UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO – UNESP INSTITUTO BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Laboratório de Biologia Celular BIOSSENSOR PARA IDENTIFICAÇÃO DA DOENÇA DE ALZHEIMER Doutoranda: Ana Lívia de Carvalho Bovolato Orientadora: Prof.ª. Dra. Elenice Deffune Coorientadora: Marli Leite Moraes Coorientador no exterior: Alexandre Brolo Colaborador: Sidney Ribeiro BOTUCATU 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO – UNESP INSTITUTO BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Laboratório de Biologia Celular BIOSSENSOR PARA IDENTIFICAÇÃO DA DOENÇA DE ALZHEIMER Tese apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia. Doutoranda: Ana Lívia de Carvalho Bovolato Orientadora: Prof.ª. Dra. Elenice Deffune Coorientadora: Prof.a Dra. Marli Leite Moraes Coorientador no exterior: Prof. Dr. Alexandre Brolo Colaborador: Prof. Dr. Sidney Ribeiro BOTUCATU 2021 Ana Livia de Carvalho Bovolato Biossensor Para Identificação Da Doença De Alzheimer Tese apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutorado Orientador: Prof(a). Dr(a) Elenice Deffune Comissão examinadora _______________________ Prof(a). Dr(a) Elenice Deffune Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP ______________________ Prof(a). Dr(a) João Pessoa Araújo Junior Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP ______________________ Prof(a). Dr(a) Glenda Gisela Ibáñez Redín Instituto de Física de São Carlos - USP ______________________ Prof(a). Dr(a) Hernane Barud Universidade de Araraquara ______________________ Prof(a). Dr(a) Arthur Oscar Shelp Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP Botucatu, 07 de Outubro de 2021. Dedicatória Dedico esse trabalho ao meu avô que sempre me pediu para estudar muito e descobrir um remédio para curar as dores dos velhinhos. Não é um remédio, mas espero que esse trabalho ajude de alguma maneira. A minha família por todo apoio, ajuda, confiança e incentivo. Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, meus Orixás e guias espirituais por terem me guiado, dado força, confiança, acalmar meu coração nos tempos difíceis e por ter colocado pessoas maravilhosas no meu caminho durante essa jornada. A todos os vôzinhos e vózinhas que aceitaram participar e tornar possível essa pesquisa. Foi graças a vocês que tive forças para terminar. Aos meus pais, por acreditarem em mim, me incentivarem, darem apoio e pela educação que me deram. Sem essa não estaria aqui e não seria quem eu sou. E toda a minha família que renunciaram a vários momentos importantes para me incentivarem e apoiarem. A Dra. Elenice, Dra. Marli, Dr Shelp, Dr Sidney e suas respectivas equipes que apoiaram e ajudaram na realização desse projeto. Ao Dr Brolo e seu grupo por terem me recebido no Canadá e me ajudado a realizar esse projeto. Ao Dr Matheus e Lenize, que me ajudarem tantas vezes a pensar e reavaliar meu trabalho. E graças aos mesmos e o Dr Shelp o trabalho pode ser iniciado. Ao Prof João Pessoa por todo apoio, orientação e conselhos. Terminei! A Pâmela, Gabi, Georgia, Fer e demais amigos que me ajudaram, deram apoio e não esqueceram de mim mesmo com a distância e em meio a pandemia. Aos meus amigos do Canadá, Christopher, Sapan, MiHai, Alê e Deisy que foram de fundamental importância para mim nesses tempos tão complicados em que vivemos. A Gi e Pedro, amigos inestimáveis e mentores que foram essenciais para a realização desse projeto e me ajudaram muito a manter meu bem-estar psicológico. Ao pessoal do Comitê de Ética e pós-graduação, por toda paciência, colaboração e simpatia. Epígrafe: “Saber Viver Não sei... Se a vida é curta ou longa demais pra nós, Mas sei que nada do que vivemos tem sentido, se não tocamos o coração das pessoas. Muitas vezes basta ser: Colo que acolhe, Braço que envolve, Palavra que conforta, Silêncio que respeita, Alegria que contagia, Lágrima que corre, Olhar que acaricia, Desejo que sacia, Amor que promove. E isso não é coisa de outro mundo, é o que dá sentido à vida. É o que faz com que ela não seja nem curta, nem longa demais, mas que seja intensa, Verdadeira, pura... Enquanto durar” Cora Coralina Bovolato, A. C. Biossensor para identificação rápida da doença de Alzheimer. Botucatu, 2021.87p. Tese (Doutorado) – Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. A doença de Alzheimer (DA) é a uma doença neurodegenerativa complexa, responsável pela maioria dos casos de comprometimento cognitivo progressivo em pacientes idosos. O processo degenerativo pode iniciar 20 anos antes da manifestação clínica da doença. O diagnóstico precoce e preciso da DA continua laborioso e quase sempre interfaceado com o diagnóstico de exclusão. Neste projeto é proposto o desenvolvimento de um biossensor para a detecção da doença de Alzheimer baseado na detecção de autoanticorpos anti-ATP-sintase subunidade Beta e anti- FRMD8 presentes em amostra periféricas, soro, e em LCR (líquido cefalorraquidiano) de pacientes com a doença de Alzheimer. Para tal foi construído dois sistemas baseados em imunoensaios: 1) imobilizou-se ATP-Sintase subunidade Beta em lâmina de ouro modificadas com 11-MUA e Quitosana e 2) imobilizou-se o peptídeo FRMD8 associado ao lipossomo de DPPG em superfície de ouro modificada com 11-MUA e PEI. Em ambos os casos se quantificou os respectivos anticorpos comerciais diluídos nas proporções não diluído, 0,01mg/mL (puro), 1:10 (0,001mg/mL), 1:100 (0,0001mg/mL), 1:1000 (10ng/mL) e 1:10000 (1ng/mL), com o intuito de gerar uma curva de calibração. Para realizar as medidas foi feita a técnica de SERS (Espectroscopia Raman Aprimorada por Superfície) usando sondas SERS de nanopartículas de ouro modificadas com Anti-IgG porção Fc. Como análise comparativa, ambos os resultados foram comparados com amostras de indivíduos não portadores de DA (como controle Alzheimer, CA) e com anti-HIV p17 como controle experimental (CE). Os sensores foram hábeis de gerar curvas de calibração na qual o biossensor baseado em FRMD8 foi capaz de detectar até 1ng/mL e o biossensor baseado em ATP-Sintase foi capaz de detectar até 10ng/mL. Na validação, apenas o biossensor baseado em ATP Sintase se demostrou eficaz na semi-quatificação e diferenciação entre controles e amostras e através de análise de PCA foi estabelecer e criar um Score SERS e correlacionar com o Score MEEM. Um ponto extremamente importante a se destacar nesse trabalho é que não há biomarcador “perfeito” para a DA devido ao seu múltiplo interfaceamento, sendo, a melhor alternativa, uma análise de múltiplos marcadores. Palavras-chave: doença de Alzheimer, biossensores, biomarcadores, SERS. Bovolato, A. C. Biosensor for rapid identification of Alzheimer's disease. Botucatu, 2021. 87p. Thesis (Doctorate) - Botucatu Biosciences Institute, UNESP Paulista State University “Julio de Mesquita Filho”. Alzheimer's disease (AD) is a complex neurodegenerative disease, responsible for most cases of progressive cognitive impairment in elderly patients. The degenerative process can start 20 years before the clinical manifestation of the disease. The early and accurate diagnosis of AD remains laborious and is almost always intertwined with diagnoses of exclusion. This project proposes the development of a biosensor for the detection of Alzheimer's disease based on the detection of anti- ATP-synthase Beta and anti-FRMD8 autoantibodies present in peripheral samples, serum, and in CSF (cerebrospinal fluid) from patients with Alzheimer's disease. For this purpose, two systems based on immunoassays were constructed: 1) ATP-Synthase Beta subunit was immobilized on gold plate modified with 11-MUA and Chitosan and 2) FRMD8 peptide associated with DPPG liposome was immobilized on a modified gold surface with 11-MUA and PEI. In both cases, the respective commercial antibodies were quantified in the proportions undiluted, 0.01mg/mL (pure), 1:10 (0.001mg/mL), 1:100 (0.0001mg/mL), 1:1000 (1ng/mL) and 1:10000 (1ng/mL), to generate a calibration curve. The SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) technique was performed using SERS probes of gold nanoparticles modified with Anti-IgG Fc portion. As a comparative analysis, both results were compared with samples from individuals without AD (as control Alzheimer, CA) and with anti-HIV p17 as experimental control (EC). The sensors were able to generate calibration curves in which the FRMD8-based biosensor was able to detect up to 1ng/mL and the ATP-Synthase-based biosensor was able to detect up to 10ng/mL. In the validation test, only the ATP Synthase-based biosensor proved to be effective in semi-qualification and differentiation between controls and samples, and, through PCA analysis, it was established and created SERS Score and correlated with the MEEM Score. An extremely important point to be highlighted in this work is that there is no “perfect” biomarker for AD due to its multiple interfacing, the best alternative being an analysis of multiple markers. Keywords: Alzheimer's disease, biosensors, biomarkers, SERS. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estimativa de custos de tratamento em relação à evolução da demência. Legenda: Desenvolvimento de custo total em milhões de Euros por ano. Fonte: Adaptado de “Cost of care for persons with dementia”; Health Econ Rev, 2020. ---------------------------------------------------------------------------20 Figura 2. Comparação entre o crescimento da mortalidade de diversas doenças nos EUA. Fonte: Adaptado de “2021 Alzheimer's disease facts and figures.”; Alzheimer's Association (2021). -------------------------22 Figura 3. Número de casos estimados em 2021 e projeção para 2060. Legenda: A: o número de casos estimados em 2021 nos EUA; B: projeção do número de casos de DA nos EUA. Fonte: Adaptado de “2021 Alzheimer's disease facts and figures.”; Alzheimer's Association (2021). -------------------------------------23 Figura 4. Estimativa da incidência anual de demência específica para a idade. Legenda: Análise derivada da meta-rregressão de Poisson de efeitos mistos, para regiões do mundo para as quais a síntese meta- analítica era viável. Fonte: World Health Organization and Alzheimer’s Disease International (WHO). Dementia: a public health priority (2012). -------------------------------------------------------------------------24 Figura 5. Prevalência da doença de Alzheimer, 2005-2050: projeções baseadas em três modelos dos efeitos dos avanços significativos do tratamento introduzidos em 2010. Legenda: Gráfico de barras comparando a prevalência de casos leves, moderados / graves e totais de doença de Alzheimer nos Estados Unidos, 2000-2050, com base em quatro projeções: nenhum avanço terapêutico (A), início tardio da doença (B), doença retardada progressão (C), e início tardio da doença e progressão tardia da doença (D). Fonte: Adaptado: “The Public Health Impact of Alzheimer’s Disease, 2000–2050: Potential Implication of Treatment Advances.” Annu. Rev. Public Health 2002. ----------------------------------------------------------25 Figura 6. Esquema e histologia da fisiopatologia da DA. Legenda: A) esquema demonstrando a formação da Placas Amiloides e Emaranhados Neurofibrilares (38). B) corte histologico de cerebro humano por coloração HE, a seta evidencia um neuronio com emaranhados neurofibrilares oriuntos de agregação da proteina Tau (37). C) corte histologico de cerebro humano por coloração de prata, evidenciando a formação de placas amilóides (36). Fonte: Figura A adaptada de: “Tau protein aggregation in Alzheimer's disease: An attractive target for the development of novel therapeutic agents.” Eur J Med Chem. 2017. Figura B extraída de: Neurofibrillary tangles. [acesso em 09 de maio de 2021]. Disponivel em: https://www.chegg.com/flashcards/nmsk-b-path-069f0110-e3bb-40e7-9521-0c1743eb9a53/deck. Figura C extraida de: “Cases of dementia in the UK and a toxic chemical may be linked.” Utah People`s Post [periodico na internet]. May 2021. [acesso em 09 maio 2021]. Disponivel em: https://www.utahpeoplespost.com/2016/01/dementia-uk-toxic-chemical-linked/.----------------------------27 Figura 7: Modelo hipotético da trajetória clínica da doença de Alzheimer (AD). Fonte: Extraído e adaptado: “Toward defining the preclinical stages of Alzheimer's disease: Recommendations from the National Institute on Aging. Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease” (2011)31. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------28 Figura 8. Sequência de eventos na fisiopatologia da doença de Alzheimer. Fonte: Adaptado de: “Aspectos da fisiopatologia da doença de Alzheimer esporádica.”, Revista Brasileira Neurologia (2012). ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------29 Figura 9: Representação esquemática da circulação de autoanticorpos proveniente da doença de Alzheimer. Legenda: A morte celular em regiões de patologia leva à liberação de proteínas e seus fragmentos como detritos associados à doença. Essas moléculas se espalham para a circulação, e o sistema imunológico https://www.chegg.com/flashcards/nmsk-b-path-069f0110-e3bb-40e7-9521-0c1743eb9a53/deck https://www.utahpeoplespost.com/2016/01/dementia-uk-toxic-chemical-linked/ responde provocando a produção de autoanticorpos. Fonte: Adaptado de “Utility of Autoantibodies as Biomarkers for Diagnosis and Staging of Neurodegenerative Diseases “, Int Rev Neurobiol (2015). -----34 Figura 10: Esquema de ATP sintase de mitocôndria de mamíferos. Legenda: Desenho da ATP sintase mitocondrial que é estruturada e funcionalmente organizada em dois setores principais: uma porção Fo embutida na membrana e um F1 catalítico solúvel voltado para a matriz. Fo funciona como um canal de prótons com um movimento rotativo que aciona o F1 acoplado para sintetizar ou hidrolisar ATP, dependendo da direção de rotação. F1 compreende três heterodímeros αβ, enquanto o setor Fo contém um anel C de subunidades transmembrana e uma cópia da subunidade A. Os dois setores são conectados por meio de um eixo de rotor central composto pelas subunidades γ, δ e ε e um estator periférico que compreende vários peptídeos. Fonte: Adaptado de “Systematic review of plasma-membrane ecto-ATP synthase: A new player in health and disease”, Exp Mol Pathol (2018). ---------------------------------------35 Figura 11: Modelos comparativos esquemáticos e atômicos de ATP Sintase F1Fo de bactérias, cloroplastos e mitocôndrias. Legenda: As subunidades são codificadas por cores para mostrar domínios homólogos entre as espécies: α (vermelho); β (amarelo), δ (cinza nas bactérias e cloroplastos, marrom nas mitocôndrias); OSCP (cinza nas mitocôndrias); b / b ′ (roxo escuro); anel c (roxo claro); F6 (rosa); γ (azul); ε (verde); e d (azul claro). Fonte: Adaptado de “ATP synthase: Evolution, energetics, and membrane interactions”, J Gen Physiol (2020). ---------------------------------------------------------------------------------36 Figura 12: FRMD8 estabiliza o complexo sheddase iRhom2 / ADAM17 na superfície da célula. Legenda: Representação esquemática do papel de FRMD8 na via iRhom2 / ADAM17: em condições de tipo selvagem, ADAM17 e iRhom2 são estabilizados por FRMD8 e, portanto, protegidos da degradação através da via endolisósmica. Fonte: Adaptado de “FRMD8 promotes inflammatory and growth factor signalling by stabilising the iRhom/ADAM17 sheddase complex”, Elife (2018). -----------------------------------------39 Figura 13: Esquema de um biossensor. Legenda: Os biossensores são constituídos por um elemento de reconhecimento biológico e um método de transdução de sinal, e têm permitido a quantificação de vários analitos. Fonte: Adaptado de “Optical Biosensors for Therapeutic Drug Monitoring”, Biosensors (2019).40 Figura 14: Esquema correlacionando ligações elásticas e níveis de energia vibracional. Legenda: A) Oscilador harmónico, constituído por duas esferas de massa m1 e m2 ligadas por uma mola sem limite de elasticidade (obedece à lei de Hooke para qualquer deformação). B) Esquema da distribuição dos níveis de energia vibracionais em função do número quântico v e valor da separação energética entre níveis consecutivos. Fonte: Extraído de “Espectroscopia Vibracional”, Revista Ciência Elementar (2018). ----43 Figura 15: Esquema demonstrando os movimentos que as moléculas podem fazem ao serem excitadas. Legenda: Graus de liberdade de uma molécula triatómica. O movimento vibracional conjectura que a ligação entre os átomos funciona como uma mola. ----------------------------------------------------------------43 Figura 16: Diagrama comparativo de espectroscopia de IR e Raman. Legenda: A) Diagrama de nível de energia mostrando os estados envolvidos nos espectros Raman em relação a IR 121. B) Três tipos de processos de espalhamento que podem ocorrer quando a luz interage com uma molécula 122. --------------45 Figura 17: Diagrama de nível de energia mostrando os estados envolvidos nos espectros Raman, Rayleigh e Fluorescência. Fonte: Applications of Raman spectroscopy in cancer diagnosis. Cancer Metastasis Rev (2018). -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------46 Figura 18: Esquema de processamento das amostras de sangue. Fonte: Arquivo pessoal. -----------------55 Figura 19: Ilustração de como ocorre a coleta de LCR. Fonte: Adaptado do site: http://crmliquor.com/exame-de-liquor/ 148. -------------------------------------------------------------------------56 Figura 20: Teste de MEEM. Fonte: Extraído do site da Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo, https://www.saude.sc.gov.br. -----------------------------------------------------------------------------------------57 Figura 21: Esquema demonstrando as etapas de modificação da superfície da lâmina de ouro. Fonte: Arquivo pessoal. --------------------------------------------------------------------------------------------------------62 Figura 22: Esquema demonstrando a síntese da nanopartícula de ouro (AuNP). Fonte: Arquivo pessoal.64 Figura 23: Esquema demonstrando a modificação das nanopartículas. Fonte: Arquivo pessoal. ----------65 Figura 24: Esquema demonstrando o ensaio sanduiche. Fonte: Arquivo pessoal. ---------------------------67 Figura 25: Esquema demonstrando o ensaio com as amostras reais. Fonte: Arquivo pessoal. -------------68 Figura 26: Esquema demonstrando a medida do imunoensaio. Fonte: Arquivo pessoal. -------------------69 Figura 27: Fluxograma do tratamento dos dados. Fonte: Arquivo pessoal. ----------------------------------71 Figura 28: Em A pode-se ver a lâmina de ouro não modificada com um risco em evidência para demonstrar que o microscópio estava em foco. Em B pode-se observar a deposição de matéria no sistema 11- MUA/Quitosana/ATP Sintase subunidade beta. Em C observa-se a deposição de matéria no sistema 11- MUA/PEI/FRMD8. Fonte: Arquivo pessoal. ----------------------------------------------------------------------72 Figura 29: Espectros de PM-IRRAS para o sistema 11-MUA/Quitosana/ATP. Legenda: A) Espectro para a camada de 11-MUA; B) Espectro para a camada Quitosana e C) Espectro para a camada ATP Subunidade beta. Fonte: Arquivo pessoal. ----------------------------------------------------------------------------------------74 Figura 30: Espectros de PM-IRRAS para o sistema 11-MUA/PEI/DPPG+FRMD8. Legenda: A) Espectro para a camada de 11-MUA; B) Espectro para a camada PEI e C) Espectro para a camada DPPG+FRMD8. Fonte: Arquivo pessoal. -----------------------------------------------------------------------------------------------75 Figura 31: Imagens de TEM das nanopartículas. Legenda: A e B) Apresentam imagens das AuNP não modificadas. C e D) apresentam imagens das AuNP modificadas. Fonte: Arquivo Pessoal. ----------------76 Figura 32: Medidas de DLS para a AuNP e sua funcionalização com NBA/PEG e NBA/PEG/EDC+NHS/Anticorpo. Fonte: Arquivo Pessoal. -----------------------------------------------------77 Figura 33: Espectros das etapas de modificação das NP por UV-Vis. Fonte: Arquivo pessoal. ------------78 Figura 34: Possíveis espectros obtidos. Legenda: A) Espectro de regiões da lâmina nos quais não houve deposição de matéria; B) Espectro com pico na região do NBA de baixa intensidade; C) Espectro característico de NBA; D) Espectro com alto grau de autofluorescência, típico de região modificada porem, na qual, não houve interação da nanopartícula ou houve porem com baixo grau de intensidade, nesse caso a intensidade da autofluorescência “oculta” o pico de interesse. Fonte: Arquivo pessoal. -------------------79 Figura 35: Isolamento do pico de interesse, NBA (592nm). Legenda: A) Espectro sem sofre tratamento de dados; B) Espectro com a região de interesse isolada e apresentando o desvio padrão (sombra). Fonte: Arquivo pessoal. --------------------------------------------------------------------------------------------------------80 http://crmliquor.com/exame-de-liquor/ https://www.saude.sc.gov.br/ Figura 36:Mapas representativos da técnica de PCA, proteína FRMD8. Legenda: A) Mapa antes do PCA, anticorpo com concentração de 1/10 (0,01mg/mL); B) Mapa antes do PCA, anticorpo com concentração de 1/1000 (0,0001mg/mL); C) Mapa A depois do PCA, anticorpo com concentração de 1/10 (0,01mg/mL); D) Mapa B depois do PCA, anticorpo com concentração de 1/1000 (0,0001mg/mL). Fonte: Arquivo pessoal.80 Figura 37: Curva de Calibração para a proteína FRMD8. Legenda: A esquerda a curva de calibração baseada na intensidade dos picos e a direita a curva de calibração baseada nas áreas sob os picos. Fonte: Arquivo pessoal. -------------------------------------------------------------------------------------------------------81 Figura 38: Curva de Calibração para a proteína ATP Sintase. Legenda: A esquerda a curva de calibração baseada na intensidade dos picos e a direita a curva de calibração baseada nas áreas sob os picos. Fonte: Arquivo pessoal. -------------------------------------------------------------------------------------------------------81 Figura 39: Validação do biossensor para o autoanticorpo Anti-FRMD8. Legenda: Gráfico da Positividade das amostras de LCR baseado na intensidade dos picos. Fonte: Arquivo pessoal.---------------------------82 Figura 40: Validação do biossensor para o autoanticorpo Anti-FRMD8. Legenda: Gráfico da Positividade das amostras de Soro baseado na intensidade dos picos. Fonte: Arquivo pessoal.---------------------------82 Figura 41: Validação do biossensor para o autoanticorpo Anti-ATP Sintase subunidade Beta. Legenda: Gráfico da Positividade das amostras de Soro baseado na intensidade dos picos. Fonte: Arquivo pessoal.-- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83 Figura 42: Validação do biossensor para o autoanticorpo Anti-ATP Sintase subunidade Beta. Legenda: Gráfico da Positividade das amostras de Soro baseado na intensidade dos picos. Fonte: Arquivo pessoal. - ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------84 Figura 43: Análise de PCA para o biossensor Anti-ATP Sintase subunidade Beta. Legenda: Através da técnica de PCA foi possível estabelecer dois grupos de DA. Fonte: Arquivo pessoal.-----------------------85 LISTA DE TABELA Tabela 1: Autoanticorpos associados a DA e seus potenciais papéis. Fonte: Adaptado “Biomarkers for the Early Detection and Progression of Alzheimer's Disease. Neurotherapeutics”, Neurotherapeutics (2017).30 Tabela 2 : Autoanticorpos encontrados associados à DA. Fonte: Adaptado “Autoantibodies in Alzheimer's disease potential biomarkers, pathogenic roles, and therapeutic implications.” J Biomed Res (2016). ----33 Tabela 3: Critérios de inclusão para os grupos de estudo. Fonte: Arquivo pessoal. -------------------------54 . Tabela 4: de PM-IRRAS para o sistema 11-MUA/Quitosana/ATP. Fonte: Arquivo pessoal. -------------74 Tabela 5: Espectros de PM-IRRAS para o sistema 11-MUA/PEI/FRMD8. Fonte: Arquivo pessoal. -----75 Tabela 6: Resultados obtidos das medidas de DLS e Potencial Zeta para a AuNP e AuNP funcionalizada com NBA/PEG e NBA/PEG/EDC+NHS/Anticorpo. Fonte: Arquivo pessoal. -------------------------------77 Tabela 7: Correlação entre os Scores do MEEM e os Scores de SERS. (Saudável:25-30, Leve: 24-20, Moderado: 10-20, Grave:<9) Fonte: Arquivo Pessoal. -----------------------------------------------------------85 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 11-MUA: Ácido 11-mercaptoundecanóico ADP: Adenosina Difosfato AgNPs: Nanopartícula de Prata AREG: Anfiregulina ATP: Adenosina Trifosfato ATP-Sintase: Adenosina Trifosfato Sintase/ Adenosina Trifosfato Sintase Subunidade Beta AuNP: Nanopartícula de Ouro βA: Beta Amiloide BACE: Gene da Beta-secretase BSA: Albumina de Soro Bovino CA: pacientes sem diagnóstico de Alzheimer, grupo controle CCL ou MCI: Comprometimento Cognitivo Leve CEP: Comitê de Ética em Pesquisa DA: pacientes portadores da doença de Alzheimer DLS: Dynamic Light Scattering, Espalhamento Dinâmico de Luz DNA: Ácido desoxirribonucleico DPPG: 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosforilglicerol EDC: Etil dimetilaminopropilcarbodiimida EDTA: Acido etilenodiaminotetracético EGF: Fator de Crescimento Epidérmico EUA ou US: Estados Unidos da América Fc: região do fragmento cristalizável ou região Fc de um anticorpo FMB: Faculdade de Medicina de Botucatu HC: Hospital das Clínicas HE: Hemocentro HIV-p17: Vírus da Imunodeficiência Humana – proteína p17 IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IgG: Imunoglobulina da classe G IgM: Imunoglobulina da classe M IR: Infravermelho ISO: International Organization for Standardization LCR: Líquido Cefalorraquidiano LEC: Laboratório de Engenharia Celular MEEM: Exame do Estado Mental NP: nanopartícula OMS: Organização Mundial da Saúde PBS: solução salina tamponada com fosfato PBST: solução salina tamponada com fosfato e Tween PCA: Análise do Componente Principal PDI: Índice De Polidispersão PEG: Polietileno Glicol PEI: Polietilenimina Pm-Irras: Espectroscopia De Absorção De Reflexão De Infravermelho Modulado Polarizado PPA: Proteína Precursora Amilóide PVPI: Iodopovidona "proteólise intramembrana regulada" (RIP RM: Ressonância Magnética RNV: Variável Normal Robusta SERS: Espectroscopia Raman Aprimorada por Superfície SERRS: Espectroscopia Raman Ressonante Aprimorada por Superfície SNC: Sistema Nervoso Central Sulfo-NHS ou NHS: Sulfo-N-hidroxisuccinimida TACE: ADAM 17 ou Enzima Conversora Do Fator De Necrose Tumoral-Alfa TCLE: Termo De Consentimento Livre E Esclarecido TEM: Microscopia Eletrônica de Transmissão TGF-α: Fator De Crescimento Transformador Alfa TNF-α: Fator De Necrose Tumoral Alfa UV-Vis: Espectroscopia de Ultravioleta-Visível SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO -----------------------------------------------------------------------------------------------------19 1.1 Adversidade Econômica e Social --------------------------------------------------------------------------------19 1.2 Epidemiologia ------------------------------------------------------------------------------------------------------21 1.3 Etiologia-------------------------------------------------------------------------------------------------------------25 1.4 Biomarcadores Da Doença De Alzheimer----------------------------------------------------------------------28 1.4.1 Autoanticorpos---------------------------------------------------------------------------------------------------32 1.4.2 ATP-sintase------------------------------------------------------------------------------------------------------35 1.4.3 FRMD-8----------------------------------------------------------------------------------------------------------37 1.5 Ferramenta proposta para diagnóstico: Biossensores---------------------------------------------------------40 1.5.1 Biossensores ópticos--------------------------------------------------------------------------------------------41 1.5.2 Espectroscopia Vibracional e Efeito Raman-----------------------------------------------------------------42 1.5.2.1 Espectroscopia Raman de Superfície Melhorada (SERS)-----------------------------------------------45 1.5.3 Biossensores usando ensaios sanduíche SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) ------------47 2 JUSTIFICATIVA----------------------------------------------------------------------------------------------------50 3 OBJETIVO------------------------------------------------------------------------------------------------------------50 3.1. Objetivo Geral-----------------------------------------------------------------------------------------------------50 3.2. Objetivos Específicos---------------------------------------------------------------------------------------------50 4 CASUÍSTICA E MÉTODOS---------------------------------------------------------------------------------------52 4.1 Comitê de Ética-----------------------------------------------------------------------------------------------------52 4.2 Cálculo da amostra-------------------------------------------------------------------------------------------------52 4.3 Grupos de estudo ---------------------------------------------------------------------------------------------------53 4.3.1 Critérios de inclusão e exclusão dos participantes-----------------------------------------------------------53 4.4 Obtenção das amostras---------------------------------------------------------------------------------------------54 4.4.1 Amostras de Sangue---------------------------------------------------------------------------------------------54 4.4.2 Amostras de Líquido cefalorraquidiano ou Líquor (LCR)--------------------------------------------------55 4.5 Prova Conceito -----------------------------------------------------------------------------------------------------56 4.5.1 MEEM-------------------------------------------------------------------------------------------------------------56 4.5.2 Realização da Ressonância Magnética------------------------------------------------------------------------58 4.6 Reagentes------------------------------------------------------------------------------------------------------------59 4.7 Biomarcadores------------------------------------------------------------------------------------------------------59 4.7.1 ATP Sintase subunidade Beta e Anticorpo Anti-ATP Sintase Subunidade Beta------------------------59 4.7.2 FRMD8 e Anticorpo Anti-FRMD8----------------------------------------------------------------------------60 4.8 Produção dos Sensores---------------------------------------------------------------------------------------------61 4.8.1 Lâmina de Ouro com Superfície Modificada-----------------------------------------------------------------61 4.8.1.1 Modificação----------------------------------------------------------------------------------------------------61 4.8.1.2 Caracterização--------------------------------------------------------------------------------------------------62 4.8.2 Nanopartículas de Ouro com Superfície Modificada--------------------------------------------------------63 4.8.2.1 Síntese-----------------------------------------------------------------------------------------------------------63 4.8.2.2 Modificação----------------------------------------------------------------------------------------------------64 4.8.2.3 Caracterização--------------------------------------------------------------------------------------------------65 4.8.3 Imunoensaio ------------------------------------------------------------------------------------------------------67 4.8.4 Imunoensaio com amostras reais – Biossensor--------------------------------------------------------------67 4.9 Medidas SERS------------------------------------------------------------------------------------------------------68 4.10 Análise de Dados--------------------------------------------------------------------------------------------------69 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO-----------------------------------------------------------------------------------72 5.1 Lâmina de Ouro com Superfície Modificada-------------------------------------------------------------------72 5.2 Nanopartículas de Ouro com Superfície Modificada----------------------------------------------------------75 5.3 Imunoensaio – medidas SERS------------------------------------------------------------------------------------78 5.4 Imunoensaio com amostras reais – Biossensor-----------------------------------------------------------------81 6 CONCLUSÃO -------------------------------------------------------------------------------------------------------87 7 REFERÊNCIAS------------------------------------------------------------------------------------------------------89 1. INTRODUÇÃO A demência é um termo genérico usado para descrever um nível de deficiência neurocognitiva que pode afetar as atividades da vida diária de uma pessoa (1–5). Múltiplas etiologias -podem levar à demência, incluindo a doença de Alzheimer (DA), doença vascular, presença de corpos de Lewy, doença Fronto temporal e lesão cerebral (1). A DA é a mais importante entre as doenças neurodegenerativas crônicas da atualidade, tendo em vista a incapacitação neurológica que ela provoca e a estimativa de aumento de incidência para as próximas décadas, justificado principalmente pelo aumento da longevidade no mundo todo, o que torna a DA um grande desafio para a saúde pública (1–3). Geralmente é caracterizada por perda progressiva de memória e funcionamento cognitivo; comprometimento funcional no desempenho das atividades diárias como comer, cozinhar, tomar banho e pagar contas; e manifestação de sintomas neuropsicológicos, como depressão, ansiedade, agitação, apatia, delírio e psicose (2). 1.1 Adversidade Econômica e Social O cuidado de pessoas com DA apresenta desafios especiais, conforme a progressão da doença. Os indivíduos requerem níveis crescentes de cuidados e apoio, incluindo tratamento médico, medicamentos específicos, equipamento médico, modificações de segurança doméstica, serviços de segurança, cuidados pessoais, creches para adultos e, por fim, serviços residenciais em tempo integral (2,3). Atualmente, não há uma cura e tratamentos eficazes para controlar a progressão da doença, portanto, impondo uma carga financeira elevada aos pacientes e suas famílias, ao sistema de prestação de cuidados de saúde e sociedade como um todo (3). Na literatura, observamos evidências crescentes de que o custo do tratamento da demência aumentará rapidamente nos próximos anos. De acordo com estimativas recentes da Associação Norte Americana de Alzheimer, o total de gastos médicos diretos associados com demências nos Estados Unidos aumentará de $ 355 bilhões (2021) para mais de $ 1 trilhão (2050), devido a aumentos projetados na população idosa (3). Estudos Europeus, baseados em dados clínicos dos centros de serviço de demência mostram, segundo a figura 1 (4), os custos estimados do tratamento, levando em consideração o desenvolvimento de limitações funcionais devido à demência, resultando no aumento do custo social por paciente, sendo mais de 800 Euros por mês, destes custos, 74% ocorreram por custos indiretos (3–7). Em um período de cinco anos, esses custos aumentarão 7,1 vezes e em 10 anos aumetarão16,2 vezes (4). Figura 1. Estimativa de custos de tratamento em relação à evolução da demência. Legenda: Desenvolvimento de custo total em milhões de Euros por ano. Fonte: Adaptado de “Cost of care for persons with dementia”; Health Econ Rev, 2020 (4). Além disso, o estudo demonstra que a maior parte do aumento de custo procede do aumento acentuado de pessoas com demência severa e que o custo da mesma prevalece sobre o custo nos períodos posteriores (4). Vários estudos econômicos relacionados ao Alzheimer argumentam que o custo do tratamento da demência não aumenta de maneira linear de acordo com os estágios de demência leve a grave, mas descrevem uma relação parabólica, ou seja, o custo do tratamento de pessoas com demência leve e grave é mais alto do que para pessoas no estágio moderado (4–13). Esses achados destacam que o estágio da demência é um dos principais direcionadores de custos (5–7). De modo geral, estudos correlacionam o aumento dos serviços de assistência à gravidade da demência como sendo uma das principais causas do aumento dos custos (6–11), e que o ambiente de cuidado e a perspectiva de custo combinados com a natureza progressiva da demência são direcionadores relevantes para o custo do cuidado (4,6,10,12). Diante dos estudos encontrados na literatura, podemos prever que o custo do sistema de saúde aumentará enormemente nas próximas décadas, especialmente porque nenhuma cura para a demência é esperada no futuro próximo (3-14). Enfatizando os três fatores de custo: nível de gravidade, custo de cuidados informais e progressão da demência - o custo do atendimento ambulatorial da demência poderia ser estimado a fim de fornecer uma boa base para o planejamento da prestação de cuidados (13). A importância da doença neurodegenerativa vai, portanto, além da sua elevada prevalência. Um a cada 3 indivíduos norte-americanos com mais de 65 anos é acometido morrem de DA ou algum tipo de demência. Estima-se que a cada minuto uma suspeita de DA seja feita nos Estados Unidos (14). 1.2 Epidemiologia A base de evidências sobre a prevalência da demência está se expandindo rapidamente. É necessária uma reavaliação da prevalência, da mortalidade (figura2) (14) e dos números globais, dadas as implicações significativas para políticas e planejamentos sociais e públicos (3). Em países de alta renda é uma prioridade de saúde e assistência social. Os governos do Reino Unido, França, Noruega, EUA e Coréia do Sul desenvolveram recentemente planos ou estratégias específicas (15). Dados estimados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram uma projeção alarmante de um número extraordinário de 100 milhões de portadores de DA no planeta, em 2050 (14). Segundo o relatório da Sociedade Internacional de Alzheimer o número de casos estimados em 2021 e de 6,2 milhões (figura 3 A) e a previsão para 2060 e de 13,8 milhões apenas nos EUA (figura 3 B) (14). Figura 2. Comparação entre o crescimento da mortalidade de diversas doenças nos EUA. Fonte: Adaptado de “2021 Alzheimer's disease facts and figures.”; Alzheimer's Association (2021) (14). O envelhecimento da população está tendo um impacto profundo no surgimento da epidemia de demência e está impulsionando as respostas do governo (14). Embora os casos com o início de sintomas em jovem, seja cada vez mais reconhecidos, a demência é tipicamente uma condição que afeta mais pessoas de idade avançada. A prevalência de demência específica para a idade varia entre as regiões do mundo, porém, pode convergir, uma vez que apresentam a mesma tendência, figura 4 (14). Como pode observar-se existe um elevado grau de diferença entre o número de casos em países de baixa e média renda para países com alta renda. Esse fenômeno pode ser explicado por dois fatores principais: 1) a diferença na expectativa de vida; 2) na falta de notificação dos casos (16–19). Figura 3. Número de casos estimados em 2021 e projeção para 2060. Legenda: A: o número de casos estimados em 2021 nos EUA; B: projeção do número de casos de DA nos EUA. Fonte: Adaptado de “2021 Alzheimer's disease facts and figures.”; Alzheimer's Association (2021) (14) Esse segundo fator foi atestado através do Relatório Mundial de Alzheimer, elaborado pela Universidade McGill em Montreal, Canadá; 75% dos casos estimados de pessoas com demência não são diagnosticadas em todo o mundo. E esse índice chega a 90% nos países de renda média e baixa (16). Já no Brasil, segundo o censo do IBGE de 2021, hoje há aproximadamente 29 milhões de pessoas acima dos 60 anos (20), e estima-se que quase 2 milhões desses idosos têm demências, sendo que de 40 a 60% são do tipo Alzheimer(21). No entanto, os dados são subestimados, devido erro no diagnostico ou falto de recurso médico para realizar o diagnóstico (21). Figura 4. Estimativa da incidência anual de demência específica para a idade. Legenda: Análise derivada da meta-rregressão de Poisson de efeitos mistos, para regiões do mundo para as quais a síntese meta-analítica era viável. Fonte: World Health Organization and Alzheimer’s Disease International (WHO). Dementia: a public health priority. (2012) (14) Segundo o estudo de Sloane PD, Zimmerman S, et al;(15) apresentado pela figura 5 (15), número de pessoas com demência pode ser modificado substancialmente por intervenções preventivas (redução da incidência), melhorias no tratamento e cuidados (prolongando a sobrevida) e intervenções modificadoras da doença (prevenção ou desaceleração da progressão). As projeções indicam que as terapias que retardam o início da doença reduzirão acentuadamente a prevalência geral da doença, enquanto as terapias para tratar a doença existentes irão alterar a proporção de casos que são leves em oposição a moderados / graves. O impacto de tais mudanças na saúde pública provavelmente envolveria a quantidade e o tipo de serviços de saúde necessários. Todos os países precisam encomendar pesquisas nacionalmente representativas que são repetidas regularmente para monitorar tendências. Figura 5. Prevalência da doença de Alzheimer, 2005-2050: projeções baseadas em três modelos dos efeitos dos avanços significativos do tratamento introduzidos em 2010. Legenda: Gráfico de barras comparando a prevalência de casos leves, moderados / graves e totais de doença de Alzheimer nos Estados Unidos, 2000-2050, com base em quatro projeções: nenhum avanço terapêutico (A), início tardio da doença (B), doença retardada progressão (C), e início tardio da doença e progressão tardia da doença (D). Fonte: Adaptado: “The Public Health Impact of Alzheimer’s Disease, 2000–2050: Potential Implication of Treatment Advances.” Annu. Rev. Public Health 2002 (15). O envelhecimento da população parece destinado a desempenhar o maior papel, e os formuladores de políticas prudentes devem planejar a futura prestação de serviços com base nas atuais projeções de prevalência. As prioridades adicionais devem incluir o investimento em programas de promoção da saúde cerebral e prevenção da demência, e o monitoramento do curso futuro da epidemia para mapear a eficácia dessas medidas. 1.3 Etiologia A etiologia da DA é complexa e está vinculada a múltiplos fatores sendo estes tanto genéticos como ambientais (22-37). Dentre esses fatores determinantes e potencializadores pode ser citado: o estilo de vida (25,27,28,31), nível educacional (25,27,31), gênero (24,25,37), distúrbios psicológicos (25,28,29), complicações vasculares (25,28,31,36), erros metabólicos (25,29,31), alteração dos níveis de colesterol (38), desbalanço no sistema imune (25,32,33), com crescente caráter autoimune (33–36) e erros no metabolismo de mitocôndrias (26). A interação desses elementos e o pouco conhecimento da intrínseca rede de relações existentes entre eles, além de tornar o diagnóstico mais complexo e demorado, também interfere na efetividade e especificidade da abordagem terapêutica (24,25,27,29,31,36). Com isso, o comprometimento da capacidade cognitiva dos portadores de DA progride de forma inexorável. O desenvolvimento contínuo de novas tecnologias para o diagnóstico mais rápido e preciso se faz necessário para colaborar com a atenção comportamental e terapêutica precoce, de maneira a proporcionar maior probabilidade de controle da doença. Embora tenha sido estudada por mais de um século, as bases moleculares para a sua patogênese ainda estão longe de ser claramente compreendida. Consequentemente, apesar de várias pesquisas, ainda não está disponível nenhuma cura ou prevenção que seja realmente efetiva. O processo degenerativo pode iniciar de 20 a 30 anos antes do início clínico da DA (12) e é a doença neurodegenerativa mais comum, sendo responsável por 60% a 70% de todos os casos de comprometimento cognitivo progressivo em pacientes idosos (39,40). Esta doença cerebral deletéria é caracterizada por duas notáveis patologias conhecidas como placas senis e emaranhados neurofibrilares, que correspondem a agregados extracelulares de peptídeo β amilóides (Aβ) (41,42) e inclusões intracelulares da proteína tau hiperfosforilada, figura 6 (42–45). Figura 6. Esquema e histologia da fisiopatologia da DA. Legenda: A) esquema demonstrando a formação da Placas Amiloides e Emaranhados Neurofibrilares (45). B) corte histologico de cerebro humano por coloração HE, a seta evidencia um neuronio com emaranhados neurofibrilares oriuntos de agregação da proteina Tau (44). C) corte histologico de cerebro humano por coloração de prata, evidenciando a formação de placas amilóides (43). Fonte: Figura A adaptada de: “Tau protein aggregation in Alzheimer's disease: An attractive target for the development of novel therapeutic agents.” Eur J Med Chem. 2017. Figura B extraída de: Neurofibrillary tangles. [acesso em 09 de maio de 2021]. Disponivel em: https://www.chegg.com/flashcards/nmsk-b-path- 069f0110-e3bb-40e7-9521-0c1743eb9a53/deck. Figura C extraida de: “Cases of dementia in the UK and a toxic chemical may be linked.” Utah People`s Post [periodico na internet]. May 2021. [acesso em 09 maio 2021]. Disponivel em: https://www.utahpeoplespost.com/2016/01/dementia-uk-toxic-chemical-linked/ A fase inicial da DA ou fase pré-clínica tem sido caracterizada, bem como o termo Comprometimento Cognitivo Leve (CCL ou mild cognitive impairment, MCI) (29), como https://www.chegg.com/flashcards/nmsk-b-path-069f0110-e3bb-40e7-9521-0c1743eb9a53/deck https://www.chegg.com/flashcards/nmsk-b-path-069f0110-e3bb-40e7-9521-0c1743eb9a53/deck https://www.utahpeoplespost.com/2016/01/dementia-uk-toxic-chemical-linked/ mostrado na figura 7 (29). O estágio CCL é utilizado para definir um estágio intermediário da DA, isto é, pacientes que apresentam um comprometimento em um ou mais domínios cognitivos, geralmente memória, ou um declínio cognitivo leve maior que esperado para a idade do indivíduo (29). Os pacientes caracterizados com CCL têm um risco de 5 a 10 vezes maior de desenvolver a doença clínica de Alzheimer dentro de 3 a 5 anos (29). Figura 7: Modelo hipotético da trajetória clínica da doença de Alzheimer (AD). Fonte: Extraído e adaptado: “Toward defining the preclinical stages of Alzheimer's disease: Recommendations from the National Institute on Aging. Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease” (2011)(29). Estudos recentes têm mostrado que existem alguns indicadores biológicos além do peptídeo β amilóides e da proteína tau hiperfosforilada, também denominados biomarcadores da doença de Alzheimer, que permitem distinguir pacientes com comprometimento cognitivo leve que irão progredir para a DA daqueles que não irão progredir (23,46). A descoberta desses biomarcadores possibilita o desenvolvimento de novas ferramentas e métodos para diagnosticar a doença de Alzheimer no estágio do CCL bem como no pré-clínico (29). 1.4 Biomarcadores Da Doença De Alzheimer Um biomarcador eficiente para o diagnóstico de uma doença como o Alzheimer deve identificar a doença em um estágio precoce, isto é, antes que os sintomas cognitivos sejam encontrados em testes neuropsicológicos e antes de haver uma degeneração clara em estudos de imagem cerebral (47,48). Na última década, juntamente com descobertas das principais características patogênicas da doença de Alzheimer, houve resultados consistentes em relação aos biomarcadores presentes no líquido cefalorraquidiano (LCR) e encontrados no sangue ou plasma (40-56). Esses biomarcadores geralmente provêm da degeneração de neurônios e sinapses, distúrbios no metabolismo da proteína precursora de amilóide (PPA) e sua posterior deposição em placas senis, estresse oxidativo e hiperfosforilação da proteína tau com posterior formação de emaranhados neurofibrilares (47,58–60), figura 8 (61). Figura 8. Sequência de eventos na fisiopatologia da doença de Alzheimer. Fonte: Adaptado de: “Aspectos da fisiopatologia da doença de Alzheimer esporádica.”, Revista Brasileira Neurologia (2012) (61). A maioria dos biomarcadores reportados na literatura mostraram níveis aceitáveis de especificidade e sensibilidade, alguns desses até mesmo na fase pré-clínica da doença de Alzheimer (61–64) possibilitando uma nova abordagem para o diagnóstico da doença, tabela 1 (65). Tabela 1: Biomarcadores associados à DA. Fonte: Adaptado “Biomarkers for the Early Detection and Progression of Alzheimer's Disease. Neurotherapeutics”, Neurotherapeutics (2017)(65). Os biomarcadores encontrados no líquido cefalorraquidiano são considerados mais precisos, uma vez que estão em contato direto com o microambiente cerebral, onde mudanças bioquímicas são refletidas diretamente (64,66,67). Ou seja, os biomarcadores aparecem primeiro no LCR, logo se apresentam em uma concentração maior inicialmente para depois começarem a aparecerem no sangue (64,66). As proteínas totais tau (T-tau), isoformas do βA, em particular o peptídeo com 42 aminoácidos, e diferentes epítopos fosfo-tau (F-tau) encontrados na LCR são biomarcadores bem caracterizados da DA e podem servir como marcadores que contribuem para o diagnóstico da doença (24-58). No entanto, a punção lombar necessária para coletar amostras do LCR é considerada uma prática invasiva e tem uma percepção pública negativa (69), limitando assim a utilidade desses marcadores como meios de diagnóstico, principalmente na fase pré-clínica assintomática. Atualmente, tendo em vista a dificuldade da coleta de LCR, tem se proposto a pesquisa de marcadores nos demais fluidos corpóreos (33,66,69,70). Alguns exemplos de biomarcadores periféricos da são peptídeos da ꞵA presente no plasma (47), formas maduras da proteína precursora da amilóide (PPA) (62) e as enzimas alfa-secretase (ADAM10) (62) e beta-secretase (BACE) (63), encontradas em plaquetas. O peptídeo ꞵA pode ser encontrado de duas formas contendo 40 ou 42 aminoácidos dependendo do C-terminal. Estes estudos mostram que altos níveis de ꞵA42 apontam um fator de risco para desenvolver a doença de Alzheimer (64,66,69).Porém, este biomarcador aparece em outras doenças cerebrais como Parkinson, Mal de Lewy, doenças Angiogênicas (71– 75) relacionadas ao cérebro e até mesmo a Síndrome de Down (76–78), o que o caracteriza como não sensível e específico para o diagnóstico precoce, embora possa ser usado, em casos específico, para prever o risco da DA (24,54). O diagnóstico confirmatório de DA em estágios iniciais pode facilitar a intervenção terapêutica precoce e o tratamento da doença, que nesse caso, se encontraria em um estágio que inicial, ou seja, tratável. Biomarcadores sensíveis e específicos também são valiosos para fins de prognóstico e para monitorar a progressão da doença e a resposta à terapia. Dessa forma, esses biomarcadores podem ser utilizados de maneira mais simplificada em biossensores de detecção rápida da doença. Em comparação com os biomarcadores que requerem imagens do cérebro e coleta do líquido cefalorraquidiano (LCR), os biomarcadores baseados no sangue como os autoanticorpos (70,79) são particularmente desejáveis porque é menos invasivo os metodos de coleta, pode ser coletados em maior volume e são mais acessíveis. Por meio da pesquisa de tais biomarcadores derivados do sangue, alguns autoanticorpos surgiram como biomarcadores potencialmente eficazes para a DA (65,80–82). 1.4.1 Autoanticorpos Os autoanticorpos são produzidos em condições fisiológicas ou fisiopatológicas. Fisiologicamente, os humanos produzem autoanticorpos naturais que reconhecem autoantígenos para facilitar o reconhecimento e eliminação de células mortas e em vias apoptóticas (67,83).Esses são frequentemente isotipos IgM e são produzidos espontaneamente durante o desenvolvimento das células B facilitam a fagocitose de células apoptóticas e inibindo as vias inflamatórias (67,83). Portanto, os autoanticorpos naturais têm um papel fundamental em atenuar a inflamação e manter a tolerância imunológica (83). A produção de autoanticorpos de alta afinidade, predominantemente da classe IgG, é promovida por inflamações e infecções que desencadeiam a maturação da afinidade do anticorpo em direção a autoantígenos. A quebra da tolerância imunológica é um mecanismo importante que leva à produção de autoanticorpos patogênicos e doenças autoimunes (65). Ao se ligarem a autoantígenos com alta afinidade, os autoanticorpos patogênicos iniciam e mantêm a cascata inflamatória responsável pelas lesões teciduais. Além disso, enquanto o perfil desses autoanticorpos naturais difere de um indivíduo para outro, eles são notavelmente estáveis ao longo do tempo dentro de um único indivíduo (84,85). Como uma faca de dois gumes, os autoanticorpos podem exercer efeitos prejudiciais e protetores (85). Em condições patológicas, os autoanticorpos interferem na função celular e desencadeiam uma resposta inflamatória severa, causando danos ao tecido e doenças autoimunes (65,85). Em condições fisiológicas, os autoanticorpos conferem tolerância imunológica, atenuam a inflamação e facilitam a eliminação de proteínas tóxicas (65,84). No entanto, as funções exatas de muitos autoanticorpos são atualmente desconhecidas (85). Alguns autoanticorpos estão especificamente associados ao estado da doença e, portanto, podem servir como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para a doença de Alzheimer, tabela 2 (51). Tabela 2: Autoanticorpos associados a DA e seus potenciais papéis. Fonte: Adaptado “Autoantibodies in Alzheimer's disease: potential biomarkers, pathogenic roles, and therapeutic implications.” J Biomed Res (2016) (51). Sendo assim, a aparição de autoanticorpos é um parâmetro fundamental para o diagnóstico de várias doenças autoimunes (65,67,83–85). Esses correspondem a estados fisiopatológicos nos quais uma resposta imune ocorre contra componentes do próprio individuo levando à produção de anticorpos contra autoantígenos específicos (70,79). Outro aspecto relevante é que os autoanticorpos podem anteceder a evolução de uma doença autoimune por meses ou anos (33- 36,47,511,53,54,67,70,80–83,86,87). O que leva claramente a implicações clínicas importantes como indicadores precoces de doenças. Compreensivelmente, uma das formas de rastreamento de uma possível doença autoimune é a pesquisa de autoanticorpos contra autoantígenos celulares(11). Os autoanticorpos contra alvos específicos envolvidos na atividade sináptica, incluindo neurotransmissores e receptores, estão associados ao declínio cognitivo, sugerindo seu uso como sinais de mau funcionamento cerebral(81,87). A presença de autoanticorpos também está associada à disfunção metabólica e ao estresse oxidativo(88). Autoanticorpos contra proteínas envolvidas no metabolismo, como a adenosina trifosfato sintase β (ATP-sintase), tem sido mais elevada nos soros(31,35,36,47,53,54,82) e LCR(31,35,47,53,58,68,82,88) de pacientes com DA do que em indivíduos saudáveis. A presença de autoanticorpos anti-neuronais foi detectada no soro de pacientes com a doença de Alzheimer e podem ser correlacionados com estágios específicos da fisiopatologia da DA(33,38,51,80–82), como pode ser exemplificado na figura 9 (82). Figura 9: Representação esquemática da circulação de autoanticorpos proveniente da doença de Alzheimer. Legenda: A morte celular em regiões de patologia leva à liberação de proteínas e seus fragmentos como detritos associados à doença. Essas moléculas se espalham para a circulação, e o sistema imunológico responde provocando a produção de autoanticorpos. Fonte: Adaptado de “Utility of Autoantibodies as Biomarkers for Diagnosis and Staging of Neurodegenerative Diseases “, Int Rev Neurobiol (2015)(82). O papel dessas proteínas antigênicas e o papel da autoimunidade na fisiopatologia da ainda não foram totalmente esclarecidos, mas há evidências suficientes para sugerir que estudos adicionais possam levar ao esclarecimento de um painel autoimune com maior especificidade e sensibilidade para diferenciar entre DA, envelhecimento normal e outras doenças que levam a demência. 1.4.2 ATP-sintase Os organismos vivos são capazes de produzir energia a partir de diferentes nutrientes. A síntese de Adenosina Trifosfato (ATP), a 'moeda de energia universal' da vida, é a reação química mais prevalente em sistemas biológicos e é responsável por alimentar quase todos os processos celulares, desde a propagação do impulso nervoso até a síntese de DNA. A energia é gerada na forma de ATP devido a fosforilação oxidativa de moléculas precursoras, o que ocorre efetivamente por ação da enzima ATP-sintase, figura 10(89). Figura 10: Esquema de ATP sintase de mitocôndria de mamíferos. Legenda: Desenho da ATP sintase mitocondrial que é estruturada e funcionalmente organizada em dois setores principais: uma porção Fo embutida na membrana e um F1 catalítico solúvel voltado para a matriz. Fo funciona como um canal de prótons com um movimento rotativo que aciona o F1 acoplado para sintetizar ou hidrolisar ATP, dependendo da direção de rotação. F1 compreende três heterodímeros αβ, enquanto o setor Fo contém um anel C de subunidades transmembrana e uma cópia da subunidade A. Os dois setores são conectados por meio de um eixo de rotor central composto pelas subunidades γ, δ e ε e um estator periférico que compreende vários peptídeos. Fonte: Adaptado de “Systematic review of plasma-membrane ecto-ATP synthase: A new player in health and disease”, Exp Mol Pathol (2018)(89). Essas enzimas são macromoléculas complexas, multiproteicas, presentes nas membranas de bactérias, mitocôndrias e cloroplastos, sendo sua atividade diferente, quanto aos mecanismos de regulação e bases moleculares, dependendo de sua origem(89–91), figura 11(92). Além disso, a ATP-sintase atua durante restrições dietéticas com metabólitos chaves que medeiam a longevidade, configurando uma estratégia para o diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças relacionadas a idade em mamíferos(93). Figura 11: Modelos comparativos esquemáticos e atômicos de ATP Sintase F1Fo de bactérias, cloroplastos e mitocôndrias. Legenda: As subunidades são codificadas por cores para mostrar domínios homólogos entre as espécies: α (vermelho); β (amarelo), δ (cinza nas bactérias e cloroplastos, marrom nas mitocôndrias); OSCP (cinza nas mitocôndrias); b / b ′ (roxo escuro); anel c (roxo claro); F6 (rosa); γ (azul); ε (verde); e d (azul claro). Fonte: Adaptado de “ATP synthase: Evolution, energetics, and membrane interactions”, J Gen Physiol (2020)(92). Os autoanticorpos contra a ATP sintase são capazes de induzir a inibição da síntese de ATP, alterando, assim, a homeostase mitocondrial e promovendo a morte celular por apoptose(94– 96). Essas descobertas sugerem que os autoanticorpos específicos da ATP sintase podem exercer um papel patogênico através de um mecanismo que traz em prática o comprometimento da homeostase do ATP extracelular e a alteração da função mitocondrial desencadeando a morte celular pelo apoptose(94–96). Usando a abordagem proteômica, ATP sintase também foi identificada como um novo autoantígeno na DA(40,47,51–53). Tornou-se então evidente que um componente autoimune poderia desempenhar um papel no início da doença de Alzheimer (DA) e/ou progressão como a ecto-F1-ATPase: a geração de ADP devido à hidrólise de ATP(53); assim como a subunidade β da ATP sintase(54). Autoanticorpos para ATP sintase foram frequentemente encontrados no soro de pacientes com DA, mas não em indivíduos saudáveis de mesma idade e em pacientes com doença de Parkinson ou aterosclerose(52,53). Essas alterações como a presença destas enzimas ou autoanticorpo no líquor e soro tem relação com o surgimento de patologias humanas neurodenerativas, sendo assim, esses autoanticorpos anti-ATP sintase podem ser usados como biomarcadores específico da DA(40,47,51–53,86,94–97). 1.4.3 FRMD-8 As células do corpo humano comunicam-se umas com as outras por muitas razões diferentes, incluindo para ajudar os órgãos a desenvolverem-se corretamente e para produzir uma resposta saudável a lesões e infecções(98). Proteínas sinalizadoras, como fatores de crescimento e citocinas, formam a principal linguagem dessa comunicação. Inicialmente, muitos fatores de crescimento e citocinas permanecem fixados à superfície da célula que os produziu como algumas metaloproteinases(98,99). Os ADAMs (desintegrina e metaloproteinase) são uma família de proteínas transmembrana e secretadas com papéis importantes na regulação por meio de seus efeitos na adesão, migração, proteólise e sinalização celular(100,101). As metaloproteinases ADAM funcionais estão envolvidas na "liberação de ectodomínio" de diversos fatores de crescimento, citocinas, receptores e moléculas de adesão(100,101). Um membro importante da família, ADAM-10, é essencial para a "proteólise intramembrana regulada" (RIP), que gera domínios intracelulares clivados que se translocam para o núcleo e regulam a transcrição do gene(102,103). Outros ADAMs não catalíticos funcionam no SNC por meio de efeitos nos mecanismos de orientação. A família ADAM é, portanto, fundamental para muitos processos de controle no desenvolvimento e homeostase e, sem surpresa, também está ligada a estados patológicos quando suas funções são desreguladas, incluindo câncer, doenças cardiovasculares, asma, doença de Alzheimer(100–102). Outra metaloprotease importante da família é a ADAM17 (também chamada de TACE – enzima conversora do fator de necrose tumoral-alfa) medeia a liberação de muitas moléculas de sinalização importantes como fator de necrose tumoral alfa (TNFα)(99,104), fator de crescimento epidérmico (EGF), anfiregulina (AREG), fator de crescimento transformador alfa (TGFα), EGF de ligação à heparina (HB-EGF), epígeno e epiregulina(105,106). Esse processo deve ser controlado cuidadosamente porque a liberação de muitos fatores de crescimento ou citocinas (ou liberá-los em momentos inadequados) pode levar ao câncer e doenças inflamatórias(99,104–106). Para isso, as proteínas chamadas iRhoms do tipo romboide têm uma relação regulatória específica e extensa com ADAM17, na medida em que iRhoms podem ser consideradas como subunidades regulatórias da protease(98,107–109). E para regular a atividade dessa existe uma proteína chamada FRMD8 que se liga a iRhoms(107–109). O significado funcional desta interação é demonstrado pela perda de FRMD8 causando um fenótipo semelhante à deficiência de iRhom nas células: perda de ADAM17 e eliminação severa dos substratos de ADAM17 da superfície celular, indicando que sua função é estabilizar o complexo iRhom/ADAM17(108,109), figura 12(108). No geral, a proteína FRMD8 é um componente essencial da maquinaria de sinalização inflamatória(108,109). Figura 12: FRMD8 estabiliza o complexo sheddase iRhom2 / ADAM17 na superfície da célula. Legenda: Representação esquemática do papel de FRMD8 na via iRhom2 / ADAM17: em condições de tipo selvagem, ADAM17 e iRhom2 são estabilizados por FRMD8 e, portanto, protegidos da degradação através da via endolisósmica. Fonte: Adaptado de “FRMD8 promotes inflammatory and growth factor signalling by stabilising the iRhom/ADAM17 sheddase complex”, Elife (2018)(108). Assim, tanto a ADAM10(100–103) como ADAM17(100–103,110,111), aparecem na literatura como potenciais marcadores de diversas doenças(100–102) assim como o Alzheimer(100–103,110,111) e outras desordens cerebrais como a Sindrome de Down(102). Pelo fato de a FRMD8 estar intrinsecamente conectada a ADAM17 atuando como proteína estabilizadora e controladora secundária da cascata inflamatória, espera-se que o desregulação de uma gere o desbalanço da outra. Apesar de não se conhecer a origem da desregulação e quem inicia esse desbalanço, a FRMD8(35,51,112) e os autoanticorpos(35,112) contra a mesma, são reportados na literatura como potenciais biomarcadores do Alzheimer. 1.5 Ferramenta proposta para diagnóstico: Biossensores Biossensores são ferramentas biotecnológicas utilizadas no diagnóstico clínico, devido à sua especificidade, sensibilidade, versatilidade e superioridade da nova metodologia(113–115). O dispositivo compreende um elemento biológico acoplado a um transdutor de sinal, o qual detecta a ligação das espécies complementares(114–116), figura 13(116). Figura 13: Esquema de um biossensor. Legenda: Os biossensores são constituídos por um elemento de reconhecimento biológico e um método de transdução de sinal, e têm permitido a quantificação de vários analitos. Fonte: Adaptado de “Optical Biosensors for Therapeutic Drug Monitoring”, Biosensors (2019)(116). Imunossensores e biossensores para o diagnóstico da doença de Alzheimer têm sido descritos na literatura(117–126). A maioria dos trabalhos usaram a detecção da βA40 e 42(124,126) que é eficiente como biomarcador no estágio pré-clínico se a amostra for retirada do LCR. Pesquisadores brasileiros reportaram o desenvolvimento de biossensores através da detecção da enzima ADAM10(80) e da glutationa(81). Porém biomarcadores metabólicos e genéticos da doença de Alzheimer são mais eficientes para ser diagnosticada em amostra do LCR. Uma alternativa para o diagnóstico da doença de Alzheimer é a detecção de autoanticorpos presentes em pacientes com DA(47,53,66,81,124,126), apesar da função protetiva ou destrutiva dessas moléculas em termos de patologia ainda não está clara(51,63,65), sua aplicação como biomarcadores é de grande interesse porque muitos deles estão presentes tanto no sangue como no LCR(47,53,66,86,92,94-97,113,114,124–127). 1.5.1 Biossensores ópticos Métodos analíticos para avaliação quantitativa e qualitativa de compostos biológicos têm sido intensamente abordados em diversas aplicações, tais como controle ecossistêmico, biotecnologia, diagnósticos clínicos e estudos farmacológicos(116,130–133). O diagnóstico e monitoramento terapêutico de doenças é uma ferramenta fundamental na medicina e na vida dos pacientes(113–116). Para fazer um diagnóstico ou monitoramento, podem-se utilizar diversos fluidos biológicos, como sangue, plasma, soro e urina, entre outros(116). A ajuda de tecnologias especializadas permite a identificação e quantificação do grau da doença(117–120,125). As técnicas mais funcionais para a rápida identificação ou quantificação empregam os biossensores, dispositivos que consistem em um elemento de reconhecimento biológico acoplado a um transdutor de sinal(116). Entre os biossensores estão os do tipo biossensor óptico, que têm sido utilizados para a semiquantificação de diferentes moléculas de interesse clínico(116,134). Entre as vantagens desses biossensores estão o seu tamanho reduzido, a velocidade de resposta, a facilidade de integração, boa biocompatibilidade e alta seletividade e sensibilidade(132). Biossensores ópticos são baseados nas mudanças das propriedades físico-químicas da matéria que por sua vez influenciam nas propriedades ópticas específicas das substâncias tornando mensurável essa resposta(134,135). Entre as propriedades ópticas que podem ser mensuradas estão: absorção, índice de refração, fluorescência, fosforescência, refletividade e comprimento de onda(134,135). Nesse presente projeto optou-se por análises espectroscópicas utilizando o comprimento de onda como propriedade óptica a ser quantificada, devido à grande variedade de técnicas que podem ser empregadas para tal. Pela versatilidade, rapidez e caráter não destrutivo, pode-se destacar três técnicas espectroscópicas: a espectroscopia de infravermelho, a espectroscopia Raman e a espectroscopia de fotoluminescência(134,135). A espectroscopia de fotoluminescência está fundamentada na emissão de radiação, a espectroscopia de infravermelho esta baseadas na absorção da radiação e a espectroscopia Raman no fenômeno de espalhamento de luz pela matéria(135). As espectroscopias de infravermelho e Raman são duas das técnicas complementares mais amplamente utilizadas nas ciências físicas e naturais hoje(134–136). Essas técnicas são usadas no intuito de identificar e caracterizar o arranjo molecular e análises de reações(134,135,137). Desta maneira, a espectroscopia Raman representa, juntamente com a espectroscopia de absorção no infravermelho, uma das ferramentas mais úteis para a obtenção de informações sobre a estrutura e propriedades das moléculas a partir de suas transições vibracionais(133–135). 1.5.2 Espectroscopia Vibracional e Efeito Raman Para compreender a espectroscopia vibracional e os tipos de espalhamentos, é fundamental ter em mente que as moléculas consistem em átomos com uma certa massa que podem ser considerados como estando conectados por ligações elásticas, figura 14(138). Figura 14: Esquema correlacionando ligações elásticas e níveis de energia vibracional. Legenda: A) Representação esquemática de um oscilador harmónico composto por dois corpos de massa m1 e m2 ligadas por uma mola sem limite de elasticidade (lei de Hooke). B) Esquema teórico dos níveis de energia vibracionais em função do número quântico (v) e valor energético entre níveis. Fonte: Extraído de “Espectroscopia Vibracional”, Revista Ciência Elementar (2018)(138). Como resultado, as moléculas podem realizar movimentos periódicos e ter graus de liberdade vibracionais. Esses movimentos podem ser por estiramento, deformação, translação ou rotação(139,140) como demostrado na figura 15(139). Figura 15: Esquema demonstrando os movimentos que as moléculas podem fazem ao serem excitadas. Legenda: Graus de liberdade de uma molécula triatómica. O movimento vibracional conjectura que a ligação entre os átomos funciona como uma mola(139). Sendo assim, as moléculas podem ser identificadas por seus espectros por causa da relação com os níveis de energia associados com movimentos dos átomos(137). Esses espectros dependem das massas dos átomos, de seu arranjo geométrico e da força de suas ligações químicas(138–140). Quando uma molécula é exposta a um campo eletromagnético, os elétrons e núcleos são forçados a se mover em direções opostas em um momento de dipolo(139,140). Essa polarização associada a frequência das vibrações e intensidade fornecem espectros específicos(137) que podem ser mensurados pelas técnicas de espectroscopia vibracional (Infravermelho (IR) e Raman) que investigam as transições entre os níveis vibracionais de uma molécula em virtude da interação com o campo elétrico oscilante da radiação eletromagnética incidente, que pode ser originada por uma fonte policromática (Infravermelho) ou monocromática (Raman)(141). Todo sistema composto por átomos ligados entre si apresentam níveis vibracionais, desde os compostos mais simples como as moléculas diatómicas aos sistemas biológicos mais complexos e materiais diversos(141). Tal fato, torna possível o uso das técnicas de espectroscopia vibracional para a caraterização de sistemas(138–141). A espectroscopia de IR tem como base o processo de absorção de fótons da radiação eletromagnética incidente por uma molécula, levando-a a um estado vibracional excitado(134,135,137,138,142). Por sua vez, a espectroscopia Raman é caracterizada pela dispersão inelástica de um fóton mediada por momento dipolar induzido pelo campo eletromagnético(135,141,142), figura 16(142,143). Devido ao seu caráter não destrutivo, a espectroscopia Raman representa, em conjunto com espectroscopia de infravermelha, uma das ferramentas mais úteis para a obtenção de informações sobre a estrutura e propriedades das moléculas(134,135,138,141,143). No entanto, a aplicação da espectroscopia Raman convencional é limitada pela fraca intensidade da luz espalhada Raman e o aparecimento de fluorescência(134,135,141,143). Figura 16: Diagrama comparativo de espectroscopia de IR e Raman. Legenda: A) Diagrama de nível de energia mostrando os estados envolvidos nos espectros Raman em relação a IR(143). B) Três tipos de processos de espalhamento que podem ocorrer quando a luz interage com uma molécula(142). Uma maneira de superar essas desvantagens é o uso de Espectroscopia de Raman Aprimorada por superfície (SERS). O efeito SERS consiste no enorme aumento do sinal Raman (106) das moléculas adsorvidas em superfícies metálicas(144,145). Desta forma, com SERS, uma sensibilidade aumentada é obtida e concentrações muito mais baixas podem ser estudadas(145). O efeito de intensificação pode influenciar a polarizabilidade molecular ou o campo elétrico experimentado pela molécula(57,132,145–148). Apesar das dificuldades e limitações da SERS como: reprodutibilidade quantitativa pobre e o efeito de fotólise de superfície, a técnica tornou-se uma ferramenta analítica cada vez mais popular, que tem sido aplicada em vários campos, como biomedicina, biofísica e bioquímica, ciência de superfície, aplicações analíticas e ambientais(146– 150). 1.5.2.1 Espectroscopia Raman Aprimorada por Superfície (SERS) Em outras palavras, SERS é uma técnica de espectroscopia vibracional ultrassensível que capta e analisa a vibração de moléculas como nanopartículas, potencializando o sinal de espalhamento da espectroscopia de Raman convencional. O fenômeno ocorre através da detecção de analitos ligados a um substrato metálico, gerando espectros dos mesmos(151). Nos últimos anos tem-se estudado novas formas de melhoria do sinal Raman(151–155). Uma técnica descrita na literatura(51,152,154,155) e nesse trabalho, associa nanopartículas metálicas com moléculas orgânicas específicas que possuem bandas características. Essa nanoestrutura modificada é denominada de sonda SERS(155–158), na qual, a nanopartícula metálica é revestida com moléculas orgânicas como corantes, os quais tem bandas de absorção no mesmo ou mais próximo do comprimento de onda do laser Raman incidente(150). Tal técnica tem o intuito de gerar o fenômeno chamado de SERS ressonante (SERRS), figura 17(150). O aprimoramento de sondas SERS é tido como uma evolução para as análises de espectroscópicas de amostras biológicas por trazer vantagens como: o aumento da sensibilidade em amostras de quantidade limitada; rápida análise, que impede o photoblenching, ou seja, a transferência de energia do estado excitado dos marcadores (corantes); aumento da intensidade do sinal que pode minimizar a autofluorescência de tecidos e células, permitindo que as sondas SERS possam ser usadas para geração de imagens não invasiva em pacientes vivos(155). Figura 17: Diagrama de nível de energia mostrando os estados envolvidos nos espectros Raman, Rayleigh e Fluorescência. Fonte: Applications of Raman spectroscopy in cancer diagnosis. Cancer Metastasis Rev (2018)(150) Uma sonda SERS pode ser constituída por uma nanoestrutura metálica, como nanopartícula de prata (AgNPs) ou nanopartícula de ouro (AuNPs), uma molécula orgânica com uma banda bem característica, como Nile Blue A (NBA) e uma molécula biológica, como um anticorpo conjugado(155). Nesse caso, as nanopartículas geram um intenso sinal espectroscópico devido as superfícies metálicas(155,157,158). A alteração da constituição química, tamanho e estrutura do núcleo de metal causam mudanças nas propriedades das sondas SERS(155,157,158). Além disso, essas moléculas orgânicas devem ser acopladas as nanoestruturas para gerar a impressão digital do SERS(155,157,158). A imobilização sobre a superfície metálica é descrita como modificação superficial por camadas automontados(150). Existem diversos tipos de substratos que podem ser utilizados, sendo que, nesse trabalho optou-se por usar o ouro, uma vez que, apresenta características como: a fácil manipulação para a formação de filmes ou colóides; o fato de o ouro ser inerte auxiliando na conservação da sua estrutura e composição em temperaturas abaixo da temperatura de fusão, não reage com O2 atmosférico - estas propriedades facilitam a manipulação; tem alta afinidade com grupos tióis, baixa toxicidade, sendo compatível com células(159,160). As aplicações usando as sondas SERS e a modificação de superfícies são as mais diversas, tais como na nanofabricação, biossensores e imunossensores(159,160). 1.5.3 Biossensores usando ensaios sanduíche SERS A primeira descrição de ensaio SERS relacionado a DA foi por Porter e colaboradores(160) usando nanopartículas de ouro para detectar IgG com alta precisão. Esse trabalho foi pioneiro usando o ensaio sanduíche, no qual, o analito de interesse foi identificado indiretamente entre uma superfície modificada e as nanopartículas recobertas com a molécula marcadora (sondas SERS) que irá gerar o sinal de interesse. Imunoensaios utilizando a técnica de SERS são conhecidos por ser uma análise que pode ser usada para diagnóstico de doenças, pois combina a facilidade, à versatilidade de síntese, produzindo sistemas com alta sensibilidade(150,159,160). Alguns requisitos fundamentais para um imunoensaio SERS para aplicações em diagnósticos são uma resposta reprodutível e uniforme, período de vida estável e a simplicidade de fabricação(153–155). Atualmente a literatura apresenta três categorias de imunoensaios com base na fisiopatologia da DA: 1) relacionados à deposição fibrilar de Aβ, 2) papel da tau na formação de emaranhados neurofibrilares e 3) perfil de biomarcadores de múltiplos domínios(161,162). Dentre esses se desses trabalhos se destacam Zengin e colaboradores(163) que relatam um ensaio para a detecção da proteína tau utilizando uma combinação de anticorpos monoclonais anti-tau, nanopartículas magnéticas. As partículas de sílica magnéticas foram revestidas com poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) e em seguida com anticorpos anti-tau. Neste trabalho os autores, mostraram que o limite de detecção abaixo de 25 fM. No entanto, é usado o líquor como biofluido. Outro trabalho que se destaca usando SERS é de Carlomagno e colaboradores(123) que descrevem um protocolo de análise usando SERS. Na busca por um perfil de biomarcadores que podem ser tratados como variáveis contínuas em relação ao dano cerebral, os pesquisadores, desenvolveram um biossensor baseado em SERS para análise de soro humano. Nesse estudo, na tentativa de evitar uso de anticorpos e um marcador único, foi analisado o soro, como um todo, através de várias diluições usando nanopartículas de ouro e prata e diversos tempos de incubação com o intuído de estabelecer um perfil espectroscópico para a DA(123). A impressão digital de DA através de SERS na tentativa de cria um biomarcador completo apresentou resultados interessantes, porem devido ao baixo número amostral não foi totalmente conclusivo(123). Outro trabalho interessante é de Jinghua Yu e colaboradores(164), no qual, é feita uma detecção multiplexada de biomarcadores https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Yu+J&cauthor_id=31353891 centrais da doença de Alzheimer. Nesse trabalho os pesquisadores construíram um biossensor múltiplo para detecção simultânea do peptídeo Aβ (1-42) e proteína Tau usando diferentes conjugados de aptâmero poliA codificado por corante Raman (PAapt-AuNPs). Os resultados revelam que a estratégia apresenta bom desempenho analítico, porém não apresenta boa sensibilidade, além disso, utilizou amostras artificiais de líquido cefalorraquidiano (LCR)(164). De uma maneira simplificada, todos os trabalhos realizados associando SERS, biomarcadores e DA(123,163–166) estão relacionados com o uso de líquor, que é um biofluido de difícil coleta, ou com os biomarcadores mais tradicionais que são peptídeo Aβ e proteína Tau(123,163–166). Esses marcadores têm um papel específico no desenvolvimento DA, porém não são únicos e exclusivos do Alzheimer, podendo trazer vieses aos resultados. 2 JUSTIFICATIVA Atualmente, o diagnóstico definitivo de DA depende da confirmação da patologia cerebral por autópsia. Como o número de pessoas que desenvolvem DA deve aumentar drasticamente nas próximas décadas, há uma necessidade urgente de desenvolver testes de diagnóstico aplicáveis a pessoas vivas. O papel dessas proteínas antigênicas e o papel da autoimunidade na fisiopatologia da DA ainda não foram totalmente esclarecidos, mas há evidências suficientes para sugerir que estudos adicionais possam levar ao estabelecimento de um painel autoimune com maior especificidade e sensibilidade para diferenciar entre doença de Alzheimer, envelhecimento normal e outras doenças que levam à demência. 3 OBJETIVO 3.1. Objetivo Geral Neste sentido o presente projeto tem como principal objetivo desenvolver biossensores com biomarcadores para o auxílio diagnóstico da doença de Alzheimer com maior especificidade dentre as doenças neurodegenerativas. 3.2. Objetivos Específicos • Compor banco de amostras criopreservadas de líquor e frações do sangue de pacientes portadores de doença de Alzheimer; • Produzir, caracterizar e validar biossensor para identificação de autoanticorpo anti-ATP- sintase; • Produzir, caracterizar e validar biossensor para identificação de autoanticorpo anti-FRMD8; • Avaliar o desempenho do biossensor com as amostras de pacientes com diagnóstico confirmado de Doença de Alzheimer e pacientes saudáveis para Alzheimer; • Definir qual será a melhor amostra ou amostras biológicas (soro ou líquor) para o diagnóstico de Alzheimer na plataforma do sensor; 4 CASUÍSTICA E MÉTODOS Para o sucesso deste projeto foram estabelecidas várias parcerias intrainstitucionais: Departamento de Neurologia, Psicologia e Psiquiatria, o Hemocentro e a Equipe de Radiodiagnóstico do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu; Instituto de Química de Araraquara (UNESP); interinstitucionais como o Instituto de Ciência e Tecnologia da UNIFESP campus São José dos Campos e internacional como o Departamento de Química da Universidade de Victoria, Canadá. 4.1 Comitê de Ética Todos os participantes envolvidos neste estudo foram amplamente informados sobre riscos e potenciais benefícios da participação neste estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) pré-aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Medicina de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista – UNESP e Plataforma Brasil, registrado sob o número de protocolo CEP 2.879.236. Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki, ISO14155 e diretrizes para Boas Práticas Clínicas. 4.2 Cálculo da amostra O tamanho da amostra por grupo para todos os testes foi estimado de forma monocaudal e o número (n) de repetições por grupo foi estimado em 10 participantes por grupo, levando-se em consideração um desvio padrão de 5%, para se detectar diferenças ao nível de 20% com nível de significância de 0,05, ponderando-se o poder do teste em 90% (http://www.lee.dante.br/pesquisa/amostragem/amostra.html). Deve-se levar em consideração para este estudo que, por tratar-se de um estudo envolvendo seres humanos pertencentes a um grupo vulnerável e que, por tratar-se de um novo teste de detecção, deve arrolar o menor número possível de participantes, em concordância com o que foi orientado pelo CEP local. 4.3 Grupos de estudo Os pacientes incluídos: 10 indivíduos não portadores de Alzheimer (grupo controle = CA), sem comprometimento do Sistema Nervoso Central (SNC), que foram examinados pela equipe de Neurologia e tiveram a necessidade da coleta de líquor e indicação de Ressonância Magnética (RM), mas obtiveram resultado negativo para doenças infectocontagiosas do SNC (meningite), tumores malignos e que concordaram em participar deste estudo. Igualmente incluídos 10 portadores da doença de Alzheimer (DA) já diagnosticados no ambulatório de Neurologia específico para o acompanhamento de DA e que seriam submetidos ao exame do líquor e de RM, que devem fornecer amostras sabidamente positivas para a doença e obtiveram resultado negativo para doenças infectocontagiosas do SNC (meningite), tumores malignos e que concordaram em participar deste estudo. Nenhum paciente, independente do grupo de pesquisa, foi submetido a coleta de líquor ou RM sem a real necessidade clínica. 4.3.1 Critérios de inclusão e exclusão dos participantes Os critérios de inclusão para ambos os grupos a serem estudados estão descritos na tabela 3. O contato com os pacientes e seus familiares foram realizados no ambulatório de Neurologia clínica. Após consulta médica e psicológica, tendo em vista a caracterização do paciente como integrante do grupo CA ou DA, foi apresentado ao mesmo e à família o escopo do projeto para anuência e assinatura do TCLE. O paciente recebe o pedido de coleta de líquor, sangue e exames de neuroimagem (RM). Para pacientes do Grupo Controle, foi reiteradamente confirmada a exclusão da hipótese diagnóstica de Alzheimer, e as demais comorbidades foram listadas para melhor entendimento dos resultados a serem obtidos. Não foram admitidos no grupo controle pacientes com alteração cognitiva, bem como não foram incluídos no grupo DA pacientes que não preencherem os critérios estabelecidos. Tabela 3 – Critérios de inclusão para os grupos de estudo Fonte: Arquivo pessoal 4.4 Obtenção das amostras 4.4.1 Amostras de Sangue Inicialmente foram coletadas as amostras de sangue periférico, em veia cubital, em frasco de 5 ml contendo anticoagulante (ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA) para realizar hemograma e um frasco sem anticoagulante para obtenção de soro (10 ml), figura 20. O frasco sem anticoagulante foi transportado até o Laboratório de Engenharia Celular (LEC) e colocado no banho-maria à 37°C por 2 horas com o intuito de retração do coágulo. Após sofreu centrifugação de 900 rpm por 10 minuto. O sobrenadante, soro, foi separado, alíquota e congelado à -80°C para preservação e posterior uso, figura 18. Figura 18: Esquema de processamento das amostras de sangue. Fonte: Arquivo pessoal. 4.4.2 Amostras de Líquido cefalorraquidiano ou Líquor (LCR) Esta coleta foi efetuada por médico neurologista devidamente autorizado. Após a coleta de sangue o paciente foi acomodado na maca em decúbito dorsal direito, solicitando-se que o mesmo flexionasse os joelhos até o peito. Inicialmente foi realizado um botão de lidocaína 2% sem vasoconstritor, subcutâneo. Após a formação do botão anestésico foi procedida nova antissepsia do local com iodopovidona (PVPI), colocação de campos estéreis, troca de luvas para luvas estéreis e com a agulha de punção lombar, foi posicionada de forma angular até ultrapassar os planos de tecidos subjacentes para atingir o espaço medular, figura 19(167). Este LCR foi coletado e acondicionado em tubo estéril, volume de 2 ml. As amostras foram levadas para o LEC, aliquotadas e congeladas à -80°C para preservação e posterior uso. Figura 19: Ilustração de como ocorre a coleta de LCR. Fonte: Adaptado do site: https://www.tuasaude.com/puncao-lombar/(167). 4.5 Prova Conceito A prova de conceito é um modelo que pode ser usado na prática como padrão de comparação que possa comprovar a hipótese estabelecida. Com esse entendimento, foi definido como prova conceito para esse trabalho o Exame do Estado Mental (EEM ou MEEM)(168) (figura 20)(169), RM e a pesquisa de biomarcadores. 4.5.1 MEEM O MEEM ou teste de Folstein(170), figura 20(169), é uma avaliação mundialmente utilizada para verificar possíveis quadros de demência de maneira rápida, objetiva e simples. No entanto, o diagnóstico não deve basear-se apenas nessa metodologia. Todavia, seus resultados podem orientar condutas mais especializadas ou colocar sob inspeção mais rígida um paciente com quadro clínico muito sugestivo. De modo geral, o MEEM divide-se em duas etapas. A primeira procura avaliar a orientação, memória e atenção. Soma, no total, 21 pontos. A segunda analisa habilidades específicas como nomeação e compreensão. Seu resultado máximo é 9 pontos. As duas fases somam 30 pontos(171,172). Figura 20: Teste de MEEM. Fonte: Extraído do site da Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo, https://www.saude.sc.gov.br.(169) https://www.saude.sc.gov.br/ Conforme o grau de pontuação do paciente pode-se estabelecer scores do grau cognitivo. Sendo assim, maior a pontuação, maior o desempenho cognitivo. Uma crítica a tal metodologia é a necessária adaptação do resultado ao grau de escolaridade do indivíduo. Uma pessoa com nível educacional mais elevado deverá, necessariamente, obter scores mais elevados. Desse modo, é indispensável moldar os scores aos anos de escolaridade do paciente. Considera-se como saudável para DA o paciente que alcança mais de 25 pontos(169,172,173). Suspeita-se de perda cognitiva leve quando o escore está entre 21 e 24 pontos, moderada, entre 10 e 20 e grave menor ou igual a 9(169,172,173). Após, agrega-se a escolaridade. Para indivíduos altamente alfabetizados desconfia-se de uma possível demência se a pontuação for menor que 24. Para pessoas com ensino fundamental a suspeita deve ser aguçada se o resultado for menor que 18. E para analfabetos, inferior a 14(173). Portanto, é indispensável um ajuste que torne os números mais fidedignos e sustente uma investigação mais detalhada. Para avaliar a progressão da doença o teste é feito em todas as consultas do paciente. Apesar do MEEM tratar-se de um teste com certas limitações, em âmbito ambulatorial pode ser um útil aliado no screening de quadros demenciais. 4.5.2 Realização da Ressonância Magnética Todos os participantes desta pesquisa tiveram como critério de inclusão a realização de um exame de RM de crânio. As imagens foram adquiridas por um aparelho MAGNETOM® Verio 3T Siemens do setor de Radiodiagnóstico do HC da FMB - UNESP. Todas as análises de imagem foram realizadas com supervisão restrita de um radiologista especializado da equipe de Radiodiagnóstico do HC da FMB. 4.6 Reagentes Em todos os experimentos foram utilizados água miliQ (Banstead Nanopure, resistividade 18.2 Ω-cm). Foram também utilizados os reagentes: Ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA, ≥ 99%, Sigma Aldrich), cloreto de ouro trihidratado (HAuCl4.3H2O, ≥ 99,9%, Sigma Aldrich), citrato de sódio dihidratado (≥ 99%, FG), Nile Blue A (NBA, 95%, Sigma Aldrich), Etil dimetilaminopropilcarbodiimida e sulfo-N-hidroxisuccinimida (EDC e sulfo-NHS, ambos da ProteoChem, USA), HS-PEG-COOH e HS-PEG-CH3 (Peso Molecular = 3000 e 5000 Da, ambos da Rapp Polymere Tuebingen, Germany), anticorpo monoclonal IgG HIV p17 (Santa Cruz Biotechonology, USA), anticorpo policlonal IgG anti-humano (específico para Fc) (Sigma Aldrich), albumina de soro bovino (BSA, ≥ 96 %, Sigma Aldrich). 4.7 Biomarcadores 4.7.1 ATP Sintase subunidade Beta e Anticorpo Anti-ATP Sintase Subunidade Beta O peptídeo recombinante humano ATP sintase subunidade beta (AQTSPSPKAG AATGRIVAVI GAVVDVQFDE GLPPILNALE VQGRETRLVL EVAQHLGEST VRTIAMDGTE GLVRGQKVLD SGAPIKIPVG PETLGRIMNV IGEPIDERGP IKTKQFAPIH AEAPEFMEMS VEQEILVTGI KVVDLLAPYA KGGKIGLFGG AGVGKTVLIM ELINNVAKAH GGYSVFAGVG ERTREGNDLY HEMIESGVIN LKDATSKVAL VYGQMNEPPG ARARVALTGL TVAEYFRDQE GQDVLLFIDN IFRFTQAGSE VSALLGRIPS AVGYQPTLAT DMGTMQERIT TTKKGSITSV QAIYVPADDL TDPAPATTFA HLDATTVLSR AIAELGIYPA VDPLDSTSRI MDPNIVGSEH YDVARGVQKI LQDYKSLQDI IAILGMDELS EEDKLTVSRA RKIQRFLSQP FQVAEVFTGH MGKLVPLKET IKGFQQILAG EYDHLPEQAF YMVGPIEEAV AKADKLAEEH SS)(174) e seu respectivo anticorpo policlonal foram comprados na MyBioSource©. O peptídeo ATP sintase subunidade beta possui 482 aminoácidos e tem peso molecular de 54kDa. É rico em alanina, glicina, leucina e isoleucina, o que confere a essa molécula uma carga residual de -19. Através da análise da sequência de aminoácidos na plataforma ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) foi possível identificar seu grau de estabilidade. Devido ao seu tamanho e estruturação tridimensional possui um índice de instabilidade de 34,93, o que, o qualifica como uma molécula estável. Para os experimentos o peptídeo foi diluído em PBS para uma solução de 0,01mg/ml. O anticorpo policlonal Anti-ATP sintase subunidade beta humana recombinante, foi diluído em PBS para as concentrações de puro (0,1mg/ml), 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000, com o intuito de estabelecer uma curva de calibração. 4.7.2 FRMD8 e Anticorpo Anti-FRMD8 O peptídeo recombinante humano FRMD8 (SREKHVLLGL RFQELSWDHT SPEEEEPILW LEFDGDSEGT PVNKLLKIYS KQAELMSSLI EYCIELSQAA EPAPQDSATG SPSDPSSSLA PVQRPKLRRQ GSVVSSRIQH LSTIDYVED) e seu respectivo anticorpo policlonal foram comprados na Sigma Aldrich©. O peptídeo recombinante FRMD8 possui 120 aminoácidos e peso molecular de 31 KDa. É rico em ácido glutâmico, leucina e serina, o que confere a essa molécula uma carga residual de -9. Através da análise da sequência de aminoácidos na plataforma ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) foi possível identificar seu grau de estabilidade. Devido ao seu tamanho e estruturação tridimensional possui um índice de instabilidade de 89,03, o que, o https://web.expasy.org/protparam/ https://web.expasy.org/protparam/ qualifica como uma molécula instável fazendo-se necessário para esse peptídeo o uso de lipossomo para a sua estruturação tridimensional e estabilidade. Para os ensaios o peptídeo foi diluído em segundo recomendação do fabricante para uma solução 0,1mg/mL (diluição sugerida na literatura(35)) a partir da solução estoque 6 mg/mL. Devido ao seu grau de instabilidade molecular o FRMD8 foi incorporado em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) da Avanti polar lipids. Os lipossomos foram preparados através da mistura das soluções DPPG (1 mmol. L-1) e FRMD8 (0,001 mmol. L-1) em metanol: clorofórmio (1:9) em um tubo Falcon. O solvente foi evaporado com ar comprimido e o filme formado ao redor do tubo foi hidratado por 12 horas com água milli-Q sob agitação. O anticorpo policlonal Anti-FRMD8 recombinante que corresponde a região entre o aminoácido 217 e 452, foi diluído em PBS para as concentrações de puro (0,01mg/ml), 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000, com o intuito de estabelecer uma curva de calibração. 4.8 Produção dos Sensores Os biossensores ópticos foram construídos baseados em 3 componentes: Lâmina de Ouro com superfície modificada, Nanopartículas de Ouro (NP) com superfície modificada e Imunoensaio Sanduiche. 4.8.1 Lâmina de Ouro com Superfície Modificada 4.8.1.1 Modificação Ambos os peptídeos foram imobilizados na superfície de lâminas de ouro de 1x1x0.04 polegadas da EMF-Dynasil© previamente limpas com solução piranha (H2SO4; H2O2, 3:1, v/v) por 10 minutos e lavadas abundantemente com água deionizada e secas com nitrogênio. As lâminas de ouro foram enriquecidas com solução de ácido 11-MUA a 50 mM por 48 horas, para funcionalizar com cargas negativas dos grupos COO- do tiol. O intuito desse enriquecimento é criar na superfície pontos de ligação para aumentar a adsorção dos grupos NH3 + dos polímeros e peptídeos. Após esse pré-tratamento as lâminas foram incubadas por 1 horas com o polímero PEI(175,176) (0,2mg/ml) para o peptídeo FRMD8 e com o polímero Quitosana(177) (0,2mg/mL) para o peptídeo ATP sintase. Os polímeros têm caráter positivo e foram utilizados para atuarem como uma cola para os peptídeos. Após a incubação com os polímeros as lâminas foram lavadas com água miliQ e secas com nitrogênio. Nesse momento, as lâminas foram incubadas com os peptídeos a 0,1mg/ml por 1 hora em temperatura ambiente. Após foram lavadas com água miliQ e secas com nitrogênio. Então foram incubadas por 30 minutos com solução de BSA a 5% para evitar interações inespecíficas, figura 21. Após foram lavadas com água miliQ e secas com nitrogênio. Nesse ponto foi montado o ensaio sanduiche (descrito no item 4.8.3). Figura 21: Esquema demonstrando as etapas de modificação da superfície da lâmina de ouro. Fonte: Arquivo pessoal. 4.8.1.2 Caracterização Para a caracterização da modificação da superfície das lâminas foi usada a técnica de espectroscopia de absorção de reflexão de infravermelho modulado polarizado (PM-IRRAS). Essa é uma técnica espectroscópica de infravermelho reflexivo sensível à superfície que mede os modos vibracionais de adsorvatos em uma superfície. A luz infravermelha é refletida de uma amostra (metálica) em um ângulo rasante, em um ângulo de alta incidência, o que permite o aumento da sensibilidade da superfície. A adsorção de monocamada automontada em um substrato de ouro é o caso ideal para detectar espécies em uma superfície devido à adsorção espontânea e seus modos de estiramento C − H acentuados devido a uma monocamada bem ordenada em uma superfície. As monocamadas tioladas são facilmente adsorvidos às superfícies de ouro por meio do grupo de cabeça de ouro-tiol, deixando um grupo de cauda funcional. Além disso, as superfícies de ouro são altamente reflexivas e não oxidam no ar em comparação com outras superfícies metálicas, portanto, um sensor perfeito para medir a adsorção(178,179). Para tal, foi usado o equipamento KSV PMI 550 (KVS Instrument©, Helsinque, Finlândia) e analisado pelo software IRRAS 1.0.5. Para tal, foram feitos 600 espectros com tempo de incidência de 1 segundo, resolução espectral de 4 cm-1 e ângulo de incidência de 80°. 4.8.2 Nanopartículas de Ouro com Superfície Modif