Luiz Henrique Alves Guerra A influência do consumo de óleo de coco na próstata de Gerbilos de Mongólia durante o envelhecimento e seu impacto na hiperplasia prostática benigna São José do Rio Preto 2022 Câmpus de São José do Rio Preto Luiz Henrique Alves Guerra A influência do consumo de óleo de coco na próstata de Gerbilos de Mongólia durante o envelhecimento e seu impacto na hiperplasia prostática benigna Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Profª. Drª. Patrícia Simone Leite Vilamaior Coorientador: Profª. Drª. Marilia de Freitas Calmon São José do Rio Preto 2022 G934i Guerra, Luiz Henrique Alves A influência do consumo de óleo de coco na próstata de Gerbilos de Mongólia durante o envelhecimento e seu impacto na hiperplasia prostática benigna / Luiz Henrique Alves Guerra. -- São José do Rio Preto, 2022 127 p. : il., tabs., fotos Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientadora: Patrícia Simone Leite Vilamaior Coorientadora: Marilia de Freitas Calmon 1. Morfologia. 2. Próstata. 3. Envelhecimento. 4. Hiperplasia prostática benigna. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Luiz Henrique Alves Guerra A influência do consumo de óleo de coco na próstata de Gerbilos de Mongólia durante o envelhecimento e seu impacto na hiperplasia prostática benigna Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Profª. Drª. Patrícia Simone Leite Vilamaior UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientadora Prof. Dr. Marcio Alberto Torsoni UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas Profª. Drª. Carolina Panis UNIOESTE – Universidade Estadual do Oeste do Paraná Profª. Drª. Raquel Fantin Domeniconi UNESP – Câmpus de Botucatu Profª. Drª. Cleida Aparecida de Oliveira UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais São José do Rio Preto 10 de março de 2022 DEDICATÓRIA Ao meu porto seguro, que sempre me inspirou a conquistar novos mares, minha mãe Sueli. AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Luiz e Sueli, por dedicarem a maior parte de suas vidas em prol da minha educação, por todo afeto e princípios transferidos a mim e por sonharem com um futuro lindo para aquele bebê que entrou na vida de deles em 1989. Também agradeço ao meu irmão, Matheus, pelo incentivo e socorro em todas as vezes que precisei. Aos meus tios Maria Inez e Alair, por me acolherem como um filho em todos esses anos, pelo carinho, companheirismo e torcida. Agradeço também aos meus primos Leonardo e Nicole, os quais tenho como meus irmãos, por todo respeito e paciência em dividir o lar e os pais de vocês comigo. À minha orientadora Profa. Dra. Patrícia Simone Leite Vilamaior pela oportunidade, confiança, paciência e o conhecimento transferido a mim em todos esses anos. Obrigado por acreditar em mim, rir e sofrer junto comigo nessa jornada. Especialmente, agradeço pela amizade construída, a qual levarei comigo por toda a vida. À minha coorientadora Profa. Dra. Marilia de Freitas Calmon, por me receber e sempre me socorrer no Laboratório de Estudos Genômicos. Agradeço pela disponibilidade, paciência, ensinamentos e amizade. Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga, por abrir as portas e me receber todos os dias com um sorriso no rosto no laboratório de Microscopia e Microanálise. Obrigado por sempre me incentivar e por todos os ensinamentos. A convivência em todos esses anos resultou em mim, uma profunda admiração e amizade. Aos membros da comissão examinadora do Exame de Qualificação, Profa. Dra. Fernanda Cristina Alcântara dos Santos e Profa. Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, pelas correções e sugestões na análise dos resultados prévios da tese. Aos membros titulares e suplentes da comissão examinadora Prof. Dr. Marcio Alberto Torsoni, Profa. Dra. Carolina Panis, Profa. Dra. Raquel Fantin Domeniconi, Profa. Dra. Cleida Aparecida de Oliveira, Profa. Dra. Ana Paula da Silva Perez, Profa. Dra. Ana Claudia Polli Lopes e Profa. Dra. Giovana Rampazzo Teixeira pela disponibilidade em participar do exame de defesa, por se dedicarem na leitura e pelas contribuições para o enriquecimento deste estudo. Ao programa de Pós-Graduação em Biociências, ao departamento de Biologia e à Seção Técnica de Pós-Graduação. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, à qual agradeço. Às minhas “irmãs acadêmicas” Nayara e Fernanda, que sempre me ajudaram em todas as etapas desse trabalho. Obrigado por me socorrerem sempre e por serem muitas vezes minha agenda pessoal e meus protocolos. Agradeço por todas as gargalhadas, mesmo nos momentos de desespero, que amenizaram todas as angústias que fazem parte do percurso do curso de doutorado. As minhas amigas e colaboradoras Silvana e Ellen, pela amizade, por acreditarem em mim, terem paciência e por todas as parcerias e contribuições ao logo desses anos. Aos colegas, que estão ou que já passaram pelo LMM e por outros laboratórios do IBILCE: Ágata, Ariele, Bruno, Carol Negrin, Carolzona, Guilherme Campos, Gustavo, Julia, Juliana, Luana, Mariana, Maria Letícia, Simone, Thalles e Vanessa. Obrigado pela ajuda e muitos cafés e almoços, que fizeram da rotina no laboratório sempre momentos divertidos. Em especial aos amigos Carol Bedolo e Julia, pelos desabafos e prontidão em me ajudar sempre que precisei. Aos meus coorientandos, Mariele e Vitor, por me ensinarem tanto, pela confiança, paciência e por toda ajuda durante a realização dos meus experimentos. Foi uma honra poder fazer parte da formação de vocês. Ao técnico Luiz Roberto Falleiros Junior pelo auxílio em diversas etapas do trabalho, pela amizade e por tornar a rotina no laboratório mais divertida. À Stella e Profa. Mariella Freitas pela colaboração nas análises do estresse oxidativo e à profa. Dra. Fátima de Souza e à Raquel pela permissão e auxílio no uso do espectrofotômetro. Às professoras Dra. Paula Rahal, Dra. Eliane Gonçalves e Dra. Mary Itoyama que, em meio a tantas portas fechadas que encontrei no Instituto, abriram as portas de seus laboratórios e me receberam com carinho. O exemplo das senhoras sempre será lembrado por mim do exercício da minha profissão. À minha querida amiga Ana Gauy, por sempre me apoiar, estar sempre do meu lado desde o primeiro ano da graduação e por toda disponibilidade na realização de experimentos e contribuição no artigo extra dessa tese. Ao meu amigo Guilherme, por todas as tentativas em tantos experimentos mirabolantes, quase sempre sem sucesso e por sempre me encorajar em sair da minha zona de conforto. Obrigado pelas viagens, cafés e jantares especiais, por sempre me apoiar e pela revisão do inglês dos capítulos desse trabalho. Aos meus amigos Wesley, Adriano, Safi, Jéssica, Daniel e Gustavo, por estarem sempre comigo nesses anos, por todas as cervejas (necessárias!!), conversas até altas horas e por compreenderem minha ausência em muitos momentos. Aos amigos que fiz quando trabalhei como caixa de supermercado no começo do doutorado, Bianca, Marcos, Edjan e Rô, por me apoiarem em um momento muito difícil na realização desse trabalho. Agradeço por desculparem minha ausência sem mesmo compreender o porquê dela e por todos os momentos divertidos. Às minhas amigas Larissa e Marília, por fazerem parte da minha vida, por toda amizade, incentivo e pela torcida que vocês sempre tiveram pelo meu sucesso. Agradeço por sempre estarem prontas pra me socorrer e por entenderem tantas vezes minha ausência. Aos meus amigos de Buritama, que sempre brigarem comigo por não estar presente, Renata, Douglas, Monise e Gilson. Obrigado pela amizade, apoio e por tantos momentos divertidos. À minha família, meus avós, tios e primos, por sempre me apoiarem e pela prontidão em me ajudar ao longo desses anos. Ao Prof. Dr. Peter James Harris pela revisão final, da língua inglesa, dos manuscritos gerados nesse estudo. Enfim, agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho fosse concluído. EPÍGRAFE "Não sei o que possa parecer aos olhos do mundo, mas aos meus pareço apenas ter sido como um menino brincando na praia, e me distraindo de vez em quando encontrando uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita do que o comum, enquanto o grande oceano da verdade estava ainda por ser descoberto diante de mim...” (BREWSTER, 1855, p 405) RESUMO A próstata é uma glândula altamente responsiva a alterações hormonais e consequentemente ao envelhecimento, uma vez que indivíduos idosos apresentam níveis diminuídos de andrógenos. Uma das respostas da próstata frente ao processo de envelhecimento é o desenvolvimento de hiperplasia prostática benigna (HPB). Essa patologia é altamente relacionada com aumento de inflamação e de estresse oxidativo e esses, por sua vez, aumentam durante o envelhecimento. O uso de terapias alternativas como tratamento para a HPB vem crescendo e tem demonstrado efeitos benéficos à próstata, sem os danosos efeitos colaterais das drogas sintéticas comumente utilizadas. Algumas propriedades do óleo de coco, como antioxidante e anti-inflamatória fazem dele um candidato para o tratamento alternativo de doenças prostáticas, e ainda esse óleo se mostrou capaz de interferir na HPB induzida por testosterona. Entretanto, até o momento, não havia nenhum estudo detalhado sobre o efeito do consumo do óleo de coco durante o envelhecimento e das respostas morfofisiológicas na próstata. Sendo assim, o presente trabalho avaliou os efeitos do consumo de óleo de coco durante o envelhecimento na morfologia prostática, bem como seus efeitos na HPB espontânea e sua relação com fatores intimamente associados a essa doença como o processo inflamatório e o estresse oxidativo. Para tal foram utilizados gerbilos machos adultos submetidos a três diferentes condições experimentais: animais que não receberam nenhum tratamento durante um ano (grupo IC), animais que receberam água (0,1ml), em dias alternados, durante um ano (grupo GC) e animais que receberam óleo de coco 0,1ml), em dias alternados, durante um ano (grupo CO) e as administrações foram via gavagem. Foram realizadas análises morfológicas, morfométricas, estereológicas, imuno-histoquímicas, sorológicas, da expressão de proteínas, citocinas e avaliação do estresse oxidativo na próstata ventral. Os resultados mostraram que a manipulação dos animais no procedimento de gavagem durante o envelhecimento agravaram as lesões prostáticas, aumentaram a expressão de receptores hormonais e aumentam a espessura e a proliferação de células do estroma muscular. Esse procedimento também interferiu na população de macrófagos e na expressão de citocinas pró-inflamatórias, metaloproteinases, além de aumentar o estresse oxidativo. Já o consumo de óleo de coco atenuou ou inibiu essas alterações relacionadas ao envelhecimento e intensificadas pelo procedimento de gavagem. Assim, o consumo de óleo de coco durante o envelhecimento resultou em efeitos favoráveis ao uso desse óleo como agente fitoterápico no tratamento de HPB. Palavras-chave: Próstata. Envelhecimento. Hiperplasia. Óleo de coco. Gerbilos. ABSTRACT The prostate gland is highly responsive to hormonal changes and thus to aging since elderly individuals present lower androgen concentrations. One of the prostate responses to the aging process is the development of benign prostatic hyperplasia (BPH). This pathology is closely linked to increases in inflammation and oxidative stress, and these both increase during aging. The employment of alternative therapies as BPH treatment has been growing and has shown positive effects on the prostate, without the harmful secondary effects caused by the commonly available synthetic drugs. Some coconut oil properties, such as antioxidant and anti- inflammatory properties make it a candidate for alternative therapy to treat prostate diseases, and this oil has been shown to interfere with testosterone-induced BPH. However, until now, there was no detailed study about the effect of coconut oil consumption over aging and the morpho-physiological responses on the prostate. Thus, the present study assessed the effects of coconut oil consumption throughout aging on the prostatic morphology, as well as its effects on naturally occurring BPH and its interaction with factors closely associated with this disease, such as the inflammatory process and oxidative stress. For this purpose, adult male gerbils were submitted to three different experimental conditions: animals without any treatment for one year (IC group), animals which received water (0.1ml), every other day, for one year (CG group), and animals which received coconut oil 0.1ml), every other day, for one year (CO group). We performed a series of analyses of morphological, morphometric, stereological, immunohistochemical, serological, protein, and cytokine expression and evaluation of oxidative stress in the ventral prostate. The results showed that animal handling in the gavage procedure throughout aging aggravated the prostatic lesions, increased the hormone receptor expression, and increased the thickness and the proliferation of the muscular stroma. This procedure also influenced the macrophage population and the expression of pro-inflammatory cytokines, metalloproteinases, in addition to increasing oxidative stress. Coconut oil consumption, in contrast, attenuated or inhibited these age-related alterations intensified by the gavage procedure. Thus, coconut oil consumption over aging resulted in supportive data for the use of this oil as a phytotherapeutic agent in the HPB treatment. Keywords: Prostate. Ageing. Hyperplasia. Coconut oil. Gerbil. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Introdução Figura 1 – Posição anatômica da próstata 16 Figura 2 – Desenho esquemático do complexo prostático e lobos prostáticos de rato isolados 17 Figura 3 – Esquema ilustrativo e fotomicrografias do ácino e epitélio prostático 19 Figura 4 – Esquema dos principais componentes do estroma 19 Figura 5 – Esquema da ação de andrógenos e de fatores de crescimento na proliferação e na morte celular prostática 21 Figura 6 – Complexo prostático do Gerbilo da Mongólia adulto em esquema e órgão fresco 24 Artigo 1 Figura 1 – Lesões prostáticas observadas em gerbilos idosos 49 Figura 2 – Componentes fibrilares dos tecidos da próstata 50 Figura 3 – Análise da incidência e multiplicidade das lesões na próstata de Gerbilo da Mongólia 50 Figura 4 – Imuno-histoquímica, frequência de células positivas para e índice de proliferação de fosfo-histona H3 e TUNEL 51 Figura 5 – Imuno-histoquímica, frequência de células positivas e densidade relativa do receptor de andrógeno 52 Figura 6 – Imuno-histoquímica, frequência de células positivas e densidade relativa do receptor de estrógeno beta 53 Figura 7 – Imuno-histoquímica, frequência de células positivas e densidade relativa do receptor de estrógeno alfa 54 Artigo 2 Figura 1 – Secções histológicas da próstata de gerbilo e quantificação de focos inflamatórios 78 Figura 2 – Imuno-histoquímica de macrófagos F4/80, CD68, CD163, a ciclo- oxigenase 2 e STAT-3-fosfatada 79 Figura 3 – Quantificação de células positivas para macrófagos F4/80, CD68, CD163, a ciclo-oxigenase 2 e STAT-3-fosfatada 80 Figura 4 – Concentração de Interleucina-6 e Fator de Necrose Tumoral alfa 81 Figura 5 – Densidade relativa de metaloproteinases 2, 3 e 9 81 Artigo 3 Figura 1 – Secções e crio-secções da próstata de gerbilos; Quantificação de lipídios intracelulares e lipofuscina 93 Figura 2 – Enzimas antioxidantes e índices de estresse oxidativo 94 Anexo Figura 1 – Histologia e ultraestrutura da próstata de gerbilos jovens 124 Figura 2 – Histologia e ultraestrutura da próstata de gerbilos adultos 125 Figura 3 – Histologia e ultraestrutura da próstata de gerbilos idosos 126 Figura 4 – Esquema das principais características morfológicas de gerbilos em três períodos do tempo de vida 127 LISTA DE TABELAS Artigo 1 Tabela 1 – Parâmetros biométricos e endócrinos de gerbilos dos diferentes grupos experimentais 47 Tabela 2 – Parâmetros morfológicos de Gerbilos da Mongólia dos diferentes grupos experimentais 48 Artigo 3 Tabela 1 – Perfil lipídico dos diferentes grupos experimentais 92 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AR Receptor de andrógeno CML Células musculares lisas CP Câncer de próstata DHT Di-hidrotestosterona ERO Espécie reativa de oxigênio ERα Receptor de estrógeno tipo alfa ERβ Receptor de estrógeno tipo beta HPA Hipotalâmico-pituitário-adrenal HPB Hiperplasia prostática benigna HPG Hipotalâmico-pituitário-gonadal MEC Matriz extracelular MMP Metaloproteinase PAP Fosfatase ácida prostática PIN Neoplasia intraepitelial PSA Antígeno prostático específico SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16 1.1 A Próstata ................................................................................................................. 16 1.1.1 Características gerais .......................................................................................... 16 1.1.2 Controle hormonal .............................................................................................. 20 1.2 Hiperplasia Prostática Benigna .............................................................................. 21 1.2.1 Inflamação .......................................................................................................... 22 1.2.2 Estresse Oxidativo .............................................................................................. 22 1.2.3 Estresse Psicológico ........................................................................................... 23 1.3 Gerbilo da Mongólia ................................................................................................ 23 1.4 Fitoterapia ................................................................................................................ 25 1.4.1 Óleo de coco ....................................................................................................... 25 2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 26 3 HIPÓTESE ...................................................................................................................... 27 4 OBJETIVO ...................................................................................................................... 28 4.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 28 4.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 28 5 RESULTADOS ................................................................................................................ 29 5.1 Capítulo 1 – Artigo 1. .............................................................................................. 30 5.2 Capítulo 2 – Artigo 2. .............................................................................................. 55 5.3 Capítulo 3 – Artigo 3. .............................................................................................. 82 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO ........................................................... 95 REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 96 ANEXO .......................................................................................................................... 105 16 1 INTRODUÇÃO 1.1 A Próstata 1.1.1 Características gerais Um dos resultados da evolução do sistema reprodutivo e da competição de espermatozoides como pressão seletiva foi o surgimento da próstata (RAMM; PARKER; STOCKLEY, 2005). A próstata é órgão do sistema genital masculino é do tipo glandular e sua secreção é fundamental para o sucesso reprodutivo (MARKER et al., 2003a), uma vez que garante aos espermatozoides condições ideais de sobrevivência e viabilidade durante e após a ejaculação (TABOGA; VILAMAIOR; GÓES, 2009). Nas últimas décadas diversos estudos têm revelado que essa glândula não é exclusiva do organismo masculino, sendo encontrada em fêmeas de diversos mamíferos, incluindo humanos (SANTOS; TABOGA, 2006; WHIPPLE, 2002). No homem e na maioria dos animais, este órgão é localizado próximo ao colo da bexiga e à uretra, possui um componente glandular e um muscular (Fig.1) que permite realizar sua função de produzir e liberar a maior fração do fluido seminal (ALUKAL; LEPOR, 2016; UNTERGASSER; MADERSBACHER; BERGER, 2005). Figura 1. Posição anatômica da próstata, localizada abaixo da bexiga e circundando a uretra. Em humanos, a próstata é dividida em zona central (cz), transicional (tz) e periférica (pz), além das regiões fibromuscular (fz) e periuretral (pgr). Fonte: Modificado de (VERZE; CAI; LORENZETTI, 2016) . A próstata apresenta morfologia variável entre as classes de mamíferos, em roedores, por exemplo, lobos distintos bilateralmente simétricos compõem o complexo prostático que circunda a uretra na base da bexiga, são designados como o lobos ventral, lateral, dorsal e ainda, associados às glândulas seminais, o lobo anterior ou glândula coaguladora (PRICE, 1963) (Fig. 2). O lobo ventral é o componente mais utilizado do complexo prostático em estudos para compreender a biologia da próstata (JESIK; HOLLAND; LEE, 1982). Essa preferência deve- 17 se ao seu tamanho, à sua sensibilidade à ação de andrógenos, e maior incidência de hiperplasia e outras lesões nesta região da próstata (BANERJEE et al., 1998; SHAPPELL et al., 2004). Figura 2. A: Desenho esquemático do complexo prostático de rato circundando a bexiga. B: Lobos prostáticos de rato isolados. Fonte: (AHMAD; SANSOM; LEUNG, 2008; MARKER et al., 2003b) A próstata é classificada histologicamente como uma glândula túbulo-acinar composta, formada pelos compartimentos epitelial e estromal, que apresentam funções e populações celulares distintas, mas conservadas entre diferentes espécies como roedores, morcegos e humanos (ALBERNAZ et al., 2021; OLIVEIRA et al., 2016; VERZE; CAI; LORENZETTI, 2016). A atividade secretora da próstata ocorre principalmente na porção alveolar, entretanto os ductos também podem secretar alguns componentes para o conteúdo final da secreção prostática (REESE et al., 1986). A secreção é sintetizada em um epitélio, organizado em ácinos, composto de quatro tipos de células: basal, secretora, intermediária e neuroendócrina que são dependentes de hormônios esteroides e reagem diferentemente a cada um. As células secretoras são os tipos mais frequentes e a elas compete a síntese e secreção de proteínas como o antígeno prostático específico (PSA) e a fosfatase ácida prostática (PAP) (MARKER et al., 2003b; RISBRIDGER; TAYLOR, 2006). Na maioria dos mamíferos, as células basais se localizam entre o epitélio secretor e a membrana basal e são fonte progenitora das células secretoras, já A B 18 as células neuroendócrinas são pouco frequentes e podem ser diferenciadas por técnicas específicas de coloração (MARKER et al., 2003a; REBELLO et al., 2021). Apesar das células secretoras, basais e as neuroendócrinas diferirem quanto à regulação hormonal, todas estão envolvidas na secreção de proteínas e substâncias de baixo peso molecular que também compõem o fluido prostático (BONKHOFF; REMBERGER, 1998). As células epiteliais são separadas do estroma por uma lâmina basal (CZYŻ; SZPAK; MADEJA, 2012) (Fig3). Os ácinos secretores e ductos são envoltos por um estroma conjuntivo ricamente vascularizado (DE CARVALHO; TABOGA; VILAMAIOR, 1997). O estroma prostático consiste em um arranjo complexo de células musculares lisas (CML), que sofrem contração no processo de ejaculação (ROSS; PAWLINA, 1979), e fibroblastos imersos em uma matriz extracelular (MEC) (TUXHORN; AYALA; ROWLEY, 2001). Além de desempenhar um papel estrutural a CML e os fibroblastos são essenciais para a manutenção da homeostase da próstata, uma vez que produzem fatores autócrinos e parácrinos que regulam diversos processos fisiológicos no estroma (MARKER et al., 2003a; ROCHEL et al., 2007b). A atividade dessas células estromais mantém a estrutura básica da MEC sintetizando proteoglicanos (KOFOED et al., 1990), componentes de fibras colágenas e elásticas (DE CARVALHO; TABOGA; VILAMAIOR, 1997; VILAMAIOR et al., 2000) e metaloproteinases de MEC (MMPs) (KIANI et al., 2020) (Fig.4). Neste compartimento também se encontram células fagocitárias, como macrófagos e células endoteliais vasculares, além de telócitos, um tipo celular que faz intercomunicação entre as células estromais e participa do desenvolvimento e manutenção da próstata (SANCHES et al., 2017, 2021). O epitélio e o estroma compartilham características comuns em diferentes animais, independentemente de variações anatômicas da glândula, sendo assim, é possível fazer homologias e analogias morfo-funcionais entre animais de laboratório e o homem (PRICE, 1963). 19 Figura 3. A: Na parte superior é mostrado o esquema ilustrativo do ácino prostático composto por células epiteliais (indicadas como células luminais), basais, e neuroendócrinas dispostas sobre uma lâmina basal, e a secreção é armazenada no lúmem; na parte inferior é mostrado um ácino em um corte histológico da próstata de Gerbilo da Mongólia corado com HE. B: Esquema do epitélio secretor composto por células epiteliais (células luminais), basais, intermediárias e neuroendócrinas. Abaixo do epitélio é mostrado a lâmina basal e o estroma contendo células musculares lisas, fibroblastos e células endoteliais. Abaixo é mostrado o epitélio e estroma em um corte histológico da próstata de Gerbilo da Mongólia corado com HE. Fonte:Arquivo pessoal e (REBELLO et al., 2021) modificado. Figura 4. Esquema dos principais componentes do estroma e do epitélio. Fonte: Modificado de (BARRON; ROWLEY, 2012) A B 20 1.1.2 Controle hormonal A próstata é regulada e dependente de andrógenos para o desenvolvimento, durante a embriogênese, e para sua manutenção ao longo da vida (MARKER et al., 2003a). A produção desses hormônios é regulada pelo eixo hipotálâmico-hipofisiário-gonadal (CUNHA et al., 2001; MARKER et al., 2003a) e eles agem em células alvo da próstata por meio da interação com os seus respectivos receptores hormonais específicos, como os receptores de andrógeno (AR) e os receptores de estrógeno (HSING; REICHARDT; STANCZYK, 2002). O principal hormônio andrógeno com interação prostática é a di-hidrotestosterona (DHT) que é resultante da conversão da testosterona pela enzima 5-α-redutase e, junto com a testosterona, ligam-se ao AR e ativam a maquinaria de transcrição de genes relacionados a atividades como crescimento celular, produção de PSA entre outros (TABOGA; VILAMAIOR; GÓES, 2009). Sendo assim, a expressão desse receptor, juntamente com os níveis de andrógenos, é responsável por controlar a razão entre proliferação e morte celular (TAN et al., 2015). Nesse cenário a atividade da 5-α-redutase tem papel fundamental no controle da proliferação celular prostática e consequentemente na modulação da hiperplasia dos compartimentos estromais e epiteliais (BECHIS et al., 2014). Além dos andrógenos, os estrógenos também controlam a fisiologia da próstata, uma vez que expressa receptores de estrógenos do tipo alfa (ER) e do tipo beta (ER) (MCPHERSON; ELLEM; RISBRIDGER, 2008). Além da expressão desses receptores, na próstata também ocorre a síntese de estrógeno por efeito da atividade da aromatase (CYP19) que converte testosterona em estradiol (GRINDSTAD et al., 2016). A participação dos estrógenos no controle da biologia prostática é apontada como um dos fatores potenciais de risco associados ao desenvolvimento de hiperplasia prostática benigna (HPB) e câncer de próstata (CP) (HENDERSON; FEIGELSON, 2000). Essa capacidade é diretamente relacionada com os níveis da expressão dos receptores ERα e ERβ e as diferentes respostas desencadeadas após a ligação dos hormônios com mesmos (CHOI et al., 2016). No tecido prostático, o aumento da expressão de ERα é associado à proliferação celular anormal e inflamação, já para o ERβ é atribuído um papel anti-proliferativo e anti-inflamatório (ELLEM; RISBRIDGER, 2009). Durante o envelhecimento os níveis de testosterona diminuem (HARMAN et al., 2001). Uma das consequências dessa alteração hormonal é o comprometimento da dinâmica celular, ou seja, do equilíbrio entre proliferação e morte e acarretar no desenvolvimento de HPB que compromete a funcionalidade do sistema urinário, além de estar relacionada à iniciação do processo carcinogênico (BONKHOFF; REMBERGER, 1998). Em adição, alterações nos níveis 21 androgênicos interfere em fatores de crescimento que podem estimular ou inibir, dependendo da situação, a divisão e a diferenciação celular (ROEHRBORN, 2008a) (Fig. 5). As consequências do envelhecimento na morfologia da próstata vão desde alterações dos componentes estromais, como alterações no arranjo de fibras colágenas e elásticas, alterações intracelulares, como aumento de acúmulo lipídico e de lipofusina, até o desenvolvimento de leões prostáticas como neoplasias intraepiteliais (PIN), atrofias e carcinomas microinvasivos (CAMPOS et al., 2008). Figura 5. Esquema da ação de andrógenos e de fatores de crescimento na proliferação e na morte celular prostática em condições normais (A) e na HPB (B) Fonte:(ROEHRBORN, 2008). 1.2 Hiperplasia Prostática Benigna A HPB é uma doença que afeta mais de cinquenta por cento dos homens com mais de cinquenta anos de idade (EGAN, 2016), sendo assim, dezenas de milhões de homens nessa faixa etária em todo o mundo possuem HPB e os dados epidemiológicos nos Estados Unidos, Europa e outras regiões sugerem que a incidência e prevalência dessa condição aumentará em um futuro próximo devido ao envelhecimento da população e o aumento da prevalência de síndrome metabólica e seus componentes (PATEL; PARSONS, 2014). Em geral, os dados da literatura sugerem que a patogênese da HPB é influenciada por diferentes mecanismos hormonais, em particular: os andrógenos e a atividade de seus receptores, a função dos fatores de crescimento 22 e a importância do metabolismo do estrogênio, porem outros aspectos devem ser considerados, como inflamação crônica e os efeitos da síndrome metabólica (LA VIGNERA et al., 2016; NGAI et al., 2017). 1.2.1 Inflamação A Inflamação e seus mediadores são relacionados diretamente com a HPB (DE NUNZIO; PRESICCE; TUBARO, 2016) e as células inflamatórias e seus produtos comumente associados com HPB são observadas no CP (KRUŠLIN et al., 2017). O aumento da população de células inflamatórias como linfócitos B e T na próstata, além da ativação de citocinas que aumentam a concentração de fatores de crescimento podem contribuir para o desenvolvimento da HPB (GANDAGLIA et al., 2017). Já os macrófagos desempenham um papel decisivo na imunidade inata e adaptativa e são cruciais no controle da resposta inflamatória e no processo de reparação e homeostase tecidual (VARIN; GORDON, 2009). Nesse cenário, alterações no ambiente prostático induzidas pela inflamação levam a várias mudanças na expressão gênica e subsequentemente resultam em inflamação crônica, isso contribui para mudanças na estrutura da próstata e para surgimento dos sintomas relacionados a HPB (TAOKA; KAKEHI, 2017). Estudos sugerem fortemente que a HPB é uma doença inflamatória imunológica (KRAMER; MARBERGER, 2006) e que a inflamação prostática deva ser considerada um novo campo na pesquisa básica e clínica em pacientes com HPB, assim como alvo para novas estratégias de tratamento (DE NUNZIO; PRESICCE; TUBARO, 2016). 1.2.2 Estresse Oxidativo O aumento do estresse oxidativo, ou de espécies reativas de oxigênio (EROs), deve ser considerada no estudo da HPB, uma vez que desempenha um papel importante nessa patogênese (ZABAIOU et al., 2016). Em condições fisiológicas normais, a produção de EROs é uma condição normal e leva à maior fosforilação de I-kβ (Inibidor de Kappa Beta) e translocação do NF-kβ (Fator Nuclear Kappa Beta) para o núcleo, resultando na transcrição de enzimas antioxidantes e a manutenção do equilíbrio (TOMÁS-ZAPICO; COTO-MONTES, 2005). O estresse oxidativo é definido como uma interrupção do equilíbrio entre moléculas oxidantes e redutoras devido à produção excessiva de EROs, sendo que esse desequilíbrio leva ao dano oxidativo do DNA e fornece uma condição favorável para a etiopatogenia de diversas doenças incluindo prostáticas (KAYA et al., 2017). Nesse aspecto, sabe-se que o aumento do estresse oxidativo afeta todas as funções e processos celulares, incluindo replicação do DNA e divisão celular, e respostas inflamatórias, sendo considerado, portanto, um dos mecanismos que 23 desencadeiam reações envolvidas no desenvolvimento e progressão da HPB (UDENSI; TCHOUNWOU, 2016). 1.2.3 Estresse Psicológico Além de fatores fisiológicos relacionados a HPB já bem estabelecidos, como inflamação e EROs, outra temática ainda pouco elucidada tem chamado a atenção. O estresse psicológico é apontado como um agente causador de HPB por promover hiperatividade do sistema nervoso simpático (SNS) e como consequência interferir no controle de proliferação e morte celular (HUANG et al., 2009; ULLRICH; LUTGENDORF; KREDER, 2007). Além disso, há indícios que o estresse psicológico também interfira no eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal (HPG) (ULLRICH et al., 2005). Dados recentes mostram que há uma relação entre o envelhecimento e o estresse psicológico, e essa relação influencia na progressão do PC por ação inflamatória (BELLINGER et al., 2021). Entretanto, estudos que induzem estresse em animais estão sujeitos a muitas variáveis expostas durante os experimentos, como a interferência do envelhecimento no eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA), que interferem nos dados obtidos (GRAY; CHAOULOFF; HILL, 2015). Nesse cenário, a literatura que aborda os efeitos diretos do estresse psicológico na próstata é escassa, revelando um campo intrigante e pouco explorado. 1.3 Gerbilo da Mongólia O Gerbilo da Mongólia (Meriones unguiculatus), uma espécie que pertence à família Muridae e subfamília Gerbillinae, é um roedor de pequeno porte com peso de aproximadamente 70 gramas em idade adulta. São animais de origem desértica e de simples manutenção em cativeiro, uma vez que apresenta comportamento dócil e se adaptam à diferentes condições (BATCHELDER et al., 2012; FISHER; LLEWELLYN, 1978). O emprego desse roedor como modelo experimental tem sido considerado em diversas áreas, como fisiologia (KHAKISAHNEH et al., 2019), genética (RAZZOLI et al., 2003) e comportamental (DENG; LIU; WANG, 2017). Outra área em que o gerbilo se mostra com um bom modelo experimental é a da reprodução, sendo utilizado em estudos de mama (LEONEL et al., 2020), testículo (PINTO-FOCHI et al., 2016) e próstata (GUERRA et al., 2019). A próstata do gerbilo é parecida com as de outros roedores e é constituída pelos lobos ventral, anterior, dorsal e dorsolateral que estão associados à uretra (Fig.6) (ROCHEL et al., 2007a). Dentre os lobos da próstata de gerbilo, o lobo ventral é o mais estudado e é altamente responsivo aos níveis androgênicos, tanto em fêmeas quanto em machos (CORDEIRO et al., 2008). Considerando os principais aspectos envolvidos na HPB, o Gerbilo da Mongólia é um modelo 24 muito interessante para o estudo dessa doença, posto que nesse animal há um aumento de ERO e também na suscetibilidade ao dano oxidativo durante o envelhecimento (SOHAL; AGARWAL; SOHAL, 1995). Além disso, esse animal apresenta HPB e PIN espontâneas quando idoso (CAMPOS et al., 2008; PEGORIN DE CAMPOS et al., 2006) e possui uma singularidade para estudos de metabolismo lipídico que é a relativa facilidade com que desenvolve hiperlipidemia em resposta à dieta, característica não compartilhada por outros roedores comumente utilizados (NICOLOSI et al., 1981). Figura 6. Complexo prostático do Gerbilo da Mongólia adulto em esquema de vista lateral (A) e dorsal (A) e do órgão fresco em vista ventral (C) e dorsal (D). Bexiga urinária (BL); glândula coaguladora ou lobo anterior (CG); lobo dorsal (DL); lobo dorsolateral (DLL); vesícula seminal (SV); uretra pélvica e músculo uretral (UR); lobo ventral (VL). Fonte: (ROCHEL et al., 2007b). 25 1.4 Fitoterapia O crescente aumento de opções no mercado farmacêutico, torna a prescrição da terapia médica apropriada para pacientes com HBP uma tarefa cada vez mais complicada, uma vez que o equilíbrio final entre eficiência, efeitos adversos e custos é muitas vezes difícil de alcançar (SHUM; LAU; TEO, 2017). Nesse contexto, além das drogas sintéticas anti-androgênicas, comumente indicadas para o tratamento de HPB e complicações do trato urinário correlatas ao longo das últimas décadas (LAM; ROMAS; LOWE, 2003), medicamentos complementares e alternativos, como os fitoterápicos entraram em cena como uma opção de tratamento para BPH (KEEHN; TAYLOR; LOWE, 2016). Cerca de trinta compostos fitoterapêuticos são utilizados tanto para “manter uma próstata saudável” quanto para o tratamento da HBP, como Serenoa repens, Hypoxis rooperi, Secale cereale (WILT et al., 2000), e seus mecanismos de ação variam desde anti-androgênicas até antioxidantes e anti-inflamatórias (ADARAMOYE et al., 2017; JEON et al., 2017; KEEHN; TAYLOR; LOWE, 2016). Dentre as possibilidades de fitoterápicos, um que chama a atenção é o óleo de coco, em razão de ser apontado como responsável por reduzir o aumento da glândula prostática em animais com HPB induzida após tratamento com testosterona (DE LOURDES ARRUZAZABALA et al., 2007). 1.4.1 Óleo de coco O óleo de coco, obtido da espécie Cocos nucifera, é um alimento funcional emergente, comumente utilizado como medicina tradicional e um suplemento dietético no sul da Índia e muitos outros países tropicais. Esse óleo é relatado como responsável por reverter a condição de lipotoxicidade no fígado e melhorar a resistência à insulina (NARAYANANKUTTY et al., 2017). No que diz respeito a sua composição, este óleo é considerado saturado, pois apresenta cerca de 90% de ácidos graxos dessa natureza sendo o ácido láurico o lipídio mais abundante (AKPAN et al., 2006), seguido dos ácidos mirístico, palmítico, caprílico, cáprico e esteárico (SHAHIDI; AMBIGAIPALAN, 2015). Entretanto. há uma pequena fração de compostos insaturados (cerca de 9%), que compreendem os ácidos oleico e linoleico e estes são constituintes importantes das células, envolvidos na função celular, e podem interferir na fluidez da membrana e regular a sinalização celular, a expressão gênica e a inflamação (CALDER, 2008). Alguns desses componentes do óleo de coco ainda possuem atividade antioxidante (YEAP et al., 2015), e são capazes de alterar o perfil lipídico sérico (RESENDE et al., 2016). 26 2 JUSTIFICATIVA Atualmente a literatura revela que diversos fatores influenciam no processo de desenvolvimento e progressão de HPB. Entre esses fatores, alguns são bem estabelecidos, como os níveis hormonais e a expressão de receptores androgênicos e estrogênicos (PRINS, 2008; ROEHRBORN, 2008b). Outras condições que modulam o desenvolvimento e a progressão dessa patologia são a inflamação e o estresse oxidativo (KRUŠLIN et al., 2017; ZHAO et al., 2021). Há ainda fatores pouco elucidados, como o estresse psicológico, capazes de interferir na HPB (ULLRICH et al., 2005). Considerando a suscetibilidade dessa doença a tantas variáveis fisiológicas, é considerável a diversidade de estudos sobre possíveis terapias para sanar esse problema que atinge mais de 50% dos homens com mais de 50 anos de idade. Nesse contexto, o estudo de possíveis agentes fitoterápico como tratamento para a HPB tem aumentado (KEEHN; TAYLOR; LOWE, 2016). O óleo de coco, que tem sido amplamente utilizado como suplementação alimentar, apresenta componentes que têm sido alvos de estudos por interferir em vias associadas à HBP e sua administração em animais com HPB mostrou-se capaz de reduzir o peso prostático absoluto (DE LOURDES ARRUZAZABALA et al., 2007). Entretanto, até o momento não há nenhum estudo sobre o resultado do consumo de óleo de coco durante o envelhecimento na HPB e em as condições fisiológicas que interferem nessa patologia, como inflamação e estresse oxidativo. 27 3 HIPÓTESE Este trabalho teve como hipótese que o consumo de óleo de coco durante o envelhecimento influencie o desenvolvimento de HPB, bem como em condições associadas a esta patologia, como inflamação e estresse oxidativo. 28 4 OBJETIVO 4.1 Objetivo Geral O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar os efeitos do consumo de óleo de coco durante o envelhecimento na morfologia prostática de Gerbilos da Mongólia bem como seus efeitos na hiperplasia prostática benigna espontânea. 4.2 Objetivos específicos • Avaliar a morfologia e expressão de receptores hormonais na próstata, além dos níveis hormonais séricos de animais que envelheceram consumindo óleo de coco e sob procedimentos de manipulação e gavagem. • Verificar o status inflamatório da próstata dos animais submetidos aos procedimentos experimentais e tratados com óleo de coco. • Analisar o efeito do consumo de óleo de coco e da manipulação experimental no perfil oxidativo e metabólico dos animais. 29 5 RESULTADOS Os resultados do presente trabalho estão apresentados em três capítulos em forma de manuscritos, além disso é apresentado um capitulo extra, em anexo: 30 5.1 Capítulo 1 – Artigo 1. Será submetido à revista “Brain, Behavior, and Immunity” Coconut oil mitigates the effects of chronic stress on the prostate of gerbils. Luiz Henrique Alves Guerra1, Nayara Fernanda Costa Castro1, Fernanda Costa Jubilato1, Ellen Cristina Rivas Leonel2, Silvana Gisele Pegorn Campos1, Marília Freitas Calmon1, Paula Rahal1, Sebastião Roberto Taboga1, Patrícia Simone Leite Vilamaior1*. 1 Department of Biological Sciences, Institute of Biosciences, Humanities and Exact Sciences, São Paulo State University (UNESP), São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. 2 Department of Histology, Embryology, and Cell Biology, Federal University of Goiás, Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brazil. *Correspondence: patricia.vilamaior@unesp.br (Dr Patrícia Simone Leite Vilamaior). Department of Biological Sciences, Institute of Biosciences, Humanities and Exact Sciences, São Paulo State University (UNESP), Rua Cristóvão Colombo 2265, Jardim Nazareth, 15054- 000, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. Abstract Despite of benign prostatic hyperplasia (BPH) association with aging and inflammation, it is also influenced by chronic psychological stress which requires new strategies to minimize its impact on BPH. This work evaluated the coconut oil intake efecct on the prostate of aging gerbils under chronic stress conditions. For this purpose, three experimental groups were assigned: intact control, stress control and stress nourished with coconut oil. Gavage procedure was performed in alternate days, as chronic stress inducer, for one year. Cortisol, testosterone and estradiol serum levels were determined. Histopathological analysis, cell proliferation index (TUNEL and P-H-H3) and receptors of androgen and estrogen were evaluated on the prostate. The chronic stress induced by gavage aggravated prostatic lesions, increased androgen receptor (AR) and estrogen receptor alpha (ERα) expression. Coconut oil intake attenuated the stress- induced alterations in addition to increase apoptosis rate in the prostatic cells. In conclusion, 31 chronic stress aggravated prostate lesions, such as BPH, whereas coconut oil treatment throughout aging mitigated the stress impacts on prostate health. Keywords: Chronic stress; Ventral Prostate; Aging; Benign prostatic hyperplasia. Introduction The elderly population is increasing and it is expected that by 2050, sixteen percent of the global population will be over the age of 65 [1]. Aging is a complex process, highly variable among different species and strongly controlled by many genes, being susceptible to several factors [2]. Some lifestyle-related risk factors, such as smoking, alcohol consumption, and lack of physical activity, are pointed out as "aging accelerators” [3], including psychological chronic stress [4, 5]. Therefore, the search for improvements in the aging process has grown in recent decades. Benign prostatic hyperplasia (BPH) is an aging-related disease and affects more than fifty percent of men over 50 years old [6], and, recent trends in the United States, Europe, and other regions suggest that its incidence and prevalence will increase due to increase in elderly population [7]. The BPH is influenced by several hormonal mechanisms, in particular, the androgens and their receptors activities, growth factors, estrogen metabolism, chronic inflammation and metabolic syndrome [8]. However, the association of stress and other psychological factors with BPH and lower urinary tract symptoms (LUTS) is not clear yet [9]. Chronic stress is pointed as a potential promoter of BPH in rats by overactivation of the sympathetic nervous system (SNS) and interference in epithelial proliferation [10]. In addition, social stress has also been reported as a plausible factor that affects prostate-specific antigen (PSA) levels [11]. The search for new strategies BPH treatment has increased and over the last decades, complementary and alternative medicines like phytotherapics agents have emerged [12]. Among them, coconut oil has been shown to reduce prostate gland enlargement in animals with testosterone-induced BPH, as observed in adult Sprague-Dawley rats [13], the cortisol levels in guinea pigs [14] and to interfere with depressive behavior in prenatally stressed rodents [15]. However, up to date, there are no evidence of its impact on psychological stress and BPH. 32 The use of animal models in stress research is complex since several conditions could interfere in the results, including animal handling and drugs administration [16]. Research concerning drug effects on stress-dependent BPH presents limitations in control groups, since the experimental condition of induced hyperplasia often interferes on the animal stress. An alternative solution to this limitation is the use of experimental models that develop BPH spontaneously. Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) represents an appropriate model to investigate the effects of different drugs as well as handling animals effects during the experimental procedures in BPH, since such rodents develop BPH, prostatic lesions and adenocarcinomas spontaneously along aging [17, 18]. In addition, gerbils increase cortisol levels in stressful conditions. Therefore, this work aimed to evaluate the animal handling- related stress and the coconut oil effect on gerbil prostate throughout aging. Materials and Methods Experimental design and sample collection Animals were breed and raised at Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences /São Paulo State University (IBILCE/UNESP) with approval and in compliance with the institutional ethics committee guidelines (183/2018- CEUA- São José do Rio Preto). Animals were kept in ventilated mini-isolators (two animals per box) under controlled light and temperature conditions (12h light/12h dark - 24ºC) with water and chow ad libitum. For the experiment, 36 male Mongolian Gerbils were distributed equally into 3 groups: Intact control (IC): animals that did not undergo to any restrain or stress induction; Gavage control (GC): at the end of adulthood (100 days of age) animals were restrained for 30 seconds and received 0.1 ml of water by gavage; Coconut oil (CO): at the end of adulthood (100 days of age) animals were restrained for 30 seconds and received 0.1 ml of coconut oil (dose equivalent to 13ml for an adult man weighing 80kg [19]) by gavage. GC and CO groups received oral gavage on alternate day regimen for one year and were euthanized at 465 days of age. Gavage was performed by introduction of a reusable appropriate needle deep into the esophagus in non-anesthetized animals under restrainment condition. At the end of the experiment, animals were euthanized by deep anesthesia, weighed for biometric analysis, decapitated for blood collection and prostate harvested entirely. The blood was centrifuged, and serum stored at -80ºC. Prostates were weighed, and ventral lobes used for morphological and protein analysis. Tissues were either frozen immediately in liquid nitrogen (n=6) or fixed by immersion in 4% formaldehyde prepared in phosphate buffer, pH 7.2, for 24h (n=6). Following the formaldehyde fixing 33 process, samples were washed with distilled water, dehydrated in an alcohol battery, immediately processed, and included in Histosec (Merck, Germany). Hormonal analysis Cortisol, testosterone, and 17-β-estradiol serum levels were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay using high sensitivity specific commercial kits (IBL International; items number 52061, 52151, and 52041 respectively) according to the manufacturer’s instructions and the readings determined in a microplate reader (TECAN ‐ Infinite F50). Morphological analysis Tissues were sectioned at 4µm, and slides stained with hematoxylin-eosin (HE) for general histology. Stromal fibrillary components were accessed using the following staining methods: for collagen fiber analysis, slides were stained with Picrosirius Red; for reticular fiber, with Gömöri’s reticulin; and, for the elastic fiber, with Weigert’s resorcin-fuchsin method. Slides were analyzed with an Olympus BX60 light microscope (Olympus, Japan), and the images digitized with DP‐BSW V3.1 (Olympus, Japan) and Image‐ProPlus 6.1 software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). The relative frequency of prostatic compartments (epithelium, lumen, smooth muscle layer (SML), non-muscular stroma, and blood vessels) and stromal fibrillar components (collagen and elastic fibers) were obtained with M130 multipoint test system Weibel, 1978 [20] using 30 random fields per group. Height of the secretory epithelial cells (µm) and thickness of the smooth muscle layer (µm) were assessed in the histological sections using 200 measurements for each experimental group. Incidence and multiplicity of lesions Prostatic proliferative disorders incidence and multiplicity rates were obtained by histopathological analysis of 3 slides, from different histological depths, from each animal (n=18/group) and tissue sections examined by investigators blindly. Samples were stained by HE and digitized at ×400 magnification using the slide scanner system (Olympus VS120 ‐ S5). Prostatic lesions classification was based on the well-established criteria of Bar Harbor [21], previously applied in the Mongolian gerbil [18, 22, 23]. The incidence was calculated as % = (number of animals with changes /number of animals per group), while the multiplicity as (number of changes in each animal / number of slides). The following prostatic lesions were considered: prostatic epithelial hyperplasia (PEH) - area of the epithelium with cell aggregation, stratification, and irregularly shaped cells; grade I intraepithelial neoplasia (PIN I) - areas with 34 clustering of cells with enlarged nuclei of varying size, dense chromatin, and an occasional large and prominent nucleolus.; grade II intraepithelial neoplasia (PINII) - Similar to PIN I but with nuclei exhibiting strongly dense chromatin and frequently large nucleoli, basal cell discontinuity, and invasion of other prostatic compartments without muscular stroma disruption; cribriform intraepithelial neoplasia (PINC) - epithelium exhibiting PIN characteristics but displayed as micro-acini.; atrophy (ATR) - area with thinning of the epithelium and muscular stroma; microinvasive carcinoma (MC) - similar to PIN II but with microvessels and rupture of the adjacent muscular layer confirmed by immunohistochemistry staining for α-actin and reticular fibers disruption. Cell proliferation index Immunohistochemistry was performed for P-H-H3 as a marker of cell proliferation, according to the procedures described in the section "Immunohistochemistry" mentioned thereafter. To access the apoptosis rate, TUNEL assay was performed with ApopTag® commercial kit (Plus peroxidase in situ apoptosis detection kit- S7101- Merck, CA, USA) to detect DNA fragmentation following the manufacturer´s instructions. Apoptosis and proliferation frequencies were determined as the ratio of marked cells to the number of total cells. At least 6000 cells were counted in the epithelium and smooth muscular layer per group. The proliferation index was assessed by the frequency of proliferation to apoptosis ratio (P-H- H3/TUNEL). Hormonal receptor expression analysis Androgen receptor (AR) and estrogen receptors alpha and beta (ERα and ERβ) expression were assessed by immunohistochemistry and western blotting. Positive cells frequency was determined by the ratio immunolabeled cells to the total number of cells of the epithelium and smooth muscular layer. Protein quantification was determined by relative density to GAPDH using ImageJ 1.46r software (Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, MD, USA). Immunohistochemistry Anti-α-actin (mouse monoclonal, 1A4, 1:100, sc-32251, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); anti- phospho-histone H3 (P-H-H3, rabbit polyclonal, H3, 1:75, Ser10, 9701, Cell Signaling, Danvers, USA); anti-AR (rabbit polyclonal IgG, N-20, 1:75, sc-816, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); anti-ERα (polyclonal IgG rabbit, 1:50, PA5-34577, 35 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA); and anti-ERβ (polyclonal IgG rabbit, 1:50, PA1-310B, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) were used as primary antibodies. Antigen retrieval was performed by tissue sections embedding in 10mM citrate buffer (pH 6.0) for α-actin, PHH3, AR and ERβ; and TRIS-EDTA buffer (pH 9) for ERα. temperature and time for retrieval were 96°C for 40 minutes for PHH3, AR, and ERβ, 93°C for 20 minutes for α-actin, and a microwave sequence (2 x 7 min at low power and 1 x 7 min at medium-low power) for ERα. Endogen peroxidases were blocked by immersing the slides in 3% H2O2 at room temperature for 30 minutes. Then, non-specific proteins were blocked with 5% skimmed milk in TBS. Sections were incubated overnight at 4°C (PHH3, AR, ERα and ERβ) or for 1h at room temperature (α-actin) before secondary antibodies (Polymer kit Novocastra Novolink RE7230-CE, Leica Biosystems, Buffalo Grove, USA) were applied for 1h at room temperature. Positive staining was detected using 3-30’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) chromogen (NovolinkMaxDAB, RE7270-CE, Leica Biosystems, Buffalo Grove, USA) and counterstained with hematoxylin. Western blot Frozen samples (6 per group) were smashed and incubated for extraction (CelLytic MT cell lysis reagent, C3228, Sigma Aldrich) at 4 °C, for 60 minutes, under agitation. Protease activity was blocked by inhibitors (Protease Inhibitor Cocktail, P8340, Sigma Aldrich), followed by centrifugation for 20 min at 14,000 rpm, 4 °C. Protein quantification was determined by BCA Protein Assay Kit (Pierce BCA Protein Assay Kit, 23,227, Thermo Fischer Scientific) and the absorbance measured in a microplate reader (SPECTROstar Omega, BMG Labtech). The extracts were stored at −80 °C until analysis. For SDS-PAGE electrophoresis, 15ug of sample was loaded in each lane. The bands were transferred to a nitrocellulose membrane. Blots were blocked using skimmed milk 5% in TBS +0.1% Tween (TBSt), for one hour, at room temperature. Overnight incubation under agitation with anti-AR, ERα, ERβ (1:300, 1:1000, and 1:1000 dilutions, respectively), and GAPDH (mouse monoclonal MB374 Millipore, 1:10,000) primary antibodies, diluted in skimmed milk 1% in TBSt. Subsequently, the membranes were incubated at room temperature for one hour under agitation with horseradish peroxidase- conjugated secondary antibodies (1:10,000 rabbit anti-mouse ab6728, Abcam, Cambridge, UK, or 1:10,000 goat anti-rabbit 115-035-144, Jackson Immunoresearch, Jannersville, PA, USA). Band visualization was performed with ECL system (32,109, Thermo Fischer) using ChemiDoc (ChemiDoc MP, BioRad) followed by quantification with ImageJ. Values were shown as mean of relative density to GAPDH (loading control) 36 Statistical analysis Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 6.00 software spreadsheets and graphs (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). First, the data were checked for normality using the Kolmogorov-Smirnov test. Parametric data were analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey's test. For non-parametric data, the Kruskal-Wallis test followed by Dunn's test was adopted. Differences were considered statistically significant when p < 0.05. Results GC animals showed lower body weight compared to IC, while CO unchanged (Table 1). Prostate weight decreased in CO compared to IC and GC (Table 1). Prostate relative weight was higher in GC compared to IC and CO (Table1). Serum hormone dosage in the GC group showed sharp decrease in cortisol levels, whereas in CO such reduction was milder (Table 1). Testosterone and estradiol levels unchanged under any condition (Table 1). The examples of lesions evaluated are depicted in Figure 1. Secretory epithelium showed many regions with stratifications and folds that enter toward the lumen. All experimental groups also showed BPH and PIN, resulting in the irregular appearance of the alveoli (Figure 1). The smooth muscular layer (SML) also showed to be irregular in many regions, notably proximal to the lesions (Figure1). In GC group, the SML thickness and frequency increased compared to the other groups (Table 2). In the CO group these alterations were not observed, exhibiting epithelium length, SML thickness, and frequency of prostatic compartments similar to IC (Table2). Regarding the fibrillar components collagen and elastic fibers, stress induction and coconut oil treatment did not modify the occurrence of these components (Table 2, Figure2). All experimental groups presented high incidence of lesions, showing 100% of prostatic epithelial hyperplasia (PEH), low-grade PIN (PIN I), and cribriform PIN (PINC) (Figure 3B). However, GC group showed the highest incidence of high-grade PIN (PIN II) with 66.66 % rate and the lowest incidence of atrophy (ATR) with 83.33 % (Figure 3B). On the other hand, the CO had 16.66 % of PIN II and 100 % of ATR similar to IC (Figure 3B). Incidence of microinvasive carcinoma (MC) for GC was 16.66% (Figure 3B). The multiplicity of the different lesions did not differ among the experimental groups (Figure 3A). 37 The staining patterns were shown in Figure 4 (A, C, E) for P-H-H3 and Figure 4 (B, D, F) for TUNEL. Apoptotic cells frequency in the epithelium and SML was higher in CO compared to IC; however, when each compartment was analyzed separately, apoptotic epithelial cells frequency in CO group increased compared to IC and GC (Figure 4B). SML P-H-H3 positive cells frequency in the GC group was higher than IC, but when combined to epithelium, there was no change in any experimental groups (Figure 4G). Considering SML only, the proliferation index increased in GC and CO (Figure 4H) but when combined to the epithelium or only epithelium itself, IC and GC had indexes close to each other and CO showed lower levels (Figure 4H). Androgen receptor (AR) expression analysis were shown in Figure 5. GC group showed an increase in AR expression and CO was similar to IC (Figure 5E). AR expression changed particularly in the SML (Figure 5D). Regarding estrogen receptor beta (ERβ) positive cells and protein expression, as presented in figure 6, they did not change in GC and CO groups compared to IC (Figure 6 D and E) whereas estrogen receptor alpha (ERα) positive cells showed higher frequency in GC compared to IC particularly in the epithelial compartment (Figure 7D). CO group showed no change in the expression of these receptors (Figure 7). Discussion Prostate is highly susceptible to the aging and may respond differently to this process, leading to BPH, prostate enlargement, and prostate cancer progression [24]. An experimental model for studying these aging-related alterations is the Mongolian gerbil which exhibits many morphological changes in the prostate throughout the life, and in advanced age the presence of BPH and microinvasive carcinoma is often observed [18]. Despite of Mongolian gerbil has been considered an adaptable model for laboratory handling, and levels of stress markers normalize after a one-week adaptation period [25], this is the first study to report the long-term manipulation caused stress and impacted the aging process. Laboratory routines may influence stress levels in animals [26]. Although the particularity of the gavage content may interfere with stress levels [27], the gavage itself is considered a stress inducer [28]. In addition to stress, long-term gavage can induce weight loss in mice [29], as we observed in GC group. Stress can be classified as acute or chronic based on the exposure duration to the stressor agent; the chronic stress-related conditions are time-dependent and can generate varied hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis responses [30]. 38 Cortisol level is an endocrine stress marker, since the stress condition, acute or chronic, interferes in the HPA axis affecting its [16]. In addition, different stress conditions, can interfere in other neuroendocrine pathways and regulate glucocorticoid levels leading to different cortisol levels depending on the stressor [31]. Low cortisol level, presented by the GC group, corroborates with Fries et. al. who proposes hypocortisolism in rats because of chronic stress. Therefore, we consider that changes in cortisol levels and body weight of CG animals indicated that long-term handling promoted a state of chronic stress. Given this scenario, it is interesting that coconut oil treatment during gavage attenuated the impact of stress on cortisol levels and animals’ weight. Coconut oil has higher saturation status since around 90% of its composition is made of saturated fatty acids, being the lauric acid the most abundant, followed by myristic, palmitic, caprylic, capric, and stearic acids [32]. This oil has been reported to interfere in the HPA axis and attenuate neuroendocrine responses to stressors, such as increased or decreased cortisol levels [14, 33]. Coconut oil was shown to decrease the weight of hyperplasic prostate in rats [13], but our data show that regarding the relative weight, only the GC group showed a decrease in the weight of this gland. Although the decrease in prostate weight in CO can be due to anatomical variation, the effect of stress on relative prostate weight did not occur in the CO. The morphological characteristics of the Mongolian gerbil prostate are well established [18, 34, 35] and typically composed by alveoli, commonly referred as acini, formed by secretory epithelium that limits the luminal region where the secretion is stored. Surrounding the acinus there is the SML and between the acini, there is the stroma [34]. Prostate is susceptible to changes and gerbil prostate is highly responsive to variations in androgen and estrogen levels, reflecting in the gland secretory activity [36–38]. The gerbil prostate is also susceptible to interference from treatments using oils such as corn and mineral oil [39]. One of the morphological responses is the SML thickness increase and alteration in prostatic compartments frequency [36, 37, 40]. In the present study, we observed such effect in GC group which was attenuated by coconut oil treatment. Alterations in cellular and extracellular matrix and their consequent increase are related with tumor progression [41]. Several studies showed that variations in SML were related with smooth muscle cells activity and a change in the extracellular matrix [42–44], and older animals have reactive stroma associated with malignant prostatic lesions [45]. Specially, the increased in collagen synthesis and remodeling provide a pro-tumoral environment [46, 47], which were not observed in GC and CO. 39 During aging, testosterone release is decreased and prostate responds with pronounced morphological changes [17] which is also observed for the Mongolian gerbil that exhibits prostatic lesions, including BPH and carcinoma, spontaneously at advanced age [18]. Our data corroborate the literature, since all old animals, presented lesions such as BPH and PIN at distinct grades. However, chronic stress seemed to intensify their gravity because high-grade PIN incidence raised, as well as the incidence of adenocarcinoma in GC. In breast tumors, chronic stress represents a risk factor for the development of more aggressive forms [48]. Psychological stress associated with aging modulates prostate cancer responses via changes in the inflammatory status [49]. Stress interferes in the autonomic nervous system (ANS), the HPA axis, and other neuroendocrine systems such as the reproductive axis, growth, and thyroid axis, as well as affecting the immune system [50]. Increased autonomous innervation of the prostate has been linked to prostate cancer progression [51]. These findings suggest that stress can induce BPH by interfering in regulatory systems, such as the HPA axis [9, 52]. Furthermore, inhibition of adrenergic receptors, responsible for receiving and transmitting signals of sympathetic and parasympathetic origin, led to higher rate of apoptosis in both benign and malignant conditions in the prostate [53]. Proliferative and apoptosis rate is directly related with prostatic lesions development and aggressiveness in gerbils and other animals [18]. Considering the potential action of stress as a lesion enhancer, GC group higher proliferation rate in the SML and thickness, taken together, it suggests that this prostate compartment is more susceptible to stress. Prostate stromal components, cells and extracellular matrix, are responsive to hormone levels variations and their receptors expression as well as growth factors [54–57], but the reasons for the greater responsiveness of this compartment to stress are still unknown. In contrast, coconut oil treatment indicated same proliferation rate compared with CG group but higher apoptosis rate when considered either the epithelium and SML together or the former alone, suggesting the coconut oil antiproliferative function. Its major component, lauric acid, has been reported as an anti-proliferative agent and apoptosis inducer in breast and endometrial cancer [58]. The stroma plays a critical role in mediating prostate carcinogenesis through AR and ERα, and the paracrine mechanisms of androgens and estrogens [41]. The prostate is an androgen-dependent gland since its development and differentiation as well as for its maintenance in adulthood, being mediated via AR. However, estrogens also influence prostate homeostasis, since it expresses both ERα and ERβ [59]. Chronic stress increased AR expression most remarkably in SML, while treatment with coconut oil maintained it similar to 40 the intact control group. AR expression is directly related with the prostate cell proliferation [60]. In the Mongolian gerbil, under normal conditions, this receptor has a uniform immunolocalization between epithelium and stroma, but this location standard can be modified by genetic and epigenetic mechanisms and yet unknown factors [61]. Our data indicated that stress might be a candidate for one among them and coconut oil interferes on it. Although ERβ expression remained unaltered, the ERα was shown to be responsive to stress. Estrogenic action within the prostate is complex, and both were reported to play different roles. ERα is related with the development and increase of proliferation, inflammation, and cancer, while ERβ has anti-proliferative, anti-inflammatory, and anticarcinogenic potential [62]. ERα expression herein consolidated our hypothesis that stress plays a pro-lesional role since GC group showed a higher frequency of ERα-positive cells. Interestingly, their immunolocalization was different from that of AR-positive cells. Studies regarding the localization of AR, ERα and ERβ expression in the gerbil ventral prostate suggest that the former is expressed in both the epithelium and SML, ERβ is more found in the epithelium, while ERα is in the SML [61, 63]. Conclusion As expected, prostate from older gerbils showed BPH and PINs which are aging-related alterations. However, the long-term gavage procedure provided a situation of chronic stress that seemed to enhance their progression likely the microinvasive carcinoma development. On the other hand, coconut oil treatment throughout aging, minimized the chronic stress impacts. Although more studies are needed to elucidate the key mechanisms involved our results are provocative, especially because of changes in morphology and in the receptors expression, mainly in the stroma. Stromal alterations are common in older animals [45] and may drive malignant transformation in human prostatic epithelial cells [41]. Therefore, the effectiveness of a natural product, such as coconut oil, to mitigate the chronic stress impact on prostate along aging caught attention for further studies regarding this issue. Acknowledgments The authors thank Mr. Luiz Roberto Falleiros Júnior for his technical assistance during the development of the experiments and Dr. Eliane Gonçalves de Freitas for providing all necessary facilities to carry out the ELISA analysis. 41 References 1. United Nations Department of Economic and Social Affairs Population Division (2019) World Population Ageing 2019 2. Flatt T, Partridge L (2018) Horizons in the evolution of aging. BMC Biol 16:1–13. https://doi.org/10.1186/s12915-018-0562-z 3. Fiorito G, McCrory C, Robinson O, et al (2019) Socioeconomic position, lifestyle habits and biomarkers of epigenetic aging: a multi-cohort analysis. Aging (Albany NY) 11:2045–2070. https://doi.org/10.18632/aging.101900 4. Révész D, Verhoeven JE, Milaneschi Y, et al (2014) Dysregulated physiological stress systems and accelerated cellular aging. Neurobiol Aging 35:1422–1430. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2013.12.027 5. 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Experimental groups IC GC CO Biometric data (g) Body weight 101.8 ± 13.85a 91.98 ± 13.23b 96.84 ± 14.69a,b Prostate weight 0.8966 ± 0.1232a 0.8978 ± 0.1083a 0.7947 ± 0.1103b Relative prostate weight x10-2 0.8897 ± 0.1317a 0.9803 ± 0.1141b 0.8327 ± 0.1410a Hormonal data Cortisol (ng/mL) 136.5 ± 17.83a 31.48 ± 22.10b 89.70 ± 33.92c Testosterone (ng/mL) 1.85 ± 0.66 1.79 ± 0.42 1.8 ± 0.51 17β-estradiol (pg/mL) 35.67 ± 9.44 59.47 ± 33.96 40.20 ± 17.96 48 Table 2: Morphological parameters of Mongolian gerbil in the different experimental groups. Values expressed as mean ± standard deviation. Superscript a and b represent statistically significant differences (p ≤ 0.05) among the experimental groups. Experimental groups IC GC CO Morphometric data (µm) Epithelium height 18.26 ± 1.65 20.58 ± 4.11 17.71 ± 1.57 SMLthickness 11.66 ± 1.01a 14.01 ± 1.04b 11.45 ± 1.16a Stereological data (%) Epithelium 22.31 ± 6.43 25.33 ± 10.50 18.49 ± 1.17 Lumen 48.10 ± 12.79 44.26 ± 11.76 53.54 ± 6.65 SML 10.51 ± 2.40a,b 15.90 ± 7.60b 8.71 ± 2.07a Stroma 18.00 ± 6.65 14.92 ± 3.67 18.42 ± 6.49 Blood vessels 1.07 ± 0.61 2.15 ± 1.93 0.83 ± 0.58 Stromal fibers data (%) Collagen fibers 37.21 ± 9.14 42.52 ± 4.41 33.65 ± 6.49 Elastic fibers 0.28 ± 0.04 0.30 ± 0.02 0.30 ± 0.02 49 Figures: Figure 1: Lesions observed in the ventral prostate of old gerbils stained with HE (A, B, C, D, E and H), with Gomori's reticulin (G) and marking for a-actin (F). Prostatic epithelial hyperplasia - PEH (A); Epithelial atrophy - ATR (B); Grade I intraepithelial neoplasia - PIN I (C); Microinvasive carcinoma - CM (D); Grade II intraepithelial neoplasia - PIN II (E); Cribriform intraepithelial neoplasia - PINC (H) with micro- lumens (*). The region delimited by the dotted line in D is depicted in F and G. Arrows point to rupture of smooth muscle layer in F and to rupture of reticular fibers in G. Bv indicates blood vessel. 50 Figure 2: Fibrillar components to prostatic tissues from IC (A, B), GC (C, D) and CO (E, F) groups. Picrosirius staining identifies collagen in red shade in A, C and E. Resorcin-fuchsin staining identifies elastic fibers in blue in B, D, and F. Figure 3: Analysis of incidence (B) and multiplicity (A) of lesions of the ventral prostate of the Mongolian Gerbil. Intact Control (IC), Gavage Control (GC) or Coconut Oil (CO) groups. Multiplicity data (A) correspond to the variation in the number of lesions per animal (n= 6 per group); the group mean is shown in parenthesis. Incidence data (B) indicate the percentage of animals affected. Prostatic epithelial hyperplasia (PEH); Grade I intraepithelial neoplasia (PIN I); Grade II intraepithelial neoplasia (PINII); Cribriform intraepithelial neoplasia (PINC); Epithelial atrophy (ATR) and Microinvasive carcinoma (CM). 51 Figure 4: Immunohistochemistry for cell proliferation index data using P-H-H3 (A, C and E) for proliferating cells and TUNEL marking (B, D, and F) for apoptotic cells. In G are shown the frequency of cells positive for TUNEL (white columns) and P-H-H3 (black columns) in the epithelium (Epi), smooth muscle layer (SML) and epithelium plus smooth muscle layer (Epi + SML). * indicates statistical difference p ≤ 0.05. In H is displayed the proliferation index (P-H- H3/TUNEL) of the epithelium (Epi), smooth muscle layer (SML) and epithelium plus smooth muscle layer (Epi + SML). Arrows point to positive cells. 52 Figure 5: Immunohistochemistry for androgen receptor (AR) in the ventral prostate of Mongolian gerbils in intact control (A), gavage control (B) and coconut oil-treated (C) groups. Frequency of cells positive for AR in the epithelium (Epi), smooth muscle layer (SML) and epithelium plus smooth muscle layer (Epi + SML) (D). Relative density of AR normalized to GAPDH, used here as a positive control (E). ** indicates statistical difference p ≤ 0.01. 53 Figure 6: Immunohistochemistry for estrogen receptor beta (ERβ) in the ventral prostate of Mongolian gerbils in intact control (A), gavage control (B), and coconut oil-treated (C) groups. Frequency of cells positive for ERβ in the epithelium (Epi), smooth muscle layer (SML) and epithelium plus smooth muscle layer (Epi + SML) (D). Relative density of ERβ normalized to GAPDH, used here as a positive control (E). There was no statistically significant difference between the groups. 54 Figure 7: Immunohistochemistry for estrogen receptor alpha (ERα) in the ventral prostate of Mongolian gerbils in intact control (A), gavage control (B), and coconut oil-treated (C) groups. Frequency of cells positive for ERα in the epithelium (Epi), smooth muscle layer (SML) and epithelium plus smooth muscle layer (Epi + SML) (D). Relative density of ERα normalized to GAPDH, used here as a positive control (E). There was no statistically significant difference between the groups. Statistical difference between the experimental groups is represented by * (p ≤ 0.05) and ** (p ≤ 0.01). 55 5.2 Capítulo 2 – Artigo 2. Será submetido à revista “The Prostate” Coconut oil attenuates the effects of the stress of animal handling on prostatic inflammation in old gerbils. Luiz Henrique Alves Guerraa, Nayara Fernanda da Costa Castroa, Fernanda Costa Jubilatoa, Mariele Ilario Zucãoa, Ellen Cristina Rivas Leonelb, Paula Rahala, Marilia de Freitas Calmona, Sebastião Roberto Tabogaa, Patrícia Simone Leite Vilamaiora*. aDepartment of Biology, Institute of Biosciences, Humanities and Exact Sciences, São Paulo State University – UNESP, São José do Rio Preto, SP, Brazil bDepartment of Histology, Embryology, and Cell Biology, Federal University of Goiás, Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brazil. *Correspondence: patricia.vilamaior@unesp.br (Dr Patrícia Simone Leite Vilamaior). Department of Biological Sciences, Institute of Biosciences, Humanities and Exact Sciences, São Paulo State University (UNESP), Rua Cristóvão Colombo 2265, Jardim Nazareth, 15054- 000, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. ORCID of the authors: Luiz H A Guerra: 0000-0001-7982-5811; Nayara F C Castro: 0000- 0002-8263-5223; Fernanda C Jubilato: 0000-0003-3373-3342; Mariele I Zucão: ; Ellen C R Leonel: 0000-0002-4597-3346;; Paula Rahal: 0000-0001-5693-6148; Marília F Calmon: 0000- 0001-5203-0103; Sebastião R Taboga: 0000-0002-0970-4288; Patrícia S L Vilamaior: 0000- 0001-9559-5497. Keywords: Phytotherapeutic, inflammatory cells, macrophage, vegetal oil, STAT3. 56 Abstract Background Inflammation is associated with age-related pathologies in the prostate, such as benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PC), which are modulated by several components of the inflammatory process, like macrophages and cytokines. Coconut oil is indicated as a protective agent in age-related effects, including inflammation. In the present study, we have investigated the impact of coconut oil consumption and animal handling on the prostate throughout the aging process Methods Animals (Mongolian gerbil, 100 days old) were divided into three groups (n=11/group): Intact Control (IC group), Gavage Control (GC group) and Coconut Oil (CO group). The animals received via gavage 0.1ml of water (GC) or coconut oil (CO) on alternate days during one year. Inflammatory foci, mast cells, F4/80 and CD68 and CD163 macrophages, COX2, p-STAT3, IL-6, TNFα and metalloproteinases (MMPs) were analyzed. Results Inflammatory foci (IF) were present in the ventral prostate of all experimental groups. The occurrence of F4/80 and CD68 macrophages did not vary between the groups, whereas CD163 macrophages decreased in the CO epithelium. The presence of p-STAT3 decreased in the epithelium and overall prostate in the CO, but increased in the GC stroma. The presence of COX2, and the levels of IL-6 did not change. TNFα concentration increased in the GC, but did not change in the CO. The GC group also showed increased expression of MMP-2 and MMP- 3. Conclusions Long-term animal handling changed the inflammatory profile in the prostate of the aged gerbils, while the administration of coconut oil throughout aging attenuated these effects. 57 Introduction The prostate is a gland responsive to the aging process, and more than half of the population of men over fifty years old develops benign prostatic hyperplasia (BPH).1 The aging process also changes the prostate inflammatory status, providing a microenvironment favorable to prostate cancer development and progression (PC).2 Prostatic inflammation can cause infertility in young and adult men.3 BPH is closely associated with inflammation, since several specific mediators of inflammatory pathways, such as interleukins and chemokines, modulate the condition of BPH.4 In addition, the activity of inflammatory cells, such as mast cells and macrophages, with their different phenotypes, plays an important role in both BPH and PC.4,5 These cells and the diverse inflammatory cytokines are found mainly in the stroma, which exhibits characteristics, acquired through aging, that contribute to the development of prostatic pathologies.6 The prostate environment is thus sensitive to inflammation-related disorders that lead to hyper- or neoplastic processes.7 The use of natural compounds as phytotherapeutic agents, with mechanisms of action including inhibition of growth factors, anti-androgenic, anti-estrogenic, and anti-inflammatory activity is expanding.8 In this scenario, studies have attributed antioxidant properties to coconut oil due to its protective role against injuries.9–11 Coconut oil, obtained from the Cocos nucifera, is an emerging functional food commonly used as a traditional medicine and dietary supplement in South India and many other tropical countries, capable of diminishing liver lipotoxicity and insulin resistance. The potential to moderate metabolic and inflammatory disorders is also attributed to coconut oil; however, these properties vary in different studies 13–15. This oil contains about 90% of saturated fatty acids, of which the most abundant is lauric acid, followed by myristic, palmitic, caprylic, capric, and stearic acids.16,17 Coconut oil decreased induced BPH in rats.18 However, its effects on the prostate are poorly known and its consumption throughout aging has not been investigated yet Given that inflammation is closely associated with BPH, we investigated the effect of coconut oil consumption on the prostate throughout aging with regard to the inflammatory profile in the Mongolian gerbil, an experimental model that exhibits spontaneous BPH with advancing age.19. 58 Materials and Methods Animals and experimental design Male gerbils (M. unguiculatus) (33 animals in total) were bred and kept in the Microscopy and Microanalysis Laboratory (Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences of São Paulo State University/UNESP), São José do Rio Preto, with approval and in compliance with the institutional ethics committee guidelines (183/2018- CEUA). At 100 days of age, animals were separated in ventilated polysulphone isolators (2 animals per box), kept under controlled temperature and light (25ºC, 12h light-dark cycle) and provided filtered water and food ad libitum during the experimental period. Three experimental groups (n=11) were set up: the Intact Control group (IC) aged without any treatment; the Gavage Control group (GC) aged with administration of 0.1ml of filtered water by gavage; the Coconut Oil group (CO) aged with administration of 0.1ml of coconut oil (Nature Corp LTDA, Sorocaba, Brazil) by gavage. Oral gavage was performed on alternate day basis throughout the experiment, and the dosage provided corresponded to 13ml for an adult male