RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/02/2022. Mariele Ilario Zucão Avaliação morfofuncional do córtex adrenal em machos de gerbilo da Mongólia durante o envelhecimento Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Profª. Drª. Patrícia Simone Leite Vilamaior São José do Rio Preto 2020 AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Ivo e Marisa, que foram os meus primeiros professores me ensinando a gostar de estudar e, também ao meu irmão, Heitor. Obrigada por me apoiarem nos meus sonhos e me incentivarem sempre, permitindo que eu chegasse até aqui. À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Patricia Simone Leite Vilamaior, por ter concedido a mim a oportunidade de participar do seu grupo de pesquisa desde o início da graduação, portanto agradeço pela confiança e pelos ensinamentos, que, sem dúvida alguma, tiveram incomensurável importância para o meu crescimento pessoal e profissional. E ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga por toda a colaboração, tanto financeira, quanto intelectual. Aos meus colegas do laboratório de Microscopia e Microanálise, pelo companheirismo, pelas risadas e choros juntos e também por toda ajuda profissional, em especial o Luiz Henrique, Nayara, Fernanda, Carol, Ellen e Gustavo. À UNESP e às políticas de permanência estudantil, que mesmo em meio à tamanha crise na ciência permitiram que uma aluna de escola pública se graduasse e cursasse o mestrado. A todos os funcionários e servidores, em especial ao Msc. Luiz Roberto Falleiros Jr., pela presteza, auxilio no suporte técnico e também pela amizade, que juntamente com a dos demais amigos do laboratório fizeram esse período mais leve e feliz. À prof.ª Dr.ª Eliane Gonçalves de Freitas por gentilmente ceder o espaço e o leitor de microplacas para os ensaios ELISA. Aos meus sogros, Marinho e Val, que me apoiaram como meus segundos pais, estando sempre junto comigo, desde a matrícula na faculdade. Também os meus cunhados, Isa, João, Thiago, Ellen; e à minha família de Rio Preto, Mat, Tida, Airam, Lenina, Paulo e Lilith, por todo acolhimento, amizade e carinho. Ao meu noivo, Matheus, por todo companheirismo, por estar ao meu lado durante todos os momentos, por me dar todo o apoio, me consolar nos momentos difíceis e se alegrar com as minhas conquistas, sem você tudo teria sido mais difícil. À CAPES, pelo apoio financeiro. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. RESUMO É conhecido que o processo de envelhecimento ocasiona em machos um desequilíbrio hormonal devido à redução gradual da síntese de testosterona pelos testículos, que afeta a maioria dos órgãos sensíveis a hormônios e dentre eles a adrenal, que é responsável pela síntese e secreção de hormônios esteroides como mineralocorticoides, glicocorticoides e andrógenos. Estudos anteriores reconhecem o importante papel da adrenal na regulação do sistema reprodutor e também é conhecido, por meio de estudos com castração, que esta é sensível à redução de andrógenos, no entanto, há pouco entendimento do papel dessa glândula no processo de andropausa e há uma dificuldade em encontrar modelos experimentais representativos, uma vez que há muitas diferenças morfofuncionais entre as adrenais dos roedores e primatas. As adrenais dos gerbilos da Mongólia têm características ultraestruturais peculiares que sugerem uma maior similaridade à dos primatas. Apesar de serem modelos experimentais utilizados em estudos de desregulação endócrina e do sistema reprodutor, há poucos estudos sobre a fisiologia do córtex adrenal dessa espécie. Considerando essa afirmação, esse estudo descreveu pela primeira vez a morfofisiologia da adrenal de gerbilos adultos e durante o envelhecimento, trazendo resultados que demonstram similaridades do córtex adrenal dessa espécie com o humano e de outros primatas, desde a morfologia à expressão de enzimas da biossíntese de cortisol e andrógenos e de receptores de andrógeno e estrógeno. Durante o envelhecimento foi constatada uma hipertrofia do córtex adrenal por meio do aumento do peso relativo e absoluto da glândula, assim como no aumento da espessura das zonas corticais e presença de células proliferativas, evidenciando assim uma possível resposta dessa glândula ao envelhecimento em decorrência do desequilíbrio hormonal. Na análise morfológica foi observada maior quantidade de tecido conjuntivo nos animais de 15meses e um acúmulo de lipofuscina na zona reticular nos grupos de 12 e 15meses, assim como regiões com células hipertróficas com grande quantidade de conteúdo lipídico, características que são sinais de senescência decorrentes do decréscimo do metabolismo celular. Tais resultados levam à conclusão de que nas idades de 12e 15meses o córtex adrenal dos gerbilos apresenta sinais de senescência apesar de também demonstrar uma hipertrofia, achados similares aos encontrados em primatas, indicando que essa espécie pode ser um modelo experimental adequado para estudo da adrenal. Palavras-chave: Adrenal. Gerbilo. Envelhecimento. ABSTRACT The aging process in males is known by occasioning a hormonal imbalance due to the gradual reduction in the testicular testosterone synthesis, which affects most of the organs sensitive to this hormone and, among them the, adrenal glands which its cortex is responsible to synthesize and secrete steroidogenic hormones as mineralocorticoids, glucocorticoids, and androgens. Existing research recognizes the significant role played by this gland in the regulation of the reproductive system; it is also known that it is sensitive to the reduction of testosterone caused by castration, although there is still very little scientific understanding of its role in the andropause process. Moreover, Mongolian gerbils are experimental models for studies in reproductive biology and endocrine deregulation, their adrenal glands present a peculiar structure and suggest having more similar morphophysiology to the primates than others rodents, although there have been few investigations about the gerbils' adrenocortical physiology. Considering this, this study has described the morphophysiology of this gland in gerbil for the first time and showed particular similarities between the adrenal cortex of M. unguiculatus and primates, since the morphology, to the expression of enzymes of cortisol and androgens biosynthesis and androgen and estrogen receptors. During aging was an hypertrophy in the adrenal cortex, based on the gradual increase in adrenal absolute weight of the adrenals in the older groups and the relative weight presents an increase in the older group (15months), as well as expression of proliferation markers highlighting the role of this gland at this stage of aging, when the sexual hormones are decreasing, as well as the morphometry has shown a larger length of all cortical areas. General morphological analysis showed in older groups larger connective tissue between cortex and medulla and increase of collagen fibers and in the reticular zone were seen lipofuscin accumulation in animal with the age of 12 and 15 months, as well as regions with larger cells and clear cytoplasm, this may reflect the decrease in the metabolic activities of the cell, due to the senescence process, leading us to conclude that at the age of 12 and 15 months the adrenal presents signs of senescence, although it shows a hypertrophy demonstrating a probable compensatory function to the low cell metabolism and to the androgens decrease, this finding is similar to the research in primates making of it a possible experimental model for adrenal diseases studies. Key-words: Adrenal. Gerbil. Aging. LISTA DE ABREVIAÇÕES 3BHSD/ HSD3B2 3β desoxidesidrogenase AC Adenilato ciclase ACTH Hormônio adeno-corticotrófico CASH Hormônio estimulador de andrógeno cortical CRH Hormônio liberador de corticotrofina CYB5 Citocromo B5 CYP/ CYP450 Citocromo p450 CYP17 Citocromo p450 17α hidroxilase/liase CYP11B2 Citocromo p450 aldosterona sintetase DHEA Dehidroepiandrosterona DHT Diidrotestosterona Dz Zona Definitiva Fz Zona Fetal LOH Late Onset Hypogonadism PADAM (Partial) Androgen Decline in the Aging Male PKA Fosfocinase A POMC Pré-pró-opiomelanocortina SDHEA Sulfato de Dehidroepiandrosterona SHH Sonic Hedgehog T Testosterona TDS Testosterone Deficiency Syndrome TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa ZF Zona Fasciculada ZG Zona Glomerulosa ZR Zona Reticular SUMÁRIO 1.1 Morfofisiologia da adrenal 10 1.2 Regulação hormonal da adrenal 12 1.3 Hormônios andrógenos e envelhecimento 13 1.4 Adrenal do gerbilo 14 2.1 Introduction 16 2.2 Material e methods 17 2.3 Results 20 2.4 Discussion 22 1 INTRODUÇÃO 9 2 ARTIGO: “AGING EFFECTS IN ADRENAL CORTEX MORPHOPHYSIOLOGY OF MALE MONGOLIAN GERBIL’S: AN INTERESTING MODEL FOR ENDOCRINE REGULATION STUDIES” 16 2.5 Conclusion 26 3 CONCLUSÃO 41 REFERÊNCIAS 41 9 1 INTRODUÇÃO O sistema endócrino sofre diversas alterações durante o envelhecimento, principalmente devido à redução da produção dos hormônios sexuais. Nas fêmeas esse é um fenômeno bastante estudado, devido à cessação da ovulação e, consequentemente da produção de estrógenos, conhecida como menopausa. Em machos, porém, essa redução é gradativa e a síntese dos andrógenos pelas gônadas não cessa completamente, no entanto, conhece-se relativamente pouco sobre esse processo, denominado andropausa e atualmente também chamada de Síndrome de deficiência androgênica, PADAM (Partial Androgen Decline in the Aging Male), LOH (Late Onset Hypogonadism), TDS (Testosterone Deficiency Syndrome ) (PARK; AHN; MOON, 2019; VANCE, 2003; YADAV et al., 2019) . A função desempenhada pela glândula adrenal tem um papel importante no processo de envelhecimento devido, principalmente, à secreção dos glicocorticoides e andrógenos, que sabe-se ter seus níveis séricos alterados durante a andropausa e têm correlação com os níveis de testosterona circulante (AJDŽANOVIĆ; MILOŠEVIĆ; SPASOJEVIĆ, 2012; BAULIEU et al., 2000; CUSAN et al., 1997). O córtex adrenal, em especial a Zona Reticular (ZR) tem papel na produção dos andrógenos (também chamados de andrógenos C9 ou precursores de andrógenos), sendo o maior sítio de síntese desses hormônios em fêmeas e o segundo maior em machos, uma vez que nestes a maior produção de andrógenos é testicular (KRONENBERG et al., 2016). Os andrógenos adrenais atuam no sistema reprodutor, no desenvolvimento das características sexuais secundárias e no comportamento (KRONENBERG et al., 2016; SOMA et al., 2008). Considerando que a testosterona em machos provém em 95% dos testículos e os 5% restantes, majoritariamente da adrenal, espera-se que essa glândula tenha um papel significativo durante a ausência ou redução dos andrógenos testiculares, uma vez que, em ratos e algumas espécies de gerbilo, sabe-se que essa glândula tem sua fisiologia alterada e a ZR apresenta hipertrofia após a orquiectomia (AJDŽANOVIĆ et al., 2016; BENMOULOUD et al., 2014; ZATRA et al., 2018). Como no envelhecimento também há uma redução gradual dos andrógenos testiculares, acredita-se que o córtex adrenal também está relacionado e apresenta respostas a esse processo (LOIS et al., 2014). Estudos em ratos como modelos de andropausa utilizam animais castrados para simular a redução de andrógenos decorrentes do envelhecimento (AJDŽANOVIĆ et al., 2016; MILOŠEVIĆ et al., 2018). No entanto, sabe-se que a andropausa é um processo gradual, 10 variável entre a população masculina e ocasiona uma redução nos andrógenos testiculares, porém não tão drástica ou absoluta, como na castração (VANCE, 2003). Logo, para melhor compreender esse processo são necessários modelos experimentais mais representativos. 1.1 Morfofisiologia da adrenal As adrenais são glândulas endócrinas com formato triangular e achatado, localizadas acima dos rins (KRONENBERG et al., 2016). Elas são recobertas por uma cápsula conjuntiva e divididas em duas regiões principais: medula e córtex, que se localizam, respectivamente, na porção central e na porção periférica da glândula. Essas regiões possuem origens embrionárias distintas e, por essa razão, podem ser consideradas como órgãos distintos por alguns autores. A medula tem origem da crista neural, ou seja, neuroectodérmica, enquanto o córtex tem origem mesodérmica (Junqueira & Carneiro 2013). Elas também se diferenciam quanto à secreção, pois as células da medula secretam catecolaminas, como adrenalina e noradrenalina, enquanto as do córtex secretam hormônios esteroides (KRONENBERG et al., 2016). O córtex adrenal, assim como testículos e ovários, tem origem do primórdio adrenoganadal (AGP), este é formado no epitélio celômico em torno de 28-30 dias pós concepção (dpc) em humanos, e expressa um receptor importante para a formação e esteroidogênese da adrenal, o fator estereidogênico 1 (SF1) (XING et al., 2015). As células progenitoras do córtex migram dorsomedialmente e células da crista neural, que originarão as células cromafins da medula, migram e se misturam a elas (PIHLAJOKI et al., 2015). Até o 52 dpc há o completo encapsulamento do córtex em desenvolvimento, pela formação de um tecido fibroso ao redor do córtex em desenvolvimento (KEEGAN; HAMMER, 2002). Após o encapsulamento há um crescimento do córtex, que apresenta duas regiões diferentes: a zona fetal (Fz), com células maiores e mais eosinófilas e a zona definitiva (Dz), com poucas células pequenas e basófilas (PIHLAJOKI et al., 2015). A adrenal fetal é grande, chegando a ter tamanho similar ao rim, devido a Fz que ocupa maior parte do córtex e sintetiza grandes quantidades de DHEA e SDHEA, hormônios importantes para a manutenção da gestação, uma vez que são convertidos em estrógenos pela placenta (XING et al., 2015). A zona fetal involui por apoptose logo após o nascimento e a zona definitiva se diferencia nas três zonas corticais: Zona glomerulosa (ZG), Zona Fasciculada (ZF) e Zona 41 3 CONCLUSÃO Esse estudo relatou as similaridades do córtex adrenal de gerbilo da Mongólia com primatas, desde a morfologia, expressão de enzimas da biossíntese de andrógenos e cortisol e receptores de andrógenos e estrógenos. Assim descrita a morfofisiologia dessa glândula desde a idade adulta até o envelhecimento também mostrou semelhança, embora estudos complementares ainda sejam necessários para estabelecer se as variações hormonais encontradas nesse modelo podem ser, de fato, caracterizadas como andropausa, adrenarca e adrenopausa. Foi constatado que a adrenal dos gerbilos machos de 12m e 15m apresentam sinais característicos de senescência, como o acúmulo de lipofuscina e hipertrofia, que é, possivelmente, uma resposta compensatória ao decréscimo do metabolismo e dos andrógenos circulantes. Os resultados dessa pesquisa norteiam uma compreensão inicial da complexa morfofisiologia do córtex adrenal do gerbilo da Mongólia durante o envelhecimento, fornecendo informações que indicam que essa espécie seja um possível modelo experimental para estudos da glândula adrenal e de envelhecimento. REFERÊNCIAS ABOOTALEBI, M.; KARGAR, M.; AMINSHARIFI, A. Assessment of the validity and reliability of a questionnaire on knowledge and attitude of general practitioners about andropause. Aging Male, v. 20, n. 1, p. 60–64, 2016. AJDŽANOVIĆ, V. Z. et al. Histological parameters of the adrenal cortex after testosterone application in a rat model of the andropause. Histology and Histopathology, v. 31, n. 11, p. 1209–1220, 2016. AJDŽANOVIĆ, V. Z.; MILOŠEVIĆ, V.; SPASOJEVIĆ, I. B. Glucocorticoid excess and disturbed hemodynamics in advanced age: the extent to which soy isoflavones may be beneficial. General physiology and biophysics, v. 31, p. 367–374, 2012. BAQUEDANO, M. S.; BELGOROSKY, A. 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