RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta Tese será disponibilizado somente a partir de 25/06/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ”JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA, CELULAR E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS DA BEXIGA DE CÃES VERÔNICA MOLLICA GOVONI BOTUCATU-SP 2021 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ”JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA, CELULAR E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS DA BEXIGA DE CÃES VERÔNICA MOLLICA GOVONI Tese apresentada ao Programa de Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho – Campus de Botucatu, para a obtenção do título de Doutora Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Fonseca Alves Co-orientadora (Brasil): Prof. Dra. Juliany Gomes Quitzan Co- orientadora (Itália): Prof. Dra. Valeria Grieco BOTUCATU-SP 2021 Palavras-chave: Cão; Carcinoma urotelial; Oncologia; Trato urinário. Govoni, Verônica Mollica. Avaliação morfológica, celular e imuno-histoquímica do carcinoma de células transicionais da bexiga de cães / Verônica Mollica Govoni. - Botucatu, 2021 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Carlos Eduardo Fonseca Alves Coorientador: Juliany Gomes Quitzan Coorientador: Valeria Grieco Capes: 50501070 1. Cães - Doenças. 2. Bexiga - Câncer. 3. Trato urinário. 4. Neoplasias urológicas. 5. Oncologia. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. iv BANCA EXAMINADORA Prof. Dr.: Carlos Eduardo Fonseca Alves (orientador) Instituição: Universidade Paulista (UNIP) – Bauru, orientador pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - Botucatu Profa. Dra.: Priscila Emiko Kobayashi Instituição: Universidade Estadual Paulista Júlia de Mesquita Filho (UNESP) – Botucatu e FAEF - Garça Profa. Dra.: Renee Laufer Amorim Instituição: Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) - Botucatu Profa. Dra.: Maria Lucia Zaidan Dagli Instituição: Universidade de São Paulo (USP) – São Paulo Profa. Dra.: Cristina de Oliveira Massoco Salles Instituição: Universidade de São Paulo (USP) – São Paulo v DEDICATÓRIA Dedico esta tese de doutorado à minha querida avó Suzana Maria de Tolosa Mollica, minha torcedora árdua e presente nas minhas mais doces lembranças (in memoriam). vi EPÍFRAGE “Agir, eis a inteligência verdadeira. Serei o que quiser. Mas tenho que querer o que for. O êxito está em ter êxito, e não em ter condições de êxito. Condições de palácio tem qualquer terra larga, mas onde estará o palácio se não o fizerem ali?” Fernando Pessoa vii AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Fonseca Alves, por me ter aceitado de braços abertos como sua orientada, me ajudando desde o início do meu projeto não apenas em sua execução como na gestão de novas ideias e na resolução de problemas, sempre de maneira muito solícita e paciente. Além disso, me permitiu o contato com a professora Valeria Grieco, possibilitando meu doutorado sanduíche. À Prof. Dra. Juliany Gomes Quitzan, por ter sido minha primeira orientadora, me incluindo em seu grupo de pesquisa e trabalho e permitindo minha inserção na rotina do Hospital Veterinário, execução de projetos paralelos e organização de cursos, além de muito ter me ensinado sobre cirurgias do trato urinário e procedimentos diagnósticos. À Prof. Dra. Renee Laufer Amorim, por ter nos auxiliado sempre com suas ideias, conselhos e direcionamentos, além da ajuda prática na leitura de lâminas histológicas. Desde a graduação é uma professora que muito contribuiu para minha formação, em minha “segunda área preferida”, e de fundamental importância para o tema com o qual venho trabalhado, que é a patologia. À Prof. Dra. Valeria Grieco, por ter me recebido na Università degli Studi di Milano (UniMi), Itália de forma tão acolhedora como sua orientada; pelos ensinamentos em patologia e todo acompanhamento teórico e prático dos meus experimentos, tanto presencialmente como à distância. Foi uma oportunidade e uma experiência incrível, tanto pessoal quanto profissional. Aos professores de cirurgia da UniMi, Damiano Stefanello e Stefano Romussi, que permitiram que eu os acompanhasse durante as cirurgias nos meus intervalos de experimento, me agregando muito conhecimento. viii À minha mãe Maria de Lourdes T. Mollica Govoni, que sempre me apoiou em todos os aspectos, sendo a maior incentivadora da construção da minha carreira e também minha maior educadora desde a infância, além de minha melhor amiga. Veio dela a valorização pelo estudo, minha admiração pela medicina veterinária e o fascínio pelos animais. Se cheguei até aqui, foi graças a força que me transmite diariamente. Ao meu irmão Enrico Mollica Govoni, por ser o irmão e amigo fonte de força em tantos momentos que precisei, nem sempre fáceis para nós. Mesmo sendo irmão mais novo, é ele meu exemplo de planejamento, responsabilidade e organização que muito me ensinaram durante meu doutorado. E por sempre me acompanhar em cada passo, vibrando por minhas conquistas. São ele e minha mãe, o meu alicerce. Ao meu namorado Claudio Pigoli, presente do meu doutorado sanduíche na Itália, por ser meu parceiro, seja perto ou a muitos km de distância, sendo uma fonte de alegria e calmaria. Contribuiu no auxilio da análise das amostras e na execução das imuno-histoquímicas, além de me acolher em sua casa em plena pandemia, me dando todo suporte, e me presenteando com uma segunda família. Aos meus sogros Paola Tomasoni e Daniele Pigoli, aos meus cunhados Elena Pigoli e Daniele Gazzoli, e suas duas filhas Marta e Elisa, por terem sido e se tornado uma segunda família, me dando amparo na situação mais inesperada. Minha quarentena longe de casa foi feliz e leve graças as pessoas maravilhosas que me ajudaram, e foi o que me permitiu finalizar a minha empreitada. Aos colegas do nosso grupo de pesquisa da Patologia de Botucatu, e aos de Milão, que de alguma forma contribuíram para a execução do projeto. Aos veterinários que nos forneceram amostras coletadas durante o transoperatório e/ou blocos parafinados de carcinoma urotelial de cão: Dr. Felipe Sueiro, Dr. Rodrigo Ubukata, Dra. Karen Abrantes Assunção. Ao Hospital Veterinário ix da UNESP de Botucatu, pelas amostras utilizadas da rotina, e à UniMi pela amostragem italiana de casos. Aos amigos, sejam eles de Guaratinguetá, Botucatu, Itália, ou outro, que fizeram parte de alguma forma desta trajetória, e àqueles que se mantiveram até aqui. Em especial, agradeço à amiga Priscila Emiko Kobayashi (Sarna), pelo apoio, conversas sobre patologia e sobre a vida, e pelos conselhos. Ao programa de Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP. `A CAPES - O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Enfim, a todos aqueles que de alguma forma colaboraram, participaram ou torceram por mim e pelo trabalho. x LISTA FIGURAS ARTIGO 1 Figura 1. A. TCC papillary and infiltrating (case 31). HE, 5x magnification. B. The same tumor at 10x magnification, focusing on tumor infiltration...................................38 Figura 2. A. TCC with histologoical grade II (case 1), HE, 40x magnification. B. TCC with histological grade III (case 3), HE, 40x magnification. Bigger nucleus size, anisocariosis and amount of nucleoli evident in grade III can be observed....................39 Figura 3. A.TCC with muscular infiltration (case 1), HE, 20x magnification. B. TCC with lymphatic infiltration (case 11), HE, 40x magnification.........................................39 Figura 4. Survival curves (Kaplan-Meier) A. Survival curve considering types of treatment. B. Survival curve considering histological type. C. Survival curve considering muscle invasion. D. Survival curve considering lymphatic invasion.......... 42 ARTIGO 2 Figura 1. Immunostaining panel. A. UC papillary and infiltrating with mild Caveolin-1 (case 6), 400x magnification. B. UC papillary and infiltrating with intermediate Caveolin-1 (case 30), 400x magnification. C. UC papillary and infiltrating wit high Caveolin-1 (case 7), 400x magnification. D. UC papillary and infiltrating with mild GATA-3 (case 2), 200x magnification. E. UC non papillary and infiltrating with intermediate GATA-3 (case 22), 200x magnification. F. UC papillary and infiltrating wit high GATA-3 (case 30), 200x magnification. G. UC papillary and infiltrating with mild ki67 (case 15), 200x magnification. H. UC papillary and infiltrating with intermediate Ki67 (case 26), 200x magnification. I. UC non papillary and infiltrating with high Ki67 (case 14), 200x magnification…………………………………….…...58 Figura 2. Spearman’s graph of multiple correlations with the respective correlation coefficients……………………………………………………………………………..59 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169028 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169028 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169029 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169029 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169029 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169030 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169030 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169031 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169031 file:///C:/BACKUP%20LENOVO/USUARIOS/Veronica/Veronica/2020/Qualificação/Documento/Artigo1/Qualificação%20de%20doutorado%20Verônica%20Mollica%20Govoni%20com%201%20artigo%20pronto.docx%23_Toc58169031 xi SUMÁRIO Capítulo 1 ........................................................................................................................ 15 1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ......................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 18 2.1 O carcinoma de células de transição (CCT) ............................................................. 18 2.2 Epidemiologia do CCT da bexiga ............................................................................. 22 2.3 Tratamento clínico convencional e prognóstico ....................................................... 24 2.4 Terapias emergentes ................................................................................................. 25 2.5 Marcadores imuno-histoquímicos ............................................................................. 27 3. OBJETIVO GERAL ................................................................................................... 18 3.1 Objetivos específicos ................................................................................................ 28 REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 29 Capítulo 2 - TRABALHO CIENTÍFICO 1 .................................................................... 38 1.Introduction .................................................................................................................. 40 2. Materials and Methods ................................................................................................ 41 2.1 Study design .............................................................................................................. 41 2.2 Histological analysis ................................................................................................. 42 2.3 Statistical analysis .................................................................................................... 42 2.4 Ethics statement ........................................................................................................ 43 3. Results ......................................................................................................................... 43 4. Discussion ................................................................................................................... 49 References ....................................................................................................................... 54 Capítulo 3 - TRABALHO CIENTÍFICO 2 .................................................................... 59 1.Introduction .................................................................................................................. 60 2. Materials and Methods ................................................................................................ 61 2.1 Ethic statement .......................................................................................................... 61 2.2 Study design .............................................................................................................. 61 2.3 Histological analysis ................................................................................................. 61 2.4 Immunohistochemical analysis ................................................................................. 61 2.4.1 ki67 ......................................................................................................................... 61 2.4.2 GATA-3 and Caveolin-1 ........................................................................................ 62 2.5 Statistical analysis .................................................................................................... 62 xii 3. Results ......................................................................................................................... 62 3.1 Clinicopathological and immunohistochemical data ............................................... 62 3.2 Associations between all pathological and immunohistochemical variables ........... 65 4. Discussion ................................................................................................................... 67 5. Conclusions ................................................................................................................. 68 References ....................................................................................................................... 69 xiii RESUMO GOVONI, V. M. Avaliação morfológica, celular e imuno-histoquímica do carcinoma de células transicionais da bexiga de cães [Morphological, cellular and immunohistochemical evaluation of transitional cell carcinoma of the bladder of dogs] 2021. 71 f. Tese (Doutorado em Biotcnologia Animal) - Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2021. O carcinoma de células transicionais canino (CCT) é considerado o tumor maligno mais comum do trato urinário em cães. Devido à sua localização anatômica e progressão da doença no momento do diagnóstico, o tratamento desse câncer representa um desafio para a medicina veterinária, sendo o cão um modelo natural para a doença em humanos. O conhecimento sobre o CCT canino é limitado, portanto, o objetivo do presente estudo é realizar uma caracterização clínica, morfológica e imuno-histoquímica deste tumor. Dados clínicos de um total de 32 amostras da Universidade Estadual Paulista, do Laboratório VetPat e da Universidade de Milão (Itália) obtidas entre janeiro de 2000 e junho de 2020 foram utilizados para as avaliações clinico-patológica e imunohistoquímica dos marcadores Ki67, GATA-3 e Caveolina-1. Os fatores clínico- patológicos que apresentaram valor prognóstico no primeiro trabalho científico foram o tipo de tratamento e a invasão linfática. E o segundo trabalho cietífico demonstrou que os biomarcadores GATA-e e Caveolina-1 assim como as variáveis invasão linfática, tipo e grau histológico são potenciais fatores preditores do comportamento do CCT canino. Palavras-chave: carcinoma urotelial, cão, oncologia, trato urinário xiv ABSTRACT GOVONI, V. M. Morphological, cellular and immunohistochemical evaluation of transitional cell carcinoma of the bladder of dogs [Avaliação morfológica, celular e imuno-histoquímica do carcinoma de células transicionais da bexiga de cães] 2020. 71 f. Tese (Doutorado em Biotcnologia Animal) - Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2021. Canine transitional cell carcinoma (TCC) is considered the most common malignant tumor of the urinary tract in dogs. Due to its anatomical location and disease progression at the time of diagnosis, the treatment of this cancer represents a challenge for veterinary medicine, with the dog being a natural model for the disease in humans. The knowledge about canine TCC is limited, therefore, the aim of the present study is to perform a clinical, morphological and immunohistochemical characterization of this tumor. Clinical data from a total of 32 samples from the Universidade Estadual Paulista, VetPat Laboratory and University of Milan (Italy) obtained between January 2000 and June 2020 were used for the clinicopathological and immunohistochemical evaluations of Ki67, GATA-3 markers and Caveolin-1. The clinicopathological factors that showed prognostic value in the first scientific work were the type of treatment and lymphatic invasion. And the second scientific work demonstrated that the biomarkers GATA-e and Caveolin-1, as well as the variables lymphatic invasion, histological type and histological grade are potential predictors of canine TCC behavior. Key- words: urothelial carcinoma, dog, oncology, urinary tract Animals 2021, 11, x FOR PEER REVIEW 69 of 71 69 of 71 References 1. Knapp DW, Dhawan D, Ramos-Vara JA, Ratliff TL, Cresswell GM, Utturkar S, et al. Naturally-Occurring Invasive Urothelial Carcinoma in Dogs, a Unique Model to Drive Advances in Managing Muscle Invasive Bladder Cancer in Humans. Front Oncol. 2019;9:1493. 2. Antoni S, Ferlay J, Soerjomataram I, Znaor A, Jemal A, Bray F. Bladder Cancer Incidence and Mortality: A Global Overview and Recent Trends. Eur Urol. 2017;71(1):96-108. 3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34. 4. Knapp DW, Ramos-Vara JA, Moore GE, Dhawan D, Bonney PL, Young KE. 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