RESSALVA 

Atendendo solicitação do(a) 
autor(a), o texto completo desta tese 
será disponibilizado somente a partir 

de 21/02/2022. 



UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

 “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU – IBB 

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (GENÉTICA) 

Estudo da variabilidade das regiões promotora e codificadora do 

gene HLA-C e assinaturas de seleção natural atuando nestes 

segmentos 

ANDRÉIA DA SILVA SOUZA 

Botucatu - SP 

2020



 
 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

 “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU – IBB 

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (GENÉTICA) 

 

 

 

 

Estudo da variabilidade das regiões promotora e codificadora do 

gene HLA-C e assinaturas de seleção natural atuando nestes 

segmentos 

  

 

ANDRÉIA DA SILVA SOUZA 

ORIENTADOR: PROF. DR. ERICK DA CRUZ CASTELLI 

 

Tese apresentada ao Instituto de Biociências, 

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita 

Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do 

título de Doutora pelo Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas (Genética).  

 

 

 

 

Botucatu – SP 

2020 



FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. 

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500  
 

    

 Souza, Andréia da Silva. 
   Estudo da variabilidade das regiões promotora e 

codificadora do gene HLA-C e assinaturas de seleção natural 

atuando nestes segmentos / Andréia da Silva Souza. - Botucatu, 

2020 

 

   Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio 

de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu 

   Orientador: Erick da Cruz Castelli 

   Capes: 20200005 

 

   1. Antígenos HLA-C. 2. Genes MHC Classe I. 3. Variação 

genética. 4. Seleção natural. 5. Benin. 6. Brasil. 

 

 

Palavras-chave: Benin; Brasil; HLA-C; seleção natural; 

variabilidade. 
 

  

 



 
 

Andréia da Silva Souza 

 

 

Estudo da variabilidade das regiões promotora e codificadora do gene 

HLA-C e assinaturas de seleção natural atuando nestes segmentos 

 

English Title: HLA-C promoter and coding genetic diversity and evolutionary 

aspects 
 

 

 
Orientador: Profº. Dr. Erick C. Castelli 

 

 

Comissão examinadora 

 

 

 

_____________________________________ 

Prof. Dr. Erick C. Castelli 

Universidade Estadual Paulista (UNESP) 

 

 

_____________________________________ 

Prof. Dr. Diogo Meyer 

 Universidade de São Paulo (USP)  

 

 

_____________________________________ 

Prof. Dr. Celso Teixeira Mendes-Junior 

Universidade de São Paulo (USP) 

 

 

_____________________________________ 

Profa. Dra. Norma Lucena Cavalcanti Licinio da Silva 

Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhaes 

 

 

_____________________________________ 

Profa. Dra. Camila Ferreira Bannwart 

Universidade Estadual Paulista (UNESP) 

 

 

 

 

 

 

Botucatu, 21 de fevereiro de 2020  



 
 

Dedicatória 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedico este trabalho... 

 

 

 

 

 

 
Aos meus pais Antônio e Lourdes que são meu porto seguro e sempre apoiam minhas 

decisões. Obrigada por toda dedicação e amor.  



 
 

Agradecimentos  

❖ Agradeço primeiramente a Deus por ter guiado os meus passos até aqui e pela sua 

constante presença em minha vida.  

❖ Aos meus pais Antônio e Lourdes, ao meu irmão Tony, minha cunhada Luana e meu 

sobrinho Anthony pelo amor e apoio incondicional em todos os momentos. 

❖ Às minhas tias Rose e Lêda por cuidar de mim, sempre me incentivar, aconselhar, 

apoiar minhas decisões e pela frase “Qualquer coisa, estamos aqui, viu!”. 

❖ A todos familiares e amigos que mesmo distantes estão sempre torcendo e ajudando 

em minha caminhada. 

❖  Ao meu namorado Marlon Jocimar, por todo companheirismo, cuidado e zelo comigo 

e por me incentivar sempre. Obrigada por tornar essa jornada mais leve. 

❖ À minha querida amiga Thálitta Ayala, por estar sempre ao meu lado e por ser a mão 

amiga a me ajudar sempre que precisei. Obrigada pelas conversas, pelos conselhos, 

por sempre me animar, pelo cuidado e pela amizade que nos sustentou em tantos 

momentos de dificuldade e que também nos trouxe tanta alegria e sorrisos durante 

essa jornada. 

❖ À minha querida amiga Letícia Pastore Mendonça pela companhia, pelos conselhos, 

pelas boas conversas, risadas e pelos cafezinhos da tarde sempre cheios de histórias de 

vida, de família, de força e de superação que nos ajudou muitas vezes a aguentar a 

saudade de casa e as dificuldades do dia a dia. Muito obrigada. 

❖ Às minhas amigas Rosemary Cristina e Luciana Pizzani pelo acolhimento, carinho e 

amizade que sempre encontro em vocês.  

❖ Aos amigos especiais que fizeram parte dessa jornada Iane de Oliveira Pires Porto, 

Michelle de Almeida Paz e Neilton Paulo Bezerra. Aprendi a amar cada um com seu 

jeito único e foi maravilhoso contar com a amizade de vocês durante esse período.  

❖ Aos amigos e colegas de trabalho do GemBio Heloisa de Souza Andrade, Marília 

Rodrigues Silva Passos, Nayane dos Santos Brito Silva, Emiliana Weiss, Hecttor 

Sebastian Baptista, Arielle Lima da Rocha, Gabriela Pereira de Carvalho e Camila 

Ferreira Bannwart que fizeram parte dessa jornada e trouxeram tantos aprendizados, 



 
 

estiveram ao meu lado em momentos difíceis e momentos de muita descontração e 

boas risadas. Obrigada pelos conhecimentos e sonhos compartilhados, pela amizade e 

principalmente pelas sessões de terapia. 

❖ Aos amigos de Botucatu que me acolheram aqui e se tornaram a família de Botucatu.  

❖ Aos professores que fizeram parte da banca de qualificação deste trabalho, Dr. Ivan 

de Godoy Maia, Dra. Claudia Aparecida Rainho e Dr. Ramon Kaneno pelas 

contribuições científicas. 

❖ Aos professores que compuseram a comissão examinadora desta tese, pelas correções 

e contribuições. 

❖ Ao meu orientador Prof. Dr. Erick C. Castelli, por contribuir com o meu aprendizado 

e com minha formação acadêmica, pelos conselhos, pela oportunidade e por inspirar 

seus alunos com sua dedicação e profissionalismo. Muito obrigada, Professor!  

❖ À Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita Filho, Campus de Botucatu, pela 

infraestrutura oferecida e pela oportunidade de construir minha formação científica 

nessa instituição. 

❖ A todos os profissionais da UNESP com os quais tive contato durante esse período de 

formação. 

❖  Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética), pela oportunidade 

e credibilidade no desempenho do projeto.  

❖ À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela 

concessão da bolsa de doutoramento.  

❖ À Fundação de Amparo e Apoio a Pesquisa (FAPESP) pelo financiamento do projeto de 

pesquisa realizado pelo grupo, processo n° 2013/17084-2, do qual faz parte a 

pesquisa apresentada nesta tese. 

❖ E a todos que fizeram parte dessa caminhada: muito obrigada! 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Quem acende uma luz é o primeiro a se beneficiar da claridade.” 

G. K. Chesterton   



 

 

SUMÁRIO 
 

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 4 

LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................... 5 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................................... 6 

RESUMO .......................................................................................................................................... 7 

ABSTRACT ...................................................................................................................................... 8 

CAPÍTULO I-REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 9 

INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 10 

Estrutura e função das moléculas HLA de classe I 11 

HLA-C e suas características particulares 17 

Seleção Natural atuando sobre os genes HLA 21 

Testes de desvio de neutralidade e demografia das populações estudadas 25 

OBJETIVOS ................................................................................................................................... 28 

Objetivo Geral 28 

Objetivos específicos 28 

REFERÊNCIAS .............................................................................................................................. 29 

CAPÍTULO II-ARTIGO ................................................................................................................. 37 

ARTICLE ........................................................................................................................................ 38 

ABSTRACT .................................................................................................................................... 39 

1. INTRODUCTION ................................................................................................................... 40 

2. MATERIALS AND METHODS ............................................................................................ 42 

2.1. Brazilian samples 42 

2.2. Beninese samples 42 

2.3. HLA-C gene amplification and sequencing libraries 43 

2.4. Raw data processing, mapping, and genotyping 43 

2.5. Phasing and HLA-C allele calling 44 

2.6. Other analyses 45 

3. RESULTS ............................................................................................................................... 46 

3.1. HLA-C genetic diversity 46 

3.2. HLA-C evolutive aspects 48 

4. DISCUSSION ......................................................................................................................... 49 

SUPPLEMENTAL MATERIAL .................................................................................................... 62 

REFERENCE .................................................................................................................................. 81 

CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................................... 86 

ANEXOS ........................................................................................................................................ 87 



 

4 
 

Lista de Figuras 

 

Lista de Figuras – Capítulo I 

  
Figura 1.  Representação esquemática da estrutura de uma molécula de MHC de classe I e 

apresentação de antígeno às células T CD8.............................................................................. 11 

Figura 2. Processamento de antígeno pela via de moléculas MHC de classe I ........................ 12 

Figura 3. Visão geral esquemática da fenda de ligação a peptídeos ......................................... 14 

Figura 4. Representação esquemática das características distintas da molécula HLA-C ......... 19 

 

Lista de Figuras – Capítulo II 

Figure 1.  Nucleotide diversity and Tajima’s D at the HLA-C promoter, CDS and 3’UTR....61 

 

Lista de Figuras - Material Suplementar 

Figure S1. Linkage Disequilibrium (LD) between pair of single nucleotide polymorphisms 

(SNPs) of the HLA-C locus, considering genomic positions from 3’UTR to Promoter 

(31268757- 31273596, from hg38).  ........................................................................................ 63 

Supplemental alignment 1. HLA-C promoter sequences in two population samples (Brazil and 

Benin). ...................................................................................................................................... 64 

Supplemental alignment 2. HLA-C 3’UTR sequences in two population samples (Brazil and 

Benin). ...................................................................................................................................... 68 

 

 

 

 

 

file:///C:/Users/thalitta/Desktop/Versão%20Completa_Qualificação_Final.docx%23_Toc494290785
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5 
 

Lista de Tabelas 

 

Lista de Tabelas - Capítulo I 

 

Tabela 1. Número de alelos identificados para os genes de classe I (The IPD-IMGT/HLA 

Database, versão 3.38.0. ........................................................................................................... 10 

 

Lista de Tabelas - Capítulo II 

Table 1. List of HLA-C promoter sequences in two population samples from Brazil and Benin, 

their frequencies and the HLA-C molecules associated with them. ......................................... 55 

Table 2. List of HLA-C CDS sequences detected in two population samples from Brazil and 

Benin, and their frequencies. .................................................................................................... 56 

Table 3. List of HLA-C encoded proteins detected in two population samples from Brazil and 

Benin, and their frequencies. .................................................................................................... 57 

Table 4.  List of HLA-C 3’UTR sequences detected in two population samples from Brazil and 

Benin, and their frequencies. .................................................................................................... 57 

Table 5. List of HLA-C extended haplotypes detected in two population samples from Brazil 

and Benin, and their frequencies. ............................................................................................. 58 

Table 6. Nucleotide diversity and Neutrality tests across the HLA-C locus............................. 60 

Table 7.  dN/dS ratio test of the HLA-C exons and CDS. ........................................................ 60 

 

Lista de Tabelas - Material Suplementar 

Table S1. List of all variants observed across HLA-C and the reference allele frequency in 

Brazil and Benin, as genotyped by the GATK HaplotypeCaller. ............................................. 70 

Table S2. List of the HLA-C genomic alleles and their frequencies in Brazil and Benin. ...... 78 

Table S3. Amino acid exchanges and their frequencies in Brazil and Benin. .......................... 79 

 

 

 

file:///C:/Users/thalitta/Desktop/Qualificação_Final/Qualificação_%20de_%20doutorado_PG_Genética_Thálitta%20Ayala.docx%23_Toc494368091
file:///C:/Users/thalitta/Desktop/Qualificação_Final/Qualificação_%20de_%20doutorado_PG_Genética_Thálitta%20Ayala.docx%23_Toc494368091
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6 
 

Lista de Abreviaturas e Siglas 

 

 

APC Célula Apresentadora de Antígeno (do inglês, Antigen Presenting Cell) 

ATP Adenosina Trifosfato (do inglês, Adenosine triphosphate) 

BiP Proteína Ligação de imunoglobulina (do inglês, Binding Immunoglobulin Protein) 

CTL Linfócito T Citotóxico 

DNA Ácido Desoxirribonucleico (do inglês, Deoxyribonucleic acid) 

ERAAP Aminopeptidases Associadas ao Processamento de antígeno do Retículo Endoplasmático 

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês, Human Immunodeficiency Virus) 

HLA Antígeno Leucocitário Humano (do inglês, Human Leukocyte Antigen) 

IFN Interferon 

IMGT International Immunogenetics Database 

KIR Receptor do tipo imunoglobulina (KIR, do inglês Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor) 

KIRV Resíduo formado pelos aminoácidos Lisina (K), Isoleucina (I), Arginina (R) e Valina (V) 

Kb Kilobase (103 bases) 

LD Desequilíbrio de Ligação (Linkage Disequilibrium) 

Mb Megabase (106 bases) 

MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade (do inglês, Major Histocompatibility complex) 

mRNA Ácido Ribonucleico mensageiro ou RNA mensageiro  

NK Célula Assassina Natural (do inglês, Natural Killer) 

NT Não Traduzida 

Pb Pares de bases 

PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction) 

RE Retículo Endoplasmático 

SNP Polimorfismo de base única (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism) 

TAP Transportador associado ao processamento de antígeno (do inglês, Transporter Associated 

with Antigen Processing) 

TCR Receptor de célula T 

TNF Fator de Necrose Tumoral 

UTR Região não traduzida (do inglês, Untranslated region) 
 

 



 

7 
 

RESUMO  

O gene HLA-C está localizado dentro do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), 

a região mais variável do genoma humano. HLA-C codifica moléculas que participam 

principalmente do processo de apresentação de antígenos intracelulares aos linfócitos T 

citotóxicos e interage com receptores presentes nas células NK, modulando sua atividade. A 

variabilidade das moléculas HLA permite a apresentação de diferentes peptídeos por um mesmo 

indivíduo e aumenta o repertório de peptídeos apresentados por uma população. Além disso, 

HLA-C é expresso na interface materno-fetal pelo trofoblasto, onde possui uma importante 

função imunomodulatória por meio da interação com receptores KIR das células NK maternas. 

Devido a sua dupla função, alguns alelos de HLA-C ou combinações de alelos HLA-C/KIR têm 

sido associados a diversos contextos fisiológicos e patológicos. Contudo, a variabilidade desse 

gene tem sido explorada principalmente para os éxons, em especial os éxons 2 e 3, que 

codificam os domínios de ligação ao peptídeo, enquanto a variabilidade de outros segmentos 

gênicos importantes (como outros éxons, íntrons e regiões regulatórias) foram pouco estudadas. 

Este estudo avaliou a variabilidade genética e assinaturas de seleção natural ao longo do gene 

HLA-C em uma amostra de 418 indivíduos do Brasil e 108 indivíduos do Benin.  Considerando 

as duas populações, detectamos 359 sítios de variação ao longo da região analisada. Os 

haplótipos promotores, codificadores e de 3’NT apresentaram uma correlação direta, com alelos 

que codificam proteínas semelhantes (grupos alélicos) associados a sequências específicas de 

promotores e de 3’NT. Observamos alta diversidade nucleotídica ao longo de todo o gene, com 

com destaque para o segmento que codifica o domínio transmembrana. Na região promotora 

foi encontrada a menor diversidade nucleotídica em uma região próxima à posição -700, um 

segmento monomórfico de 115pb que é compartilhado entre diferentes primatas. Para a 3’NT 

foi encontrada alta diversidade na segunda metade deste segmento, porém baixa diversidade no 

trecho inicial. Nas duas populações foram detectados valores positivos de D de Tajima e valores 

negativos de F de Ewens-Watterson para quase todos os segmentos do gene HLA-C, 

compatíveis com seleção balanceadora atuando em todo o gene. Além disso, ambas as 

populações apresentaram evidência de seleção positiva para o éxon 1, que é responsável por 

codificar o peptídeo de sinal. As frequências dos motivos HLA-C previamente associados à 

interação com KIR e regulação da expressão são semelhantes entre as duas populações, porém 

há mudanças na frequência de aminoácidos que influenciam o repertório de peptídeo ligantes, 

indicando que o repertório peptídico apresentado por essas populações pode ser diferente. Essas 

populações apresentam grandes diferenças na frequência de aminoácidos no segmento 

transmembrana e também no primeiro aminoácido do domínio alfa-1, mas não está claro se 

essas modificações alteram a função e a estabilidade do HLA-C. Estudos funcionais ainda são 

necessários para o melhor entendimento sobre a relação entre o padrão de variabilidade de HLA-

C e sua expressão, capacidade de apresentação antigênica, estabilidade e perfil de ligação 

KIR/HLA-C.  

 

Palavras-chave: HLA-C, variabilidade, seleção natural, NGS, Brasil, Benin. 

  



 

8 
 

ABSTRACT 

 
Human Leucocyte antigen-C (HLA-C) is a classical HLA class I molecule that binds and 

presents peptides to cytotoxic T lymphocytes in the cell surface. HLA-C has a dual function 

since it also interacts with KIR receptors expressed in NK and T cells, modulating their activity. 

The structure and diversity of the HLA-C regulatory regions, as well as the relationship among 

variants along the HLA-C locus, is poorly addressed, and no population-based study explored 

the complete HLA-C variability in different population samples. Here we first present a new 

molecular and bioinformatics method to evaluate the full HLA-C segment, including regulatory 

sequences. Then, we applied this method to survey the HLA-C diversity in two geographically 

distinct population samples, one admixed from Brazil (São Paulo State) and one less admixed 

from Benin. Our results indicate that the HLA-C promoter and 3’UTR are very polymorphic, 

with the presence of few but highly divergent haplotypes. However, both these regulatory 

regions present conserved segments that are shared among different primates. Nucleotide 

diversity was higher in other exonic segments rather than exons 2 and 3, and also higher in the 

second half of the 3’UTR region. We detected evidence of balancing selection on the 

entire HLA-C locus and positive selection in exon 1, for both populations. HLA-C motifs 

previously associated with KIR interaction and expression regulation are similar between both 

populations, but the frequency of amino acids influencing peptide-binding is different between 

samples. Each allele group is associated with specific regulatory sequences, supported by the 

high linkage disequilibrium along the entire HLA-C locus in both populations. 

 

Key words: HLA-C, variability, natural selection, NGS, Brazil, Benin. 
 

  



 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Capítulo I-Revisão de Literatura



 

10 
  

INTRODUÇÃO 

 

Os Antígenos Leucocitários Humanos (HLA, do inglês Human Leucocytes Antigens) 

são moléculas envolvidas no controle da reposta imunitária, principalmente no processo de 

apresentação de peptídeos aos linfócitos T (Shiina et al., 2004; Shiina et al., 2009). Os genes 

HLA estão localizados dentro do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês 

Major Histocompatibility Complex), no braço curto do cromossomo seis, em 6p21.3. Esse 

complexo possui aproximadamente 250 genes distribuídos em ~4Mb e está dividido 

didaticamente em três grupos ou classes, denominados classe I, II, ou III (Shiina et al., 2004; 

Shiina et al., 2009).  Os genes HLA de classe I são responsáveis pela codificação de proteínas 

ligadas à membrana celular e possuem um papel essencial no desempenho da resposta imune 

inata e adaptativa, podendo interagir com receptores dos linfócitos T citotóxicos ou CD8+ e de 

células Natural Killer (NK). Essa classe de genes pode ainda ser subdividida em genes HLA de 

classe I clássicos ou Ia (HLA-A, HLA-B e HLA-C), associados principalmente a apresentação 

antigênica, e não clássicos ou Ib (HLA-E, HLA-F e HLA-G) que desempenham funções 

imunomodulatórias (Klein and Sato, 2000; Blais et al., 2011; Donadi et al., 2011). Os genes de 

classe I, principalmente os loci HLA-A, HLA-B e HLA-C, constituem os genes mais variáveis 

do genoma humano (Klein and Sato, 2000; Bernatchez and Landry, 2003; Abbas et al., 2011). 

Atualmente, cerca de 18.441 diferentes alelos para estes genes estão depositados no banco de 

dados oficial para HLA (The IPD-IMGT/HLA Database) (Robinson et al., 2015) (Tabela 1).  

Tabela 1. Número de alelos identificados para os genes de classe I (The IPD-IMGT/HLA Database, 

versão 3.39.0 de 20-01-2020).  

 
CLASSE I CLÁSSICOS CLASSE I NÃO CLÁSSICOS 

Gene Alelos Proteínas Gene Alelos Proteínas 

HLA-A 5.907 3.720 HLA-E 84 15 

HLA-B 7.126 4.604 HLA-F 44 6 

HLA-C 5.709 3.470 HLA-G 69 19 

Total 18.742 11.794 Total 197 40 

 

A região da classe II abrange aproximadamente 0,7 Mb de DNA e contém os genes que 

codificam as cadeias α e β dos HLA de classe II clássicos, HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR. Essas 

moléculas são expressas na superfície de células  apresentadoras de antígenos (APC, do inglês 

Antigen Presenting Cell) e apresentam antígenos exógenos às células T auxiliares ou CD4+. A 

região da classe III, localizada entre as regiões de classe I e classe II, apresenta alta densidade 



 

11 
  

gênica, com aproximadamente um gene a cada 14.516 nucleotídeos, e contém genes do sistema 

complemento (e.g., C2 e C4) genes de citocinas (e.g., TNF, LTA e LTB) e muitos genes sem 

relação direta conhecida com a função imunitária ou inflamação (Horton et al., 2004; Shiina et 

al., 2004; Shiina et al., 2009). 

Estrutura e função das moléculas HLA de classe I 

Estruturalmente, as moléculas de classe I clássicas e não clássicas são semelhantes, 

sendo compostas por uma cadeia pesada α associada não covalentemente a uma cadeia leve de 

β2-microglobulina (β2m), codificada por um gene localizado no cromossomo 15 (Abbas et al., 

2011). A cadeia α codificada pelos genes HLA de classe I é composta por cinco domínios: 

domínios α1 e α2, que constituem o sítio de ligação a peptídeos; domínio α3 semelhante à 

imunoglobulina, que interage com o co-receptor CD8 dos linfócitos; domínio transmembrana 

e domínio citoplasmático (Klein and Sato, 2000; Alberts et al., 2015) (Figura 1).   

No entanto, moléculas clássicas e não clássicas são diferencialmente expressas e 

possuem funções diferentes. As moléculas HLA de classe I clássicas (HLA-A, HLA-B e HLA-

C) são expressas pela maioria das células somáticas e atuam principalmente no processo de 

apresentação de antígenos intracelulares aos linfócitos T citotóxicos ou TCD8+. As moléculas 

HLA de classe I não clássicas (HLA-E, HLA-F e HLA-G) possuem expressão celular mais 

restrita e desempenham principalmente um papel imunomodulatório, por meio de ligações com 

receptores específicos em células do sistema imune, tais como monócitos, células T, B e NK 

(Natural Killer) (Klein and Sato, 2000; Lepin et al., 2000; Pietra et al., 2009; Donadi et al., 

2011). No entanto, há evidências de que as moléculas não clássicas também participam da 

apresentação antigênica (D'souza et al., 2019).  

 

Figura 1.  Representação esquemática da estrutura de uma molécula de MHC de classe I e apresentação de antígeno 

às células T CD8 (Adaptado de Li et al., 2016). 



 

12 
  

As duas cadeias polipeptídicas das moléculas HLA de classe I (α e β2m), são 

sintetizadas separadamente e são associadas na superfície luminal do retículo endoplasmático 

(RE) pela ação de chaperonas, como a calreticulina, BiP (do inglês, Binding immunoglobulin 

Protein), p57 do retículo endoplasmático e calnexina (Yewdell et al., 2003; Parcej and Tampé, 

2010; Abbas et al., 2011; Eggensperger and Tampé, 2015). Os peptídeos que serão associados 

às moléculas de HLA de classe I são gerados por um complexo multiprotéico denominado 

proteassoma, responsável pela degradação de proteínas citoplasmáticas, em um processo 

dependente de ubiquitina e ATP (ATP, do inglês, Adenosine triphosphate) (Yang et al., 1996). 

Esses peptídeos são transportados ao lúmen do RE por meio do Transportador Associado ao 

Processamento de Antígeno (TAP), onde se associam as moléculas de HLA de classe I com o 

auxílio do complexo de carregamento de peptídeos (formado por TAP e chaperonas). A tapasina 

é uma chaperona fundamental para a ligação do peptídeo e interage diretamente com a molécula 

de MHC I (Hulpke et al., 2012; Blees et al., 2017) (Figura 2).  

 

Figura 2. Processamento de antígeno pela via de moléculas MHC de classe I (Adaptado de Parcej e Tampé, 2010).  

As moléculas HLA de classe I associam-se a peptídeos de aproximadamente 8 a 9 

aminoácidos (AA), dando origem aos complexos HLA-peptídeo (Yang et al., 1996). Peptídeos 

maiores precisam ser clivados pelas aminopeptidases associadas ao processamento de antígeno 

do RE (ERAAP) e assim adquirir o tamanho adequado para ligar a fenda de ligação a peptídeo 

da molécula HLA (Yewdell et al., 2003; Parcej and Tampé, 2010; Blees et al., 2017). Dada a 

ligação peptídica bem-sucedida, o complexo HLA-peptídeo se dissocia do complexo de 



 

13 
  

carregamento de peptídeos para ser exportado à superfície celular através da via secretora 

padrão. Na superfície celular, o complexo HLA-peptídeo será reconhecido pelos Receptores 

das Células TCD8+ (TCR, do inglês, T-cell Receptor) (Parcej and Tampé, 2010) (Figura 2). 

Os peptídeos apresentados pelas moléculas HLA de classe I são, em sua maioria, 

citosólicos, oriundos de proteínas virais, de microrganismos intracelulares, da degradação de 

proteínas próprias ou ainda proteínas de células transformadas (Alberts et al., 2015; Rock et al., 

2016). Uma vez que os receptores dos linfócitos TCD8+ tenham reconhecido peptídeos não-

próprios via MHC, eles serão ativados, se diferenciarão em linfócitos efetores e podem então 

reconhecer qualquer célula alvo expressando os mesmos complexos HLA-peptídeo (Alberts et 

al., 2015). Em conjunto as interações HLA/peptideo-TCR, HLA-CD8, moléculas de adesão e 

proteínas de sinalização intracelular, na interface entre as duas células (célula infectada e 

linfócito T), formam uma sinapse imunológica. A resposta citotóxica dos linfócitos T contra a 

célula infectada/alterada ocorre por meio da liberação de proteases no espaço sináptico ou por 

induzir a célula alvo à apoptose (Yang et al., 1996; Alberts et al., 2015). 

O conjunto HLA-peptídeo interage com os TCRs, porém, os resíduos polimórficos no 

topo das alfas hélices das moléculas HLA são a base para especificidade de TCRs para uma 

forma alélica particular de MHC associada a um peptídeo antigênico (fenômeno chamado 

restrição de MHC) (Rock et al., 2016). Isso ocorre porque as moléculas de HLA estão 

diretamente envolvidas na seleção do repertório de células T durante a fase de maturação no 

timo. O processo de seleção de linfócitos (timócitos) garante um repertório de células T 

funcionais, ou seja, capazes de interagir com moléculas de HLA do indivíduo. Apenas linfócitos 

portando TCRs que interagem com MHC-peptídeo próprio são selecionados (processo 

conhecido como seleção positiva) (Klein et al., 2014). Além disso, o processo de maturação 

tímica fornece um repertório de linfócitos autotolerantes, impedindo que linfócitos portando 

TCRs com forte afinidade por MHC-peptídeo próprio sejam liberados na circulação periférica 

(seleção negativa) (Sebzda et al., 1999; Wiegers et al., 2011; Klein et al., 2014). A falha nesse 

processo é considerada um dos principais mecanismos associados ao desenvolvimento de 

doenças autoimunes. Entretanto linfócitos com potencial autorreativo que escapam à seleção 

negativa e adentram a circulação periférica podem ainda ser inativados, suprimidos ou 

eliminados pela tolerância periférica para não desencadear autoimunidade (Ohashi, 2002; 

Abbas et al., 2011; Wiegers et al., 2011).  

Assim, além da capacidade de apresentar antígenos, as moléculas HLA também são 

responsáveis pela seleção de células T aptas a distinguir adequadamente entre antígenos 



 

14 
  

próprios e não próprios. Deste modo, as moléculas HLA tem importante implicação em 

contextos fisiológicos e patológicos, relacionadas com autotolerância e autoimunidade, defesa 

contra patógenos, tumores e rejeição a transplantes alogênicos. 

A habilidade das moléculas HLA de classe I clássicas de apresentar diversos peptídeos 

diferentes é devido à grande variabilidade existente nos domínios de ligação ao peptídeo 

(codificada pelos éxons 2 e 3). De fato, os resíduos polimórficos da fenda de ligação modificam 

a especificidade de ligação a peptídeos, porque modificam os bolsões (do inglês, pockets) que 

são preenchidos pelas cadeias laterais de aminoácidos dos peptídeos antigênicos (os chamados 

resíduos âncoras). Cada peptídeo antigênico tem poucos resíduos âncoras, que são aminoácidos 

específicos para ligação aos bolsões da molécula HLA. Os demais aminoácidos próximos aos 

resíduos âncoras, que interagem com a fenda, podem variar entre todas as possibilidades dos 

20 aminoácidos conhecidos (Rock et al., 2016) (Figura 3). Isso permite que o repertório de 

peptídeos apresentados por uma molécula de HLA seja bastante vasto.  

 

Figura 3. Visão geral esquemática da fenda de ligação a peptídeos. a) Painel apresentando os ‘pockets’ de A a F 

na fenda de ligação a peptídeo de uma molécula de MHC de classe I (diferenciados por um mapa de cores), com 

as posições dos AA na molécula (Adaptado de Van Deutekom e Keşmir, 2015). b) Fenda de ligação do MHC de 

classe I com petídeo antigênico do ‘pocket’, o peptídeo é um nonâmero com dois resíduos âncoras nas posições 1 

e 6 (Adaptado de (Kloetzel, 2001).   

 

De tal modo, a substituição de um único aminoácido na fenda de ligação ao peptídeo 

pode ter efeito no repertório de peptídeos compatíveis com uma determinada molécula HLA, 

porém depende da posição substituída e das propriedades físico-químicas dos aminoácidos 

envolvidos (Van Deutekom and Keşmir, 2015; Kaur et al., 2017). De forma semelhante, a 

mudança de um resíduo âncora de um epítopo antigênico pode impedir sua ligação e 

apresentação por uma determinada molécula HLA (Rock et al., 2016).  

Van Deutekom e Keşmir (2015) usaram um método in silico para estudar o efeito de 

mutações únicas no repertório de peptídeos de várias molélulas HLA-A e HLA-B e mostraram 



 

15 
  

que as posições que mais alteram a ligação peptídica são as mais polimórficas. No entanto, as 

posições que raramente variam entre as moléculas HLA parecem não interferir no repertório de 

peptídeos apresentados. O mesmo estudo demonstrou que o efeito, no repertório de peptídeo 

ligantes, causado por uma substituição na fenda peptídica é significativamente maior em 

moléculas de HLA-B em comparação com as moléculas de HLA-A. Considerando que uma 

nova molécula HLA com um repertório de peptídeos alterado seja mantida na população, caso 

proporcione vantagens adaptativas,  novas moléculas de HLA-B poderiam evoluir facilmente 

através de mutações pontuais e, portanto, alcançar uma maior diversidade a nível populacional 

(Van Deutekom and Keşmir, 2015). 

Além da ampla gama de peptídeos que podem ser apresentados por cada molécula HLA 

de classe I individualmente, especialmente os genes clássicos que são muito polimórficos (ver 

Tabela 1), o repertório é ainda maior quando consideramos a redundância dessas moléculas na 

superfície celular. Cada indivíduo pode ter de três a seis moléculas HLA de classe I clássicas, 

considerando a co-expressão dessas moléculas e dependendo dos alelos herdados (Rock et al., 

2016).  

A maior diversidade alélica dos genes HLA aumenta a capacidade de apresentação 

antigênica, favorecendo uma melhor adaptabilidade em um contexto de resposta a patógenos e 

combate a células tumorais. Todavia, essa elevada diversidade alélica pode representar um 

problema para a compatibilização genotípica entre dois indivíduos (doador e receptor) no 

contexto do transplante alogênico. Rejeições a enxertos já foram associados a pequenas 

diferenças (variações) na fenda ligadora de peptídeos das moléculas HLA dos doadores e 

receptores (Choo, 2007; Ayala García et al., 2012; Tiercy, 2014).  

Ainda, é válido ressaltar que apesar da elevada diversidade nucleotídica dos genes HLA 

estar associada a uma melhor capacidade de apresentação antigênica no contexto de resposta a 

patógenos e células tumorais, os vírus e as células tumorais podem evadir a resposta 

imunológica por meio de mecanismos que afetem o processo de apresentação antigênica 

(Seliger et al., 2006).  

Além da modificação de resíduos âncoras para evitar a ligação à molécula HLA, como 

já citado, os patógenos podem também: (a) escapar da degradação proteasomal, evitando assim 

a produção de epítopos imunogênicos (Seliger et al., 2006); (b) codificar proteínas que inibem 

o transportador de peptídeos (TAP) (Van Hall et al., 2007); (c) codificar proteínas que induzem 

a retenção de moléculas de MHC I no RE-Golgi (Ziegler et al., 2000); (d) codificar proteínas 

que deslocam as moléculas MHC de classe I do RE ao citosol, onde são rapidamente degradadas 



 

16 
  

pelo proteassoma (Wiertz, Jones, et al., 1996; Wiertz, Tortorella, et al., 1996) e/ou (e) reduzir 

a expressão MHC classe I por induzir endocitose dessas moléculas, acúmulo em vesículas 

endossomais e degradação (Schwartz et al., 1996).  

A ausência ou redução da expressão das moléculas HLA de classe I em células tumorais 

também tem sido frequentemente observada em muitas neoplasias malignas humanas e 

representa um importante mecanismo de escape da resposta imune (Campoli et al., 2002; 

Aptsiauri et al., 2007). A diminuição da expressão de componentes da maquinaria de 

processamento de antígenos da via HLA classe I (e.g., chaperonas e TAP) geralmente têm um 

impacto negativo no curso clínico dos tumores. Em um número substancial de neoplasias 

prostáticas, a maioria dos componentes da maquinaria de processamento de antígenos foi 

encontrada com expressão reduzida, com consequente redução ou ausência de HLA de classe I 

na superfície celular. Este fenômeno estaria relacionado com progressão e recorrência da 

doença (Seliger et al., 2010). 

Nesse sentido, as células NK são fundamentais na resistência do hospedeiro a infecções 

virais ou células tumorais, porque estão entre as primeiras células a detectar a liberação de 

citocinas pró-inflamatórias, bem como a redução da expressão de moléculas MHC de classe I 

na superfície de células infectadas (Jonjic et al., 2008). O reconhecimento de moléculas HLA 

por receptores KIR (do inglês, Killer cell Immunoglobulin like Receptor) ativatórios e 

inibitórios promove um equilíbrio de sinais que regulam a atividade de células NK (Parham, 

2004; Parham, 2005; Augusto and Petzl-Erler, 2015). Assim, a expressão reduzida de HLA na 

superfície celular pode induzir a ativação de células NK por ‘missing self’ (ausência do próprio) 

(Parham, 2004; Parham, 2005; Jonjic et al., 2008). Porém, os vírus adquiriram numerosos 

mecanismos destinados a subverter ou evadir a vigilância imune das células NK (Jonjic et al., 

2008; Béziat et al., 2017). As células tumorais também podem aumentar a expressão de HLA 

classe I não clássicos como mecanismo de escape da resposta imune, visto que estas moléculas 

desempenham funções imunomodulatórias por meio de ligações a receptores específicos em 

várias células do sistema imunológico (Paul et al., 1998; Ibrahim et al., 2001; Wiendl et al., 

2002; Bossard et al., 2012). 

Este cenário evidencia uma constante co-evolução entre patógenos e sistema imune, que 

no caso das moléculas HLA precisa favorecer a constante mudança no repertório de peptídeos 

que podem ser apresentados, o escape à regulação da expressão mediada por proteínas dos 

patógenos e manutenção de certa conservação em domínios importantes para interação com co-

receptores, receptores imunomodulatórios e moléculas da via de processamento de antígenos. 



 

17 
  

HLA-C e suas características particulares 

O gene HLA-C, alvo deste estudo, pertence à classe de genes mais polimórficos entre os 

genes HLA. Apesar disso, o estudo da variabilidade desse gene foi negligenciado por um longo 

tempo e HLA-C foi considerado pouco polimórfico comparado aos outros genes de classe I 

clássicos. Atualmente, conhecemos cerca de 5.709 alelos que codificam 3.470 proteínas HLA-

C diferentes (Tabela 1), variabilidade que acompanha a de outros genes clássicos como HLA-A 

e HLA-B. Porém, algumas características específicas de HLA-C, como a restrição peptídica e 

menor expressão na superfície celular, ainda o diferencia dos seus correlatos (Blais et al., 2011). 

 A menor expressão celular de HLA-C tem sido associada a vários fatores, tais como: 

(a) instabilidade do RNA mensageiro (Mccutcheon et al., 1995); (b) retenção prolongada da 

molécula HLA-C no interior do retículo endoplasmático por associação ineficiente da cadeia α 

pesada de HLA-C com a β2m (Neefjes and Ploegh, 1988), por interações estáveis da molécula 

HLA-C com TAP ou tapasina ou ainda por causa da restrição do repertório de peptídeos (Neisig 

et al., 1998; Sibilio et al., 2008), que é consequência da maior conservação nos domínios de 

ligação de peptídeos de HLA-C (Zemmour and Parham, 1992; Neisig et al., 1998; Turner et al., 

1998) (Figura 4) .  

O motivo KIRV (resíduos nas posições 66, 67, 69 e 76) na α hélice de HLA-C é 

extremamente conservado na maioria de seus grupos alélicos, exceto para a algumas proteínas 

do grupo HLA-C*07 e C*15, que tem uma mudança de aminoácido na posição Lys66Asn (IMGT 

database, 3.38.0) (Robinson et al., 2015). Esse motivo conservado é característico apenas de 

HLA-C, não está presente em outros genes HLA de classe I (exceto HLA-B*46) e parece 

favorecer uma rigorosa seleção/restrição do repertório de peptídeos. Além disso, KIRV confere 

maior associação de HLA-C às chaperonas TAP e tapasina e acúmulo intracelular por 

deficiência em montagem ou instabilidade pós montagem da molécula (Sibilio et al., 2008).  

Um estudo recente com dois alelos de HLA-C (HLA-C*05:01 e HLA-C*07:02) mostrou 

a influência dos domínios de ligação a peptídeo na expressão de superfície celular. HLA-C*05, 

mesmo com um promotor mais fraco que HLA-C*07 (avaliado por expressão do gene repórter 

luciferase), apresentou uma expressão duas vezes maior que HLA-C*07 na superfície celular. 

Ainda, a maior expressão de C*05 em relação a C*07 não foi consequente à regulação 

diferencial mediada pela porção 3’não traduzida (3’NT), uma vez que para descartar essa 

influência fora utilizada uma região do gene H-2Kb (MHC de classe I murino) do íntron 3 até a 

porção 3’NT, tornando esse segmento idêntico para ambos os alelos. O mesmo estudo mostrou 

que a fenda peptídica de HLA-C*05 é mais plana enquanto a de HLA-C*07 é mais profunda e 



 

18 
  

estreita. Essa característica permitia HLA-C*05 ligar um número de peptídeos três vezes maior 

que HLA-C*07, indicando que quanto maior a restrição a peptídeos, maior o acúmulo 

intracelular e menor a expressão na superfície celular (Kaur et al., 2017). Estes achados 

fornecem informações sobre a complexidade da regulação da expressão de HLA-C que depende 

de fatores pré-transcricionais (importante influência da região promotora), pós-trancricionais 

(regulação diferencial por ligação de microRNAs a região 3’NT) e pós-traducionais 

(montagem, estabilidade e ligação a peptídeos), sendo a última, dependente da sequência do 

alelo codificador. 

Contudo, outra característica de HLA-C é a imunomodulação, função característica de 

genes não-clássicos (Klein and Sato, 2000; Lepin et al., 2000; Pietra et al., 2009; Blais et al., 

2011; Donadi et al., 2011). O gene HLA-C é o único entre os genes HLA de classe I clássicos 

expresso na interface materno-fetal, junto com os genes não clássicos HLA-E,HLA-F e HLA-G 

(Hackmon et al., 2017). Vários estudos tem mostrado que combinações particulares de alelos 

HLA-C fetais e KIR inibitórios presentes nas células NK maternas são fundamentais para 

imunotolerância materno-fetal e sucesso da gravidez (Trowsdale and Moffett, 2008; Chazara et 

al., 2011). 

O HLA-C é considerado o mais importante entre os genes clássicos para a biologia das 

células NK (Parham, 2005). A variabilidade encontrada em algumas porções da molécula HLA-

C, em especial nas α hélices, pode modificar a afinidade com receptores KIR (Boyington and 

Sun, 2002). A presença de um dimorfismo na posição 80 da sequência de aminoácidos na 

molécula HLA-C define dois grupos de ligantes a receptores KIRs: HLA-C1 (Asn80), ligante 

dos KIRs inibitórios KIR2DL2 e KIR2DL3, e HLA-C2 (Lys80), ligante do inibitório KIR2DL1 

e do ativador KIR2DS1. O KIR ativador KIR2DS4 pode interagir com ambos os alótipos de 

HLA-C (Parham, 2005; Blais et al., 2011; Parham and Moffett, 2013). A capacidade de 

interagir com vários KIRs inibitórios e ativadores pode ser um dos motivos por que 

determinados alelos de HLA-C ou combinações específicas de alelos de HLA-C e KIR têm sido 

associados a um grande número de doenças autoimunes, alérgicas, inflamatórias, cânceres,  

abortos recorrentes, pré-eclâmpsia (Kulkarni et al., 2008; Kuśnierczyk, 2013), aloreatividade 

pós-transplantes e doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD, do inglês Graft versus Host 

disease) (Parham, 2005).  

A função imunomodulatória de HLA-C também aumentou as especulações sobre a 

importância dos níveis de expressão de HLA-C em infecções. A observação de que a proteína 

Nef do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, do inglês, Human Immunodeficiency Virus) 



 

19 
  

reduz a expressão de HLA-A e HLA-B, mas não de HLA-C e HLA-E (Le Gall et al., 1998; 

Cohen et al., 1999; Williams et al., 2002) (Figura 4) foi considerada um mecanismo de escape 

do vírus. A diminuição nos níveis de expressão das moléculas HLA-A e HLA-B permitiria ao 

vírus HIV escape da vigilância imunológica, neste caso, do reconhecimento pelas CTL, 

enquanto que a manutenção da expressão de HLA-C e HLA-E poderia favorecer a inibição de 

células NK (Williams et al., 2002; Blais et al., 2011). 

 

Figura 4. Representação esquemática das características distintas da molécula HLA-C (Adaptado de Blais; Dong 

and Rowland-Jones, 2011). 

Contrariando a visão de que a expressão de HLA-C favoreceria a infecção por HIV, 

estudos de variabilidade genética em porções regulatórias de HLA-C mostrou que variantes 

favorecendo a expressão do gene estão associadas ao controle da infecção por HIV.  Um 

polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) a -35 Kilobases (Kb) de distância do gene HLA-C 

(rs9264942 C) está associada a maior expressão de HLA-C e a uma menor carga viral (Fellay 

et al., 2007; Thomas et al., 2009). Esse polimorfismo foi ainda encontrado em desequilíbrio de 

ligação com outra variante na região 3’NT (rs67384697), que também favorece a expressão de 

HLA-C, uma variante do tipo inserção/deleção, com a deleção afetando a ligação do microRNA 

miR-148a (Thomas et al., 2009; Kulkarni et al., 2011; Blais et al., 2012; Chen et al., 2012). 

Ainda, Apps e colaboradores (2013) mostraram que o aumento da expressão de HLA-C em 

pacientes infectados pelo HIV, independentemente do alótipo, pode aumentar a resposta 

citotóxica de linfócitos T, apontando um efeito protetor da alta expressão de HLA-C (Apps et 

al., 2013). 

A contribuição de determinados alelos de HLA-C no controle de doenças infecciosas, 

como nos casos de infecções pelo vírus da hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus), 



 

20 
  

citomegalovírus (Kondo et al., 2004; Lauer et al., 2004; Bihl et al., 2005), HIV (Bihl et al., 

2005; Makadzange et al., 2010) e vírus Epstein–Barr (Ito et al., 2007), também tem sido 

descrita. Estes achados parecem estar relacionados a uma apresentação antígeno-específica por 

determinadas variantes de HLA-C. Além disso, respostas eficazes contra infecções virais podem 

ser mediadas por interações HLA-C/KIR. O receptor ativatório KIR2DS2 de células NK é capaz 

de ligar a moléculas HLA-C*01:02 associadas a peptídeos virais derivados de regiões 

conservadas de RNA helicases da superfamília dos flavivírus (vírus da dengue, Zika e da febre 

amarela) e do HCV, levando a ativação de células NK (Naiyer et al., 2017). É possível que 

todas essas respostas sejam impactadas positivamente pela maior expressão celular de HLA-C. 

De modo oposto, a maior expressão de HLA-C em doenças autoimunes, como doença 

de Crohn (Apps et al., 2013), ou maior expressão de um alótipo específico como HLA-C*06 

em psoríase, parece ter um efeito deletério (Majorczyk et al., 2014). Nesses casos, 

provavelmente, por aumento na expressão de alelos comprometidos com a apresentação 

antigênica e ativação de CTLs contra peptídeos próprios. A hipótese é reforçada pelo achado 

de efeitos epistáticos entre HLA-C e ERAP1 (ou ERAAP) na psoríase. A susceptibilidade a 

psoríase é aumentada em indivíduos que possuem polimorfismos em ERAP1 somente quando 

também apresentam o alelo de risco HLA-C (Strange et al., 2010).  A ERAP1 desempenha um 

papel importante no processamento de peptídeos de MHC classe I que serão apresentados a 

CTLs. De modo semelhante, também foi identificada relação entre os genes ERAP, KIR e 

HLA-C na suscetibilidade ao aborto espontâneo recorrente (Wilczyńska et al., 2019). Isso 

porque a mudança no repertório de peptídeos gerados por ERAP pode alterar o complexo HLA-

peptídeo e em consequência, alterar tanto a interação HLA-peptídeo-KIR como a interação 

HLA-peptídeo-TCR. 

Em transplantes alogênicos de medula óssea com incompatibilidades permissivas para 

o gene HLA-C, entre doador e receptor, a aloreatividade pós-transplante pode ser impactada 

pelo nível de expressão da molécula HLA-C. Desta forma, como o nível de expressão do alótipo 

de HLA-C incompatível pode influenciar o aloreconhecimento por CTL, alelos HLA-C de baixa 

expressão podem representar melhores chances para transplantes com incompatibilidades 

permissivas (Tiercy, 2014). Assim, é possível que a complexidade dos efeitos de HLA-C, em 

transplantes e em diversas patogenias, exceda a especificidade de ligação a peptídeo e inclua os 

diferentes níveis de expressão do gene, que podem modular o potencial da resposta imune. 

Entretanto, os mecanismos relacionados com a regulação da expressão não estão 

completamente elucidados, assim como a variabilidade inerente as regiões regulatórias 



 

21 
  

(promotora e 3’não-traduzida) do gene HLA-C e o impacto desta variabilidade na modulação 

da expressão gênica. Para a região 3’NT, os poucos estudos existentes apontam para uma 

influência de um polimorfismo na ligação do miR-148a-3p (Thomas et al., 2009; Chen et al., 

2012; Apps et al., 2013). Um outro estudo explorou a influência de variações na 3’NT 

relacionadas com os alelos C*07:02 e C*06:02 na regulação do HLA-C, em linhagens celulares 

homozigotas (Kulkarni et al., 2011).  

Em relação ao promotor do HLA-C, alguns estudos mostraram variantes que podem 

afetar a ligação de fatores de transcrição, como rs2395471 A/G, que está localizado em um 

motivo consenso de ligação do fator de transcrição Oct1 (Vince et al., 2016) e duas variantes 

regulatórias que influenciam a resposta ao  TNF-α (-196A>G, rs2524094) e IFN-γ 

(−166_−163delTCT, rs10657191) (Hundhausen et al., 2012). Outro estudo explorando a 

variabilidade na região promotora de HLA-C, porém em linhagens celulares homozigóticas para 

HLA classe I, mostrou que alguns grupos de alelos HLA-C tais como HLA-C *03, -C *07 e -C 

*17 têm variações em um ou mais motivos do ‘core’ promotor (Ramsuran et al., 2017). Esses 

três grupos alélicos HLA-C também apresentam a variante na região 3’NT com afinidade para 

o miR-148a-3p e o alelo rs2395471G na região promotora, ambos associados a baixos níveis 

de expressão de HLA-C na superfície celular (Vince et al., 2016; Ramsuran et al., 2017). 

Embora alguns estudos tenham demonstrado associações entre variantes regulatórias, 

alelos codificadores e perfis diferenciais de expressão, nenhum estudo explorou a variabilidade 

das regiões regulatórias e codificadora de HLA-C  em uma amostra populacional. Geralmente, 

os segmentos regulatórios e íntrons de HLA-C são desconsiderados na maioria dos estudos 

abordando sua variabilidade. Ainda, o banco de dados IPD-IMGT/HLA, por exemplo, não 

contempla a variabilidade do HLA-C além do promotor proximal e 5’não traduzida (5’NT), e a 

maioria dos alelos já descritos para HLA-C carecem de sequências de íntrons, promotor e 3’NT. 

Diante do exposto, é notória a importância dos níveis de expressão da molécula HLA-

C para a realização de suas funções, apresentação antigênica e imunomodulação, e que a 

regulação da expressão é dependente da variabilidade tanto das regiões regulatórias quanto da 

região codificadora do gene. Portanto, a avaliação da variabilidade de todo o gene é de extrema 

importância para o entendimento da biologia e função deste gene paradoxal, que combina 

características de genes HLA clássicos e não clássicos.  

Seleção Natural atuando sobre os genes HLA 

 Estudos de variabilidade genética permitem que o grau de polimorfismo do genoma seja 

usado como um indicador para identificação de regiões gênicas submetidas a diferentes regimes 



 

22 
  

de seleção natural (Satta et al., 1998; Meyer et al., 2017). Seleção natural atuando sobre uma 

região gênica pode, em nível populacional, elevar a frequência de alelos que aumentam o fitness 

de um indivíduo (seleção positiva ou balanceadora). Mas, diminuir a frequência ou eliminar 

variantes que reduzam o fitness do indivíduo (seleção negativa ou purificadora). Regiões 

gênicas sob seleção direcional (positiva ou negativa/purificadora) apresentam uma taxa 

reduzida de polimorfismos (Fu and Akey, 2013), enquanto aquelas submetidas à seleção 

balanceadora tendem a manter um grande número de variantes adaptativas na população, em 

frequências intermediárias, aumentando o grau de variabilidade e a heterozigose (Key et al., 

2014). Sem a ação da seleção natural, esses loci evoluem segundo a teoria da neutralidade, em 

que mutações que não afetam o fitness do organismo podem aumentar ou diminuir sua 

frequência em uma população por meio de deriva genética (Satta et al., 1998). 

Seleção balanceadora é um termo amplo que engloba vários regimes seletivos 

responsáveis pela manutenção de variantes genéticas adaptativas, aumentando a diversidade 

genética, entre eles: (a) Vantagem do heterozigoto (ou sobredominância), que ocorre quando o 

‘fitness’ do genótipo heterozigoto é maior que de ambos os alelos em homozigose, mantendo 

dois ou mais alelos indefinidamente na população; (b) a seleção variável ou flutuação (em 

tempo e espaço) mantém níveis de diversidade semelhantes ao esperado sobre vantagem do 

heterozigoto, porém, como o valor adaptativo dos genótipos podem variar ao longo do tempo e 

espaço, as frequências genotípicas também podem mudar; e (c) vantagem do alelo raro ou 

seleção dependente de frequência negativa, que pode ser explicada pela co-evolução antagônica 

entre patógenos e hospedeiros, uma vez que há forte seleção em patógenos para superar a 

resistência dos alelos MHC mais comuns, os alelos raros que podem ainda oferecer resistência 

ao patógeno tem uma vantagem seletiva e tendem a aumentar sua frequência (Meyer and 

Thomson, 2001; Spurgin and Richardson, 2010; Meyer et al., 2017). 

Vários autores apontaram para uma incontestável assinatura de seleção balanceadora 

em genes HLA de classe I clássicos, que seria a explicação para o alto grau de polimorfismos 

observados, excesso de variantes não-sinônimas e elevado desequilíbrio de ligação nesses genes 

(Hughes and Yeager, 1998; Meyer and Thomson, 2001; Garrigan and Hedrick, 2003; Sanchez-

Mazas, 2007; Spurgin and Richardson, 2010; Meyer et al., 2017). De fato, somente a ação de 

seleção natural poderia explicar a extrema diversidade genética de genes HLA de classe II e 

classe I clássicos, como também a alta conservação dos genes não-clássicos. 

Seleção balanceadora atuando sobre determinado segmento de DNA pode se estender, 

por efeito carona, para regiões próximas até uma distância de pelo menos 10kb (Satta et al., 



 

23 
  

1998).  Porém, nos genes HLA, as assinaturas de seleção podem ser diferentes em segmentos 

muito próximos. No gene HLA-G, por exemplo, uma provável seleção purificadora atua sobre 

a região codificadora, limitando a variabilidade deste segmento (Mendes-Junior et al., 2013). 

No entanto, as regiões regulatórias do gene HLA-G (promotora e 3’ NT) parecem estar sob ação 

de seleção balanceadora, elevando a heterozigose de haplótipos divergentes (Tan et al., 2005; 

Castelli et al., 2011; Castelli et al., 2014; Sabbagh et al., 2014; Gineau et al., 2015). 

Estudos sobre a variabilidade do gene HLA-E também apontam para perfis de seleção 

diferentes atuando em diferentes segmentos gênicos. O gene HLA-E apresenta um perfil de 

seleção balanceadora na região codificadora da fenda peptídica, especialmente em um ponto de 

variação não sinônima no éxon 3, mas o éxon 4 (que codifica α3) e regiões não-codificadoras 

apresentaram assinaturas de seleção purificadora. Adicionalmente, a região 3’ NT de HLA-E 

também é muito conservada (Veiga-Castelli et al., 2012; Felicio et al., 2014). De forma 

semelhante, alta conservação foi descrita para o gene HLA-F (Lima et al., 2016). 

Mesmo HLA-A que apresenta assinatura de seleção balanceadora em quase todo 

segmento gênico (região codificadora e regiões regulatórias), apresenta alta conservação e 

sinais de seleção purificadora no éxon 4, que codifica α3 (Lima et al., 2019).  

Em geral, a assinatura de seleção balanceadora observada para genes HLA de classe I 

clássicos foi detectada na região que codifica a fenda de ligação aos peptídeos (éxons 2 e 3), 

cuja manutenção da alta diversidade alélica aumentaria a capacidade de apresentar um maior 

repertório de peptídeos e consequentemente, o ‘fitness’ na resistência contra patógenos (Meyer 

and Thomson, 2001; Sanchez-Mazas, 2007; Cagliani and Sironi, 2013; Dos Santos Francisco 

et al., 2015; Bitarello et al., 2016; Buhler et al., 2016).  

Ainda, levando em conta a vantagem do heterozigoto, a maior divergência entre os 

alelos (vantagem do alelo divergente, DAA) de um heterozigoto aumentaria a capacidade de 

apresentar um conjunto maior de peptídeos que aqueles heterozigotos com alelos mais próximos 

do ponto de vista de sequência (Buhler et al., 2016). Porém, a grande proporção de homozigotos 

observada em um ou mais loci HLA em estudos populacionais, em pequenas e grandes 

populações, indica que mecanismos adicionais, além da vantagem do heterozigoto, estão 

envolvidos para garantir uma adequada proteção imune nessas populações (Buhler et al., 2016).  

Esses achados elevaram o interesse em abordagens que investiguem os padrões de 

variação genética de HLA observados em diferentes populações, em relação à funcionalidade 

das moléculas (especificidade de ligação ao peptídeo). Os resultados desse tipo de estudo 

confirmaram que os resíduos polimórficos não são distribuídos aleatoriamente dentro da fenda 



 

24 
  

de ligação a peptídeo, mas seguem um padrão de maior diversidade em sítios que definem o 

repertório de peptídeos (Dos Santos Francisco et al., 2015; Van Deutekom and Keşmir, 2015; 

Bitarello et al., 2016; Buhler et al., 2016). Assim, Buhler e colaboradores (2016) propuseram o 

modelo de seleção assimétrica divergente dos genes HLA de classe I, que sugere que a falta de 

diversidade em um gene HLA, como observado em algumas populações, é contrabalanceada 

por propriedades complementares de ligação ao peptídeo das moléculas codificadas por outros 

genes. No entanto, Buhler observou que este modelo parece ser robusto para os genes HLA-A e 

HLA-B, porém HLA-C não aumenta significativamente o potencial de ligação de peptídeo dos 

HLA de classe I, sugerindo que este locus assume um papel mais importante em suas funções 

relacionadas a KIR (Buhler et al., 2016). Além disso, é possível que a adaptação envolvendo 

genes HLA seja poligênica e que haplótipos (estendidos) carregando combinações de alelos 

HLA que apresentam maior número de peptídeos sejam favorecidos (Meyer et al., 2017) . Em 

suporte a essa hipótese, já foi demostrado que alelos HLA em forte desequilíbrio de ligação, 

em média, tem menor sobreposição do repertório de peptídeo (Penman et al., 2013). 

Embora seja consenso que a alta diversidade do MHC é fundamental para defesa imune 

contra patógenos, é bem conhecida a associação entre diversos genes localizados nesse 

complexo e doenças humanas, entre elas, doenças autoimunes como diabetes tipo I, psoríase, 

doença de Crohn, doença celíaca, esclerose múltipla, lúpus, artrite reumatoide e espondilite 

anquilosante  (Trowsdale and Knight, 2013; Matzaraki et al., 2017). 

O delicado equilíbrio entre variantes genéticas que favoreçam o controle de infecções, 

mas que podem aumentar a suscetibilidade à doença autoimune, pode ser considerado um 

importante paradigma em genética evolutiva (Chen et al., 2012). De fato, à partir de uma 

perspectiva evolutiva, é intrigante a existência de condições auto-imunes, que reduzem as 

chances de sobrevivência e reprodução de um indivíduo, associadas a alelos HLA relativamente 

comuns (Meyer et al., 2017). Contudo, isso pode ser resultado da seleção de alelos que 

conferem resistência a doenças infecciosas e ao mesmo tempo estão associadas a condições 

auto-imunes (Corona et al., 2010; Abadie et al., 2011; Sams and Hawks, 2014; Meyer et al., 

2017). Por exemplo, alelos HLA-C relacionados com psoríase e doença de Crohn também estão 

relacionados a proteção contra doenças infecciosas, como infeção pelo HIV (Blais et al., 2012; 

Chen et al., 2012; Apps et al., 2013; Kulkarni et al., 2013; Majorczyk et al., 2014).  

Algumas interações entre HLA e KIR (especialmente HLA-C/KIR) também têm sido 

associadas a diversas doenças autoimunes (Parham, 2005; Blais et al., 2011; Augusto and Petzl-

Erler, 2015). Há evidências de co-evolução entre os complexos KIR e HLA, e é possível que 



 

25 
  

seleção balanceadora esteja mantendo a diversidade excepcional do sistema KIR-HLA, 

aparentemente evoluindo sob a pressão proporcionada pelas exigências concorrentes da 

reprodução e da imunidade inata e adaptativa (Augusto and Petzl-Erler, 2015). 

O gene HLA-C é altamente polimórfico e ao mesmo tempo mantém vários motivos 

conservados em sua fenda de ligação a peptídeo, que restringe seu repertório de peptídeos e 

regula a sua expressão na supeficie celular. Adicionalmente, a molécula HLA-C desempenha a 

função de apresentação antigênica a CTLs (como HLA-A e HLA-B), mas também tem um 

papel imunomodulatório importante semelhante aos genes não clássicos, ambas situações sendo 

impactadas pelos níveis de expressão do gene supracitado. Levando em consideração o papel 

crucial que o gene HLA-C desempenha na resposta imunitária, ressalta-se a importância dos 

estudos de variabilidade no intuito de esclarecer de que forma variações em sua sequência se 

relacionam com diferentes perfis de expressão. Além disso, estudos que avaliem os perfis de 

seleção natural em cada segmento de HLA-C é de fundamental importância para esclarecer de 

que maneira a variabilidade desse gene tem sido moldada evolutivamente. Desta forma, o 

presente estudo busca esclarecer se o perfil de seleção balanceadora se extende por toda região 

codificadora e segmentos regulatórios de HLA-C, ou se estes estão sob diferentes regimes de 

seleção natural, permitindo assim um melhor entendimento acerca da biologia do gene HLA-C. 

Testes de desvio de neutralidade e demografia das populações estudadas  

Para testar seleção natural atuando a nível de DNA em amostras populacionais, é 

possível utilizar testes estatísticos de desvio de neutralidade. Esses testes utilizam uma 

abordagem teórica baseada em simulações de coalescência para detectar desvios significativos 

de um modelo de neutralidade (Excoffier and Lischer, 2010; Gineau et al., 2015). 

Neste estudo as assinaturas de seleção presentes no gene HLA-C foram avaliadas por 

meio de três testes de desvio da neutralidade: (a) teste de Ewens-Watterson (Ewens, 1972; 

Watterson, 1978), que compara a homozigose observada na população em estudo com a 

homozigose esperada sob expectativas de neutralidade e em equilíbrio de Hardy-Weinberg, 

para um mesmo tamanho amostral (2n) e com o mesmo número de alelos únicos. O excesso de 

homozigose indica a possibilidade de uma seleção direcionada, enquanto um excesso de 

heterozigose pode indicar atuação de seleção balanceadora favorecendo genótipos 

heterozigotos; (b) teste D de Tajima (Tajima, 1989), que é calculado considerando a diferença 

entre as estimativas ϴ (theta), que se baseia no número médio de diferenças observadas entre 

pares de sequências (π) e o número de sítios de segregação (S). A significância estatística do D 

de Tajima é testada através da geração de amostras aleatórias sob a hipótese de neutralidade 



 

26 
  

seletiva em uma população com tamanho constante e em equilíbrio, utilizando um número 

determinado de simulações (Excoffier and Lischer, 2010); e (c) Razão dN/dS, que compara as 

taxas de substituições não-sinônimas (dN) e sinônimas (dS) e permite inferir os regimes de 

seleção que estão atuando sobre a região codificadora do gene em estudo (Kumar et al., 2016). 

Segmentos exônicos em que a razão dN/dS é superior a 1 podem estar sob seleção direcional 

positiva (Kumar et al., 2016). Porém esse critério é considerado conservador, visto que apenas 

alguns códons podem estar sob seleção positiva (Bitarello et al., 2016), enquanto a maior parte 

das mutações não-sinônimas são deletérias e são eliminadas da população sem contribuir com 

a evolução ou o polimorfismo (Kimura, 1991) (seleção purificadora). Assim, muitas vezes esse 

critério (dN/dS > 1) não é atendido quando analisamos genes ou segmentos exônicos inteiros, 

mesmo quando há presença de alguns códons sob seleção positiva, tornando necessária a análise 

de subconjuntos de códons. Razões dN/dS inferiores a 1 podem ser um indicativo de seleção 

direcional negativa (Kumar et al., 2016). 

O uso de mais de um teste avaliando as assinaturas de seleção evita resultados falso-

positivos, uma vez que a variação das frequências alélicas pode sofrer influência de efeitos 

demográficos, tais como efeito fundador, migração, miscigenação, contração ou expansão 

populacional e deriva genética (Stajich and Hahn, 2005; Gineau et al., 2015). Os valores 

positivos de D de Tajima, por exemplo, são indicativos de um excesso de alelos de frequência 

intermediária (seleção balanceadora) ou contração recente da população (gargalo), enquanto os 

valores D negativos de Tajima indicam um excesso de alelos raros, que pode ser resultado de 

expansão recente da população, varredura seletiva, seleção negativa fraca ou amostra 

proveniente de uma população miscigenada (Stajich and Hahn, 2005).  

Além do uso de três testes distintos, nós também optamos por estudar populações de 

dois continentes diferentes. A população brasileira é sabidamente uma população miscigenada, 

formada por 5 séculos de mistura interétnica entre europeus, africanos e nativos americanos 

(Pena et al., 2011), além das migrações do leste asiático ocorridas no último século, o que 

poderia levar a resultados tendenciosos nos testes de desvio de neutralidade devido à sua 

história demográfica. Por isso, nós inserimos nesse estudo uma população do Benin, país 

localizado no continente africano. Essa amostra é composta por indivíduos da etnia Toffin 

(etimologicamente “pessoas da água''). Os Toffin estão presentes em mais de 10 aldeias, 

representando pequenas comunidades autônomas, fugitivos das lutas encabeçadas pelos 

soldados franceses durante o período pré-colonial e localizados na mesma região há séculos 

(Sonon et al., 2018). A população do Benin é menos miscigenada que a população brasileira, 



 

27 
  

mas também tem uma história demográfica que poderia influenciar uma análise de seleção 

natural de sua população quando estudada individualmente. Não obstante a história 

demográfica de cada população, temos duas populações com diferentes histórias demográficas, 

localizadas em continentes distintos e ambas apresentaram o mesmo perfil de assinaturas de 

seleção natural  atuando no gene HLA-C.  

 



 

28 
  

OBJETIVOS  

 

Objetivo Geral 

Avaliar a variabilidade e os haplótipos encontrados na região promotora, codificadora e 

3’ não-traduzida do gene HLA-C em uma amostra brasileira e beninense e detectar assinaturas 

de seleção natural ao longo do gene. 

 

Objetivos específicos  

 

➢ Consolidar uma metodologia para avaliação da variabilidade do gene HLA-C por 

sequenciamento massivo paralelo (ou sequenciamento de nova geração);  

➢ Caracterizar os pontos de variação e haplótipos encontrados para o gene HLA-C em uma 

amostra do Brasil e do Benin;  

➢ Caracterizar as amostras brasileiras utilizadas quanto a seus perfis de ancestralidade; 

➢ Avaliar o perfil de seleção atuando ao longo de todos os segmentos do gene HLA-C.  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 

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