1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA EFEITO DO CLOPROSTENOL SÓDICO SOBRE A INVOLUÇÃO UTERINA DE BOVINOS E BUBALINOS PÓS-PARTO ALINE SOUSA CAMARGOS Botucatu – SP 2012 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA EFEITO DO CLOPROSTENOL SÓDICO SOBRE A INVOLUÇÃO UTERINA DE BOVINOS E BUBALINOS PÓS-PARTO ALINE SOUSA CAMARGOS Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor(a). Orientadora: Profa. Dra. Eunice Oba Botucatu – SP 2012 3 Autora: Aline Sousa Camargos Título: EFEITO DO CLOPROSTENOL SÓDICO SOBRE A INVOLUÇÃO UTERINA DE BOVINOS E BUBALINOS PÓS-PARTO COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra. Eunice Oba ____________________________ Presidente e Orientadora Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP – Campus Botucatu Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo ____________________________ Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP – Campus Botucatu Prof. Dr. Carlos Antônio de Carvalho Fernandes ________________________ Membro Pós-graduação em Medicina Veterinária UNIFENAS Prof. Dr. Luiz Sérgio de Almeida Camargo ____________________________ Membro Laboratório de Reprodução Animal Embrapa Gado de Leite Prof. Dr. Luis Souza Lima Souza Reis ____________________________ Membro Departamento de Medicina Veterinária UNISA Data de defesa: 12 de dezembro de 2012. 4 Ao meu pai, Luis Vieira Camargos (sempre presente), por compartilhar dos meus sonhos e não medir esforços para torná-los realidade. DEDICO 5 AGRADECIMENTOS À Deus, por mais esta graça em minha vida. À minha orientadora, Profa. Eunice Oba, pela oportunidade, ensinamentos, amizade e, acima de tudo, pela confiança depositada desde o início. À Fazenda Santa Fé, em especial à amiga Médica Veterinária Isadora Frazon Costa e família, por acreditar neste projeto e disponibilizar estrutura, animais, funcionários e momentos muito agradáveis durante a realização do mesmo. Aos funcionários Benedito (Seu Dito), Roque, José (Zé) e Maurício pela dedicação, descontração e respeito. Ao Setor de Bubalinocultura da Fazenda Experimental Lageado, em especial aos funcionários Wilson (Lipe), Desidério (Setor de Bovinos de Leite), Amarildo (Liu), Wilson (Boca), Benedito e estagiários pela ajuda e bom humor durante o período experimental; ao Prof. André Mendes Jorge, por disponibilizar os animais. À Fazenda Santa Helena (Sete Barras – SP), na pessoa do Sr. Pedro Paulo Delgado, presidente da Associação de Criadores de Búfalos do Vale do Ribeira, por incentivar o progresso da pesquisa em ciência animal brasileira, disponibilizando animais e funcionários para realização do projeto. Aproveito para agradecer ao Dr. Nélcio Carvalho, da APTA Vale do Ribeira, pela indicação e intermédio. À Empresa Genética Pecuária El Cangre (San José de las Lajas – Cuba), em especial ao Dr. Eulógio Padrón, por disponibilizar as vaquerias, búfalas e funcionários para o experimento. Aos funcionários que abraçaram o projeto e não mediram esforços para sua realização. Ao Instituto de Ciência Animal (San José de las Lajas – Cuba), por firmar o Convênio de Pesquisa e disponibilizar funcionários, estadia, transporte, animais e estrutura durante a execução do projeto. Em especial a Orlando Fundora Sanchez, Carlos Gallego González, Yusely Hernandes e Alejandro Menendez. 6 Ao Prof. João Carlos Pinheiro Ferreira, pela oportunidade de participação em projeto de pesquisa, sugestões e apoio durante as dosagens de PGFM. Ao Prof. Alcides Amorim, pela grande ajuda com as análises estatísticas. Aos colegas de Pós-graduação, em especial Luis Reis, Diego Gouvêa, Gabriel Monteiro, Mariana Zorzetto, Stephane Vexenat, Yamê Fabrês, Myrna Campos, Wolf Marques, Eduardo Trevisol, Camila Ackerman, Tatiana Cabrera, Margarita Pardo, Rosiara Maziero e todos os outros que, de alguma forma, contribuíram para a execução deste projeto. Aos professores Nereu Carlos Prestes e Sérgio Luis Felisbino pelo estágio de docência. A todos os demais docentes e funcionários do Departamento de Reprodução Animal. À CAPES, pela bolsa de doutorado e Convênio CAPES – MES Cuba (bolsa de doutorado sanduíche e financiamento do projeto de pesquisa no exterior). À FAPESP, pelo financiamento do projeto de pesquisa no Brasil. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP Botucatu e seu curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, pela oportunidade de cursar o doutorado. Em especial, ao supervisor José Roberto. À minha família pelo apoio, incentivo e compreensão nos momentos de ausência. Em especial à minha querida irmã Luciana, pela torcida e design de posters e slides. Aos professores Carlos Antônio de Carvalho Fernandes, Flávio Moreno e Marilu Gioso, por cultivarem a idéia de ingresso no curso de doutorado. Ao meu parceiro em todos os momentos, meu namorado Rafael Graciano Fleischacker, por me apoiar incondicionalmente, mesmo nos momentos de falta de tempo e quando a distância se fazia presente. 7 “Comece fazendo o que é necessário. Depois, o que é possível. E, de repente, você estará fazendo o impossível.” (São Francisco de Assis) 8 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 2 Tabela 1 - Grau de involução uterina à palpação transretal dos grupos tratados com cloprostenol, durante o puerpério precoce ou intermediário de búfalas, aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias pós-parto (média ± desvio padrão). ............................. 48 Tabela 2 - Acúmulo de fluido intrauterino avaliado por exame ultrassonográfico (escala de 0 a 3) dos grupos tratados com cloprostenol, durante o puerpério precoce ou intermediário, aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após o parto (média ± desvio padrão). ..................................................... 50 CAPÍTULO 4 Tabela 1 - Grau de involução uterina à palpação transretal dos grupos tratados com cloprostenol, durante o puerpério precoce ou intermediário de vacas mestiças Holandês- Zebu, aos 2, 7, 14, 21 e 28 dias pós-parto (média ± desvio padrão). ................................................................................ 86 CAPÍTULO 5 Tabela 1 - Grau de involução e acúmulo de fluido uterino dos grupos com e sem retenção de placenta, durante o puerpério precoce de vacas mestiças Holandês-Zebu, aos 2, 7 e 14 dias pós-parto (média ± desvio padrão). .............. 101 viii 9 LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figura 1 - Útero bovino no 1o e 20o dias pós-parto. ............................. 22 Figura 2 - Útero gestante bovino. ......................................................... 24 CAPÍTULO 2 Figura 1 - Gráfico ilustrando o nível de progesterona plasmática (P4) de búfalas dos 7 aos 35 dias após o parto. ......................... 51 Figura 2 - Médias de dias do período de serviços (PS) e intervalo entre partos (IEP) dos grupos de búfalas tratadas com cloprostenol na primeira ou terceira semanas pós-parto. .... 51 CAPÍTULO 3 Figura 1 - Grau de involução uterina (média ± desvio padrão) de búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. .……………………………….……….. 63 Figura 2 - Acúmulo de fluido intrauterino (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. …………………………..…………….. 65 Figura 3 - Concentração de progesterona (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. …………………………......………….. 67 Figura 4 - Concentração de PGFM (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. ….................................................….. 69 Figura 5 - Concentração de estradiol (média ± desvio padrão) em ix 10 búfalas Murrah entre os dias 2 e 28 pós-parto. …………..... 71 CAPÍTULO 4 Figura 1 - Acúmulo de fluido intrauterino em vacas mestiças Holandês-Zebu dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. ……………........................................ 87 Figura 2 - Concentração de progesterona em vacas mestiças Holandês-Zebu dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. …………........................................… 89 Figura 3 - Concentração de estradiol em vacas mestiças Holandês- Zebu entre os dias 2 e 28 pós-parto. …………………...…… 90 Figura 4 - Concentração de PGFM em vacas mestiças Holandês- Zebu dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós- parto. ……………………....................................................... 91 CAPÍTULO 5 Figura 1 - Concentração de PGFM nos grupos CONT (sem retenção de placenta), RET (com retenção de placenta tratado com cloprostenol) e CLO (sem retenção de placenta tratado com cloprostenol) no puerpério precoce. ............................. 102 Figura 2 - Concentração de progesterona em vacas mestiças Girolando dos grupos CONT (sem retenção de placenta), RET (com retenção tratada com cloprostenol) e CLO (sem retenção tratada com cloprostenol) nos dias 2, 7 e 14 após o parto. ................................................................................. 103 Figura 3 - Concentração de estradiol em vacas mestiças Holandês- Zebu com ou sem retenção de placenta entre 2 e 7 dias pós-parto. ............................................................................. 104 x 11 LISTA DE ABREVIATURAS 9K-PGR Prostaglandina E2-9-ketoredutase COX Cicloxigenase FP Receptor de prostaglandina F2α GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinas GPCRs Receptores transmembrana acoplados à proteína G IEP Intervalo entre partos IM Intramuscular NADPH Fosfato dinucleotídeo de nicotinamida e adenina PGF2α Prostaglandina F2α PGFM Metabólito de prostaglandina PGFS Prostaglandina sintase PGG2 Prostaglandina G2 PGH2 Prostaglandina H2 PLA2 Fosfolipase A2 PLC Fosfolipase C PS Período de serviços xi 12 SUMÁRIO Página RESUMO .............................................................................................. xiv ABSTRACT .......................................................................................... xvi CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................... 19 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................... 21 1.1 Útero de ruminantes ............................................................... 21 1.2 Involução uterina .................................................................... 22 1.2.1 Contração miometrial .................................................. 23 1.2.2 Reparação do endométrio ........................................... 24 1.2.3 Ação hormonal ............................................................ 25 1.2.4 Prostaglandina F2α e receptor FP .............................. 26 1.2.5 Redução do fluxo sanguíneo ...................................... 29 1.2.6 Relação com a atividade ovariana .............................. 30 1.2.7 Fatores que afetam a involução .................................. 31 BIBLIOGRAFIA ............................................................................... 33 CAPÍTULO 2 – Acompanhamento ultrassonográfico, da concentra- ção de progesterona e indicadores de desempenho reprodutivo após aplicação de cloprostenol em búfalas pós-parto. Resumo .......................................................................................... 44 Abstract .......................................................................................... 45 CAPÍTULO 3 – Concentrações de 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α, pro- gesterona e estradiol após administração de prostaglandina em dife- rentes períodos do puerpério de búfalas. Resumo .......................................................................................... 71 CAPÍTULO 4 – Concentrações de 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α, pro- gesterona e estradiol e acompanhamento ultrassonográfico do puer- pério de vacas leiteiras mestiças Holandês-Zebu após administração de prostaglandina. Resumo .......................................................................................... 79 xii 13 CAPÍTULO 5 – Níveis de 13, 14-dihydro-15-keto-PGF2α, progestero- na e estradiol e acompanhamento ultrassonográfico de vacas mesti- ças Holandês-Zebu com retenção das membranas fetais. Abstract .......................................................................................... 105 APÊNDICES ......................................................................................... 108 xiii 14 CAMARGOS, A.S. “Efeito do cloprostenol sódico sobre a involução uterina de bovinos e bubalinos pós-parto”. Botucatu, 2012. 124p. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Este estudo foi dividido em três experimentos. No experimento 1, objetivou-se avaliar e comparar o efeito da administração de análogo sintético de prostaglandina em diferentes períodos do puerpério de bubalinos. 45 búfalas pluríparas foram distribuídas aleatoriamente em três grupos: CON (controle) – soro fisiológico na primeira e terceira semanas pós-parto; CLO1 – cloprostenol sódico na primeira semana e; CLO3 – cloprostenol sódico na terceira semana. Os animais foram avaliados nos dias 7, 14, 21, 28 e 35 após o parto quanto ao grau de involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino, concentração de progesterona plasmática, período de serviços e intervalo entre partos. Não houve diferença entre os grupos quanto ao grau de involução uterina e concentração de progesterona plasmática. Os animais dos grupos CLO1 e CLO3 apresentaram menor acúmulo de fluido intrauterino, período de serviços e intervalo entre partos em relação ao grupo controle. O protocolo com aplicação de cloprostenol na primeira semana apresentou os melhores resultados sobre a eficiência reprodutiva de búfalas pós-parto. No experimento 2, o objetivo do estudo foi verificar se a aplicação de cloprostenol, no puerpério precoce ou intermediário, induz mudanças nas concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol de búfalas pós-parto, além de efeitos sobre a involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino e retorno da atividade ovariana cíclica. 30 búfalas Murrah foram distribuídas aleatoriamente em três grupos: CONT (solução salina); CLO2 (cloprostenol nos dias 2 e 5 pós-parto) e; CLO15 (cloprostenol nos dias 15 e 20 pós-parto). Exames ginecológicos foram realizados nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós-parto, onde foram avaliados o grau de involução uterina, o acúmulo de fluido intrauterino e a atividade ovariana. Após os exames, foram coletadas amostras de sangue para dosagem das concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol. O grupo CLO2 xiv 15 apresentou maior involução uterina, retorno mais rápido à atividade ovariana cíclica e menores concentrações plasmáticas de progesterona e PGFM em relação aos demais grupos (P < 0,01). Os grupos CLO2 e CLO15 apresentaram menor acúmulo de fluido intrauterino quando comparados ao grupo CONT (P < 0,01). Não foi observada diferença significativa na concentração de estradiol entre os grupos experimentais (P > 0,01). A aplicação de análogo de prostaglandina em búfalas pós-parto induz alterações hormonais e fisiológicas, culminando na otimização dos indicadores de desempenho reprodutivo desta espécie. No experimento 3, o objetivou-se verificar se a aplicação de cloprostenol, no puerpério precoce ou intermediário, induz mudanças nas concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol de vacas mestiças Holandês-Zebu pós-parto, além de efeitos sobre a involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino e retorno da atividade ovariana cíclica. 30 vacas Girolando foram divididas aleatoriamente em três grupos e avaliadas idem ao experimento 2. O tratamento com cloprostenol na primeira semana pós-parto (CLO2) foi significativamente melhor para a involução uterina das vacas mestiças em relação a CONT e CLO15 (P < 0,01). Não foi observada diferença significativa no acúmulo de fluido uterino, concentração de progesterona, estradiol e PGFM entre os grupos experimentais (P > 0,01). Houve diferença significativa entre os dias avaliados para involução uterina, acúmulo de fluido e concentração plasmática de estradiol (P < 0,01). Animais diagnosticados com atividade ovariana cíclica apresentaram maior grau de involução uterina, menor acúmulo de fluido intrauterino e maiores concentrações plasmáticas de progesterona e estradiol que aqueles em anestro (P < 0,01). A concentração plasmática de PGFM permaneceu alta durante todo o período do estudo. A aplicação de análogo sintético de prostaglandina em vacas mestiças Holandês-Zebu parece não induzir alterações hormonais no período pós-parto, embora acelere o processo de involução uterina nesta espécie. Palavras chave: PGFM, progesterona, estradiol, lóquio, atividade ovariana, puerpério. xv 16 CAMARGOS, A.S. “Effect of sodium chloprostenol in postpartum bovine and buffalo uterine involution”. Botucatu, 2012. 124p. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT This study was divided into three experiments. In experiment 1, the aim was to evaluate and compare the effect of prostaglandin synthetic analogue administration at different periods of buffalo puerperium. 50 pluriparous buffaloes were randomly divided into three groups: CON (control) – saline at first and third weeks postpartum; CLO1 – chloprostenol at first week and; CLO3 – chloprostenol at third week. Animals were evaluated at days 7, 14, 21, 28 and 35 after parturition about uterine involution degree, uterine fluid accumulation, progesterone plasmatic level, service period and parturition interval. There was no difference between groups on uterine involution degree and progesterone plasmatic level. Groups CLO1 and CLO3 animals presented lower uterine fluid accumulation, service period and parturition interval in relation to control group. The protocol of chloprostenol administration in the first week presented best results on postpartum buffalo reproductive efficiency. In experiment 2, the objective of the study was to verify if chloprostenol administration, at early or intermediary puerperium, can induces changes on progesterone, PGFM and oestradiol plasma concentrations of postpartum buffaloes, beyond effects on uterine involution, intrauterine fluid accumulation and ovarian activity return. 30 Murrah buffaloes were randomly divided into three groups: CONT (saline); CLO2 (chloprostenol at days 2 and 5 postpartum) and; CLO15 (chloprostenol at days 15 and 20 postpartum). Gynecological examinations were performed at days 2, 7, 14, 21 and 28 postpartum, when were evaluated uterine involution degree, intrauterine fluid accumulation and ovarian activity. After exams, were collected blood samples to dosage of progesterone, PGFM and oestradiol plasma concentrations. Group CLO2 showed more uterine involution, faster ovarian activity return and lower progesterone and PGFM plasma concentrations in relation to other groups (P < 0.01). Groups CLO2 and CLO15 xvi 17 presented lower intrauterine fluid accumulation compared to group CONT (P < 0.01). There was no significant difference in oestradiol concentration between experimental groups (P > 0.01). The prostaglandin analogue administration in postpartum buffaloes induces hormonal and physiological alterations, resulting on better reproductive performance indexes of this specie. In experiment 3, the objective was to verify if chloprostenol administration, at early or intermediary puerperium, induces changes on progesterone, PGFM and oestradiol plasma concentrations of Holstein-Zebu postpartum cows, beyond effects on uterine involution, intrauterine fluid accumulation and ovarian activity return. 30 dairy cattle were randomly divided into three groups and evaluated idem experiment 2. Chloprostenol treatment at first week postpartum (CLO2) was significantly better to uterine involution of Holstein-Zebu cows in relation to CONT and CLO15 (P < 0.01). No significant difference was observed on uterine fluid accumulation and progesterone, oestradiol and PGFM concentrations between experimental groups (P > 0.01). There was significant difference between days of evaluation to uterine involution, fluid accumulation and oestradiol plasma concentration (P < 0.01). Animals diagnosed with ovarian activity presented higher uterine involution degree, lower intrauterine fluid accumulation and higher progesterone and oestradiol plasma concentrations than those in anestrus (P < 0.01). PGFM plasma concentration remained high during all study period. Prostaglandin synthetic analogue administration on Holstein-Zebu cattle seems not to induce hormonal alterations in postpartum period, although it accelerates uterine involution in this specie. Keywords: PGFM, progesterone, oestradiol, lochia, ovarian activity, puerperium. xvii 18 CAPÍTULO 1 19 INTRODUÇÃO O índice reprodutivo é uma característica importante para os sistemas de produção de bovinos e bubalinos, uma vez que promove a melhoria da rentabilidade na atividade, podendo, ainda, viabilizar o emprego de programas de seleção animal, em função da maior taxa anual de reposição (MORAES et al., 2007). Para a avaliação da eficiência reprodutiva em rebanhos, o intervalo entre partos é uma variável de grande importância. Porém, trata-se de um índice global que reflete a condição geral da situação reprodutiva da propriedade. Este índice depende, principalmente, de duas variáveis, que seriam a duração do período do parto ao reinício da atividade reprodutiva (intervalo parto – 1º estro), e também do tempo gasto para que se estabeleça uma nova gestação (número de serviços/concepção) (FERNANDES et al., 2002a). No século passado, pensava-se que o reinício da reprodução mais precoce que 60 dias pós-parto seria prejudicial à futura vida reprodutiva do animal. Hoje, preconiza-se que o período puerperal na vaca e na búfala deva evoluir de forma a permitir que a função reprodutiva da fêmea esteja iniciada tão cedo quanto possível após o parto. Desse modo, será possível atingir o objetivo econômico da exploração de um parto/vaca/ano (HORTA, 1995). Como a duração da gestação não pode ser alterada, para melhorar os índices reprodutivos de um plantel, é necessário que as vacas retornem à atividade reprodutiva rapidamente após o parto e que tenham condições ótimas de concepção, ou seja, boa fertilidade (FERNANDES et al., 2004). Para o retorno à atividade reprodutiva, é importante uma involução uterina rápida. Existe correlação entre a involução uterina e o retorno da atividade ovariana pós-parto, isto é, o retardo na involução uterina pode atrasar o reinício da atividade funcional nos ovários, adiando o primeiro cio pós-parto (ZANCHET, 2005). A liberação de prostaglandina F2α (PGF2α) após o parto intensifica o processo de involução (KINDAHL et al., 1999). O conhecimento da eficácia das prostaglandinas no processo de involução uterina levou ao desenvolvimento de protocolos para utilização dos seus análogos no pós-parto, objetivando 20 aceleração da involução uterina, inicialmente em animais onde este processo foi atrasado por algum distúrbio (FERNANDES et al., 2002). Nas últimas décadas, tem sido mostrado que, mesmo em animais com parto normal, a involução pode ser acelerada pela aplicação destas substâncias, levando a melhoras no desempenho reprodutivo (FERNANDES & FIGUEIREDO, 2007). Devido ao baixo custo e fácil aplicação, os protocolos de utilização de prostaglandina exógena podem ser viáveis em qualquer rebanho de bovinos ou bubalinos, independentemente do número de animais. A utilização de análogos da prostaglandina pode levar à aceleração da involução uterina e, por consequência, do intervalo entre partos. No entanto, o mecanismo de ação desses análogos ainda não foi descrito. Deste modo, este estudo tem por objetivo avaliar o efeito da aplicação do cloprostenol sódico (análogo sintético da PGF2α), no puerpério precoce e intermediário, sobre o mecanismo de involução uterina pós-parto de vacas mestiças Holandês-Zebu e búfalas Murrah; por meio da avaliação da velocidade de involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino, reinício da atividade ovariana cíclica e níveis plasmáticos de 13, 14-Dyhidro-15-Keto-PGF2α (PGFM), estrógeno e progesterona durante o puerpério. 21 REVISÃO DE LITERATURA 1.1 Útero de ruminantes O útero, tanto da vaca como da búfala, é bipartido, apresentando cérvix, corpo do útero e 2 cornos uterinos (direito e esquerdo). O órgão não-gestante de bovinos apresenta comprimento médio de 10 cm, 3 a 4 cm e 35 a 40 cm para cérvix, corpo e cornos uterinos, respectivamente. Está localizado quase em sua totalidade na cavidade abdominal em bovinos adultos (SISSON, 1986). Já o útero bubalino, apesar de similar quanto as divisões, apresenta tamanho menor e localização na cavidade pélvica (MOURÃO, 2007). O útero de ambas espécies é constituído por três camadas teciduais: perimétrio (serosa), miométrio (muscular) e endométrio (mucosa) (MARQUES et al., 2007; HAFEZ & JAINUDEEN, 1995). O perimétrio é a camada mais externa, formada predominantemente por tecido conjuntivo frouxo. O miométrio consiste em uma espessa camada de células musculares lisas. O endométrio é constituído por tecido epitelial e conjuntivo, onde podem ser observadas as glândulas endometriais. Nesta camada uterina bovina, existem regiões específicas denominadas carúnculas, proeminências ovais (15 mm de comprimento) formadas por espessamentos circunscritos da lâmina própria, ricos em fibroblastos e suprimento sanguíneo (SISSON, 1986). As carúnculas também podem ser observadas na espécie bubalina. No entanto, apresentam achatamento no eixo dorso-ventral em relação às carúnculas bovinas (MARQUES et al., 2007). Durante a gestação, o útero aumenta consideravelmente em tamanho e espessura. Há tanto hipertrofia como hiperplasia das células musculares lisas miometriais e aumento do calibre dos vasos sanguíneos uterinos. No endométrio, se desenvolvem as carúnculas maternas até cerca de 10 a 12 cm de comprimento, onde se ligam os cotilédones placentários (SENGER, 2003; SISSON, 1986). 22 1.2 Involução uterina Imediatamente após o parto, inicia-se o processo de involução uterina. Este mecanismo inclui um conjunto de modificações que ocorrem no útero da fêmea, levando o orgão à recuperação das transformações ocorridas durante o período da prenhez, para finalmente atingir volume, tamanho, posição e recuperação da capacidade reprodutiva para uma futura gestação (KOZICKI, 1998). A espécie bovina apresenta involução uterina lenta, com duração que varia de 30 a 120 dias (LANDIM, 2006). A involução uterina de búfalas é mais rápida, completando-se entre 15 e 60 dias após o parto (VALE e RIBEIRO, 2005; SHAH, 1990). A massa do tecido uterino deve reduzir mais de 10 vezes dentro de 4 semanas (Figura 1). O útero, logo após o parto normal, pesa aproximadamente 10kg, reduzindo para 0,7-0,8 kg até a 6ª semana após o parto (FERNANDES & FIGUEIREDO, 2007). Figura 1. Útero bovino no 1o e 20o dias pós-parto. Redução do comprimento uterino de 85 cm, no dia 1 pós-parto, para 29 cm no dia 20 pós-parto. Fonte: Senger, 2003. Nos primeiros quatro dias após o parto, a involução uterina é rápida, seguindo uma escala logarítmica, tornando-se mais lenta do 4º ao 9º dia. Nesta fase, chamada período refratário do útero, e que vai do 4º ao 7-8º dia pós- parto, o útero permanece praticamente inerte, não respondendo aos estímulos de hormônios que teriam a capacidade de provocar a contratilidade. A partir do 23 10º dia, e estendendo-se até cerca do 14º dia pós-parto, novamente o processo de involução uterina é retomado, quando já existirão alguns folículos ovarianos atuantes, com produção de quantidades significativas de 17β-estradiol. Esse hormônio irá favorecer a involução uterina, completando-se entre a 4ª e a 7ª semana pós-parto, embora as mudanças após 20-25 dias pós-parto sejam pouco perceptíveis (KOZICKI, 1998). A partir da década de 70, os critérios utilizados para avaliar a involução uterina passaram a ser, basicamente, verificar o tempo de retorno do útero à posição normal na cavidade pélvica, pela palpação retal (SÁNCHEZ et al., 1999). Outros aspectos a serem avaliados são a recuperação do tamanho da cérvix (KASIMANICKAM et al., 2004), do tamanho e da simetria dos cornos uterinos e do restabelecimento da consistência e do tônus uterino (LOPES, 2007; MELENDEZ et al., 2004). Ao exame ultrassonográfico, é possível mensurar com maior precisão o diâmetro dos cornos uterinos e cérvix, além de permitir a visualização do conteúdo uterino (SHELDON et al., 2006; KASIMANICKAM et al., 2004; MELENDEZ et al., 2004). Segundo Melendez et al. (2004), pode-se ainda estimar a espessura do miométrio, subtraindo-se o diâmetro do lúmen uterino do diâmetro total do útero. O mecanismo de involução uterina envolve uma complexa série de eventos que incluem contrações miometriais, reparação do endométrio (SCHIRAR & MARTINET, 1982) e redução do fluxo sanguíneo uterino (KRUEGER et al., 2009). 1.2.1 Contração miometrial Durante o processo de involução, o útero apresenta perdas significativas em massa e volume tecidual. O miométrio apresenta contrações musculares, que auxiliam a sua redução volumétrica (HERTELENDY & ZAKAR, 2004). Em raças leiteiras, as células miometriais possuem 700 µm no dia do parto, reduzindo para 200 µm poucos dias depois (SENGER, 2003). O tecido miometrial tem a capacidade de adaptar-se rapidamente à diminuição de conteúdo, sem prejuízo para o tônus muscular. A contração das células 24 musculares (miometriais) é cálcio-dependente. A liberação de cálcio no citoplasma dessas células é estimulada por ação hormonal (HERTELENDY & ZAKAR, 2004). O intervalo entre as contrações miometriais aumenta à medida que avança o puerpério. Na maioria das espécies domésticas, as contrações miometriais ocorrem em intervalos de 3-4 minutos na primeira semana pós- parto (SENGER, 2003). 1.2.2 Reparação do endométrio A placentação da vaca é do tipo adeciduado (Figura 2; JAINUDEEN & HAFEZ, 1995). A placenta só é expulsa algumas horas após o nascimento. Após o parto, as carúnculas e o restante da parede uterina iniciam um processo semelhante a um processo inflamatório (BENCHARIF et al., 2000). Figura 2. Útero gestante bovino. FC – cotilédones fetais; MC – carúnculas maternas; C – córion; A – amnion; M – miométrio; E – endométrio. Fonte: Senger, 2003. Para que haja o restabelecimento do endométrio, é necessário acontecer o descolamento fisiológico da placenta. Inicia-se então outro processo onde as criptas endometriais, que eram profundas, tornam-se mais aplainadas, as vilosidades coriônicas diminuem de tamanho devido à redução do fluxo sanguíneo pelo corte do cordão umbilical, bem como ocorrerá a colagenização dos espaços nos placentomas (GRUNERT & BIRGEL, 1982). 25 Sabe-se que, durante os primeiros 7 a 10 dias pós-parto, há descarga de líquido chamado lóquio. Esse lóquio é formado por substâncias remanescentes do fluido fetal, sangue dos vasos rompidos e grânulos de enzimas proteolíticas formados no endométrio durante a gestação (GRUNERT & BIRGEL, 1982). Células binucleadas e fagocitárias iniciam mudanças necróticas pelas camadas celulares da superfície endometrial (carúnculas) destruídas pela degeneração gordurosa, já nas primeiras 48 horas pós-parto, dando origem à secreção serosa, com conteúdo celular, na cavidade uterina. No quinto dia pós-parto, as carúnculas apresentam superfície necrótica de 1 a 2 mm de espessura. Posteriormente, este tecido necrótico será eliminado no lóquio (NOAKES, 1991). Inicialmente, o volume de lóquio é de aproximadamente 1500 ml, reduzindo para cerca de 500 ml no 8º dia (GRUNERT & BIRGEL, 1982). Clinicamente, quanto mais viscosa e inodora for a descarga loquial, melhor é o prognóstico reprodutivo. A regeneração do endométrio ocorre imediatamente após o parto naquelas áreas menos danificadas e completa-se na região intercaruncular em torno do 8º dia pós-parto. A completa reepitelização das carúnculas, que inicia-se na terceira semana pós-parto, originada em grande parte pelo crescimento celular centrípeto das células que circundam as glândulas uterinas, completa-se entre o 25º e o 60º dias pós- parto (NOAKES, 1991; ARTHUR et al., 1989). 1.2.3 Ação hormonal Devido ao prolongado período de inibição durante a gestação, pelo contínuo feed-back negativo da progesterona secretada pelo corpo lúteo e placenta, a hipófise torna-se temporariamente refratária no pós-parto (LAMMING et al., 1979). O período do parto ao reinício da atividade ovariana caracteriza-se, do ponto de vista hormonal, pela ausência de esteróides sexuais na circulação e por níveis elevados de prostaglandina F2 alfa (PGF2α), de origem predominantemente uterina (TORIBIO et al., 1994). 26 1.2.4 Prostaglandina F2α e receptor FP A PGF2α é um metabólito do ácido aracdônico, que é liberado dos fosfolipídeos pela fosfoslipase A2 (PLA2). O endométrio bovino contém grandes quantidades de ácido aracdônico e tem a habilidade de metabolizá-lo em uma variedade de produtos (AULETTA & FLINT, 1988). A síntese de prostaglandinas ocorre em etapas pela enzima peroxidase citosólica e por dois tipos de enzimas ligadas à membrana (cicloxigenase-COX e isomerase endoperoxidase) (SALAMONSEN & FINDLAY, 1990). A primeira etapa da produção de prostaglandina é catalisada pela enzima COX (prostaglandina G/H sintase) que converte ácido aracdônico em uma forma instável de PGG2. A peroxidase converte rapidamente PGG2 em PGH2. PGG2 e PGH2 são moléculas biologicamente ativas instáveis, chamadas endoperóxidos. A PGH2 é convertida em PGF2α e outras prostaglandinas pela endoperóxido isomerase (prostaglandina sintase) e outras peroxidases (SALAMONSEN & FINDLAY, 1990; OKUDA et al., 2002). A expressão do gene COX nas células do endométrio bovino é influenciada por esteróides ovarianos. Progesterona e estrógeno podem afetar diretamente a secreção de PGF2α basal pelo endométrio, regulando a resposta endometrial à ocitocina e outros fatores de regulação (XIAO et al., 1998). A progesterona estimula a produção basal de PGF2α pelas células e tecidos do endométrio bovino, mas inibe a secreção de ocitocina estimulada por PGF2α (SKARZYNSKI et al., 1999). O estradiol diminui a produção basal de PGF2α pela down-regulation da COX-mRNA (XIAO et al., 1998), e aumenta a produção de PGF2α estimulada pela ocitocina em células endometriais de bovinos cultivadas por longo período (OKUDA et al., 2002). No endométrio bovino, há a expressão de duas enzimas que conduzem diretamente a produção de PGF2α, a PGF sintase (PGFS) e PGE2-9- ketoredutase (9K-PGR). A PGFS catalisa a redução de PGH2 em PGF2α, enquanto a 9K-PGR é uma enzima dependente de NADPH, que catalisa a conversão de PGE2 em PGF2α. A PGF2α e outras prostaglandinas não são armazenadas nas células, sendo liberadas imediatamente após a síntese (ASSELIN & FORTIER, 2000). 27 A PGF2α é primariamente secretada pela região intercaruncular da superfície epitelial uterina, sendo considerada a maior contribuinte para a regulação dos processos reprodutivos (ASSELIN et al., 1998; SKARZYNSKI et al., 2000). A habilidade do endométrio bovino de produzir prostaglandina varia durante o ciclo estral e puerpério (OKUDA et al., 2002). Durante o ciclo estral, o útero libera PGF2α em séries de pulsos de curta duração por 2-3 dias durante e após a luteólise (KINDHAL et al., 1981). No processo fisiológico de separação e expulsão da placenta nos bovinos (HORTA, 1995), a PGF2α é liberada antes do início do parto e acarreta a luteólise pré-parto. Após o parto, na fase do puerpério precoce, o fenômeno endócrino dominante é a liberação de grande quantidade de prostaglandina, devido principalmente à elevada incidência de contaminação bacteriana. Os níveis elevados de PGF2α impedem que os ovários iniciem a atividade cíclica propriamente dita (KINDAHL et al., 1992; JAINUDEEN & HAFEZ,1995), além de intensificar o processo de involução uterina (FERNANDES et al., 2003; KINDHAL et al., 1999). Vários pesquisadores têm procurado esclarecer o mecanismo de ação da prostaglandina no pós-parto, porém o mesmo ainda não está de todo elucidado (MACHADO et al., 2003). Durante o período puerperal, há presença de metabólitos da prostaglandina (PGFM) no sangue, e estes estão correlacionados à involução uterina em vacas e búfalas (MISHRA & PRAKASH, 2005; BEKANA et al., 1999). O nível de PGFM alcança seu valor máximo 2-3 dias após o parto em bovinos e diminui progressivamente até retornar a seu nível basal aos 15 dias pós-parto (GUILBAULT et al., 1984). Já na espécie bubalina, o valor máximo é observado um dia antes do parto, alcançando o nível basal em 4 semanas (MISHRA & PRAKASH, 2005). O período onde a produção de prostaglandina pelo útero é maior coincide com a involução uterina de bovinos, comprovando ser esta a principal substância relacionada a este processo na espécie bovina (TORIBIO et al., 1994). A PGF2α estimula a atividade da camada muscular uterina (miométrio) após o parto em bovinos (FERNANDES et al., 2003). Se a duração da liberação de PGF2α for muito curta, a involução uterina estará prejudicada; já se for mais longa, o processo involutivo do útero será mais acelerado (KINDHAL 28 et al., 1992). No entanto, não há relatos deste efeito em búfalas durante o puerpério. Nas vacas que não apresentam retenção de placenta após o parto, há inicialmente nos placentomas PGF2α em concentrações mais elevadas do que nas vacas que tiveram a placenta retida (GRUNERT & BIRGEL,1982). Um fenômeno semelhante foi relatado em bubalinos, onde os níveis plasmáticos de PGFM são maiores em animais que não tiveram retenção das membranas fetais (MISHRA & PRAKASH, 2005). As prostaglandinas mediam suas ações por meio de receptores transmembrana acoplados à proteína G (GPCRs) específica para cada prostanóide (ANDERSON et al., 1999). O receptor da PGF2α é conhecido como receptor FP (MILNE & JABBOUR, 2003). Em bovinos e bubalinos, os estudos do receptor FP têm sido limitados ao corpo lúteo (VERMA-KUMAR et al., 2004). No entanto, estudos em mulheres identificaram o miométrio como o principal alvo da PGF2α. O receptor FP é expresso em grande quantidade no miométrio humano (MATSUMOTO et al., 1997), com concentrações nanomolares de PGF2α induzindo contrações em tiras de miométrio in vitro (SENIOR et al., 1992). A evidência de que o miométrio é o maior alvo para PGF2α é reforçada pelas observações de receptor FP de rato, onde a perda de contratilidade miometrial e falha na indução do parto são as maiores mudanças fenotípicas (SUGIMOTO et al., 1997; MILNE & JABBOUR, 2003). No endométrio, a expressão do receptor FP está localizada predominantemente nas células epiteliais com regulação temporal, onde o nível de expressão mais alto é detectado no endométrio em proliferação. Após o tratamento com PGF exógena, foi observada ativação do mecanismo PLC e liberação de inositol fosfato. Os fatores que regulam a expressão do receptor FP durante a fase proliferativa no endométrio humano não estão claros. No entanto, tem sido mostrado que os hormônios esteróides afetam a expressão deste receptor (MILNE & JABBOUR, 2003). Além de estar presente nas células epiteliais, o receptor FP também está localizado nas células perivasculares do endométrio humano ao longo do ciclo menstrual. Esta expressão é mais comum na camada de músculo liso da 29 região perivascular, onde o FP possivelmente media efeitos vasopressores que estão associados à função da PGF2α na vasculatura (GRIFFIN et al., 1998). Não há possibilidade de ocorrer ovulação pós-parto, até que a liberação de PGF2α cesse ou que esteja muito próxima aos níveis basais, fato que ocorre a partir da quarta semana após o parto em bovinos (KINDAHL et al.,1992) e bubalinos (VALE & RIBEIRO, 2005). Assim como a PGF2α endógena, seus análogos sintéticos (cloprostenol sódico, dinoprost, fluprostalene, fluprostenol, luprostil e prostaleno) atuam de forma semelhante sobre a involução uterina. Os protocolos de cloprostenol sódico no pós-parto têm sido os mais utilizados, apresentando efeitos benéficos sobre a eficiência reprodutiva dos bovinos e bubalinos (FERNANDES & FIGUEIREDO, 2007; FERRAZ, 2006). 1.2.5 Redução do fluxo sanguíneo Em vacas holandesas no puerpério, a perfusão uterina diminui drasticamente na primeira semana pós-parto (FORD et al., 1982; GUILBAULT et al., 1984), acompanhando a involução uterina que diminui de 8 kg no dia do parto até 3,6 kg após oito dias (GIER & MARION, 1968). Entre os dias sete e 28 pós-parto, o volume de fluxo sanguíneo uterino continua diminuindo discretamente (KRUEGER et al., 2009). Diferente do volume de fluxo sanguíneo, o índice de pulsatilidade apresenta um aumento linear durante as quatro primeiras semanas após o parto, o que pode ocorrer devido à vasoconstrição dos vasos carunculares. Embora a involução uterina complete-se por volta de 45 dias pós-parto, foi relatado que o índice de pulsatilidade continua alterado até o dia 86, sem atingir ainda seu valor mínimo (KRUEGER et al., 2009). Em vacas holandesas, as variações do índice de pulsatilidade não cessam após a primeira ovulação pós-parto, assim como não há influência da atividade ovariana cíclica sobre os parâmetros de fluxo sanguíneo. O número de crias é um fator a ser considerado, já que foi observado que animais com mais de duas lactações apresentam volumes de fluxo sanguíneo mais altos. Quanto à fertilidade, animais que ficaram gestantes antes de 86 dias pós-parto 30 não apresentaram diferenças significativas no índice de pulsatilidade após o dia 14 (KRUEGER et al., 2009). Até o momento, não há relatos de estudos do fluxo sanguíneo em búfalas pós-parto. 1.2.6 Relação com a atividade ovariana O início da atividade ovariana corresponde ao momento em que os níveis de prostaglandinas atingem, pela primeira vez, os valores basais após o parto (VALE & RIBEIRO, 2005; HORTA, 1995). Com o início da atividade ovariana, inicia-se uma alternância cíclica entre as concentrações de estrógenos, progesterona e prostaglandina na circulação, resultante de interações entre útero, ovário, hipotálamo e hipófise. Neste período, que se inicia normalmente antes da involução completa do útero, as taxas de involução do cérvix e do útero são influenciadas significativamente pelo momento em que se inicia a atividade ovariana (MARQUES & HORTA, 1987). O retorno à atividade ovariana na espécie bovina é marcado pela ocorrência de ciclos estrais curtos. Característica essa pouco observada em búfalas no puerpério, já que a maioria apresenta ciclos estrais de duração normal neste período (VALE & RIBEIRO, 2005). Em gado de leite, ciclos estrais curtos podem ser verificados em 50% das vacas no início do período pós-parto (FERREIRA et al., 2007). O 1º ciclo estral, seguido de ovulação em bovinos, é de aproximadamente 17 dias de duração. Muitos dos primeiros estros pós-parto com ovulação são silenciosos, e o cio clássico somente será observado em 20 a 30 % das vacas européias com corpo lúteo no 30º dia (KOZICKI, 1998). Na espécie bubalina, o retorno da atividade ovariana cíclica ocorre por volta dos 37 dias em média para animais Murrah leiteiros. O primeiro estro, seguido de comportamento, é relatado com variação de 24 a 100 dias após o parto (BARUSELLI, 1992). Animais em ordenha podem apresentar cio aos 60 dias pós-parto (variando de 22 a 120 dias). Já aqueles em sistema de bezerro 31 ao pé, podem apresentar cio aos 75 dias (38 a 135 dias; EL-FADALY, 1980a; b; EL-FOULY, 1976). Há correlação positiva da 1ª ovulação (ciclo normal) com a completa involução uterina. Isto significa que animais com mais rápida involução uterina retornarão também mais rapidamente à atividade ovariana (KOZICKI, 1998). 1.2.7 Fatores que afetam a involução As complicações durante o parto e puerpério estão significativamente correlacionadas com a involução uterina (ZAIN et al., 1995). Partos distócicos, gestação gemelar, prolapso uterino, retenção de placenta e infecção uterina podem atrasar o processo de involução (LANDIM, 2006; ZAIN et al., 1995). O número de partos é outro fator de grande influência. Sánchez et al. (1999) descrevem tendência de aumento de tempo de involução à medida que aumenta o número de partos. Por outro lado, animais em lactação possuem involução uterina mais rápida (JAINUDEEN & HAFEZ, 1995). Búfalas submetidas ou não a separação de bezerros à noite apresentaram diferença na duração do processo de involução uterina e retorno da atividade ovariana cíclica (VALE & RIBEIRO, 2005). Além disto, a literatura relata diferença na duração do processo de acordo com a raça da fêmea. Segundo Landim (2006), raças taurinas apresentam involução com duração média de 30 a 60 dias, enquanto animais zebuínos de até 100 a 120 dias. A involução uterina pode estar completa a partir de 45 dias após o parto em animais oriundos de cruzamento holandês- zebu. A involução dos cornos uterinos de vacas Gir leiteiras tem duração média de 29,7± 9,6 dias e, na maioria das vezes, a involução da porção cervical demora mais que 43 dias. Em raças européias, 85% dos animais completam a involução uterina até o 42º dia pós-parto (SÁNCHEZ et al., 1999). Em bubalinos, foi reportada involução uterina completa aos 39 dias pós- parto para búfalas Murrah (DEVANATHAN et al., 1987), 27 dias para a raça Nili-ravi (CHAUDHRY et al., 1987; USMANI et al., 1985), 38 a 51 dias para a raça Kundi (SAMO et al., 1987) e 33 dias para búfalos do pântano (PERERA et al., 1987; JAINUDEEN et al., 1985). 32 A estacionalidade reprodutiva, precipitação pluviométrica (CHANTALAKHANA et al., 1984), oferta de pastagem (RIBEIRO, 1996) e escore de condição corporal dos animais (HEGAZY et al., 1994; BHALARU et al., 1987; DOBSON & KAMONPATANA, 1986) também são fatores que podem influenciar a duração do processo de involução em búfalas. 33 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDERSON, L.E.; SCHULTZ, M.K.; WILTBANK, M.C. Prostaglandin moieties that determine receptor binding specificity in the bovine corpus luteum. Journal of Reproduction and Fertility, v. 116, p. 133-141, 1999. ARTHUR, G.H.; NOAKES, D.E.; PEARSON, H. Veterinary reproduction and obstetrics. 6ª ed. Bail. 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A Hora Veterinária, v. 24, n. 143, 2005. 43 CAPÍTULO 2 44 Artigo científico a ser enviado ao Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia Acompanhamento ultrassonográfico, da concentração de progesterona e indicadores de desempenho reprodutivo após aplicação de cloprostenol em búfalas pós-parto Ultrasonographic monitoring, progesterone level and reproductive performance index after chloprostenol injection in postpartum buffalo A.S. Camargos1, E. Oba1, A. A. Ramos2, E. Padron3, O. F. Sanchez3, Y. M. Montes3, C. G. Gonzalez3 1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ UNESP, Botucatu - SP 2 Departamento de Produção Animal – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ UNESP, Botucatu - SP 3 Departamento de Ruminantes – Instituto de Ciência Animal – ICA, San José de las Lajas - Cuba RESUMO Este estudo objetivou avaliar o efeito da administração de análogo sintético de prostaglandina F2α em diferentes períodos do puerpério de bubalinos. 50 búfalas pluríparas foram divididas aleatoriamente em três grupos: CON (controle) – soro fisiológico na primeira e terceira semanas pós-parto; CLO1 – cloprostenol sódico na primeira semana e; CLO3 – cloprostenol sódico na terceira semana. Os animais foram avaliados nos dias 7, 14, 21, 28 e 35 após o parto quanto ao grau de involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino, concentração de progesterona plasmática, período de serviços e intervalo entre partos. Não houve diferença entre os grupos quanto ao grau de involução uterina e concentração de progesterona plasmática. Os animais dos grupos CLO1 e CLO3 apresentaram menor acúmulo de fluido intrauterino até o dia 21 (0,44±0,63 do CON; 0,07±0,26 do CLO1; e 0,15±0,37 do CLO3), período de serviços 45 (51,8± do CON; 35,5± do CLO1; e 44,56 do CLO3) e intervalo entre partos (371,1± do CON; 355± do CLO1; e 363,53 do CLO3) em relação ao grupo controle. O protocolo com aplicação de cloprostenol na primeira semana apresentou os melhores resultados sobre a eficiência reprodutiva de búfalas pós-parto. Palavras chave: involução uterina, intervalo entre parto, prostaglandina F2α, Bubalus bubalis ABSTRACT This study aimed to evaluate the effect of prostaglandin synthetic analogue administration at different periods of buffalo puerperium. 50 pluriparous buffaloes were randomly divided into three groups: CON (control) – saline at first and third weeks postpartum; CLO1 – chloprostenol at first week and; CLO3 – chloprostenol at third week. Animals were evaluated at days 7, 14, 21, 28 and 35 after parturition about uterine involution degree, uterine fluid accumulation, progesterone plasmatic level, service period and parturition interval. There was no difference between groups on uterine involution degree and progesterone plasmatic level. Animals of groups CLO1 and CLO3 presented lower uterine fluid accumulation, service period and parturition interval in relation to control group. The protocol of chloprostenol administration in the first week presented best results on postpartum buffalo reproductive efficiency. Key-words: uterine involution, parturition interval, prostaglandin F2α, Bubalus bubalis INTRODUÇÃO Durante a gestação, o útero aumenta consideravelmente em tamanho e espessura. Há tanto hipertrofia como hiperplasia das células musculares lisas miometriais e aumento do calibre dos vasos sanguíneos uterinos. No endométrio, se desenvolvem as carúnculas maternas até cerca de 10 a 12 cm de comprimento, onde se ligam os cotilédones placentários (Sisson, 1986; Senger, 2003). Imediatamente após o parto, inicia-se o processo de involução uterina. Este mecanismo inclui um conjunto de modificações que ocorrem no útero da fêmea, levando o orgão à recuperação das transformações ocorridas durante o período da 46 prenhez, para finalmente atingir volume, tamanho, posição e recuperação da capacidade reprodutiva para uma futura gestação (Kozicki, 1998). A involução uterina na espécie bubalina é rápida, completando-se entre 15 e 60 dias após o parto (Shah, 1990; Vale e Ribeiro, 2005). A avaliação da involução uterina consiste, basicamente, em verificar o tempo de retorno do útero à posição normal na cavidade pélvica, pela palpação retal (Sánchez et al., 1999). Outros aspectos a serem avaliados são a recuperação do tamanho da cérvix (Kasimanickam et al., 2004), do tamanho e da simetria dos cornos uterinos e do restabelecimento da consistência e do tônus uterino (Melendez et al., 2004; Lopes, 2007). Ao exame ultrassonográfico, é possível mensurar com maior precisão o diâmetro dos cornos uterinos e cérvix, além de permitir a visualização do conteúdo uterino (Kasimanickam et al., 2004; Melendez et al., 2004; Sheldon et al., 2006). O hormônio responsável pelo processo de involução uterina após o parto é a prostaglandina F2α (PGF2α) (Kindahl et al., 1999; Mishra e Prakash, 2005). Isto levou ao desenvolvimento de protocolos para utilização dos seus análogos sintéticos no pós- parto, objetivando a redução do intervalo entre partos (IEP) (Fernandes et al., 2002). Devido ao baixo custo e fácil aplicação, os protocolos de utilização de prostaglandina exógena podem ser viáveis em qualquer rebanho de bovinos ou bubalinos, independentemente do número de animais (Fernandes e Figueiredo, 2007). Deste modo, este trabalho objetivou avaliar o efeito de análogo sintético da prostaglandina F2α, aplicado no puerpério precoce ou intermediário, sobre a eficiência reprodutiva de búfalas pós-parto, por meio de exames de palpação, ultrassonografia, dosagem de progesterona plasmática, período de serviços (PS) e IEP. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado entre julho de 2011 e outubro de 2012, na Empresa Genética Pecuária El Cangre, La Habana, Cuba (Latitude 23º 5.35’ N; Longitude 82º 30.5’ W). Foram selecionadas 45 búfalas de rio pluríparas gestantes, com escore de condição corporal maior que três (escala de 1 a 5), manejadas em sistema extensivo, sem qualquer suplementação alimentar. Apenas foram utilizados os animais que apresentaram parto normal sem retenção de placenta. 47 Após o parto, estes animais foram acompanhados e divididos aleatoriamente, de acordo com a ocorrência de parições, em três grupos experimentais: CON (controle; N = 15) – aplicação intramuscular (IM) de 2 mL de solução fisiológica nos dias 2, 5, 15 e 20 pós-parto; CLO1 (cloprostenol na 1ª semana; N = 15) – aplicação IM de 2 mL de cloprostenol sódico (0,530 mg - Ciosin®, Intervet Schering-Plough) nos dias 2 e 5 pós- parto e aplicação de 2 mL de solução fisiológica nos dias 15 e 20 pós-parto; CLO3 (cloprostenol na 3ª semana; N = 15) – aplicação IM de 2 mL de solução fisiológica nos dias 2 e 5 pós-parto e 2 mL de cloprostenol sódico nos dias 15 e 20 pós-parto. Para evitar influência de outras variáveis, como aspectos climáticos e nutricionais, todos os grupos experimentais foram avaliados simultaneamente. A solução fisiológica e o cloprostenol foram acondicionados em frascos iguais com identificação numérica 1 e 2. Deste modo, foi realizado um teste cego, onde somente o técnico responsável estava ciente do conteúdo dos frascos. Durante o estudo, todas as búfalas foram avaliadas quanto ao grau de involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino, concentração de progesterona plasmática. As avaliações foram realizadas nos dias 7, 14, 21, 28 e 35 após o parto. O exame ginecológico dos animais foi iniciado pela avaliação do grau de involução uterina, via palpação retal. O grau de involução uterina foi classificado em uma escala de 1 a 3 (Grunert, 1980), sendo: Grau 1 - útero pouco involuído com a totalidade da sua massa na cavidade abdominal, apresentando grande assimetria, não sendo possível examinar toda sua extensão; Grau 2 - útero com parte de sua massa na cavidade abdominal, com razoável assimetria entre os cornos, sendo possível a palpação e o exame de toda a sua extensão e; Grau 3 - útero em quase sua totalidade na cavidade pélvica, apresentando-se simétrico ou com discreta assimetria. A involução uterina foi considerada completa quando não houve mais alteração do diâmetro e do tônus uterino, após duas palpações consecutivas. Em seguida, os animais foram submetidos a exame ultrassonográfico (Aloka SSD500) em modo B para avaliação do acúmulo de fluido intrauterino, conforme descrito por Krueger et al. (2009). O acúmulo de fluido foi quantificado pela média de três avaliações do diâmetro do corno uterino e classificado em uma escala de 0 a 3, onde: 0 - sem fluido; 1 - entre 0 e 1,5 cm; 2 - entre 1,5 e 2,5 cm e; 3 - maior que 2,5 cm. Após cada exame ginecológico, foram colhidas amostras de sangue da veia jugular em tubos heparinizados para dosagem de progesterona, por sistema de coleta a vácuo. As amostras foram mantidas em caixa térmica refrigerada por 10 minutos e 48 centrifugadas (2500 giros) por 15 minutos. O plasma foi acondicionado em microtubos e congelado (-20ºC) para análise posterior. A concentração de progesterona foi mensurada através de kit diagnóstico em fase sólida Coat-a-Count (Diagnostics Products Corporation®, Los Angeles, CA, USA), por leitura com sistema de radioimunoensaio, segundo as recomendações do fabricante. Funcionários da empresa foram instruídos para colheita dos dados das ocorrências reprodutivas, como estros, montas e partos, em formulários próprios. Para as análises estatísticas, os dados foram analisados pelo método dos quadrados mínimos descrito no procedimento GLM do SAS (2012), tendo como causa de variação tratamentos e dias de avaliação. As diferenças entre médias foram submetidas ao teste de Tukey a 5% de probabilidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO O grau de involução uterina não apresentou diferença significativa entre os grupos de tratamento avaliados (Tab. 1). Foi observada diferença apenas no dia 14 para os grupos CLO1 e CLO3 em relação ao grupo CON. Aos 35 dias, a involução uterina estava completa em todos os grupos avaliados. Tabela 1. Grau de involução uterina à palpação transretal dos grupos tratados com cloprostenol, durante o puerpério precoce ou intermediário de búfalas, aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias pós-parto (média ± desvio padrão). Tratamento 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias CON (N = 15) 1,06±0,25 Aa 1,50±0,63 Ab 2,56±0,51 Ac 2,87±0,34 Ad 3,00±0,00 Ad CLO1 (N = 15) 1,07±0,26 Aa 1,80±0,86 Bb 2,53±0,64 Ac 2,87±0,35 Ad 3,00±0,00 Ad CLO3 (N = 15) 1,08±0,28 Aa 2,00±0,82 Bb 2,69±0,48 Ac 3,00±0,00 Ad 3,00±0,00 Ad CON – grupo controle; CLO1 – grupo recebedor de cloprostenol na 1ª semana pós-parto; CLO3 – grupo recebedor de cloprostenol na 3ª semana pós-parto. AB - Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. ab - Letras minúsculas diferentes na mesma linha diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Estes resultados indicam que a utilização de análogo sintético de PGF2α pode não ser tão eficaz em acelerar a involução uterina de búfalas pós-parto como ocorre na espécie bovina. Deve-se atentar para o fato de que as búfalas apresentam um período de involução uterina mais curto (entre 25 e 30 dias) quando comparado aos bovinos, ou 49 seja, sua involução é naturalmente mais rápida. Isto pode ter reduzido o efeito do protocolo hormonal, devido a uma saturação das ligações hormônio-receptor FP uterino. Ferraz (2006) observou uma redução média de 4,2 dias no período total de involução uterina, após a aplicação de cloprostenol nos dias 2 e 7 pós-parto. Ainda quanto à involução uterina, foi observada diferença significativa entre os dias 7, 14, 21 e 28 pós-parto. Na primeira semana após o parto, não foi observada involução uterina, sendo observado o grau mínimo (1). Isto ocorre porque, como o útero está em sua maior parte na cavidade abdominal, não é possível examiná-lo em toda a sua extensão (Ferraz, 2006). Portanto, se há involução uterina neste período, não é possível detectá-la pelo exame de palpação transretal. Já entre o sétimo e 14º dias, a involução uterina foi significativamente mais rápida e possível de ser detectada à palpação. Apesar de ainda apresentarem grande assimetria, já pôde-se distinguir os cornos uterinos. A involução uterina manteve-se rápida até a semana seguinte (aos 21 dias pós-parto), com os animais sendo avaliados, no mínimo, como grau 2. A partir dos 21 dias após o parto, a involução uterina tornou-se mais lenta. Foram observadas pequenas reduções no tamanho uterino. Aos 28 dias, os cornos uterinos já apresentavam um padrão de assimetria discreta ou simetria. As mudanças entre 28 e 35 dias foram quase imperceptíveis. Períodos de involução uterina semelhantes, entre 25,1 e 30 dias, foram descritos anteriormente para búfalas pluríparas (Soares et al., 1985; Vale et al., 1986; Del Rei et al., 1991; Baruselli et al., 1996; Ferraz, 2006; Ferreira et al., 2010). O acúmulo de fluido intrauterino foi menor (Tab. 2) nos grupos que receberam cloprostenol (CLO1 e CLO3). Embora não tenha sido capaz de acelerar a involução uterina, o cloprostenol parece ter exercido efeito positivo sobre o tônus muscular uterino, favorecendo a eliminação de lóquios. Segundo Vasconcelos et al. (2000), a ação miotônica da prostaglandina endógena é potencializada quando administra-se prostaglandina exógena, levando a maior amplitude das contrações uterinas. Efeito este benéfico no período puerperal, por auxiliar a limpeza do lúmen uterino durante o processo de eliminação de restos placentários e fetais e reparação do endométrio. Quanto mais rápida a eliminação de lóquio, menor a chance de um quadro de infecção uterina puerperal (Noakes, 1991). A ação benéfica do cloprostenol sobre o tônus uterino de búfalas pós-parto foi relatada anteriormente por Ferraz (2006). 50 Tabela 2. Acúmulo de fluido intrauterino avaliado por exame ultrassonográfico (escala de 0 a 3) dos grupos tratados com cloprostenol, durante o puerpério precoce ou intermediário, aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após o parto (média ± desvio padrão). Tratamento 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias CON (N = 15) 2,87±0,34 Aa 1,50±0,73 Ab 0,44±0,63 Ac 0,19±0,40 Ac 0,06±0,25 Ac CLO1 (N = 15) 2,07±0,88 Ba 1,20±0,86 Bb 0,07±0,26 Bc 0,07±0,26 Ac 0,00±0,00 Ac CLO3 (N = 15) 2,23±0,72 Ba 1,08±0,95 Bb 0,15±0,37 ABc 0,08±0,28 Ac 0,00±0,00 Ac CON – grupo controle; CLO1 – grupo recebedor de cloprostenol na 1ª semana pós-parto; CLO3 – grupo recebedor de cloprostenol na 3ª semana pós-parto. AB - Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. ab - Letras minúsculas diferentes na mesma linha diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Além disto, foi observada diferença significativa de acúmulo de fluido intrauterino entre os dias 7, 14 e 21 pós-parto. Este período coincide com o período de eliminação de lóquio no puerpério fisiológico. A quantidade de líquido produzido e excretado diminui conforme o volume uterino é reduzido pelas contrações miometriais (Noakes, 1991). Aos sete dias após o parto, o volume de lóquio liberado ainda é alto, em torno de 500 mL (Grunert e Birgel, 1982). Quanto à concentração de progesterona plasmática, não houve diferença significativa entre os grupos de tratamento. Uma diferença foi notada apenas entre os dias 7, 14 e 21 com relação ao dia 35 após o parto (Fig. 1). A concentração de progesterona plasmática diminuiu ao longo do puerpério. Principalmente, nas duas primeiras semanas após o parto. Esta redução hormonal mostrou-se mais lenta quando comparada à espécie bovina. Durante todo o período gestacional de ruminantes, há produção intensa de progesterona pelo corpo lúteo e placenta (Lamming et al., 1979). Após a luteólise pré- parto, as concentrações de progesterona tendem a diminuir gradativamente, voltando a aumentar somente após o restabelecimento da atividade ovariana cíclica, quando há formação de novo corpo lúteo (Toribio et al., 1994). Os índices PS e IEP foram significativamente diferentes em todos os grupos avaliados (Fig. 2), sendo menores nos grupos tratados (CLO1 e CLO3). O grupo CLO1 obteve os melhores índices reprodutivos, atingindo uma diferença de 15 dias em relação ao grupo controle. 51 Figura 1. Gráfico ilustrando a concentração de progesterona plasmática (P4) de búfalas dos 7 aos 35 dias após o parto. Eixo vertical corresponde à concentração plasmática de progesterona (ng/mL). Eixo horizontal corresponde ao dia pós-parto. Figura 2. Médias de dias do período de serviços (PS) e intervalo entre partos (IEP) dos grupos de búfalas tratadas com cloprostenol na primeira ou terceira semanas pós-parto. CON – grupo controle; CLO1 – grupo recebedor de cloprostenol na 1ª semana pós-parto; CLO3 – grupo recebedor de cloprostenol na 3ª semana pós-parto. Os números de cada coluna representam a média de dias de período de serviços (em azul) e intervalo entre partos (em vermelho). Ao contrário do que foi observado por Ferraz (2006), o uso de duas doses de cloprostenol em búfalas pós-parto levou a uma redução do período de serviços e intervalo entre partos destes animais. Em estudos anteriores, este protocolo levou apenas à redução do intervalo parto-1º estro de bubalinos (em 20,1 dias). Resultados C on ce nt ra çã o de p ro ge st er on a (n g/ m L) 52 semelhantes ao deste estudo foram relatados anteriormente em bovinos (Fernandes et al., 2003; Fernandes et al., 2004; Camargos, 2009), com redução de até 26 dias no intervalo entre partos. CONCLUSÃO Apesar de não ter acelerado o processo de involução uterina em búfalas pós- parto, a utilização de análogo sintético de prostaglandina durante o puerpério foi eficaz na otimização dos indicadores de performance reprodutiva desta espécie. O protocolo com aplicação de cloprostenol sódico no puerpério precoce obteve o melhor resultado, podendo ser indicado para aumento da eficiência reprodutiva em rebanhos bubalinos. AGRADECIMENTO À CAPES pelo financiamento do projeto e bolsa de doutorado sanduíche. REFERÊNCIAS BARUSELLI, P. et al. Involução uterina no período pós-parto em fêmeas bubalinas (Bubalus bubalis). B. Indústr. Anim., v.53, n. 1, p.51-55, 1996. CAMARGOS, A. S. 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Carvalho3 1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Distrito Rubião Jr. s/ n., Botucatu, SP, Brasil 2 Departamento de Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Fazenda Lageado, Botucatu, SP, Brasil 3 Agência Paulista de Tecnologia do Agronegócio – APTA, Fazenda Experimental, Rodovia Régis Bittencourt km 435, Registro, SP, Brasil * Corresponding author. Endereço: Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Distrito Rubião Jr. s/ n., Botucatu, SP, Brasil. E-mail: euniceoba@fmvz.unesp.br (E. Oba) 1. Introdução Para o retorno à atividade reprodutiva, é importante a involução uterina rápida. A liberação de prostaglandina F2α (PGF2α) após o parto intensifica o 58 processo de involução (Kindahl et al., 1999). O conhecimento da eficácia das prostaglandinas no processo de involução uterina levou ao desenvolvimento de protocolos para utilização dos seus análogos no pós-parto (Fernandes et al., 2002). Devido ao baixo custo e fácil aplicação, os protocolos de utilização de prostaglandina exógena podem ser viáveis em qualquer rebanho, independentemente do número de animais. A utilização de análogos da prostaglandina pode levar à aceleração da involução uterina e, por consequência, redução do intervalo entre partos (Ferraz, 2006). Durante o puerpério, há intensa produção de PGF2α pela região intercaruncular da superfície epitelial do endométrio (Asselin et al., 1998; Skarzynski et al., 2000). A PGF2α é um metabólito do ácido aracdônico, que é liberado dos fosfolipídeos pela fosfoslipase A2 (PLA2). O endométrio contém grandes quantidades de ácido aracdônico e tem a habilidade de metabolizá-lo em uma variedade de produtos (Auletta e Flint, 1988). A síntese de prostaglandinas ocorre em etapas pela enzima peroxidase citosólica e por dois tipos de enzimas ligadas à membrana (cicloxigenase-COX e isomerase endoperoxidase; Salamonsen e Findlay, 1990). Em bovinos, a expressão do gene COX nas células do endométrio pode ser influenciada pela presença de esteróides ovarianos. Progesterona e estrógeno podem afetar diretamente a secreção de PGF2α basal pelo endométrio (Xiao et al., 1998). A progesterona atua estimulando a produção basal de PGF2α pelas células e tecidos do endométrio bovino (Skarzynski et al., 1999). Por outro lado, o estradiol diminui a produção basal de PGF2α pela down-regulation da COX-mRNA (Xiao et al., 1998), mas aumenta a produção 59 de PGF2α estimulada pela ocitocina em células endometriais de bovinos cultivadas por longo período (Okuda et al., 2002). Na espécie bubalina, a relação entre a produção de PGF2α após o parto e os hormônios esteróides ainda não foi descrita, assim como se há efeito endócrino deste protocolo hormonal a base de PGF2α sintética. Deste modo, o objetivo deste estudo foi verificar se a aplicação de análogo sintético de prostaglandina (cloprostenol), no puerpério precoce ou intermediário, induz efeitos sobre a involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino e retorno da atividade ovariana cíclica, além de mudanças nas concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol de búfalas pós-parto. 2. Material e Métodos 2.1 Seleção dos animais e grupos experimentais O estudo foi realizado entre Março e Julho de 2012 na Fazenda Experimental Lageado UNESP (Botucatu, SP) e na Fazenda Santa Helena (em Registro, SP). O rebanho experimental foi constituído por 30 búfalas Murrah (entre 1 e 9 partos) gestantes, apresentando escore de condição corporal entre 3,5 e 4,0 (escala de 0 a 5). Para tanto, os animais permaneceram em piquetes separados para o monitoramento do parto. A alimentação foi composta de pastagem Brachiaria decumbens, com fornecimento de água e suplemento mineral ad libitum. Os animais foram submetidos tanto a monta natural como a inseminação artificial em tempo fixo. 60 Somente foram incluídos no estudo aqueles animais que apresentaram parto normal sem retenção de placenta, ou seja, com eliminação dos anexos fetais dentro das primeiras 12 horas pós-parto. Após o parto, as búfalas foram divididas aleatoriamente, de acordo com a ocorrência das parições, em três grupos de tratamento: CONT (controle; N = 10) - aplicação de 2mL de soro fisiológico por via intramuscular (IM) nos dias dois e cinco pós-parto (dia 0 = parto); CLO2 (N = 10) - aplicação de 2mL de cloprostenol sódico (0,530mg, Ciosin, Intervet Schering-Plough) IM nos dias dois e cinco pós-parto; e CLO15 (N = 10) - aplicação de 2mL de cloprostenol sódico IM nos dias 15 e 20 pós-parto. 2.2 Exame ginecológico Exames ginecológicos foram realizados nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós- parto. Inicialmente, foi avaliado o grau de involução uterina, via palpação transretal, conforme uma modificação do escore de Grunert (1980). O grau de involução uterina foi classificado por uma escala de 1 a 3, sendo: Grau 1 - útero pouco involuído com a totalidade da sua massa na cavidade abdominal, apresentando grande assimetria entre os cornos uterinos, não sendo possível examinar toda sua extensão; Grau 2 - útero com parte de sua massa na cavidade abdominal, com razoável assimetria entre os cornos, sendo possível a palpação e o exame de toda a sua extensão e; Grau 3 - útero em quase sua totalidade na cavidade pélvica, apresentando-se simétrico ou com discreta assimetria. 61 Os animais foram submetidos também a exame ultrassonográfico em modo B para avaliação do acúmulo de fluido intrauterino, conforme descrito por Krueger et al. (2009). O acúmulo de fluido foi quantificado pela média de três avaliações do diâmetro do corno uterino e classificado em uma escala de 0 a 3, onde: 0 - sem fluido; 1 - entre 0 e 1,5 cm; 2 - entre 1,5 e 2,5 cm e; 3 - maior que 2,5 cm. Adicionalmente, o exame em modo B também foi utilizado para avaliação da atividade ovariana cíclica pós-parto. Para tanto, foi considerada em atividade ovariana cíclica aquela búfala que apresentava folículo maior que 10 mm e/ou corpo lúteo nos ovários direito e esquerdo. 2.3 Coleta de sangue e dosagens hormonais Após cada exame ginecológico, foram colhidas amostras de sangue da veia jugular em tubos heparinizados para dosagem de PGFM, estrógeno e progesterona, por sistema de coleta a vácuo. As amostras foram mantidas em caixa térmica refrigerada por 10 minutos e centrifugadas (2500 giros) por 15 minutos. O plasma foi acondicionado em microtubos e congelado (-20º C) para análise posterior. As concentrações de estrógeno e progesterona foram mensuradas pelo uso de kits diagnósticos em fase sólida Coat-a-Count (Diagnostics Products Corporation®, Los Angeles, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante, por leitura em sistema de radioimunoensaio (Packard Cobra II Auto Gamma), no Laboratório de Endocrinologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP Campus Botucatu. 62 Já a dosagem de PGFM foi realizada com uso de kit diagnóstico (DetectX 13, 14-dihydro-15-keto-PGF2α ®, Arbor Assays, EUA) por método de enzimaimunoensaio, conforme instruções do fabricante e leitura em espectrofotômetro, no Laboratório de Proteína de Fase Aguda e Monitorização Não Invasiva da Reprodução e do Bem-estar Animal. 2.4 Análise estatística Para a análise estatística, os dados foram submetidos à análise de variância pelo procedimento descrito no GLM do SAS (2012), tendo como causas de variação o efeito do tratamento (CONT, CLO2 e CLO15), dos dias de avaliação (2, 7, 14, 21 e 28), da atividade ovariana (presente ou ausente) e a interação tratamento versus dia. As diferenças entre médias foram submetidas ao teste de Tukey a 5% de probabilidade para todas as causas de variações. 3. Resultados e Discussão 3.1 Involução uterina, acúmulo de fluido e atividade ovariana As mudanças no grau de involução uterina das búfalas pós-parto dos diferentes grupos recebedores ou não de análogo de PGF2α (CONT, CLO2 e CLO15) estão representadas na Fig. 1. Não houve diferença significativa (P > 0,05) entre os grupos apenas no exame ginecológico do dia 2 após o parto. Em 63 todos os animais, foi observado útero com volume ainda muito aumentado e assimétrico, posicionado na cavidade abdominal. A partir do exame ginecológico do dia 2, o grupo CLO2 apresentou um grau médio de involução uterina significativamente maior que os demais grupos do estudo (P < 0,05). O grupo CLO 15 apresentou o menor grau de involução uterina até o exame ginecológico do dia 14, quando apresentou um aumento expressivo do grau de involução. No dia 28 após o parto, já apresentava média maior que do grupo controle. Fig. 1. Grau de involução uterina (média ± desvio padrão) de búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto. Os períodos de maior velocidade de involução uterina detectados pelo exame de palpação transretal foram entre os 7 e os 21 dias pós-parto. A maior velocidade dos grupos tratados com cloprostenol coincidiram com o término Gr au d e in vo lu çã o ut er in a Dias 64 dos protocolos hormonais, correspondendo aos 7 e 14 dias para os grupos CLO2 e CLO15, respectivamente. Na última avaliação, aos 28 dias, nenhum dos grupos acompanhados apresentou uma involução uterina completa. Apesar de os grupos tratados terem obtido médias significativamente mais altas, o grau 3 não foi alcançado. A involução uterina completa-se por volta de 25 a 39 dias na espécie bubalina (Baruselli et al., 1996; Devanathan et al., 1987; Ferraz, 2006; Ferreira et al., 2010), podendo variar de acordo com a raça, número de partos, lactação, separação do bezerro, estacionalidade reprodutiva, precipitação pluviométrica e oferta de pastagem (Hegazy et al., 1994; Ribeiro, 1996; Vale e Ribeiro, 2005). Já foi relatada uma redução média de 4,2 dias no período total de involução uterina, após a aplicação de cloprostenol nos dias 2 e 7 pós-parto (Ferraz, 2006). As médias dos grupos CONT, CLO2 e CLO15 para acúmulo de fluido intrauterino nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós-parto estão ilustrados na Fig. 2. Assim como para a involução uterina, ao exame no dia 2 após o parto, não houve diferença significativa entre os grupos avaliados. Neste dia, foi observado o maior volume de líquido no interior do útero em relação aos outros dias do estudo. Na avaliação