RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 18/03/2020 Luís Fernando Segala Diferenciação populacional em Drosophila sturtevanti (subgrupo sturtevanti, grupo saltans) avaliada por morfometria geométrica da asa e do edeago São José do Rio Preto 2019 Câmpus de São José do Rio Preto Luís Fernando Segala Diferenciação populacional em Drosophila sturtevanti (subgrupo sturtevanti, grupo saltans) avaliada por morfometria geométrica da asa e do edeago Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Genética junto ao Conselho do Programa de Pós-graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientadora: Profª. Drª. Lilian Madi Ravazzi Coorientador: Prof. Dr. Rogério P. Mateus São José do Rio Preto 2019 Segala, Luís Fernando. S454d Diferenciação populacional em Drosophila sturtevanti (subgrupo sturtevanti, grupo saltans) avaliada por morfometria geométrica da asa e do edeago / Luís Fernando Segala. -- São José do Rio Preto, 2019 106 p. : tabs., mapas Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientadora: Lilian Madi-Ravazzi Coorientador: Rogério Pincela Mateus 1. Evolução. 2. Drosophila. 3. Morfometria Geométrica. 4. Diferenciação Populacional. 5. Mata Atlântica. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Luís Fernando Segala Diferenciação populacional em Drosophila sturtevanti (subgrupo sturtevanti, grupo saltans) avaliada por morfometria geométrica da asa e do edeago Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Genética junto ao Conselho do Programa de Pós-graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Profa Dra Lilian Madi-Ravazzi UNESP- São José do Rio Preto Orientadora Profa Dra Blanche Cristine Pires de Bitner-Mathé UFRJ – Rio de Janeiro Profa Dra Maura Helena Manfrin USP – Ribeirão Preto Profa Dra Mary Massumi Itoyama UNESP- São José do Rio Preto Prof Dr Eduardo Fernando Santos UNESP- São José do Rio Preto São José do Rio Preto 18 de março de 2019 A meus pais Antonio e Luiza (in memoriam), à milha esposa Deise e às minhas filhas Camila e Ana Luísa, dedico. AGRADECIMENTOS Pesquisa é algo que não se faz sozinho. Precisa de gente, ainda que para um papo amigo. Quando comecei a estudar drosófilas, apesar de ter me preparado alguns anos estudando a rotina do Laboratório de Genética, Ecologia e Evolução de Drosophila, não sabia ao certo quão específica era esta área. Não imaginava que houvesse até um simpósio bienal apenas para se falar desta mosquinha. Mas as coisas foram acontecendo e um bocado de gente me ajudando a formatar o pensamento deste trabalho todo, assim, preciso agradecer tanta gente que talvez alguns acabem sendo esquecidos. De toda forma, agradeço a todos os que contribuíram nesta minha etapa. Agradeço a compreensão da minha família nas muitas vezes que estive ausente ao convívio das coisas simples (e que são as mais importantes), para correr atrás de minhas moscas. Principalmente agradeço à minha esposa Deise Regis Segala e às minhas filhas Camila Regis Segala e Ana Luísa Regis Segala pelo convívio diário. Agradeço à minha orientadora, Professora Dra Lilian Madi-Ravazzi, por acreditar na possibilidade de alguém com formação em exatas tornar-se doutor em Biologia. Agradeço ao meu coorientador, Professor Dr Rogério Pincela Mateus, pelas inúmeras sugestões. Ao pessoal do Laboratório de Genética, Ecologia e Evolução de Drosophila, pelo companheirismo em todas as fases deste trabalho. Muito devo a eles e talvez fosse mais correto inserir seus nomes como coautores, tão grandes foram suas colaborações. Obrigado Bruna Memari Trava, Samara Videira Zorzato, Bruna Emília Roman, Gabriel Accioly Trípode, Rafael Miyazaki, Jéssica Fernanda Paixão e Larissa Gonçalves dos Santos. Devo agradecer imensamente ao Sebastião “Tião” Dias Barbosa e sua equipe que faz com que seja possível a manutenção do estoque, organizando as garrafas, as rolhas e fazendo o meio de cultura, sem esquecer da panelinha de pipoca, de vez em quando. Agradeço ainda aos companheiros do Laboratório do Professor Dr. Classius de Oliveira e do Laboratório da Professora Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira pelo empréstimo dos microscópios e lupas com câmeras fotográficas e pela enorme disponibilidade em me acompanhar na obtenção das imagens das asas e edeagos. Agradeço especialmente à Maysa Succi Domingues que não poupou esforços para me auxiliar neste sentido. Agradeço ainda aos companheiros de trabalho e alunos das escolas onde leciono (Coopec, Invictus, Unirp e Doutor Concursos), por tantas vezes suportarem meus papos sobre drosófilas. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, à qual agradeço. Minha mãe achava estudo a coisa mais fina do mundo. Não é. A coisa mais fina do mundo é o sentimento. Aquele dia de noite, o pai fazendo serão, ela falou comigo: Coitado, até essa hora no serviço pesado”. Arrumou pão e café, deixou tacho no fogo com água quente. Não me falou em amor. Essa palavra de luxo. (Adélia Prado, 2015, p. 87) RESUMO A morfometria da asa e do edeago tem sido amplamente utilizada para estudar a evolução das espécies do gênero Drosophila pois são caracteres altamente sensíveis a variação genética e ambiental. No presente trabalho utilizamos esta técnica em um estudo populacional de Drosophila sturtevanti com ênfase em moscas procedentes de áreas de Mata Atlântica do Brasil e da Floresta Tropical Úmida da Costa Rica. Para isto utilizamos as asas e edeagos de machos destas populações e analisamos o nível de diferenciação quanto a estes marcadores discutindo sua associação com sua localização geográfica, a fitofisionomia do fragmento de mata, a umidade relativa média anual, a temperatura média anual e a área do fragmento de mata. Os resultados indicaram a existência de uma estruturação latitudinal tanto para o tamanho e a forma da asa como para a forma do edeago, além de correlação entre estas características e algumas variáveis ambientais. A diferenciação quanto à forma do edeago, entretanto, foi menos significativa que a diferenciação da forma e do tamanho da asa. A relação entre forma e tamanho das asas obtida foi divergente dos resultados encontrados para outras espécies de Drosophila, apresentando asas maiores e mais arredondadas nas populações da faixa latitudinal Sul 1 (PIR, AGU e RDI) e asas menores mais alongadas em uma população da faixa latitudinal Nordeste (CUR). As populações da Costa Rica (TIR e LSA) e as populações do Sul mostraram divergência significativa para os marcadores avaliados, entretanto, as populações da faixa latitudinal Sudeste (MAT, NGR, SDC, PIC e VIT) não apresentaram estruturas congruentes e foram melhor agrupadas por fitofisionomias. Os resultados apresentados refletem a diferenciação genética em curso nas populações de D. sturtevanti, sendo acentuada para as procedentes da América Central e as do Sul do Brasil, indicando a ocorrência de diferenciação populacional quanto aos marcadores estudados e que podem ser um reflexo da existência de novas espécies deste subgrupo, que já tinha sido sinalizado em estudos anteriores e também em estudos recentes do nosso laboratório com marcadores moleculares para estas mesmas populações. Palavras-chave: Diferenciação populacional. Plasticidade fenotípica. Cline latitudinal. Evolução morfológica. Especiação. ABSTRACT Wing and aedeagus morphometry have been widely used to study the evolution of species of the genus Drosophila because they are highly sensitive characters to genetic and environmental variation. In this present research we use this technique in a populational study of Drosophila sturtevanti with emphasis on flies coming from Atlantic Forest areas of Brazil and the Tropical Rainforest of Costa Rica. For that we use the wings and aedeagus of males of these populations and we analyzed the level of differentiation regarding these markers discussing their association with its geographic location, the phytophysiognomy of the forest fragment, the average annual relative humidity, the annual average temperature and the area of the forest fragment. The results indicated the existence of a latitudinal structure for both the size and shape of the wing and the shape of the adeagus, besides the correlation between these characteristics and some environmental variables. The differentiation in the form of aedeagus, however, was less significant than the differentiation of the shape and size of the wing. The relation obtained between the shape and size of the wings was divergent from the results found for other Drosophila species, presenting bigger and more rounded wings in the populations of South 1 latitude (PIR, AGU and RDI) and smaller and elongated wings in a population from the Northeast latitude range (CUR). The populations of Costa Rica (TIR and LSA) and the South population showed significant divergence for the markets evaluated, however, the populations of the Southeast latitudinal range (MAT, NGR, SDC, PIC and VIT) did not present congruent structures and were better grouped by phytophysiognomies. The present results reflect the genetic differentiation in course in D. Sturtevanti populations, being accentuated for those coming from Central America and those from Southern Brazil, indicating the occurrence of an differentiation in relation to markers studied and that may reflect the existence of new species of this subgroup, which had already been signaled in previous studies and in recent studies of our laboratory with molecular markers for these same populations. Keywords: Populational differentiation. Phenotypic plasticity. Latitudinal cline. Morphological evolution. Speciation. LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I Figura 1: Locais de coleta Figura 2: Vista lateral do edeago e do arco entre o ápice e o processo ventral Figura 3: Variações dos contornos dos edeagos para os sete componentes principais estudados Figura 4: Análise de cluster para o edeago total Figura 5: Distribuição das 15 populações em relação ao edeago total Figura 6: Contornos médios da região contendo o arco entre o ápice e o processo ventral Figura 7: Análise de cluster para o edeago parcial Figura 8: Distribuição das 15 populações em relação ao edeago parcial CAPÍTULO II Figura 1: Locais de coleta Figura 2: Imagem lateral da asa com os marcos anatômicos Figura 3: Médias e intervalos de confiança (95%) para os tamanhos dos centroides Figura 4: Diagrama de dispersão entre latitudes e coeficiente de variação dos logaritmos dos centroides Figura 5: Marcadores mais variáveis nos dois componentes principais estudados Figura 6: Diagrama de dispersão comparando as variações na forma das asas Material suplementar Figura 1: Forma das asas de cada uma das populações em relação à variável PC1 Figura 2: Diagrama de dispersão comparando as variações na forma das asas segundo as variáveis fitofisionomia e faixa latitudinal 38 40 42 44 45 47 48 50 71 73 74 76 77 78 97 98 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I Tabela 1: Dados das populações estudadas Tabela 2: Comparações par-a-par entre as populações Tabela 3: Resultados para o teste de Levene, para igualdade de variâncias, e de para o Teste de Kruskall-Wallis CAPÍTULO II Tabela 1: Dados das populações estudadas Tabela 2: Valores de F e p da ANOVA para tamanho e forma das asas Material suplementar Tabela 1: Coeficientes dos dois componentes principais estudados Tabela 2: Porcentagens de reclassificação errônea obtidas por Análise de Função Discriminante Tabela 3: Distâncias de Mahalanobis entre as populações recém- coletadas Tabela 4: Distâncias de Procrustes entre as populações recém- coletadas 37 43 46 70 75 93 94 95 96 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1.1 O grupo saltans e o subgrupo sturtevanti 1.2 Morfometria 1.3 Marcadores morfológicos: asa e edeago 2 OBJETIVOS 3 CAPÍTULO I - Diferenciação populacional da morfologia do edeago em Drosophila sturtevanti (Diptera, Drosophilidae, grupo saltans, subgrupo sturtevanti) após recente expansão demográfica 4 CAPÍTULO II - Plasticidade fenotípica e clines em populações geográficas de Drosophila sturtevanti (Diptera, Drosophilidae, grupo saltans, subgrupo sturtevanti) avaliadas pela morfometria das asas 4.1 Material Suplementar 5 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS 16 16 19 23 29 30 63 93 99 100 16 1 INTRODUÇÃO 1.1 O grupo saltans e o subgrupo sturtevanti de Drosophila Segundo a base de dados online Taxodros (https://www.taxodros.uzh.ch), a família Drosophilidae possui aproximadamente 4500 espécies sendo aproximadamente 1000 na subfamília Steganinae e 3500 na subfamília Drosophilinae. A subfamília Drosophilinae subdivide-se em 48 gêneros, dentre os quais o gênero Drosophila com aproximadamente 2000 espécies. O grupo saltans pertencente ao subgênero Sophophora forma juntamente com o grupo willistoni os dois grupos da radiação do Novo Mundo (STURTEVANTI, 1942; THROCKMORTON, 1975). A literatura menciona que o grupo é constituído por 21 espécies incluídas em cinco subgrupos: cordata (2 espécies), elliptica (4 espécies), parasaltans (2 espécies), sturtevanti (5 espécies) e saltans (7 espécies) (MAGALHÃES; BJÖRNBERG, 1957, MAGALHÃES, 1962, MOURÃO; BICUDO, 1967). As espécies do grupo saltans são distribuídas do México ao Rio Grande do Sul - Brasil (MAGALHÃES, 1962; MOURÃO; BICUDO, 1967; SOUZA et al., 2014). Os subgrupos parasaltans e cordata são encontrados na região Neotropical e os subgrupos elliptica, sturtevanti e saltans são encontrados em ambas regiões, Neotropical e Neoártica (MAGALHÃES, 1962). Alguns trabalhos discutiram a filogenia do grupo saltans, com a utilização de diversos tipos de marcadores. A primeira filogenia do grupo foi proposta com base no acúmulo do pigmento pteridina no corpo dos indivíduos das espécies do grupo saltans (THROCKMORTON; MAGALHÃES, 1962). Outros trabalhos https://www.taxodros.uzh.ch/ 17 utilizando marcadores morfológicos foram realizados (THROCKMORTON, 1975; YASSIN, 2009; SOUZA et al., 2014), assim como a utilização de outros marcadores, como isolamento reprodutivo (BICUDO, 1973a; BICUDO, 1979), polimorfismo cromossômico (BICUDO, 1973b), padrões de esterases (NASCIMENTO; BICUDO, 2002; BERNARDO; BICUDO, 2009), análises moleculares (O’ GRADY et al., 1998; RODRIGUEZ-TRELLES et al., 1999; TARRIO et al., 2000, O’ GRADY; KIDWELL, 2002) e elementos transponíveis (CLARK et al., 1995; SILVA; KIDWELL, 2000; CASTRO; CARARETO, 2004). Os resultados das análises destes trabalhos algumas vezes foram incongruentes em relação à filogenia e origem do grupo. O trabalho de Throckmorton (1975) foi pioneiro na discussão da origem do grupo saltans. O autor utilizou os resultados da filogenia sugerida por Throckmorton e Magalhães (1962) e propôs que o grupo se originou na América do Norte, devido à ocorrência das espécies dos subgrupos mais primitivos, subgrupos cordata e elliptica, do México ao Brasil. O grupo ancestral teria então colonizado o continente sul-americano, dando origem aos subgrupos sturtevanti, parasaltans e saltans, possivelmente antes da formação do Istmo do Panamá. E após o soerguimento do Istmo, as espécies destes subgrupos invadiram e se dispersaram para o norte. Algumas espécies do subgrupo saltans se dispersaram na América Central e México há aproximadamente 4,5 milhões de anos. Entretanto, estudos realizados por Rodríguez-Trelles et al. (1999) e Tarrio et al. (2000) com o gene Xdh sugerem que o grupo saltans teria se originado na América do Sul e não na América do Norte, devido à ocorrência no Brasil das espécies do subgrupo parasaltans, considerado o mais primitivo pelas análises 18 efetuadas. Assim, a origem do grupo e as relações entre seus subgrupos e espécies permanecem uma questão em aberto. O grupo saltans é composto por espécies crípticas, que são distinguidas principalmente pela morfologia da terminália masculina, apresentando grande variação na mesma. Entretanto, a morfologia da terminália feminina é bem semelhante entre os subgrupos. Em muitas espécies de animais com fertilização interna, a genitália externa masculina é uma estrutura com rápida evolução (EBERHARD, 1985). D. sturtevanti é uma espécie neotropical e uma das poucas espécies que se adaptam a diferentes climas (DAVID; TSACAS, 1981) tendo sida coletada em savanas (CHAVES; TIDON, 2008), manguezais (SCHMITZ, et al., 2007) e principalmente na Mata Atlântica (PENARIOL, 2012; MATEUS et al., 2013). Entre as espécies do subgrupo sturtevanti é a que possui maior extensão geográfica, ocorrendo desde o México até o sul do Brasil, inclusive sendo frequente nas Ilhas do Caribe (BICUDO, 1979). Foi descrita por Duda em 1925, mas sua melhor descrição foi feita por Dobzhansky e Pavan (1943), em um trabalho no qual os autores descrevem sistematicamente 31 espécies encontradas no estado de São Paulo e em Brasília, incluindo a morfologia externa e a anatomia dos adultos, ovos, larvas, pupas e cromossomos. A espécie foi avaliada quanto ao isolamento reprodutivo por Bicudo (1979), em testes de cruzamento com D. milleri e D. magalhaesi, e foi observado isolamento reprodutivo entre as três espécies. A autora sugeriu que o isolamento ocorre predominantemente no nível de inseminação, já que a morfologia genital dos machos das três espécies é bem semelhante. 19 Hosaki-Kobayashi e Bicudo (1994) estudaram isolamento reprodutivo intraespecífico, cruzando moscas de 24 linhagens mantidas em estoque de laboratório com 67 isolinhagens obtidas de moscas recém-coletadas, de 11 localidades distintas no Brasil. Os resultados mostraram diferenciação populacional quanto a fertilidade, entretanto, não foi detectado nenhum grau de isolamento reprodutivo entre estas populações. Em outro trabalho semelhante, das mesmas autoras, ((HOSAKI- KOBAYASHI; BICUDO, 1997), foi observado isolamento reprodutivo entre as populações da Guiana e da Colômbia e entre as populações de São José do Rio Preto/SP e do México. A ausência de esperma nas espermatecas das fêmeas dos cruzamentos estéreis, indica a existência de isolamento sexual entre estas espécies. D. sturtevanti apresenta uma ampla variabilidade genética observada por diferentes marcadores e também foi detectado isolamento reprodutivo incipiente entre alguma de suas populações. Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa por marcadores microssatélites e genes mitocondriais demonstraram que esta espécie está em expansão demográfica. Estas características associadas a sua ampla distribuição geográfica e sua ocorrência em diferentes fitofisionomias da mata Atlântica fazem desta espécie um organismo apropriado para estudos de diferenciação e estrutura populacional. 1.2 Morfometria Quantificar a variação morfológica tem sido uma ferramenta eficaz em estudos de Biologia Evolutiva, principalmente após o surgimento da morfometria 20 geométrica nos anos 80 e 90. Trabalhos utilizando diferentes organismos valeram-se desta técnica para analisar a forma e o tamanho dos mais variados marcadores anatômicos. Estudos comparando crânios de cães domésticos e de cães selvagens utilizaram morfometria geométrica para diferenciar as espécies e mostraram que a seleção artificial por oferta de alimentação é determinante e pode facilitar a especiação (DRAKE; KLINGENBERG, 2010). A morfometria também tem sido utilizada em pesquisas da evolução humana como por exemplo em estudos comparativos entre a morfologia craniofacial e do tórax de neandertais e humanos modernos (BASTIR et al., 2007; BASTIR et al., 2015) e em estudos sobre dimorfismo craniofacial (BULYGINA et al., 2006) Para ilustrar ainda mais a importância do desenvolvimento das técnicas de morfometria e as vantagens de utilização de morfometria geométrica em relação às técnicas lineares, podemos citar o trabalho de Sidlaukas et al. (2011) que aplicaram diferentes técnicas de morfometria na identificação de espécies de peixes do grupo Leporinus cylindriformis. Ambas as abordagens (linear e geométrica) retornaram padrões congruentes de separação entre espécies putativas, mas a abordagem geométrica distinguiu quatro pares de espécies a mais do que a abordagem linear fornecendo um pouco mais de poder estatístico. Com base em morfometria, merística e coloração distintas, uma nova espécie foi descrita (Leporinus apollo sp. nov.). Em estudos com insetos, a morfometria geométrica é aplicada em diferentes partes anatômicas e com finalidades variadas. Patterson et al. (2001) realizaram análises quantitativas de caracteres morfológicos da cabeça para 21 reconstruir a história evolutiva de Triatoma rubrofasciata (Hemiptera: Reduviidae) e compará-la com sete outras espécies, observando que T. rubrofasciata apresenta similaridade com as espécies de triatoma da região Neoártica implicando uma ancestralidade comum para esses grupos. Em sua tese de doutorado, Patterson avalia a possibilidade de se utilizar morfometria geométrica em estudos de dinâmica populacional de T. rubrofasciata, concluindo que a variação da forma das asas apresentou maior congruência com os padrões de variação obtidos por sequenciamento do DNA mitocondrial que a variação da forma da cabeça. O autor sugere a utilização da forma da asa em avaliações morfométricas de dinâmica populacional. Uma das maiores preocupações do autor, no entanto, é a atuação da plasticidade fenotípica como fator de confusão em estudos de estrutura populacional. De fato, diversos estudos utilizam morfometria geométrica com a intenção de estudar a plasticidade fenotípica e sua interação com variabilidade genética, sendo que em sua maioria, a asa é o marcador escolhido para análise (PATTERSON et al., 2001). Outro exemplo de aplicação com sucesso de técnicas de morfometria geométrica é o estudo de Garnier et al. (2005), no qual os pesquisadores utilizaram resultados morfométricos do pronoto e do edeago de Carabus solieri (Coleoptera, Carabidae) conjuntamente a resultados moleculares. A correlação entre estes marcadores e a localização geográfica permitiu inferir o cenário filogeográfico, propondo que duas populações de C. solieri se dividiram antes do último período de glaciação, diferenciando-se em dois grupos distintos (um com coloração esverdeada ao norte e outro com coloração azulada ao sul). Com o fim do período de glaciação, as duas populações se reaproximaram formando 22 um grupo de transição ao centro do local de incidência da espécie (GARNIER et al., 2005). No que se refere à utilização de asa como marcador, Sontigun et al. (2017), aplicaram a morfométria geométrica baseada em 19 pontos de referência para a identificação de 12 espécies de moscas varejeiras da Tailândia com interesses clínicos (disseminação de doenças) e forenses (estágios de decomposição de cadáveres). Eles concluíram que o tamanho das asas não é adequado para a discriminação das espécies, mas a forma sim, desta forma, recomenda o uso desta técnica por ser um método simples, confiável e barato. Em geral, estudos morfológicos exigem menor custo e tempo que estudos moleculares (WORTLEY; SCOTLAND, 2006; YASSIN, 2009; TRAVA, 2014), desta forma, constituem-se em uma excelente opção de trabalho e fornecem resultados bastante confiáveis, desde que se aplique corretamente as técnicas de instrumentação, análise gráfica e estatística (BITNER-MATHÉ; DAVID, 2015). Em especial, técnicas de morfometria geométrica têm sido aplicadas para a análise da morfologia da asa e do edeago de drosofilídeos. Destacam-se as análises de marcadores com consequente análise de Distâncias de Procrustes nas intersecções das veias e das bordas das asas (KLINGENBERG, 2011; MATEUS et al., 2013; TRAVA, 2014; COSTA et al. 2015), ajuste de uma elipse no contorno da asa (BITNER-MATHÉ; KLACZKO, 1999) e em edeagos, utilização de Descritores Elípticos de Fourier (KUHL; GIARDINA, 1982; CAVICHI, et al., 1991; DEBAT, et al. 2003; ANDRADE, et al. 2005; ANDRADE, et al. 2009). 23 1.3 Marcadores morfológicos: Asa e Edeago Entre os marcadores morfológicos mais estudados em espécies do gênero Drosophila estão a asa e o edeago. Estudos anteriores indicam, que a asa apresenta plasticidade fenotípica em relação a diferentes fontes de variação ambiental (WEBER, 1990; DAVID et al., 1994; MONTEIRO; REIS, 1999; MORIN et al., 1999; DEBAT et al., 2003; CARREIRA et al., 2006; SOTO et al., 2008) e existe evidência de que os diferentes aspectos da morfologia da asa (tanto o tamanho quanto à forma) são alvos da seleção natural (POWELL, 1997; GILCHRIST et al., 2004). A técnica de morfometria geométrica mais utilizada para análise de asas é a Análise das Distâncias de Procrustes (GOODALL, 1991; SOTO et al., 2008; KLINGENBERG, 2010; KLINGENBERG, 2011) que consiste na marcação de marcos anatômicos, localizados na intersecção de veias ou no encontro entre a veia e a borda da asa, a superposição de todas as asas e a análise da variação dos pontos em torno do centroide (ponto médio). Esta técnica foi utilizada por Debat et al. (2003) em estudos sobre componentes alométricos e não-alométricos em asas de D. simulans. Concluíram que 24% da variação da forma da asa se deve a componentes alométricos e 76% a componentes não-alométricos e sugeriram que o estresse, ao invés da temperatura, é o principal fator que afeta a forma da asa. Soto et al. (2008) utilizaram esta técnica para estudar a morfologia das asas de D. gouveai e D. antonietae, obtendo divergência entre as espécies e associando esta divergência a fatores ecológicos e genéticos. A principal correlação obtida por estes pesquisadores refere-se à forma da asa e o cacto 24 hospedeiro (local de alimentação e oviposição). Conclui que a diminuição do estresse ambiental gera aumento na asa, mas o aumento de estresse gera diminuição e variação na forma. Pitchers et al. (2013) associaram a variação da forma e tamanho das asas a um cline altitudinal. Trabalhando com asas de D. melanogaster, analisadas segundo distâncias de Procrustes, propuseram um modelo linear generalizado misto com as variáveis altitude, sexo, latitude e longitude. Os resultados mostraram que além da esperada adaptação termal, a seleção responsável pela formação de clines latitudinais, longitudinais e altitudinais deve ser muito mais complexa. Ainda sobre a forma das asas, Ray et al. (2016) usaram manipulação genética para alterar a expressão do gene narrow relacionado à forma das asas em D. melanogaster. Em seguida, analisaram 15 marcadores através de Análise de Procrustes e mostraram que a forma da asa altera significativamente a performance do voo, ou seja, a manobrabilidade e a agilidade. Utilizando uma técnica de morfometria geométrica plana que consiste em ajustar uma elipse ao contorno da asa (BITNER-MATHÉ; KLACZKO, 1999), Moraes e Sene (2004) estudaram herdabilidade da forma e do tamanho da asa em populações selvagens versus populações mantidas em laboratório em D. gouveai, A herdabilidade foi significativamente maior para as populações selvagem apenas em três parâmetros, ligados aos marcadores do final da terceira e da quarta veia longitudinal das asas, mas ainda assim, concluem que a herdabilidade é maior em populações selvagens que em populações de laboratório. Concluem ainda que parâmetros morfométricos são apropriados para estudar a variação morfológica entre populações e que os parâmetros 25 referentes à terceira e à quarta veia longitudinal são os mais importantes para explicar a maior herdabilidade das moscas selvagens (MORAES; SENE, 2004). A mesma técnica de ajuste de uma elipse ao contorno da asa foi utilizada por Matta e Bitner-Mathé (2010) na análise de asas de D. simulans e D. sechellia (Diptera), correlacionando os resultados com variações em 12 locos de traços quantitativos (QTL) que relacionam-se ao tamanho e à forma das asas identificados pelos autores. A comparação possibilitou o mapeamento das bases genéticas para a divergência no tamanho das asas das duas espécies, a identificação de que esta divergência em tamanho não é acompanhada por divergência em forma e que o dimorfismo sexual ocorre em relação à forma e ao tamanho, apresentando machos com asas menores e mais arredondadas (MATTA; BITNER-MATHÉ, 2010). A terminália masculina é formada por um conjunto de apêndices (edeago, hipândrio e arcos genitais), apresenta evolução rápida e divergente e é um dos padrões mais gerais de diversificação morfológica em animais com fertilização interna (ARNQVIST, 1997; HOUSE; SIMMONS, 2005; HUBER; BRESCOVIT; RHEIMS, 2005). Medidas da diferenciação da morfologia genital são muito utilizadas em estudos evolutivos populacionais, pois além de constituir um caráter diagnóstico para várias espécies, como carabídeos, libélulas e besouros, diferenças na morfologia da terminália podem gerar o isolamento reprodutivo entre populações (PAULSON, 1974; SOTA; KUBOTA, 1998; NAGATA et al., 2007). Estudos com diversas espécies do gênero Drosophila utilizam análises morfométricas do edeago com finalidades variadas. Franco et al. (2006), por exemplo, estudaram a morfologia do edeago de espécies cactofílicas (D. 26 antonietae e D. buzzatti) focando em quatro regiões do edeago. Obtiveram que a região entre o ápice e o processo ventral é a mais variada, corroborando resultados anteriores que consideram esta região do edeago como um hot spot evolutivo (KULIKOV et al. 2004). Atribuíram a variação desta região a fatores epigenéticos e ambientais agindo conjuntamente. O mesmo grupo de pesquisadores, em 2008, apresentaram um estudo com a espécie D. serido, analisando os edeagos de 8 populações e encontrando divergências na forma dos edeagos correlacionadas à distância geográfica das populações. Sugeriram três possibilidades de explicação para a variação: hipótese chave-fechadura, pleiotropia e seleção sexual. Richmond et al. (2012), realizaram estudos comparativos dos edeagos D. arizonae e de quatro subespécies de D. mojavensis utilizando Descritores Elípticos de Fourier. As análises por morfometria geométrica utilizadas foram eficazes na distinção das duas espécies e de três das quatro subespécies de D. mojavensis e concluíram que D. mojavensis sonorensis apresenta um padrão diferente de evolução. Os autores sugeriram duas hipóteses para explicação deste fato: pressões seletivas agindo no sistema pré-copulatório causadas por simpatria entre D. m. sonorensis e D. arizonae, ou, alternativamente, fluxo gênico entre D. m. sonorensis e D. m. baja, pois as condições climáticas e geográficas são favoráveis. Algumas pesquisas ainda utilizaram a morfometria aplicada aos dois marcadores (asas e edeagos) para descrever a diferenciação entre espécies e intraespecíficas. Soto et al. (2010) analisaram a variação dos dois marcadores em D. gouveai e D. antonietae buscando correlação com o cacto hospedeiro. Por meio de hibridização experimental, mostraram que a morfologia genital e da asa 27 dos híbridos depende da planta onde a mãe se hospeda, mas concluíram que a extensão da diferenciação morfológica entre híbridos e espécies puras bem como os padrões de plasticidade variaram entre os órgãos, sugerindo uma arquitetura genética complexa para as características estudadas. Populações geográficas da região neotropical de D. sturtevanti têm sido estudadas por nosso grupo de pesquisa há algum tempo utilizando marcadores morfológicos (SOUSA et al., 2014) e genéticos, como por exemplo, os microssatélites e genes mitocondriais (ZORZATO, 2019). Os dados de microssatélites mostraram, no geral, diferenciação genética de baixa (AMOVA, GST e D – distância de Nei) a moderada (FST) entre as populações estudadas, e, consequentemente, elevada identidade (Nm). Porém, indícios de estruturação populacional foram encontrados em análises como a Bayesiana, implementada no programa STRUCTURE (PRITCHARD et al., 2000), e da genética da paisagem (landscape genetics), realizada pelo programa GENELAND (GUILLOT et al., 2005). Na primeira análise foram detectados dois grupos, um formado pelas populações do Sul do Brasil (Aguaí/SC, Ribeirão da Ilha-Florianópolis/SC e Piraí/SC), separado das demais, que formaram o segundo grupo. Na segunda análise, foram encontrados cinco grupos. Um com as três populações do sul do Brasil (igual ao primeiro grupo observado na análise do STRUCTURE. O segundo grupo foi formado pelas populações localizadas próximas ao litoral do sudeste do Brasil (Serra da Cantareira/SP e Picinguaba/SP). O terceiro foi formado pelas populações do interior do sudeste (Matão/SP e Nova Granada/SP). Este agrupamento foi consistentemente observado em diversas outras análises (GST, D de Nei, e Nm). O quarto foi formado pela população do interior do nordeste brasileiro (Pratigi/BA). E o quinto 28 foi representado pela população de Guaribas/PB. Além da consistente proximidade entre as populações do interior do sudeste, a população insular de Ribeirão da Ilha (Florianópolis/SC) mostrou-se também consistentemente mais diferenciada das demais (TRAVA, 2018). 99 5 CONCLUSÃO Quando analisamos os dois marcadores (asas e edeagos) conjuntamente, podemos ver que as populações de D. sturtevanti apresentam variações que seguem alguns padrões por proximidade geográfica. A divergência obtida para as asas pode ser explicada em grande parte por fatores ambientais, já que são mais suscetíveis a estes fatores que os edeagos, mas efeitos de fundação da população, de gargalos populacionais e diminuição do fluxo gênico correlacionados à fragmentação da Mata Atlântica não podem ser descartados. De forma geral, as diferenciações morfométricas das asas e dos edeagos mostraram certos pontos de convergência. Destacamos a diferenciação latitudinal com o agrupamento das populações da América Central diferindo com bastante intensidade das populações do sul do Brasil. Esta divergência pode ser um reflexo da existência de uma nova espécie na Costa Rica, que está sendo testado em nosso laboratório com marcadores moleculares e testes de isolamento reprodutivo. Também houve dificuldades em se estabelecer critérios de associação para as populações do Sudeste brasileiro, mostrando que tais caracteres podem estar sendo influenciados por fatores ambientais e genéticos e outros a serem explorados. Além disso, a relação entre tamanho e forma das asas em D. sturtevanti foi divergente dos resultados encontrados para outras espécies de Drosophila, o que demonstra um aspecto intrínseco desta espécie que necessita ser melhor investigado em projetos futuros. 100 REFERÊNCIAS ANDRADE, C.; HATADANI, L.; KLACZKO, L. Phenotypic plasticity of the aedeagus of Drosophila mediopunctata: Effect of the temperature. 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