Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia REPERCUSSÕES DO TABAGISMO PASSIVO DURANTE A PRENHEZ E ASSOCIADO AO EXERCÍCIO FÍSICO DURANTE O CRESCIMENTO NA MUSCULATURA DE RATOS WISTAR Presidente Prudente 2013 Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia REPERCUSSÕES DO TABAGISMO PASSIVO DURANTE A PRENHEZ E ASSOCIADO AO EXERCÍCIO FÍSICO DURANTE O CRESCIMENTO NA MUSCULATURA DE RATOS WISTAR Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/Unesp, Campus de Presidente Prudente, para obtenção do título de mestre no programa de pós-graduação em fisioterapia. Orientador: Prof. Dr. José Carlos Silva Camargo Filho Presidente Prudente 2013 FICHA CATALOGRÁFICA Urban, Jacqueline Bexiga. U63r Repercussões do tabagismo passivo durante a prenhez e associado ao exercício físico durante o crescimento na musculatura de ratos wistar / Jacqueline Bexiga Urban. - Presidente Prudente : [s.n], 2013 107 f. Orientador: José Carlos Silva Camargo Filho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências e Tecnologia Inclui bibliografia 1. Ratos Wistar - Crescimento e desenvolvimento. 2. Exercícios físicos. 3. Exposição à fumaça do cigarro. I. Camargo Filho, José Carlos Silva. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências e Tecnologia. III. Título. “Repercussões do tabagismo passivo durante a prenhez e associado ao exercício físico durante o crescimento na musculatura de ratos wistar” “Effects of passive smoking during pregnancy and associated with exercise during growth in muscles of Wistar rats” Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a mortalidade, peso, comprimento corporal e o músculo gastrocnêmio de filhotes submetidas à exposição de fumaça do cigarro e programa de natação. Métodos: Os filhotes foram gerados por matrizes controle (G1) e expostas a fumaça do cigarro (G2). As ratas advindas da gestação foram separadas após a lactação, segundo o grupo de suas matrizes, em G_CN (controle natação), G_CS (controle sedentário), G_FN (exposto natação) e G_FS (exposto sedentário). Foi obtido o peso corporal dos filhotes semanalmente, e o comprimento corporal, considerando o tamanho crânio-cóccix. Ao final do experimento foi realizada a análise morfométrica do músculo gastrocnêmio. Para a análise estatística, foi utilizado teste T independente, e ANOVA para medidas repetidas e ANOVA One-Way, adotando p < 0,05. Resultados: Não houve diferença significativa entre os grupos no número de filhotes (p=0,387). Os filhotes do grupo G1 apresentaram pesos maiores e comprimentos maiores a partir da primeira semana (p<0,0001), quando comparados aos filhotes do grupo G2. Tal diferença entre os grupos persistiu até a idade adulta. As medidas do diâmetro menor das fibras dos grupos G1FN e G1CS foram maiores em comparação ao G1CN. Conclusão: Observou-se que os filhotes submetidos ao tabagismo passivo durante sua gestação e lactação apresentaram alteração no crescimento e que a natação não demonstrou alterações importantes. Palavras-chaves: Exposição à fumaça do cigarro, Ratos Wistar/crescimento & desenvolvimento, Exercício físico, Lactação, Peso ao nascer. “Repercussões do tabagismo passivo durante a prenhez e associado ao exercício físico durante o crescimento na musculatura de ratos wistar” “Effects of passive smoking during pregnancy and associated with exercise during growth in muscles of Wistar rats” Purpose: The purpose of this study was to evaluate weight, body length and the gastrocnemius muscle of offspring of rats submitted to exposure to second- hand smoke and swimming program and. Methods: Ten female rats were divided into groups: G1 (control), G2 (exposed to cigarette smoke) and five male rats. The female pups were separated after lactation , the group from its headquarters in G_CN control (swimming), G_CS (sedentary control), G_FN (exposed swimming) and G_FS (exposed sedentary). The body weight of the pups was measured at six time points. The gastrocnemius muscle of the pups was obtained for evaluation of muscle development. For statistical analysis, was used ANOVA for repeated measures and ANOVA One-Way, considering p<0.05. Results: Puppies of G1 showed higher weights at birth (p=0.011) and longer lengths from the first week (p<0.0001) compared to pups of G2, the difference between the groups persisted into adulthood. The measured of smaller diameter fibers in G1CS and G1FN group was higher compared to G1CN. Conclusions: Observed that pups submitted to passive smoking during their pregnancy and lactation showed abnormalities in growth and the swimming protocol did not show significant changes. Keywords: Tobacco smoke pollution, Wistar/growth & development, Exercise, Lactation, Birth weight Rats. SUMÁRIO Dedicatória........................................................................................ 05 Agradecimentos................................................................................ 07 Epígrafe............................................................................................ 10 Apresentação.................................................................................... 12 INTRODUÇÃO............................................................................................ 14 Artigo I............................................................................................... 22 Artigo II.............................................................................................. 52 CONCLUSÕES........................................................................................... 71 REFERÊNCIAS........................................................................................... 73 ANEXO I...................................................................................................... 79 ANEXO II..................................................................................................... 94 ANEXO III.................................................................................................... 108 Dedicatória Dedico esta dissertação à minha mãe, Janete. Agradecimentos Agradeço, A Deus, por esse crescimento, por ter me mostrado o caminho a seguir, me fortalecer nos obstáculos que confrontei e por entregar seu Filho para me salvar. A minha mãe, por me apoiar, por não medir esforços para me incentivar. Sem sua dedicação, não teria chegado aqui. Ao meu irmão, Leonardo, que sempre estava disposto a me ajudar com meus dados. Aos meus familiares, que torceram por mim durante esses dois anos. Ao meu orientador, professor Zeca, pela confiança, por dar suporte durante minha iniciação científica e mestrado, e ter se empenhado em me fazer crescer como pesquisadora e como fisioterapeuta. A professora Regina, que sempre estava ali para que eu pudesse tirar minhas dúvidas e me ensinar. A minha dupla, Regiane, que conseguiu fazer esse projeto realidade, sem você teria sido muito mais difícil. A Taíse, minha quase orientanda de Iniciação Científica, por largar sua férias e ficar comigo para fazer a experimentação do projeto. A Glaucia, Tatiana e Robson, por largarem um pedaço das suas férias e virem ajudar nos testes de lactacidemia e na eutanásia. A Darlene, Laís e Rafael, por ajudarem na eutanásia, mesmo sendo dia de colação de grau... Aos demais colegas do LAPMus, Adriana, Alan, Alice, André, Fábio, Guilherme, Mariana, que de alguma forma ajudaram na idealização e realização do projeto. As meninas do Laboratório da Fisiologia do Estresse, Aline, Ana Clara, Ana Laura, Camila, Marianne, Naiara e Renata, pela ajuda nas dúvidas, pelo empréstimo de café e por estarem sempre dispostas a ajudar. Aos técnicos do laboratório, Sidney e William, por colaborarem em todas as etapas do estudo. A minha eterna co-orientadora, Bruna, que sempre está disposta a me ajudar, mesmo estando incrivelmente ocupada. Ao Rogério e a Malena, meus colegas de disciplina, meus créditos ficaram bem mais tranquilos com vocês. Aos meus amigos, Alex, Gabrielle, Paulo, pela nossa amizade, pelas risadas, viagens e torcida. Amo vocês pra sempre! Aos meus amigos e irmãos em Cristo, Felipe, Henrique, Isabella, Izabela, Sarah e suas respectivas famílias, pelas orações e apoio em todos os momentos. Aos meus nakamas, Breyner, Lidenio, Lucas e Vitória, pelos momentos de descontração, pelas risadas e principalmente, por estarem lá sempre que eu precisava de uma palavra de motivação. A minhas companheiras, Bruna, Cláudia, Fernanda, Marcela, Stela, Márcia, por torcer por mim, por se preocuparem comigo e Aos meus amigos do inglês, Caio, Camila, Débora, Fernando, Helder, Marcos, Rafaela, Thaísa, e meus professores, Ana Paula, Fabiana, Fernanda, Fred, Vanessa e Zé, pela amizade, pela troca de vocabulário, cultura e me darem ânimo para estudar inglês e passar na prova de proficiência. Ao professor Mario Jefferson, por permitir as análises no seu laboratório. Aos professores Luiz Carlos e Patrícia, pelas contribuições e correções prévias do trabalho. A professora Iracimara, por ter me chamado para fazer parte da pesquisa com a Samanta e deixar a porta entreaberta para entrar nessa equipe. Aos professores Luiz Carlos (novamente) e Hermann por terem aceito o convite para participarem dessa banca. Epígrafe “E Israel ficará sabendo que o Senhor não depende de armas para realizar seus planos; Ele trabalha sem levar em conta os recursos humanos!” (I Samuel 17:47a) Apresentação Esta dissertação é composta de uma introdução e de dois artigos científicos, originados de pesquisas realizadas no Laboratório de Histologia do Departamento de Fisioterapia da FCT/UNESP – Presidente Prudente. Em consonância com as regras do Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia, os artigos foram redigidos de acordo com as normas dos periódicos Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia e Acta Ortopédica Brasileira. - Artigo I. Urban JB, Trindade Camargo CLT, Costalonga RR, Biral TM, Macedo LA, Coladello L, Camargo Filho JCS. Análise do desenvolvimento corporal de filhotes de ratas submetidas ao tabagismo passivo durante o período pré-natal: Estudo no período de lactação e a influência do exercício físico após a lactação. Submetido à apreciação visando publicação no periódico Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia. - Artigo II. Urban JB, Costalonga RR, Louzada MJQ, Fernandes RA, Trindade Camargo RC, Camargo Filho JCS. Estudo da influência do tabagismo passivo no período de intra-uterino e lactacional e a ação do exercício físico após a lactação no conteúdo mineral ósseo e na densidade mineral óssea. Submetido à apreciação visando publicação no periódico Acta Ortopédica Brasileira. Introdução 15 A inatividade física está entre as dez principais causas de mortalidade e incapacidade no mundo desenvolvido, segundo o Relatório Mundial da Saúde no ano de 2002. No ano de 2004, a Organização Mundial da Saúde estimou que aproximadamente 2 milhões de mortes no mundo podem ser atribuída a inatividade física (DUMITH et al., 2010). Desta forma, a promoção da atividade física deve começar na infância; O Physical Activity Guidelines for Americans afirma que crianças e adolescentes devem realizar atividades física, de intensidade moderada a vigorosa, durante 60 minutos por dia para obter benefícios na saúde (DUMITH et al., 2010). Entre as crianças e adolescentes, a atividade física regular melhora a composição corporal, forma física cardiorrespiratória e muscular e o desenvolvimento ósseo (DUMITH et al., 2010), além dos benefícios metabólicos cardiovasculares e neurovegetativos, com redução relevante na morbidade e mortalidade, e melhora na capacidade funcional global (ARAÚJO et al., 2010) A atividade física é multidimensional, e sua prática pode ser influenciada por fatores psicológicos, ambientais, do desenvolvimento, fisiológicos, sociais e demográficos, além de proporcionar melhora da saúde, como ativação das defensas imunológicas e do sistema antioxidante, redução do processo inflamatório e incremento na qualidade de vida (AGUIAR E SILVA et al., 2010). Entre os tipos de exercício físico que as crianças podem ser apresentadas, existe a natação. O exercício em piscina mostra proporcionar benefícios aos sistemas muscular, esquelético, nervoso e cardiovascular. Exercícios em água aquecida possuem diversos efeitos fisiológicos que podem promover incremento ao processo de reparo tecidual e dentre estes efeitos podem ser citados: o aumento da circulação periférica e consequente aumento no suprimento de oxigênio e nutrientes ao músculo ativo, aumento no retorno sanguíneo, redução de edemas pela ação da pressão hidrostática e redução da sensibilidade dos terminais nervosos que somadas com todas as outras causam um relaxamento muscular geral (PESTANA et al., 2011). Em especial, os exercícios de intensidade leve a moderada podem promover melhora na resistência e flexibilidade muscular, sem aumento no risco de lesões (FABRIN et al., 2011). 16 Em especial ao tecido muscular, o exercício físico promove a plasticidade muscular, devido a atividade contrátil, danos diretos (laceração, contusão e estiramento) e indiretos (isquemia e disfunção neurológica), favorecendo a mecânica funcional do corpo humano. Esses efeitos na saúde são dependentes das propriedades mecânicas do exercício; e em pesquisas experimentais, da espécie do animal utilizado. (PESTANA et al., 2011). Em estudos histológicos, existe a ocorrência de alterações na forma das fibras musculares e presença de processo inflamatório muscular em fibras musculares de animais submetidos a estresse por exercício de natação (CAMARGO FILHO et al., 2006) e esteira rolante (CAMARGO FILHO et al., 2005), sendo identificado como um mecanismo adaptativo do tecido muscular frente ao exercício físico (BRITO et al., 2006; CAMARGO FILHO et al., 2006; CAMARGO FILHO et al., 2011). Já em estudos histoquímicos, como por exemplo, na reação histoquímica de NADH-TR ocorrem alterações enzimáticas devido ao aumento da demanda metabólica (FOUREAX et al., 2006; CAMARGO FILHO et al., 2011). Quando foram realizados estudos morfométricos, verificou-se que animais exercitados apresentam maiores valores de diâmetro menor quando comparados a sedentários (PAUL & ROSENTHAL et al., 2002; CAMARGO FILHO et al., 2011), podendo-se assim dizer que o exercício causa hipertrofia de fibras musculares, resultando na ampliação do número de elementos contráteis em paralelo e aumento da tensão máxima que o músculo esquelético pode produzir (CAMARGO FILHO et al., 2011). Além das alterações no músculo, a atividade física e participações em esportes durante o crescimento são cruciais para a aquisição de massa óssea e prevenção de doenças ósseas (BAILEY et al., 1996; GÓMEZ BRUTON et al., 2013). O efeito osteogênico é produzido por impactos e cargas mecânicas aplicadas no osso, adaptando o osso a novas demandas e, consequentemente, o conteúdo mineral ósseo (CMO) e a densidade mineral óssea (DMO) são modificadas (BERGMANN et al., 2010; GÓMEZ BRUTON et al., 2013) Os valores de CMO e DMO costuma ser menor em nadadores quando comparados a esportes de alto impacto como a ginástica (MAIMOUM et al., 2013; GÓMEZ BRUTON et al., 2013) e maior quando comparados a sedentários, independentemente do método de análise (GÓMEZ BRUTON et 17 al., 2013). Muitos fatores podem interferir no efeito de natação no osso, tais como as concentrações hormonais ou de ingestão de cálcio (GÓMEZ BRUTON et al., 2013). Em contrapartida aos benefícios do exercício físico aquático, o tabagismo é a principal causa prevenível de morte, uma morte a cada 10 minutos (COSTA E SILVA & KOIFMAN, 1998), e de doenças no mundo, uma das causas de doenças cardiovasculares e câncer (COSTA E SILVA & KOIFMAN, 1998), chegando a 5 milhões de mortes/ano, devendo alcançar mais de 10 milhões de mortes/ano em 2030 (LEITÃO FILHO et al., 2009). Diferentemente das doenças infecciosas, o tempo de manifestação clínica de problemas de saúde decorrentes do hábito tabágico é longo, ocorrendo depois de 20 ou 30 anos do início da exposição (COSTA E SILVA & KOIFMAN, 1998). No Brasil, a prevalência total de fumantes atinge a taxa de 17,2% de fumantes com idade acima de 15 anos, sendo 18,2 milhões de homens e 12,4 milhões de mulheres tabagistas ativos (LEITÃO FILHO et al., 2009). Com essa prevalência, estima-se que o tabagismo promova 200 mil mortes anuais (LEITÃO FILHO et al., 2009). As mudanças demográficas e socioeconômicas ocorridas nos países da América Latina provocaram mudanças no estilo de vida, como na dieta e no uso do tabaco (COSTA E SILVA & KOIFMAN, 1998). Essas mudanças associadas ao redirecionamento de esforços de venda para países em desenvolvimento, após medidas restritivas de comercialização nos países desenvolvidos (Wünsch Filho et al., 2010) Na fumaça do cigarro, 4720 elementos diferentes já foram identificados, sendo que dentre estes existem substâncias tóxicas e cancerígenas (MELLO et al., 2001; CAMPOS et al, 2008). Estas substâncias são encontradas na fumaça do cigarro, constituída principalmente por dois componentes: fumaça central e fumaça periférica (MELLO et al., 2006). O fumo ativo é caracterizado pela fumaça central, gerada pelas altas temperaturas (acima de 950°C), produzida quando o fumante traga o cigarro, é lançada ao meio ambiente após ser aspirada pelo filtro do cigarro, entrando em contato com os pulmões, sendo exalada em seguida (MELLO et al., 2006). 18 Em contrapartida, o fumo passivo é composto em princípio pela fumaça periférica, uma mistura de gases e partículas em estado líquido e sólido, produzida em temperaturas mais baixas (próximas a 350°C), durante a lenta queima das extremidades do cigarro entre as tragadas do fumante ativo. Corresponde aproximadamente a 85% da fumaça de cigarro presente no ambiente, a constituição química é semelhante à da fumaça central, diferindo quantitativamente, pois esta não é filtrada (MELLO et al., 2006; CAMPOS et al., 2008). O tabagismo passivo contém cerca de 4.000 substâncias químicas, faz com que cerca de 3000 casos de mortes por câncer de pulmão entre os fumantes a cada ano, e afeta mais de 22 milhões de crianças nos Estados Unidos anualmente (ASHFORD & WESTNEAT, 2012). É definido como fumaça inalada por uma pessoa que não está ativamente engajada em fumar, mas que está exposta ao fumo do tabaco ambiental (ASHFORD & WESTNEAT, 2012). O tabagismo passivo afeta mais de 22 milhões de crianças nos Estados Unidos anualmente (ASHFORD & WESTNEAT, 2012) Nakamura et al. (2004) descreveram o tabagismo passivo como um problema relevante à saúde pública em todo o mundo, por apresentarem maior risco de morbidade das doenças causadas pelo cigarro, pois a escala da exposição ao tabagismo passivo é grande, incluindo mulheres grávidas (WDOWIAK et al., 2009) e crianças(ASHFORD & WESTNEAT, 2012). No território brasileiro, a fumaça do cigarro está presente em 27,9% dos domicílios e 24,4% dos ambientes de trabalho (WÜNSCK FILHO et al., 2010). Destacam-se nos componentes da fumaça do cigarro, a nicotina e o monóxido de carbono (MELLO et al., 2001). A nicotina é uma das mais perigosas substâncias do tabaco, pois é capaz de difundir-se pela placenta (CLARK et al.,1992), além de liberar, no organismo materno, catecolaminas, causando no organismo: vasoconstrição periférica, taquicardia, aumento da pressão arterial, elevação da resistência periférica, acidose, hipercapnia respiratória, redução da perfusão sanguínea uterina e hipóxia (CZEKAJ et al., 2002) resultando em uma pobre nutrição e oxigenação fetal (NAKAMURA et al., 2004). O monóxido de carbono é produzido na queima incompleta do cigarro, e este realiza com a hemoglobina uma ligação estável. Weinberger & Weiss 19 (1996 apud NAKAMURA et al., 2004) relatam que fumantes, com consumo de 40 cigarros/dia, apresentavam elevação de 10% de carboxihemoglobina e a redução de 60% do fluxo fetal sanguíneo. O feto é extremamente sensível aos efeitos da hipóxia, causado pelo alto nível de carboxihemoglobina no sangue materno (SARTIANI et al., 2004). Em somatória, o tabagismo na mulher reduz globalmente a fertilidade, com evidente atraso da primeira gestação (MELLO et al., 2001). O tabagismo reduz a fertilidade, diminuindo 3,4 vezes a probabilidade de levar mais de um ano para a concepção em comparação a mulheres não fumantes (MELLO et al., 2001). Durante o fumo, a mulher expõe seu feto tanto aos componentes contidos no cigarro, muitos capazes de difundirem-se pela placenta quanto as alterações metabólicas desencadeadas pelo tabagismo (NAKAMURA et al., 2008). Na literatura, existem diversos relatos sobre a relação entre o baixo peso ao nascer, déficit de crescimento, risco aumentado de aborto espontâneo, maior incidência de gestações ectópicas, além de descolamento prematuro de placenta e parto prematuro (MELLO et al., 2001 e NAKAMURA et al., 2008). Todas as alterações citadas são, proporcionalmente, aumentadas com o número de cigarros consumidos por dia (MAINOUS & HEUSTON, 1994). Sendo estas alterações causadas pelo negativo impacto biológico do tabagismo materno na função placentária, como transferência de nutrientes, oxigênio, proteínas, além de mecanismo ainda desconhecidos (CHERTOK et al., 2010). Com destaque, observou-se que o fumo após o quarto mês é decisivo para a perda de peso fetal (CHIOLERO et al., 2005). Este parâmetro é relacionado com a morbimortalidade perinatal e infantil, com grande relevância em Saúde Pública (AZENHA et al., 2008). Chertok et al. (2010) sugerem que o baixo peso ao nascer seja decorrente de interações entre o genótipo metabólico materno e o hábito tabágico. Um estudo realizado por Wdowaik et al. (2009) demonstrou queda na porcentagem de peso entre filhos de gestantes fumantes ativas quando comparadas a fumantes passivas; sendo essa queda mais crítica em filhos de gestantes que consumiam acima de dez cigarros por dia (GALÃO et al., 2009), respondendo por 25 a 75g a menos no peso ao nascer nos recém-natos de mães expostas ao tabagismo (JADDOE, 2007). 20 O tabagismo materno impõe o feto a uma condição de hipóxia fetal, pela redução da capacidade da hemoglobina de liberar oxigênio (GALÃO et al., 2009), além da vasoconstrição dos vasos umbilicais, mediada pela inibição da produção de vasodilatadores nas paredes destes vasos (MELLO et al., 2001). Estes mecanismos podem ser os responsáveis pela redução do crescimento em filhos de mulheres fumantes, quando comparados a filhos de mães não fumantes (GALÃO et al., 2009). Em somatória, o parto prematuro (baixa idade gestacional) oferece a maior proporção dos casos de morte neonatal e morbidade a longo prazo, com destaque a mães com alta dependência da droga (CHERTOK et al., 2010). No recém-nascido, o tabagismo aumenta duas vezes o risco da síndrome da morte súbita em comparação com bebês não expostos (NEFF et al., 2004; SARTIANI et al., 2004; CAMPOS et al, 2008; NAKAMURA et al., 2004). Além dos efeitos descritos, há relato da relação entre mal formações fetais, como fenda oro-labial (LEITE et al., 2002), efeitos nos sinais vitais no nascimento, segundo Nakamura et al. (2008), demonstrados por baixos escores Apgar , a relação com problemas respiratórios, como redução do crescimento dos pulmões (MACHADO et al., 2009), comprometimentos do desenvolvimento do sistema nervoso central da criança (CAMPOS et al, 2008) e quadros de isquemia e hipóxia (CZEKAJ et al., 2002; NEFF et al., 2004; BAYKAN et al., 2005; CAMPOS et al, 2008) Além dos efeitos do hábito tabágico na mulher, as crianças e os recém- nascidos são particularmente vulneráveis aos efeitos perniciosos devido ao fato de estarem em desenvolvimento e à sua condição de criança, que a deixa sem opção perante a companhia de genitores tabagistas (CAMPOS et al, 2008). Em paralelo aos efeitos no desenvolvimento infantil, o fumo é capaz de alterar características do tecido muscular como alterações no tamanho das fibras, bem como modificações na atividade oxidativa muscular, tendência a atrofia e fagocitose de fibras (MONTES et al., 2002; NAKATANI et al., 2002; NAKATANI et al., 2003; DUBOWITZ & SEWRY, 2007; CAMARGO FILHO et al., 2011); sendo essas alterações compreendidas como resposta ao baixo fornecimento de energia, decorrente da baixa oxigenação (NAKATANI et al., 2002; NAKATANI et al., 2003). 21 Conjuntamente aos efeitos no músculo esquelético, o fumo é capaz de inibir a formação óssea, por ação da nicotina (ROTHEN et al., 2009; KIM et al., 2013). Em resposta a isso, existe a redução de 4% da densidade mineral óssea (DMO) em fumantes ativos quando comparados a não-fumantes (BJARNASON & CHRISTIANSEN, 2000; KIM et al., 2013), quando se lembra que a redução da DMO aumenta significantemente o risco de fraturas (KANIS et al., 2010; KIM et al., 2013). Em estudos animais a exposição de animais à fumaça do cigarro produziu a diminuição do tamanho de osteócitos (AJIRO et al., 2010; KIM et al., 2013), diminuição da quantidade dos osteoblastos e células da medula óssea (GAO et al., 2011; KIM et al., 2013). Dessa forma, esta dissertação se propõe a estudar os efeitos do tabagismo passivo durante a prenhez e lactação e as alterações promovidas pela associação do tabagismo passivo ao exercício físico durante o crescimento. Artigo 23 “Análise do desenvolvimento corporal de filhotes de ratas submetidas ao tabagismo passivo durante o período pré-natal: Estudo no período de lactação e a influência do exercício físico após a lactação” “Analysis of grownth of offspring rats submitted to passive smoking during the prenatal period and associated with swimming” Jacqueline Bexiga Urban1, Regina Celi Trindade Camargo2, Regiane Rocha Costalonga1, Taíse Mendes Biral3, Lidiane Aparecida de Macedo3, Luiz Carlos Marques Vanderlei4, José Carlos Silva Camargo Filho2 Trabalho realizado na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 1 Discente do Programa de Pós-Graduação - Mestrado em Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 2 Docente do Departamento de Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 3 Discente do Curso de Graduação em Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 4 Discente do Programa de Pós-Graduação - Mestrado em Matemática Aplica e Computacional da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. Correspondência: José Carlos Silva Camargo Filho 24 Departamento de Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. Rua Roberto Simonsen, 305; CEP 19060-900 – Presidente Prudente/SP Tel.: (18) 3229-5388 / Fax.: (18) 3229-5353; E-mail.: camargo@fct.unesp.br mailto:camargo@fct.unesp.br 25 RESUMO Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a mortalidade, peso, comprimento corporal e o músculo gastrocnêmio de filhotes submetidas à exposição de fumaça do cigarro e programa de natação. Métodos: Os filhotes foram gerados por matrizes controle (G1) e expostas a fumaça do cigarro (G2). As ratas advindas da gestação foram separadas após a lactação, segundo o grupo de suas matrizes, em G_CN (controle natação), G_CS (controle sedentário), G_FN (exposto natação) e G_FS (exposto sedentário). Foi obtido o peso corporal dos filhotes semanalmente, e o comprimento corporal, considerando o tamanho crânio-cóccix. Ao final do experimento foi realizada a análise morfométrica do músculo gastrocnêmio. Para a análise estatística, foi utilizado teste T independente, e ANOVA para medidas repetidas e ANOVA One-Way, adotando p < 0,05. Resultados: Não houve diferença significativa entre os grupos no número de filhotes (p=0,387). Os filhotes do grupo G1 apresentaram pesos maiores e comprimentos maiores a partir da primeira semana (p<0,0001), quando comparados aos filhotes do grupo G2. Tal diferença entre os grupos persistiu até a idade adulta. As medidas do diâmetro menor das fibras dos grupos G1FN e G1CS foram maiores em comparação ao G1CN. Conclusão: Observou-se que os filhotes submetidos ao tabagismo passivo durante sua gestação e lactação apresentaram alteração no crescimento e que a natação não demonstrou alterações importantes. Palavras-chaves: Exposição à fumaça do cigarro, Ratos Wistar/crescimento & desenvolvimento, Exercício físico, Lactação, Peso ao nascer. 26 ABSTRACT Purpose: The purpose of this study was to evaluate weight, body length and the gastrocnemius muscle of offspring of rats submitted to exposure to second-hand smoke and swimming program and. Methods: Ten female rats were divided into groups: G1 (control), G2 (exposed to cigarette smoke) and five male rats. The female pups were separated after lactation , the group from its headquarters in G_CN control (swimming), G_CS (sedentary control), G_FN (exposed swimming) and G_FS (exposed sedentary). The body weight of the pups was measured at six time points. The gastrocnemius muscle of the pups was obtained for evaluation of muscle development. For statistical analysis, was used ANOVA for repeated measures and ANOVA One-Way, considering p<0.05. Results: Puppies of G1 showed higher weights at birth (p=0.011) and longer lengths from the first week (p<0.0001) compared to pups of G2, the difference between the groups persisted into adulthood. The measured of smaller diameter fibers in G1CS and G1FN group was higher compared to G1CN. Conclusions: Observed that pups submitted to passive smoking during their pregnancy and lactation showed abnormalities in growth and the swimming protocol did not show significant changes. Keywords: Tobacco smoke pollution, Wistar/growth & development, Exercise, Lactation, Birth weight Rats. 27 “Análise do desenvolvimento corporal de filhotes de ratas submetidas ao tabagismo passivo durante o período pré-natal: Estudo no período de lactação e a influência do exercício físico após a lactação” “Analysis of grownth of offspring rats submitted to passive smoking during the prenatal period and associated with swimming” INTRODUÇÃO Gestantes e crianças são expostas ao tabagismo passivo em todo o mundo1,2 e somente nos Estados Unidos, nove milhões de crianças abaixo de cinco anos são expostas à fumaça do cigarro3. Considera-se tabagismo passivo, a inalação de fumaça e os derivados do tabaco (cigarro, cigarrilhas, cachimbo, charuto...), por pessoas não fumantes, mas que convivam com fumantes em ambiente fechado, sendo a ele atribuída a terceira maior causa de óbito no mundo, subsequente ao tabagismo ativo e ao consumo excessivo de álcool3,4. Os efeitos dessa condição durante o período pré-concepcional e gestacional são descritos na literatura 1,6 como: diminuição da fertilidade 6 , aumento do tempo para a concepção 6 , aumento do risco de aborto espontâneo 1,6 , maior risco de prematuridade 1,2,6 , déficit do desenvolvimento fetal 1,2,6,7,8 , menores índices de escores Apgar 1 , maior índice de mortalidade perinatal 1,2 , redução da produção láctea 6 , redução do ganho ponderal de peso durante a amamentação exclusiva 1,6 e desmame precoce 6 . Na infância, a exposição ao tabagismo passivo, pode reduzir níveis da função cognitiva 9 . Porém, o efeito do tabagismo passivo durante a infância não é totalmente elucidado. Em contraposição aos efeitos deletérios do cigarro, o exercício físico promove alterações morfológicas e características fisiológicas, reduz a morbimortalidade, melhora a capacidade funcional global, previne doenças 10,11 28 e estimula diversos sistemas corporais como o sistema muscular, cardiorrespiratório, nervoso e endócrino 12 . Levando-se em consideração os efeitos da fumaça do cigarro no período pré concepcional e gestacional, espera-se que: em um modelo experimental, a prole de ratas expostas à fumaça do cigarro apresente peso e comprimento menores do que as ratas não expostas, que as alterações promovidas pela fumaça do cigarro sejam persistentes até a idade adulta e também que os efeitos do exercício físico possam minimizar as ações promovidas pela fumaça de cigarro nos períodos pré-concepcional e gestacional explanados acima. OBJETIVOS Nesse sentido, o modelo experimental do presente estudo teve por objetivo: a) avaliar a influência do tabagismo passivo nos índices de fertilidade, incidência de aborto espontâneo e, durante o crescimento intrauterino, nas medidas de peso e comprimento corporal dos filhotes. b) Verificar os efeitos do tabagismo passivo materno durante a prenhez e lactação em conjunto com a associação do tabagismo passivo ao exercício físico durante o crescimento de filhotes nas mensurações de peso corporal, comprimento corporal, ganhos de peso e crescimento corporal e diâmetro menor das fibras do músculo gastrocnêmio. MÉTODOS Animais Para realização desse estudo foram utilizados 11 ratas virgens (72 dias de idade) e cinco machos, da linhagem Wistar (Rattus novergicus, var. albina, Rodentia, Mammalia), os quais foram mantidos em gaiolas individuais, sob temperatura média de 22 ± 2ºC, umidade de 50 ± 10%, ciclo claro/escuro de 12 horas (7-19h), tendo livre acesso à água e ração padrão da marca Primor®. Além disso, foram utilizados as filhotes fêmeas obtidas pela cópula desses 29 animais, mantidas em gaiolas coletivas (5 animais por gaiola) também sob as mesmas condições ambientais e nutricionais descritas acima. Todos os procedimentos utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição (Proc. nº 06/2011) e seguiu os “Princípios Éticos na Experimentação Animal”, adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL). Grupos Experimentais As ratas foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo: G1 (Grupo controle, n = 5) e G2 (Grupo exposto à fumaça do cigarro, n = 6). Com 90 dias de vida as ratas foram submetidas a um esfregaço vaginal para verificação da fase do ciclo estral e, após a comprovação da fase estro, cada rata foi colocada em gaiolas com um rato, onde permaneceram por uma noite para cópula. Na manhã seguinte, a prenhez foi diagnosticada pela presença de espermatozóide(s) no esfregaço vaginal, caracterizando o dia zero da prenhez12. Todos os filhotes gerados na gestação foram mantidos com as matrizes até o final da lactação, caracterizado no 21º dia de vida. Após esse período, as fêmeas foram divididas em sub grupos de acordo com o grupo de sua ascendente (Controle ou Exposto a fumaça do cigarro) da seguinte forma: a) Grupos das matrizes controles: Grupo exposto à fumaça do cigarro e natação (G1FN; n=08), grupo exposto à fumaça do cigarro e sedentário (G1FS; n=05), grupo controle e natação (G1CN; n=06), grupo controle sedentário (G1CS; n=04); b) Grupos das matrizes expostos à fumaça do cigarro: Grupo exposto à fumaça do cigarro e natação (G2FN; n=08), grupo exposto à fumaça do cigarro e sedentário (G2FS; n=04); grupo controle e natação (G2CN; n=04) e grupo controle e sedentário (G2CS; n=05). Desenho Experimental 30 Para realização do procedimento experimental, as matrizes foram divididas em dois grupos (G1 – grupo controle e G2 – grupo exposto à fumaça do cigarro) aos 72 dias de vida, após a divisão, as ratas do grupo G2 iniciaram o protocolo de exposição ao tabagismo passivo. Com 90 dias de vida, as ratas que estavam na fase estro do ciclo estral foram colocadas com um macho para cópula. Após confirmada a prenhez elas foram alocadas em gaiolas individuais e acompanhadas diariamente, em busca de evidências de aborto espontâneo. Após a realização do parto foi determinado o número de filhotes nascidos vivos e mortos. Os filhotes tiveram o peso e o comprimento mensurados no primeiro, sétimo, 14º e 21º dia de vida. Ao 21º dia de vida dos filhotes, foi realizado o término da exposição ao tabagismo passivo das matrizes do grupo G2. Na 5ª semana de vida foi realizada a divisão os filhotes. As fêmeas foram selecionadas e divididas em oito grupos (G1FN, G1FS, G1CN, G1CS, G2FN, G2FS, G2CN e G2CS). Também na 5ª semana de vida dos filhotes, foi iniciado o protocolo de natação dos filhotes (G1FN, G1CN, G2FN e G2CN), com 30 sessões ao total. Em somatória, foi iniciado na 6ª semana de vida dos filhotes o protocolo de exposição a fumaça do cigarro dos filhotes (G1FN, G1FS, G2FN e G2FS), com 25 sessões. Durante os protocolos de natação e exposição à fumaça do cigarro foram obtidos o peso e comprimento corporais, na 6ª, 11ª, 16ª, 21ª e 26ª sessões de natação (respectivamente, 1ª, 6ª, 11ª, 16ª e 21ª sessão de exposição à fumaça do cigarro). Ao final dos protocolos, foi obtido o delta de ganho de peso e comprimento corporal com os dados do início e do fim do treinamento. Após o fim dos protocolos, foi realizada a eutanásia dos animais, os quais tiveram o seu músculo gastrocnêmio retirado para análise do diâmetro médio das fibras musculares. Programa de exposição à fumaça do cigarro 31 O protocolo de exposição à fumaça de cigarro realizado pelas matrizes (G2) e pelos filhotes expostos a fumaça do cigarro (G1FN, G1FS, G2FN e G2FS) foi dividido em duas fases: a) Fase de adaptação: compreendida pelos primeiros cinco dias de exposição à fumaça de cigarro na câmara de fumo a uma temperatura de 23 ± 1°C13, durante 10 minutos, uma vez ao dia, com 250 ppm (partes por milhão) de CO (monóxido de carbono) medido por um detector de gás específico (ToxiPro® da Biosystems); b) Fase experimental: que compreendeu da 6º sessão em diante, com duração da sessão de 30 minutos, duas vezes ao dia (manhã e tarde), cinco dias por semana, com 350 ppm de CO por exposição12. A dose da fase experimental equivale à consumida por fumantes crônicos, por totalizar em média dois cigarros/dia/animal12. Para a realização deste protocolo foi utilizada uma câmara para inalação de fumaça dividida em dois compartimentos: um para a colocação de cigarros acesos; e outro destinado à exposição da gaiola com seis animais, sendo adaptada segundo o modelo de inalação descrito por Cendon et al.15 Foram utilizados cigarros, adquiridos comercialmente, compostos por: mistura de fumos, açúcares, papel de cigarro, extratos vegetais e agentes de sabor, que produziram em cada queima: 9,3 ± 0,93 mg/cig de alcatrão, 0,78 ± 0,078 mg/cig de nicotina e 8,0 ± 1,2 mg/cig de monóxido de carbono, conforme relatado na embalagem do produto. As matrizes do G2 iniciaram o protocolo de exposição a fumaça de cigarro com 72 dias e vida e realizaram esse protocolo até o 21º dia de vida dos filhotes, totalizando um mínimo 34 sessões de exposição. Já os filhotes iniciaram sua exposição à fumaça de cigarro na sexta semana de vida e realizaram 25 sessões de exposição. As matrizes e filhotes do G1 foram submetidos à inalação de ar comprimido em uma outra câmara, com as mesmas características de tempo e periodicidade dos animais expostos ao fumo. 32 Programa de natação O programa de natação foi realizado em um tanque contendo água a 30ºC no nível de 40 cm, com finalidade de não permitir apoio da cauda dos filhotes no fundo do tanque, visando o estímulo de nadar (Volpato et al.)16, e foi dividido em duas fases: a) Fase de adaptação ao treinamento: compreendida pelas cinco primeiras sessões de exercício, com aumento progressivo de 10 minutos de duração por dia, iniciando com 20 minutos e chegando à quinta sessão com 60 minutos; b) Fase de treinamento: iniciada na sexta sessão, com tempo de duração de 60 minutos até a 30ª sessão, sem sobrecarga17. As sessões de exercício foram diárias, contínuas, realizadas no período vespertino, cinco dias na semana, durante 30 sessões. No caso específico dos grupos G1FN e G2FN, o protocolo de natação foi realizado após a exposição à fumaça do cigarro. Os animais sedentários foram submetidos às mesmas condições do programa de natação, contudo, com água a 10cm por 15 minutos, para que sofressem o mesmo estresse do meio líquido, entretanto sem o estímulo de nadar14. Análise da taxa de fecundidade, abortos e animais nati-mortos Para avaliação desses parâmetros, após a confirmação da prenhez das ratas as gaiolas foram observadas para verificação de abortos espontâneos e, após o parto, foi obtido o número de filhotes nascidos vivos e mortos8. Peso e comprimento corporal 33 Durante a lactação (1º dia, 7º dia, 14º dia e 21º dia de vida), foram mensurados o peso e o comprimento nasoanal. Durante o treinamento essas mesmas medidas foram feitas na 6ª sessão, 11ª sessão, 16ª sessão, 21ª sessão e 26ª sessão de treinamento. Para a pesagem foi utilizada uma balança eletrônica digital (Marte, modelo ASF11, Brasil), com capacidade máxima 500g e mínima 0,002g. A mensuração do comprimento nasoanal foi realizada por meio de uma régua milimetrada6. Os deltas de ganho de peso e crescimento corporal durante o treinamento foram obtidos pela subtração das medidas de peso e comprimento nasoanal observadas na 26ª sessão de treinamento pelas medidas da 1ª sessão de treinamento16. Diâmetro das Fibras Musculares Para mensuração do diâmetro das fibras musculares, após 48 horas da 30ª sessão de treinamento, os filhotes foram anestesiados com xilazina (40 mg/kg, i.p.) e ketamina (40 mg/kg, i.p.)7 e, após confirmada a anestesia, foi injetado cerca de 1ml de KCl a 10% no ventrículo esquerdo até obter parada cardíaca em diástole. Depois de confirmada a eutanásia, os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico para extração do músculo esquelético gastrocnêmio do membro direito, sendo seus fragmentos congelados pelo sistema de imersão em N-Hexana resfriada a -70ºC, e armazenados em freezer (ColdLab ®– Ultra Freezer CL5880-80V) (-80°C). A microtomia foi realizada em micrótomo criostato (HM 505 E Microm, Alemanha) e as lâminas foram confeccionadas com cortes de 5 μm e coradas pelo método hematoxilina-eosina (HE)18. Foram mensurados os menores diâmetros de 120 fibras por animal8, por meio de uma câmera de alta resolução acoplada ao microscópio óptico (Eclipse 50i H550S - Nikon®) com objetiva com aumento de 20 vezes, e observadas por 34 meio de um sistema de análise computadorizada (software NIS-ElementsD3.0 – SP7 - Nikon®)18. Análise Estatística Depois de obtidos peso, comprimento e os diâmetros mínimos do músculo gastrocnêmio, foi realizada análise descritiva com média e erro padrão. Para o estudo da comparação entre os grupos de matrizes aplicou-se o teste T independente. Para a comparação dos pesos e comprimentos dos filhotes no período de treinamento, foi aplicada a análise de variância ANOVA, com pós-teste de Tukey, ao nível de significância de 5%. Para a análise do menor diâmetro das fibras musculares foi utilizada a análise de variância (ANOVA One-Way) e pós-teste de Tukey. Os resultados seguem distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk, com nível de significância de 5%) e os grupos são independentes. Para todas as análises foi utilizado o programa Statistical Analysis System – SAS. RESULTADOS Fecundidade Levando-se em consideração a taxa de fecundidade, o grupo exposto à fumaça do cigarro (8,50±0,40 filhotes por matriz) apresentou fecundidade levemente menor que o grupo controle (10,40±1,97 filhotes por matriz), porém, não houve diferença estatística (p=0,387). Durante o experimento, somente uma rata (grupo G2) apresentou sinais de ocorrência de aborto espontâneo (13 filhotes abortados). Assim, o evento único não foi capaz de demostrar diferença estatística em comparação ao grupo G1 (p=0,389). Da mesma forma, uma rata 35 do grupo G1, apresentou filhotes natimortos (04 filhotes natimortos), mas não promovendo diferença em relação ao grupo G2 (p=0,374) (Tabela 01). Inserir Tabela 1 Mensurações corporais na lactação No momento do nascimento, os filhotes das matrizes do grupo controle (G1) não presentaram peso estatisticamente diferente (p=0,890) que os filhotes das matrizes expostas a fumaça do cigarro (G2). Da mesma forma, não houve diferença entre o tamanho corporal dos filhotes (p=0,079). A partir da segunda semana até o 21º dia de lactação, a medida de peso (7, 14 e 21 dias = p<0,001) e comprimento dos filhotes (7, 14 e 21 dias = p<0,001) do grupo G1 foram estatisticamente maiores em relação aos filhotes do grupo G2 (Tabela 02). Inserir Tabela 2 Mensurações corporais no Treinamento Durante a sexta sessão de treinamento, o grupo G1FS apresentou pesos corporais maiores quando comparados aos pesos dos filhotes do grupo G2FN (p<0,05). Não houve diferença estatística entre os grupos na 11ª sessão de treinamento (p=0,39). Já na 16ª sessão de treinamento, o grupo G1CN apresentaram pesos corporais menores que o grupo G2FS (p<0,01); porém, foram encontradas medidas de peso corporal maiores no grupo G1CN em relação ao grupo G2CN (p<0,05). Da mesma forma o grupo G1FS apresentou pesos corporais maiores que os grupos G1FN (p<0,05), G2FN (p<0,001), G2FS (p<0,05) e G2CN (p<0,01). Entretanto, na 21ª sessão de treinamento, não houve diferenças estatísticas entre os grupos (p=0,0546). Contudo, na 26ª sessão de treinamento, o grupo G1CS apresentou pesos maiores que os grupos G1FN, G1FS, G2FN, G2FS, G1CN, G2CN e G2CS (p<0,001 para todas as diferenças). Em somatória, o grupo G1CN obteve mensurações maiores de 36 peso em comparação ao grupo G2FN (p<0,05) e G2CN (p<0,05). Assim como o grupo G1FS demonstrou peso corporal maior que os grupos G2FN (p<0,001), G2FS (p<0,05) e G2CN (p<0,001) (Tabela 03). Inserir Tabela 03 Em consideração ao comprimento corporal, o grupo G1CN apresentavam medidas maiores de comprimento corporal que os grupos G1FN (p<0,05) e G2FN (p<0,01) na sexta sessão de treinamento. Já na 11ª sessão de treinamento, o grupo G1FS demonstrou mensurações maiores que os grupos G1CS (p<0,01) e G2FN (p<0,001). Entretanto, na 16ª sessão, a única diferença estatística encontrada foram as medidas menores do grupo G2FN quando comparadas as medidas apresentadas do grupo G1FN (p<0,05). Nas mensurações da 26ª sessão, o grupo G1CS apresentaram comprimentos corporais maiores que os grupos G1CS, G1FN, G1FS, G2CS, G2CN, G2FN, G2FS (p<0,001 para todas as diferenças) (Tabela 04). Inserir Tabela 04 No delta de ganho de peso, não houve diferença estatística entre os grupos (p=0,0917). Porém, no delta de crescimento corporal, o grupo G1CS apresentou maior crescimento quando comparado aos grupos G1FN (p<0,01), G1FS (p<0,001) e G2FN (p<0,001). De forma semelhante, o grupo G1FN teve crescimento estatisticamente maior que os grupos G2CS (p<0,05) e G1CN (p<0,01) (Tabela 05). Inserir Tabela 05 Medida do menor diâmetro Em relação ao desenvolvimento muscular, as ratas do grupo controle exercitado provenientes de matrizes controle (G1CN) apresentaram diâmetro das fibras do músculo gastrocnêmio maior em comparação ao grupo exposto à 37 fumaça do cigarro exercitado (G1FN) e grupo controle sedentário (G1CS); ambos provenientes de matrizes controle (p<0,05) (Tabela 06). Inserir Tabela 06 DISCUSSÃO No presente estudo foi testada a hipótese de que o tabagismo passivo influenciaria de forma negativa no desenvolvimento dos filhotes de ratas desde sua concepção até a idade adulta, podendo ser minimizada pela prática de natação. Verificou-se que para o número de matrizes do estudo, não houve diferença no número de filhotes gerados por grupo. Sabe-se que os períodos intrauterinos e neonatal exercem maior influência sobre o crescimento e as condições de saúde do indivíduo10. Dessa forma, as alterações negativas no crescimento encontradas nos filhotes, em especial no período de lactação, pode-se dever a influência negativa do tabagismo, causado pelo estresse oxidativo promovido pela nicotina e pelo monóxido de carbono no organismo materno, induzindo liberação de catecolaminas, vasoconstrição generalizada materna, com destaque para vasoconstrição placentária, promovendo isquemia fetal13,20 e uma nutrição fetal diminuída. No presente estudo, não foi encontrado menores pesos ao nascer dos filhotes das matrizes expostas ao fumo em comparação a matrizes controle, como encontrado por Ino (2010) 21 e Suzuki (2011) 22 . Durante a lactação, verificou-se que os parâmetros de peso e comprimento dos filhotes das matrizes controle distanciaram-se dos parâmetros correspondentes da prole das ratas expostas ao tabagismo passivo. Durante o treinamento, as maiores medidas, de peso e comprimento corporais, eram averiguadas nos animais gerados por matrizes controle. Em 38 especial, ao fim do treinamento, os grupos sedentários apresentavam maiores medidas corporais finais, devido a menor demanda energética quando comparados aos animais do seu grupo similar exercitado, assim como o encontrado por Nery et al. (2011)19. Estudos apontam para uma tendência de peso e massa gordurosa maiores em filhotes expostos a nicotina no período perinatal em comparação a ratos controles, que se apresenta inicialmente na infância e persiste até a idade adulta23,24. Porém, no presente estudo foi verificada a permanência de baixo peso do nascer à idade adulta dos grupos de matrizes expostas com seu similar grupo proveniente de matriz controle, assim como encontrado no estudo de Gao et al. (2011) 25 . Em relação ao exercício físico, sabe-se que ele é benéfico à saúde, porém as alterações por ele provocadas são dependentes da intensidade, duração e frequência do esforço10. No atual estudo, como maneira geral, o exercício atuou como regulador do peso das ratas exercitadas. Durante o treinamento, não houve diferença estatística no parâmetro delta de ganho de peso, porém, os grupos G1CS (quando comparado aos grupos G1FS, G2FN e G1CS) e G1FN (quando comparado aos grupos G1CN e G2CS) apresentavam deltas de crescimento corporal maiores que outros grupos. No estudo de Nery et al (2011), o exercício promovia menor ganho de peso; contudo, no estudo de Melo et al. (2013)26, a prática do exercício físico não influenciava o peso dos animais. Porém não foi encontrado estudos que estudaram o crescimento corporal em situações similares. Os resultados da medida do menor diâmetro das fibras do músculo gastrocnêmio demonstraram maiores mensurações no grupo G1CN em comparação aos grupos G1FN e G1CS. Na literatura, o fumo é relatado como influente nas características musculares, como alteração no tamanho das fibras e modificações na atividade oxidativa do músculo. Acredita-se que a ação vasoconstritora da nicotina e aumento dos níveis de carboxihemoglobina no sangue, relatados acima, sejam os mecanismos para alterações musculares como as encontradas no estudo de Camargo Filho et al. (2011) 18 . Outra explicação seria que a somatização de estresse provocada pela associação do 39 tabagismo passivo ao exercício de natação, provocando a diminuição do diâmetro menor das fibras do músculo gastrocnêmio. Nos estudos de Camargo Filho et al. (2011) 18 e Melo et al. (2013) 26 , foi encontrada diminuição dos valores de diâmetro médio das fibras musculares do músculo gastrocnêmio no grupo controle sedentário quando comparado ao grupo controle exercitado, porém sem diferença estatística entre os dados, como o verificado no presente estudo. Limitações Encontra-se como limitação deste estudo, não ter sido avaliado o peso corporal das ratas durante todo o período compreendido entre o nascimento e a idade adulta e um estudo histoquímico para a tipagem das fibras musculares do músculo gastrocnêmio, a fim de verficiar alterações promovidas pelos protocolos na tipagem. CONCLUSÃO Observou-se que os filhotes submetidos ao tabagismo passivo durante sua gestação e lactação apresentaram alteração no crescimento e que a natação não demonstrou alterações importantes. Além disso, a exposição ao tabagismo e a ausência da prática da natação diminuiu o diâmetro da musculatura esquelética. 40 REFERÊNCIAS 1. Galao AO, Soder AS, Gerhardt M, Faertes TH, Kruguer MS, Pereira DF, Borba CM. Efeitos do fumo materno durante a gestação e complicações perinatais. Rev HCPA. 2009; 29(3):218-24. 2. Wdowiak A, Wiktor H, Wdowiak L. Maternal passive smoking during pregnancy and neonatal health. Ann Agric Environ Med. 2009; 16:309-12. 3. 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Jiang W, Shen H, Luo W, Xu W, Tian J, Lei G. Bone turnover in passive smoking female rat: relationships to change in bone mineral density. BMC Musculoskeletal Disorders. 2011, 12:131. 43 26. Melo MPP, Vasconcelos ACS, Santos PCP, Monteiro HMC, Santos AA, Maia LMSS, Evêncio LB. L-Arginine and physical exercise interferenceon the morphology of the skeletal muscle in young rats. Rev Bras Med Esporte. 2012, 19(4):287-91. 44 TABELAS Tabela 01 – Média seguida de desvio padrão do número de filhotes por rata e número de incidência de aborto e natimortos. Número de Filhotes Incidência de Aborto Incidência de Natimortos G1 10,40 ± 0,400 - 01 G2 8,50 ± 1,979 01 - G1: grupo controle e G2: grupo exposto à fumaça de cigarro 45 Tabela 02 – Média e erro padrão do peso e comprimento corporal dos filhotes durante a lactação. G1 G2 p Peso Corporal Nascimento 6,67 ± 0,84 6,65 ± 0,67 0,890 7 Dias 12,50 ± 0,87 10,85 ± 1,69 <0,001 14 Dias 27,34 ± 4,60 21,87 ± 1,71 <0,001 21 Dias 34,13 ± 1,74 29,57 ± 2,55 <0,001 Comprimento Corporal Nascimento 5,20 ± 0,24 5,06 ± 0,35 0,079 7 Dias 6,46 ± 0,37 6,10 ± 0,45 <0,001 14 Dias 8,67 ± 0,79 7,76 ± 0,56 <0,001 21 Dias 10,43 ± 0,35 9,36 ± 0,71 <0,001 G1: grupo controle e G2: grupo exposto à fumaça de cigarro. 46 Tabela 03 – Média e desvio padrão do peso corporal dos filhotes durante o protocolo de natação. 6ª Sessão 11ª Sessão 16ª Sessão 21ª Sessão 26ª Sessão G1FN 205,31 ± 8,62 218,33 ± 14,05 213,00 ± 13,98 a 226,51 ± 13,78 232,91 ± 15,44 b G1FS 217,92 ± 22,29 c 219,18 ± 21,96 242,18 ± 18,67 c, d, f 249,48 ± 21,61 267,24 ± 26,56 c, d, e, f G2FN 173,75 ± 15,15 187,67 ± 13,33 196,85 ± 11,81 g 221,06 ± 37,66 209,24 ± 14,61 g, h G2FS 190,07 ± 9,44 190,67 ± 10,91 206,47 ± 11,25 227,00 ± 7,49 222,40 ± 9,86 G1CS 184,30 ± 47,33 201,15 ± 19,56 229,20 ± 18,08 260,77 ± 58,94 348,80 ± 33,47 i, j, k G1CN 205,40 ± 21,15 184,83 ± 82,90 230,00 ± 22,82 l 234,88 ± 24,81 246,88 ± 23,89 l G2CS 209,70 ± 15,83 203,62 ± 15,34 216,42 ± 15,77 227,34 ± 17,80 226,40 ± 17,57 G2CN 176,50 ± 13,15 181,77 ± 13,47 195,27 ± 7,67 192,52 ± 7,95 197,17 ± 8,55 Letras significam diferenças estatísticas entre os grupos: a G1FN x G1FS; b G1FN x G1CS; c G1FS x G2FN; d G1FS x G2FS; e G1FS x G1CS; f G1FS x G2CN; g G2FN x G1CS; h G2FN x G1CN; i G1CS x G1CN; j G1CS x G2CS; k G1CS x G2CN; l G1CN x G2CN. G1CN: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1CS: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G1FN: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1FS: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2CN: Grupo proveniente de 47 matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2CS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2FN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2FS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e sedentário. 48 Tabela 04 - Média e desvio padrão do comprimento corporal dos filhotes durante o protocolo de natação. 6ª Sessão 11ª Sessão 16ª Sessão 21ª Sessão 26ª Sessão G1FN 17,62 ± 0,51a 19,75 ± 0,70 19,75 ± 0,70b 19,06 ± 0,77 20,31 ± 0,79c G1FS 18,40 ± 0,54 19,60 ± 0,89 d, e 19,60 ± 0,89 19,80 ± 0,83 20,20 ± 0,83 e G2FN 17,37 ± 1,30 f 18,65 ± 0,74 18,65 ± 0,74 18,68 ± 1,16 19,50 ± 0,53 g G2FS 18,00 ± 0,81 19,00 ± 0,00 19,00 ± 0,00 19,25 ± 0,50 19,25 ± 0,50 h G1CS 18,25 ± 0,50 19,62 ± 0,75 19,62 ± 0,75 19,25 ± 0,95 23,00 ± 0,81 i, j, k G1CN 19,33 ± 1,21 19,08 ± 0,20 19,08 ± 0,20 19,50 ± 0,54 19,66 ± 0,81 G2CS 18,20 ± 0,44 18,80 ± 0,44 18,80 ± 0,44 19,60 ± 0,89 10,20 ± 0,83 G2CN 18,25 ± 0,50 18,75 ± 0,50 18,75 ± 0,50 18,75 ± 0,50 19,25 ± 0,95 Letras significam diferenças estatísticas entre os grupos: a G1FN x G1CN; b G1FN x G2FN; c G1FN x G1CS; d G1FS x G2FN; e G1FS x G1CS; f G2FN x G1CN; g G2FN x G1CS; h G2FS x G1CS; i G1CS x G1CN; j G1CS x G2CS; k G1CS x G2CN. G1CN: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1CS: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G1FN: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1FS: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2CN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2CS: Grupo proveniente de matriz exposta à 49 fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2FN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2FS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e sedentário. 50 Tabela 06 – Média e desvio padrão do delta de ganho de peso e crescimento corporal Grupo Δ Peso Δ Crescimento G1FN 27,60 ± 15,14 2,68 ± 0,80 a, b, c G1FS 49,32 ± 16,07 1,80 ± 0,83 d G2FN 35,48 ± 15,95 2,12 ± 1,00 e G2FS 32,68 ± 5,49 1,20 ± 0,83 G1CS 167,78 ± 37,93 4,60 ± 0,54 G1CN 41,48 ± 12,13 0,83 ± 0,75 G2CS 16,70 ± 8,62 1,00 ± 0,70 G2CN 20,47 ± 11,17 1,50 ± 0,57 Letras significam diferenças estatísticas entre os grupos: a G1FN x G1CS; b G1FN x G1CN; c G1FN x G2CS; d G1FS x G1CS; e G2FN x G1CS. G1CN: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1CS: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G1FN: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1FS: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2CN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2CS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2FN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2FS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e sedentário. 51 Tabela 05 – Média e desvio padrão da medida de menor diâmetro das fibras musculares do músculo gastrocnêmio. Grupo Diâmetro G1CN 49,71 ± 0,09a G1CS 34,45 ± 0,51 G1FN 34,46 ± 0,43 G1FS 45,27 ± 0,75 G2CN 40,94 ± 0,36 G2CS 37,20 ± 0,23 G2FN 44,98 ± 0,37 G2FS 38,47 ± 2,33 a Diferença significativa entre os grupos G1CN em relação aos grupos G1CS e G1FN (p<0,05). G1CN: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1CS: Grupo proveniente de matriz controle, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G1FN: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G1FS: Grupo proveniente de matriz controle, exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2CN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2CS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, não exposto à fumaça do cigarro e sedentário; G2FN: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e exercitado; G2FS: Grupo proveniente de matriz exposta à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro e sedentário. Artigo 53 “Estudo da influência do tabagismo passivo no período de intra-uterino e lactacional e a ação do exercício físico após a lactação no conteúdo mineral ósseo e na densidade mineral óssea” “The influence of passive smoking in the intrauterine and lactational period with physical exercise after lactation on bone mineral content and bone mineral density” Jacqueline Bexiga Urban1, Regiane Rocha Costalonga1, Mário Jefferson Quirino Louzada², Rômulo Araújo Fernandes³, Regina Celi Trindade Camargo4, José Carlos Silva Camargo Filho5 Trabalho realizado na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 1 Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 2 Professor Doutor do Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária – FMVA/UNESP – Araçatuba (SP), Brasil. 3 Professor Assistente Doutor do Departamento de Educação Física da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 4 Professora Assistente do Departamento de Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. 5 Professor Doutor do Departamento de Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. Correspondência: José Carlos Silva Camargo Filho Departamento de Fisioterapia da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – FCT/UNESP – Presidente Prudente (SP), Brasil. Rua Roberto Simonsen, 305; CEP 19060-900 – Presidente Prudente/SP 54 Tel.: (18) 3229-5388 / Fax.: (18) 3229-5353; E-mail.: camargo@fct.unesp.br 55 RESUMO Objetivo: O objetivo desse estudo é investigar o efeito do tabagismo passivo durante a prenhez e associado a natação no crescimento de ratos na área óssea, densidade mineral óssea (DMO) e no conteúdo mineral ósseo (CMO). Métodos: Os filhotes foram gerados por matrizes controle (G1) e expostas à fumaça do cigarro (G2). Os filhotes foram reagrupados em 8 subgrupos, respeitando o grupo de matrizes em: controle sedentário (G1CS e G2CS), controle natação (G1CN e G2CN), tabagista passivo sedentário (G1FS e G2FS) e tabagista passivo natação (G1FN e G2FN). O protocolo de exposição a fumaça aconteceu entre o 72º dia de vida das matrizes até o fim da lactação dos filhotes e a partir da 6ª semana de vida dos filhotes, com doses equivalentes a fumantes crônicos. O exercício de natação foi iniciado na quinta semana de vida dos filhotes sendo realizado 5 dias/semana e se estendeu juntamente com a exposição até a 30ª sessão de natação. A área, DMO e CMO foram aferidas pela tíbia e pelo fêmur e analisados pelo dual X-ray absorptiometry. Os resultados foram analisados pelo teste de ANOVA One- Way, com pós-teste de Tukey, ao nível de significância de 5%. Resultados: No estudo do CMO da tíbia, foi observado taxa melhor no grupo G2CN quando comparado aos filhotes dos grupos G1CS (p=0,014), G1CN (p=0,023) e G1FN (p=0,008). Na averiguação da DMO no fêmur, foi observado maior taxa de densidade no grupo G1FS quando confrontado aos grupos G2CS (p=0,004), G2CN (p<0,001), G2FS (p=0,008) e G2FN (p<0,001). Já no estudo da tíbia, os animais do grupo G1FS apresentaram maiores taxas quando comparado aos grupos G2CS (p=0,003) e G2FN (p=0,007). Conclusões: O modelo de filhotes machos expostos ao fumo passivo durante a desenvolvimento fetal apresentou uma forte diminuição dos parâmetros analisados. Palavras-chaves: Exercício físico, Exposição à fumaça do cigarro, Ratos Wistar/crescimento & desenvolvimento, Lactação, Peso ao nascer. 56 ABSTRACT Objective: The aim of this study is to investigate the effect of passive smoking during pregnancy and associated with swimming in the growth of rats on bone area, bone mineral density (BMD) and bone mineral content (BMC). Methods: Newborn rats were generated by control mothers (G1) and exposed to cigarette smoke (G2). The pups were grouped into 8 subgroups, respecting the group of matrices: sedentary control (G1CS and G2CS), control swimming (G1CN and G2CN), sedentary passive smoker (G1FS and G2FS) and passive smoker swimming (G1FN and G2FN). The protocol for exposure to smoke occurred between the 72 th day of life mothers until the end of lactation and the pups from the 6th week of the puppies life, with doses equivalent to chronic smokers . The swimming exercise was initiated in the fifth week of life the chicks being conducted 5 days/week and extended along with exposure to the 30th session of swimming. The area, BMD and BMC were measured by the tibia and femur and analyzed by dual X- ray absorptiometry. The results were analyzed by one-way ANOVA test with Tukey post-test, at a significance level of 5 %. Results: In the study in BMC of the tibia, best rate was observed in G2CN group compared to offspring of G1CS groups (p=0.014), G1CN (p=0.023) and G1FN (p=0.008). In the investigation of BMD in the femur , greater density ratio was observed in the group when confronted G1FS G2CS groups (p = 0.004), G2CN (p < 0.001) , G2FS (p=0.008) and G2FN (p<0.001). In the study of the tibia, the animals G1FS group had higher rates compared to G2CS groups (p=0.003) and G2FN(p=0.007). Conclusions: The model of male offspring exposed to secondhand smoke during fetal development showed a strong decrease in the parameters analyzed. Keywords: Exercise, Exposure to cigarette smoke, Wistar/growth & development, Lactation, Birthweight. 57 “Estudo da influência do tabagismo passivo no período de intra-uterino e lactacional e a ação do exercício físico após a lactação no conteúdo mineral ósseo e na densidade mineral óssea” “The influence of passive smoking in the intrauterine and lactational period with physical exercise after lactation on bone mineral content and bone mineral density” INTRODUÇÂO Sabe-se que o exercício físico tem um importante papel no desenvolvimento ósseo1. É conhecido a associação do exercício físico com a redução da reabsorção óssea e o aumento da formação óssea, dessa forma, sendo realizado como estratégia de redução da fragilidade óssea e do risco de fraturas1, muito comuns na infância(referenciar). Entre os indicadores clínicos de saúde óssea pode-se ressaltar o conteúdo mineral ósseo (CMO) e a densidade mineral óssea (DMO)2. Atividade física com suporte de peso são relatadas como favorecedoras do aumento do CMO e da DMO, porém, não há consenso em relação a exercícios sem suporte de peso, como a natação2. Em contraposição aos benefícios do exercício físico, o efeito da nicotina, um dos componentes do cigarro, é indicado como deteriorante ao tecido ósseo3, e aparece estar associado ao mecanismo dose-resposta4. Por fim, sabe-se que o esqueleto humano e o esqueleto dos ratos apresentam respostas similares a influências mecânicas, hormonais e de outros agentes2. Dessa forma, o estudo vem com uma hipótese de que o tabagismo passivo poderia alterar negativamente o crescimento de ratos desde o período intra-útero até a idade adulta, tendo sua influência minimizada pelo exercício físico. Dessa forma, pretende-se avaliar a formação óssea na exposição ao tabagismo passivo durante o período intra-útero e associado ao exercício físico durante o crescimento nas medidas de DMO e CMO. MÉTODOS 58 Animais e Desenho Experimental Foram utilizados inicialmente 15 animais, sendo 11 ratas virgens e 4 ratos (72 dias de idade), da linhagem Wistar (Rattus novergicus, var. albina, Rodentia, Mammalia), mantidos em gaiolas individuais, sob temperatura média de 22 ± 2ºC, umidade de 50±10%, ciclo claro/escuro de 12 horas (7-19h) e tiveram livre acesso à água e ração padrão da marca Primor®. As ratas foram divididas aletoriamente em dois grupos, sendo: G1 (Grupo controle, n=5) e G2 (Grupo exposto à fumaça do cigarro, n=6). O início do protocolo de exposição foi iniciado no 72º dia de vida das matrizes e teve seu término ao fim da lactação. Ao chegarem ao 90º dia de vida, as ratas foram submetidas a um esfregaço vaginal para verificação da fase do ciclo estral, caso fosse observada a fase estro, as ratas foram colocadas em gaiolas individuais com um rato, onde permaneceram por uma noite para cópula. Na manhã seguinte, a prenhez foi diagnosticada pela presença de espermatozoide(s) no esfregaço vaginal, o que caracterizou o dia zero da prenhez5. Os filhotes machos foram mantidos com as matrizes até o fim da lactação, 21º dia de vida, e após divididos em subgrupos de acordo com o grupo de sua ascendente. Os ratos foram divididos aleatoriamente em: G1FN (n=14) e G2FN (n=15) (Grupo exposto à fumaça do cigarro e exercitado); G1FS (n=10) e G2FS (n=09) (Grupo exposto à fumaça do cigarro e sedentário); G1CN (n=11) e G2CN (n=10) (Grupo controle exercitado); e G1CS (n=08) e G2CS (n=10) (Grupo controle sedentário). O protocolo de adaptação ao meio líquido teve início na quinta semana de vida dos filhotes, e na sexta semana de vida foi iniciado o protocolo de treinamento físico e a exposição à fumaça do cigarro. Este estudo utilizou o procedimento técnico experimental aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Campus de Presidente Prudente, sob o Processo no 06/2011, sendo seguidos os “Princípios Éticos na Experimentação Animal” adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL). Programa de exposição à fumaça do cigarro 59 Foram realizados dois períodos distintos do estudo com exposição à fumaça do cigarro. O primeiro período ocorreu quando as ratas chegaram a 72 dias de vida e o segundo período no mesmo dia que ocorreu a sexta sessão de natação dos filhotes. O protocolo de exposição à fumaça de cigarro, foi sub-dividido em duas fases: . Fase de adaptação: compreendida pelos primeiros cinco dias de exposição do grupo G1 à fumaça de cigarro na câmara de fumo a uma temperatura de 23±1°C6, durante 10 minutos, uma vez ao dia, com 250 ppm (partes por milhão) de CO (monóxido de carbono) medido pelo detector de gás específico (ToxiPro® da Biosystems); e . Fase experimental: compreendeu da 72º dia de vida das matrizes até o fim da lactação para o grupo G2 e da 6º sessão até o 21º dia de lactação dos filhotes, com a sessão com duração de 30 minutos, duas vezes ao dia (manhã e tarde), cinco dias por semana, com 350 ppm de CO por exposição7. Para melhor assimilação ao consumo de fumantes crônicos, a dose experimental foi totalizada em média a dois cigarros/dia/animal5. Os animais dos grupos G1 foram submetidos à inalação de ar comprimido, com as mesmas características de tempo e periodicidade dos animais expostos ao fumo. Para a realização deste protocolo foram utilizadas duas câmaras hermeticamente fechadas: uma para os animais dos grupos controles com inalação somente de ar comprimido e uma segunda caixa para os grupos expostos ao tabagismo com inalação de fumaça de cigarro. A câmara para inalação de fumaça era dividida em dois compartimentos: um para a colocação de cigarros acesos; e outro destinado à exposição da gaiola com seis animais, sendo adaptada segundo o modelo de inalação descrito por Cendon et al.8. Foram utilizados cigarros, adquiridos comercialmente, compostos por: mistura de fumos, açúcares, papel de cigarro, extratos vegetais e agentes de sabor, que produziram em cada queima: 9,3 ± 0,93 mg/cig de alcatrão, 0,78 ± 0,078 mg/cig de nicotina e 8,0 ± 1,2 mg/cig de monóxido de carbono, conforme relatado na embalagem do produto. Programa de natação 60 O programa de natação foi iniciado na quinta semana de vida dos filhotes machos. Como descrito por Volpato et al.9 foi utilizado um tanque contendo água a 30ºC no nível de 40 cm, com finalidade de não permitir apoio da cauda dos filhotes no fundo do tanque, visando o estímulo de nadar. O programa foi dividido em duas fases: . Fase de adaptação ao treinamento: caracterizada, cinco primeiras sessões de exercício, pelo aumento progressivo de 10 minutos de duração por dia, iniciando com 20 minutos e chegando à quinta sessão com 60 minutos; . Fase de treinamento: foi iniciada na sexta sessão, com tempo duração de 60 minutos até a 30ª sessão, sem sobrecarga adicional10. As sessões do exercício foram diárias, sem interrupção, no período vespertino, por cinco dias da semana, durante 30 sessões, e no caso dos grupo G1FN e G2FN após o protocolo de exposição à fumaça. Os animais sedentários foram submetidos as mesmas condições do programa de natação, contudo, com água a 10cm por 15 minutos, para que sofressem o mesmo estresse do meio líquido, entretanto sem o estímulo de nadar. Parâmetros avaliados Peso e comprimento corporal Durante a lactação (1º dia, 7º dia, 14º dia e 21º dia de vida), foram mensurados o peso e o comprimento nasoanal. Para a pesagem foi utilizada uma balança eletrônica digital (Marte, modelo ASF11, Brasil), com capacidade máxima 500g e mínima 0,002g. A mensuração do comprimento nasoanal foi realizada por meio de uma régua milimetrada. Densidade mineral óssea e Conteúdo mineral ósseo Após 48 horas da 30ª sessão de treinamento, os filhotes foram eutanasiados com xilazina (40 mg/kg, i.p.) e ketamina (40 mg/kg, i.p.). Confirmada a anestesia, foi injetado cerca de 1ml de KCl a 10% no ventrículo esquerdo até parada cardíaca em diástole. Após confirmada a eutanásia por 61 parada cardíaca em diástole, os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico para extração do fêmur e da tíbia do membro direito dos filhotes. A densidade mineral óssea e o conteúdo mineral ósseo foram mensurados pelo dual-energy X-ray asborptiometry (DXA) equipamento equipado com software para pequenos animais4. Estatística Foi obtido peso, comprimento dos filhotes e mensurações de DMO, CMO e área dos ossos fêmur e tíbio. Foi realizado a análise descritiva com média e desvio padrão. Para a comparação dos pesos e comprimentos dos filhotes no período de treinamento, foi aplicado a análise de variância ANOVA de medidas repetidas, com pós-teste de Tukey, ao nível de significância de 5%. Para a análise do CMO, DMO e área do osso foi utilizado foi utilizada a análise de variância (ANOVA One-Way) e pós-teste de Tukey. Os resultados seguem distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk, com nível de significância de 5%) e os grupos são independentes. Para todas as análises foi utilizado o programa Statistical Analysis System – SAS. Resultados No momento do nascimento, o parâmetro peso apresentou dados maiores dos filhotes do grupo controle (G1) em comparação aos filhotes das matrizes expostas ao tabagismo (G2) (p=0,890). Essa diferença não foi observada no parâmetro comprimento corporal (p=0,079). No decorrer da lactação, o crescimento dos filhotes dos grupos apresentou-se de forma desigual. Os pesos corporais dos filhotes do grupo G1 apresentaram medidas maiores que os filhotes das ratas expostas à fumaça durante toda a lactação (07, 14 e 21 dias - p<0,001). O parâmetro comprimento corporal, que não fora observado diferença estatística no nascimento, apresentou mensurações maiores nos filhotes gerados por matrizes do grupo G1 quando comparados aos filhotes do grupo G2 (07 dias – p=0,001, 14 e 21 dias - p<0,001) (Tabela 01). Inserir tabela 01 62 As áreas do fêmur e tíbia não apresentaram diferença estatística pelo teste ANOVA (p=0,058 e p=0,700, respectivamente) (Tabela 02). Inserir tabela 02 No estudo de densitometria óssea, não foi observada diferença estatística (p=0,366) entre os grupos do estudo no parâmetro conteúdo mineral ósseo do fêmur. Porém, no estudo do mesmo parâmetro da tíbia foi encontrado menores mensurações no grupo G2CN quando comparado aos filhotes dos grupos G1CS (p=0,014), G1CN (p=0,023) e G1FN (p=0,008) (Tabela 03). Inserir tabela 03 Quando analisado a densidade mineral óssea, foi observada diferença estatística nos dois ossos pesquisados. Na averiguação da densidade mineral óssea no fêmur, foi observado maior taxa de densidade no grupo G1FS quando confrontado aos grupos G2CS (p=0,004), G2CN (p<0,001), G2FS (p=0,008) e G2FN (p<0,001). Já no estudo da tíbia, os animais do grupo G1FS apresentaram maiores taxas quando comparado aos grupos G2CS (p=0,003) e G2FN (p=0,007) (Tabela 04). Inserir tabela 04 Discussão Após o nascimento, os filhotes das matrizes tabagistas passivas continuaram com pesos menores e com o passar do tempo apresentaram aumento da diferença entre os animais provenientes das ratas controle, esse fenômeno pode ser explicado pelos baixos níveis de prolactina encontrados em mulheres fumantes ativas no período gestacional e pós-natal12, 13. Outro estudo analisou o tempo de amamentação de crianças, e foi encontrado durações de amamentação menores em crianças que tinham o pai fumante13, 14. Durante o treinamento, os grupos de animais gerados por matrizes controle apresentavam mensurações maiores de peso e comprimento quando comparados aos grupos de filhotes de ratas expostas ao fumo do cigarro; 63 demonstrando que o fumo passivo materno pode ter sido determinante na redução do peso dos animais. Assim como Gao et al. (2008)16, no presente estudo foi observada a permanência das menores mensurações entre os grupos expostos a fumaça do cigarro em relação ao grupo controle. Foi encontrado valores de DMO e CMO menores nos filhotes de matrizes expostas ao tabagismo quando comparados a animais gerados por ratas controle, no estudo de GAO et al. (2012)4 foi encontrado respostas semelhantes ao presente estudo após 4 meses de exposição ao tabagismo. A literatura sinaliza que a acidose metabólica pode influenciar negativamente o metabolismo ósseo2. No presente estudo, os animais foram expostos ao tabagismo passivo que promove acidose respiratória6, podendo ser sugerido que as alterações encontradas na DMO e no CMO pode ser ligada ao efeito da exposição a fumaça. Já foi demostrado que os períodos intrauterinos e neonatal exercem maior influência sobre o crescimento e as condições de saúde do indivíduo16, no presente estudo foi averiguado que a exposição materna ao tabagismo passivo demonstrou-se determinante para diminuição dos valores de densidade e conteúdo mineral ósseo. Segundo GAO et al. (2012)4, o tabagismo suprime a formação e aumenta a reabsorção óssea. Já a exposição no período de crescimento não acarretou diferenças estatísticas significantes, no estudo de GAO et al. (2011)17 foi encontrada diferença estatística somente após 4 meses de exposição; os ratos expostos por 2 ou 3 meses não mostraram diferenças nos parâmetros ósseos avaliados4. Em relação a variável exercício de natação, não foi verificada alterações capazes de serem atribuídas ao efeito da prática da atividade física, provavelmente essa falta de resposta pode ser devido ao tempo de protocolo realizado (30 sessões), segundo Iwamoto et al. (1998)18, ratas osteopênicas não mostraram diferença estatística no parâmetro BMD em 4 ou 8 semanas de treinamento, sendo demonstrada somente após 12 semanas de treinamento. Outro fato que pode ser levantado é que a maturação óssea ocorre somente após o 8º mês de vida dos ratos4, indicando uma perspectiva futura de 64 acompanhamento do crescimento até o 8º mês para averiguar a extensão da ação do tabagismo passivo crônico associado ao exercício físico de natação. Conclusão Em resumo, no presente estudo, o modelo de filhotes machos expostos ao fumo passivo durante a desenvolvimento fetal apresentou uma forte diminuição dos parâmetros, peso e comprimento, corporais. Já o treinamento de natação não apresentou grande influência, nos parâmetros analisados nesse estudo. No tecido ósseo, a exposição materna ao tabagismo passivo foi determinante para a alteração da DMO e CMO dos filhotes. 65 REFERÊNCIAS 1. 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G1CS G1CN G1FS G1FN Área Fêmur 1,34 ± 0,27 1,41 ± 0,17 1,31 ± 0,22 1,38 ± 0,22 Tíbia 1,1658 ± 0,21 1,15 ± 0,19 0,93 ± 0,16 1,13 ± 0,18 G2CS G2CN G2FS G2FN Área Fêmur 1,31 ± 0,14 1,43 ± 0,21 1,28 ± 0,09 1,53 ± 0,20 Tíbia 1,00 ± 0,10 0,91 ± 0,10 1,01 ± 0,13 1,00 ± 0,11 G1CS: grupo, filhotes de matrizes controle, controle sedentário; G1CN: grupo, filhotes de matrizes controle, controle exercitado; G1FS: grupo, filhotes de matrizes controle, exposto à fumaça do cigarro sedentário; G1FN: grupo, filhotes de matrizes controle, exposto à fumaça do cigarro exercitado; G2CS: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, controle sedentário; G2CN: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, controle exercitado; G2FS: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro sedentário; G2FN: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro exercitado. 69 Tabela 03 – Média e desvio padrão do conteúdo mineral ósseo G1CS G1CN G1FS G1FN CMO Fêmur 0,28 ± 0,05 0,29 ± 0,04 0,29 ± 0,05 0,29 ± 0,04 Tíbia 0,20 ± 0,03 a 0,19 ± 0,03 b 0,17 ± 0,02 0,19 ± 0,03 c G2CS G2CN G2FS G2FN CMO Fêmur 0,26 ± 0,03 0,28 ± 0,04 0,26 ± 0,02 0,30 ± 0,04 Tíbia 0,16 ± 0,02 0,15 ± 0,02 0,16 ± 0,02 0,16 ± 0,02 G1CS: grupo, filhotes de matrizes controle, controle sedentário; G1CN: grupo, filhotes de matrizes controle, controle exercitado; G1FS: grupo, filhotes de matrizes controle, exposto à fumaça do cigarro sedentário; G1FN: grupo, filhotes de matrizes controle, exposto à fumaça do cigarro exercitado; G2CS: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, controle sedentário; G2CN: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, controle exercitado; G2FS: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro sedentário; G2FN: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro exercitado. Letras significam diferença estatística entre: a = G1CS vs. G2CN (p=0,014), b = G1CN vs. G2CN (p=0,023), c = G1FN vs. G2CN (p=0,008) 70 Tabela 04 - Média e desvio padrão da densidade mineral ósseo G1CS G1CN G1FS G1FN DMO Fêmur 0,21 ± 0,01 0,20 ± 0,01 0,22 ± 0,02 a, b, c, d 0,21 ± 0,01 Tíbia 0,17 ± 0,01 0,17 ± 0,02 0,18 ± 0,02 a, d 0,17 ± 0,01 G2CS G2CN G2FS G2FN DMO Fêmur 0,20 ± 0,01 0,19 ± 0,01 0,20 ± 0,01 0,19 ± 0,01 Tíbia 0,16 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,16 ± 0,01 G1CS: grupo, filhotes de matrizes controle, controle sedentário; G1CN: grupo, filhotes de matrizes controle, controle exercitado; G1FS: grupo, filhotes de matrizes controle, exposto à fumaça do cigarro sedentário; G1FN: grupo, filhotes de matrizes controle, exposto à fumaça do cigarro exercitado; G2CS: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, controle sedentário; G2CN: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, controle exercitado; G2FS: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro sedentário; G2FN: grupo, filhotes de matrizes expostas à fumaça do cigarro, exposto à fumaça do cigarro exercitado. Letras significam diferença estatística entre: a = G1FS vs. G2CS, b = G1FS vs. G2CN, c = G1FS vs. G2FS, d = G1FS vs. G2FN Conclusão 72 Após, as análises dos dados de fecundidade, pode-se afirmar que o tabagismo passivo apenas diminuiu levemente a fertilidade, não sendo capaz de causar diferença estatística. Em relação ao crescimento corporal, os filhotes de matrizes expostas ao tabagismo apresentaram pesos e comprimentos menores apenas após a primeira semana. Na musculatura esquelética, a exposição ao tabagismo passivo diminuiu o diâmetro da fibra muscular, efeito semelhante ao encontrado na ausência da prática da natação. Já na análise óssea, a natação não demostrou-se determinante na alteração dos parâmetros analisados nesse estudo, porém, a exposição materna foi determinante para a redução dos parâmetros de densidade mineral óssea e conteúdo mineral ósseo. Referências 74 AGUIAR E SILVA, M. A.; VECHETTI-JUNIOR, I. J.; NASCIMENTO, A. F.; FURTADO, K. S.; AZEVEDO, L.; RIBEIRO, D. 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