271 Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.73, n.3, p.271-276, jul./set., 2006 Bactérias do gênero Aeromonas no fluxograma de beneficiamento do leite tipo A e seu comportamento frente à ação de antimicrobianos. BACTÉRIAS DO GÊNERO AEROMONAS NO FLUXOGRAMA DE BENEFICIAMENTO DO LEITE TIPO A E SEU COMPORTAMENTO FRENTE À AÇÃO DE ANTIMICROBIANOS M.S. Carneiro; O.D .Rossi Junior Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, km 5, CEP 14884- 900, Jaboticabal, SP, Brasil. RESUMO Objetivando verificar os possíveis pontos de contaminação e disseminação de bactérias do gênero Aeromonas , foram analisadas amostras de leite colhidas em diferentes pontos do fluxogra- ma de beneficiamento em uma granja de leite tipo A. De 80 amostras analisadas, Aeromonas spp. foram isoladas em 37 (46,25%) delas. Foram colhidas 20 amostras de cada ponto da linha de produção e revelaram-se positivas no isolamento, 90% (18/20) das amostras de leite cru, 30% (6/ 20) das de leite da saída do pasteurizador, 40% (8/20) das de leite do tanque de abastecimento da máquina de empacotar e 25% (5/20) das amostras do leite pronto para consumo. Dentre as espécies foram identificadas Aeromonas sobria em 40,54% das amostras, Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae em 21,62% delas, Aeromonas veronii em 10,81% e Aeromonas schubertii em 2,7%. Das cepas isoladas, 37 foram submetidas a testes de sensibilidade a antimicrobianos. Destas, 100% foram resistentes à ampicilina, 75,67% à cefalotina, 64,86% à cefoxitina e 48,64% ao aztreonam. As drogas as quais as cepas mostraram-se menos resistentes foram, cloranfenicol, netilmicina, amicacina, gentamicina, tetraciclina e tobramicina. Os resultados obtidos demonstram que bactérias do gênero Aeromonas resistentes a vários antimicrobianos podem estar presentes no leite tipo A, o que faz com que este produto possa determinar risco à saúde da população consumidora, e que deve servir de alerta aos serviços de saúde pública. PALAVRAS-CHAVE: Aeromonas spp., leite pasteurizado, antimicrobianos. ABSTRACT BACTERIA OF AEROMONAS GENUS IN THE TYPE “A” MILK PROCESSING FLOW AND THEIR BEHAVIOR IN REGARD TO ANTIMICROBIALS. Milk samples obtained from different points of the processing flow at a type “A” milk farm were analysed with the objective to verify possible points of Aeromonas genus bacteria contamination and dissemination. In 80 samples analysed, Aeromonas spp. were isolated in 37 (46.25%) of them. From each point of the processing flow 20 samples were obtained. The results showed that 90% (18/20) of raw milk samples, 30% (6/20) of the pasteurizer-exit samples, 40% (8/20) of the packing-machine-tank samples and 25% (5/20) of ready-to-drink milk samples were positive on isolation. The breakdown by species of the bacteria isolated was: Aeromonas sobria in 40.54% of the samples, Aeromonas hydrophila and Aeromonas caviae in 21.62%, Aeromonas veronii in 10.81%, and Aeromonas schubertii in 2.7%. Of the isolated strains, 37 were submitted to antimicrobial susceptibility testing, which revealed that 100% were resistant to ampicillin, 75.64% to cephalotin, 64.86% to cefoxitin and 48.64% to aztreonam. The strains presented less resistance to chloramphenicol, netilmicin, amikacin, gentamicin, tetracycline and tobramycin. The results demonstrate that Aeromonas spp. bacteria resistant to several antimicrobials may be present in type “A” milk, indicating that this product might be a risk to consumer health, and this data should be an alert to public health services. KEY WORDS: Aeromonas spp., pasteurized milk, antimicrobials. INTRODUÇÃO Nos anos recentes, surtos de doenças bacterianas de origem alimentar têm sido reportados por todo mundo, alguns causados por agentes chamados clás- sicos, os quais têm patogenia e epidemiologia bem conhecidas, como o Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e salmonelas, mas a grande maioria deter- minada por bactérias que não são comumente pesquisadas durante investigações de surtos. Dentre essas bactérias estão as aeromonas móveis (HANDFIELD et al., 1996). IdeaPad Caixa de texto DOI: 10.1590/1808-1657v73p2712006 272 Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.73, n.3, p.271-276, jul./set., 2006 M.S. Carneiro; O.D. Rossi Junior Aeromonas spp. são microrganismos de ocorrência amplamente difundida no meio ambiente (CUNLIFFE & ADCOCK, 1989), sendo membros importantes da microbiota normal da água (PALUMBO et al., 1996), com relatos de isolamento a partir de água utilizada para os mais diversos fins (ROSSI JÚNIOR et al., 1996; GAVRIEL et al., 1998). A água, por sua vez, exerce papel de extrema importância como fonte de contaminação dos alimentos de origem animal (HÄNNINEN & SIITONEN, 1995; ROSSI JÚNIOR et al., 2000). O mecanismo de patogenicidade das aeromonas é considerado multifatorial, sendo sua ação classifi- cada como de nível não intestinal e gastrentérica (KO & CHUANG, 1995). Como fatores de virulência são atribuídos ao gênero Aeromonas a produção de enterotoxinas, citotoxinas, hemolisinas e proteases, além de grande capacidade de aderência e invasão em células da mucosa intestinal (SINGH & SANYAL, 1992; KÜHN et al., 1997; MARTINS et al., 2002). Dentre os alimentos de origem animal Aeromonas spp. já foi isolado de carnes cruas, peixes, frutos do mar, aves, ovos, leite e derivados (ABEYTA JÚNIOR et al., 1986; KIROV et al., 1993; PIN et al., 1994; COSTA & ROSSI JÚNIOR, 2002; BULHÕES & ROSSI JÚNIOR, 2002; NOCITI et al., 1999; FREITAS et al., 1993). Particularmente, em relação ao leite bovino, a maioria dos trabalhos prende-se ao estudo do leite cru (KIROV et al., 1993; PRABHA et al., 1996; MELAS et al., 1999) ou no final do fluxograma de produção, já pasteurizado e pronto para a comercialização (FREITAS et al., 1993; ENEROTH et al., 2000; CRAVEN & MACAULEY, 1992). Em vista do exposto, foi realizado o presente estu- do com o objetivo de verificar a presença de bactérias do gênero Aeromonas em diferentes etapas do fluxo- grama de beneficiamento do leite tipo A e verificar o comportamento dos isolados frente à ação de antimicrobianos. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido analisando amostras de leite ao longo do processo de beneficiamento em uma granja de leite tipo A localizada no interior do Estado de São Paulo. Foram analisadas amostras de leite cru da saída do pasteurizador, do tanque de abastecimento da máquina de envase e do leite empa- cotado pronto para a comercialização. No total foram analisadas 80 amostras, sendo 20 de cada um dos pontos estudados. As amostras do leite do tanque de leite cru, do pasteurizador e do tanque de abastecimento da má- quina de envase foram colhidas em frascos de vidro esterilizados, de 500 mL de capacidade, através de torneiras para a tomada de amostras existentes na- queles pontos. Os frascos, bem como o leite pasteuri- zado empacotado, foram acondicionados em caixas de material isotérmico com blocos de gelo e imediata- mente transportados ao laboratório onde foram reali- zadas as análises. O enriquecimento seletivo das amostras foi reali- zado após homogeneização manual, tomando-se 10 mL de cada uma delas e transferinda-os para frascos tipo Erlenmeyer contendo 100 mL de caldo tripticase- soja (TSB) acrescido de ampicilina na concentração de 30 mg/L (ABEYTA JUNIOR et al., 1990). Após incuba- ção a 28º C por 24h, as culturas foram semeadas em placas contendo ágar vermelho de fenol-amido- ampicilina (PALUMBO et al., 1985; MAJEED et al., 1990) e ágar dextrina-ampicilina (HAVELAAR & VONK, 1988), as quais foram incubadas a 28º C por 24h e examina- das quanto à presença de colônias grandes, de cor amarela, rodeadas por halo decorrente da hidrólise do amido ou da dextrina, respectivamente, caracterís- ticas do gênero Aeromonas. Colônias com características sugestivas foram semeadas em tubos com ágar tripticase-soja (TSA) inclinado e, constatada a presença de culturas puras, elas foram semeadas em ágar tríplice-açúcar-ferro (TSI) e incubadas a 28º C por 24h (SAAD et al., 1995). As culturas que apresentavam reação ácida tanto na base como no bisel, com ou sem formação de gás, foram submetidas às provas da motilidade, oxidase, catalase e resistência ao agente vibriostático O/129 (fosfato de 2,4-diamino-6,7-diisopropilpteridine), em esquema de identificação adotado por POPOFF (1984) e NEVES et al. (1990). A caracterização das espécies foi realizada seguindo o esquema de POPOFF (1984) acres- cido de outras provas recomendadas por BUCHANAN & PALUMBO (1985) e ABEYTA JÚNIOR et al. (1990). As cultu- ras que deram reação distinta da classificação de POPOFF (1984) em apenas uma prova bioquímica foram designadas como atípicas, conforme adotado por MAJEED et al. (1990) e KIROV et al. (1993). As espécies caracterizadas foram submetidas a testes de sensibilidade a antimicrobianos através da técnica de disco de difusão (BAUER et al., 1966; NCCLS, 2000). Utilizou-se polidiscos (Laborclin – LB6) com os princípios ativos: tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg), netilmicina (30 µg), aztreonam (30 µg), gentamicina (10 µg), amicacina (30 µg), sulfazotrim (25 µg), tobramicina (10 µg), ampicilina (1 0µg), cefalotina (30 µg), cefoxitina (30 µg) e cefotaxima (30 µg). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados apresentados na Tabela 1 demonstram que, do total de 80 amostras analisadas, 37(46,25%) revelaram-se positivas para a presença de bactérias do gênero Aeromonas, sendo que 18 (90%) eram de leite cru, 6(30%) do leite colhido na saída do pasteurizador, 273 Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.73, n.3, p.271-276, jul./set., 2006 Bactérias do gênero Aeromonas no fluxograma de beneficiamento do leite tipo A e seu comportamento frente à ação de antimicrobianos. 8 (40%) do leite do tanque de abastecimento da máqui- na de envase e 5 (25%) amostras do leite empacotado pronto para o consumo. Nestas amostras foram identificadas as espécies A. hydrophila, A. sobria, A. caviae, A. veronii e A. schubertii, além de vários isolados considerados como cepas atípicas. A presença de Aeromonas sp. no leite cru tem sido demonstrada por vários autores, em diversas partes do mundo, com percentuais de amostras positivas bem inferiores aos 90% encontrados no presente estudo. SAAD (1991) obteve 38% de amostras positivas colhidas em Assiut City, identificando a espécie A. hydrophila. PIN et al. (1994) na Espanha e URAZ & ÇITAK (1998) na Turquia encontraram percentuais de 20% e 0,5%, res- pectivamente, também com predominância dentre os isolados da espécie A. hydrophila. KIROV et al. (1993), no entanto, encontraram positividade em 60% das amos- tras e identificaram as espécies A. sobria, A. hydrophila e A. caviae, além de cepas atípicas. PRABHA et al. (1996) identificaram as mesmas espécies na Índia, e 33,82% de amostras positivas. Os autores citados são unânimes em afirmar que a origem desses microrganismos esta- ria relacionada a deficiências nos procedimentos de higiene na obtenção do leite. Com base nessas afirma- ções, e em vista dos resultados obtidos, pode-se afirmar que o percentual de 90% de amostras positivas verifi- cado no presente estudo é um forte indicativo de falhas no processo de obtenção. Considerando-se ainda os dados da Tabela 1, referentes ao leite recém pasteurizado colhido na saída do pasteurizador e ao leite do tanque de abas- tecimento da máquina de empacotar, que não deveriam encontrar-se contaminados, pois as Aeromonas spp são sensíveis ao calor e destruídas durante a pasteu- rização, verifica-se que foram encontradas 6 (30%) amostras do primeiro produto e 8 (40%) do segundo, positivas para o gênero Aeromonas. ENEROTH et al. (1998) analisando os pontos críticos de contaminação no fluxograma de laticínios na Suécia e Noruega, não verificaram contaminação do leite na saída do pasteurizador e tampouco no leite do tanque de abas- tecimento da máquina de envase. Um fato que pode explicar a presença de aeromonas no leite pasteurizado é que as tubulações, o tanque de abastecimento da máquina de envase e a própria máquina de envase podem conter resíduos de água antes da passagem do leite. Sabe-se que estes resíduos podem abrigar um número considerável de microrganismos e os equipamentos, por estarem cons- tantemente úmidos durante o dia de produção, se não forem apropriadamente limpos e secos no fim do dia podem permitir a formação de biofilmes, em decorrên- cia da multiplicação dos microrganismos nas super- fícies. ISONHOOD & DRAKE (2002) afirmam que as aeromonas podem formar biofilmes e que estes contri- buem no aumento da resistência aos tratamentos bactericidas normais. No que diz respeito às amostras de leite pasteuri- zado prontas para consumo, o percentual de positividade encontrado, de 25% (5/20), foi superior ao verificado por KIROV et al. (1993), que obtiveram 4% de amostras positivas. Coincidentemente ao encon- trado no presente estudo, a espécie que prevaleceu no leite pasteurizado foi a A. sobria, em cujas cepas os autores verificaram capacidade de produzir fatores de virulência como enterotoxinas, hemolisinas, citotoxinas e adesinas, caracterizando risco à saúde pública. Os dados da Tabela 1 permitem verificar também que a Aeromonas caviae foi a espécie que determinou o segundo maior número de amostras positivas, 8 (21,62%), isoladas em todos os tipos de amostras, exceto do leite recém pasteurizado colhido na saída do pasteurizador. O isolamento de A. caviae em leite tipo A pronto para consumo, que é considerado um leite de melhor qualidade, é outro fator que deve ser Tabela 1 – Número de amostras positivas para cada uma das espécies de bactérias do gênero Aeromonas identificadas, em relação ao total analisado para cada um dos tipos de amostras colhidas em diferentes pontos do fluxograma de beneficiamento do leite tipo A. Tipo de Total de amostras Espécies identificadas no de amostras (%) amostra1 positivas/analisadas A. hydrophila A. sobria A. caviae A. veronii A. schubertii atípicas LC 18/20 5 (25)2 6 (30) 5 (25) 4 (20) 1 (5) 5 (25) LSP 6/20 0 (0) 3 (15) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (15) LTE 8/20 3 (15) 2 (10) 2 (10) 0 (0) 0 (0) 3 (15) LE 5/20 0 (0) 4 (20) 1 (5) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 37/80 8 (21,62) 15 (40,54) 8 (21,62) 4 (10,81) 1 (2,7) 11 (29,73) 1 LC= leite cru; LSP= leite na saída do pasteurizador; LTE= leite do tanque da máquina de empacotar; LE= leite envasado. 2 Número de amostras em que a espécie foi isolada (porcentagem em relação ao total de amostras analisadas para cada tipo). 274 Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.73, n.3, p.271-276, jul./set., 2006 M.S. Carneiro; O.D. Rossi Junior levado em consideração pelos serviços de saúde pú- blica, pois o leite é um alimento comum na dieta de muitas pessoas, incluindo grupos de alto risco, mais susceptíveis às infecções alimentares, e já foi observa- do que aquela espécie, ainda que em menor grau, também produz fatores de virulência, conforme des- crevem CAHILL (1990) e HAVELAAR et al. (1992). Segun- do REINA et al. (1991), a espécie A. caviae foi encontrada como principal enteropatógeno em casos de diarréia infantil em crianças submetidas a aleitamento artifi- cial em Palma de Mallorca (Balares). Analisando-se os dados da Tabela 2 verifica-se que o maior percentual de cepas resistentes, sem considerar a ampicilina, foi verificado frente a cefalotina (75,67%), cefoxitina (64,86%) e aztreonam (48,64%). Para os demais princípios ativos testados os percentuais de cepas resistentes estiveram abaixo de 40%. KO et al. (1998) encontraram resultados seme- lhantes para cefalotina e cefoxitina em Tainan (Taiwan), ao analisarem cepas de A. hydrophila isola- das de paciente com infecção. URRIZA et al. (2000), analisando cepas isoladas de água de 2 rios europeus encontraram baixa resistência à gentamicina (1%) e à tetraciclina (14%) e alta resistência à gentamicina (93%) o que difere do presente estudo. NOCITI et al. (1999) verificaram alto percentual de resistência a vários antimicrobianos entre cepas isoladas de carca- ças de frango, concluindo pelo risco de infecções por microrganismos de alta resistência a partir do consu- mo daqueles produtos. Os autores citados são unâni- mes em afirmar que a emergência de resistência entre as Aeromonas spp. pode ser acelerada pelo mau uso dos antibióticos na terapêutica clínica, e também pela adição generalizada de subdoses em rações animais. Considerando que as bactérias do gênero Aeromonas possuem capacidade de sobreviver e mul- tiplicar em alimentos mantidos sob refrigeração, como o leite, e que muitas cepas são capazes de produzir toxinas, sua presença em leite pasteurizado, particu- larmente no tipo A, pode conferir a este produto um sério risco à saúde, principalmente, para o segmento da população considerado de alto risco, como crian- ças, idosos e pacientes imunodeprimidos. REFERÊNCIAS ABEYTA JUNIOR, C.; KAYSNER, C.A.; WEKEL, M.M.; STOTT, R.F. Incidence of motile aeromonads from United States west coast shellfish growing estuaries. Journal of Food Protection, v.53, n.10, p.849-855, 1990. ABEYTA JUNIOR, C.; KAYSNER, C.A.; WEKEL, M.M.; S ULLIVAN , J.J.; STEMA, G.N. Recovery of Aeromonas hydrophila from oysters implicated in an outbreak of foodborne illness. Journal of Food Protection , v.49, p.643-646, 1986. BAUER, A.W.; K IRBY, W.M.; S HERRIS, J.C.; TURCK, M. 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Antimicrobiano No de cepas resistentes/testadas(%) Total de cepas resistentes (%) A. hydrophila A. sobria A. caviae A. veronii atípicas Amicacina 0/12 (0%) 2/8 (25) 0/8 (0) 0/4 (0) 1/5 (20) 3 (8,11)1 Ampicilina 12/12 (100) 8/8 (100) 8/8 (100) 4/4 (100) 5/5 (100) 37 (100) Aztreonam 7/12 (58,33) 4/8 (50) 4/8 (50) 0/4 (0) 3/5 (60) 18 (48,64) Cefalotina 8/12 (66,66) 7/8 (87,5) 4/8 (50) 4/4 (100) 5/5 (100) 28 (75,67) Cefotaxima 1/12 (8,33) 2/8 (25) 2/8 (25) 0/4 (0) 4/5 (80) 9 (24,32) Cefoxitina 6/12 (50) 7/8 (87) 5/8 (62,5) 1/4 (25) 5/5 (100) 24 (64,86) Cloranfenicol 1/12 (8,33) 2/8 (25) 1/8 (12,5) 1/4 (25) 3/5 (60) 8 (21,62) Gentamicina 1/12 (8,33) 2/8 (25) 3/8 (37,5) 1/4 (25) 2/5 (40) 9 (24,32) Netilmicina 0/12 (0) 2/8 (25) 1/8 (12,5) 0/4 (0) 3/5 (60) 6 (16,21) Sulfazotrim 3/12 (25) 3/8 (37,5) 4/8 (50) 0/4 (0) 5/5 (100) 15 (40,54) Tetraciclina 3/12 (25) 1/8 (12,5) 1/8 (12,5) 1/4 (25) 4/5 (80) 10 (27,02) Tobramicina 2/12 (16,66) 2/8 (25) 0/8 (0) 1/4 (25) 4/5 (80) 9 (24,32) 1 Porcentagem em relação ao total de cepas testadas 275 Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.73, n.3, p.271-276, jul./set., 2006 Bactérias do gênero Aeromonas no fluxograma de beneficiamento do leite tipo A e seu comportamento frente à ação de antimicrobianos. COSTA, F.N. & ROSSI JUNIOR, O.D. Bactérias do gênero Aeromonas em abatedouro de frangos. Arquivo Brasi- leiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.54, n.5, p.534- 538, 2002. CRAVEN, H.M. & MACAULEY , B.J. Microorganisms in pasteurized milk after refrigerated storage. 1. Identification of types. Australian Journal of Dairy Technology, v.47, n.1, p.38-45, 1992. CUNLIFFE, D.A. & ADCOCK, P. Isolation of Aeromonas spp. from water by using anaerobic incubation. Applied and Environmental Microbiology, v.55, n.9, p.2138-2140, 1989. ENEROTH, A.; AHRNÉ, S.; MOLIN, G. Contamination of milk with gram-negative spoilage bacteria during filling of retail containers. International Journal of Food Microbiology, v.57, p.99-106, 2000. ENEROTH, A.; CHRISTIANSSON , A.; BRENDENHAUG, J.; MOLIN, G. 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