Karina Peres Ferrassoli Produção de biossurfactantes por Candida tropicalis utilizando resíduos do processamento do abacaxi (Ananas comosus) como substrato. São José do Rio Preto 2019 Karina Peres Ferrassoli Produção de biossurfactantes por Candida tropicalis utilizando resíduos do processamento do abacaxi (Ananas comosus) como substrato. Dissertação apresentada como parte de requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz. Financiadora: CNPq – Processo: 132638/2017-7 São José do Rio Preto 2019 Ferassoli, Karina Peres F345p Produção de biossurfactantes por Candida tropicalis utilizando resíduos do processamento do abacaxi (Ananas comosus)como substrato / Karina Peres Ferassoli. - São José do Rio Preto, 2019. 95 f. : il., tabs., + 1 CD- ROM Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientador: Crispin Humberto Garcia Cruz 1. Tecnologia de Alimentos. 2. Biopolímeros. 3. Biossurfactantes. 4. Substratos renováveis. 5. Abacaxi. Karina Peres Ferrassoli Produção de biossurfactantes por Candida tropicalis utilizando resíduos do processamento do abacaxi (Ananas comosus) como substrato. Dissertação apresentada como parte de requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq – Processo: 132638/2017-7 Banca Examinadora Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz UNESP- São José do Rio Preto - Orientador Profª.Drª. Silvia Messias Bueno UNILAGO – São José do Rio Preto Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto 08 de Maio de 2019 AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais pela força e pelo apoio ao longo desse caminho e por confiarem em mim, minha mãe amada que me manteve forte e nunca me deixou desistir. Ao meu amado Deus e sua enorme magnitude por me manter firme em meus pensamentos e projetos. Agradeço ao meu companheiro Antônio pela companhia nas noites varadas no laboratório e pela força, eu te amo. Ao meu orientador que se manteve paciente comigo e sempre acreditou no meu potencial. Ao CNPq pelo apoio financeiro, processo: 132638/2017-7. Agradeço aos colegas de laboratório por me ajudarem nessa caminhada. Agradeço a minha banca por estarem comigo nessa etapa tão importante da minha vida. RESUMO Biossurfactantes são grupos de compostos químicos produzidos por bactérias, fungos e leveduras através da biodegradação de matérias-primas renováveis. Tais compostos possuem característica anfipática, agindo como emulsificantes de hidrocarbonetos. São polímeros que formam micelas que se acumulam na interface entre líquidos de diferentes graus de polaridade. A utilização de biossurfactantes tornou-se uma alternativa bastante interessante em substituição aos surfactantes sintéticos, pois geram menor impacto ambiental devido à sua biodegradabilidade, diversidade estrutural e baixa toxicidade. O abacaxi é uma fruta tropical muito consumida no Brasil, principalmente o suco e a fruta “in natura”, gerando assim uma grande quantidade de resíduos como a casca e o talo de abacaxi. O presente trabalho teve como objetivo a produção de biossurfactante por meio da fermentação dos resíduos hidrolisados do processamento do abacaxi (Ananas comosus), por Candida tropicalis. A hidrólise foi realizada utilizando diferentes concentrações de ácido sulfúrico submetidas a diferentes tempos de aquecimento em autoclave. Foram realizadas análises de açúcares, composto fenólico e produção de biossurfactantes. Os resultados indicaram que a melhor concentração de ácido sulfúrico para realização da hidrólise foi 2,5% de H2SO4 com tempo de aquecimento de 15 minutos. A desintoxicação diminuiu a quantidade de compostos fenólicos. Foi determinada a melhor forma da produção de biossurfactantes por fermentação durante 12 horas e utilizando como fonte de carbono os hidrolisados da casca de abacaxi, talo de abacaxi e glicose na concentração de 5%. A partir destes resultados testou-se a capacidade de produção de biossurfactante utilizando o hidrolisado da casca e do talo de abacaxi e glicose. Os biossurfactantes produzidos após 2h, 4h, 6h e 8h em todos os substratos mantiveram um índice de emulsificação menor do que 50%, já os biossurfactantes produzido após 10 horas de fermentação tiveram valores próximos de 50% e mantiveram a estabilidade da emulsão acima das 24 horas. Os resultados obtidos para atividade emulsificante mostraram que quanto maior for a concentração de biossurfactante e maior o tempo de fermentação maior foi o valor de atividade emulsificante. Foram constatadas reduções da tensão superficial para os biossurfactantes produzidos a partir dos hidrolisados de todos os substratos. Deste, o biossurfactante obtido usando o hidrolisado do talo reduziu a tensão superficial até 30 mNm-1. A concentração micelar crítica teve seu valor menor também com o biossurfactante produzido pelo hidrolisado do talo de abacaxi, porém todos os substratos mantiveram valores baixos o que indica que os biossurfactantes produzidos foram eficazes. Foi analisado o índice de emulsificação em ensaios imitando um molho tipo francês. A formulação contendo 6 mL de biossurfactante estabilizou a mistura melhor. A análise em tempos de 15 em 15 dias verificou que com essa formulação há uma estabilização do molho, havendo pouca variação nos 120 dias analisados. Palavras - chave: Biossurfactante, fermentação, abacaxi. ABSTRACT Biosurfactants are groups of chemical compounds produced by bacteria, fungi and yeasts through the biodegradation of renewable raw materials. Such compounds have amphipathic properties, acting as hydrocarbon emulsifiers. They are polymers that form micelles that accumulate at the interface between liquids of different degrees of polarity. The use of biosurfactants has become a rather interesting alternative to synthetic surfactants because they generate less environmental impact due to their biodegradability, structural diversity and low toxicity. Pineapple is a tropical fruit very consumed in Brazil, mainly the juice and the fruit "in natura", thus generating a great amount of residues like the pell and the stem of pineapple. The present work had as objective the production of biosurfactant by means of the fermentation of the hydrolyzed residues of the processing of the pineapple (Ananas comosus), by Candida tropicalis. The hydrolysis was performed using different concentrations of sulfuric acid submitted to different autoclaving times. Analyzes of sugars, phenolic compounds and biosurfactants production were carried out. The results indicated that the best sulfuric acid concentration for the hydrolysis was 2.5% H2SO4 with a heating time of 15 minutes. Detoxification decreased the amount of phenolic compounds. The best form of biosurfactant production was determined by fermentation for 12 hours and using the hydrolysates of pineapple peel, pineapple stem and glucose at 5% concentration as the carbon source. From these results the biosurfactant production capacity was tested using the hydrolyzate of the peel and the stem of pineapple and glucose. The biosurfactants produced after 2h, 4h, 6h and 8h in all substrates maintained an emulsification index of less than 50%, while the biosurfactants produced after 10 hours of fermentation had values close to 50% and maintained the emulsion stability above 24 hours. The results obtained for emulsifying activity showed that the higher the biosurfactant concentration and the longer the fermentation time the higher the emulsifying activity value. Reductions of the surface tension for the biosurfactants produced from the hydrolysates of all the substrates were observed. From this, the biosurfactant obtained using the pineapple stem hydrolyzate reduced the surface tension to 30 mNm-1. The critical micellar concentration was also lower with the biosurfactant produced by the pineapple stem hydrolyzate, but all the substrates maintained low values indicating that the biosurfactants produced were effective. The emulsification index was assayed in assays mimicking a French type dressing. The formulation containing 6 ml of biosurfactant stabilized the mixture better. The analysis at 15- day times showed that with this formulation there is a stabilization of the sauce, with little variation in the 120 days analyzed. Keywords: Biosurfactant, fermentation, pineapple. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Organização molecular de um surfactante.......................................20 Figura 2 – Representação esquemática de outras estruturas organizadas de surfactantes.......................................................................................................21 Figura 3 – Representação esquemática: (A): Gota de água em superfície hidrofóbica. (B): Gota de água em uma superfície hidrofóbica, contendo moléculas de surfactante. A redução da tensão superficial na gota de água, após a adição de surfactante aumentou a área de contato da água com a superfície hidrofóbica.........................................................................................22 Figura 4 – Elemento de volume de água de superfície, mostrando a saturação de moléculas de surfactante..............................................................................23 Figura 5 – Principais vias biossintéticas para a produção de biossurfactante...................................................................................................27 Figura 6 – Estrutura química do emulsan..........................................................29 Figura 7 – Fluxograma do processamento do abacaxi para obtenção do suco...................................................................................................................36 Figura 8 – Preparação do pré-inóculo para fermentação..................................42 Figura 9 – Molho tipo francês comercializado e lista de ingredientes..............47 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 – Diagrama da variação de tensão superficial, interfacial e solubilidade do composto orgânico com relação a concentração do tensoativo...........................................................................................................24 Gráfico 2 – Concentrações de açúcares totais em g/L liberadas por hidrólise ácida com 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10% de H2SO4, com aquecimento de 15 e 30 minutis em autoclave.........................................................................................49 Gráfico 3 – Concentrações de açúcares redutores em g/L liberadas por hidrólise ácida com 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10% de H2SO4, com aquecimento de 15 e 30 minutos em autoclave................................................................................50 Gráfico 4 – Concentrações de compostos fenólicos em g/L liberadas por hidrólise ácida com 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10% de H2SO4, com aquecimento de 15 e 30 minutos em autoclave................................................................................50 Gráfico 5 – Açúcares redutores em g/L sem desintoxicar, desintoxicado e após concentração.....................................................................................................52 Gráfico 6 – Compostos fenólicos em g/L sem desintoxicar, desintoxicado e após concentração.............................................................................................53 Gráfico 7 - Crescimento microbiano para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..................................................................................................54 Gráfico 8 – Crescimento microbiano para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...........................................................54 Gráfico 9 – Crescimento microbiano para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..........................................................................55 Gráfico 10 – Variação do pH para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................56 Gráfico 11 – Variação do pH para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..........................................................................56 Gráfico 12 – Variação do pH para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..........................................................................57 Gráfico 13 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 2 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...............................................................................................58 Gráfico 14 -Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 4 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...............................................................................................58 Gráfico 15 - Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 6 horas de fermentação a 30º C e 200 rpm..............................................................................................59 Gráfico 16 - Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca) utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 8 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...............................................................................................59 Gráfico 17 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 2 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..............................................................................................................60 Gráfico 18 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 4 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..............................................................................................................60 Gráfico 19 - Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 6 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..............................................................................................................61 Gráfico 20 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 8 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..............................................................................................................61 Gráfico 21 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 2 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................62 Gráfico 22 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 4 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................62 Gráfico 23 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 6 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................63 Gráfico 24 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 8 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................63 Gráfico 25 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 10 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..........................................................................64 Gráfico 26 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo) utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 10 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...........................................................................................................65 Gráfico 27 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de glicose utilizada pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactante no período de 10 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................65 Gráfico 28 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..........................................................................67 Gráfico 29 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...........................................................................................................67 Gráfico 30 – Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de glicose utilizada pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactante no período de 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................68 Gráfico 31 –Tensão superficial do sobrenadante livre de células obtido em diferentes concentrações de glicose durante 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação utilizando a levedura Candida tropicalis a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................72 Gráfico 32 – Tensão superficial do sobrenadante livre de células obtido em diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo) durante 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação utilizando a levedura Candida tropicalis a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................72 Gráfico 33 – Tensão superficial do sobrenadante livre de células obtido em diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca) durante 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação utilizando a levedura Candida tropicalis a 30ºC e 200 rpm..............................................................................................................73 Gráfico 34 – Concentração micelar crítica (CMC) no sobrenadante livre de células quando foi utilizado glicose como substrato pela levedura Candida tropicalis no tempo de fermentação de 10 horas a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................74 Gráfico 35 – Concentração micelar crítica (CMC) no sobrenadante livre de células quando foi utilizado o hidrolisado de abacaxi (talo) como substrato pela levedura Candida tropicalis no tempo de fermentação de 10 horas a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................74 Gráfico 36 – Concentração micelar crítica (CMC) no sobrenadante livre de células quando foi utilizado o hidrolisado de abacaxi (casca) como substrato pela levedura Candida tropicalis no tempo de fermentação de 10 horas a 30ºC e 200 rpm...........................................................................................................75 Gráfico 37 – Estabilidade da emulsão do molho tipo francês por 120 dias....................................................................................................................77 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Valores de HLB e potencial aplicação.............................................24 Tabela 2 – Biossurfactantes e micro-organismos produtores...........................31 Tabela 3 – Principais frutas produzidas no Brasil.............................................35 Tabela 4 – Funções e aplicações de alguns biossurfactantes..........................39 Tabela 5 –Meio de manutenção utilizado para a levedura Candida tropicalis.............................................................................................................41 Tabela 6 – Meio de padrão utilizado para compor o meio de produção............43 Tabela 7 – Atividade emulsificante para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm..........................................................................69 Tabela 8 – Atividade emulsificante para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm...........................................................................................................69 Tabela 9 – Atividade emulsificante para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm.....................................................................................................................70 Tabela 10 – Formulação do sistema utilizado para análise do índice de emulsificação simulando um molho tipo francês...............................................76 Tabela 11 – Índice de emulsificação dos ensaios realizados...........................76 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 17 2. OBJETIVOS ................................................................................................. 19 2.1 Objetivos gerais ....................................................................................... 19 2.2 Objetivos específicos............................................................................... 19 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 20 3.1 Surfactantes .............................................................................................. 20 3.2 Biossurfactantes e mercado mundial ..................................................... 25 3.3 Classificação dos biossurfactantes e micro-organismos produtores. 28 3.4 Produção de biossurfactantes por leveduras ........................................ 32 3.4.1 Candida tropicalis .................................................................................... 32 3.5 Substratos ................................................................................................. 34 3.5.1 Abacaxi .................................................................................................... 34 3.6 Aplicações dos biossurfactantes ........................................................... 36 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 40 4.1 Matéria-prima ............................................................................................ 40 4.2 Preparo da matéria-prima ........................................................................ 40 4.3 Pré-tratamento da biomassa ................................................................... 40 4.4 Desintoxicação do hidrolisado ............................................................... 40 4.5 Micro-organismo ...................................................................................... 41 4.6 Meio de manutenção ................................................................................ 41 4.7 Preparo do pré-inóculo para ativação da levedura ............................... 41 4.8 Padronização do inóculo ......................................................................... 42 4.9 Preparo do meio de fermentação ............................................................ 43 4.9.1 Meio Padrão ............................................................................................ 43 4.9.2 Meio de Produção ................................................................................... 43 4.9.3 Fermentação ........................................................................................... 43 4.10 Métodos analíticos ................................................................................. 44 4.10.1 Determinação do pH.............................................................................. 44 4.10.2 Determinação do crescimento microbiano ............................................ 44 4.10.3 Determinação da presença de biossurfactante ..................................... 44 4.10.4 Separação do biossurfactante ............................................................... 45 4.10.5 Construção da curva padrão para determinação da massa celular seca.... .............................................................................................................. 45 4.10.6 Potencial para estabilizar emulsões de molho estilo Francês ............... 46 4.10.7 Determinação de açúcares totais .......................................................... 47 4.10.8 Determinação de açúcares redutores.....................................................47 4.10.9 Determinação do teor de compostos fenólicos......................................47. 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................. 48 5.1 Padronização da hidrólise da casca e do talo do abacaxi .................... 48 5.2 Desintoxicação e concentração dos hidrolisados do talo e da casca do abacaxi ............................................................................................................ 52 5.3 Determinação do crescimento microbiano ............................................ 53 5.4 Variação do ph .......................................................................................... 55 5.5 Índice de emulsificação ........................................................................... 57 5.6 Atividade emulsificante .......................................................................... 68 5.7 Tensão superficial .................................................................................... 70 5.8 Concentração micelar crítica (cmc) ........................................................ 73 5.9 Determinação do efeito do biossurfactante para estabilização de um molho tipo francês ......................................................................................... 76 5.10 Separação do biossurfactante .............................................................. 78 6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 79 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 80 APÊNDICE A - Concentração de glicose e absorbância (490 nm) para padronização da curva padrão de açúcares totais. ........................................ 90 APÊNDICE B - Curva padrão para açúcares totais........................................ 90 APÊNDICE C - Concentração de glicose e absorbância (540 nm) para padronização da curva padrão de açúcares redutores................................... 91 APÊNDICE D - Curva padrão para açúcares redutores ................................. 91 APÊNDICE E - Concentração de ácido vanílico e absorbância (750 nm) para padronização da curva padrão de compostos fenólicos................................ 92 APÊNDICE F - Curva padrão compostos fenólicos ..................................... 92 APÊNDICE G - Peso celular da levedura (g/L) e absorbâncias determinadas na obtenção da curva do crescimento de Candida tropicalis....................... 93 APÊNDICE H - Curva Padrão de glicose para crescimento da Candida tropicalis ....................................................................................................... 93 17 1. INTRODUÇÃO Os surfactantes são compostos que possuem diversas propriedades tensoativas e são amplamente utilizados em vários segmentos industriais. Entretanto, a maioria dos surfactantes disponíveis comercialmente é de origem química, sintetizados a partir de derivados do petróleo, representando assim riscos ao meio ambiente. Em consequência disso e das novas legislações de controle do meio ambiente, a busca por novos compostos bioativos tornou-se um alvo para as indústrias. Os biossurfactantes são compostos anfifílicos produzidos por micro- organismos, que contem grupos hidrofóbicos e hidrofílicos, possuem a capacidade de se acumular entre fases dos fluidos imiscíveis, diminuindo a tensão superficial e interfacial, permitindo a formação de um sistema homogêneo. O grande desafio em relação à produção de biossurfactantes no lugar dos surfactantes sintéticos é a redução dos custos do processo de produção. Portanto, a utilização de substratos agroindustriais como matéria-prima nos bioprocessos tem sido relatada com grande ênfase em diversos estudos e pode se tornar uma solução para as indústrias. Dessa maneira, é possível obter um produto de alto valor agregado, a baixos custos de produção, gerando para as empresas maiores lucros e menores impactos ao meio ambiente. A maioria das pesquisas relacionadas à produção de biossurfactantes utilizam bactérias, porém as leveduras também são conhecidas pela produção de biossurfactantes em grande escala quando comparadas a produção por bactérias, assim as leveduras do gênero Candida têm sido estudadas com sucesso na obtenção dessas biomoléculas. O abacaxi é uma das frutas mais populares do mundo, sendo o Brasil um dos maiores produtores. Seu consumo é baseado apenas no suco ou da fruta “in natura”. Os resíduos como, a casca e o talo, são desperdiçados causando um grande acúmulo quando descartados no meio ambiente. O presente estudo teve como objetivo a produção de biossurfactantes por Candida tropicalis a partir de resíduos hidrolisados do abacaxi (Ananas 18 comosus) (casca e talo), com avaliação subsequente do potencial para produção de biossurfactantes e a possibilidade de usá-los como emulsificantes para estabilização de molho tipo francês. 19 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais Produzir biossurfactante com a levedura Candida tropicalis utilizando glicose (padrão) e como resíduo foi utilizado o caldo hidrolisado do processamento do abacaxi (casca e talo) (Ananas comosus). 2.2 Objetivos específicos  Avaliar a influência de diferentes concentrações de glicose, utilizada como padrão, na produção de biossurfactantes e no crescimento da levedura;  Determinar o efeito da hidrólise ácida da casca e do talo do abacaxi, variando-se: - Tempo de aquecimento em autoclave: 15 e 30 minutos; - Concentração de ácido sulfúrico: 2,0%; 2,5%; 5,0%; 7,5% e 10% (v/v).  Avaliar o efeito da desintoxicação dos hidrolisados para a remoção de compostos inibidores da fermentação produzidos durante a hidrólise nos diferentes tempos de autoclavagem;  Determinar os melhores parâmetros para produção de biossurfactante;  Selecionar a melhor condição de cultivo para a produção de biossurfactantes;  Analisar o potencial de aplicação dos biossurfactantes produzidos na estabilidade da emulsão de um molho estilo francês. 20 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Surfactantes Os surfactantes são uma classe importante de compostos químicos utilizados em diversos setores industriais onde atuam como dispersantes ou solubilizantes de compostos orgânicos e apresentam também baixa solubilidade em água. Os surfactantes possuem grande importância comercial devido a evidente tendência do mercado em aumentar sua produção (GOUVEIA et al, 2003). São moléculas anfipáticas com uma parte hidrofílica e outra hidrofóbica, que tendem a se acumular na interface entre fases de diferentes graus de polaridade, tais como óleo/água ou ar/água. A fração apolar geralmente é uma cadeia hidrocarbonada e a porção polar pode ser iónica (catiónica ou aniónica), não iónica ou anfotérica como ilustrado na Figura 1 (SILVA et al, 2014). Figura1 – Organização molecular de um surfactante. Fonte: FELIPE; DIAS, 2016. Os surfactantes possuem a tendência de formar agregados chamados micelas. Essas micelas formam-se, na maioria das vezes, em baixas concentrações de água, sendo uma propriedade intrínseca e característica dos surfactantes. A micelização ocorre devido à diminuição da área de contato entre as cadeias hidrocarbônicas do surfactante e da água (OLIVEIRA, 2014). 21 As estruturas formadas por estes surfactantes dependem da natureza do monômero do surfactante, da natureza do solvente e por possíveis íons vizinhos (PACHECO, 2008). Na Figura 2, mostra outros tipos de formatos das micelas. Figura 2 - Representação esquemática de outras estruturas organizadas de surfactantes. Fonte: PACHECO, 2008. A palavra surfactante é derivada de uma expressão em inglês “surface active agent”, significando agente de atividade superficial. Os surfactantes são considerados tenso-ativos, pois apresentam capacidade de reduzir a tensão superficial e também a tensão interfacial, aumentando assim a solubilidade e mobilidade dos compostos hidrofóbicos (DELEU; PAQUOT, 2004). Devido à presença de surfactantes, a energia requerida para trazer uma molécula até a superfície é menor e a tensão superficial também diminui. Isto acontece devido à característica anfifílica que provoca uma distorção da molécula da água pelo grupo hidrofóbico resultando, assim, em um aumento da energia livre desse sistema. Em consequência, o trabalho necessário para uma molécula surfactante vir à superfície é menor do que para uma molécula de água, por exemplo, (SANTOS et al., 2007). Em um estudo realizado por Sousa, et. al (2014), demonstraram que o biossurfactante produzido por Pseudomonas aeruginosa, a partir de glicerol possui boa atividade superficial, obtendo-se uma tensão superficial mínima de 32,0 mN (SOUSA et al. 2014). A tensão superficial está diretamente ligada às forças de atração e repulsão que existem nas moléculas de um fluido. Para que estas moléculas se 22 mantenham coesas na superfície desse fluido, estas forças exercem uma força de atração intermolecular forte agindo sobre as moléculas mais próximas da superfície, dessa maneira os líquidos tendem a diminuir sua área de superfície (PIRÔLLO et al., 2008). Esta força repulsiva começa a diminuir quando a concentração do surfactante no meio aquoso aumenta, ou seja, a eficácia dos surfactantes é determinada pela sua capacidade em reduzir a tensão superficial medindo-se a energia livre da superfície por unidade de área que será necessária para trazer uma molécula do interior da solução para a superfície, como demonstra a Figura 3 (RUFINO, et al. 2014). Figura 3 – Representação esquemática: (A): Gota de água em superfície hidrofóbica. (B): Gota de água em uma superfície hidrofóbica, contendo moléculas de surfactante. A redução da tensão superficial na gota de água, após a adição do surfactante aumentou a área de contato da água com a superfície hidrofóbica. Fonte: FELIPE; DIAS, 2016. Outro importante parâmetro utilizado frequentemente para avaliação de um surfactante é a concentração micelar crítica (CMC). As moléculas dos surfactantes por terem características anfifílicas apresentam comportamentos distintos ao interagirem com a água, por exemplo, a parte polar (cabeça) atrai as moléculas de água, enquanto a parte apolar (cauda) repele (LAWRENCE, 2000). 23 Há duas possibilidades pelas quais essas interações ocorrem: (1) as moléculas do surfactante estão abaixo da superfície, neste exemplo, essas moléculas podem formar agregados, sendo que a parte polar ficará orientada em direção as moléculas de água e a parte apolar voltada para o solvente. (2) neste exemplo a parte polar da molécula interage com a água, já a porção apolar fica sobre a superfície, podendo estar em contato com o ar ou com outro solvente apolar, neste caso as moléculas do surfactante estão acima da superfície (Figura 4). O fato de essas moléculas estarem na superfície rompe as forças de ligação que existem nessas moléculas, diminuindo assim a energia existente na superfície (tensão superficial) (BORGES, 2007). Figura 4 - Elemento de volume de água de superfície, mostrando a saturação de moléculas de surfactante. Fonte: LAWRENCE, 2000. A concentração micelar critica (CMC), portanto, é a concentração micelar mínima de tenso-ativo necessária para atingir os valores mais baixos de tensão superficial e interfacial, na qual se inicia a formação de agregados chamados de micelas (Gráfico 1). A micelização geralmente resulta na solubilização de óleo e água originando uma emulsão. Após a CMC, as micelas, diferentemente dos monômeros, ficam dispersas em toda a solução não apresentando, portanto, nenhum efeito sobre a tensão superficial da água (SANTOS et. al., 2007). 24 Gráfico 1 – Diagrama da variação de tensão superficial, interfacial e solubilidade do composto orgânico com relação à concentração do tensoativo. Fonte: BUENO, 2008. A determinação do balanço hidrofílico e lipofílico (HLB) tem sido comumente avaliada, descrevendo uma relação entre as partes hidrofílicas e lipofílicas da molécula (BORGES, 2007). Esta relação pode afetar as propriedades físico-químicas das moléculas sendo este valor uma indicação da solubilidade no óleo ou na água da solução (PARKINSON, 1985). Na Tabela 1 estão representados os valores de HLB e suas aplicações. Tabela 1 - Valores de HLB e potencial aplicação. HLB APLICAÇÕES 1-3 Agentes espumantes 3-6 Agentes emulsificantes (emulsão A/O) 7-9 Agentes de molhabilidade 8-18 Agentes emulsificantes (emulsão O/A) 13-16 Detergentes 16-18 Agentes solubilizantes Fonte: MOURA, 2017. 25 Os surfactantes disponíveis no comércio em sua grande maioria são sintetizados a partir de derivados de petróleo (DESAI; BANAT, 1997). Esses surfactantes sintéticos são classificados de acordo com a sua carga iônica, a qual reside na parte polar da molécula. Esta carga iônica pode ser classificada como aniônica ou catiônica não iônica ou anfotérica, já a porção polar geralmente é uma cadeia hidrocarbonada (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Existe grande ênfase para os impactos ambientais gerados pela utilização dos surfactantes químicos; muitos desses surfactantes são tóxicos e não são biodegradados, podendo se acumular e assim provocar efeitos adversos para o ambiente e também à saúde humana. Levando, portanto, em consideração a questão dos recursos ambientais e sua consequente devastação pelo uso exagerado de produtos químicos, dentre eles os surfactantes sintéticos, é importante que haja mais estudos sobre possibilidades menos agressivas ao meio ambiente, por isso a biotecnologia tem estado em constante desenvolvimento tentando otimizar a produção de biossurfactantes (OLIVEIRA, 2014). 3.2 Biossurfactantes e mercado mundial Os surfactantes sintéticos, existem há pouco mais de 100 anos e são usados pela sociedade em grandes quantidades e em diversas áreas. Sendo assim, esses compostos sintéticos têm acompanhado a evolução de vários setores industriais, porém o uso em demasia dessas substâncias trouxe em geral diversos danos ao ambiente. Portanto, diversos estudos para substituição desses produtos visando à diminuição dos danos ao meio ambiente começaram a ser realizados, fazendo que o uso de biossurfactantes se destaque no conceito atual (MARCELINO, 2016). Os biossurfactantes, tenso-ativos produzidos por bactérias, leveduras e fungos, são moléculas que apresentam biodegradabilidade, excelente eficiência em condições extremas de pH, temperatura, força iônica e biocompatibilidade em comparação com surfactantes sintéticos. Podem ser produzidos utilizando substratos renováveis, e uma das maiores vantagens é o fato serem moléculas atóxicas. Devido ao fato de serem produzidos por micro- 26 organismos, estes não derivam do petróleo, portanto, não são dependentes do preço (AQUINO, 2011). As vantagens dos biossurfactantes, em relação aos surfactantes sintéticos, concedem uma gama maior de aplicações industriais, principalmente pelo fato da possibilidade de modificação da estrutura química e das propriedades físicas, o que permite a produção de biossurfactantes para necessidades específicas (NITSCHKE; PASTORE, 2002). A aplicabilidade de biossurfactantes é bem extensa e observada em vários campos: construção, indústrias alimentícias, agricultura, têxtil, farmacêuticas, papel, cosméticos, etc. (REIS et al, 2013). Os biossurfactantes são produzidos principalmente pelo crescimento aeróbio de micro-organismos em meios aquosos, sendo excretados no meio de cultivo durante o crescimento microbiano. Eles auxiliam no transporte e na translocação de substratos insolúveis através da membrana celular (BOGNOLO, 1999). Os biossurfactantes são classificados de acordo com sua natureza bioquímica, com a espécie microbiana produtora e também com a composição química, ou seja, na natureza, as fontes de carbono e nitrogênio são as limitações nutricionais e a temperatura, aeração e pH vão influenciar no tipo de polímero que será produzido (CALVO et al, 2009). Ter controle desses parâmetros é extremamente importante, pois somente assim pode-se potencializar a produção de biossurfactantes (OLIVEIRA, 2014). Em um estudo realizado por Satpute et al. (2010), foram descritos quatro vias potenciais para a produção de biossurfactante (Figura 5). 27 Figura 5 – Principais vias biossintéticas para a produção de biossurfactante (BS) Fonte: SATPUTE et al., 2010. A produção de biossurfactantes tem como desvantagem a dificuldade em encontrar um resíduo com composição adequada de nutrientes que irá permitir o crescimento celular e o acúmulo do produto de interesse. Assim se faz necessária uma adequação na padronização do processo biotecnológico e, em consequência disso, há um rendimento menor na produção, necessidade de grande investimento de capital, equipamentos adequados para padronização do processo, etc. (CALVO et al., 2009). Em relação ao mercado mundial de biossurfactantes, a produção em alta escala vem sendo implementada. Em 2013, um total de 300 toneladas foram produzidas de acordo com a Transparency Market Research, em Nova York (MARQUES, 2017). A estimativa é que no ano de 2018 essa produção tenha atingido mais de 400 toneladas de biossurfactantes, crescendo com uma taxa anual de 4,3%. O Brasil vem se destacando entre os países latino-americanos, em relação à produção e patentes de biossurfactantes, sendo o Brasil também detentor da 28 única planta piloto construídos exclusivamente para a produção de biossurfactante (BRUMANO, 2016). A maior parte dos estudos para produção de biossurfactantes é sobre o uso de bactérias, sendo poucos sobre a produção por leveduras. As leveduras são conhecidas pela produção em grande escala, se comparada com as bactérias. Destas, o gênero Candida tem sido o mais estudado e empregado com sucesso na produção de biossurfactantes (ACCORSINI, 2010). 3.3 Classificação dos biossurfactantes e micro-organismos produtores Segundo Darvishi e colaboradores (2011), os biossurfactantes são agrupados levando em consideração a sua composição química e sua origem microbiana. As classes principais são: glicolipídios, lipopeptídeos e lipoproteínas, fosfolipídeos e ácidos graxos, surfactantes poliméricos e surfactantes particulados. Os biossurfactantes do tipo glicolipídios possuem em sua estrutura carboidratos (glicose, galactose, manose ou ramnose) e são combinados com ácidos graxos de cadeia longa (FELIX, 2012). Os lipopeptídeos e lipoproteínas são compostos por peptídeos ou proteínas ligados a ácidos graxos, os aminoácidos estão ligados em forma cíclica e a porção proteica é aniônica ou neutra (BARROS et al, 2005). Os biossurfactantes do tipo fosfolipídio são encontrados em todos os micro-organismos, havendo poucos exemplos de produção extracelular esta classe de biossurfactante é produzida por leveduras ou bactérias que utilizam alcanos como fontes de carbono e energia para o crescimento (SILVA et al, 2014). Em relação aos biossurfactantes poliméricos ou lipopolissacarídeos, são caracterizados por ácidos graxos e polissacarídeos ligados covalentemente. Por exemplo, o emulsan (Figura 6), no qual ácidos graxos estão ligados a um esqueleto heteropolissacarídico, ou o liposan de C. lipolytica, constituído por carboidratos e proteínas (NITSCHKE; PASTORE, 2002). 29 Figura 6 - Estrutura química do emulsan. Fonte: NITSCHKE; PASTORE, 2002. Os biossurfactantes particulados são vesículas extracelulares produzidas por algumas bactérias, apresentando elevada atividade tensoativa e transportando alcanos para o interior da célula (FELIX, 2012). Em um estudo realizado na Índia em 2007, Joshi e colaboradores produziram biossurfactantes com a bactéria Bacillus subtilis 20B que foi isolada de alimentos fermentados e posteriormente foi analisada a sua utilização em recuperação de óleos, obtendo bons resultados. Em outro estudo, Fox e Bala (2000) obtiveram níveis elevados no rendimento de produção de biossurfactante pela mesma bactéria a partir de um meio rico em amido. Damião (2012) estudou a produção de biossurfactantes por Pseudomonas aeruginosa em meio salino mineral utilizando como fonte de carbono a glicerina comercial e a glicerina bruta a 2%, e os resultados mostraram que no meio salina mineral com glicerina bruta houve uma produção de 2,87 g/L, já utilizando a fonte de carbono glicerina comercial a linhagem produziu 2,47 g/L, mostrando assim a viabilidade do uso da glicerina para a produção de biossurfactantes. Em um estudo realizado por Vera (2017), foi analisada a produção de biossurfactantes por Lactococcus lactis CECT-4434 a partir de resíduos agroindustriais, tais como o soro de leite e vinhaça de uva e foram suplementados com sacarose e extrato de levedura, os resultados mostraram que na concentração de 15% de soro de leite o emulsificante produzido reduziu a tensão superficial em 18,1 mN/m, alcançando uma produção máxima de biossurfactante equivalente em surfactina de 11,02mg/L. 30 Antunes (2010) analisou a produção de biossurfactantes por Chromobacterium violaceum em meios alternativos e de baixo custo realizando um planejamento fatorial para analisar o melhor resultado quanto à produção de biossurfactante e a melhor redução da tensão superficial, sendo o melhor resultado no ensaio que continha 8% de milhocina, 1% de lactose e 7,5% de óleo de milho pós-fritura no tempo de 72 horas de fermentação, diminuindo a tensão superficial da água de 71 para 29 mN/m. Ehrhardt (2015) produziu biossurfactante por Bacillus subtilis utilizando como substrato os resíduos do processamento do abacaxi. Neste estudo, foram realizadas fermentações com três diferentes concentrações de glicose (1%, 3% e 5%). Posteriormente, essas concentrações foram enriquecidas com glicerol comercial (3%, 5% e 10%). Os melhores resultados foram com 5% de glicose e sem adição de glicerol, com redução da tensão superficial em 25% e índices de emulsão de 67%. Na Tabela 2, podem-se observar os biossurfactantes e seus respectivos micro-organismos produtores. 31 Tabela 2 - Biossurfactantes e micro-organismos produtores. Biossurfactantes Micro-organismos Glicolipídeos Rhamnolipídeos Pseudomonas aeruginsa Pseudomonas sp. Trealolipídeos Rhodococcus erythropolis Nocardia erythropolis Mycobacterium sp. Lipídeos sulforosos Torulopsis bombicola T. apícola T. petrophilum Celobiolipídeos Ustilago zeae U. maydis Lipopeptídeos e lipoproteínas Peptídeo-lipídeo Bacillus licheniformis Viscosina P. fluorescens Surfactina B. subtilis Subtilisina B. subtilis Gramicidina B. brevis Polimixina B. polymyxa Ácidos graxos, lipídeos neutros e fosfolipídeos Ácidos graxos Corynebacterium lepus Lipídeo neutro Nocardia erythropolis Fosfolipídeos Thiobacillus thiooxidans Biossurfactantes poliméricos Emulsan Acinetobacter calcoaceticus Biodispersan A. calcoaceticus Proteína-manana-lipídeo Candida tropicalis Liposan C. lipolytica Carboidrato-proteína-lipídeo P. fluorescens Protéina PA P. aeruginosa Fonte: DESAI; BANAT, 1997. 32 3.4 Produção de biossurfactantes por leveduras As leveduras produzem emulsificantes extracelulares quando crescem em substratos imiscíveis em água, facilitando seu consumo; elas também produzem biossurfactantes em alta concentração (FONTES, et al, 2008). Em 2000, Ijah isolou 20 bactérias de um solo poluído devido ao derramamento de óleo e lixo na Nigéria e 10 leveduras isoladas de um solo não poluído nos campos da Universidade de Calabar (Nigéria), a levedura Candida tropicalis apresentou uma maior eficiência ao atuar como biossurfactante se comparado a outras duas bactérias Serratia marcenscens e Acinetobacter calcoaceticus. Em um estudo também utilizando leveduras, Aragão e colaboradores (2007) utilizaram as espécies Pichia membranaefaciens e Pichia anômala obtendo a produção de biossurfactantes em um meio mineral contendo glicerol. Felse e colaboradores (2007) estudaram a produção de soforolipídeos por Candida bombicola, quando cultivada em ácidos graxos residuais, obtendo uma concentração de 120 g/L em um sistema operado por batelada alimentada. Em um estudo realizado por Sarubbo e Farias (2007), foram aperfeiçoadas as condições de produção do biossurfactante por Candida lipolytica em meio que continha óleo de canola e glicose. O biossurfactante reduziu a tensão superficial de 72 mN/m para valores em torno de 30 mN/m. A produção de biossurfactante por Candida sphaerica foi estudada por Luna e colaboradores (2008), onde se utilizou um planejamento fatorial avaliando a influência dos componentes do meio, os quais eram: milhocina, resíduo de refinaria de óleo vegetal e água do mar para redução da tensão superficial, obtendo resultados melhores no ponto central do planejamento (meio contendo 4% do resíduo, 4% de milhocina e 50% de água do mar). 3.4.1 Candida tropicalis Leveduras do gênero Candida são classificadas como um grupo de fungos com a forma leveduriformes encontrados em diversos ecossistemas, 33 que apresentam células ovaladas ou alongadas, com o comprimento de 3 a 14 µm e de 3 a 7µm de largura, com micélio em forma de pseudo-hifas ou também como hifas verdadeiras. Suas colônias são úmidas, cremosas, aspecto liso ou rugoso e coloração branco-amarelada (BARROS, 2005). A levedura Candida tropicalis é diploide asporogenica, sendo capaz de consumir diferentes substratos como, por exemplo, dissacarídeos, fenóis, alcanos e ácidos, obtendo sempre altos rendimentos de biomassa. É considerada também uma levedura termotolerante (JAMAI et al, 2001). Diversos estudos têm sido relatados sobre o uso dessa levedura para produção de biossurfactantes, obtendo na maioria deles bons resultados e um alto rendimento (LUNA et al. 2008). Almeida e colaboradores (2014) estudaram a produção de biossurfactante por Candida tropicalis usando um planejamento experimental a partir de resíduos industriais, sendo eles, melaço, milhocina e óleo de canola residual. Neste estudo, obteve-se um melhor resultado na condição contendo 2,5% de melaço, 2,5% de milhocina e 2,5% de óleo de canola residual, sob agitação de 250 rpm, tendo diminuído a tensão superficial do meio para 29,52 mN/m. Sarubbo et. al (2016) realizaram a produção de biossurfactantes por Candida tropicalis e sua aplicação para remoção de metais pesados. Os meios utilizados foram melaço, óleo de fritura e milhocina e os resultados em biorreator mostraram que a tensão superficial ficou em torno de 31mN/m com um rendimento de 27 g/L. Este biossurfactante produzido removeu 80% de Zn, 70% de Cu e 15% de Pb. Em um estudo para a produção de biossurfactantes utilizando Candida tropicalis isoladas de mangue, Ribeaux (2016) obteve resultados que demonstraram que esta linhagem possui a capacidade em converter resíduos agroindustriais (soro de leite, manipueira e óleo de soja pós-frituras) em biossurfactante. A pesquisa foi realizada utilizando planejamento fatorial, sendo que o melhor resultado foi o meio basal (3% de soro de leite, 7% de manipueira e 10% de oléo de soja pós-frituras), observando-se uma redução na tensão superficial da água de 72 para 30,8 mN/m, tendo um cultivo de 96 horas e 150 rpm. 34 3.5 Substratos O aspecto econômico é geralmente o primeiro parâmetro a ser avaliado nos processos biotecnológicos. Assim, o sucesso da produção depende exclusivamente do desenvolvimento e planejamento de processos mais baratos utilizando, portanto, substratos renováveis e de baixo custo (DAMIÃO, 2012). Devido a crescente necessidade de se ter planejamentos mais desenvolvidos, por conta principalmente da exigente competitividade do mercado global, as indústrias passaram a utilizar toda e qualquer matéria-prima para o melhoramento de bens de consumo que tragam em curto prazo produtos melhores e com o custo de produção menor (MORAIS, 2012). Além de agregar valor aos subprodutos em relação as tradicionais sinteses químicas as vantagens dos biossurfactantes são: pH do meio de cultivo ou reacional proximo da neutralidade dependendo do micro-organismo utilizado, utilização de condições brandas de processo, já que são utilizados micro-organismos e estes crescem na temperatura ambiente, acarretando um menor gasto energético, baixa carga de resíduos gerados durante o processo, além da toxicidade ser mínima ou nenhuma, regioespecificidade e estereosseletividade das reações nos processos biocatalíticos produzindo compostos enantiomericamente puros, e, por último, a possibilidade de realizar processos em meio sólido (COMASSETO, 2010). Há uma grande dificuldade na seleção de um resíduo que contenha a composição adequada de nutrientes que permitirá o crescimento microbiano e o acúmulo do produto de interesse, porém, em geral os resíduos de origem agroindustrial que contenham altos níveis de carboidratos ou de lipídeos superam essa necessidade de fonte de carbono para a produção de biossurfactantes (ANTUNES, 2010). 3.5.1 Abacaxi É uma fruta tropical e está entre as mais populares do mundo. No Brasil é a terceira fruta mais produzida, como pode ser observado na Tabela 3. 35 Tabela 3 - Principais frutas produzidas no Brasil. Fruta Área (há) Produção (ton) Valor %Produção % Valor Laranja 667.529 15.983.273 4.397.201 40,5 20,5 Banana 474.054 6.962.134 4.155.030 17,6 19,3 Abacaxi 68.618 3.417.729 1.623.963 8,7 7,6 Uva 77.119 984.493 1.327.722 2,5 6,2 Maça 34.399 1.064.708 803.988 2,7 3,7 Demais 1.256.929 11.087.158 9.174.163 2,81 42,7 Total 2.578.648 39.499.495 21.482.067 100,0 100,0 Fonte: IBGE/LSPA, 2016. O abacaxi é um pseudofruto pertencente a família Bromeliaceae, da qual a espécie mais conhecida é a Ananas comosus sendo este o único cultivado extensivamente como fonte de alimento. O fruto, normalmente cilindrico ou ligeralmente cônico, é constituído por 100 a 200 pequenas bagas ou frutilhos que são fundidos entre si sobre o eixo central (EMBRAPA, 2000). A sua composição química varia muito de acordo com a época do ano. Geralmente a sua produção inicia-se no verão e produz frutos com um maior conteúdo de açúcares utilizados na maioria das vezes na forma de suco. Existem diversos estudos mencionando a diversidade de vitaminas e minerais contidas no abacaxi, o que aumenta o interesse em seu consumo. Diante disso, há uma geração de resíduos muito grande (casca e talo), contabilizando cerca de 50% do peso total do abacaxi (EHRHARDT, 2015). Na prensagem do fruto para obtenção do suco, 15 a 25% resultam na torta que é composta de casca e talo. Esse resíduo é rico em fibras e um razoável conteúdo proteico, além de uma quantidade alta de carboidratos que são encontrados no talo (ROGÉRIO et al, 2007). Na Figura 7 pode-se observar o fluxograma da produção de suco de abacaxi. 36 Figura 7 – Fluxograma do processamento do abacaxi para obtenção do suco. Fonte: AGEITEC, 2018. Em um estudo realizado por Ehrhardt (2015), se obteve bons resultados ao produzir biossurfactante por Bacillus subtilis usando como substrato os resíduos do processamento do abacaxi, reduzindo-se a tensão superficial em 20% e os índices de emulsificação atingiram valores de 53% tanto para o óleo de soja como para o óleo de motor. 3.6 Aplicações dos biossurfactantes Atualmente, há um potencial muito grande para a aplicação de biossurfactantes nas indústrias devido à existência de muitas propriedades, tais Pesagem Lavagem Seleção Prensagem do fruto Estocagem Acondicionamento Desinfecção Preservação Formulação Torta (talo + casca) = 25% 37 como: emulsificação, separação, umedecimento, solubilização, inibição de corrosão, redução de viscosidade de líquidos e redução da tensão superficial. Essas propriedades são aplicadas nos mais diversos campos industriais, sendo esses campos: agrícolas, indústrias alimentícias, de bebidas, de papel, metal, têxtil, farmacêuticas e de cosméticos (ROCHA, 2017). Na recuperação melhorada do petróleo utiliza-se um biossurfactante, pois os óleos que possuem frações mais pesadas se sedimentam no fundo do reservatório, sendo muito difícil sua aspiração por meio de bombas. Portanto, a lavagem requer o uso de solventes e limpeza manual. Esses métodos se baseiam na formação de emulsões concentradas de óleo em água através de agentes de superfície, com posterior bombeamento da emulsão formada. Em seguida, é feita a quebra da emulsão e recolhimento do óleo. Para este fim, o biossurfactantante mais utilizado é o derivado da bactéria Acinotecbater calcoaceticus, denominado “emulsan”, cuja estrutura contem um ácido graxo e uma cadeia proteica ligada a um polissacarídeo (BOGNOLO, 1999). O uso de biossurfactantes na biorremediação também vem sendo destaque desde o ano 2000. Por exemplo, na Alemanha a empresa Biodetox possui um processo de descontaminação de solos, lamas industriais e águas residuais. O procedimento envolve o transporte de material contaminado para “biopilhas”, onde receberá tratamento através de um produto comercial contendo bactérias, nutrientes e biossurfactantes, que promovem a degradação e limpeza do material (BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000). Existem vários estudos para remediação de solos contaminados com metais pesados, seja pela complexação das formas livres do metal em solução aquosa, promovendo a adsorção do metal ao biossurfactante, ou pelo acúmulo de biossurfactantes na interface sólido/líquido, sob condições de tensão interfacial reduzida, permitindo, assim seu contato com o metal adsorvido. Como exemplo, no trabalho realizado por NEILSON et al. (2003), foi analisada a atividade de ramnolipidíos na remoção de metais pesados, como Ni e Cd do solo, com eficiência de 80-100% em laboratório e 20-80% no solo. Em relação a aplicações terapêuticas, um dos mais conhecidos biossurfactantes, a surfactina possui várias aplicações farmacêuticas, como a inibição da formação de coágulos, formação de canais iônicos em membranas, atividade antibacteriana e antifúngica, atividade antiviral e antitumoral, 38 produzido por Rhodococcus erythropolis, o biossurfactante inibiu o vírus da herpes simples e vírus parainfluenza (NITSCHKE ; PASTORE, 2002). Na agricultura, os biossurfactantes são utilizados principalmente em formulações de herbicidas e pesticidas. Os compostos ativos dessas formulações são geralmente hidrofóbicos, sendo, portanto, necessário agentes emulsificantes para dispersá-los em soluções aquosas. Os surfactantes produzidos por Bacillus foram utilizados para emulsionar a formulação de pesticidas organofosforados imiscíveis (BARROS, et al. 2005). Mnif et al, (2015), em seu estudo demonstraram, que a surfactina possui propriedades antifúngicas, podendo, dessa maneira, ser utilizada como fungicida natural para o combate de fungos que infestam diversas plantações. Os biossurfactantes possuem compatibilidade com a pele, portanto, eles podem ser usados em produtos de higiene e cosméticos. Desde o ano de 2002, existe no mercado um produto que contêm 1 mol de soforolipídios e 12 moles de propilenoglicol, o qual apresentou excelente compatibilidade dérmica, sendo utilizado em hidratantes faciais (NITSCHKE ; PASTORE, 2002). Alguns soforolipídios são utilizados como umectantes para incorporação em produtos de maquiagem. A KAO Co. Ltda. desenvolveu um processo fermentativo para produção de soforolipídios, que posteriormente sofrem esterificação, resultando em um produto com aplicação em batons e como hidratante para pele e cabelos (BARROS et al., 2007). A emulsificação tem um papel muito importante nas indústrias de alimentos na formação da consistência e textura, assim como na dispersão de fases e na solubilização de aromas. Os biossurfactantes são utilizados como emulsificante no processamento de matérias-primas, na panificação e em produtos derivados de carne, influenciando nas propriedades reológicas da farinha de trigo e a emulsificação de gorduras (AQUINO, 2011) Alguns biossurfactantes produzidos por micro-organismos, tais como os de Candida utilis, têm sido muito utilizados em molhos prontos para saladas (NITSCHKE, PASTORE, 2002). Silva et al (2016), analisaram a capacidade emulsificante em um preparado alimentício óleo/água (molho grego) utilizando um biossurfactante produzido por Yarrowia lipolytica, obtendo bons resultados para a capacidade emulsificante. Os biossurfactantes também são utilizados em laticínios retardando a colonização de Streptococcus thermophilus, que causa o 39 cheiro ou gosto ruim durante a pasteurização (BOGNOLO, 1999). Os biossurfactantes também podem ser utilizados nas indústrias de papel, têxtil e cerâmica, por exemplo, o biodispersan é um produto usado na indústria de tintas, pois gera maior espalhabilidade e aumenta as propriedades de mistura. As propriedades de estabilização de espumas são necessárias na fabricação de extintores de incêndio (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Na Tabela 4, há um resumo das aplicações e funções de alguns biossurfactantes. Tabela 4 - Funções e aplicações de alguns biossurfactantes. Função do Biossurfactante Aplicações Recuperação de óleo residual, Redução da viscosidade de óleo Petrolífera Bactericida, antifúngico e antiviral Farmacêutica Limpeza Alimentícia, petrolífera, cosmética e química Solubilização Alimentícia, cosmética farmacêutica e têxtil Emulsificante Alimentícia, cosmética petrolífera, plástico, curtumes e biorremediação Detergente, formadores de espuma Curtumes, química e metalúrgica Agente umectante Têxtil, metalúrgica e cosmética Lubrificante Têxtil e metalúrgica Agentes permeabilizadores Farmacêutica, têxtil e química Estabilizantes Têxtil e alimentícia Agente dispersante Papel e petrolífera Sequestrante de metais Biorremediação e tratamento de resíduos Removedor de ceras de frutas e vegetais Alimentícia Ligação do asfalto à areia e cascalho Construção civil Fonte: SINGH et al, 2007. 40 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Matéria-prima Os substratos utilizados foram os resíduos do abacaxi (Ananas comosus) coletados em barracas de venda de frutas e sucos localizados no mercado municipal de São José do Rio Preto – SP. 4.2 Preparo da matéria-prima Os resíduos do abacaxi (casca e talo) foram cortados manualmente com auxílio de um facão inox em pedaços menores que 3 cm, distribuídos em bandejas de inox e expostos ao sol, durante aproximadamente 24 h ou até que ficassem duros e quebradiços. As amostras secas foram moídas em um moedor de facas e peneiradas até 14 mash, acondicionadas em frascos de vidro e armazenadas à temperatura ambiente. 4.3 Pré-tratamento da biomassa Para o preparo da hidrólise das amostras de biomassa, o pré-tratamento foi realizado de acordo com o método proposto por Monsalve, Perez e Colorado (2006), com algumas modificações, adicionando 100 ml de ácido sulfúrico nas concentrações de 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0%, respectivamente, para cada 10 g de amostra seca e moída, com subsequente aquecimento em autoclave a 121ºC durante 15 e 30 min. 4.4 Desintoxicação do hidrolisado O processo de desintoxicação foi realizado de acordo com Mussato e Roberto (2004), com algumas modificações. Primeiramente, foram adicionados 2,5% de carvão ativado ao hidrolisado, e a mistura foi submetida à agitação de 200 rpm, a 30ºC, por 1 h. A mistura foi centrifugada (3000g, 20 min.) e filtrada. 41 Posteriormente, no sobrenadante filtrado, foram realizadas análises de açúcares totais, açúcares redutores e compostos fenólicos, conforme descrito nos itens 4.10.7, 4.10.8, 4.10.9, respectivamente. 4.5 Micro-organismo O micro-organismo utilizado foi a levedura Candida tropicalis, adquirida da Coleção de Culturas Tropical (CCT) da Fundação André Tosello – Pesquisa e Tecnologia de Campinas, Estado de São Paulo. 4.6 Meio de manutenção A levedura foi crescida em estufa a 30º C por 24 h no meio de manutenção descrito na Tabela 5, e depois mantida em refrigeração a 4º C. Todo mês foi realizado repique da levedura para manter a viabilidade. Tabela 5 – Meio de manutenção utilizado para a levedura Candida tropicalis. Composto Concentração (g. ) Glicose 10,0 Extrato de levedura 3,0 Extrato de malte 3,0 Peptona de carne 5,0 Ágar 20,0 4.7 Preparo do pré-inóculo para ativação da levedura O inóculo foi preparado pela transferência de uma amostra de Candida tropicalis, crescida previamente por 24 horas como descrito no item 4.6 para frascos de Erlenmeyer (250 ml) contendo 150 ml do meio de manutenção descrito na Tabela 5 sem adição do Ágar, obtendo-se assim um caldo. Este Erlenmeyer foi incubado em estufa a 30ºC por 24 h com agitação de 200 rpm. Após foi centrifugado a 7000 g por 15 minutos. A Figura 8 mostra o “pellet” formado no fundo do tubo da centrifuga. 42 Figura 8 - Preparação do pré-inóculo para fermentação. Fonte: Próprio autor. 4.8 Padronização do inóculo A padronização do inóculo foi realizada a partir do sedimento (Figura 9). Esse “pellet” foi ressuspendido em água destilada estéril de forma a se obter uma suspensão celular com absorbância de 0,6 em um comprimento de onda de 600nm. Primeiramente foram colocados em uma cubeta de espectrofotômetro 3 ml de água destilada (branco), depois nessa mesma cubeta gotejou-se a suspensão da levedura até atingir a absorbância 0,6. Por meio de uma regra de três foi determinada a quantidade de inóculo a ser adicionada em cada erlenmeyer contendo o meio de cultura para fermentação. Cálculo: 3 ml------- Equação 1 Onde: X: volume utilizado de suspensão da levedura A: volume final de meio de fermentação B: volume de suspensão de levedura utilizada para a fermentação 3 ml--------X A------------B 43 4.9 Preparo do meio de fermentação Para a produção de biossurfactante, foram utilizados os meios de fermentação especificados a seguir: 4.9.1 Meio Padrão O meio padrão foi semelhante ao definido por Rodríguez e Callieri (1986), com algumas modificações, conforme especificado na Tabela 6. Tabela 6 – Meio Padrão utilizado para compor o meio de produção. Composto Concentração (g. ) Extrato de levedura 5,0 KH2PO4 1,0 (NH4)2SO4 1,0 MgSO4.7H2O 1,0 4.9.2 Meio de Produção Para os ensaios, utilizaram-se as concentrações de glicose e água destilada 1, 2, 3, 4 e 5% somando 75 mL e esterelizou-se, depois adicionou-se 75 mL do meio padrão já esterelizado e com a quantidade padronizada de inóculo descrita no item 4.8, somando no total 150 mL. O mesmo foi realizado com os hidrolisados da casca e do talo do abacaxi. Calculou-se a concentração inicial de açúcares nos hidrolisados de casca e talo, obtendo assim o valor inicial de açúcares de cada concentração e adicionou-se a água destilada para obter 75 mL no final e consequente esterelização, após foi adicionado os 75 mL do meio padrão já esterilizado e com a quantidade de inóculo padronizado. 4.9.3 Fermentação Após a preparação do meio de produção descrito no item 4.9.2, os frascos contendo no total 150 ml de cada concentração (75 ml do meio padrão + 75 ml de cada concentração) para os substratos (glicose, casca e talo do abacaxi), foram incubados, separadamente, a 30ºC e 200 rpm e foi avaliada a 44 produção de biossurfactantes nos intervalos de fermentação de 2h, 4h, 6h, 8h, 10h e 12 horas. 4.10 Métodos analíticos 4.10.1 Determinação do pH O pH foi determinado ao final de cada tempo de fermentação e foi analisado diretamente no caldo fermentado utilizando o potenciômetro pHmetro Digmed modelo DM20. 4.10.2 Determinação do crescimento microbiano A determinação do crescimento microbiano foi determinada por meio das medidas de absorbância no espectrofotômetro Biochrom, modelo Libra S22. Para isto, as células contidas nos hidrolisados fermentados foram separadas como descrito no item 4.8 e quantificadas com a curva de padrão construída para determinar a quantidade de crescimento da levedura (4.10.5). Os testes foram realizados em triplicata. 4.10.3 Determinação da presença de biossurfactante Após cada tempo de fermentação (2h, 4h, 6h, 8h, 10h e 12h), os caldos fermentados foram centrifugados (centrífuga – Jouan, modelo GR2022) a 7000g por 20 minutos a 4ºC para separação de células do sobrenadante. Neste foi realizada a determinação de biossurfactante pelas seguintes análises: índice de emulsificação, atividade emulsificante, tensão superficial, concentração micelar crítica (CMC). O índice de emulsificação foi determinando por meio da adição de 2 ml de óleo de soja em tubos de ensaio 100 X 15 mm contendo 3,5 ml do caldo fermentado livre de células obtido após a centrifugação. Os tubos foram submetidos a agitação por meio de vortex durante 2 minutos. Posteriormente foi realizada a leitura nos tempos de 10 minutos (t0), 24, 48, 72 e 96 horas (t1, t2,t3 e t4). O índice de emulsificação foi calculado segundo Iqbal e colaboradores (1995): 45 IE= (altura da camada de emulsão (mm)/ altura total da coluna (mm)) X 100. A atividade emulsificante foi determinada pela mistura de 2 ml de óleo de soja com 3,5 ml do caldo de fermentação livre de células, submetidos a agitação máxima em agitador de tubos por 2 minutos. Posteriormente, foi realizada a leitura em espectrofotômetro (Biochrom, modelo Libra S22), no comprimento de onda de 620 nm. O branco era o caldo de fermentação livre de células. A atividade emulsificante foi calculada pela equação: AE: (absorbância da amostra – absorbância do branco) X diluição A determinação da tensão superficial foi realizada em um tensiômetro Leconde Du Nouy, na temperatura de 25ºC, utilizando um volume de 10 ml do caldo de fermentação livre de células. Para a determinação da concentração micelar crítica, foram realizadas diluições do caldo de fermentação livre de células em água destilada até alcançar a concentração micelar crítica (CMC), na qual o biossurfactante começa a se agregar e não é mais observada a redução significativa da tensão superficial. A determinação da CMC foi representada por um gráfico da tensão superficial versus concentração do biossurfactante no ponto de inflexão da curva. 4.10.4 Separação do biossurfactante O sobrenadante livre de células foi colocado em frascos previamente pesados, e o biossurfactante foi separado por precipitação com etanol absoluto (1:3 v/v), em seguida foi mantido em repouso por um dia em uma temperatura de 4 ºC. Após esse procedimento, ele foi seco em estufa a 45°C até peso constante. O biossurfactante obtido foi expresso em g/L. 4.10.5 Construção da curva padrão para determinação da massa celular seca Um volume de 400 ml obtido após o processo de pré-fermentação foi centrifugado conforme o item 4.8 e o sobrenadante foi descartado. Posteriormente, as células foram lavadas com a mesma quantidade de água destilada e novamente foi realizada a centrifugação nas mesmas condições. O 46 sobrenadante foi descartado novamente e a massa celular úmida foi suspensa em 200 mL de água destilada e em seguida foram realizadas diferentes diluições, para medição da densidade ótica destas em espectrofotômetro (Biochrom, modelo Libra S22) no comprimento de onda de 600nm. Os cadinhos de porcelana foram previamente secos em mufla a 550ºC por 2 horas e pesados em balança analítica. Posteriormente foram adicionados 50 mL das diluições preparadas anteriormente e colocadas para secagem em estufa a 55ºC até peso constante. A massa celular seca foi determinada por meio da subtração do peso dos cadinhos com células e do peso destes limpos e secos, dividido pelo volume adicionado (50 mL). A massa celular seca foi expressa em g/L. Foi construída uma curva padrão relacionando a absorbância com a massa celular em g/L. 4.10.6 Potencial para estabilizar emulsões de molho estilo Francês Foram realizados ensaios para determinar o potencial de aplicação do biossurfactante produzido para estabilizar emulsões de molhos para salada estilo francês. As leituras do índice de emulsificação (E24) foram realizadas em misturas de vinagre (4mL), Ketchup industrial (2 mL), óleo de soja (4mL) e sal (1gr) com a concentração do biossurfactante variando de 0 a 10 mL; estas foram homogeneizadas e posteriormente realizadas leituras em 10 minutos e 24 horas. O índice de emulsificação foi calculado com a porcentagem da altura da camada emulsificada (cm) dividida pela altura total do líquido (cm). As análises foram realizadas em períodos pré-determinados de 15 em 15 dias durante o tempo de 4 meses, imitando a vida de prateleira do produto. Todas as análises foram realizados em triplicata. O molho francês usado como exemplo é mostrado na Figura 9. 47 Figura 9: Molho tipo francês comercializado e lista de ingredientes. Fonte: www.junior.com.br 4.10.7 Determinação de açúcares totais Os açúcares totais foram determinados pelo método fenol-sulfúrico, descrito por Dubois et al. (1956). Foram realizadas leituras de absorbância no comprimento de onda de 490 nm, e a quantificação foi determinada por curva padrão de glicose em diferentes concentrações. 4.10.8 Determinação de açúcares redutores Os açúcares redutores foram determinados de acordo com o método do cuproarsenato descrito por Nelson (1944) e Somogyi (1952). Foram realizadas leituras de absorbância no comprimento de onda de 540 nm, e a quantificação foi determinada por curva padrão de glicose utilizando diferentes concentrações. 4.10.9 Determinação do teor de compostos fenólicos A concentração de fenóis totais foi determinada pelo método de Folin- Ciocalteau modificado por Chaovanalikit e Wrolstad (2004). Uma amostra de 0,5 mL de hidrolisado foi misturada com 0,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu e 7,5 mL de água destilada. A mistura foi deixada em repouso por 10 min, à temperatura ambiente. Depois foram adicionados 1,5 mL de carbonato de sódio (20%). As amostras foram colocadas em banho Maria por 20 min, E posteriormente realizaram-se as leituras de absorbância no comprimento de onda de 755 nm. 48 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Padronização da hidrólise da casca e do talo do abacaxi Testes foram realizados a fim de se comparar o desempenho da utilização de diferentes concentrações de ácido sulfúrico para a hidrólise da casca e do talo do abacaxi em diferentes tempos de aquecimento com a finalidade de selecionar as melhores condições de produção. Portanto a hidrólise foi realizada nas concentrações de H2SO4 (2; 2,5; 5,0; 7,5 e 10) e nos tempos de aquecimento em autoclave de 15 e 30 minutos. Essas análises foram realizadas para determinar qual concentração de ácido libera mais açúcares fermentescíveis que serão utilizados pela levedura para consequente fermentação. O uso de ácido mais concentrado rompe com mais facilidade de lignina e hemicelulose contida na casca e no talo do abacaxi, porém resulta na formação de grande quantidade de compostos tóxicos que podem prejudicar a fermentação, portanto o uso da hidrólise ácida deve ser feita levando em consideração todos esses aspectos (PEREIRA, MENDES, SEOLATTO, 2013). A hidrólise foi padronizada com ácido sulfúrico na concentração de 2,5% (v/v), com aquecimento de 15 minutos na autoclave. Esta escolha foi feita de acordo com os resultados de açúcares (totais e redutores) e compostos fenólicos. Os resultados das análises de açúcar total para a casca e o talo de abacaxi nos tempos de aquecimento 15 e 30 minutos podem ser observado no Gráfico 2. 49 Gráfico 2 - Concentrações de açucares totais em g/L liberados por hidrólise ácida com 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0% de H2SO4, com aquecimento 15 e 30 min em autoclave. No Gráfico 2 observa-se que em relação à casca houve uma queda muito acentuada no valor de açúcares totais na concentração de 2,5% no tempo de 30 minutos, portanto a escolha foi no tempo de 15 minutos. Em relação à concentração a melhor neste caso seria a de 5 %, pois ela apresentou o melhor resultado no tempo 15 minutos, porém se pensar em uma indústria fica muito mais viável se utilizar concentrações menores por isso à concentração de 2,5% foi escolhida, já que a diferença dos valores não compensaria o gasto com o ácido. Em relação ao talo do abacaxi houve também uma diferença nas quantidades de açúcares totais, sendo que no tempo de 15 minutos e na concentração de 2,5% se obteve a maior concentração de açúcares totais, logo se escolheu esses valores para a padronização da hidrólise. Os resultados obtidos para açúcares redutores e compostos fenólicos podem ser observados nos Gráficos 3 e 4 respectivamente. 0 20 40 60 80 100 2 2,5 5 7,5 10 A ç ú c a re s t o ta is e m g /L Concentração de H2SO4 ( %) Casca 15 min Casca 30 min Talo 15 min Talo 30 min 50 Gráfico 3- Concentrações de açúcares redutores em g/L liberados por hidrólise ácida com 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0% de H2SO4, com aquecimento 15 e 30 min em autoclave. Gráfico 4 - Concentrações de compostos fenólicos em g/L liberados por hidrólise ácida com 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0% de H2SO4, com aquecimento 15 e 30 min em autoclave. No Gráfico 3 observa-se que na concentração de 2% e 30 minutos de aquecimento para o talo do abacaxi obteve-se o melhor resultado para açúcares redutores, porém a diferença para 15 minutos de aquecimento é muito pequena e sabendo-se que quanto menor o aquecimento menor é a liberação de compostos fenólicos escolheu-se 15 minutos de aquecimento, 0 50 100 150 200 250 300 2 2,5 5 7,5 10 A ç ú c a re s r e d u to re s e m g /L Concentração de H2SO4 (%) Talo 30 min Talo 15 min Casca 30 min Casca 15 min 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 2 2,5 5 7,5 10 C o m p o s to s f e n ó li c o s e m g /L Concentração de H2SO4 (%) Casca 15 min Casca 30 min Talo 15 min Talo 30 min 51 quanto a concentração percebe-se que para 2% de ácido houve uma liberação maior dos açúcares redutores, mas para obter uma padronização exata para todas as análises foi escolhida a concentração 2,5% assim como nas outras análises realizadas. O aquecimento escolhido para a casca foi o de 15 minutos, uma vez que não houve muita diferença no conteúdo de açúcares redutores assim a opção foi escolher a mesma concentração de ácido sulfúrico 2,5% e o mesmo tempo de 15 minutos, respectivamente o qual foi escolhido para a casca nos outros experimentos. Seolatto et al (2014) compararam o rendimento de açúcares fermentescíveis com o pré tratamento de hidrólise ácida em bagaço de abacaxi para a produção de biocombustível e nesse estudo observaram que a maior produção de açúcares redutores ocorreu nas menores temperaturas utilizadas. Em um estudo realizado por Pattana et al (2010), onde realizou-se a hidrólise ácida dos substratos do abacaxi, obteve-se 5,47g/L de glicose, mostrando assim que o abacaxi apresenta bons rendimentos de açúcares fermentescíveis. Silva (2011), em seu estudo utilizando planejamento fatorial para determinar o melhor rendimento de açúcares redutores em bagaço de abacaxi, este, encontrou na concentração de 1,5 % de ácido sulfúrico, temperatura de 140º C e tempo de 30 minutos a melhor liberação de açúcares redutores sendo 11 g/L de xilose e 4g/L de frutose. O Gráfico 4 mostra a determinação dos compostos fenólicos. É importante saber que quanto menor a concentração destes compostos melhor será o crescimento celular e menor a interferência na produção de biossurfactante. Estes compostos reagem com as moléculas biológicas da célula (proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos) e provocam danos à membrana celular, gerando perda da integridade da membrana e sua seletividade, afetando dessa maneira sua capacidade como matriz enzimática e barreira seletiva, diminuindo o crescimento celular e a suplementação de açúcares (CAMPOS et al., 2009). Portanto, baseado nos dados relatados, a casca e o talo do abacaxi no tempo de 15 minutos de aquecimento e 2,5% de concentração de ácido sulfúrico, foram as que apresentaram os menores valores. Sendo assim foi possível observar que quanto maior o aquecimento 52 maior é a liberação desses compostos. No Gráfico 4 observa-se ainda que para o tempo de aquecimento 30 minutos os valores de compostos fenólicos tanto para a casca quanto para o talo do abacaxi foram altos. 5.2 Desintoxicação e concentração dos hidrolisados do talo e da casca do abacaxi A hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos possibilita a liberação de açúcares polimerizados que podem ser fermentados e podem produzir biossurfactantes por micro-organismos, como por exemplo, a Candida tropicalis, porém além desses açúcares, há também a liberação de compostos inibidores que limitam a produção de biossurfactante e, por isso, são desenvolvidos métodos específicos de desintoxicação do material hidrolisado, para realizar o processo de fermentação (PALMQVIST; HAHN-HAGERDAL, 2000). Essa etapa serve para diminuir os compostos inibidores e outros fatores que possam interferir no desenvolvimento dos micro-organismos. Para monitorar antes e depois da desintoxicação foram realizadas análises de açúcares redutores e compostos fenólicos e também depois de concentrar o sobrenadante foram realizadas novas análises de açúcares redutores e compostos fenólicos. Os resultados podem ser observados nos Gráficos 5 e 6, respectivamente. Gráfico 5 - Açúcares redutores em g/L sem desintoxicar, desintoxicado e após concentração 0 100 200 300 400 500 600 700 sem desintoxicar desintoxicado concentrado A ç ú c a re s r e d u to re s e m g /L Açúcares redutores casca talo 53 Gráfico 6 - Compostos fenólicos em g/L sem desintoxicar, desintoxicado e após concentração. No Gráfico 5 observa-se que no hidrolisado sem desintoxicar e desintoxicado o conteúdo de açúcares redutores não teve muita mudança, porém ao concentrar o desintoxicado os valores tanto para a casca como para o talo de abacaxi subiram, sendo que para o talo o aumento de açúcares redutores foi o maior. Já para os compostos fenólicos, o Gráfico 6 nos mostra que após desintoxicar o hidrolisado os valores diminuíram tanto para a casca quanto para o talo do abacaxi, porém ao concentrar esse hidrolisado os valores voltaram a aumentar. 5.3 Determinação do crescimento microbiano O crescimento microbiano foi avaliado para concentrações de glicose (1 a 5%) e para concentrações de diferentes substratos casca e talo do abacaxi (1 a 5%). Os resultados estão demosntrados nos Gráficos (7, 8 e 9), respectivamente. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 sem desintoxicar desintoxicado concentrado C o m p o s to s f e n ó li c o s e m g /L Compostos fenólicos casca talo 54 Gráfico 7: Crescimento microbiano para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200rpm. Gráfico 8: Crescimento microbiano para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200rpm. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas 10 Horas 12 Horas C re s c im e n to M ic ro b ia n o g /L Tempo de Fermentação GLICOSE Conc.1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas 10 Horas 12 Horas C re s c im e n to m ic ro b ia n o g /L Tempo de Fermentação CASCA Conc.1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5 55 Gráfico 9: Crescimento microbiano para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200rpm. 5.4 Variação do ph Foram realizadas fermentações em períodos de 2h, 4h, 6h, 8h, 10h e 12 horas para cada concentração de glicose (1 a 5%) e também para cada concentração dos substratos (1 a 5%) sendo eles a casca e o talo do abacaxi e analisada a variação do pH para cada fermentação. Os resultados demonstraram que houve variação do pH ao longo da fermentação em relação ao pH inicial de 6,5. Observa-se também que estas mudanças são diferentes em relação ao substrato e a concentração utilizada (Gráficos 10, 11 e 12). Os valores de pH baixo em algumas concentrações de substrato está relacionada ao fato do carboidrato ter sido catabolizado resultando na produção de ácidos e consequentemente ao aumento do crescimento celular (FERREIRA, 2007). 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas 10 Horas 12 Horas C re s c im e n to M ic ro b ia n o g /L Tempo de Fermentação TALO Conc.1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5 56 Gráfico 10: Variação do pH para as diferentes concentrações de glicose utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200rpm. Gráfico 11: Variação do pH para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (talo), utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200rpm. 0 1 2 3 4 5 6 7 2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas 10 Horas 12 Horas p H Tempo de Fermentação GLICOSE Conc. 1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5 0 1 2 3 4 5 6 7 2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas 10 Horas 12 Horas p H Tempo de Fermentação TALO Conc. 1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5 57 Gráfico 12: Variação do pH para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca) utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes nos períodos de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm. 5.5 Índice de emulsificação A determinação do índice de emulsificação esta diretamente relacionado com a presença de biossurfactantes no caldo fermentado livre de células, tendo assim altos índices de emulsificação que indicarão maior quantidade de biossurfactantes (OLIVEIRA, 2014). Um bom biossurfactante possui a capacidade de emulsificação e estabilização da emulsificação em torno de 50% do volume da emulsão original 24 horas depois da sua formação (ANTUNES, 2010). Os biossurfactantes produzidos nos períodos de 2 h, 4h, 6h e 8h para os três substratos, (casca, talo de abacaxi e glicose respectivamente) obtiveram resultados abaixo de 50% indicando que a produção de biossurfactante por Candida tropicalis nesses intervalos de fermentação ficaram abaixo de 50% conforme mostram os Gráficos 13, 14, 15 e 16 para casca, 17, 18, 19 e 20 para talo e 21, 22, 23 e 24 para glicose. Isso pode ser explicado pela pouca produção de biossurfactante, uma vez que, existe a relação entre a concentração do biossurfactante produzido e o valor de índice de emulsificação (CALVO, et al.,2009). 0 1 2 3 4 5 6 7 2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas 10 Horas 12 Horas p H Tempo de Fermentação CASCA Conc. 1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5 58 Gráfico 13: Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca) utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 2 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm. *BS: Biossurfactante produzido. Gráfico 14: Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca) utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 4 horas de fermentação a 30ºC e 200 rpm. *BS: Biossurfactante produzido. 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 10 min 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas p o rc e n ta g e m Tempo Índice de emulsificação ( 2 Horas de fermentação casca) Conc.1 (BS + oléo vegetal) Conc.2 (BS+ oléo vegetal) Conc.3 (BS + oléo vegetal) Conc.4 (BS + óleo vegetal) Conc.5 (BS + oléo vegetal) 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 10 min 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas p o rc e n ta g e m Tempo Índice de emulsificação (4 horas de fermentação casca) Conc.1 (BS + oléo vegetal) Conc.2 (BS + óleo vegetal) Conc.3 (BS + oléo vegetal) Conc.4 (BS + oléo vegetal) Conc.5 (BS + oléo vegetal) 59 Gráfico 15: Índice de emulsificação para as diferentes concentrações de hidrolisado de abacaxi (casca) utilizadas pela levedura Candida tropicalis durante a produção de biossurfactantes no período de 6 horas de fer