UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CAMPUS DE BOTUCATU ANÁLISE IN SILICO INDICA SIMILARIDADE DA EXPRESSÃO GÊNICA NA REDE DE INTERAÇÃO DO RECEPTOR DE VITAMINA D NA SÍNDROME CLINICAMENTE ISOLADA E ESCLEROSE MÚLTIPLA Alexia Dimitra Zarbinati de Oliveira BOTUCATU/SP 2014 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CAMPUS DE BOTUCATU ANÁLISE IN SILICO INDICA SIMILARIDADE DA EXPRESSÃO GÊNICA NA REDE DE INTERAÇÃO DO RECEPTOR DE VITAMINA D NA SÍNDROME CLINICAMENTE ISOLADA E ESCLEROSE MÚLTIPLA Alexia Dimitra Zarbinati de Oliveira Orientadora: Profª. Drª. Doralina Guimarães Brum Souza Supervisor: Profº. Drº. Danilo Moretti-Ferreira Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, como exigência parcial para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biomédicas BOTUCATU/SP 2014 1 Análise In Silico Indica Similaridade Da Expressão Gênica Na Rede De Interação Do Receptor De Vitamina D Na Síndrome Clinicamente Isolada e Esclerose Múltipla In Silico Analysis Indicates Similarity Of Gene Expression In Vitamin D Receptor Interaction Network In Clinically Isolated Syndrome And Multiple Sclerosis Alexia Dimitra Zarbinati de Oliveira1, José Luiz Rybarczyk Filho2, Doralina Guimarães Brum 1 1 Departamento de Neurologia, Psicologia e Psiquiatria da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil 2 Departamento de Física e Biofísica, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil - Autor para correspondência: Doralina Guimarães Brum Departamento de Neurologia, Psicologia e Psiquiatria, Faculdade de Medicina de Botucatu, Distrito de Rubião Junior, Caixa Postal 540, CEP 18618-970, Botucatu-SP Telefone: (14) 3880-1233 Email: doradoralina@uol.com.br *Trabalho Científico apresentado segundo as normas da Revista Brasileira de Neurologia e Psiquiatria mailto:doradoralina@uol.com.br 2 RESUMO Objetivo: Criar rede de interação do receptor de vitamina D e verificar o padrão de expressão gênica de seus constituintes em pacientes com esclerose múltipla (EM) e pacientes que apresentaram episódio isolado de disfunção neurológica sugestivo de mecanismo desmielinizante, clinical isolated syndrome (CIS). Metodologia: A rede de interação do VDR foi criada a partir de bancos de dados específicos para interações físicas, metabólicas e transcricionais. Paralelamente, foram realizadas busca na base de dados GEO DataSets empregando os descritores “multiple sclerosis” e “vitamin D”. Dois artigos envolvendo pacientes com EM, CIS e controles foram selecionados. Apenas os dados de expressão desses grupos foram utilizados para aplicação do método. O GALANT projeção os dados de expressão sobre a rede criada, resultando em mapas funcionais, no qual o perfil de expressão de CIS e EM foi reproduzido segundo uma escala de cores. Resultados: A rede de interação do VDR totalizou 102 genes e 1501 interações físicas, metabólicas e transcricionais. Três analises resultaram da relação entre CIS versus Controles, EM versus Controles e EM versus CIS. Em todas as análises, encontramos sete áreas indicando hiperexpressão dos genes correspondentes na rede. Conclusão: A criação de uma rede de interações especifica do VDR e a aplicação do GALANT para análise dos dados de expressão gênica de pacientes com EM evidenciaram-se ferramentas com potencial de identificar novos genes relacionados com o mecanismo da doença. Palavras Chave: esclerose múltipla, receptor de vitamina D, redes de interação, bioinformática 3 ABSTRACT Purpose: The aim of the study was to create a vitamin D receptor (VDR) network. Additionally, to verify the pattern of gene expression in multiple sclerosis (MS) and clinical isolated syndrome (CIS) Methods: Gene expression GEO database of MS and CIS patients was identified and selected. GALANT was used to analyze this data Results: The VDR network identified a total of 102 genes and 1501 transcriptional, physical and metabolic interactions among them. Analyses of gene expression with GALANT created three images after comparing MS and CIS, CIS and control, MS and control. Conclusion: Similar areas of gene expression in MS and CIS corroborates there is trait of disease. Additionally, our findings suggested GALANT can be a potential tool to discover more about pathogenic mechanism of the disease. Functional genomics studies is necessary to validate these findings. Key words: Multiple sclerosis, vitamin D receptor, interaction networks, bioinformatics 4 INTRODUÇÃO Os avanços da bioinformática na compreensão dos mecanismos celulares O seqüenciamento do genoma humano possibilitou desvendar uma grande quantidade de dados contidos no deoxyrribonucleic acid (DNA), tornando-se necessário o seu armazenamento. O avanço de novas técnicas computacionais aplicadas à biologia molecular e genômica resultou no surgimento de uma promissora área da ciência, a bioinformática. Esta ferramenta mostrou-se útil para uso em pesquisa com fins diagnósticos preventivos e terapêuticos caracterizando a aplicação biomédica (1), A experimentação computacional, denominada análise in silico, possibilita construir e simular sistemas voltados para a predição de propriedades e comportamentos biológicos (2) Uma célula, para funcionar corretamente, depende de que todos os seus componentes participem de reações bioquímicas intracelulares e interajam entre si. Por isso, o metabolismo celular pode ser reproduzido como uma rede formada por diferentes tipos de interações, como por exemplo: interação gene-gene, proteína-proteina, gene- proteina, gene-metabólito e assim por diante (3). A construção de uma rede é feita a partir de complexos modelos matemáticos e computacionais que identificam e caracterizam as relações de dependência de cada gene. A expressão dos genes envolvidos nos diversos metabolismos pode ser quantificada por meio de métodos que avaliem o perfil transcricional celular. A técnica de microarray (ou microarranjos) permite comparar níveis de expressão gênica em larga escala em diferentes tecidos, tempos e condições. Seu princípio consiste na hibridização por complementaridade dos ácidos nucléicos. Milhares de seqüência de nucleotídeos (cDNA ou oligonucleotideos) são fixadas em uma lamina de vidro (chip). Essas sequências correspondentes aos genes, conhecidas como “sondas”, hibridizam com RNAs mensageiros das amostras de interesse marcados com fluoróforos para que possa ser realizada a leitura do chip (4). Estudos como o de associação de genômica ampla (GWAS, em inglês) são capazes de gerar grande quantidade de dados, entretanto não fornecem informações importantes a respeito da função, localização e interações dos genes. Alguns estudos de associação têm utilizado da criação de complexas redes de interações para ampliar o 5 conhecimento sobre a patogenia das doenças e encontrar genes relacionados à suscetibilidade e possíveis alvos terapêuticos (5–7). Na última década, inúmeros sistemas computacionais relacionando dados de expressão gênica foram criados para aplicação na biomedicina. O ViaComplex foi desenvolvido para analisar a expressão dos genes em redes biológicas por meio da construção de “mapas funcionais” utilizando dados de expressão gênica previamente processadas sobrepostos às redes de interação (8). Diferentemente das ferramentas já existentes, o ViaComplex considera a relação entre os genes não individualizados e fornece uma visualização menos poluída da projeção. Com o intuito de expandir esta funcionalidade, o mesmo grupo desenvolveu o GALANT (GrAph LANdscape VisualizaTion), um plug-in para o programa Cytoscape (9). Da mesma forma, o GALANT projeta qualquer tipo de dado numérico sobre a rede e cria imagens que lembram o layout da mesma. Esta análise se baseia no princípio de que genes que seriam descartados em uma análise de genes diferencialmente expressos podem causar um efeito nos processos biológicos em que estão envolvidos, quando se relacionam com outros componentes dentro do sistema em questão. Esclerose múltipla A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória, desmielinizante e autoimune restrita ao sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade permanente entre adultos jovens (10). Cerca de 90% das primeiras manifestações da EM são decorrentes de acometimento da medula espinhal, nervo óptico e tronco cerebral, causando mielite, neurite óptica e síndrome de tronco cerebral respectivamente. Esta primeira manifestação neurológica é definida como sindrome clínicamente isolada (CIS, do inglês clinical isolated syndrome) e tem duração de pelo menos 24 horas. A ocorrência de um novo episódio de caráter desmielinizante inflamatório em uma topografia diferente da inicial, com intervalo de 30 dias e duração maior que 24 horas caracteriza a disseminação temporal e espacial e a conversão de CIS para EM (11,12) A etiologia da EM ainda não é conhecida. No entanto, há evidências de que a interação de fatores genéticos e ambientais contribua para sua manifestação. Estudos familiares mostraram que a taxa de concordância entre gêmeos monozigóticos é aproximadamente seis vezes maior do que entre gêmeos dizigóticos (13). Os genes do 6 sistema HLA, principalmente os de classe II, são os principais envolvidos na suscetibilidade à EM (14). A etnia também pode desempenhar um papel no desenvolvimento da doença, sendo algumas etnias mais afeadas que outras (15). Entre os fatores ambientais estudados, o tabagismo, a infecção pelo vírus Epsten-Barr e baixas concentrações de vitamina D apresentam as maiores evidencias de associação (16). Esse último poderia explicar o motivo da variação na distribuição geográfica da EM, considerando que países do hemisfério norte recebem menos radiação solar do que os demais países e há uma alta prevalência de hipovitaminose D nessas populações (17). Adicionalmente, estudos asseguram o efeito protetor da vitamina D e defendem seu uso em doses adequadas no tratamento da esclerose múltipla (18). Vitamina D O termo vitamina D corresponde a um grupo de hormônios esteróides derivados do 7-deidrocolesterol (7-DHC). Essas moléculas são sintetizadas na epiderme exposta à da radiação ultravioleta B (UVB) e obtidas, em menor quantidade, pela ingestão de peixes de águas salgadas (atum e salmão) e alguns tipos de fungos. Tanto a vitamina proveniente da dieta quanto a produzida por síntese endógena dão origem â forma ativa 1,25(OH)2D (calcitriol) após passagem pelo fígado e rim. A principal função da vitamina D é a regulação da homeostase osteomineral através da manutenção dos níveis séricos de cálcio e fósforo (17). Entretanto, o calcitriol também desempenha um importante papel imunorregulatório, participando da diferenciação das células T helper, inibição da diferenciação e maturação das células dendríticas, bem como da produção de moléculas proinflamatórias (19). O envolvimento da vitamina D em doenças autoimunes como a EM, diabetis melitus tipo I e artrite reumatóide confirmam sua ação no sistema imunológico (20). Adicionalmente, a vitamina D está associada à prevenção de neoplasias e processos degenerativos cardiovasculares (21). Os efeitos biológicos da 1,25(OH)2D são mediados pelo seu receptor Vitamin D Receptor (VDR), um fator de transcrição pertencente a família dos receptores nucleares. O VDR está presente em quase todas as células humanas e parece regular direta ou indiretamente cerca de 3% do genoma humano (22). Dada a importância da vitamina D no sistema imunológico e em doenças autoimunes como a EM, consideramos justificada a realização desse estudo utilizando as técnicas de bioinformática apresentadas. Neste contexto, objetivamos (i) criar a rede 7 do receptor de vitamina D, (ii) avaliar suas relações de interação e (iii) verificar a presença de genes hiperexpressos a partir de dados de expressão gênica de pacientes com EM e CIS utilizando o GALANT. MATERIAIS E MÉTODOS Pesquisa e escolha dos artigos de referência para aplicação do método Foram realizadas buscas na base de dados GEO DataSets, em 30 julho de 2013, empregando as palavras-chave “multiple sclerosis” e “vitamin D”. Dois artigos foram selecionados utilizando o tamanho amostral como critério de seleção. O primeiro artigo (A1), “Microarray analysis identifies altered regulation of nuclear receptor family members in the pre-disease state of multiple sclerosis” (23), código de acesso GSE14895, verificou a expressão gênica de 64 pacientes com EM (n=9), CIS (n=31) e controles saudáveis (n=24). O segundo artigo (A2), “Prediction of acute multiple sclerosis relapses by transcription levels of peripheral blood cells” (24), código de acesso GSE15245, avaliou indivíduos com EM (n=62) e CIS (n= 32) com o objetivo de identificar genes com valor de predizer o tempo para o próximo surto. Para identificar os grupos de pacientes com EM, CIS e Controles em ambos os artigos definimos que EM1, CIS1 e Controles referem-se aos grupos do A1; EM2 e CIS2 referem-se aos pacientes do A2. A metodologia aplicada foi a mesma para os dois trabalhos. O objetivo, o mérito e o resultado dos artigos não foram considerados no estudo atual. Nesse contexto, usamos somente os dados de expressão dos individuos para aplicação do método proposto. Normalização dos dados Ambos os estudos utilizaram GeneChips das plataformas HG-U133A e HG- U133A 2.0 da Affymetrix (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, USA). Os dados foram normalizados pelo método de Robust Multi-array Average (RMA) com o auxilio do pacote “Affy” carregado no software estatístico R (R Development Core Team, 2011). Criação da rede de interação do VDR 8 Os constituintes da rede e todas as interações foram verificados experimentalmente e encontram-se disponíveis em bancos de dados específicos: As interações físicas foram obtidas do banco de dados HIPPIE (Human Integrated Protein- Protein Interaction rEference) (25); as interações de regulação transcricional foram extraídas do HTRIdb (Human Transcriptional Regulation Interaction database) (26); e as interações metabólicas do Recon 1database (27). A rede do receptor de vitamina D foi construída baseada na suposição de que dois genes G1 e G2, que codificam respectivamente as proteínas P1 e P2, interagem entre si se, (i) há interação física entre as proteínas, (ii) ocorre regulação transcricional de P1 ou P2 sobre G1 ou G2 ou (iii) se ocorre interação entre os metabólitos gerados por P1 ou P2 (28). Visualização da rede e importação dos dados de expressão A visualização da rede e importação dos dados foram feitas pelo software Cytoscape versão 2.8.2 (29). Os dados de expressão gênica normalizados foram importados em formato de tabela e combinados a rede, atribuindo valores aos genes constituintes. Projeção das imagens pelo GALANT O plugin GALANT foi implementado ao Cytoscape. Utilizando a opção “Exp x Control”, a relação entre valores de expressão foi calculada através da fórmula matemática , onde “caso” corresponde a EM ou CIS. Em A1, fizemos as comparações de “CIS1 x controles” e “EM1 x Controles”. Em A2, comparamos EM2 e CIS2. A interpretação dos resultados foi feita segundo uma escala de cores: A coloração vermelha intensa e suas variações (resultado igual ou próximo a 1) indicam que os genes localizados naquela região estão mais expressos no caso do que no controle. A coloração verde (resultado igual a 0,5) indica que os genes estão igualmente expressos no caso e no controle. A coloração azul e suas variações (resultado igual ou próximo a 0,1) indicam que os genes estão mais expressos no controle do que no caso. Classificação e análise ontológica 9 Os genes de interesse foram identificados e agrupados em núcleos devidamente enumerados para melhor identificação. Informações sobre localização cromossômica, funções celulares, proteína codificada e participação em processos biológicos foram obtidas nos bancos de dados online GeneCards® (www.genecards.org) e DAVID 6.7 (www.david.abcc.ncifcrf.gov). RESULTADOS Rede do VDR A rede do VDR (figura 1) totalizou 1501 interações físicas, metabólicas e transcricionais entre 102 genes identificados pelos seus respectivos ID’s - Entrez Gene Database (30). Os dados de expressão gênica normalizados atribuíram valor a 89 dos 102 genes existentes. Treze genes não receberam atributos quantitativos por não possuírem sondas em uma ou ambas as plataformas do chip de microarray. A relação dos tipos de interações observadas entre os genes de interesse e o VDR encontra-se disponível no material suplementar I. Figura 1: Rede de interação do receptor da vitamina D (destacado em amarelo) apresentando as interações que ocorrem por contato físico (azul), atividade transcricional (verde) e interação metabólica (vermelho) http://www.genecards.org/ http://www.david.abcc.ncifcrf.gov/ 10 Análise da expressão gênica pelo GALANT Três análises foram feitas pelo GALANT a partir da projeção dos dados de expressão obtidos dos artigos selecionados sobre a rede do VDR (figura 2). A análise dos dados de A1 - “Microarray analysis identifies altered regulation of nuclear receptor family members in the pre-disease state of multiple sclerosis” - produziu as imagens 2a e 2b, que correspondem às relações de expressão entre CIS1 e controles e EM1 e controles, respectivamente. A análise dos dados de A2 - “Prediction of acute multiple sclerosis relapses by transcription levels of peripheral blood cells” – deu origem à imagem 2c, que corresponde ao resultado da relação da expressão entre os EM2 e CIS2. Considerando a escala de cores definida pelo GALANT, encontramos sete núcleos (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7) de coloração avermelhada sugerindo hiperexpressão de seus componentes. Os 50 genes distribuídos nessas sete áreas foram identificados pelo EntrezID e símbolo , e agrupados em seus respectivos núcleos (tabela 1). Nesta, os principais processos biológicos relacionados a cada núcleo também foram incluídos. Informações adicionais sobre localização cromossômica, proteína codificada e função de cada gene encontram-se disponíveis no material suplementar II. Figura 2: Conjunto de imagens obtidas pelo GALANT a partir da projeção de dados de expressão sobre a rede de interação do receptor de vitamina D. As analises 2a e 2b referem-se aos dados do estudo A1 (ACHIRON et al., 2010) e correspondem às comparações de expressão entre CIS1 versus Controles e EM1 versus Controles, respectivamente. A análise 2c é referente aos dados do estudo A2 (GUREVICH et al., 2009) e corresponde a relação de expressão entre EM2 versus CIS2. Áreas avermelhadas (N1, N2, N3, N4, N5, N6 e N7) correspondem à evidência de hiperexpressão. 11 Segundo a análise ontológica dos processos biológicos, cinco núcleos (N1, N2, N3, N5 e N6) apresentaram genes relacionados ao processo transcricional e sua regulação. O N2 apresentou também genes envolvidos com apoptose. Interessantemente, o N3 apresentou também genes relacionados ao sistema imune e à resposta inflamatória, O N4 apresentou genes importantes na sinalização das vias dos hormônios esteroides. A composição gênica do N7 mostrou relação com transmissão do impulso nervoso pela junção neuromuscular; sinapses e mecanismos regeneração e plasticidade axonal. Todos os núcleos, exceto N1, apresentaram composição similar, independente do grupo ou estudo avaliado. Isto é, encontramos os mesmos genes nas diferentes análises de CIS1 versus CTRL1, EM1 versus CTRL1 e EM2 versus CIS2. Em contraste, a intensidade de coloração dos núcleos apresentou variação. Houve acréscimo de cinco genes na composição do N1 resultante da análise entre EM1 e CTRL1: nuclear receptor corepressor 1 (NCOR1), Sp1 transcription factor (SP1), SWI/SNF related matrix associated actin dependent regulator of chromatin subfamily a member 4 (SMARCA4), nuclear receptor subfamily 0 group B member 2 (NR0B2) e SMAD family member 3 (SMAD3). Estes genes apresentaram relação com o mesmos processos biológicos que os demais constituintes do núcleo. Dentre os 50 genes destacados na rede do VDR, seis apresentaram relação prévia com a EM, segundo banco de dados do GeneCards. Foram eles: Jun Proto-Oncogene (JUN) CREB Binding Protein (CREBBP), Cytochrome P450 Family 24 Subfamily A Polypeptide 1 (CYP24A), Interleukin 10 (IL-10), Interferon Alpha-Inducible Protein 27 (IFI27) e Cyclin-Dependent Kinase 7 (CDK7). Ainda segundo o banco de dados do GeneCards, alguns genes, entre eles o Retinoid X Receptor Alpha (RXRA), Sp1 Transcription Factor (SP1) e Phospholipase D1 Phosphatidylcholine-Specific (PLD1) foram identificados em estudos experimentais relacionados com doenças autoimunes como a encefalomielite aguda experimental (EAE), lúpus eritromatoso sistêmico (LES) e diabetes mellitus tipo 1. 12 Núcleos Núcleo 1 Núcleo 2 Núcleo 3 Núcleo 4 Núcleo 5 Núcleo 6 Núcleo 7 EntrezID – Gene 3725 – JUN** 8626 - TP63 3586 - IL10** 1591 - CYP24A1** 5469 - MED1 3172 - HNF4A 7316 - UBC 10499 - NCOA2 3066 - HDAC2 8648 - NCOA1 9324 - HMGN3 9862 - MED24 8204 - NRIP1 7314 - UBB 9612 - NCOR2 9031 - BAZ1B 5449 - POU1F1 2539 - G6PD 268 - AMH 6257 - RXRB 6233 - RPS27A 2353 – FOS 862 - RUNXIT1 6256 - RXRA 11345 - GABARAPL2 5337 - PLD1 22938 - SNW1 1387 – CREBBP** 573 - BAG1 23054 - NCOA6 8668 - EIF3I 5705 - PSMC5 1050 – CREBPA 7704 - ZBTB16 3429 - IFI27** 2033 - EP300 1027 - CDKN1B 1022 - CDK7** 9611 – NCOR1 5501 - PPP1CC 23710 - GABARAPL1 6667 – SP1 8443 – GNPAT 6597 – SMARCA4 9604 - RNF14 8431 – NROB2 9969 - MED13 4088 – SMAD3 8031 - NCOA4 8295 – TRRAP Processos biológicos Regulação da transcrição e da expressão gênica Regulação da transcrição, morte celular programada Regulação da transcrição e da expressão gênica, resposta inflamatória Cascata de sinalização intracelular, via de sinalização dos hormônios esteroides Regulação da transcrição Regulação da transcrição e da expressão gênica Neurotransmissão na junção neuromuscular, regulação e organização sináptica Tabela 1: Composição dos sete núcleos obtidos pelo GALANTe descrição dos seus principais processos biológicos. Os genes destacados em negrito estão presentes somente na análise resultante da comparação dos dados entre pacientes com esclerose múltipla (EM) e controles (Achiron et all., 2010). ** Genes relacionados à EM segundo o GeneCards (www.genecards.org) 13 DISCUSSÃO Neste estudo, aplicamos o GALANT para conhecer a rede de interação física, transcricional e metabólica do VDR e seu padrão de expressão em pacientes com EM e CIS. A maioria dos estudos relacionados ao VDR refere-se a mecanismos de regulação gênica e às redes de interação transcricionais (31). Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez que uma rede do VDR envolvendo três tipos de interações é apresentada com a finalidade de reproduzir o padrão de expressão gênica por meio de imagens funcionais. As imagens obtidas pela projeção dos dados de CIS1 x Controles, EM1 x Controles e EM2 x CIS2 apresentam discretas diferenças, sugerindo que a assinatura da doença na rede de interações do VDR é similar entre os pacientes que apresentaram apenas um episódio clínico isolado e aqueles que converteram para a forma clinica definida. Essa similaridade de expressão observada em análise in silico corrobora com achados em análise de líquor (32), ressonância magnética (33) e de expressão gênica (23) previamente relatados. Considerando os processos biológicos ativos, o controle do processo transcricional predominou entre os núcleos. Porém quatro núcleos destacaram-se por apresentar componentes importantes no desempenho de outros processos biológicos: morte celular programada pelo N2, resposta imune pelo N3, sinalização dos hormônios esteroides pelo N4 e transmissão sináptica na junção neuromuscular pelo N7. O mecanismo de morte celular desempenha funções importantes e contraditórias na patogenia da EM. De um lado, induzida por fatores próinflamatórios infiltrados no SNC, a apoptose causa a destruição dos oligodendrócitos e desmielinizaçao (34). De outro, a inativação da célula T por morte celular é um importante caminho para a remissão dos surtos. Esses eventos ocorrem por uma variedade de vias e o conhecimento de seus mediadores possibilita novas abordagens experimentais. Um estudo populacional que avaliou o perfil de expressão de indivíduos em diferentes estágios de desenvolvimento da EM apontou a apoptose como o principal processo comprometido em todos os grupos. A baixa expressão do VDR e de outros genes correlacionados resultou na supressão da maquinaria apoptótica. Os autores ainda sugeriram o possível uso terapêutico da vitamina D nos pacientes que tenham o mecanismo de apoptose deficiente (35). 14 A via das citocinas também tem sua importância bem estabelecida na EM. A IL- 10, citocina antinflamatória produto do gene IL-10, tem como alvo principal os macrófagos e as células dendríticas. Sua função principal é impedir a apresentação de antígenos e a ativação das células T por meio da redução da expressão do MHC de classe II na membrana plasmática das células apresentadoras de antígeno (36) e supressão da produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-2, IL-12 e TNF-a. Adicionalmente, regula o crescimento e/ou diferenciação de células B e parece ter papel sobre a diferenciação dos linfócitos Treg (37). O gene da IL-10 está associado à EM (38). Células mononucleares expressando maior quantidade de RNA mensageiro de IL- 10 foram encontradas em pacientes com EM (39). Na EAE, a expressão de IL-10 aumenta gradativamente contribuindo para a remissão do surto e diminuição do processo inflamatório no SNC (40). A vitamina D ativa, mediada pela ação regulatória de seu receptor, potencializou o desenvolvimento e a quantidade de células produtoras de IL-10 em pacientes com EM, agindo em sinergismo com a própria citocina (41). Essas observações foram amparadas pela experimentação no modelo animal, na qual a vitamina D inibiu a resposta inflamatória apenas em ratos que possuíam a via de sinalização da IL-10 inalterada (42). O processo de transmissão nervosa na junção neuromuscular é fundamental para todas as ações motoras na vida diária. A disfunção da JNM é a marca da Miastenia gravis, pela presença de anticorpos anti receptor de acetilcolina, causando fadiga e fraqueza flutuante. A fadiga também é um típico sintoma da EM que, segundo estudos, apresenta transmissão neuromuscular anormal (43). No que se refere aos efeitos neuromusculares da vitamina D, sabe-se suas ações via VDR envolvem desde a síntese protéica até o mecanismo de contração muscular (44,45). Pouco se conhece sobre a relação entre a vitamina D e a junção neuromuscular na patogenia da EM. Entretanto, a 1,25(OH)2D tem sido relacionada a diminuição da força e da massa muscular (46,47). Em três dos sete núcleos foram identificados cinco genes hiperexpressos na rede do VDR que já evidenciaram relação com a EM de acordo com o banco de dados do GeneCards. Os genes CREBBP e CYP24A1, sendo o último associados previamente a EM (48), fazem parte do metabolismo da vitamina D. CYP24A1 tem sua expressão aumentada pelo SNP rs2248359, um alelo de susceptibilidade associado a EM. (49); o IFI27 codifica uma proteína de função desconhecida, mas que foi identificada como um biomarcador da resposta positiva ao tratamento com betainterferona na EM (50); o JUN 15 foi encontrado expresso em neurônios da periferia das placas na fase aguda da doença e pode estar associado à capacidade regenerativa dos neurônios (51); o gene CDK7 está relacionado no bando de dados do GeneCards, mas não encontramos trabalhos publicados sobre sua relação com a EM. A associação do gene IL-10 com a EM já foi discutida nesta sessão. Alguns componentes dos núcleos, entre eles o PLD1, o RXRA e o SP1, já foram observados em estudos experimentais em modelo animal de doenças autoimunes como EAE (52), lúpus eritromatoso sistêmico (53) e diabetes mellitus (54), respectivamente. Considerando que a EM é uma doença autoimune, esses genes poderão ter importância na patogenia da doença. Observamos também que muitos genes não estão envolvidos em outros mecanismos patológicos, como por exemplo, os componentes do N2 que estão em sua maioria envolvidos com processos neoplásicos (55–57) Neste estudo, cerca de 10% dos genes presentes na composição dos núcleos foram relacionados à EM. Portanto, temos por volta de 40 genes identificados por esse método que ainda não foram associados à doença em estudos casos-controles. O GALANT sugere que esses genes podem não estar associados diretamente à EM, mas sim com processos biológicos envolvidos em sua patogenia. A análise in silico possui um limitante pertinente ao método que somente apresenta potencial de predição para os eventos relacionados. Portanto, para a validação dos achados é indispensável a realização de estudos de genômica funcional. Somente após essa etapa o poder de predição do método poderá ser inferido. CONCLUSÃO A criação de uma rede de interações especifica do VDR e a aplicação do GALANT para análise dos dados de expressão gênica de pacientes com EM evidenciaram-se ferramentas com potencial de identificar novos genes relacionados com a doença. Experimentos de genômica funcional poderão confirmar o envolvimento dos novos genes nos mecanismos moleculares da patogenia da EM. 16 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Prosdocimi F, Coutinho G, Ninnecw E, Silva AF, dos Reis AN, Martins AC, et al. Bioinform{á}tica: manual do usu{á}rio. Biotecnol Ci{ê}ncia Desenvolv. 2002;29:12–25. 2. Palsson B. The challenges of in silico biology. Nat Biotechnol [Internet]. 2000 Nov [cited 2014 Jun 27];18(11):1147–50. 3. Rybarczyk-Filho JL. Medidas de performance metabólica usando a expressão gênica de genoma completo [Internet]. 2011. p. 84. 4. Heller MJ. DNA microarray technology: devices, systems, and applications. Annu Rev Biomed Eng [Internet]. 2002 Jan [cited 2014 May 27];4:129–53. 5. 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