RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 15/12/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Padronização, caracterização e potencial atividade biológica do óleo vegetal de girassol ozonizado Matheus Henrique Vieira Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin Araraquara - SP 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Padronização, caracterização e potencial atividade biológica do óleo vegetal de girassol ozonizado Matheus Henrique Vieira Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin. Araraquara - SP 2023 Vieira, Matheus Henrique. V658p Padronização, caracterização e potencial atividade biológica do óleo vegetal de girassol ozonizado / Matheus Henrique Vieira. – Araraquara, 2023. 80 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos. Orientadora: Chung Man Chin. 1. Óleo vegetal ozonizado. 2. Óleo vegetal girassol. 3. Ozônio. 4. Oleozonioterapia. I. Chung, Man Chin, orient. II. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030078P6 Esta ficha não pode ser modificada CERTIFICADO DE APROVAÇÃO Câmpus de Araraquara UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Padronização, caracterização e potencial atividade biológica do óleo vegetal de girassol ozonizado TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: AUTOR: MATHEUS HENRIQUE VIEIRA ORIENTADORA: CHUNG MAN CHIN Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Ciências, área: Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos pela Comissão Examinadora: Profa. Dra. CHUNG MAN CHIN (Participaçao Presencial) Departamento de Farmacos e Medicamentos / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas do Campus de Araraquara da Unesp Profa. Dra. CIBELE ROSANA RIBEIRO DE CASTRO LIMA (Participaçao Presencial) Academia Brasileira de Tricologia (ABT) Profa. Dra. TAIS MARIA BAUAB (Participaçao Presencial) Departamento de Ciencias Biologicas / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas do Campus de Araraquara da Unesp Araraquara, 15 de dezembro de 2023 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA - JAÚ, Km 1, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/ciencias-farmaceuticas/CNPJ: 48.031.918/0025-00. AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida e pelas oportunidades diárias de crescer e evoluir. A minha esposa Jaqueline e minha filha Alice que sempre me deram forças para seguir estudando. Aos meus pais, que desde pequeno sempre me orientaram que o estudo seria um caminho importante para vencer na vida. Ao meu amigo Celso Junior, que foi o grande incentivador para ingressar no mestrado. A minha orientadora Dra. Chung Man Chin, por seu olhar criterioso e ao mesmo tempo acolhedor, compartilhando seu conhecimento e suas ideias para aprimorar o trabalho de maneira sempre pontual e cirúrgica. A minha amiga Dra. Cibele Rosana de Castro Lima, um exemplo de profissional e me inspirou muito para chegar ao mestrado. Ao Grupo Martbel, pelo incentivo e disposição de tempo que tive que me ausentar das atividades de trabalho para realização dos estudos. Ao Grupo Ipclin, pelos testes todos cedidos do estudo em especial ao Laboratório Atena e Núcleo Vitro. A empresa Ozon Solution, por fornecer amostras do Óleo Vegetal Girassol. Ao Dr. Jean Lucas de Oliveira Arias da Universidade Federal do Rio Grande, que muito contribuiu para esse projeto. Enfim, a todos colaboradores da Melk Cosméticos que sempre estão comigo no dia a dia, me ajudam e me estimulam a sempre crescer como profissional e ser humano. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. RESUMO A molécula de ozônio é formada por três átomos de oxigênio com elevado poder oxidante, sendo amplamente empregada para diversas finalidades, inclusive para tratamento terapêutico que inclui a administração de ozônio medicinal no combate a diversas doenças. Desde 2018, a utilização de ozônio medicinal foi incorporada como uma prática de medicina complementar e integrativa no Sistema Único de Saúde (SUS). Contudo, é crucial destacar que a eficácia do ozônio está intimamente ligada à sua concentração, uma vez que concentrações inadequadas podem resultar em efeitos deletérios ou ineficácia no tratamento. Neste contexto, a padronização do óleo ozonizado se torna indispensável para assegurar a segurança do paciente. O objetivo principal deste trabalho consistiu em desenvolver protocolos para a padronização e caracterização, com isso foram utilizadas técnicas como cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas, ensaios microbiológicos e citotóxicos. Os resultados obtidos indicaram que após 480 minutos de ozonização em 100 mL de óleo vegetal de girassol (OG), ocorreu um significativo potencial antimicrobiano, resultando na formação de ozonídeos. Esse processo provocou alterações físico-químicas no aspecto, cor, odor e na produção de subprodutos no óleo, conforme evidenciado pela cromatografia, sendo esta última dependente da atividade citotóxica/antibacteriana. Os ensaios de atividade antibacteriana e antifúngica, conduzidos por meio dos métodos de "time kill", difusão em ágar e Concentração Inibitória Mínima (CIM), revelaram atividade contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis e Malassezia furfur. Estes resultados demonstram o potencial terapêutico do óleo ozonizado no tratamento de doenças infecciosas. Em síntese, a padronização do processo de ozonização do óleo vegetal de girassol revelou-se promissora, proporcionando um produto com marca da atividade antimicrobiana e potencial terapêutico, abrindo perspectivas para sua aplicação em diversas áreas da medicina. Palavras-chave: óleo vegetal ozonizado, óleo vegetal girassol, ozônio, oleozonioterapia. ABSTRACT The ozone molecule is formed by three oxygen atoms with high oxidizing power, being widely used for various purposes, including therapeutic treatment that includes the administration of medicinal ozone to combat various diseases. Since 2018, the use of medicinal ozone has been incorporated as a complementary and integrative medicine practice in the Unified Health System (SUS). However, it is crucial to highlight that the effectiveness of ozone is closely linked to its concentration, since inadequate concentrations can result in deleterious effects or ineffective treatment. In this context, the standardization of ozonized oil becomes essential to ensure patient safety. The main objective of this work was to develop protocols for standardization and characterization, using techniques such as gas chromatography coupled to mass spectrometry, microbiological and cytotoxic assays. The results obtained indicated that after 480 minutes of ozonization in 100 mL of sunflower vegetable oil (OG), a significant antimicrobial potential occurred, resulting in the formation of ozonides. This process caused physical-chemical changes in the appearance, color, odor and production of by- products in the oil, as evidenced by chromatography, the latter being dependent on cytotoxic/antibacterial activity. Antibacterial and antifungal activity assays, conducted using the "time kill", agar diffusion and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) methods, revealed activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis and Malassezia furfur. These results demonstrate the therapeutic potential of ozonized oil in the treatment of infectious diseases. In summary, the standardization of the ozonization process of sunflower vegetable oil proved to be promising, providing a product with antimicrobial activity and therapeutic potential, opening up perspectives for its application in various areas of medicine. Keywords: ozonized vegetable oil, sunflower vegetable oil, ozone, oleozone therapy. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Gerador de ozônio proposto por Werner SIemens ........................... 16 Figura 2 Estrutura Molecular de Óleo Vegetal. ............................................... 19 Figura 3 Mecanismo de ozonólise de proposto por Criegee ........................... 21 Figura 4 Mecanismo de ozonólise de olefina .................................................. 22 Figura 5 (CG-MS) de uma amostra de azeite refinado. .................................. 23 Figura 6 (CG-MS) de uma amostra de azeite refinado ozonizado. ................. 23 Figura 7 Mecanismo de Criegee para reações de ozónio com ligação dupla carbono-carbono. ............................................................................................ 24 Figura 8 Cilindro de Oxigênio, Gerador de Ozônio e OG seguido do OGO .... 40 Figura 9 Cromatograma perfil graxo óleo girassol (OG). ................................ 42 Figura 10 Cromatograma perfil graxo óleo girassol (OGO 100 minutos). ....... 43 Figura 11 Cromatograma perfil graxo óleo girassol (OGO 240 minutos). ....... 44 Figura 12 Cromatograma perfil graxo óleo girassol (OGO 480 minutos). ....... 45 Figura 13 Cromatograma da matéria insaponificável do óleo de girassol (OG) ........................................................................................................................ 48 Figura 14 Cromatograma matéria insaponificável do óleo de girassol ozonizado (OGO 100 minutos) ......................................................................................... 50 Figura 15 Cromatograma matéria insaponificável do óleo de girassol ozonizado (OGO 240 minutos) ......................................................................................... 52 Figura 16 Cromatograma matéria insaponificável do óleo de girassol ozonizado(OGO 480 minutos) ......................................................................... 54 Figura 17 Emulsão com diferentes tipos de Óleo vegetal de oliva. ................. 57 Figura 18 Difusão em ágar OGO vs controle com a cepa Staphylococcus aureus ATCC 6538 ......................................................................................... 64 Figura 19 Plaqueamento de cepa para o ensaio time-kill (tempo de morte). .. 65 Figura 20 Microdiluição com microplaca de 96 poços. ................................... 66 Figura 21 Controle versus concentração de OGO 480 minutos. ..................... 68 . LISTAS DE TABELAS E QUADROS Tabela 1 Suscetibilidade bacteriana ao gás ozônio. ....................................... 17 Tabela 2 Agentes oxidantes e seu potencial de oxidação. .............................. 18 Tabela 3 Perfil graxo óleo girassol (OG). ........................................................ 42 Tabela 4 Perfil graxo óleo girassol ozonizado (OGO 100 minutos). ............... 43 Tabela 5 Perfil graxo óleo girassol ozonizado (OGO 240 minutos). ................ 44 Tabela 6 Perfil graxo óleo girassol ozonizado (OGO 480 minutos). ................ 45 Tabela 7 Percentagem de insaturação de ácidos graxos vs tempo de ozonização ...................................................................................................... 47 Tabela 8 Matéria insaponificável do óleo de girassol (OG). ............................ 48 Tabela 9 Matéria insaponificável do óleo de girassol ozonizado (OGO 100 minutos). ......................................................................................................... 51 Tabela 10 Matéria insaponificável do óleo girassol ozonizado (OGO 240 minutos). ......................................................................................................... 53 Tabela 11 Matéria insaponificável do óleo de girassol ozonizado (OGO 480 minutos). ......................................................................................................... 55 Tabela 12 Comparativo dos 5 componentes majoritarios perfil graxo. ............ 57 Tabela 13 Comparativo dos 5 componentes majoritarios da matéria insaponificável. ............................................................................................... 58 Tabela 14 Índice de acidez OG e OGO .......................................................... 59 Tabela 15 Comparativo tempo, dosagem vs índice de peróxido. .................... 60 Tabela 16 Índice de iodo das amostras de OG e OGO. .................................. 61 Tabela 17 Parâmetros físico-químicos do óleo de girassol ozonizado obtido por (DIAZ et al., 2012) com oxigênio como fonte de ozônio. ................................. 61 Tabela 18 Estabilidade acelerada OGO 100 minutos. .................................... 62 Tabela 19 Estabilidade acelerada OGO 240 minutos. .................................... 63 Tabela 20 Estabilidade acelerada OGO 480 minutos. .................................... 63 Tabela 21 Contagem de bactérias e leveduras (tempo de contato e fator de redução). ......................................................................................................... 65 Tabela 22 Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OGO 480 minutos.......... 67 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS OGO Óleo vegetal de girassol ozonizado OG Óleo vegetal de girassol CIM Minimum inhibitory concentracion (Concentração Mínima Inibitória) O2 Oxigênio O3 Ozônio GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry (Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa) kPa Kilo pascal NaOH Hidróxido de Sódio S.aureus Staphylococcus aureus ATCC 6538 E.coli Escherichia coli ATCC 8739 S.choleraesuis Salmonella choleraesuis ATCC 10708 P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 C.albicans Candida albicans ATCC 16404 A. brasiliensis Aspergilus brasiliensis ATCC 16404 M.furfur Malassezia furfur ATCC 14521 PG Perfil graxo MI Matéria insaponificável mEq O2/kg miliequivalente de oxigênio por quilograma Na2S2O3 Tiossulfato de Sódio DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (Meio Eagle modificado Dulbecco) TSB Caldo Seletivo Tradicionalmente UFC Unidade Formadora de Colônia / g ou mL após exposição % RF Fator de redução (% redução a partir contagem inicial da linha de base) AOCS American Oil Chemists´Society (Sociedade Americana Química Óleo) ASTME Standard Guide For Assessment Of Antimicrobial Activity Using A Time-Kill Procedure ((Guia padrão para avaliação da atividade antimicrobiana usando um procedimento time-kill). LESS Lauril éter sulfato sódio SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 14 2. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................... 16 2.1. Ozônio ...................................................................................................... 16 2.2 Reação Química do Ozônio e Óleo Vegetal ............................................. 18 2.OBJETIVOS ................................................................................................. 27 2.1. Objetivo Geral........................................................................................... 27 2.2. Objetivo Específico ................................................................................... 27 3. MATERIAL e MÉTODOS .......................................................................... 28 3.1. Reagentes ................................................................................................ 28 3.2. Equipamentos .......................................................................................... 28 3.3. Preparação do Óleo Vegetal de girassol ozonizado (OGO) ..................... 29 3.4. Cromatografia Gasosa acoplado à espectrometria de massas (GC-MS) .. 29 3.5. Análise físico-química ............................................................................... 30 3.6. Ensaios microbiológicos ........................................................................... 32 3.6.1. Cepas ................................................................................................ 32 3.6.2. Difusão em ágar (Pour-Plate) ............................................................. 33 3.6.3. Time-kill (tempo de morte) ................................................................. 33 3.6.4. Concentração inibitória mínima (CIM) ................................................ 36 3.7. Estudo in vitro de citoxicidade .................................................................. 38 4. RESULTADOS e DISCUSSÕES .............................................................. 39 4.1. Preparação do óleo de girassol ozonizado ............................................... 40 4.2. Cromatografia gasosa acoplada à espectometria de massas (GC-MS) .... 42 4.2.1. Perfil graxo óleo girassol (OG) e óleo girassol ozonizado (OGO) ....... 42 4.2.2. Perfil cromatográfico da matéria insaponificável da amostra de óleo de girassol (OG) e óleo girassol ozonizado (OGO) .............................................. 47 4.3. Análise Físico-química.............................................................................. 58 4.3.1. Índice de acidez ................................................................................. 58 4.3.2. Índice de Peróxido ............................................................................. 59 4.3.3. Índice de Iodo .................................................................................... 60 4.3.4. Estabilidade Físico-química ............................................................... 62 4.4. Eficácia Microbiológica ............................................................................. 64 4.4.1. Difusão em ágar (Pour-Plate) ............................................................. 64 4.4.2. Time-Kill (tempo de morte) ................................................................. 64 4.4.3. Concentração Inibitória Minima (CIM) ................................................ 66 4.5. Estudo in vitro de citoxicidade .................................................................. 68 5. CONCLUSÃO ........................................................................................... 70 6. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 72 14 1. INTRODUÇÃO O ozônio (O3), embora tenha sido produzido em laboratório pela primeira vez em 1839 por Christian Friedrich Schönbein, é uma substância natural. Sua descoberta foi um resultado do interesse de Schönbein em compreender o odor produzido por certos processos químicos e elétricos. (McELROY; FOGAL, 2008). Durante a primeira guerra mundial (1914-1918) médicos familiarizados com o O3 e com poucos outros recursos médicos disponíveis na época, aplicaram topicamente em feridas infectadas e descobriram que o ozônio não apenas curava a infecção, mas também tinha propriedades hemodinâmicas e antiinflamatórias. (SERRA et al., 2023). O ozônio tem sido utilizado com sucesso na medicina há mais de 100 anos devido ao seu potencial microbiológico. A crescente preocupação com a resistência aos microrganismos e aos antimicrobianos convencionais tem direcionado a atenção para alternativas como ozônio. O seu uso na desinfecção de ambientes (hospitais, hotéis entre outros) foi alvo de estudo por Sharma e Hudson (2008) que demonstraram a eficácia antimicrobiana com este gás. Rangel, Cabral, Lechuga, Carvalho, Villas- Boas, Midley e De-Simone (2021) determinaram as concentrações mínimas de ozônio necessárias para controlar e eliminar tanto bactérias Gram-positivas quanto bactérias Gram-negativas. (SHARMA; HUDZON, 2008; RANGEL et al, 2021). Conforme Brito Júnior, Carneiro, Reis, Oliveira e Dantas (2022) a ozonioterapia tem sido explorada em várias áreas terapêuticas devido às suas propriedades antimicrobianas e potencial de regeneração tecidual. No Brasil, o sistema de saúde público é robusto e, desde a década de 1980 foram introduzidas as práticas de medicina tradicional, complementar e integrativa. Em 2018, a ozonioterapia foi incluída como prática integrativa complementar apresentando diversos benefícios. (SERRA et al., 2023). Na ozonioterapia, tem utilizado os óleos vegetais ozonizados devido ser um método de baixo custo e com resultados eficientes, incluindo a fácil aplicação do óleo ozonizado na pele. (UEBELE et al., 2022). Os óleos ozonizados tem despertado um grande interesse nas esferas científica e clínica devido aos seus potenciais aplicações terapêuticas. A 15 transformação de óleos vegetais pelo ozônio resulta na formação de ozonídeos e outros compostos que demonstram liberar lentamente o ozônio retido como ozonídeos (MOULYDIA et al., 2018; UGAZIO et al., 2020). Entretanto, a padronização e caracterização dos óleos vegetais ozonizados, é de extrema importância, tendo em vista que a concentração de ozônio pode tornar o óleo ineficaz pela baixa concentração, ou torna-lo tóxico, devido ao excesso de ozônio aplicado, formando componentes como formaldeído, tóxico para microrganismos e também ao ser humano (UGAZIO et al., 2020). Assim, esta pesquisa visa a padronização do óleo vegetal ozonizado e suas potencialidades antimicrobianas o qual trará avanços significativos no campo da ozonioterapia, com segurança para uso medicinal. 70 5. CONCLUSÃO A padronização e caracterização do OGO de 120, 240 e 480 minutos na concentração 60 µg/ml de ozônio, as propriedades físico-química se modificaram com o aumento do tempo de ozonização. A coloração alterou, apresentando-se mais clara, a densidade aumentou, o odor alterou, os índices de peróxido, acidez aumentaram e índice de iodo reduziu. Na ozonização foi caracterizado a formação de novos compostos ozonídeos, os dados de CG-MS apontaram para o aparecimento de ácido benzoico, 2,5 furandione, fitosteróis, entre outros. Referente a atividade biológica, o OGO 480 minutos se mostrou efetivo nas cepas: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, Salmonela choleraesuis ATCC 10708, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 entre os ensaios microbiológicos como difusão em ágar, time-kill (tempo de morte) e CIM. No ensaio CIM notou-se que a levedura Candida albicans ATCC 16404 apresentou a maior inibição na diluição 6,25% de OGO 480 minutos e 93,75% OG, enquanto a bactéria Escherichia coli ATCC 8739 apresentou inibição na diluição de 50% de OGO e 50% OG. O parâmetro físico-químico índice de peróxido um assunto muito comentado quando se trata de óleo vegetal ozonizado, estudos corroboram que não é apenas esse índice determinante para a qualidade do produto, porém percebe-se que quanto maior o tempo de ozonização, maior será esse índice. Um parâmetro predominante é a cromatografia, pois é nessa análise que vamos identificar os componentes que terão de fato a eficácia e também a segurança do produto. Quanto ao resultado citotóxico em célula Balb/c 3T3 clone 31 in vitro o OGO 480 minutos mostrou-se citotóxico nas dosagens de 1 a 10 ug/mL, estudos adicionais são necessários para segurança. Esse trabalho corrobora para a utilização terapêutica de OGO: 480min 60 µg/ml O3 padronizado, em doenças bacterianas e fúngicas. É uma opção viável de tratamento sendo de origem vegetal, livre de conservantes e fragrâncias. 72 6. REFERÊNCIAS ABELAN, U.S.; CANADA, M.L.M.; KOZUSNY-ANDREANI, D.; ZÂNGARO, R.A.; RAMOS, R.R. 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