Gabriela Bottaro Gelaleti MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DAS INTERLEUCINAS 17B E 25 ASSOCIADAS À MELATONINA COMO INDUTORES DE APOPTOSE EM CULTIVO CELULAR DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS São José do Rio Preto 2015 Câ mp u s d e S ã o J o s é d o Ri o Pr e t o Gabriela Bottaro Gelaleti MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DAS INTERLEUCINAS 17B E 25 ASSOCIADAS À MELATONINA COMO INDUTORES DE APOPTOSE EM CULTIVO CELULAR DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Genética, junto ao Programa de Pós- Graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Profª. Drª. Debora Ap. Pires de Campos Zuccari Co-orientador: Dr. Alicia Viloria-Petit São José do Rio Preto 2015 Gelaleti, Gabriela Bottaro. Modulação da atividade das interleucinas 17B e 25 associadas à melatonina como indutores de apoptose em cultivo celular de neoplasias mamárias / Gabriela Bottaro Gelaleti. -- São José do Rio Preto, 2015 137 f. : il., tabs. Orientador: Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari Coorientador: Alicia Viloria-Petit Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Genética. 2. Câncer – Aspectos genéticos. 3. Mamas - Câncer. 4. Interleucina-17. 5. Melatonina. 6. Apoptose. 7. Neovascularização. I. Zuccari, Debora Aparecida Pires de Campos. II. Viloria-Petit, Alicia. III. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título. CDU – 616-006.6 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Campus de São José do Rio Preto Gabriela Bottaro Gelaleti MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DAS INTERLEUCINAS 17B E 25 ASSOCIADAS À MELATONINA COMO INDUTORES DE APOPTOSE EM CULTIVO CELULAR DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Genética, junto ao Programa de Pós- Graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Profª. Drª. Debora Ap. Pires de Campos Zuccari UNESP – São José do Rio Preto Orientador Profª. Drª. Ana Elizabete Silva UNESP – São José do Rio Preto Profª. Drª. Dorotéia Rossi Silva Souza FAMERP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Alexandre Lima de Andrade UNESP – Araçatuba Profª. Drª. Ana Paula Girol UNESP – São José do Rio Preto / FAMECA - Catanduva São José do Rio Preto 05 de agosto de 2015 Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC) na Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), SP, Brasil, sob orientação da Profa. Dra. Debora Ap. Pires de Campos Zuccari e no Laboratory for Integrated Study of the Mechanisms of Breast Cancer Invasion and Metastasis – University of Guelph, Guelph, Ontario, Canadá, com a co-orientação da Dr. Alicia Viloria-Petit. Os recursos para o desenvolvimento do projeto foram obtidos na forma de Auxílio à Pesquisa (Proc. 2012/06098-0) e bolsa de estudos (Proc. 2012/02128-1/Proc. 2012/25191-0) da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Dedicatória Dedico esse trabalho aos meus pais Jorge e Mirtes e ao meu irmão Rafael, os maiores incentivadores da minha vida. Agradeço pelo apoio, amor incondicional e constante torcida em cada vitória minha. Dedico também ao meu noivo Andre, por todo o carinho, incentivo e apoio. Agradecimentos Agradeço a minha orientadora, Profa. Dra. Debora Zuccari, pela amizade, confiança e todo apoio durante a realização desse trabalho. Agradeço pelos ensinamentos transmitidos e principalmente por ter confiado que eu seria capaz, estando ao meu lado nos momentos de dificuldade e superação. Aos grandes amigos do LIMC: Thaíz F. Borin, Bruna V. Jardim-Perassi, Marina G. Moschetta, Lívia C. Ferreira, Camila Leonel, Larissa B. Maschio, Gustavo R. Martins, Naiane N. Gonçalves, Giovanna R. Varallo, Juliana R. Lopes, Jucimara Colombo, Tialfi Castro, Nathália Sonehara, Rubens P. Junior, Jéssica Z. Lacerda, Alexandra P. Fantinatti e André L. Mota, pela amizade e companheirismo todos os dias. Agradeço por muitos se tornarem amigos para a vida toda e por estarem sempre presentes nos momentos profissionais e pessoais durante todos esses anos. Meu carinho por vocês é eterno. A Dr. Alicia M. Viloria-Petit, minha co-orientadora, por permitir a realização do estágio no exterior na University of Guelph no Laboratory for Integrated Study of the Mechanisms of Breast Cancer Invasion and Metastasis. Agradeço pelo auxílio no desenvolvimento do trabalho e também pela amizade e a de todos os integrantes do grupo de pesquisa, permitindo meu crescimento pessoal e profissional. Agradeço também a Camila Leonel que compartilhou comigo essa experiência maravilhosa. A banca examinadora do exame geral de qualificação, Profa. Dra. Ana Paula Girol e Profa. Dra. Patrícia S. L. Vilamaior pelas sugestões que permitiram melhorar meu trabalho. Aos Professores: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva, Profa. Dra. Dorotéia R. S. Souza, Profa. Dra. Ana Paula Girol e Prof. Alexandre Lima de Andrade por aceitarem fazer parte da banca de defesa. Aos professores, alunos e funcionários da Pós-Graduação em Genética do Ibilce que contribuíram com meu aprendizado. Agradeço especialmente a Profa. Patricia S. L. Vilamaior e ao Prof. Eduardo A. Almeida por me aceitarem no estágio de docência, complementando minha formação. A FAPESP, pela concessão da bolsa de estudos no país (Proc. 2012/02128-1) e exterior (Proc. 2012/25191-0) e Auxílio Financeiro concedido (Proc. 2012/06098-0), indispensáveis para a realização desse projeto. A UNESP/IBILCE e a FAMERP pela infra-estrutura e profissionais que possibilitaram a realização do projeto. Aos meus pais Jorge Luiz Gelaleti e Mirtes Ap. Bottaro Gelaleti. Obrigada pela dedicação, pelo exemplo de vida e companheirismo e por sempre acreditarem em minhas escolhas e que essas me fariam uma pessoa melhor. Ao meu irmão, Rafael Bottaro Gelaleti, pela demonstração de companheirismo e amor a vida toda. Obrigada pelos conselhos, por compartilhar do mesmo ideal, pelas conversas de “Biólogos” e por fazer parte dos momentos felizes da minha vida. Ao meu noivo, Andre Murari Boatto, por todo amor e companheirismo nessa fase da minha vida e em todos os anos que estamos juntos. Agradeço pela compreensão, por acreditar em mim sempre e por me mostrar que a felicidade só aumenta quando compartilhamos nossos sonhos com quem amamos. A minha avó Hermínia Bottaro, pelo amor e exemplo de força, e também a minha avó Dornélia Inês Gelaleti e meus avôs Hilário Bottaro e Jorge João Gelaleti, pelos ensinamentos que levo comigo para toda a vida, com a certeza de que sempre olham por mim. Aos meus tios, tias, primos e primas. Obrigada por estarem sempre presentes na minha vida e desejarem o meu sucesso. Aos meus sogros Nilo Boatto e Márcia Murari Boatto e toda a família Murari pelo carinho e dedicação, sempre torcendo por minha vitória. Aos amigos da faculdade, pela amizade de tantos anos. Em especial a Ana Beatriz M. Tenália e Ariane Zanchetta minhas “BFFs”, obrigada pelo carinho e dedicação sempre. A Tamirys Manzatti, Adauto O. Borguetti e Danilo G. da Silva, amigos queridos. As amigas, Ana Carolina S. Camargo e Natalie P. Cruz pela amizade da vida toda, que a cada ano se renova, agora com a chegada da Theodora e Victoria, lindas da “titia”. E agradeço também a Ingrid Dutra, amiga querida. As amigas de república Ariane Zanchetta, Rafaela R. Brito e Gisele M. Martins pela amizade. A Deus, pela proteção, conduta aos caminhos certos e por me permitir conviver com pessoas tão maravilhosas. Muito obrigada!!! "Não é o que você faz, mas quanto amor você dedica no que faz que realmente importa." Agnes Gonxha Bojaxhiu (Madre Teresa de Calcutá) “Agradeço todas as dificuldades que enfrentei, não fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mas as críticas nos auxiliam muito.” Chico Xavier Sumário SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS............................................................................................ 14 LISTA DE TABELAS........................................................................................... 17 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ..................................................... 19 RESUMO............................................................................................................... 23 ABSTRACT .......................................................................................................... 26 I. INTRODUÇÃO............................................................................................ 29 1. CÂNCER DE MAMA ................................................................................. 29 1.1 Aspectos gerais ................................................................................................ 29 1.2 Microambiente tumoral ................................................................................... 31 2. PROCESSOS ATUANTES NA TUMORIGÊNESE .................................... 34 2.1 ANGIOGÊNESE ............................................................................................. 34 2.2 APOPTOSE ..................................................................................................... 38 2.2.1 Via extrínseca ............................................................................................... 39 2.2.2 Via intrínseca ................................................................................................ 40 3. NOVOS ALVOS TERAPÊUTICOS NO CÂNCER DE MAMA ................ 42 3.1 INTERLEUCINA-25 ..................................................................................... 42 3.2 MELATONINA ............................................................................................. 45 3.2.1 Síntese e degradação ..................................................................................... 45 3.2.2 Receptores da melatonina ............................................................................. 47 3.2.3 Melatonina e câncer ...................................................................................... 48 II. OBJETIVOS ................................................................................................ 52 III. CAPÍTULOS ................................................................................................ 54 Artigo I ................................................................................................................. 56 Artigo II ................................................................................................................ 94 IV. CONCLUSÕES .......................................................................................... 123 V. REFERÊNCIAS ......................................................................................... 125 VI. ANEXOS ..................................................................................................... 136 13 Lista de figuras 14 Lista de figuras Figura 1. Taxas de mortalidade das cinco localizações primárias de neoplasias mais frequentes em 2012, ajustadas por idade, pela população mundial por 100.000 mulheres, Brasil, entre 1979 e 2012. .............................................................................................. 29 Figura 2. Capacidades biológicas adquiridas durante o desenvolvimento de múltiplos passos dos tumores. ....................................................................................................... 32 Figura 3. Representação do tecido inflamatório e do microambiente tumoral invasivo. ........................................................................................................................................ 33 Figura 4. Representação da ativação da angiogênese a partir de células quiescentes. ........................................................................................................................................ 35 Figura 5. Representação das etapas do processo de angiogênese com a participação de inúmeros fatores pró-angiogênicos. ............................................................................... 37 Figura 6. Representação das vias extrínseca e intrínseca da apoptose. ........................ 40 Figura 7. Via extrínseca e intrínseca da ativação da caspase-3. ................................... 42 Figura 8. Esquema representativo da família IL-17 e seus receptores. ........................ 43 Figura 9. Diagrama esquemático da atividade citotóxica da IL-25 em células do câncer de mama que expressam IL-25R. .................................................................................. 44 Figura 10. Esquema da sinalização IL-17RB/IL-17B em células do câncer de mama. 45 Figura 11. Esquema representativo da via de síntese da melatonina. ........................... 46 Figura 12. Esquema da via extrínseca e intrínseca da apoptose. .................................. 49 Figura 13. Ação da melatonina na inibição da proliferação de células tumorais. ........ 50 Artigo 1 Fig. 1. Effect of melatonin and interleukin-25 on viability of cell lines. …….……….. 28 Fig. 2. Gene silencing of IL-17B. .................................................................................. 29 Fig. 3. Cleaved caspase-3 expression in MDA-MB-231. …………………………….. 30 Fig. 4. Cleaved caspase-3 expression in MCF-7. …………………..…...…………… 31 15 Fig. 5. Cleaved caspase-3 expression in MDA-MB-231 and MCF-7 3D structures. ……………………………………………………………………………………….... 32 Fig. 6. Differentially apoptotic protein expression in MDA-MB-231 cells treated with 1 mM of melatonin. ………………………………………………..…………………… 33 Fig. 7. VEGF-A expression in MDA-MB-231. ............................................................. 34 Fig. 8. VEGF-A expression in MCF-7. ……………………………………...……….. 35 Artigo 2 Fig. 1. Effect of melatonin on viability of canine mammary tumor cell lines. ……... 115 Fig. 2. Cleaved caspase-3 expression in CF-41 cells. ……………….………….…. 116 Fig. 3. Cleaved caspase-3 expression in CMT-U229 cells. ……………...…………. 117 Fig. 4. Cleaved caspase-3 expression in CF-41 and CMT-U229 3D structures. ...… 118 Fig. 5. Differentially apoptotic protein expression in CF-41 cells treated with 1 mM of melatonin. …………………………………………………………………………… 119 Fig. 6. VEGF-A expression in CF-41 cells. ……………………………………….... 120 Fig. 7. VEGF-A expression in CMT-U229 cells. …………………………………… 121 16 Lista de tabelas 17 Lista de tabelas Artigo 1 Table 1. Human Apoptosis Array C1 (RayBiotech) contening 43 different factors for analysis of protein expression profile of MDA-MB-231 cells after melatonin treatment. ……………………………………………………………………………………..….. 26 Artigo 2 Table 1. Apoptosis Array C1 (RayBiotech) contening 43 different factors for analysis of protein expression profile of CF-41 cells after melatonin treatment. …………......... 114 18 Lista de abreviaturas e símbolos 19 Lista de abreviaturas e símbolos µL microlitros 3D tridimensional 5-HTP triptofano em 5-hidroxitriptofano AA-NAT N-acetiltransferase ACTB gene beta actina AIF fator de indução de apoptose ANOVA análise de variância APAF-1 do inglês apoptotic protease activating factor 1 APO-1 do inglês accumulation of photosystem one 1 ASK do inglês apoptosis signal-regulating kinase 1 BAD do inglês Bcl-2-antagonist of cell death BAR do inglês bifunctional apoptosis regulator BCA do inglês bicinchoninic acid Bcl-2 Bax do inglês B-cell lymphoma 2 do inglês Bcl-2-associated X protein BCLW do inglês Bcl-2-like protein 2 BID do inglês BH3 interacting-domain death agonist bFGF do inglês basic fibroblast growth factor BIM do inglês bisindolylmaleimide-based protein kinase C (PKC) inhibitors BIRC do inglês baculoviral IAP repeat-containing protein 3 cAMP do inglês adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate CARD do inglês caspase activation and recruitment domains Caspase do inglês cysteine-aspartic proteases or cysteine-dependent aspartate- directed proteases cDNA DNA complementar CFI do inglês Canadian Foundation for Innovation cm2 centímetros quadrados CO2 fórmula química do gás carbônico CYTO-C do inglês cytochrome c DAPI do inglês 4',6-diamidino-2-phenylindole DD domínio de morte DED domínio efetor de morte DISC complexo de sinalização de morte DMEM do inglês Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO do inglês dimethylsulfoxide DR do inglês death receptor EGF do inglês endothelial growth factor ELISA do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay FADD do inglês fas-associated protein with death domain FAPERP Fundação de Amparo à Pesquisa de São José do Rio Preto FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAS do inglês first apoptosis FBS soro fetal bovino, do inglês fetal bovine serum FoxO3A do inglês Forkhead box O3 20 GAPDH do inglês glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GPCR do inglês G-protein coupled receptor HIF-1α do inglês hypoxia-inducible factor 1-alpha HER2 receptor do fator de crescimento epidermal 2 HIOMT hidroxi- indol-Ometiltransferase HRP do inglês horseradish peroxidase HSP do inglês heat shock protein hTRA do inglês high-temperature requirement A serine peptidase HuMEC do inglês Basal Human Mammary Epithelial Cell IAPs inibidores de proteínas apoptóticas IARC do inglês International Agency for Research on Cancer IGF-1 do inglês insulin-like growth factor 1 IGFBP do inglês growth factor insulin-binding protein IL interleucina INCA Instituto Nacional do Câncer iNOS espécies reativas de oxigênio JNK do inglês c-Jun N-terminal kinase kDa kilodaltons LIMC Laboratório de Investigação Molecular no Câncer M.O.D. densidade óptica média MAPK gene da família MAPK quinase MEC matriz extracelular mg miligrama mL mililitro mM milimolar MMPs matrix metaloproteinases MPT transição de permeabilidade mitocondrial MRI do inglês Ministry of Research Infrastructure mRNA RNA mensageiro MTNR1A/MT1 do inglês melatonin receptor-1 MT2 do inglês melatonin receptor-2 MTT do inglês 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay Na3VO4 do inglês phosphatase inhibitor cocktail NAS N-acetilserotonina NF-kB do inglês nuclear factor-κB ng nanograma NRP2 do inglês neuropilin 2 ºC graus celsius P21 do inglês cyclin-dependent kinase inhibitor 1 P53 do inglês tumor protein p53 PARP do inglês poly (ADP-ribose) polymerase PBS tampão fosfato salino PDGF do inglês platelet-derived growth factor PIGF fator de crescimento placentário PKA do inglês protein kinase A 21 PKC do inglês protein kinase C PLAU do inglês urokinase-plasminogen activator qPCR do inglês quantitative polimerase chain reaction RE receptor de estrogênio RNA ácido ribonucléico ROR do inglês receptor orphan receptor ROS do inglês reactive oxygen species RP receptor de progesterona RPS19 gene ribosomal protein-19 RPS5 gene ribosomal protein-5 RZR receptor Z para retinóide RZR/ROR receptor Z para retinóide/receptor órfão para retinóide SMAC do inglês second mitochondria-derived activator of caspases siRNA do inglês silence RNA TGF-b do inglês transforming growth factor beta Th2 do inglês t helper-2 Tie-1 do inglês receptor tyrosine kinase of angiopoietin-1, tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1 Tie-2 do inglês receptor tyrosine kinase of angiopoietin-1 TNF do inglês tumor necrosis factor TNFRII do inglês tumor necrosis factor receptor II TNFR-II do inglês Tumor necrosis factor receptor 2 TNM sistema de estadiamento clínico, T= tumor, N=linfonodo (do inglês node), M= metástase TPH1 triptofano hidroxilase 1 TRADD do inglês TNFRSF1A-associated via death domain TRAIL do inglês TNF-related apoptosis-inducing ligand TRAF do inglês TNF receptor-associated factor u.a. unidades arbitrárias VEGF do inglês vascular endothelial growth factor VEGFR do inglês vascular endothelial growth factor receptor XIAP do inglês X-linked inhibitor of apoptosis protein 22 Resumo 23 RESUMO O desenvolvimento da carcinogênese mamária envolve a neovascularização, desregulação da diferenciação e apoptose nas células neoplásicas e no microambiente que estão inseridas. Está estabelecido que tais efeitos podem ser controlados pela melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal, que tem ação oncostática em células tumorais e modula a expressão de interleucinas (ILs). A IL-25, também conhecida como IL-17E, é uma citocina ativa em processos inflamatórios, capaz de induzir a apoptose em células tumorais devido à expressão diferencial do seu receptor (IL-17RB). Sabe-se que a IL-17B compete com a IL-25 pela ligação ao receptor IL-17RB em células tumorais, promovendo a tumorigênese. O objetivo deste estudo foi verificar a ação da melatonina e da sinalização IL-25/IL-17B no processo de apoptose e angiogênese em células tumorais mamárias. Linhagens tumorais mamárias humanas, metastática (MDA-MB-231) e não-metastática (MCF-7) e caninas, metastática (CF-41) e não-metastática (CMT-U229), e a linhagem epitelial mamária humana não tumorigênica (MCF-10A) foram cultivadas em monocamada e em estruturas tridimensionais em matriz extracelular ricas em laminina e tratadas por 48 horas com melatonina, IL-25, siIL-17B e os três tratamentos combinados. A viabilidade celular foi mensurada pelo ensaio de MTT, a expressão gênica e proteica por qRT-PCR e imunofluorescência, respectivamente. Além disso, uma análise quantitativa de proteínas presentes na via apoptótica foi realizada após o tratamento com melatonina nas células MDA-MB-231 e CF-41. Os tratamentos com 1 mM de melatonina e 1 ng/mL de IL-25 reduziram significativamente a viabilidade das linhagens tumorais humanas (p < 0,05) e não alteraram a viabilidade celular da linhagem MCF-10A (p > 0,05). Nas linhagens caninas, apenas 1 mM de melatonina reduziu significativamente a viabilidade celular (p < 0,05). Todos os três tratamentos independentes e combinados foram capazes de aumentar significativamente a 24 expressão proteica da caspase clivada-3 em todas as linhagens cultivadas em monocamada e em modelo 3D (p < 0,05), o que confirma o potencial pró- apoptótico dos tratamentos nas linhagens tumorais mamárias. A análise semi- quantitativa das proteínas envolvidas na via apoptótica, mostrou aumento das proteínas pró-apoptóticas CITO-C, DR6, IGFBP-3, IGFBP-5, IGFPB-6, IGF-1, IGF-1R, LIVINA, P21, P53, TNFRII, XIAP e hTRA (p <0,05) nas células MDA- MB-231 e redução da caspase-3 (p = 0,04). Para as células CF-41, o tratamento com melatonina foi capaz de aumentar a expressão das proteínas BCLW e IGF-1 e -2 (p < 0,05) e reduzir as proteínas BAD, IGFBP1 e TNFRII (p < 0,05). Todos os tratamentos reduziram a expressão da proteína VEGF-A nas linhagens tumorais mamárias humanas e caninas (p < 0,05). Nossos achados sugerem o potencial terapêutico, com eficácia oncostática, propriedades pró- apoptóticas e anti-angiogênicas da melatonina e da sinalização IL-25/siIL-17B no câncer de mama. Palavras-chave: câncer de mama, melatonina, interleucina-25, interleucina- 17E, interleucina-17B, apoptose, VEGF-A, angiogênese. 25 Abstract 26 ABSTRACT The development of mammary carcinogenesis involves neovascularization, deregulation of differentiation and apoptosis in tumor cells and the microenvironment. It is established that such effects may be controlled by melatonin, a hormone produced by the pineal gland that has oncostatic action on tumor cells and modulates interleukins (ILs) expression. IL-25, also known as IL-17E, is an active cytokine in inflammatory processes, capable of inducing apoptosis in tumor cells because of differential expression of its receptor (IL- 17RB). It is known that IL-17B competes with IL-25 for binding to receptor IL- 17RB on tumor cells, promoting tumorigenesis. The aim of this study was to investigate the action of melatonin and IL-25/IL-17B signaling in apoptosis and angiogenesis in breast tumor cells. Metastatic (MDA-MB-231 and CF-41), non- metastatic (MCF-7 and CMT-U229) human and canine mammary tumor cell lines and human non-tumorigenic mammary epithelial cells (MCF-10A) were cultured in monolayer and three-dimensional structures on extracellular matrix rich in laminin (ECM) and treated for 48 hours with melatonin, IL-25, siIL-17B and the three combination therapies. Cell viability was measured by MTT assay, gene and protein expression by qRT-PCR and immunofluorescence, respectively. Also, a quantitative analysis of proteins present in the apoptotic pathway was performed after treatment with melatonin in the MDA-MB-231 and CF-41 cells. The treatment with 1 mM melatonin and 1 ng/mL of IL-25 significantly reduced the viability of human tumor cell lines (p < 0.05) and did not alter the cell viability of MCF-10A cells (p > 0.05). In canine cell lines, only 1 mM melatonin significantly reduced cell viability (p < 0.05). All three independent and combined treatments were able to significantly increase the protein expression of cleaved caspase-3 in all the tumor cells in monolayer and 3D structures (p < 0.05), which confirms the pro-apoptotic potential of the treatments in mammary tumor cell lines. Likewise, all treatments reduced the 27 expression of VEGF-A protein in human and canine mammary tumor cell lines (p < 0.05). The semi-quantitative analysis of proteins involved in the apoptotic pathway showed an increase of pro-apoptotic proteins DR6, IGFBP-3, IGFBP-5, IGFPB-6, IGF-1sR, LIVIN, P21, P53, TNFRI, xIAP and hTRA in MDA-MB-231 (p < 0.05) and reduction of caspase-3 cells (p = 0.04). For the CF-41 cells, treatment with melatonin was able to increase expression of proteins BCLW and IGF-1 and -2 (p < 0.05) and reduce proteins BAD, IGFBP1 and TNFRII (p < 0.05). Our findings suggest the oncostatic efficacy, pro-apoptotic and anti- angiogenic properties of melatonin and IL-25/IL-17B signaling as therapeutic potential in breast cancer. Keywords: Breast cancer, melatonin, interleukin-25, interleukin-17E, interleukin- 17B, apoptosis, VEGF-A, angiogenesis. 28 Introdução 29 I. INTRODUÇÃO 1. CÂNCER DE MAMA 1.1 Aspectos gerais Dados do IARC (Agência Internacional de Pesquisa no Câncer; Julho, 2015) estimam 14 milhões de novos casos de câncer no mundo para este ano, com previsão de 8.2 milhões de óbito (IARC). O câncer de mama representa a maior causa de morte por câncer em mulheres e, no Brasil, segundo dados do INCA (Instituto Nacional do Câncer; Julho 2015), estimou-se a ocorrência de 57.120 novos casos para o ano de 2014 e a mesma freqüência é esperada para o ano de 2015 (INCA). As taxas de mortalidade por câncer de mama continuam elevadas, sendo a capacidade de invasão das células tumorais e consequente desenvolvimento de metástases, as principais causas de mortalidade em mulheres portadoras desta neoplasia (Santos et al., 2010). Na população mundial, a sobrevida média das pacientes após cinco anos de acompanhamento é de 61 % e, apesar do progresso no diagnóstico e tratamento nos últimos 30 anos, essa doença é, ainda, responsável por quase meio milhão de mortes por ano no mundo (Snoussi et al., 2010) (Figura 1). Figura 1. Taxas de mortalidade das cinco localizações primárias de neoplasias mais frequentes em 2012, ajustadas por idade, pela população mundial por 100.000 mulheres, Brasil, entre 1979 e 2012. Fonte: INCA, 2014. Dentre todos os mamíferos, a espécie canina apresenta a maior incidência de neoplasias mamárias, representando aproximadamente 52 % do total (Brodey, Goldschmidt e Roszel, 1983; Sleeckx et al., 2013), e, quando comparada à mulher, possui três vezes mais chances de desenvolvê-la (Krol et al., 2009; Gelaleti et al., 2012; 30 Michel et al., 2012; Pawłowski et al., 2013). A prevalência de câncer de mama nessa espécie tem aumentado ao longo dos anos, sendo que a incidência de lesões malignas está em torno de 26 a 73 % (MacEwen, 1990; Gelaleti et al., 2012; Zuccari et al., 2012). Tumores da glândula mamária partilham características comuns entre cães e seres humanos. Por esta razão, são excelentes modelos para o estudo da biologia do câncer assim como para testes de agentes terapêuticos, já que animais de estimação têm tumores com apresentação histopatológica similares àqueles que acometem a mulher e por apresentarem uma resposta semelhante à cirurgia e a esquemas de quimioterapia (Andrade et al., 2010; Phillips, Lembcke e Chamberlin, 2010; Rasotto et al., 2014; Rismanchi et al., 2014). O grau histológico do tumor e o estadiamento clínico pelo sistema de graduação TNM, que abrange a avaliação do tamanho tumoral, presença de metástase em linfonodos regionais (do inglês node) e de metástase à distância permitem estabelecer o prognóstico e o planejamento terapêutico do câncer de mama (Pedersen et al., 2004). Além dos fatores clínico-patológicos, o conhecimento das características moleculares dos tumores tem contribuído com a avaliação mais precisa do prognóstico, e com o desenvolvimento e incorporação de novos agentes e estratégias terapêuticas (Gonzalez- Angulo, Morales-Vasquez e Hortobagyi, 2007; Gralow et al., 2008; Hicks e Kulkarni, 2008; Duffy, O'Donovan e Crown, 2011). A classificação prognóstica atual considera além dos subtipos histológicos os subtipos moleculares (Perou, 2011), caracterizados nos seguintes fenótipos: Luminal A (receptor de estrogênio (RE) positivo e/ou receptor de progesterona (RP) positivo e receptor do fator de crescimento epidermal 2 negativo (HER2-); Luminal B (RE+ e/ou RP+, HER2+); Basal like (RE-, RP-, HER2-, citoqueratina 5/6+ e/ou HER1+); HER2 superexpresso (RE-, RP-, HER2+). Esses subtipos moleculares apresentam comportamentos distintos relacionados com a sobrevivência, prognóstico e resposta à terapêutica específica. Os subtipos luminais A tem baixa taxa de proliferação e são acompanhados de um bom prognóstico. Os luminais B tem alta taxa de proliferação e um prognóstico mais pobre que o luminal A. Portanto, o status do HER2 e dos receptores hormonais, RE e RP, são fatores prognósticos e preditivos que foram incorporados à rotina clínica e permitem que se 31 estabeleça um tratamento individualizado (Hsiao et al., 2010). A imunoexpressão do RE e RP, por exemplo, está associada ao melhor prognóstico da doença (Duffy, O'Donovan e Crown, 2011). O HER2 tem expressão alterada em aproximadamente 10- 15 % dos casos. Essa alteração está diretamente associada com o pior prognóstico, resistência à quimioterapia e terapia hormonal e aumento da proliferação celular (Jukkola et al., 2001). Quanto ao tratamento personalizado, o uso de trastuzumabe (Herceptin) em pacientes com câncer de mama que apresentam superexpressão da proteína HER2 é um exemplo de sucesso da terapia-alvo com anticorpos monoclonais. Já a positividade para o RE é um fator preditivo de resposta ao quimioterápico Tamoxifeno (Hsiao et al., 2010). Porém, os tumores chamados triplo-receptor-negativos (RE-, RP- e HER2-) são caracterizados por um pior prognóstico, uma vez que não respondem a tratamentos específicos, relacionando-se a ocorrência de metástases e menor sobrevida das pacientes. Esses dados mostram a importância da expressão de um ou mais imunomarcadores como uma informação útil, e muitas vezes conclusiva, na prática clínica (Thomas e Berner, 2000), permitindo que estratégias de tratamento sejam definidas de maneira mais eficaz e com menor toxicidade (Gonzalez-Angulo, Morales- Vasquez e Hortobagyi, 2007; Hicks e Kulkarni, 2008; Duffy, O'Donovan e Crown, 2011). 1.2 Microambiente tumoral O câncer é um processo complexo que se desenvolve em várias etapas determinadas por perturbações genéticas, como a ativação de oncogenes ou silenciamento de genes supressores tumorais, além de eventos epigenéticos que podem ocorrer no interior das células (Hahn e Weinberg, 2002; Baylin, 2005; Bartels e Tsongalis, 2009; Pierce et al., 2009). Além disso, a perda de mecanismos reguladores que controlam o comportamento normal das células tem importante ação no microambiente tumoral através da atuação de diversos fatores (Hahn e Weinberg, 2002; Baylin, 2005; Bartels e Tsongalis, 2009). As influências do microambiente tumoral que relacionam os fatores pró e anti- inflamatórios atuantes tem importância crescente (Baylin, 2005; Hahn e Weinberg, 32 2002; Pierce et al., 2009). Os tumores sólidos são reconhecidos por um microambiente complexo que envolve interações de diferentes componentes celulares e moleculares (Joyce e Pollard, 2009; Egeblad, Nakasone e Werb, 2010), reforçando a necessidade de estudos que esclareçam sua influência no desenvolvimento tumoral e resposta a tratamentos. Em 2011, Hanahan e Weinberg postularam diretrizes agrupando 10 principais características das células tumorais, dentre elas a alta taxa de proliferação celular e replicação contínua (ultrapassando o controle o ciclo celular), resistência a morte celular (evadindo o processo de apoptose), capacidade de invasão e metástase (ativando a neovascularização), instabilidade genômica com acúmulo de mutações, desregulação do metabolismo energético, evasão do sistema imune e infiltração inflamatória, sendo este um dos fatores contribuintes para o pior prognóstico nas neoplasias mamárias (Figura 2). Figura 2. Capacidades biológicas adquiridas durante o desenvolvimento de múltiplos passos dos tumores. Adaptado de Hanahan; Weinberg, (2011). O microambiente tumoral é um sistema dinâmico e, portanto, formado em grande parte por células inflamatórias que liberam suas citocinas. A interação desses 33 fatores pode estimular a proliferação e sobrevivência de células com danos no DNA, e o acúmulo dessas alterações genéticas permite a evolução para a malignidade (Condeelis e Pollard, 2006) (Figura 3). Algumas células, que regulam a expressão de citocinas e quimiocinas para ajudar no recrutamento de células inflamatórias e agir contra as células tumorais, atuam de maneira contrária no microambiente tumoral, utilizando esses fatores para promover o crescimento e a progressão tumoral (Richmond e Thomas, 1986). Além disso, as células tumorais são capazes de evadir os principais mecanismos de ação do sistema imunológico, se beneficiando com a inflamação no microambiente tumoral (Coussens e Werb, 2002). Figura 3. Representação do tecido inflamatório e do microambiente tumoral invasivo. A. Tecido em processo inflamatório, representação da arquitetura desorganizada. B. Tecido neoplásico de carcinoma invasivo com arquitetura desorganizada, neovascularização, presença de tecidos linfáticos e matriz extracelular remodelada que interagem com outros tipos celulares, como citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. Adaptado de Coussens e Werb (2002). Apesar dos avanços terapêuticos, a taxa de mortalidade por câncer de mama continua crescendo. Os padrões de recidiva são relacionados à resistência a múltiplas terapias (tais como combinações de quimioterapia, radiação ionizante e imunoterapia) que refletem as respostas multifatoriais desse tipo tumoral (Mohammad et al., 2015). Nesse sentido, um importante foco das pesquisas no câncer de mama tem sido melhorar 34 o entendimento da relação dos componentes moleculares com a doença, a fim de identificar possíveis marcadores preditivos e prognósticos, bem como, novos alvos terapêuticos e, assim, desenvolver novas estratégias terapêuticas (Ali et al., 2010; Levashova et al., 2010; Park et al., 2010). 2. PROCESSOS ATUANTES NA TUMORIGÊNESE 2.1 ANGIOGÊNESE A angiogênese é um processo de formação de novos vasos sanguíneos, a partir de um endotélio vascular preexistente, que visa o fornecimento de nutrientes e oxigênio e, assim, permitir a proliferação das células e consequente crescimento e progressão do tumor (Takahashi e Shibuya, 2005; Gavalas et al., 2013). Além disso, permite a retirada do gás carbônico (CO2) e dos resíduos metabólicos do leito neoplásico, representando ainda, uma importante via de disseminação metastática (Zhang et al., 2010; Liu e Ouyang, 2013). Nesse contexto, o crescimento tumoral se inicia lentamente e, à medida que a disponibilidade de oxigênio e nutrientes diminui, ocorre a ativação do “interruptor angiogênico” (angiogenic switch), que induz o aumento dos fatores pró-angiogênicos e diminuição dos anti-angiogênicos, garantindo o crescimento exponencial do tumor. Assim, as células endoteliais quiescentes passam a responder a estímulos de proliferação e migração para formação de novos vasos (Bergers e Benjamin, 2003) (Figura 4). 35 Figura 4. Representação da ativação da angiogênese a partir de células quiescentes. Adaptado de http://www.clinicaloptions.com/ Durante seu crescimento, o tumor pode alcançar aproximadamente 1-2 mm3 antes que suas demandas metabólicas sejam restritas devido ao limite de difusão de oxigênio e nutrientes no local (Carmeliet e Jain, 2011). A hipóxia ou baixa oxigenação pode ocorrer em decorrência da proliferação descontrolada das células e do rápido crescimento tumoral e, também, da perfusão inadequada em parte do tecido resultante da estrutura caótica dos novos vasos sanguíneos formados (Carmeliet e Jain, 2000; Harris, 2002; Vordermark, 2010). De acordo com a intensidade, a hipóxia pode resultar em apoptose, ou induzir respostas adaptativas de sobrevivência celular (Sadri e Zhang, 2013; Zhang e Liu, 2013). Assim, ao contrário das células normais, para manter a sobrevivência em situações de hipóxia, as células tumorais são capazes de promover mecanismos adaptativos, como a indução de fatores envolvidos no processo de angiogênese (Kallergi et al., 2009). A formação de novos vasos sanguíneos pela angiogênese envolve um número sequencial de passos e se inicia a partir de capilares pré-existentes no tumor. Além disso, diversas moléculas participam, como as angiopoitinas 1 e 2 e seus receptores Tie- 1 e Tie-2, angiogenina, metaloproteinases (MMPs), fator de crescimento placentário http://www.clinicaloptions.com/ 36 (PIGF), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento endotelial (EGF), fator de crescimento semelhante a insulina-1 (IGF-1), citocinas pró- inflamatórias, entre outros (Arbab, 2012). Inicialmente, as células endoteliais quiescentes são ativadas por fatores liberados pelas células tumorais em resposta a condições adversas como privação de nutrientes e oxigênio. Posteriormente, fatores de crescimento pró-angiogênicos produzidos e liberados pelas células tumorais, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e angiopoitina-2 atuam na desestabilização inicial dos vasos pré-existentes e aumento da permeabilidade vascular, levando a degradação da membrana basal e matriz extracelular, pela sua capacidade de induzir a síntese de enzimas proteolíticas tais como as MMPs, permitindo a remodelação da matriz, e eventual liberação de fatores pró- angiogênicos. Em seguida, ocorre a proliferação e migração das células endoteliais, bem como a formação do tubo, recrutamento e diferenciação de periquitos e células de suporte perivascular. Nessa etapa inúmeros fatores estão envolvidos como VEGF, angiogenina, PDGF, bFGF, EGF, entre outros. Ao final, ocorre a maturação e estabilização dos novos vasos formados, com a participação de fatores como a angiopoitina-1 e seu receptor Tie-2 (Bergers e Benjamin, 2003; Pradeep, Sunila e Kuttan, 2005; Milkiewicz et al., 2006; Clapp et al., 2009; Coulon et al., 2011; Weis e Cheresh, 2011) (Figura 5). 37 Figura 5. Representação das etapas do processo de angiogênese com a participação de inúmeros fatores pró-angiogênicos. Adaptado de Gacche; Meshram, 2013. O VEGF é um potente mitógeno que atua em diferentes etapas do processo angiogênico, promovendo o aumento da permeabilidade vascular, estimulação da migração, proliferação e invasão de células endoteliais (Shibuya, 2011). Esse fator foi primeiramente descrito em células endoteliais e, portanto, denominado “fator de crescimento endotelial vascular”, no entanto, o VEGF pode exercer ação mitogênica em outros tipos celulares (Ferrara e Davis-Smyth, 1997). O VEGF é composto por uma família de cinco isoformas denominadas VEGF- A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PIGF, os quais ligam-se a receptores específicos do tipo tirosina quinase, promovendo uma cascata de eventos intracelulares (Brito et al., 2011; Finley, Dhar e Popel, 2013). Cada isoforma pode ativar um ou mais receptores conhecidos, como VEGFR1, localizado na superfície de células hematopoiéticas, macrófagos e monócitos, VEGFR2, encontrado no endotélio vascular e linfático e o VEGFR3, localizado predominantemente no endotélio linfático (Stefanini et al., 2008; Taneja et al., 2010). Receptores de VEGF também são encontrados em células tumorais, 38 e podem estimular o crescimento celular de maneira autócrina (Weis e Cheresh, 2011; Arbab, 2012). O VEGF–A se liga a dois receptores específicos, o VEGFR1 e o VEGFR2 enquanto o VEGF–B e PGF são reconhecidos apenas pelo receptor VEGFR1. O VEGF- C e VEGF-D se ligam ao VEGFR2 e também são reconhecidos pelo VEGFR3. A ligação entre o VEGF-A e VEGFR2 é considerada o mais importante passo do processo de angiogênese (Woolard et al., 2004; Coulon et al., 2011), enquanto a ligação de VEGF-C com VEGFR3 está envolvida no processo de linfangiogênese (Brito et al., 2011). Nesse contexto, dada a variedade de sinais envolvidos no processo angiogênico, diversos fatores podem ser considerados alvos terapêuticos, auxiliando no bloqueio da progressão do câncer (Arbab, 2012). 2.2 APOPTOSE A morte celular pode ocorrer por um espectro de vias morfologicamente e bioquimicamente distintas, incluindo a apoptose, necrose e autofagia. O termo "apoptose", descrito por Kerr, Wyllie e Currie (1972) caracteriza-se por alterações morfológicas, incluindo retração celular, condensação da cromatina, perda da integridade da membrana nuclear, formação de vesículas na membrana plasmática e corpos apoptóticos. Os mecanismos de apoptose são altamente complexos e sofisticados e envolvem uma cascata de eventos moleculares dependentes de energia. Existem duas principais vias apoptóticas descritas: extrínseca ou via do receptor de morte e intrínseca ou via mitocondrial. Há evidências de que ambas as vias são vinculadas e que moléculas de uma via podem influenciar na outra. Existe ainda uma via adicional que envolve citotoxicidade mediada por células T e é considerado um processo independente da caspase (cysteine-aspartic proteases) que pode ser iniciado pelo fator de indução de apoptose (FIA) (Proietti et al., 2014). As três vias convergem para o mesmo terminal, ou via de execução – a apoptose celular. As vias intrínseca e extrínseca da apoptose podem ser desencadeadas por diversos estímulos extracelulares e intracelulares que resultam na ativação coordenada 39 de uma família de proteases de cisteína chamada caspases. Estímulos externos podem ocorrer através da interação de receptores e ligantes da família do fator de necrose tumoral (TNF, Fas ligand, TRAIL) e estímulos internos, como privação de fatores de crescimento, danos no DNA, hipóxia ou ativação de oncogenes (Grivicich et al., 2007). Caspases desempenham um papel crítico na execução da apoptose em variados tipos celulares. A maioria das caspases são sintetizadas como pró-enzimas inativas e posteriormente ativadas (adquirindo sua forma clivada) e tornam o processo de morte celular irreversível. A clivagem ocorre por auto-proteólise e/ou a partir de ações de outras proteínas, consistindo em subunidades grandes (17-20 kDa) e pequenas (10-12 kDa). Aproximadamente 14 caspases foram descritas em mamíferos, classificadas como iniciadoras (exemplo: caspase-2, 8, 9, 10), efetoras ou executoras (exemplo: caspase-3, 6, 7) e inflamatórias (exemplo: caspase-1, 4, 5) (Elmore, 2007). 2.2.1 Via extrínseca A via de sinalização extrínseca da apoptose envolve a interação de receptores transmembrana. Estes fatores incluem receptores de morte (death receptors DRs), membros da superfamília de genes receptores de TNF como TNF receptor-1 (TNFRa), CD95 (também chamado Fas e APO-1), receptor de morte 3 (death receptor DR3), TNF indutor de apoptose receptor-1 ligante (TRAIL-R1, também chamado DR4) e TRAIL- R2 (também chamado DR5). Os membros da família de receptores TNF compartilham domínios extracelulares ricos em cisteína e tem um domínio citoplasmático de cerca de 80 aminoácidos denominado "domínio de morte" (DD). Estes domínios de morte desempenham papel fundamental na transmissão do sinal de morte a partir da superfície celular para as vias de sinalização intracelulares. A ligação de ligantes DR a receptores faz com que a proteína pró-caspase-8 seja recrutada via DED (domínio efetor de morte) ao complexo de sinalização de morte (DISC) que também inclui proteínas Adaptadoras de Sinalização de Receptores de Domínio de Morte (FADD) ou TNFR-associada ao domínio de morte (TRADD). FADD então associa-se a pró-caspase-8 por meio da dimerização do DED e, uma vez ativada a caspase-8, a apoptose é desencadeada (Elmore, 2007; McIlwain, Berger e Mak, 2013; Mohammad et al., 2015) (Figura 6). 40 Figura 6. Representação das vias extrínseca e intrínseca da apoptose. Adaptado de Elmore (2007). 2.2.2 Via intrínseca A via de sinalização intrínseca que inicia a apoptose envolve um conjunto diversificado de estímulos não mediados por receptores que produzem sinais intracelulares e atuam diretamente em alvos mitocondriais no interior da célula. Os estímulos que iniciam a via intrínseca da apoptose produzem sinais intracelulares que podem atuar de forma positiva ou negativa. Sinais negativos envolvem a ausência de alguns fatores de crescimento, hormônios e citocinas que podem levar à insuficiência de fatores de supressão de morte celular, desencadeando a apoptose. Sinais positivos incluem radiação, toxinas, hipóxia, hipertermia, infecções virais e presença de radicais livres (Elmore, 2007; McIlwain, Berger e Mak, 2013; Mohammad et al., 2015). Todos estes estímulos causam alterações na parte interna da membrana mitocondrial, resultando na abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT). A perda do potencial mitocondrial transmembrana ocasiona a liberação de dois grupos principais de proteínas pró-apoptóticas do espaço 41 intermembranas para o citosol (Elmore, 2007; McIlwain, Berger e Mak, 2013; Mohammad et al., 2015). A caspase iniciadora da via intrínseca da apoptose é a caspase-9, que é ativada por dimerização induzida quando o domínio de recrutamento de caspase (CARD) liga- se à Apaf-1 (proteína humana fator de ativação de protease associada à apoptose 1), formando o “apoptossomo”. Além disso, a ativação da via intrínseca da apoptose é dependente da inativação das IAPs (inibidores de proteínas apoptóticas) (Elmore, 2007; McIlwain, Berger e Mak, 2013; Mohammad et al., 2015). O segundo grupo de proteínas pró-apoptóticas, FIA, endonuclease G e CAD, são liberadas a partir da mitocôndria durante a apoptose. Esse grupo de proteínas participam do evento tardio da apoptose. O controle e a regulação destes eventos apoptóticos mitocondriais ocorrem através de membros da família de proteínas Bcl-2 (proteína da célula B linfoma 2), que regulam a permeabilidade da membrana mitocondrial e podem atuar tanto a favor como contra a apoptose. O principal mecanismo de ação da família Bcl-2 é a regulação da liberação do citocromo c das mitocôndrias através da alteração da permeabilidade da membrana mitocondrial. Alguns mecanismos têm sido estudados, mas nenhum foi comprovado definitivamente. Assim, a elucidação destas vias tem implicações importantes na tumorigênese (Elmore, 2007; McIlwain, Berger e Mak, 2013; Mohammad et al., 2015) (Figura 6). A caspase-3 é denominada mediador chave na apoptose, desempenhando papel crucial no sistema nervoso, sendo ativada por ambas as vias extrínseca e intrínseca da apoptose. Em resposta a vários sinais de morte, a proenzima caspase-3 é ativada pela clivagem proteolítica de Asp28-Ser29 e Asp175-Ser176 através das ligações catalíticas pela granzima B, caspase-6, caspase-8, caspase-9 e caspase-10 gerando duas subunidades (p17) e (p12), formando um heterodímero ativo. Embora o precursor da caspase-3 esteja localizado no citoplasma, a caspase-3 desempenha funções essenciais no núcleo das células apoptóticas (Elmore, 2007; McIlwain, Berger e Mak, 2013; Mohammad et al., 2015) (Figura 7). 42 Figura 7. Via extrínseca e intrínseca da ativação da caspase-3. Visão geral da ativação da caspase-3. Setas indicam conversões químicas ou reações catalisadas enquanto setas com bloqueio representam inibição. Adaptado de Harrington et al. (2008). A apoptose é alvo de potencial uso na prática clínica e para a compreensão dos mecanismos de resistência à radioterapia e à quimioterapia (Grivicich et al., 2007). Assim, várias tentativas têm sido feitas na última década para desenvolver moléculas capazes de direcionar a ativação da caspase-3 para utilização na terapia do câncer (McIlwain, Berger e Mak, 2013). 3. NOVOS ALVOS TERAPÊUTICOS NO CÂNCER DE MAMA 3.1 INTERLEUCINA-25 No câncer de mama invasivo, as células mioepiteliais e a membrana basal são invadidas, deixando as células tumorais em contato direto com o estroma intersticial remodelado, compreendendo fibroblastos e miofibroblastos, células vasculares tumorais e um número considerável de células-imune infiltradas, como linfócitos, macrófagos e mastócitos (Inman e Bissell, 2010). Um estudo de Furuta et al. (2011) mostrou que 43 células mioepitelias não malignas secretam fatores que inibem o crescimento e/ou sobrevivência de células malignas, bem como acionam mecanismos subjacentes a esta atividade antitumoral intrínseca, sendo constatada a liberação da interleucina (IL)-25, também conhecida como IL-17E, denominada citocina antitumoral. O papel das células Th17 no câncer permanece incerto, com ações controversas na inibição e progressão de tumores (Lyon et al., 2008). As ILs-17 mediam seus efeitos pró-inflamatórios através de seus receptores, expressos em todos os tipos celulares (Aggarwal e Gurney, 2002; Korn et al., 2009). A família IL-17 compreende seis citocinas, IL-17A, B, C, D, E e F, produzidas pela ativação de células T de memória, e compartilham ações semelhantes na maquinaria intracelular (Lyon et al., 2008). Cinco receptores foram descritos, sendo que IL-17A liga-se aos receptores IL-17RA/IL-17RC, enquanto a IL-17E, liga-se ao heterodímero IL-17RA/RB (Figura 8). Figura 8. Esquema representativo da família IL-17 e seus receptores. Lyon et al. (2008). A IL-25 é uma citocina pró-inflamatória, altamente expressa em alguns órgãos, tais como testículos, próstata e baço, e expressa em baixas quantidades em outros, incluindo o epitélio mamário. É o membro mais distante da família das proteínas IL-17, partilhando apenas 16 a 30 % de homologia com os demais membros da família (Furuta et al., 2011). Ao contrário dos efeitos pró-inflamatórios associados com a família de IL- 17, a IL-25 parece ser uma citocina pleiotrópica que desempenha respostas sistêmicas 44 do tipo t helper-2 (Th2) com alterações imunológicas e patológicas tecido-específicas, incluindo, mas não se limitando, a alteração na expressão das interleucinas IL-4, 5 e 13. Estudo de Furuta et al. (2011) definiu que a interação entre IL-25 e seu receptor IL-25R (também chamado IL-17RB) envia um sinal de morte celular, promovendo a indução da apoptose em células neoplásicas enquanto células não malignas apresentam resistência a essa ligação, conferida pela expressão diferencial do receptor. No entanto, embora células cancerosas expressem o receptor, elas não expressam o ligante apoptótico (IL-25), podendo expressar outro ligante que contribui para seu potencial tumorigênico. O candidato à ligação é a IL-17B, super-expressa em 30 % das células neoplásicas de mama e não detectada em tecidos normais (Figura 9). A B Figura 9. Diagrama esquemático da atividade citotóxica da IL-25 em células do câncer de mama que expressam IL-25R. A. MEC não malignas não expressam IL- 25R e são resistentes a apoptose induzida por IL-25. Células do câncer da mama expressam IL-25R e são susceptíveis a apoptose induzida por IL-25. B. Ligante IL-17B competidor do receptor IL-25R em células do câncer de mama tornam-se resistentes a apoptose induzida. Adaptado de Furuta et al. (2011). Embora a ligação da IL-17B ao receptor apresente menor afinidade, contribui para o potencial tumorigênico do câncer de mama, traduzindo sinais através do receptor associado à TNF, ativando o NF-kB e levando a superexpressão de genes antiapoptóticos como Bcl2 (Huang et al., 2014) (Figura 10). 45 Figura 10. Esquema da sinalização IL-17RB/IL-17B em células do câncer de mama. Quando a sinalização de IL-17RB/IL-17B é ativada, TRAF6 é recrutado para IL-17RB e ativa a via de sinalização NF-kB para regular positivamente a expressão do gene anti-apoptótico Bcl-2. Alvos IL-17B (anticorpos azuis), receptores de IL-17RB (anticorpos verdes). Adaptado de Huang et al. (2014). Compreender o papel destas interleucinas na progressão tumoral e durante a imunoterapia é fundamental para melhorar a eficácia das terapias cujo alvo é a modulação imunológica. 3.2 MELATONINA 3.2.1 Síntese e degradação A melatonina, conhecida como N-acetil-5-metoxitriptamina, é um hormônio naturalmente produzido e secretado pela glândula pineal além da síntese extra-pineal que ocorre na retina, pele, trato gastrointestinal, células tronco e linfócitos (Acuña- Castroviejo et al., 2014). Diferentes mecanismos de ação da melatonina têm sido propostos, regulando uma variedade de vias celulares, dentre as quais se destaca a cronobiológica. Esse hormônio é considerado um “tradutor neuroendócrino” do ciclo circadiano, controlando os padrões secretórios de diversas substâncias, como o cortisol e adrenalina, atuando sobre os ciclos de atividade-repouso e vigília-sono (Maganhin et al., 2008). Além disso, a melatonina atua sobre o sistema reprodutor, cardiovascular, sistema imunológico, crescimento e envelhecimento (Maganhin et al., 2008). 46 Sua produção segue um padrão rítmico, com pico secretório no período noturno, atingindo níveis plasmáticos máximos entre 03:00 e 04:00 horas em humanos, e quase nenhuma produção no período diurno (Ravindra, Lakshmi e Ahuja, 2006; Espino, Pariente e Rodríguez, 2012). É sintetizada a partir da conversão do aminoácido triptofano em 5-hidroxitriptofano (5-HTP) pela enzima triptofano hidroxilase 1 (TPH1). O 5-HTP é descarboxilado pela 5-HTP descarboxilase em serotonina, a qual é acetilada em N-acetilserotonina (NAS) na reação catalisada pela enzima arilalquilamina N- acetiltransferase (AA-NAT). Então, a NAS é convertida em melatonina pela enzima hidroxi-indol-Ometiltransferase (HIOMT) (Espino, Pariente e Rodríguez, 2012; Al- Omary, 2013) (Figura 11). Figura 11. Esquema representativo da via de síntese da melatonina. Início na conversão do aminoácido triptofano até o último passo para a formação de melatonina pela enzima HIOMT. A enzima AA-NAT apresenta ritmo diário, atingindo concentrações 100 vezes superiores na fase escura, quando comparado à fase clara. Esta variação cíclica da AA- NAT faz com que a redução dos níveis de serotonina na fase escura seja acompanhada 47 pelo aumento das concentrações de NAS e melatonina. A melatonina é secretada durante a noite em todas as espécies de mamíferos, independente de possuírem hábito diurno ou noturno (Korf e Von Gall, 2006; Bilu e Kronfeld-Schor, 2013). Sua degradação ocorre principalmente no fígado, envolvendo a hidroxilação em 6- hidroximelatonina [6(OH)M], seguida dos processos de sulfatação ou glicuronidação, e posterior excreção na urina (Reiter, 1991; Facciolá et al., 2001). 3.2.2 Receptores da melatonina Os mecanismos de ação da melatonina incluem a ligação a receptores localizados na membrana celular, ligação a proteínas intracelulares, como a calmodulina, interações com receptores nucleares e atividade oxidante (Jablonska et al., 2013). A melatonina pode ligar-se e ativar os receptores de membrana MT1 e MT2 em uma variedade de tecidos (Hill et al., 2009). Receptores MT1 pertencem a superfamília de receptores acoplados à proteína G e, quando mediados à subunidade G, os receptores MT1 inibem a atividade da adenil-ciclase, diminuindo a produção de adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP), tornando possível controlar a atividade das proteínas quinases (PKC, PKA, MAPK), bem como a expressão de genes específicos, envolvidos nos processos de proliferação, angiogênese, migração e diferenciação celular (Jablonska et al., 2013). Um terceiro receptor com menor afinidade pela melatonina é denominado MT3 e sua ativação ainda não possui papel fisiológico definido, no entanto, apresenta 95 % de homologia com a enzima quinona redutase II, envolvida na detoxificação de radicais livres (Foster et al., 2000). A melatonina também pode atuar por mecanismos independentes de seus receptores de membrana, exercendo atividade antioxidante diretamente na redução de radicais livres ou pelo aumento de enzimas antioxidantes. Ainda, por ser lipossolúvel, a melatonina pode atravessar diretamente a membrana celular e interagir com proteínas intracelulares, como a calmodulina, e com receptores nucleares RZR/ROR (receptor Z para retinóide/receptor órfão para retinóide). Apesar dessa capacidade de interação ainda ser controversa, a ligação da melatonina com receptores nucleares explica muitas 48 de suas funções, inclusive relacionadas à alteração de genes envolvidos na proliferação celular e apoptose (Sánchez-Barceló et al., 2003). Uma vez produzida, a melatonina, por ser altamente lipossolúvel, difunde-se para a corrente sanguínea e, posteriormente, para órgãos distantes, bem como do fluído cerebroespinhal para o hipotálamo e sistema nervoso central (Proietti et al., 2013). 3.2.3 Melatonina e câncer Além de estar envolvida nas funções fisiológicas, a melatonina tem importante papel em processos patológicos, incluindo o câncer. Os primeiros indícios de que a melatonina poderia ser útil na terapêutica oncológica surgiram em um estudo realizado por Cohen, Lippman e Chabner (1978). Os autores propuseram que a diminuição da função da glândula pineal poderia aumentar o risco de desenvolvimento do câncer de mama, sugerindo que a ausência da síntese de melatonina poderia induzir a exposição prolongada ao estrógeno resultando no desenvolvimento do tumor mamário. Em 1981, Bartsch et al. demonstraram que as concentrações de melatonina são diminuídas em pacientes com câncer de mama. Desde então, diversas pesquisas confirmaram que os pacientes com câncer de mama estabelecido têm níveis mais baixos de melatonina mensurável. Estudos epidemiológicos têm revelado o elevado risco de câncer de mama em sociedades industrializadas, sendo que o risco aumenta em mulheres com trabalho noturno, com consequente falta de exposição à luz e bloqueio da síntese de melatonina (Proietti et al., 2013). Na década de 90 alguns estudos clínicos foram realizados, demonstrando que a utilização da melatonina, em conjunto com terapias convencionais, apresenta efeitos benéficos em diferentes tipos de tumores avançados e intratáveis ou em pacientes com câncer metastático, quer seja aumentando a eficácia do tratamento (Lissoni et al., 1995; Lissoni et al., 1996), ou diminuindo os efeitos colaterais contribuindo, portanto, para a melhora da qualidade de vida desses pacientes (Barni et al., 1990; Lissoni et al., 1992). Desde então, têm sido demonstrado que a melatonina inibe o desenvolvimento e a progressão de diferentes tipos de câncer, e muitos mecanismos de ação estão sendo investigados (Di Bella et al., 2013). Estes incluem efeitos oncostáticos e anti- 49 inflamatórios, aumento da imunidade local (Luchetti et al., 2010; Alvarez-García et al., 2012; Di Bella et al., 2013; Ordoñez et al., 2014), da capacidade antioxidante celular (Fic et al., 2007; Mirunalini e Dhamodharan, 2010), regulação da expressão de genes supressores tumorais (Mediavilla et al., 2010), controle da diferenciação e proliferação celular (Sánchez-Barceló et al., 2005) e indução da apoptose (Proietti et al., 2013). Alguns estudos demonstram, ainda, que a melatonina minimiza a inflamação, bloqueando fatores de transcrição como o fator nuclear NF-kB, inibindo a expressão de citocinas, além de espécies reativas de oxigênio (EROS), MMPs e do VEGF (Li et al., 2005; Korkmaz, Rosales-Corral e Reiter, 2012). Além disso, Alvarez-García et al. (2012) e Ordoñez et al. (2014) confirmam que a melatonina também modula citocinas pró-inflamatórias, e isto pode influenciar o microambiente do tumor. A melatonina pode atuar em ambas as vias extrínseca e/ou intrínseca da apoptose (Figura 12), sendo que ambas convergem à clivagem da caspase-3. Figura 12. Esquema da via extrínseca e intrínseca da apoptose. *modulada pela melatonina. Adaptado de Rodriguez et al. (2013). 50 Além disso, no trabalho de Proietti et al. (2013) é proposto um terceiro mecanismo de atuação da melatonina na fase inicial da apoptose, envolvendo processos independentes da caspase com atuação do FIA (Figura 13). Figura 13. Ação da melatonina na inibição da proliferação de células tumorais. Em destaque a ação da melatonina na apoptose na fase inicial, processo independente da caspase, envolvendo fator de indução de apoptose (FIA). Ação da melatonina na fase tardia da apoptose, processo dependente da caspase, com ativação da caspase-9 e 7 e clivagem de PARP, concomitante a subregulação de Bcl/Bax. Adaptado de Proietti et al. (2013). Nesse contexto, a melatonina pode ser considerada importante alvo no controle da progressão tumoral criando, assim, um caminho promissor para sua utilização como agente terapêutico no câncer. 51 Objetivos 52 II. OBJETIVOS Objetivo geral  Avaliar a eficácia da melatonina, da IL-25 e do silenciamento gênico da IL-17B na modulação da apoptose e angiogênese no câncer de mama. Objetivos específicos  Verificar a viabilidade celular das linhagens tumorais mamárias humanas MDA-MB-231 (triplo negativa e metastática) e MCF-7 (REα positiva e não- metastática) e da linhagem epitelial mamária não-tumorigênica (MCF-10A), bem como das linhagens tumorais mamárias caninas CF-41 (metastática) e CMT-U229 (não- metastática) após os tratamentos com melatonina e IL-25 em diferentes concentrações por 48 horas;  Estabelecer o silenciamento gênico da IL-17B nas linhagens MDA-MB- 231, MCF-7, CF-41 e CMT-U229;  Avaliar a expressão gênica e proteica da caspase-3 e sua forma clivada e do VEGF-A por PCR em tempo real e imunofluorescência, respectivamente, em cultivo em monocamada e tridimensional nas linhagens MDA-MB-231, MCF-7, CF-41 e CMT-U229 após os tratamentos com melatonina, IL-25 e siIL-17B por 48 horas;  Quantificar a expressão de 43 proteínas envolvidas na via de sinalização da apoptose em cultivo em monocamada nas linhagens tumorais mamárias metastáticas MDA-MB-231 e CF-41 após tratamento com melatonina por 48 horas;  Demonstrar a eficácia da melatonina, isolada, e em associação à via de sinalização da IL-25 e seu competidor IL-17B como potenciais alvos terapêuticos no controle da tumorigênese mamária. 53 Capítulos 54 III. CAPÍTULOS Os resultados referentes aos objetivos desta Tese serão apresentados a seguir na forma de dois artigos científicos, conforme as normas de publicações específicas de cada periódico. Artigo I Título: Efficacy of melatonin, IL-25 and siIL-17B in apoptosis and angiogenesis response of breast cancer cell lines Autores: Gabriela Bottaro Gelaleti, Thaiz Ferraz Borin, Larissa Bazela Maschio, Marina Gobbe Moschetta, Bruna Victorasso Jardim-Perassi, Guilherme Berto Calvinho, Mariana Castilho Facchini, Alicia M. Viloria-Petit, Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari* Periódico: Journal of Pineal Research, submetido. Artigo II Título: Melatonin and IL-25 induces pro-apoptotic and anti-angiogenic factors in canine mammary tumor cell lines Autores: Gabriela Bottaro Gelaleti, Thaiz Ferraz Borin, Larissa Bazela Maschio, Marina Gobbe Moschetta, Eva Hellmén, Alicia M. Viloria-Petit, Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari* Periódico: Breast Cancer Research, a ser submetido. 55 Artigo I For Peer Review Efficacy of melatonin, IL-25 and siIL-17B in apoptosis and angiogenesis response of breast cancer cell lines Journal: Journal of Pineal Research Manuscript ID: Draft Manuscript Type: Original Manuscript Date Submitted by the Author: n/a Complete List of Authors: Gelaleti, Gabriela; Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP/IBILCE), Programa de Pós-Graduação em Genética Borin, Thaiz; Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC) Maschio, Larissa; Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP/IBILCE), Programa de Pós-Graduação em Genética Moschetta, Marina; Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC) Jardim-Perassi, Bruna; Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC) Calvinho, Guilherme; Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC) Facchini, Mariana; Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC) Viloria-Petit, Alicia; University of Guelph, Ontario Veterinary College, Department of Biomedical Sciences Zuccari, Debora; Faculdade de Medicina de Sao Jose do Rio Preto - FAMERP, Molecular Biology Keywords: Breast Cancer, Melatonin, Interleukin-25, Interleukin-17E, Interleukin-17B, Apoptosis, Angiogenesis Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research For Peer Review 1 Efficacy of melatonin, IL-25 and siIL-17B in apoptosis and angiogenesis response of breast cancer cell lines Gabriela Bottaro Gelaleti 1,2 gabi_b_g@yahoo.com.br Thaiz Ferraz Borin 2 thaiz80@yahoo.com.br Larissa Bazela Maschio 2 larissa_maschio@hotmail.com Marina Gobbe Moschetta 2 marinagobbe@hotmail.com Bruna Victorasso Jardim-Perassi 2 brunavj@hotmail.com Guilherme Berto Calvinho 2 gbc1991@gmail.com Mariana Castilho Facchini 2 vinagretefamerp@yahoo.com.br Alicia M. Viloria-Petit 3 aviloria@uoguelph.ca Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari 1, 2 * debora.zuccari@famerp.br 1 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP/IBILCE), Programa de Pós-Graduação em Genética, São José do Rio Preto, SP, Brasil. 2 Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC), São José do Rio Preto, SP, Brasil. 3 Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada. *Corresponding author. Profa. Dra. Debora Ap. Pires de Campos Zuccari, Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC), Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), Avenida Brigadeiro Faria Lima, 5416, Vila São Pedro, São José do Rio Preto (SP) 15090-000, Brasil. Tel.: 55 (17) 32015885. e-mail: debora.zuccari@famerp.br Page 1 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 2 ABSTRACT Mammary tumors involve cell autoregulation and tumor microenvironment changes, including insufficient apoptosis, cell differentiation and neovascularization. Such effects can be modulated by melatonin, which has oncostatic action and modulates interleukins (ILs) expression. IL-25, also known as IL-17E, is an active cytokine that induce apoptosis in tumor cells due to differential expression of its receptor (IL-17RB). IL-17B competes with IL-25 for binding to IL-17RB in tumor cells, promoting tumorigenesis. This study was to address the possibility of engagement of IL-25/IL-17RB signaling as an enhancer of melatonin effects on breast cancer cells. Breast cancer cell lines were cultured in monolayer and as tridimensional structures on matrigel and treated with melatonin, IL-25, siIL-17B and all combined treatments. Cell viability, gene and protein expression, immunofluorescence, and apoptosis membrane array was performed. Treatments with melatonin and IL-25 significantly reduced the tumor cells viability at 1 mM and 1 ng/mL, respectively, but did not alter MCF-10A cell viability. All treatments alone and combined significantly increased caspase-3 cleavage in tumor cells grown as monolayers and 3D structures. Semi-quantitative analysis of proteins involved in the apoptotic pathway showed an increase of CYTO-C, DR6, IGFBP-3, IGFBP-5, IGFPB- 6, IGF-1, IGF-1R, Livin, P21, P53, TNFRII, XIAP and hTRA proteins and reduction of caspase-3 (p<0.05) after melatonin treatment. Also, all treatments reduced VEGF-A protein expression in tumor cells (p<0.05), which confirms the anti-angiogenic potential of the treatments in mammary tumor cells. Our results suggest therapeutic potential, with oncostatic effectiveness, pro-apoptotic and anti-angiogenic properties for melatonin and IL-25-driven signaling in breast cancer cells. Keywords: Breast Cancer, Melatonin, Interleukin-25, Interleukin-17E, Interleukin-17B, Apoptosis, Angiogenesis. Page 2 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 3 INTRODUCTION The breast tumor microenvironment is composed by several cell types, including inflammatory and endothelial cells, fibroblasts and adipocytes, among others [1], [2], [3]. Mutual interactions between the malignant epithelial cells and the surrounding microenvironment, in part mediated by cytokines and their receptors, modulate the behavior of malignant cells and drive tumor progression [4], [5], [6] and [3]. Thus, it is important to identify these microenvironmental mediators of tumor progression as well as strategies to successfully target them [7]. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine), an endogenous molecule, is an evolutionary conserved indolamine synthesized from tryptophan that is mainly produced by the pineal gland and other nonendocrine organs such as skin, gut and immune system, among others [8]. Different mechanisms of melatonin action have been proposed, regulating a variety of cellular pathways. These include oncostatic and anti- inflammatory effects, increase local immunity [9], [10], [11], [8], cellular antioxidant capacity [12], [13], upregulation of tumor suppressor gene expression [14], control of cell differentiation and proliferation [15], [16] and induction of apoptosis [17]. Besides this, melatonin blocks the activity of transcription factors, such as nuclear factor-κB (NF-κB), inhibiting the expression of cytokines, metalloproteinases and the vascular endothelial growth factor (VEGF) [18], [19], [20]. Further, Alvarez-García et al. [10] and Ordoñez et al. [8] showed that melatonin also modulate pro-inflammatory cytokines, and this might impact the tumor microenvironment. A family of six pro-inflammatory cytokines comprised of interleukin (IL) 17A, B, C, D, E and F [21], [22], [23], [24] have been considered as potent activators of innate immunity, promoting a protective tumor immunity [25]. Unlike the pro- inflammatory effects associated with IL-17 family, the IL-17E (also known as IL-25) appears to be a unique pleiotropic cytokine that engages a systemic Th2-like response with tissue-specific immunological and pathological changes, which include but are not limited to, expression of IL-4, 5 and 13 [21], [22] once overexpression of IL-17E resulted in profound alterations of the immune system. IL-25 is secreted from non-malignant mammary epithelial cells and referred as anti-tumoral cytokine [26]. Anti-inflammatory effects has been associated with IL-25 in both in vitro and in vivo studies [21]; besides, this cytokine can induces breast cancer Page 3 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 4 apoptosis by differential expression of its receptor, IL-25R (also called IL-17RB), which is composed of IL-17RB and IL-17RA heterodimer [26], [27]. Furuta et al. [26] observed that another ligand, IL-17B, compete for the same receptor site of IL-25 in malignant tissues, which contributes to tumorigenic potential. IL-17B was reported to bind to IL-17RB with an affinity of 7.6 nM, while IL-25 binds to IL-17RB with an affinity in the range of 1.1–1.4 nM. The IL-17RB/IL-17B transduces pro-survival signaling, and their combined expression has been associated with poor prognosis in breast cancer patients [27]. No studies have previous addressed whether melatonin in combination with IL- 25 could be a better strategy to target breast cancer cells. Here we explore the therapeutic potential of such combinatory approach by assessing the effect of melatonin, IL-25, and IL-17B gene silencing, alone or in combination, on cell viability and the differential mRNA and protein expression of apoptosis and angiogenesis mediators in normal versus malignant human breast cells. MATERIAL AND METHODS Cytokines and Antibodies Melatonin was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Purified IL-25 was from ProSpec (East Brunswick, NJ, USA). Primary antibodies included: cleaved caspase-3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), IL-17RB and VEGF-A (both from Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Cell lines culture Triple negative (MDA-MB-231) (ATCC, Manassas, VA, USA) and estrogen receptor (ER) positive (MCF-7) (ATCC, Manassas, VA, USA) human breast cancer cell lines were cultured in 75 cm 2 culture flasks (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) with Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Cultilab, Campinas, SP, Brazil) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) (Cultilab, Campinas, SP, Brazil), penicillin (100 IU/mL) and streptomycin (100 mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in a humidified incubator at 5.0 % CO2 at 37 ºC until they were 80-90 % confluent. The human non-tumorigenic breast epithelial cell line (MCF-10A) (ATCC, Manassas, VA, USA) was cultured in 1:1 DMEM: Ham's F-12 (Cultilab, Campinas, SP, Page 4 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 5 Brazil) media supplemented with 5 % donor equine serum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), epidermal growth factor (20 ng/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), hydrocortisone (500 ng/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), insulin (0.01 mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), cholera toxin (100 ng/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), penicillin (100 IU/mL) and streptomycin (100 mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in a humidified incubator at 5.0 % CO2 at 37 ºC until they were 80-90 % confluent. Three-dimensional (3D) Matrigel culture assay Sparse tumor single-cell suspensions were plated on individual wells of 8-well chamber slides (Sarsted, Newton, NC, USA) previously covered with a 1-mm thick layer of laminin-rich extracellular matrix (Matrigel® - Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), at a concentration of 3.5 x 10 4 cells/0.5 mL Basal Human Mammary Epithelial Cell (HuMEC) medium (Life Technologies, Eugene, OR, USA) supplemented with the HuMEC Supplement Kit (Gibco® - Life Technologies, Eugene, OR, USA) and 2 % Matrigel®. The cells were maintained in a humidified incubator at 5 % CO2 at 37 ºC for eight days until the formation of established 3D structures, with treatments replenished every two days. The 3D morphogenesis was monitored and analyzed using immunofluorescence and confocal microscopy. Cell viability assessment by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay For MTT assay, individual wells of 0.31 cm 2 (96-well plate) were inoculated with 100 µL of regular growth medium containing 5 x 10 4 cells and incubated in this media overnight, after which the media was changed to 2.0 % FBS, containing increasing concentrations of melatonin (0.001 mM, 0.01 mM, 0.1 mM and 1 mM) and different concentrations of purified IL-25 (1 ng/mL, 10 ng/mL and 50 ng/mL). Control wells, corresponding to 0 ng/mL of either treatment, contained the highest concentration of the vehicle for the corresponding treatment, which was 1 % dimethylsulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for melatonin, and 0.001 % e-pure water for IL-25. Following 48 hours of the aforementioned treatments, 10 µL of MTT solution from the Vibrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen - Life Technologies, Eugene, OR, USA) were added to each well and the plates were Page 5 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 6 incubated at 37 ºC for an additional 4 h. To solubilize the MTT formazan crystals, the cells were incubated with 50 µL of DMSO (100 %) and then incubated again at 37 °C for 10 minutes. Absorbance was measured at 540 nm using an ELISA plate reader (Thermo Fisher Scientific - Waltham, MA USA). Medium alone was used as a blank and the corresponding optical density was subtracted from the samples. Cell viability (%) was calculated for all groups relative to control samples. All treatments were done in triplicate. Gene silencing of interleukin-17B For IL-17B gene silencing four different siRNA were initially tested (SI00106127, SI00106134, SI02640652 and SI02640659) (ProSpec, East Brunswick, NJ, USA), selected from preserved gene regions and thermodynamic stability according by inventoried assay (Qiagen, Valencia, CA, USA). Individual wells of 1.88 cm 2 (24- well plate) were inoculated with 500 µL of normal growth medium containing 8 x 10 4 cells. Subsequently the cells were transfected using the siRNA Human/Mouse Starter Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), which included the positive control MAPK-1 siRNA (Qiagen, Valencia, CA, USA), a siScramble negative control (Qiagen, Valencia, CA, USA) and the Gene Kit Solution targeting siIL-17B (Cat No. 1027416 - Qiagen, Valencia, CA, USA), all at 10 nM in a 0.5 % HiPerfect solution (Qiagen, Valencia, CA, USA). Cells were incubated with these reagents for 48 hours, after which total cellular RNA was isolated using the Trizol method (Invitrogen - Life Technologies, Eugene, OR, USA) and purified using the RNeasy Kit extraction columns (Qiagen, Valencia, CA, USA). Absolute quantification by real-time (qRT-PCR) The concentration of RNA from each sample was determined using a NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific - Waltham, MA USA). cDNA was obtained by RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) using the High Capacity cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The qRT-PCR reaction was performed to assess the efficiency of gene silencing of IL-17B, as well as treatment effect on caspase-3 and VEGF-A levels, using a StepOne Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Specific primers included: IL-17B - sense (5' GCAGCTGTGGATGTCCAACA 3') Page 6 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 7 antisense (5' GGGTCGTGGTTGATGCTGTAG 3') and MAPK-1 - sense (5' TCCAACCTGCTGCTCAACAC 3') antisense (5' TCATGGTCTGGATCTGCAACA 3'), inventoried TaqMan assays caspase-3 (Hs0023487_m1), VEGFA (Hs00900055_m1), and the housekeeping genes beta-actin (ACTB; 4333762F) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; 4333764F), all at a concentration of 100 ng for each cDNA sample. The amplification was performed in cycles at 95 °C for 10 minutes, followed by 40 cycles at 95 °C for 15 seconds and 60 °C for one minute. The value of the relative expression of the genes of interest was determined with DataAssist 3.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) by ∆∆Ct method [28]. The samples were tested in triplicate and each experiment included a negative control. Immunofluorescence staining Previously treated 3D structures grown on matrigel and treated monolayer cells were washed once with PBS, fixed in 4.0 % paraformaldehyde solution in PBS for 20 minutes at room temperature, and blocked with 10 % donkey serum solution for 1 hour at room temperature. The specific primary antibodies was then added and incubated overnight at 4 ºC. After washing three times with immunofluorescence (IF) buffer (0.1 % FSB, 0.2 % triton and 0.05 % Tween 20), a secondary Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for both cleaved caspase-3 and VEGF-A was added per 1 hour at room temperature. Following three time washing with IF buffer, the cells were incubated with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solution (Life Technologies, Eugene, OR, USA) and mounted with Prolong Gold ® (Life Technologies, Eugene, OR, USA). 3D structures images were captured and processed using a confocal microscope and associated software (ZEISS, model LSM 710, software ZEN 2010, Thornwood, NY, USA) and monolayer cells were captured and processed using a microscope and associated software (OLYMPUS, model BX53, software Image-Pro Plus version 7.0, Center Valley, PA, USA). Evaluation of immunofluorescence staining For apoptosis analysis, all cleaved caspase-3 positive cells were counted in three different photomicrographs (100X magnification) per treatment group. Results were Page 7 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 8 quantified as percent of apoptotic monolayer and 3D structures. The number of cleaved caspase-3 positive cells was normalized to the area of photomicrography. IL-17RB and VEGF-A proteins was quantified according to Jardim-Perassi et al. [29]. In summary, three different photomicrographs taken at 100X magnification under bright field and the intensity of the staining was quantified by Image J Software (NIH, Bethesda, MD, USA). Each photograph was divided into four quadrants and 20 spots (small circular ROI) were randomly selected (avoiding the nucleus) in each photomicrograph. A negative control section of the corresponding staining was used for measuring background activity. The values were obtained in arbitrary units (a.u.) and represented as the mean optical density (M.O.D.) for each sample. Protein extraction In order to reaffirm melatonin action in apoptosis pathway in triple negative hormone receptors cells it was performed a membrane array analysis in MDA-MB-231 cells. Cells were plated in individual wells of 1.88 cm 2 (24-well plate) at 0.5 x 10 6 cells confluence and inoculated with 500 µL of normal growth medium overnight. Thereafter, cells were treated with or without 1 mM of melatonin for 48 hours and performed protein extraction of adherent ad supernatant cells. Cells were washed in ice- cold PBS and lysed with MILLIPLEX® MAP lysis buffer supplemented with 1 mM of phosphatase inhibitor cocktail (Na3VO4) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) and 1:10 of protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). After incubation for 30 minutes with intermittent vortexing, the cell lysate was centrifuged and the proteins collected on supernatant. Concomitantly the supernatant medium was collected and used ultrafiltration (Amicon®, EMD Millipore, Billerica, MA) to concentrate the proteins. The supernatant was included in columns containing filter of three kDa, centrifuged and posteriorly larger proteins were retained in filter and subsequently quantified. Proteins extracts were quantified by the bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (PIERCE - Thermo Scientific - Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Membrane array The membrane Human Apoptosis Array C1 (RayBiotech, Norcross, GA, EUA) was incubated with 2 mL of 1X blocking solution buffer (RayBiotech, Norcross, GA, Page 8 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 9 EUA) for 30 minutes. Treated and control samples were added in a concentration of 600 µg (300 µg of lisate cells and 300 µg of supernatant cells) and incubated in membrane at 4 ºC overnight. Membrane was washed three times with wash buffer 1X (RayBio I, RayBiotech, Norcross, GA, EUA) and two times with wash buffer 1X (RayBio II, RayBiotech, Norcross, GA, EUA) for five minutes each. Biotin conjugate anti- cytokines (RayBiotech, Norcross, GA, EUA) was added and the samples incubated at 4º overnight. The membrane was wash again and then incubated with horseradish peroxidase (HRP) estreptavidina 1000X (RayBiotech, Norcross, GA, EUA) solution at 4 °C overnight. The membrane was wash and incubated with detection solution (RayBiotech, Norcross, GA, EUA) for two minutes and exposed to ChemiDoc system (BioRad, Hercules, CA, EUA). Optical density reference to protein expression was normalized with positive control and quantification was performed using ImageJ Software (NIH, Bethesda, MD, USA) as image analyzer. The values were obtained in a.u. and represented as the M.O.D. for each sample. All samples were included in duplicate plus positive and negative membrane controls. Statistical analysis All data were expressed as mean ± standard error of mean (SEM). All statistical analyses were done using GraphPad Prism4 (San Diego, CA, USA). Raw data was initially subjected to descriptive analysis to determine the normal range. Normal range data were analyzed by two-way ANOVA, followed by Bonferroni test for MTT results and Student’s t-test was performance for another analysis. A p-value ≤ 0.05 was considered significant. RESULTS Melatonin and IL-25 reduce cell viability of breast cancer cells and did not affect MCF-10A cells Breast cancer cell lines were subjected to MTT cell viability testing, after being treated with melatonin and IL-25. Jardim-Perassi et al. [29] and [30] previously showed that the MDA-MB-231 and MCF-7 cells were sensitive to 1 mM of melatonin after 24 hours of incubation, showing a statistically significant reduction in cell viability compared to control groups (p < 0.05). Following 48 hours of treatment, we previously Page 9 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 10 found (Borin et al., 2015 submitted on Journal of Pineal Research - JPI-OM-06-15- 0169) that the concentrations of 0.01 to 1 mM melatonin remained significantly different for both cell lines when compared to control groups (p < 0.05). As the 1 mM concentration showed a significant reduction of viability it was adopted as the standard dose to other procedures. Cell viability was tested with IL-25 at 1 ng/mL, 10 ng/mL and 50 ng/mL for 48 hours and were able to reduce cell viability in both breast cancer cell lines. For MDA- MB-231 cells, biphasic effect was observed, with 1 ng/mL and 50 ng/mL of IL-25 causing a significant 25 % reduction in viability compared to the control group (73.92 ± 10.25 %; 72.54 ± 8.504 %; p < 0.05). For MCF-7 cells, the lowest dose of 1 ng/mL of IL-25 significantly reduced cell viability by 60 % (38.59 ± 8.911 %; p < 0.05) (Fig. 1A and B). Neither melatonin or IL-25 treatments caused a significant reduction in viability compared to control in MCF-10A cells, when the effective doses for MDA-MB-231 and MCF-7 cells were chosen (p > 0.05) (Fig. 1C). These results suggest that melatonin and IL-25 preferentially target transformed cells. Effective gene silencing of IL-17B In order to test our hypothesis that a reduction in IL-17B level may lead to increased tumor cell apoptosis by enhancing IL-25 binding to the IL-17RB receptor, IL- 17B gene silencing was performed, as there is no specific inhibitor for this interleukin. Silencing of the positive control, MAPK-1, was carried out to optimize the concentration and incubation period of the transient transfection. The positive control was effective at 10 nM in both breast cancer cell lines with 74.0 % for MDA-MB-231 cells and 67.0 % for MCF-7 cells following 48 hours after transfection (data not shown). siRNA #2 and #3 were effective for IL-17B silencing for MDA-MB-231 cells with the best silencing (44 %) obtained with siIL-17B #2 (Fig. 2A). For MCF-7 cells, the silencing gene was effective for siRNA #2, #3 and #4, with 66 % of silencing for siIL-17B #2 (Fig. 2B). Induction of apoptosis after treatment with melatonin, IL-25 and siIL-17B To test the hypothesis that IL-25 added to melatonin enhances breast cancer cell apoptosis, breast cancer cell lines were cultured with 1 mM of melatonin, 1 ng/mL Page 10 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 11 of IL-25 and 10 nM of siIL-17B #2 as well as its control groups, for 48 hours and the caspase-3 expression was evaluated. Those three treatments separated and associated were effective in increasing the caspase-3 gene expression compared to control groups in MDA-MB-231 cells (melatonin, p < 0.0001; IL-25, p < 0.0001; siIL-17B, p = 0.0001 and treatments associated, p = 0.0002). Furthermore, MDA-MB-231 cells treated for 48 hours showed a 3-fold higher average of positive apoptotic cells compared to control groups for all treatments (37.1 % versus 12.8 %, p < 0.05; Fig. 3). However, the combined treatments did not further increase apoptosis compared to individual treatments. Similarly, melatonin, IL-25 and siIL-17B treatments for 48 hours, alone and combined, were effective at increasing the caspase-3 gene expression compared to control groups in MCF-7 cells (melatonin, p = 0.002; IL-25, p = 0.01; siIL-17B, p = 0.01 and treatments associated, p = 0.02). The average percent of apoptotic cells after 48 hour of individual and combined treatments was 4-fold higher compared to control groups (57.5 % versus 13.0 %, p < 0.05; Fig. 4). For MCF-7 cells, combined treatment showed pro-apoptotic advantage once resulted in an average 87 % enhancement of the protein levels of cleaved caspase-3, compared to the 47 % increase observed with each treatment alone. Although this is largely due to melatonin treatment, that showed 63 % of apoptotic cells. The pro-apoptotic effect of treatments is enhanced in 3D cultures As an alternative to classical in vitro studies with cells grown as monolayers studies, the 3D culture mimics tissue architecture in vivo, possibly predicting better cellular response in actual tumors [31] . 3D culture permits cells to explore the three dimensions of the space thereby increasing cell-cell interactions, as well as interactions with the microenvironment [31]. Thus, we aimed to characterize the increase expression of cleaved caspase-3 in 3D structures of breast cancer cells. An increase of intensity in nuclei labeling of cleaved caspase-3 in different sequential planes image in MDA-MB-231 and MCF-7 cells was found (Fig. 5A and B). Treatment with 1 mM of melatonin was capable to enhance apoptotic 3D structures in 31 % for MDA-MB-231 cells and 24 % for MCF-7 (p = 0.05; p = 0.002, respectively), IL-25 treatment enhanced apoptotic 3D structures in 20 % for MDA-MB-231 cells and 26.4 % for MCF-7 (p = 0.04; p = 0.01, respectively), siIL-17B was more effectively in Page 11 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 For Peer Review 12 enhanced apoptotic 3D structures for 68 % for MDA-MB-231 cells and 74 % for MCF- 7 (p < 0.0001; p < 0.0001, respectively) and, treatments combined not shown significantly increase of apoptotic 3D structures in MDA-MB-231 cells and a minor enhance was observed in MCF-7 cells (30 % combined treatments versus 11 % control group; p = 0.01) (Fig. 5C and D). Melatonin modulate apoptotic proteins in MDA-MB-231 cells Apoptosis related factors (Table 1) were estimated in MDA-MB-231 cells using a membrane protein array kit. Treatment with 1 mM of melatonin for 48 hours in this cells showed increase of pro-apoptotic proteins compared to control group, including cytochrome c (CYTO-C), death receptor 6 (DR6), growth factor insulin-binding protein-3 (IGFBP-3), IGFBP-5, IGFPB-6, insulin-like growth factor 1 (IGF-1), IGF-1 receptor (IGF-1R), Livin, P21, P53, tumor necrosis factor receptor II (TNFRII), apoptosis inhibitory protein X (XIAP) and high temperature required A (hTRA) (p < 0.05) and a reduction of caspase-3 was observed (p = 0.04) (Fig. 6). Decrease expression of VEGF after treatment with melatonin, IL-25 and siIL-17B Therefore, we tested the influence of 48 hours treatment with melatonin, IL-25 and siIL-17B separate or in combination, on VEGF-A RNA and protein expression via qRT-PCR and immunofluorescence, respectively. It was observed an increase VEGF-A mRNA expression in MDA-MB-231 cells after treatment with IL-25, siIL-17B and combined treatments (p = 0.006; p = 0.002; p = 0.006, respectively), though the protein levels of this factor were significantly reduced by the same treatments (IL-25 10.67 ± 0.3982 u.a., p < 0.0001; siIL-17B 13.68 ± 0.4615 u.a., p < 0.0001; treatment combined 21.09 ± 0.7657 u.a., p < 0.0001), as well as melatonin (15.98 ± 0.6371 u.a., p < 0.0001) compared to control groups (Fig. 7). For MCF-7 cells, VEGF-A mRNA decreased after treatment with melatonin (p = 002). In contrast, IL-25, siIL-17B and combined treatments increased VEGF-A gene expression compared to control groups (p < 0.0001; p < 0.0001, p < 0.0001, respectively). VEGF-A protein levels were reduced after 48 hours of incubation with all treatments compared to control groups (melatonin 17.11 ± 0.5092 u.a., p < 0.0001; IL- Page 12 of 35 Journal of Pineal Research Journal of Pineal Research 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21