados a tumores recidivantes. Para as análises metabolômicas, foram coletadas amostras de plasma de 51 pacientes portadores de meningioma e 50 indivíduos saudáveis devidamente pareados por idade e sexo. De acordo com os valores de massa/carga (m/z), as moléculas foram identificadas através da busca em bancos de dados de metabólitos e pesquisa na literatura científica. Dessa forma, os metabólitos selecionados com potencial para atuar como marcadores indicativos de meningioma incluem hidroximetiluracil (m/z 143), sulfatídeo (m/z 931) e gangliosídeo (m/z 1116). As análises dos valores de área sob a curva (AUC – Area Under the Curve) ROC para as moléculas identificadas mostraram um excelente potencial do metabólito hidroximetiluracil (AUC = 0,93) em indicar a presença de meningioma. Para as análises de polimorfismos em p53, foi utilizada a técnica tetra- primer ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) para detecção das mutações R248Q e R273H, visando estabelecer uma possível correlação entre os polimorfismos e a recidiva tumoral. Todos os pacientes analisados apresentaram genótipo homozigoto G/G (selvagem) para ambos os polimorfismos estudados, sugerindo o não envolvimento das mutações nas recidivas da doença. ABSTRACT Meningiomas (MGM) represent the most common primary central nervous system tumors, accounting for around 36% of all cases. According to the World Health Organization, meningiomas are histologically classified according to their malignancy levels in tumoral grades 1, 2 and 3, besides the incorporation of molecular biomarkers to aid meningiomas diagnosis, prognosis, and classification. The present study aimed to identify potential tumor related biomarkers, as well as biomarkers that might be associated with tumor recurrence through analysis of p53 mutations in meningioma patients. For the metabolomics analysis, blood plasma was collected from 51 meningiomas patients and 50 healthy individuals properly matched by gender and age. According to the mass-to-charge (m/z) ratios, the molecules were identified through research at the metabolites databases and the scientific literature. The selected metabolites with potential to act as meningioma biomarkers include hydroxymethyluracil (m/z 143), sulfatide (m/z 931), and ganglioside (m/z 1116). The analyses of the area under the ROC curves of the identified molecules suggested a excellent potential for hydroxymethyluracil (AUC = 0.93) to indicate presence of meningioma. For the p53 polymorphisms analysis, a tetra-primer ARMS-PCR method was performed for the detection of R248Q and R273H mutations, aiming to establish the potential role of the polymorphisms at tumor recurrence. All patients analyzed presented a homozygous G/G genotype (wild-type) for both polymorphisms, suggesting no involvement of the mutations in tumor recurrence. 1 1. Introdução 1.1. Meningiomas Os meningiomas representam o tipo de tumor primário intracraniano mais comum, correspondendo a cerca de 36% dos casos (BENSON et al., 2008; FATHI; ROELCKE, 2013; WANG; OSSWALD, 2018). Originam-se a partir das células aracnoides das leptomeninges (MASHAYEKHI; SABERI; MASHAYEKHI, 2018; WIEMELS; WRENSCH; CLAUS, 2010), sendo a maioria benigno (FATHI; ROELCKE, 2013; MAROSI et al., 2008) e de crescimento lento (BENSON et al., 2008; BUERKI et al., 2018). Ocorrem principalmente entre os 60 e 70 anos (LAMSZUS, 2004; MAROSI et al., 2008; WANG; OSSWALD, 2018), aumentando a probabilidade de desenvolvimento com o aumento da idade (WIEMELS; WRENSCH; CLAUS, 2010). Geralmente, são tumores altamente vascularizados, com maior predisposição de ocorrer em mulheres (BENSON et al., 2008; BUERKI et al., 2018; FATHI; ROELCKE, 2013; LAMSZUS, 2004; MAROSI et al., 2008; WANG; OSSWALD, 2018). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), os meningiomas são classificados em graus 1, 2 e 3 a partir de critérios histológicos. Os meningiomas grau 1, também chamados de benignos, correspondem a 80-90% dos casos de meningioma (FATHI; ROELCKE, 2013; MASHAYEKHI; SABERI; MASHAYEKHI, 2018) e costumam apresentar crescimento lento (BENSON et al., 2008; MAROSI et al., 2008), podendo haver mitoses ocasionais e núcleos pleomórficos (LAMSZUS, 2004). Apresentam bom prognóstico, com taxa de recorrência entre 7% e 25% (LAMSZUS, 2004; WANG; OSSWALD, 2018), e baixo risco de apresentar comportamento agressivo. Nos meningiomas grau 2, ou atípicos, são observados atividade mitótica aumentada ou pelo menos três dos seguintes critérios patológicos: aumento da celularidade, células pequenas com elevada razão núcleo/citoplasma, nucléolo proeminente, focos de necrose espontânea e laminação. Porém, caso haja invasão do tecido cerebral, mesmo na ausência das demais características, o tumor pode ser classificado como grau 2. As taxas de prevalência e recorrência dos meningiomas grau 2 são, respectivamente, 20-25% e 29-52%. Por fim, os meningiomas grau 3, ou anaplásicos, apresentam 2 atividade mitótica excessivamente elevada, necrose extensiva, metástase, altas taxas de invasão cerebral e características de malignidade muito além das anormalidades dos tumores atípicos. São tumores malignos, com prognóstico desfavorável e representam de 1 a 3% dos meningiomas, com recorrência entre 50 e 94% dos casos (FATHI; ROELCKE, 2013; LAMSZUS, 2004; MAROSI et al., 2008; WANG; OSSWALD, 2018). Apesar de serem tumores predominantemente benignos, os meningiomas de alto grau apresentam taxas de mortalidade relativamente elevadas, com estimativas de 10 anos de sobrevida em torno de 53% para tumores anaplásicos e 0% para tumores malignos (MAGGIO et al., 2021), ressaltando a importância do diagnóstico assertivo e da correta caracterização dos graus da doença para o prognóstico dos pacientes. Além dos critérios anatomopatológicos, foram incorporados biomarcadores moleculares à última classificação dos tumores de Sistema Nervoso Central provida pela OMS (LOUIS et al., 2021), auxiliando tanto na classificação mais acurada dos tumores quanto no fornecimento de informações diagnósticas e prognósticas mais precisas a respeito da doença. De acordo com a nova classificação, entre os principais marcadores moleculares que podem ser utilizados no diagnóstico e graduação dos meningiomas estão NF2, SMARCE1, BAP1, mutações KLF4/TRAF7, perfil de metilação do DNA, mutação do promotor TERT e deleção homozigota de CDKN2A/B (LOUIS et al., 2021). Dentre os marcadores moleculares, dois apresentam evidências que permitem a associação com o grau histológico do tumor e prognóstico do paciente: mutação do promotor TERT e deleção homozigota de CDKN2A/B, sendo a detecção de um deles suficiente para o diagnóstico de meningioma maligno (NASRALLAH; ALDAPE, 2023). O gene TERT codifica a subunidade catalítica da telomerase, cuja atividade permanece silenciada na maioria dos tecidos (BELL et al., 2016). Porém, mutações em sua região promotora aumentam a expressão do gene e, consequentemente, contribuem com a imortalização de células cancerígenas através da elongação constante de seus telômeros (SAHM et al., 2016), uma das principais características da tumorigênese (HEIDENREICH; KUMAR, 2017). Mutações na região promotora de TERT já foram associadas à maiores probabilidades de recidiva, tanto 3 em pacientes portadores de meningiomas graus 1 e 2 quanto naqueles portadores de meningiomas malignos, revelando uma prognosticação independente dos critérios histológicos adotados pela Organização Mundial da Saúde (MIRIAN et al., 2020; SAHM et al., 2016), além de estarem diretamente associadas a maiores riscos de progressão tumoral (GOUTAGNY et al., 2014) e menor sobrevivência (MIRIAN et al., 2020), com a frequência das mutações aumentando de acordo com a idade e o grau de malignidade da doença (KOELSCHE et al., 2013). Dessa forma, o status do promotor TERT apresenta bom potencial para ser utilizado como ferramenta prognóstica nos meningiomas, atuando na identificação de subgrupos com menor tempo para recorrência e sobrepondo-se às limitações intrínsecas à classificação histológica dos tumores (SAHM et al., 2016). Os genes CDKN2A e CDKN2B, localizados no cromossomo 9p21, são importantes supressores tumorais frequentemente mutados em diversos cânceres humanos e responsáveis por codificar as proteínas p16 e p15, respectivamente, que atuam como reguladoras da transição G1/S no ciclo celular (BOSTROM et al., 2001; RUAS; PETERS, 1998). Deleções homozigotas em CDKN2A/B são frequentemente encontradas em meningiomas anaplásicos e raramente presentes nos tumores benignos e atípicos, revelando uma possível participação na progressão da doença (BOSTROM et al., 2001; GOUTAGNY et al., 2010; PERRY et al., 2002; WEBER et al., 1997). Ainda, a alterações genômica em questão já foi associada a tumores com caráter de maior malignidade e, consequentemente, pior prognóstico, como maiores probabilidades de recidivas e menor sobrevivência (GUYOT et al., 2019; PERRY et al., 2002; SIEVERS et al., 2020). Dessa forma, a detecção de mutações em 9p21 tem potencial para atuar como um marcador prognóstico independente na identificação de meningiomas mais agressivos e com tendência a recidivas mais precoces (SIEVERS et al., 2020). Assim, com essa nova abordagem histopatológica e molecular para aplicação clínica, observa-se que a busca por marcadores moleculares mais assertivos e de fácil análise se torna cada vez mais necessária. Além dos métodos analíticos laboratoriais supracitados para classificação tumoral, os principais métodos radiológicos para diagnóstico de meningioma são a 4 ressonância magnética (RM) e a tomografia computadorizada (TC). Devido à alteração da barreira hematoencefálica nos meningiomas, as imagens obtidas por RM apresentam forte contraste; porém, não permitem determinar o grau histológico e o potencial de crescimento tumoral. Já nas imagens por TC, são obtidas informações sobre a hiperostose, destruição óssea e infiltração causadas pela doença, além de detectar calcificação tumoral, um prognóstico de crescimento lento, especialmente em pacientes mais velhos. Portanto, para um bom planejamento a respeito da melhor opção de tratamento, a combinação de ambos os métodos parece ser a melhor escolha (BUERKI et al., 2018; FATHI; ROELCKE, 2013; MAROSI et al., 2008; WANG; OSSWALD, 2018). Meningiomas assintomáticos são, na maioria, descobertos de forma incidental, e geralmente são acompanhados através de exames rotineiros de imagem. São direcionados para tratamento quando surgem os primeiros sintomas, ou quando se detecta crescimento considerável ou invasão de tecidos adjacentes, situações em que o tratamento recomendado é a ressecção cirúrgica e/ou radioterapia. Outra opção de tratamento é a terapia sistêmica, recomendada apenas para meningiomas recidivos quando cirurgia e radioterapia não são possíveis. Devido à alta vascularização, uma opção de tratamento sistêmico promissor é a inibição da angiogênese pelo interferon (IFN), capaz de inibir a proliferação das células do meningioma in vitro (BUERKI et al., 2018; MAROSI et al., 2008; WANG; OSSWALD, 2018). Embora as opções de tratamento, de forma geral, sejam capazes de ajudar os pacientes, as chances de cura aumentam quanto mais precoce for o diagnóstico. Porém, as técnicas atualmente disponíveis para diagnóstico e identificação de graus de tumores são dispendiosas e podem não indicar precocemente a progressão da doença para estágios de maior malignidade (BUERKI et al., 2018; NOWOSIELSKI et al., 2017). Visando o entendimento das alterações metabólicas que possam estar associadas ao processo de formação de meningiomas, a identificação de biomarcadores surge como uma possível ferramenta com potencial para indicar presença da doença, os quais podem ser detectados através de diferentes técnicas, dentre elas a metabolômica. 5 1.2. Metabolômica Metabólitos são moléculas de baixo peso molecular (< 1500 Da) produzidas pelo metabolismo das células dos sistemas biológicos e responsáveis por desempenhar diversas funções, como transdução de sinais e produção de energia, por exemplo. Por serem capazes de fornecer informações sobre os organismos e definirem seus fenótipos frente a mudanças genéticas ou ambientais, há o interesse em determinar suas funções específicas e entender seus papéis biológicos (JOHNSON; IVANISEVIC; SIUZDAK, 2016; KIM et al., 2016). O estudo do conjunto de metabólitos que compõem as células, tecidos e fluidos biológicos (metaboloma) é denominado Metabolômica. Quando comparados aos genes e proteínas, os metabólitos apresentam maior facilidade para serem rastreados devido às suas características estruturais mais simples e pelo fato de estarem prontamente disponíveis para detecção, graças à ampla disponibilidade dessas moléculas nos organismos (GUIJAS et al., 2018). Além disso, por basear-se na análise de metabólitos, a metabolômica representa a ciência “ômica” que mais se aproxima dos fenótipos dos organismos estudados (GUIJAS et al., 2018). Trata-se de uma técnica rápida e eficaz na seleção de metabólitos envolvidos em doenças humanas, o que os torna biomarcadores com potencial para a detecção de distúrbios, até mesmo no estágio pré-doença. A técnica já vem sendo usada para identificação de moléculas em diferentes situações, tanto para estudos de biologia de sistemas, quanto para detecção de biomarcadores que possam estar relacionados a determinadas doenças metabólicas (LI et al., 2017), como diabetes (WANG et al., 2011), obesidade (NI et al., 2015) e cânceres (MEDINA et al., 2014). A partir da identificação de biomarcadores pela metabolômica, abrem-se novas oportunidades para o desenvolvimento de diferentes alternativas em saúde, como novos testes diagnósticos, novos fármacos e terapias para prevenção de doenças crônicas, bem como tratamentos individuais e personalizados de acordo com os fenótipos dos pacientes, buscando a melhor resposta metabólica do organismo (JOHNSON; IVANISEVIC; SIUZDAK, 2016; MEDINA et al., 2014). Na tentativa de identificar novos biomarcadores, a metabolômica exploratória (ou metabolômica sem alvo específico) vem contribuir com a identificação da maior 6 quantidade possível de metabólitos, visando a seleção de moléculas importantes de acordo com a condição de cada amostra. Para tais análises, a principal ferramenta analítica utilizada é a espectrometria de massas, uma técnica bastante sensível para detecção de moléculas em amostras biológicas, como urina ou plasma/soro sanguíneos, os quais podem ser obtidos por meios minimamente invasivos e que apresentam grandes quantidades de metabólitos detectáveis (CHEN et al., 2023; GUIJAS et al., 2018; KIM et al., 2016; MEDINA et al., 2014). Particularmente, o plasma/soro sanguíneo, por irrigarem a maioria dos tecidos, apresenta moléculas representativas de diversas patologias que ainda não se manifestaram clinicamente, evidenciado um ótimo exemplo do potencial de aplicação das análises em biópsia liquida na rotina laboratorial. A espectrometria, trata-se, portanto, de uma técnica útil para identificar biomarcadores e gerar hipóteses, sendo que os marcadores poderão ser futuramente utilizados no desenvolvimento de novos métodos diagnósticos ou até mesmo se tornar alvos terapêuticos. 1.3. Metabolismo e TP53 Alterações metabólicas são muito comuns em células tumorais e apresentam um importante papel na manutenção do câncer, através da ativação de oncogenes e/ou inativação de genes supressores tumorais. Diante disso, o estudo de como as vias bioquímicas são controladas vem revelando contribuições interessantes de oncoproteínas e proteínas supressoras tumorais bem conhecidas, como a p53. O gene TP53 é o gene mais comumente mutado nos cânceres humanos (~50%) e suas principais funções incluem a regulação da divisão celular, manutenção da estabilidade genômica e indução de apoptose e senescência, desempenhando, portanto, um importante papel na regulação metabólica das células (LIU et tal., 2019; MAO; JIANG, 2023; WANG; STRASSER; KELLY, 2022). Nesse contexto, alterações no gene TP53 que levem à disfunção da proteína são as mais comumente encontradas nos cânceres humanos (LEVINE, 2020). Cerca de 70% das mutações observadas em TP53 são mutações missense, ou seja, a substituição de um único nucleotídeo dentro da sequência codificadora da proteína (KLEMKE et al., 2021), resultando na regulação dominante negativa da proteína p53 selvagem pela proteína 7 mutada (DONEHOWER et al., 2019). Além disso, algumas mutações missense em p53 foram associadas a ganho de funções oncogênicas (MULLER; VOUSDEN, 2013, 2014). Cerca de 80% das mutações missense da proteína p53 ocorrem no domínio de ligação ao DNA, sendo que 25% delas são encontradas nos códons 175, 245, 273, 248 e 249 (FULCI; VAN MEIR, 1999; SUN et al., 2020). Os polimorfismos de interesse, localizados nos códons hotspots 248 e 273, são ambos bem estudados em diversos tumores e já tendo sido associados a características de maior malignidade e agressividade, como proliferação, maior predisposição à metástase, migração, caráter invasivo, resistência contra fármacos e diminuição da sobrevivência (GAO et al., 2022; KLEMKE et al., 2021; LI et al., 2014; NAKAZAWA et al., 2019; SCHULZ-HEDDERGOTT et al., 2018; SUN et al., 2020; WANG et al., 2015). Embora estudos a respeito do papel de p53 em meningiomas sejam escassos, diferentes autores relataram a superexpressão da proteína nesses tumores, podendo haver uma relação direta entre a expressão de p53, o grau histológico e a taxa de recorrência do tumor (AMATYA et al., 2001; CHO et al., 1999; CHOZICK et al., 1996; KAMEI et al., 2000; OHKOUDO et al., 1998; RAO et al., 2009), indicando a possibilidade da proteína p53 ser utilizada como um marcador para transformação maligna em meningiomas (WANG et al., 1995). Além disso, a expressão de p53 também se mostrou útil para identificação de meningiomas que, apesar de serem classificados histologicamente como benignos, apresentaram recidivas tumorais associadas à superexpressão da proteína e características de malignidade (RAO et al., 2009). Embora a possível mutação não tenha sido investigada nesses casos, a proteína pode se acumular por se tratar de uma molécula anormal e estável, provocado possivelmente por mutação no gene TP53 (PAVELIN et al., 2013; RAO et al., 2009). A proteína p53 mutada pode apresentar maior estabilidade devido à ligação com proteínas do maquinário das chaperonas, que inativam outras proteínas envolvidas na degradação mediada por proteassomos, como a MDM2. Dessa forma, há o acúmulo de p53 mutada com funções oncogênicas (MANTOVANI; COLLAVIN; DEL SAL, 2019; SCHULZ-HEDDERGOTT; MOLL, 2018; WIECH et al., 2012). Logo, o acúmulo da proteína pode ser uma indicação de mutação em 8 TP53. Além das alterações quantitativas e constitutivas representarem fatores importantes no câncer, também podem impactar a resposta e a regulação celular frente a situações de estresse metabólico, ou até mesmo contribuir para alterações em vias metabólicas associadas à tumorigênese, pois a p53 também tem surgido como um importante protagonista no metabolismo celular (VOUSDEN; RYAN, 2009). Resultados do nosso grupo de pesquisa (KUROKAWA et al., 2023 – Anexo II) sugerem que alterações no metabolismo das ceramidas estão associadas à pior prognóstico em pacientes com meningioma (MGM), as quais foram encontradas em indivíduos MGM graus 2 e 3. Alguns pesquisadores têm investido esforços para desvendar a possível associação entre a proteína p53 e a ceramida. De fato, os níveis intracelulares de ceramida parecem ser regulados de forma dependente de p53 (DBAIBO et al., 1998). Ainda, a formação de ceramida e consequente indução de morte celular parecem depender da proteína p53 funcional (KIM et al., 2002; SAWADA et al., 2001), indicando que mutações missense em p53 podem prejudicar os processos de formação de ceramida e de indução de apoptose de células tumorais. Sendo assim, a superexpressão da proteína selvagem aparenta estar relacionada ao acúmulo do lipídio, desempenhando assim uma função supressora mais intensa (SAWADA et al., 2001). Se assim o for, resultados preliminares sugerem que TP53 possa apresentar mutações associadas ao menor controle do metabolismo de ceramidas, já que os resultados indicam perda de ceramidas nos maiores graus do tumor. Considerando que o papel exato dos polimorfismos na fisiopatologia da doença e reincidência dos meningiomas ainda não está bem estabelecido, ressalta-se a importância desses dados para o entendimento da evolução da doença, uma vez que a detecção dessas mutações pode apresentar potencial como marcador de prognóstico para os pacientes. Portanto, as análises moleculares para detecção dos polimorfismos em hotspots de p53 nos indivíduos portadores de meningioma podem complementar as análises metabolômicas do plasma dos pacientes na busca por marcadores que indiquem a possibilidade de recidiva tumoral. A partir dessa verificação, é possível, em caso de correlação positiva, propor o uso de técnicas 9 moleculares para análise de mutação e potencial ferramenta prognóstica para meningiomas. 10 2. Hipótese Pacientes portadores de meningioma apresentam alterações metabólicas relacionadas ao desenvolvimento da doença, as quais podem ser detectadas através de análises metabolômicas do plasma desses indivíduos, resultando na identificação de biomarcadores diferenciais indicativos da presença de meningioma. Além disso, mutações missense no gene TP53 podem estar associadas a maiores chances de recidivas nesses pacientes. 11 3. Justificativa Considerando que o diagnóstico assertivo e a correta identificação dos graus de malignidade dos tumores do Sistema Nervoso Central são fundamentais para melhor definir a abordagem terapêutica, melhorar a qualidade de vida e aumentar a sobrevida do paciente, métodos mais acessíveis, minimamente invasivos e capazes de identificar as fases iniciais do desenvolvimento da doença, bem como identificar assertivamente seu grau histopatológico, são necessários para o sistema de saúde. Para atender a esses critérios, a identificação de novos biomarcadores moleculares que indiquem a presença de meningioma é essencial para o entendimento das vias metabólicas que se encontram alteradas nos pacientes. 12 4. Objetivos 4.1. Gerais Determinar o perfil de metabólitos diferenciais de pacientes portadores de meningioma comparado a um grupo de indivíduos saudáveis, visando a busca de marcadores capazes de indicar a presença da doença, possibilitando o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da doença. Ainda, detectar polimorfismos em p53, com o intuito de estabelecer possíveis correlações entre as mutações e o processo de recidiva dos tumores. 4.2. Específicos • Análise do perfil de metabólitos em amostras de plasma de pacientes portadores de meningioma e de doadores saudáveis; • Seleção e identificação dos principais marcadores diferenciais entre os grupos; • Proposição das vias bioquímicas possivelmente envolvidas na fisiopatologia da doença; • Detecção de polimorfismos em hotspots de TP53 nos pacientes portadores de meningioma e, em caso positivo, correlacioná-los com o processo de recidiva dos tumores. 13 5. Materiais e Métodos 5.1. Casuística O presente estudo faz parte de um estudo prévio que já se encontra aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (parecer 4.896.170 – Anexo I). Para esta pesquisa, foram analisadas amostras de sangue periférico de 50 doadores saudáveis e 51 pacientes portadores de diferentes graus de meningioma (grau 1 = 43; grau 2 = 5; grau 3 = 3), pareados por idade e sexo, para a comparação dos perfis de metabólitos diferenciais. Além do sangue, o estudo propõe a análise por biologia molecular de tecido tumoral (n = 45) proveniente de biópsia durante a cirurgia de ressecção. 5.2. Critérios de inclusão I – Presença ou suspeição de meningiomas com indicação neurocirúrgica formal; II – possibilidade de coleta de 4 mL de sangue total do paciente durante procedimento cirúrgico, sem prejuízo ao paciente ou outros exames necessários; III – possibilidade de coleta de fragmentos tumorais (3 mm3) durante o procedimento cirúrgico, sem que haja qualquer prejuízo ao exame histopatológico ou a outros que porventura sejam necessários; IV – expresso entendimento e concordância em participar do estudo, manifestada pelo paciente ou pelo seu responsável legal, previamente à cirurgia, através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). 5.3. Critérios de exclusão I – Pacientes que reconhecidamente apresentarem neoplasias de origens diversas às previamente estabelecidas; II – pacientes com tumores primários do SNC recidivantes previamente tratados com radioterapia e/ou quimioterapia de qualquer modalidade; III – pacientes com tumores pequenos, dos quais se obtenha material escasso ou insuficiente para o estudo histopatológico e/ou outros exames necessários; IV – pacientes ou responsáveis legais que não tenham conseguido compreender suficientemente as diretrizes da pesquisa ou que tenham se negado a participar do estudo, conforme estabelecido no Termo de Consentimento Livre e 14 Esclarecido (TCLE). 5.4. Preparo da amostra Para a análise metabolômica, o sangue dos participantes foi coletado em tubo contendo EDTA (1,5 mg/mL de sangue) e submetido à centrifugação para coleta do plasma. Em seguida, o plasma foi submetido à extração dos metabólitos, sendo que 20 µL de cada amostra foram diluídos em 200 µL de Tetrahidrofurano (THF) e 780 µL de Metanol grau HPLC. Essa solução foi centrifugada e o sobrenadante novamente diluído na proporção de 1:9 em Metanol grau HPLC (q.s.p. 500 µL) e homogeneizada. Para a ionização química desta solução final foi adicionado ácido fórmico (grau analítico) a 0,1%, conforme descrito por MELO et al. (2017). 5.5. Análise do perfil de metabólitos por espectrometria de massas Após a extração dos metabólitos e ionização, as amostras foram diretamente injetadas no equipamento ESI-LTQ-XL (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) de acordo com os seguintes parâmetros: fluxo da amostra de 10 µL/min, temperatura do capilar de 180 ºC, 7kV de tensão no spray e gás de arraste em 2 unidades arbitrárias. A análise foi realizada no modo positivo, sendo que a faixa de massa utilizada abrangeu 100-1400 m/z e foram feitas 10 replicatas analíticas para cada replicata biológica. Para a aquisição e processamento dos dados no espectrômetro, foi utilizado o software XCalibur (v. 2.4, Thermo Scientific, San Jose, CA). A partir da seleção das relações massa/carga pela análise estatística, os marcadores foram submetidos à fragmentação (espectrometria de massas in tandem) para verificação estrutural, utilizando para tal o software Mass Frontier (v. 6.0, Thermo Scientific, San Jose, CA). Esta análise foi a base para a verificação da identidade molecular, definida a partir de consultas a bancos de dados especializados, como METLIN, Human Metabolome Database (HMDB) e LIPID MAPS, e consultas à literatura científica, permitindo a proposição de vias bioquímicas relacionadas à fisiopatologia da doença e o melhor entendimento dos processos fisiopatológicos responsáveis pelo desenvolvimento dos meningiomas. 15 5.6. Análise estatística Devido às diferenças de metabólitos entre os grupos, as amostras foram analisadas in sílico utilizando ferramentas de biologia de sistemas, dentre elas a plataforma MetaboAnalyst 5.0 (PANG et al., 2021). O poder preditivo dos marcadores foi determinado utilizando a ferramenta estatística PLS-DA, que visa a separação dos grupos de acordo com os marcadores diferenciais. A seleção dos marcadores foi realizada com base nos valores de p < 0,05 (definido para o teste- T), VIP Score e de Fold Change (FC). A partir da curva ROC gerada para o grupo de metabólitos identificados foi possível confirmar o potencial discriminatório dos mesmos através da análise dos valores de área sob a curva (AUC – Area Under the Curve), interpretados da seguinte maneira (NAHM, 2022): AUC = 0,5 ➔ resultado aleatório; não há discriminação; 0,6 ≤ AUC < 0,7 ➔ baixo poder discriminatório; 0,7 ≤ AUC < 0,8 ➔ poder discriminatório razoável; 0,8 ≤ AUC < 0,9 ➔ bom poder discriminatório; 0,9 ≤ AUC ≤ 1 ➔ poder discriminatório excelente. 5.7. Análise de polimorfismos em p53 O tecido tumoral (n = 45) dos pacientes cujas amostras de plasma foram analisadas pelas técnicas metabolômicas foi submetido à extração de DNA utilizando o kit DNeasy® Blood and Tissue (Qiagen), seguindo as recomendações do fabricante. O DNA foi avaliado quanto à pureza e concentração através de espectrofotometria por meio de NanoDrop ND-1000. Os polimorfismos G743A e G818A (nucleotídeos 743 e 818, com alteração de uma guanina para um adenina) presentes, respectivamente, nos hotspots R248Q [NM_000546.6(TP53):c.743G>A (p.Arg248Gln)] e R273H [NM_000546.6(TP53):c.818G>A (p.Arg273His)] (aminoácidos 248 e 273, com alteração de arginina para, respectivamente, glutamina e histidina) foram avaliada pela técnica tetra primer ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction). Para R248Q, os primers externos (outer) Forward – 5’ACTCCAGCCTGGGCGACAG3’ e Reverse – 16 5’TAAGAGGTGGGCCCAGGGG 3’ amplificaram um segmento comum a todas as amostras de DNA de 313 pb, atuando como o controle positivo para a reação. Já os primers internos (inner) Forward – 5’CATGGGCGGCATGAAACG 3’ e Reverse – 5’ ATGGTGAGGATGGGCCGCT 3’ amplificaram fragmentos alelo- específicos de, respectivamente 140 pb em indivíduos selvagens (alelo G) e 210 pb em indivíduos mutados (alelo A). A PCR foi realizada em volume final de reação de 20 µL, contendo 1 pmol de cada primer externo, 10 pmol de cada primer interno, 0,15 mM de dNTP, 1,875 mM de MgCl2 e 0,75 U de Taq polimerase. A solução foi incubada por 2 minutos a 95 ºC, seguido por 36 ciclos de 1 minuto de desnaturação (95 ºC), 1 minuto de anelamento (62 ºC) e 1 minuto de extensão (72 ºC), além de uma etapa adicional de extensão por 2 minutos a 72 ºC. Da mesma forma, para R273H, os primers externos Forward – 5’TCCTTACTGCTCCCACTCAG 3’ e Reverse – 5’GCATAACTGCACCCTTGGT 3’ amplificaram fragmentos comuns de 392 pb, enquanto os primers internos Forward – 5’GGAACAGCTTTGAGGTTCG 3’ e Reverse – 5’CCAGGACAGGCACAAAAAT 3’ amplificaram fragmentos de 172 pb e 258 pb, respectivamente. A PCR foi realizada em volume final de reação de 20 µL, contendo 1 pmol de cada primer externo, 5 pmol de cada primer interno, 0,15 mM de dNTP, 2 mM de MgCl2 e 0,75 U de Taq polimerase. A solução foi incubada por 2 minutos a 95 ºC, seguido por 37 ciclos de 1 minuto de desnaturação (95 ºC), 1 minuto de anelamento (60 ºC) e 1 minuto de extensão (72 ºC), além de uma etapa adicional de extensão por 2 minutos a 72 ºC. Após a ciclagem, os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida (7%) para visualização dos padrões de bandas. Os dados das mutações foram analisados com estatística descritiva, com dados de frequência e porcentagem para as variáveis qualitativas. 6. Resultados 6.1. Características epidemiológicas Os dados epidemiológicos dos grupos estudados estão dispostos na Tabela 1. O grupo CT foi composto por 50 indivíduos saudáveis entre 18 e 64 anos (média de 17 37 anos), sem comorbidades. O grupo MGM foi composto por 18 (35,3%) pacientes do sexo masculino e 33 (64,7%) pacientes do sexo feminino entre 27 e 85 anos (média de 52,8 anos), portadores de diferentes graus de meningioma. Dentre os 51 pacientes, 42 (82,4%) eram portadores de meningioma grau 1, 6 (11,8%) apresentavam meningioma grau 2, e 3 (5,8%) pacientes eram portadores de meningioma grau 3. A incidência de meningioma foi 1,8 vez maior nos indivíduos do sexo feminino do que nos indivíduos do sexo masculino. MGM (%) CT (%) Sexo masculino 18 (35,3) 33 (66) Sexo feminino 33 (64,7) 17 (34) Média de idade (anos) 52,8 37 6.2. Perfil diferencial de metabólitos Visando a seleção de biomarcadores diferenciais com potencial para indicar a presença da doença, a análise dos dados de espectrometria de massas por PLS-DA permitiu estabelecer uma clara separação entre os pacientes portadores de meningioma (MGM) dos indivíduos saudáveis (CT) (Figura 1). Tabela 1. Características epidemiológicas dos grupos meningioma (MGM) e controle (CT). 18 Figura 1. Análise dos marcadores por PLS-DA mostrando uma clara separação entre indivíduos portadores de meningioma (MGM) e indivíduos controle saudáveis (CT). 19 Ainda, foi possível identificar os marcadores responsáveis pela diferenciação dos grupos com base no VIP Score (Figura 2), ou seja, aqueles marcadores que apresentaram maior importância na distinção dos pacientes entre indivíduos com a doença e indivíduos saudáveis controle, em que VIP Score ≥ 2,5. Os valores de m/z dos metabólitos mais relevantes para o grupo MGM correspondem a 143, 1116, 102, 819, 931 e 181. Os metabólitos também foram selecionados de acordo com a medida de Fold Change (FC) entre indivíduos portadores de meningioma e indivíduos controle (MGM/CT). O Fold Change representa a razão das intensidades dos metabólitos entre os grupos de interesse, nesse caso, indivíduos portadores de meningioma e indivíduos saudáveis (MGM/CT) (PACHOLEWSKA, 2017). Ou seja, essa medida indica quantas vezes a intensidade de um determinado metabólito encontra-se aumentada ou diminuída nos indivíduos doentes em relação aos indivíduos Figura 2. Marcadores selecionados pela análise de PLS-DA, de acordo com o VIP Score (Variable Importance in Projection Score). De acordo com o espectro de cores lateral, os marcadores mais relevantes para cada um dos grupos estão marcados em vermelho, e aqueles menos importantes, em azul. https://sciencematters.io/articles/201706000011/authors 20 saudáveis. Foram escolhidos os marcadores com Log2(FC) ≥ 2, ou seja, aqueles marcadores cujas intensidades eram pelo menos quatro vezes maiores (FC ≥ 4) nos indivíduos portadores de meningioma do que naqueles que não portavam a doença. Os valores de m/z selecionados foram: 172, 102, 124, 180, 1116, 168 e 999. Os valores de FC, Log2(FC) e VIP Score, tanto dos marcadores selecionados com base no VIP (VIP ≥ 2,5) quanto daqueles selecionados utilizando o Fold Change (FC ≥ 4), estão descritos na Tabela 2. Massa/Carga (m/z) Fold Change (FC) Log2(FC) VIP Score 172 10,997 3,459 2,5475 102 10,597 3,4056 3,4985 124 9,2958 3,2166 2,3053 180 6,4969 2,6998 0,40341 1116 5,235 2,3882 4,0649 168 4,9673 2,3125 1,1087 999 4,4057 2,1394 2,0814 931 3,9678 1,9883 2,9398 143 2,5443 1,3473 5,5556 819 2,435 1,2839 3,2434 181 2,0098 1,0071 2,7122 Para analisar a significância estatística dos marcadores selecionados com base nos valores de VIP e FC, foi gerado um gráfico Volcano Plot (Figura 3; p < 0,05; Fold Change ≥ 2,5) através da plataforma MetaboAnalyst 5.0. O Volcano Plot tem como finalidade demonstrar visualmente se há diferenças significativas em grandes conjuntos de dados gerados por experimentos repetidos, com os pontos de maior interesse estatístico localizados na parte superior do gráfico e mais distantes do centro (CUI; CHURCHILL, 2003; FERRETTI, 2015; LI, 2012). Uma vez que os marcadores foram analisados com base nas suas intensidades em indivíduos portadores de meningioma em relação aos indivíduos saudáveis (MGM/CT), os valores de m/z localizados à direita representam os marcadores de maior importância para o grupo MGM, dos quais foram destacados aqueles com valor de p < 0,05 e FC ≥ 2,5. Tabela 2. Valores de Fold Change, Log2(FC) e VIP Score das moléculas com potencial para indicar presença de meningioma. Inicialmente, foram selecionados como possíveis marcadores diferenciais aqueles com VIP ≥ 2,5 e/ou Fold Change ≥ 4,0. 21 A fim de selecionar os principais marcadores diferenciais e verificar seu potencial em distinguir assertivamente pacientes portadores de MGM dos indivíduos saudáveis, gerou-se a curva ROC com intervalo de confiança de 95% (Figura 4) para os marcadores com VIP > 2,5 e FC > 2,5, sendo seus valores de massa/carga: 172, 102, 1116, 931 e 143. Figura 3. Gráfico Volcano Plot para os valores de m/z selecionados como potenciais marcadores para meningioma. Foram destacados aquele em que p < 0,05; Fold Change ≥ 2,5; Log2(FC) ≥ 1,322. 22 Através da busca em bancos de dados especializados de metabólitos, como METLIN, LIPID MAPS e Human Metabolome Database (HMDB), e da pesquisa na literatura científica, foi possível determinar as possíveis identidades dos metabólitos a partir de seus valores de m/z selecionados. Por fim, realizou-se a análise por espectrometria de massas in tandem (MS/MS), onde os metabólitos foram submetidos a fragmentação molecular e seus fragmentos foram comparados a fim de se certificar a respeito das identidades das moléculas selecionadas. A lista contendo as possíveis identidades dos metabólitos selecionados com potencial para indicar presença de meningioma, bem como seus padrões de fragmentação, estão descritos na Tabela 3. Figura 4. Curva ROC com intervalo de 95% de confiança para os metabólitos selecionados com base no VIP > 2,5 e FC > 2,5. Foram selecionados os marcadores com m/z 172, 102, 1116, 931 e 143. 23 Tabela 3. Marcadores plasmáticos indicativos de presença de meningioma selecionados com base no VIP Score e Fold Change. Massa (m/z) ID Base de Dados Metabólito Fórmula Adutos MS/MS 172 ---------- Não identificado ---------- ---------- ---------- 102 ---------- Não identificado ---------- ---------- ---------- 1116 MID7148 Ganglioside GA2 (d18:1/18:0)* C56H104N2O18 [M + Na]+ 338-804-523- 321-112/113 931 HMDB0000024 3-O-Sulfogalactosylceramide (d18:1/24:0)* C48H93NO11S [M + K]+ 310-109-121- 720-328-357- 410-184 143 MID5456 5-Hydroxymethyluracil C5H6N2O3 [M + H]+ 116-111-117- 97-125 6.3. Detecção de polimorfismos em p53 Dentre os 51 pacientes envolvidos no estudo, 6 não apresentaram tecido tumoral suficiente para extração do material genético; logo, foram excluídos da etapa de detecção de polimorfismos em p53. As demais amostras de tecido tumoral (n = 45) foram submetidas à amplificação pela técnica tetra-primer ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) para detecção das mutações R248Q [NM_000546.6(TP53):c.743G>A (p.Arg248Gln)] e R273H [NM_000546.6(TP53):c.818G>A (p.Arg273His)], seguida por eletroforese em gel de poliacrilamida (7%) para análise dos padrões de bandas e genotipagem dos indivíduos (Figura 5). Das amostras de tecido tumoral analisadas para a presença dos polimorfismos R248Q e R273H no gene TP53, 45 (100%) apresentaram genótipo homozigoto G/G para ambos os polimorfismos, ou seja, todos os pacientes possuem o alelo selvagem, indicando a ausência das mutações de interesse na proteína p53. Representações das análises dos polimorfismos podem ser encontradas na Figura 6. Legenda: ID – identificador das bases de dados utilizadas para pesquisa de metabólitos. MID: METLIN; HMDB: Human Metabolome Database. *(número de carbonos : ligações duplas). 24 Figura 5. (A) Reação de amplificação por tetra-primer ARMS-PCR. Incompatibilidades (mismatches) intencionais nas extremidades 3’ dos primers internos os tornam alelo-específicos, possibilitando a genotipagem dos indivíduos através da eletroforese em gel de poliacrilamida para presença ou ausência dos polimorfismos (B) R248Q e (C) R273H. Abreviações: OF: Outer Forward; OR: Outer Reverse; IF: Inner Forward; IR: Inner Reverse. (A) (B) (C) 25 Figura 6. Gel de poliacrilamida (7%) para análise dos polimorfismos (A) R248Q e (B) R273H em p53. Da esquerda para a direita: DNA Ladder 100 pb; DNA amplificado a partir de amostras de meningioma (grau 1: TC120; grau 2: TC108, TC115, TC116 e TC117; e grau 3: TC28 e TC74); DNA amplificado de amostra de câncer gástrico (CG06) heterozigota para o polimorfismo (controle positivo); controle negativo da reação (NO). (A) (B) 26 7. Discussão 7.1. 5-Hidroximetiluracil Dentre os metabólitos identificados com potencial para indicar presença de meningioma está o 5-hidroximetiluracil (5-hmU; m/z = 143), um metabólito gerado principalmente pela interação de espécies reativas de oxigênio (ROS) através da I) oxidação/hidroxilação da timina, resultando na formação de 5-hmU pareada com adenina; e II) processos de desmetilação do DNA através da desaminação de 5- hidroximetilcitosina (5-hmC), gerando 5-hmU mal pareada com guanina (OLINSKI; STARCZAK; GACKOWSKI, 2016). A formação de 5-hmU é um processo comum de lesão oxidativa causada por ROS; porém, sob condições fisiológicas, os mecanismos de reparo do DNA garantem baixas concentrações do metabólito (PAPALUCA et al., 2018) através do reconhecimento e remoção da 5- hmU por enzimas de reparo do DNA, como a 5-hmU-DNA glicosilase, restaurando o pareamento normal das bases e garantindo a integridade genética (BOORSTEIN; LEVY; TEEBOR, 1987; HOLLSTEIN et al., 1984; OLINSKI; STARCZAK; GACKOWSKI, 2016; PAPALUCA et al., 2018). Entretanto, esses processos podem levar a alterações mutagênicas importantes para o processo da tumorigênese, como a inativação da proteína p53 (ZUO; BOORSTEIN; TEEBOR, 1995), além de atuarem como marcadores epigenéticos (OLINSKI; STARCZAK; GACKOWSKI, 2016). De fato, estudos sugerem o envolvimento do metabólito com o desenvolvimento de mutações genômicas uma vez que a ação da 5-hmU-DNA glicosilase mostrou- se de magnitude similar à atividade de outras enzimas atuantes no reparo de lesões potencialmente mutagênicas (BOORSTEIN; LEVY; TEEBOR, 1987). Além disso, foram constatados aumentos dos níveis séricos de 5-hmU em mulheres com maior predisposição para o desenvolvimento de cânceres de mama e colorretal (DJURIC et al., 2001; FRENKEL et al., 1998), bem como em mulheres portadoras de câncer de mama (DJURIC et al., 1996). Ainda, dados de metabolômica mostraram níveis plasmáticos aumentados do metabólito em pacientes portadores de glioblastoma quando comparados com o plasma de indivíduos sem o tumor (FERRASI et al., 2023). Juntos, esses dados suportam a hipótese do 5-hidroximetiluracil como 27 indicador de instabilidade genômica, destacando seu potencial para atuar como biomarcador plasmático para presença de meningiomas. A curva ROC gerada para avaliar o modelo levando como base o metabólito 5-hidroximetiluracil é apresentada na Figura 7A, assim como a matriz de confusão (Figura 7B) e o poder preditivo do biomarcador (Figura 7C). Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 448 26 VPN 94,5% MGM 52 484 VPP 90,3% Especificidade 89,6% Sensibilidade 94,9% Acurácia 92,3% 7.2. 3-O-Sulfogalactosilceramida (d18:1/24:0) Outro metabólito identificado, um sulfatídeo (m/z = 931), é uma molécula proveniente do metabolismo da ceramida, lipídio que, além de desenvolver funções estrutural e reguladora (OGRETMEN; HANNUN, 2004; SADDOUGHI; (C) Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 448 26 VPN 94,5% MGM 52 484 VPP 90,3% Especificidade 89,6% Sensibilidade 94,9% Acurácia 92,3% (C) Figura 7. Análise da acurácia do metabólito 5-hidroximetiuracil para atuar como biomarcador indicativo de presença de meningioma. (A) Curva ROC com intervalo de confiança de 95%; (B) gráfico demonstrativo das probabilidades das classificações previstas para cada replicata (n = 10), onde os pontos pretos representam as replicatas das amostras de MGM, e os pontos brancos, as replicatas de cada CT; e (C) matriz de confusão mostrando os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia do metabólito para indicar presença do tumor. (B) Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 448 26 VPN 94,5% MGM 52 484 VPP 90,3% Especificidade 89,6% Sensibilidade 94,9% Acurácia 92,3% (C) (A) Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 448 26 VPN 94,5% MGM 52 484 VPP 90,3% Especificidade 89,6% Sensibilidade 94,9% Acurácia 92,3% (C) 28 OGRETMEN, 2013), atua como supressor tumoral através da ativação de cascatas de sinalização que levam à morte celular (OGRETMEN; HANNUN, 2001; RYLAND et al., 2011). Assim, a metabolização da ceramida pode funcionar como uma rota de escape utilizada pelas células tumorais como forma de inibir a apoptose e, consequentemente, favorecer o crescimento celular (MORAD; CABOT, 2013). Uma das vias propostas como possível rota de escape utilizada pelo maquinário das células tumorais é a conversão da ceramida em Galactosilceramida (GalCer), pela atividade da enzima ceramida galactosiltransferase (UGT8) (BEIER; GÖRÖGH, 2005; SPRONG et al., 1998). Estudos envolvendo a enzima demonstraram relação direta entre a expressão de UGT8 e o grau de malignidade de células tumorais (DZIȨGIEL et al., 2010; OWCZAREK et al., 2013). Após a glicosilação da ceramida, a enzima galactosilceramida sulfotransferase atua na sulfonação da GalCer, convertendo-a em 3-O-Sulfogalactosilceramida (m/z = 931) (GASA et al., 1990). Estudos apontaram para níveis aumentados da enzima no soro de pacientes portadores de carcinoma renal (GASA et al., 1990) e carcinoma hepatocelular (GASA et al., 1991). Células com grande potencial metastático, quando comparadas com células com menor potencial para desenvolvimento de metástases, também apresentaram maior expressão da enzima (SHI et al., 2005). Além disso, o metabólito em questão mostrou potencial para atuar como biomarcador de progressão tumoral em pacientes portadores de meningioma (KUROKAWA et al., 2023), bem como um possível marcador para agressividade e invasão do tecido cerebral adjacente (FERRASI et al., 2023). Juntos, esses dados apontam para a possibilidade da 3-O-Sulfogalactosilceramida atuar como marcador plasmático adjuvante de presença de diferentes tumores, dentre eles o meningioma. A curva ROC gerada para avaliar o modelo levando como base o metabólito 3-O-Sulfogalactosilceramida é apresentada na Figura 8A, assim como a matriz de confusão (Figura 8B) e o poder preditivo do biomarcador (Figura 8C). 29 Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 463 213 VPN 68,5% MGM 37 297 VPP 88,9% Especificidade 92,6% Sensibilidade 58,2% Acurácia 75,2% 7.3. Gangliosídeo GA2 (d18:1/18:0) Por fim, foi identificado um gangliosídeo (m/z 1116). Os gangliosídeos são uma subclasse de glicoesfingolipídios caracterizados pela presença de um ou mais resíduos de ácido siálico e participam como reguladores de diversos processos fisiológicos, como adesão celular, comunicação célula-célula, migração, proliferação e apoptose, bem como em processos patológicos, como o câncer (DANIOTTI; LARDONE; VILCAES, 2016; GROUX-DEGROOTE; GUÉRARDEL; DELANNOY, 2017; SARBU; ICA; ZAMFIR, 2022). Estão localizados no folheto externo da membrana plasmática, sendo ubiquamente (B) Figura 8. Análise da acurácia do metabólito 3-O-sulfogalactosilceramida para atuar como biomarcador indicativo de presença de meningioma. (A) Curva ROC com intervalo de confiança de 95%; (B) gráfico demonstrativo das probabilidades das classificações previstas para cada replicata (n = 10), onde os pontos pretos representam as replicatas das amostras de MGM, e os pontos brancos, as replicatas de cada CT; e (C) matriz de confusão mostrando os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia do metabólito para indicar presença do tumor. (A) (C) (C) 30 encontrados nos tecidos e fluidos (GROUX-DEGROOTE; GUÉRARDEL; DELANNOY, 2017; SARBU; ICA; ZAMFIR, 2022). Além das funções exercidas no contexto fisiológico, os gangliosídeos possuem potencial imunomodulatório, atuando na supressão das respostas imunes inata e adaptativa, possibilitando o escape tumoral e, consequentemente, contribuindo com o processo de tumorigênese (DANIOTTI; LARDONE; VILCAES, 2016). Diversos estudos têm mostrado aumento dos níveis de gangliosídeos em pacientes portadores de diferentes cânceres do sistema nervoso (BERRA et al., 1983; BERRA; GAINI; RIBONI, 1985; DAVIDSSON et al., 1990; LADISCH et al., 1997), ressaltando seu potencial para atuar como marcador indicativo de presença da doença. Além disso, o metabólito mostrou-se diferentemente expresso em diferentes tipos histológicos de tumores do Sistema Nervoso Central (SHINOURA et al., 1992), estando relacionado com o processo de desenvolvimento e progressão tumoral, bem como a um pior prognóstico (BATTULA et al., 2012; VALENTINO et al., 1990). Juntos, esses estudos suportam a hipótese de que gangliosídeos possam ser peças fundamentais para o desenvolvimento de diferentes cânceres, bem como seu potencial para atuar como biomarcador indicativo de presença desses tipos tumorais. A curva ROC gerada para avaliar o modelo levando como base o metabólito gangliosídeo GA2 (d18:1/18:0) é apresentada na Figura 9A, assim como a matriz de confusão (Figura (B) e o poder preditivo do biomarcador (Figura 9C). 31 Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 477 153 VPN 75,7% MGM 23 357 VPP 93,9% Especificidade 95,4% Sensibilidade 70% Acurácia 82,6% (C) Figura 9. Análise da acurácia do metabólito gangliosídeo GA2 (d18:1/18:0) para atuar como biomarcador indicativo de presença de meningioma. (A) Curva ROC com intervalo de confiança de 95%; (B) gráfico demonstrativo das probabilidades das classificações previstas para cada replicata (n = 10), onde os pontos pretos representam as replicatas das amostras de MGM, e os pontos brancos, as replicatas de cada CT; e (C) matriz de confusão mostrando os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia do metabólito para indicar presença do tumor. (A) (B) 32 Por fim, com o objetivo de analisar o potencial dos metabólitos identificados em diferenciar indivíduos saudáveis daqueles portadores de meningioma, gerou-se a curva ROC em conjunto para os marcadores com m/z 143, 931 e 1116, bem como o gráfico das probabilidades de classificação e a matriz de confusão. Os dados, dispostos na Figura 10, revelam um excelente potencial dos metabólitos selecionados e identificados no presente estudo para indicar presença de meningioma, sugerindo um possível envolvimento das moléculas em questão com a fisiopatologia da referida doença. Matriz de Confusão Classificação verdadeira CT MGM Classificação pelo marcador CT 452 32 VPN 93,4% MGM 48 478 VPP 90,9% Especificidade 90,4% Sensibilidade 93,7% Acurácia 92,1% (B) Figura 10. Análise em conjunto da acurácia dos metabólitos com m/z 143, 931 e 1116 para atuarem como biomarcadores indicativos de presença de meningioma. (A) Curva ROC com intervalo de confiança de 95%; (B) gráfico demonstrativo das probabilidades das classificações previstas para cada replicata (n = 10), onde os pontos pretos representam as replicatas das amostras de MGM, e os pontos brancos, as replicatas de cada CT; e (C) matriz de confusão mostrando os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia dos metabólitos para indicar presença do tumor. (A) (C) 33 7.4. Polimorfismos em p53 A proteína p53 é uma proteína supressora tumoral sintetizada a partir do gene TP53, localizado no braço curto do cromossomo 17, e desempenha importantes papéis antiproliferativos, como manutenção da estabilidade genômica, regulação da divisão celular, reparo do material genético e indução de apoptose (FULCI; VAN MEIR, 1999; VERHEIJEN et al., 2002). Alterações no gene TP53 associadas à disfunção da proteína são as mais comumente encontradas nos cânceres humanos (LEVINE, 2020), podendo também resultar em ganhos de funções oncogênicas (MULLER; VOUSDEN, 2013, 2014). Além disso, por apresentar maior estabilidade, a proteína mutada tende a se acumular (MANTOVANI; COLLAVIN; DEL SAL, 2019), casos em que a maior expressão da proteína já foi associada à progressão maligna (WANG et al., 1995), características de tumores mais agressivos (RAO et al., 2009) e recorrência (CHO et al., 1999; NAGAHAMA et al., 2021; OHKOUDO et al., 1998) em meningiomas. Sabendo disso, a busca por mutações em p53 nos pacientes portadores de meningioma pode apresentar potencial para ser utilizada como marcador indicativo de possibilidade de recidiva tumoral, complementando o grupo de biomarcadores identificados através das análises metabolômicas, dada a aparente relação entre a proteína, os níveis de ceramida e o desempenho das funções antitumorais do lipídio (DBAIBO et al., 1998; KIM et al., 2002; SAWADA et al., 2001). No presente estudo, os polimorfismos R248Q e R273H não foram detectados no gene TP53 em nenhum dos 45 pacientes testados, ou seja, todos os pacientes apresentaram genótipo G/G (selvagem) para os polimorfismos de interesse. Embora alguns estudos tenham sugerido o possível envolvimento de mutações em TP53 com tumores mais agressivos e recorrência em meningiomas, grande parte desses estudos basearam-se na análise da expressão de p53, e não na detecção de polimorfismos na proteína. Nos casos em que foram analisados os polimorfismos em p53, não houve associações significativas entre a presença desses polimorfismos e a etiologia de meningiomas (MALMER et al., 2005, 2007; VERHEIJEN et al., 2002). 34 8. Conclusão Em conclusão, as análises metabolômicas realizadas a partir de amostras de plasma de pacientes portadores de meningioma, quando comparadas àquelas coletadas de indivíduos saudáveis, permitiram a seleção e identificação de um grupo de metabólitos diferenciais com potencial para indicar presença do tumor com alta relevância estatística (AUC = 0,976), revelando um possível envolvimento das moléculas em questão com a fisiopatologia dos meningiomas. Já as análises realizadas por técnicas de biologia molecular de DNA extraído a partir de amostras de tecido tumoral, bem como demais estudos envolvendo a análise de polimorfismos no gene TP53, apontam para o não envolvimento dos polimorfismos R248Q e R273H em p53 na recidiva dos meningiomas. Entretanto, ressalta-se a necessidade de novas análises nos demais hostspots da proteína que possam estar associados à fisiopatologia da doença e recorrência tumoral. A pequena quantidade de amostras de meningiomas graus 2 e 3 (n = 5 e n = 3, respectivamente) também representa uma importante limitação do presente estudo, sendo necessária a incorporação de um maior número de pacientes, bem como a comparação dos perfis metabólicos de pacientes portadores de diferentes tumores do sistema nervoso central a fim de validar os marcadores identificados. Além disso, a semelhança entre determinados metabólitos identificados como possíveis biomarcadores para meningioma (KUROKAWA et al., 2023) e glioblastoma (FERRASI et al., 2023) pode estar relacionada à metabolização de fármacos administrados aos pacientes. Dessa forma, há de se ter cautela antes de extrapolar os resultados para a prática clínica. As próximas etapas do presente estudo incluem a validação dos metabólitos identificados através de técnicas de metabolômica alvo, bem como a comparação de perfis metabólicos de diferentes tumores do sistema nervoso central a fim de assegurar que os marcadores encontrados são específicos para os tumores de interesse. Por fim, realizar a identificação de metabólitos característicos de tumores recidivantes, visando a detecção precoce de recidivas tumorais e, consequentemente, garantindo um melhor prognóstico aos pacientes. 35 9. Referências AMATYA, V. J. et al. Immunohistochemical study of Ki-67 (MIB-1), p53 protein, p21WAF1, and p27KIP1 expression in benign, atypical, and anaplastic meningiomas. Human pathology, v. 32, n. 9, p. 970–975, 2001. BATTULA, V. L. et al. Ganglioside GD2 identifies breast cancer stem cells and promotes tumorigenesis. Journal of Clinical Investigation, v. 122, n. 6, p. 2066– 2078, 2012. BEIER, U. H.; GÖRÖGH, T. 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As etapas principais do projetos serão: (i)desenvolvimento da plataforma de detecção, de baixo custo; (ii) estudo dos marcadores de superfície celular tumoral (por exemplo o EpCAM); (iii) validação da sensibilidade e especificidade do dispositivo em amostras sanguíneas de pacientes acometidos por tumores do SNC e doadores saudáveis de sangue. Critérios de elegibilidade adequados Serão incluídas cerca de 400 participantes caracterizados por Grupo Caso (200 participantes acometidos por tumores do SNC); Grupo Controle (200 indivíduos saudáveis). Amostras a serem coletadas: Grupo Caso: 4 mL de sangue periférico + 2 fragmentos (3mm3) do tumor; Grupo Controle: 4 mL de sangue periférico; - Construção do Dispositivo Microfluídico: Confecção de um molde em PDMS (Dimetil Polissiloxano) e acoplamento em uma lâmina de vidro, conforme descrito em Zhang et al (2016). A princípio, o sistema será baseado na afinidade das CTCs com anticorpos imobilizados (anti- Apresentação do Projeto: Financiamento PróprioPatrocinador Principal: 18.618-970 (14)3880-1609 E-mail: cep@fmb.unesp.br Endereço: Bairro: CEP: Telefone: Chácara Butignolli , s/n Rubião Junior UF: Município:SP BOTUCATU Página 01 de 10 10.1. Anexo I UNESP -FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU Continuação do Parecer: 4.896.170 EpCAM, anti -Human CD326), contudo, outros marcadores tumorais poderão ser testados, de acordo com o tipo de tumor do SNC. - A validação do dispositivo ocorrerá por testes com amostras sanguíneas de pacientes acometidos por tumores do SNC (grupo controle) e aqueles que não estão com a doença (grupo controle). - Análises de novos Marcadores Tumorais: Serão estudados novos marcadores de superfície celular que possam ser utilizados especificamente para os diferentes tumores do SNC coletados. INTRODUÇÃO Seguramente, um dos maiores desafios na saúde humana está relacionado à morbidade e mortalidade dos cânceres no sistema nervoso central. Portanto são necessários recursos diagnósticos, cuidados médicos e cirúrgicos altamente especializados, além de tratamento e seguimento em longo prazo. Os sintomas são inespecíficos e podem ser confundidos facilmente com outras comorbidades comuns, prolongando o tempo até que diagnóstico definitivo seja alcançado e aumentando o risco de morte desses pacientes. Atualmente, nenhum teste simples de rastreamento populacional está disponível para câncer do SNC, o diagnóstico requer o uso de modalidades de imagem avançadas e caras, não facilmente acessíveis a todos. Nesse contexto, o desenvolvimento de uma técnica simples, sensível e barata permitiria o acesso a um indicador precoce de células tumorais circulantes (CTCs), reduzindo o prazo do diagnóstico, melhorando o prognóstico e aumentando a sobrevida do paciente. Além disso, a detecção das células tumorais circulantes (CTCs) por meio de biópsias líquidas é particularmente importante em doenças malignas do SNC devido ao potencial de acompanhar a progressão da doença com um exame de sangue, sem repetir procedimentos neurocirúrgicos que apresentam risco de morbidade do paciente. As informações descritas nos campos foram retiradas dos documentos e arquivo - Informações Básicas do Projeto. Objetivo da pesquisa: OBJETIVOS GERAIS: Construção de um sistema microfluídico para a detecção e separação de CTCs no sangue periférico de pacientes acometidos por tumores do sistema nervoso central, com alta seletividade e sensibilidade, com potencial de utilização no diagnóstico e/ou no monitoramento da doença. Objetivo da Pesquisa: 18.618-970 (14)3880-1609 E-mail: cep@fmb.unesp.br Endereço: Bairro: CEP: Telefone: Chácara Butignolli , s/n Rubião Junior UF: Município:SP BOTUCATU Página 02 de 10 UNESP -FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU Continuação do Parecer: 4.896.170 ESPECÍFICOS: a) Desenvolvimento de sistema microfluídico b) Funcionalização do microdispositivo e validação da metodologia c) Detecção de células tumorais circulantes em sangue periférico d) Validação dos dispositivos em amostras de sangue periférico de pacientes e doadores saudáveis e) verificação da expressão gênica de biomarcadores de membrana que possam ser utilizados como alvos de superfície. METODOLOGIA: 4.1 Casuística O grupo “caso” será composto por 200 pacientes, com idade igual ou superior a 18 anos, acometidos por tumores primários do sistema nervoso central e o grupo “controle” será composto por 200 indivíduos saudáveis, com idade igual ou superior a 18 anos, todos participantes voluntários. Serão convidados a participar do estudo, pacientes atendidos pelo Serviço de Neurocirurgia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu (HC/FMB). Serão convidados a participar do estudo, doadores voluntários de sangue periférico do Hemocentro de Botucatu (HC/FMB). 4.2 Seleção dos Participantes Grupo Caso Critérios de inclusão no estudo: I- Presença ou suspeição de tumores do sistema nervoso central com indicação neurocirúrgica formal, incluindo casos de recidivas; II- Possibilidade de coleta de 4mL de sangue total do paciente durante o procedimento cirúrgico, sem prejuízo ao paciente ou a outros exames necessários; III- Possibilidade de coleta de fragmentos tumorais (3mm3 ) durante o procedimento cirúrgico, sem que haja qualquer prejuízo ao exame histopatológico ou a outros que porventura sejam necessários; IV- Expresso entendimento e concordância em participar do estudo, manifestada pelo paciente ou pelo seu responsável legal previamente à cirurgia através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Critérios de exclusão do estudo: I- Pacientes que reconhecidamente apresentarem neoplasias de origem diversa às previamente estabelecidas; II- Pacientes com tumores primários do SNC redicivantes previamente tratados com radioterapia e/ou quimioterapia de qualquer modalidade; III- Pacientes com tumores pequenos, dos quais se obtenha material escasso ou insuficiente para o estudo histopatológico e/ou outros exames necessários; IV- Pacientes ou responsáveis legais que não tenham conseguido compreender suficientemente as 18.618-970 (14)3880-1609 E-mail: cep@fmb.unesp.br Endereço: Bairro: CEP: Telefone: Chácara Butignolli , s/n Rubião Junior UF: Município:SP BOTUCATU Página 03 de 10 UNESP -FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU Continuação do Parecer: 4.896.170 diretrizes da pesquisa ou que tenham se negado a participar do estudo, conforme estabelecido no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Grupo Controle Doadores de Sangue Critérios de inclusão no estudo: I- Indivíduos saudáveis, com idade igual ou superior a 18 anos, aptos a doação voluntária de sangue; II- Possibilidade de coleta de 4mL de sangue total, sem prejuízos para a sua doação ao banco de sangue ou para outros exames necessários; III- Expresso entendimento e concordância em participar do estudo, manifestada pelo paciente através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Critérios de exclusão do estudo: I- Presença ou suspeição de qualquer tipo de neoplasia; II- Pacientes que foram tratados com radioterapia e/ou quimioterapia de qualquer modalidade; III- Indivíduos que não tenham conseguido compreender suficientemente as diretrizes da pesquisa ou que tenham se negado a participar do estudo, conforme estabelecido no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). 4.3 Amostras Grupo Caso Sangue Periférico A alíquota contendo aproximadamente 4mL de sangue total será coletada durante o procedimento cirúrgico, em tubo contendo anticoagulante (EDTA). Fragmento Tumoral As amostras de tecido tumoral (de aproximadamente 3mm3) serão coletadas após a retirada cirúrgica da massa tumoral do paciente, não interferindo com o tempo de anestesia e de cirurgia. Após a coleta, as amostras serão depositados imediatamente em criotubos contendo 300µL de conservante e congeladas em freezer -80°C. Grupo Controle Sangue Periférico A alíquota contendo aproximadamente 4mL de sangue total será coletada em tubo contendo anticoagulante (EDTA). 4.4 Métodos Todas as amostras serão registradas de maneira que os dados dos participantes da pesquisa sejam anonimizados. As análises laboratoriais serão realizadas no laboratório de biologia molecular da Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) da Universidade Estadual Paulista (UNESP). Desenvolvimento do sistema microfluídico Para a formação dos microdispositivos, os mesmos serão confeccionados num molde em PDMS (Dimetil Polissiloxano) e acoplados a uma lâmina de vidro. A Figura 1 demonstra o modelo proposto. Primeiro será fabricado o desenho da estrutura microfluídica com a utilização da ferramenta computacional AutoCAD (Computer Aided Design). O arquivo CAD será o enviado para uma empresa para impressão de transparências e todo o processo será realizado conforme descrito em 18.618-970 (14)3880-1609 E-mail: cep@fmb.unesp.br Endereço: Bairro: CEP: Telefone: Chácara Butignolli , s/n Rubião Junior UF: Município:SP BOTUCATU Página 04 de 10 estel Realce UNESP -FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU Continuação do Parecer: 4.896.170 Zhang et al (2016). 36 Para a fabricação do molde de silício, uma máscara impressa será utilizada. O padrão na máscara será transferido por um fotoresistor com 2 m de espessura em uma placa de silício, utilizando fotolitografia. Após a confecção do molde, o substrato de PDMS será fabricado por litografia macia. O molde contendo PDMS será então curado durante 3 horas à 65°C, numa estufa. Após este processo, retira-se o PDMS do molde, e, após o seu endurecimento, este é encaixado sobre uma lâmina de microscópio perfurada para entrada e na saída do fluxo. Para o acoplamento do PDMS à lâmina de microscópio, será realizado um tratamento com ozônio durante 5 minutos, formando ligações epóxi. O microdispositivo terá um canal na forma de serpentina com incorporação de filtros laterais. O sistema proposto neste projeto será baseado em afinidade de CTCs com contato direto entre os anticorpos imobilizados (anti-EpCAM, anti-Human CD326) e as paredes do microdispositivo. O aumento da área das estruturas internas pode aumentar a probabilidade da interação entre os anticorpos e as CTCs. Espera-se que o contato direto entre as CTCs seja inevitável, devido a diminuição dos espaços. Figura 1 – Modelo de Sistema Microfluídico para captura de CTCs. A) O sistema compreende de 4 canais principais em serpentina com uma matriz de filtros laterais incorporados em cada canal. Os filtros laterais são divididos em 10 zonas com base no tamanho do filtro. Cada zona de filtro consiste em 10 colunas de filtros laterais de mesmo tamanho. A maior zona de filtro (zona de filtro de 25 m) está localizada perto da entrada do dispositivo. A zona de filtro menor (zona de filtro de 12 m) está localizada perto da saída. O comprimento do canal serpentino será L = 5000 m. B) A largura do canal serpentino é W = 300 m; O comprimento do filtro L1 = 50 m; o tamanho do filtro W1 varia de 10 a 25 m. A distância entre os filtros laterais W2 pode ser 50 m ou 100 m dependendo do número de filtros. Como mostrado na Figura 1, o tamanho do filtro destin