RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 05/11/2021. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL QUALIDADE DE CARNE DE BOVINOS SUBMETIDOS A DIFERENTES ESTRATÉGIAS DURANTE A RECRIA E TERMINAÇÃO Juliana Akamine Torrecilhas Zootecnista 2020 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL QUALIDADE DE CARNE DE BOVINOS SUBMETIDOS A DIFERENTES ESTRATÉGIAS DURANTE A RECRIA E TERMINAÇÃO Juliana Akamine Torrecilhas Orientadora: Profa. Dra. Telma Teresinha Berchielli Coorientador: Dr. Elias San Vito Coorientador: Dr. Giovani Fiorentini Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do Título de Doutor em Zootecnia (Nutrição e Produção Animal). 2020 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Juliana Akamine Torrecilhas, filha de José Carlos Torrecilhas e Jucimara Akamine Torrecilhas, nasceu em Maringá, Paraná, no dia 26 de abril de 1988. De 2009 a 2013 desenvolveu o curso de Zootecnia pela Universidade Estadual de Maringá -UEM, onde foi bolsista de iniciação cientifica sobre orientação do prof. Dr. Ivanor Nunes do Prado. Em março de 2014, ingressou no Programa de Pós Graduação em Zootecnia, em nível mestrado, área de concentração Nutrição e Produção Animal, na Universidade Estadual de Maringá sobre orientação do prof. Dr. Ivanor Nunes do Prado, obtendo o título de mestre em fevereiro de 2016. Em fevereiro de 2016, ingressou no Programa de Pós graduação em Zootecnia, em nível doutorado, na Universidade Estadual Paulista – Júlio de Mesquita Filho – Campus de Jaboticabal sobre orientação da Profa. Dra. Telma Teresinha Berchielli. Em março de 2020 submeteu-se à defesa da tese. “Tenha coragem. Vá em frente. Determinação, coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o sucesso. Não importa quais sejam os obstáculos e as dificuldades. Se estamos possuídos de uma inabalável determinação, conseguimos superá-los independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de orgulho.” Dalai Lama “Don’t let the noise of others’ opinions drown out your own inner voice” “The only way to do great work is to love what you do.” Steve Jobs Aos meus pais José Carlos Torrecilhas e Jucimara Akamine Torrecilhas, pelo carinho, pela força, dedicação, amor e contribuição para minha formação, social e pessoal. Aos meus irmãos, Josiane e Carlos Eduardo, que sempre estiveram ao meu lado. Aos meus avós, Lídia e José Torrecilhas pelo grande apoio e carinho. A toda minha família, que mais do que me proporcionaram uma boa infância e formaram os fundamentos do meu caráter. Dedico. AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida, por ter me iluminado nas decisões mais difíceis e por ter me guiado ao longo do doutorado. A Universidade Estadual Paulista (UNESP), a pós graduação em Zootecnia da Unesp e professores do programa que possibilitou a realização deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida no início do doutorado. A Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da bolsa de pós graduação (processo 2016/10953-3), e ao projeto auxílio (processo 2015/01147-0). A minha orientadora Telma Teresinha Berchielli, pela confiança em todo o meu doutorado e pelas oportunidades geradas para minha formação. Aos meus coorientadores Elias San Vito e Giovani Fiorentini, pelas orientações, conselhos, paciência e toda ajuda. Aos Prof. Terry Engle e Prof. Dr. Joanis Zervoudakis, por toda amizade, apoio e auxílio durante o estágio de pesquisa no exterior. Aos amigos, Nomaiaci Andrade, Eulalia Pinheiro, Kênia Alves, Karine Vecchia, Pablo Castagnino, Sergio Pereira, Rayanne Costa, Paloma Gonçalves, Geovany Carvalho, Thaís Brito e Iorrano Cidrini pela amizade, pelo apoio e auxílio nos momentos difíceis, paciência, conselhos e amizade. Aos que participaram do projeto, Tiago Simioni, Giovane Penasso, Thais Ribeiro, Maria Julia Ganga, Breno Maximo, Erick Escobar, Laís Lima, Paulo Colovate, Vladmir, Alinne Oliveira e Conceição Oliveira por toda ajuda. Aos técnicos de laboratório da Unesp, João Carlos Campanharo, Claudia Fiorillo e Ana Paula Sader por toda ajuda e auxílio durante o desenrolar das análises. Ao Prof. Dr. Ivanor Nunes do Prado e Dra. Ana Guerrero, pela amizade adquirida no Mestrado e mantida até os dias atuais, pelos ensinamentos e por terem aceitado participar da minha banca de defesa. A Dra. Josiane Lage por ter participado do projeto, pelos auxílios durante o doutorado e por ter aceitado participar da minha banca de defesa. Ao Dr. Fernando Baldi, por ter contribuído na qualificação e aceitado participar da banca de defesa. Ao grupo de pesquisa da professora Telma Berchielli, Juliana Duarte, Yury Granja e grupo todo pelo ensinamento durante o experimento. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. i SUMÁRIO RESUMO ........................................................................................................................ v ABSTRACT ................................................................................................................... vii CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ................................................................. 1 1. Introdução ............................................................................................................. 1 1.1. Suplementação de bovinos durante a fase de recria ...................................... 2 1.2. Fase de terminação de bovinos ...................................................................... 5 1.3. Desenvolvimento do tecido adiposo ............................................................... 7 1.4. Qualidade da carne de bovinos .................................................................... 11 1.5. Perfil de Ácidos graxos intramuscular ........................................................... 15 2. Referências ......................................................................................................... 17 CHAPTER 2 - EFFECTS OF THE SUPPLEMENTATION STRATEGY DURING THE GROWING PHASE ON MEAT QUALITY FROM BULLS FINISHED IN DIFFERENT SYSTEM ....................................................................................................................... 24 Abstract ...................................................................................................................... 24 1. Introduction .......................................................................................................... 25 2. Materials and Methods ........................................................................................ 26 2.1. Animals source ............................................................................................. 26 2.2. Growing phase (first experimental phase) .................................................... 26 2.3. Finishing phase (second phase experimental) .............................................. 27 2.4. Slaughter procedure and muscle sampling ................................................... 28 2.5. Warner – Bratzler shear force (WBSF) ......................................................... 28 2.6. Myofibril fragmentation index ........................................................................ 29 2.7. Sarcomere length.......................................................................................... 29 ii 2.8. Cooking loss, thawing loss, and water holding capacity ............................... 30 2.9. Instrumental fat colour .................................................................................. 30 2.10. Malonaldehyde concentration .................................................................... 31 2.11. Myoglobin .................................................................................................. 31 2.12. Instrumental meat colour ........................................................................... 31 2.13. Statistical analysis ..................................................................................... 32 3. Results ................................................................................................................ 32 3.1. pH, fat thickness, WBSF, sarcomere length, MFI, WHC, thawing loss, and cooking loss ............................................................................................................ 33 3.2. Instrumental fat colour .................................................................................. 33 3.3. Lipid oxidation, myoglobin, and display ......................................................... 34 4. Discussion ........................................................................................................... 35 4.1. pH, WBFS, sarcomere length, MFI, WHC, thawing loss, cooking loss ......... 35 4.2. Instrumental Fat colour ................................................................................. 37 4.3. Lipid oxidation, myoglobin, and instrumental colour...................................... 37 5. Conclusion ........................................................................................................... 40 6. Reference ............................................................................................................ 40 CHAPTER 3. THE EXPRESSION GENE ASSOCIATED IN LIPID METABOLISM OF LONGISSIMUS THORACIS FROM BULLS SUPPLEMENTED DURING THE GROWING PHASE AND FINISHED IN DIFFERENT SYSTEMS .................................................... 53 Abstract ...................................................................................................................... 53 1. Introduction .......................................................................................................... 54 2. Materials and Methods ........................................................................................ 55 2.1. Animals ......................................................................................................... 55 2.2. Growing phase (first experimental phase) .................................................... 55 iii 2.3. Finishing phase (second phase experimental) .............................................. 56 2.4. Slaughter procedure and muscle sampling ................................................... 57 2.5. Chemical composition of meat ...................................................................... 57 2.6. Fatty acid profile of meat and diet ................................................................. 58 2.7. Lipogenic enzyme activity ............................................................................. 58 2.8. Gene expression analyses ............................................................................ 58 2.9. Gene set enrichment analysis ....................................................................... 59 2.10. Statistical analysis ..................................................................................... 60 3. Results ................................................................................................................ 60 3.1. Meat composition .......................................................................................... 61 3.2. Fatty acid profile............................................................................................ 61 3.3. Lipogenic enzyme activity ............................................................................. 62 3.4. Relative expression of genes relationship with lipid metabolism ................... 62 4. Discussion ........................................................................................................... 63 5. Conclusion ........................................................................................................... 68 6. Reference ............................................................................................................ 69 iv v QUALIDADE DA CARNE DE BOVINOS SUBMETIDOS A DIFERENTES ESTRATÉGIAS DURANTE A RECRIA E TERMINAÇÃO RESUMO – Nosso objetivo foi avaliar o efeito da estratégia de suplementação durante a fase de recria na qualidade da carne de bovinos terminados em pasto mais concentrado ou confinamento. Cento e vinte machos não castrados [10 ± 2 meses de idade e 256,54 ± 28,92 kg de peso vivo (PC) inicial] foram blocados por peso e aleatoriamente designados para os tratamentos em design fatorial 2 × 2, dois suplementos durante a fase de recria: mineral (ad libitum – MIN) ou proteína + energia (0,3% PC/ animal/ dia – PRE) e dois sistema de terminação: pasto mais suplementação com concentrado (2% PC/ animal/ dia - PAST); e confinamento (25:75 %; silagem de milho: concentrado - FLOT). Depois de 285 dias os bovinos (503,89 ± 56,61 kg) foram abatidos em frigorifico comercial, a carcaça foi dividida medialmente do esterno e da coluna, resultando em duas metades semelhantes. Amostras (10g) do Longíssius thoracis (LT) foram removidas imediatamente depois do abate, entre a 12ª e 13ª costela de cada animal e congeladas (nitrogênio líquido) para: atividade de enzima lipogênica e relativa abundancia de RNAm associado com metabolismo de lipídeos, analisados por qRT-PCR os genes alvos incluíram PPARγ, SREBP1c, SCD1, ACCα LPL, FBP4, CPT2, ACOX e PPARα. Após 24 horas de resfriamento de carcaça, o pH foi mesurado entre a 12ª e 13ª costela do LT. A gordura subcutânea e cinco bifes de 2,54 cm do LT (entre a 9ª a 13ª costela) foram coletados para análises: perfil de ácido graxo, composição química, força de cisalhamento, comprimento de sarcômero, índice de fragmentação miofibrilar, perda de descongelamento, perda de cocção, capacidade retenção de água, cor de gordura, mioglobina, oxidação lipídica e parâmetros de cor que foram avaliados nos dia 1, 4, 7, 10, 14 de exposição ao oxigênio a 0 ± 4°C. O sistema FLOT aumentou (P < 0,050) a espessura de gordura subcutânea (7,01 vs. 3,07 mm), o comprimento de sarcômero (1,59 vs. 1,42 µm) e diminuiu (P < 0,050) a força de cisalhamento da carne (36,29 vs. 43,20 N), enquanto o grupo do PAST mostrou maior (P < 0,050) capacidade retenção de água (68,16 vs. 64,32%), gordura amarela (16,66 vs. 14,30), concentração de mioglobina (4,56 vs. 3,95 mg/g de carne). A carne dos bovinos alimentados com MIN durante a fase de crescimento seguidos pela terminação FLOT mostraram aumento (P < 0,050) da oxidação lipídica comparado aos bovinos do MIN seguidos do sistema PAST (0.35 vs. 0.27 mg/kg de carne). Durante o tempo de armazenamento, a carne dos bovinos alimentados com MIN seguido pelo sistema PAST mostraram menores (P < 0,050) valores de L* comparados com os outros tratamentos. Nos dias, 4 e 7 de display, o grupo FLOT tiveram aumento (P < 0,050) de a* e C* na carne comparado ao PAST. Os animais do sistema PAST mostraram menores (P < 0,050) valores de b* comparado ao FLOT (12,17 vs. 13,40, respectivamente). O sistema FLOT aumentou (P < 0,050) o conteúdo de lipídeo na carne do que o PAST (2,72 vs. 1,49%, respectivamente). Os animais alimentados com MIN seguidos da terminação FLOT mostraram um aumento (P < 0,050) dos ácidos C12:0, C14:0, e C16:0, o que levou a um aumento da concentração do total de ácido graxo saturado. Os bovinos terminados no sistema FLOT tiveram maior (P < 0,050) concentração do total de ácido graxo monoinsaturado coincidindo com o aumento (P < 0,050) da expressão do gene SCD1 no musculo em comparação ao sistema PAST. vi A carne dos bovinos do sistema FLOT mostrou diminuição (P < 0,050) de C18:2n6, C20:3n6, C20:4n6, C20:5n3, razão n6/n3, e isocitrato desidrogenase em comparação ao sistema PAST. Além disso, os bovinos alimentados com PRE seguidos pela terminação FLOT tiveram maior (P < 0,050) expressão de CPT2 no musculo, enquanto que a suplementação MIN seguido pelo sistema PAST mostraram diminuição (P < 0,050) de SREBP1c, aumento (P < 0,050) da expressão de CPT2 e PPARα no musculo. Em geral, esses resultados sugerirem que os atributos relacionados com a maciez da carne não foram afetados pela fase de crescimento. O sistema PAST diminuiu a maciez e luminosidade da carne, mas esses atributos ainda mostraram dentro dos padrões aceitos na indústria de carne. Além disso, o sistema FLOT aumentou o lipídio intramuscular em comparação com o sistema PAST, mas os animais alimentados com MIN durante a fase de crescimento acompanhado do sistema PAST apresentaram maior expressão de genes relacionados à degradação lipídica e menores genes relacionados à síntese de lipídios. Palavras – chave: Coloração, Expressão de genes, Marmoreio, Suplementação intensiva vii MEAT QUALITY OF BULLS SUBMITTED TO DIFFERENT STRATEGY DURING THE GROWING AND FINISHING PHASE ABSTRACT – Our objective was to evaluate the supplementation strategy during the growing phase on the meat quality of bulls finished in pasture plus concentrate or feedlot. One hundred and twenty young bulls uncastrated males [10 ± 2 month old and 256.54 ± 28.92 kg of body weight (BW)] were blocked by weight and randomly assigned to treatments in 2 × 2 factorial design, two supplements during the growing phase: mineral (ad libitum - MIN) or Protein + Energy (0.3% BW/ animal/ day - PE) and two finishing system: pasture plus concentrate (2% BW/ animal/ day - PAST) or feedlot (25:75; corn silage: concentrate - FLOT). After 285 days the bulls (503.89 ± 56.61 kg) were slaughtered, the carcasses were divided medially from the sternum and the spine, resulting in two similar halves. The Longissimus thoracis (LT) sample (10 g) was removed immediately after slaughtered between 12th and 13th ribs from each animal and frozen (liquid nitrogen) for: lipogenic enzyme activity and relative abundance of mRNA associated with lipid metabolism measured by qRT-PCR, target genes include PPARγ, SREBP1c, SCD1, ACCα, LPL, FBP4, CPT2, ACOX, and PPARα. After 24 h carcass chilling, the pH was measured between the 12th and 13th ribs of the LT. The fat thickness and five steaks of 2.54 cm from LT (between the 9th and 13th ribs) were collected for fatty acid profile, chemical composition, shear force, sarcomere length, myofibrillar fragmentation index, thawing loss, cooking loss, water holding capacity, fat color, myoglobin, lipid oxidation and meat color which was measured on days, 1, 4, 7, 10 and 14 storage time exposed to oxygen at 0 ± 4°C. The FLOT system increased (P < 0.050) the fat thickness (7.01 vs. 3.07 mm), sarcomere length (1.59 vs. 1.42 µm), and decreased the meat shear force (36.29 vs. 43.20 N), while the PAST group showed higher (P < 0.050) water holding capacity (68.16 vs. 64.32%), yellowness fat (16.66 vs. 14.30), myoglobin concentration (4.56 vs. 3.95 mg/g of meat). The meat of bulls fed with MIN during the growing phase following by FLOT finishing showed increased (P < 0.050) of lipid oxidation compared to bulls from MIN following by PAST system (0.35 vs. 0.27 mg/kg of meat). During the storage time, the meat of bulls fed with MIN following by PAST system showed lower (P < 0.050) L* value compared to the other treatments. On days, 4 and 7 of the display, the FLOT group had increased (P < 0.050) of a* and C* in meat compared to PAST. The bulls from PAST system showed lower (P < 0.050) b* value compared to FLOT (12.17 vs. 13.40, respectively). The FLOT group had (P < 0.050) higher lipid content than PAST (2.72 vs 1.49%, respectively). The bulls fed with MIN following by FLOT system showed an increase (P < 0.050) of C12:0, C14:0, and C16:0 which led to greater saturation fatty acid total concentration. The bulls finished in FLOT system had higher (P < 0.050) monounsaturated fatty acid total concentration coinciding with the up-regulated (P < 0.050) of gene expression of SCD1 compared to PAST system. The meat of bulls from FLOT system showed a decrease (P < 0.050) of C18:2n6, C20:3n6, C20:4n6, C20:5n3, n6/n3 ratio and isocitrate dehydrogenase compared to PAST system. In addition, the animals fed with PRE following by FLOT finishing had higher (P < 0.050) CPT2 expression, while the MIN supplementation following by PAST viii system showed decreased (P < 0.050) of SREBP1c, increased (P < 0.050) CPT2 and PPARα expression. Globally, these results suggested which the attributes relationship with tenderness meat was not affected by the growing phase. The PAST system decreased the tenderness and lightness of meat, but these attributes still showed within the acceptable standards of the meat industry. In addition, the FLOT system increased the intramuscular lipid compared to PAST system, but the animals fed with MIN during the growing phase following by PAST showed greater genes expression related to lipid degradation and lower gene expression related with synthesis of lipids. Keywords: Colour, Gene expression, Marbling, Intensive supplementation 1 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 1. Introdução O Brasil possui produção de bovinos predominantemente a pasto, a maior parte do território para criação, apresenta característica climática favorável durante a época de verão para produção de gado, devido ao aumento de incidência de chuvas e melhora na quantidade e qualidade de forragem (Moreira et al., 2008). Por outro lado, na época de inverno é caracterizado por limitar o crescimento de forrageiras, que consequentemente fornece menor disponibilidade de nutrientes ao animal, que por sua vez pode comprometer seu desempenho (Detmann et al., 2014). Para obter eficiência nas respostas produtivas na bovinocultura de corte em regime de pasto, tanto na fase de crescimento quanto na terminação, é fundamental estabelecer desde a idade jovem dos animais, um ambiente adequado e uma estratégia de suplementação alimentar eficiente e bem planejada. A fase de recria é um ponto chave para busca de antecipação da idade de abate, cujo os animais apresentarem uma melhor eficiência biológica quanto a deposição de tecidos, devido apresentarem curva de crescimento mais acentuada (Owens et al., 1993). A deposição de proteína é quatro vezes mais eficiente em comparação a deposição de gordura, uma vez que para a deposição de tecido muscular, aproximadamente 78% de agua é estocada, enquanto que 10% de agua é armazenada para deposição de gordura (Owens et al., 1995). Dessa forma, a suplementação é uma estratégia de produção que pode ser utilizada para explorar a fase de recria, sendo que o ganho adicional nessa fase é mantido durante a fase de terminação sendo a pasto ou em confinamento, e o tempo necessário para engorda desses animais é reduzido em relação ao uso de sal mineral (Casagrande et al., 2013). A medida que o animal cresce e se aproxima da maturidade, a intensidade de crescimento muscular é reduzida e a constituição do ganho passa a ser composto pelo crescimento do tecido adiposo (Owens et al., 1993). Assim sendo, na fase de terminação na época de inverno apresenta um entrave devido à escassez de forragem e a baixa oferta de nutrientes para o animal. Por conseguinte, estratégias de dieta com o uso de 2 alta inclusão de concentrado em relação ao peso corporal animal (1.5 a 2% do peso corporal), seja em sistema de pasto ou confinamento convencional pode reduzir o ciclo de produção e levar a um melhor acabamento de carcaça, aumento do marmoreio da carne, características cada vez mais desejadas pela indústria da carne e mercado consumidor (Carvalho e Smith, 2018). Dessa forma, a compreensão fisiológica do crescimento animal é de extrema importância, uma vez que a quantidade de cada tecido, a velocidade com que são depositados, e a nutrição animal podem influenciar o ganho de peso animal, na composição do ganho e na qualidade de carne. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da estratégia de suplementação durante a fase de crescimento sobre a qualidade da carne de bovinos jovens terminados em diferentes sistemas de terminação, pasto com suplementação de concentrado (Expresso®) ou em confinamento convencional. 40 5. Conclusion Bulls finished in feedlot systems increase the fat thickness and it improves the meat tenderness. On one hand, supplementation with mineral in the growing phase combined with concentrate supplementation in the pasture system during the finishing phase can impair meat colour by increasing dark cutting beef. On the other hand, the pasture system decreased the fat thickness and tenderness in meat without affecting the industry standards of quality. 6. Reference AMSA. (1995). Research guidelines for cookery, sensory evaluation and instrumental tenderness measurements of fresh meat. In A. M. S. Association (Ed.), American Meat Science Association (pp. 48). Savoy, IL: National Livestock and Meat Board. Apaoblaza, A., Strobel, P., Ramírez-Reveco, A., Jeréz-Timaure, N., Monti, G., & Gallo, C. (2017). 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