Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa Integrando diferentes abordagens genéticas para a compreensão dos cupins: delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910) (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), filogeografia da espécie N. jaraguae no bioma Mata Atlântica e filogenia das espécies do gênero Nasutitermes Dudley, 1890 São José do Rio Preto 2018 Câmpus de São José do Rio Preto Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa Integrando diferentes abordagens genéticas para a compreensão dos cupins: delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910) (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), filogeografia da espécie N. jaraguae no bioma Mata Atlântica e filogenia das espécies do gênero Nasutitermes Dudley, 1890 Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadores: CNPq-Proc.140534/2014-8 CAPES-Proc.88881.135711/2016-01 FAPESP-Proc.2013/20068-9 Orientadora: Profª. Drª. Adriana Coletto Morales-Corrêa e Castro Co-orientadora: Profª. Drª. Lilian Madi- Ravazzi São José do Rio Preto 2018 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Câmpus de São José do Rio Preto Barbosa, Nara Cristina Chiarini Pena. Integrando diferentes abordagens genéticas para a compreensão dos cupins : delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910) (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), filogeografia da espécie N. jaraguae no bioma Mata Atlântica e filogenia das espécies do gênero Nasutitermes Dudley, 1890 / Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa. -- São José do Rio Preto, 2018 113 f. : il., tabs. Orientador: Adriana Coletto Morales-Corrêa e Castro Coorientador: Lilian Madi-Ravazzi Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Genética animal. 2. Térmita - Mata Atlântica. 3. Filogeografia. 4. Filogenia. I. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. II. Título. CDU – 591.15 Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa Integrando diferentes abordagens genéticas para a compreensão dos cupins: delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910) (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), filogeografia da espécie N. jaraguae no bioma Mata Atlântica e filogenia das espécies do gênero Nasutitermes Dudley, 1890 Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadores: CNPq-Proc.140534/2014-8 CAPES - Proc.88881.135711/2016-01 FAPESP - Proc.2013/20068-9 Comissão Examinadora Profª. Drª. Adriana Coletto Morales-Corrêa e Castro UNESP – Câmpus de Jaboticabal Orientadora Profª. Drª Claudia Marcia Aparecida Carareto UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Profª. Drª. Hélida Ferreira da Cunha UEG – Anápolis Prof. Dr. Ives Haifig UFU – Monte Carmelo Profª. Drª. Mary Massumi Itoyama UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto São José do Rio Preto 09 de março de 2018 Dedico este trabalho, e as conquistas decorrentes dele, à minha família. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer, primeiramente, às pessoas que contribuíram diretamente para a realização desse trabalho. À Profa. Adriana Coletto Morales-Corrêa e Castro, por ser não apenas minha orientadora, mas uma amiga, que mais uma vez aceitou o desafio do novo e esteve presente nas horas mais difíceis e com as palavras certas, sendo fundamental para o meu crescimento profissional. Agradeço à Profa. Eliana Marques Cancello e toda a equipe do Museu de Zoologia da USP, que enriquecem nossos trabalhos com sua vasta experiência e nos proporcionam momentos de descontração em campo e nos congressos. À Profa. Lilian Madi-Ravazzi, pela coorientação e apoio. Agradeço ainda ao Programa de Pós-graduação em Biociências, e a todos os funcionários do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (UNESP/IBILCE) e da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (UNESP/FCAV), pela estrutura e suporte, bem como à Profa. Janete Apparecida Desidério e ao Prof. Manoel Victor Franco Lemos, por cederem os equipamentos e o espaço do Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada, necessários a realização deste trabalho. Ao Prof. Edward Vargo e à toda equipe do Rollins Urban and Structural Entomology Facility, pela atenção, carinho e paciência e à Texas A&M University, pela estrutura disponibilizada durante a realização do doutorado sanduíche. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa regular (processo n° 140534/2014-8), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa no Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior (processo n° 88881.135711/2016-01) e à Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio financeiro do projeto (processo n° 2013/20068-9). Por último, mas não menos importante, agradeço àqueles que me apoiaram durante todos esses anos. Agradeço aos meus pais, Honorato e Maria do Carmo, por todo o amor dispensado a mim e por nunca medirem esforços para que eu alcançasse meus objetivos e realizasse meus sonhos, e aos meus irmãos, José Henrique, Márcia Cristina e José Renato e meus cunhados, irmãos de coração, por todo o apoio, conselhos e incentivo. Ao meu namorado, Pedro Henrique, por toda a compreensão, paciência e incentivo, principalmente nos momentos em que nada parecia dar certo, e a toda sua família, por sempre desejarem meu sucesso. Aos meus sobrinhos, Davi e José Lucas, pelos momentos de descontração em meio à falta de tempo. Aos amigos do LaBE, Amanda, Maria Cecília, Thaís, Rullian e Rafael, pelos bolos e aflições compartilhadas. Às amigas de longa data, Josiane de Fátima, Gabriela e Josiane Pires, por todo apoio, mesmo que à distância. Às amigas Samara e Bruna, pelos infinitos documentos entregues na seção de pós, as caminhadas na represa e todo o companheirismo. Às melhores roomates, Jussara, Josiane e Joelma, que dividiram não apenas uma casa, mas suas vidas comigo, e transformaram quatro meses numa amizade para a vida toda, fazendo parte da minha “família americana”. Agradeço também à Catalina e Nick (e não podia faltar a cachorra Luna), que fizeram eu me sentir em casa, mesmo estando tão longe e perdida, e a todos que fizeram do momento mais desafiador da minha vida, um momento inesquecível. Agradeço também àqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e que eu não tenha citado para não estender esses agradecimentos, mas que certamente recebem meu reconhecimento e gratidão. “A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” (Arthur Schopenhauer) RESUMO O gênero Nasutitermes contém 257 espécies descritas, sendo considerado o gênero com a maior riqueza de espécies e a maior distribuição geográfica, entretanto, sua taxonomia ainda é bastante confusa. Este gênero é apontado como dominante no bioma Mata Atlântica e possui várias espécies que se distribuem por toda a região, como a espécie Nasutitermes jaraguae, a qual é morfologicamente muito semelhante a outras espécies que ocorrem nas mesmas localidades. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos diferenciar, por meio de ferramentas moleculares, espécies do Grupo N. jaraguae; definir os processos responsáveis pelo padrão de distribuição da variabilidade genética da espécie N. jaraguae e entender as relações filogenéticas e os processos de diversificação das espécies do gênero Nasutitermes. As análises de delimitação de espécies do Grupo N. jaraguae foram realizadas com o gene mitocondrial COII e mostraram que os caracteres morfológicos, diagnósticos para a identificação das espécies analisadas, tanto reuniram espécimes geneticamente distintos, como separaram espécimes geneticamente semelhantes. Este cenário reflete a discordância entre a separação de linhagens e os critérios utilizados para a delimitação de espécies por diferentes conceitos de espécies, bem como demonstra que estes podem representar a plasticidade fenotípica de uma mesma linhagem. Evidenciou-se sete unidades evolutivas distintas, as quais podem ser consideradas espécies com base nos conceitos filogenéticos e evolutivos de espécies. A análise filogeográfica de N. jaraguae, realizada com o gene COII, demonstrou a existência de três grupos haplotípicos bem estruturados, cujos haplótipos encontram-se geograficamente agrupados. A organização na distribuição geográfica dos haplogrupos pode ser explicada com base na hipótese de refúgios florestais do Plioceno-Pleistoceno, o que reforça o padrão de distribuição de espécies na Mata Atlântica observado para outros grupos biológicos, enquanto a distribuição dos haplótipos dentro dos haplogrupos pode ser explicada pela hipótese de gradientes ecológicos. As análises filogenéticas do gênero Nasutitermes foram realizadas com os genes COII, 16S rRNA e 12S rRNA e a região ITS2. Espécies com distribuição geográfica distante apareceram filogeneticamente relacionadas, indicando que a origem do gênero Nasutitermes é posterior a separação da Gondwana, com episódios de dispersão intercontinentais dentro do gênero, bem como eventos de especiação independentes nas regiões zoogeográficas. Foi possível ainda sugerir novas hipóteses sobre a diversificação de Nasutitermes e, dessa forma, compreender melhor a história evolutiva deste gênero. Palavras-chave: Cupim. Mata Atlântica. COII. 16S rRNA. 12S rRNA. ITS2. ABSTRACT The genus Nasutitermes contains 257 described species, being the genus with the greatest species richness and the broadest geographical distribution, however, its taxonomy is confused still. This genus is considered as dominant in the Atlantic Forest biome and includes several species that are distributed throughout the region, such as Nasutitermes jaraguae, which is morphologically similar to other species that occur in the same localities. This study aimed to differentiate species of the Group Nasutitermes jaraguae through molecular tools; to define the processes by distribution pattern of the genetic variability of N. jaraguae, to understand the phylogenetic relationships and the diversification process of the Nasutitermes species. The analysis of species delimitation of the Group N. jaraguae was performed with the mitochondrial COII gene. The morphological diagnostic characters for the identification of the species analyzed both grouped genetically distinct specimens and separated specimens genetically similar. This scenario reflects the disagreement between the separation of lineages and the criteria used for the species delimitation by different species concepts, and demonstrates these may represent the phenotypic plasticity of the same lineage. It was evidenced seven distinct evolutionary units, which can represent species based on the phylogenetic and evolutionary concepts of species. The phylogeographic analysis of N. jaraguae, performed with the COII gene, demonstrated the existence of three well-structured haplotypic groups, whose haplotypes are geographically grouped. The organization in the geographic distribution of haplogroups can be explained based on the Pliocene-Pleistocene refuge hypothesis, which reinforces the pattern of species distribution in the Atlantic Forest observed for other biological groups, while the distribution of haplotypes within the haplogroups can be explained by the ecological gradient hypothesis. Phylogenetic analyzes of the genus Nasutitermes were performed with mitochondrial genes (COII, 16S rRNA and 12S rRNA) and a nuclear fragment (ITS2 region). Species with distant geographic distribution appeared phylogenetically nearly, indicating the origin of the genus Nasutitermes is posterior to Gondwana separation, with intercontinental dispersion episodes within the genus, as well as independent speciation events in the zoogeographic regions. It was also possible to suggest new hypotheses about the diversification of Nasutitermes and, in this way, to better understand its evolutionary history. Keywords: Termite. Atlantic Forest. COII. 16S rRNA. 12S rRNA. ITS2. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Visão dorsal da cabeça de um espécime de Nasutitermes jaraguae, na qual podem ser observados aspectos morfológicos, como formato e coloração. ........................................................... 16 Figura 2. Mapa da distribuição das fitofisionomias na Mata Atlântica brasileira. ................................ 17 Figura 3. Localização geográfica aproximada das principais descontinuidades filogeográficas na Mata Atlântica. ............................................................................................................................................... 19 Figura 4. Mapa de distribuição das amostras de Nasutitermes jaraguae utilizadas nas análises populacionais e filogeográficas. ............................................................................................................ 34 Figura 5. Divisões geográficas consideradas para as análises filogenéticas. ........................................ 39 Figura 6. Redes de haplótipos para o gene COII, formadas pelo Grupo Nasutitermes jaraguae (N. jaraguae, N. ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4). .......................................................................................................................................................... 48 Figura 7. Inferência Bayesiana para o gene COII para o Grupo Nasutitermes jaraguae (N. jaraguae, N. ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4). ............. 49 Figura 8. Redes de haplótipos para o gene COII, formadas pelo Grupo Nasutitermes jaraguae (N. jaraguae, N. ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4), evidenciando os grupos obtidos por inferência filogenética e distância genética, representada por retângulos coloridos. ............................................................................................................................. 52 Figura 9. Gráfico do teste de Mantel realizado para as populações de Nasutitermes jaraguae. ........... 54 Figura 10. Rede de haplótipos da espécie Nasutitermes jaraguae para o gene COII. .......................... 55 Figura 11. Rede de haplótipos da espécie Nasutitermes jaraguae para o gene COII aninhada segundo a metodologia de Templeton, Boerwinkle e Sing (1987). ....................................................................... 56 Figura 12. Mismatch distribution para os haplogrupos de Nasutitermes jaraguae. A - haplogrupo 1; B - haplogrupo 2; C - haplogrupo 3. ......................................................................................................... 57 Figura 13. Inferência Bayesiana para a espécie Nasutitermes jaraguae. Valores nos nós indicam o tempo de divergência e a probabilidade posterior que sustentam os clados. ........................................ 58 Figura 14. Inferência Bayesiana para a espécie Nasutitermes jaraguae. (A) As cores indicam a fitofisionomia em que as amostras foram coletadas e os valores nos nós representam a probabilidade posterior bayesiana (>50). (B) As cores representam a localização dos espécimes e a possível origem geográfica dos ancestrais comuns. A escala indica o tempo em milhões de anos (Ma). ...................... 59 Figura 15. Inferência Bayesiana para o gênero Nasutitermes a partir dos dados concatenados (COII, 16S, 12S e ITS2), ressaltando os clados mais basais. ........................................................................... 61 Figura 16. Inferência Bayesiana para o gênero Nasutitermes a partir dos dados concatenados (COII, 16S, 12S e ITS2), ressaltando os clados intermediários. ....................................................................... 63 Figura 17. Inferência Bayesiana para o gênero Nasutitermes a partir dos dados concatenados (COII, 16S, 12S e ITS2), ressaltando os clados mais internos. ........................................................................ 64 Figura 18. Rotas de dispersão entre as regiões zoogeográficas inferidas com base na análise filogenética por inferência Bayesiana. .................................................................................................. 77 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Espécies utilizadas na análise de delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae. ............................................................................................................................................................... 31 Tabela 2. Localidades amostradas nas análises populacionais e filogeográficas de Nasutitermes jaraguae, número de colônias amostradas em cada localidade (N) e número de identificação (voucher) da Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE). .............................. 32 Tabela 3. Espécies do gênero Nasutitermes e grupo externo utilizados nas análises filogenéticas; regiões zoogeográficas de ocorrência (Procheş e Ramdhani, 2012); número de identificação (voucher) da Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE) ou número de acesso no banco de dados GenBank. ................................................................................................................ 35 Tabela 4. Primers utilizados nos testes de amplificação dos genes empregados nas análises de delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae e análises filogeográficas, populacionais e filogenéticas. ......................................................................................................................................... 40 Tabela 5. Primers desenhados para a amplificação de fragmentos menores do gene COII, suas respectivas sequências e posição em relação a uma sequência referência de Nasutitermes corniger. .. 40 Tabela 6. Condições de amplificação dos genes utilizados nas análises de delimitação de espécies do Grupo N. jaraguae, análises filogeográficas e filogenéticas. ................................................................ 41 Tabela 7. Haplótipos presentes nas amostras representativas do Grupo N. jaraguae (N, jaraguae, N. ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4), número de espécimes que pertencem a cada haplótipo, número de identificação (voucher) que representam os indivíduos e respectivas espécies com base na identificação morfológica. .......................................... 46 Tabela 8. Lista dos haplótipos que compõe as redes obtidas pelo TCS. ............................................... 49 Tabela 9. Distância genética entre as espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae, determinadas por morfologia. ............................................................................................................................................ 50 Tabela 10. Distância genética entre as redes haplotípicas obtidas pelo TCS para os representantes do Grupo Nasutitermes jaraguae. .............................................................................................................. 50 Tabela 11. Distância genética entre os clados obtidos pela análise filogenética por inferência Bayesiana para os representantes do Grupo Nasutitermes jaraguae..................................................... 51 Tabela 12. Parâmetros da estatística descritiva para as populações de Nasutitermes jaraguae com mais de uma colônia amostrada. .................................................................................................................... 53 Tabela 13. Parâmetros significativos observados no teste de correlação entre a rede de haplótipos aninhada e a distribuição geográfica dos haplótipos e sua interpretação filogeográfica. ...................... 56 Tabela 14. Resultados dos testes de neutralidade para os haplogrupos de Nasutitermes jaraguae. ..... 57 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................................. 13 1.1 Aspectos gerais de cupins e espécies de estudo ........................................................................................... 13 1.2 História biogeográfica da Mata Atlântica .................................................................................................... 16 1.3 Estudos genéticos ........................................................................................................................................ 20 1.3.1 Delimitação de espécies com base em dados moleculares ................................................................... 20 1.3.2 Genética de populações e filogeografia ................................................................................................ 21 1.3.3 Reconstrução filogenética ..................................................................................................................... 25 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................................................... 28 2.1 Objetivos gerais ........................................................................................................................................... 28 2.2 Objetivos específicos ................................................................................................................................... 28 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................................ 30 3.1 Material biológico ....................................................................................................................................... 30 3.1.1 Espécimes utilizados na análise de delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae ........... 30 3.1.2 Espécimes utilizados nas análises populacionais e filogeográficas de Nasutitermes jaraguae ............ 31 3.1.3 Táxons amostrados na análise filogenética do gênero Nasutitermes .................................................... 34 3.2 Extração do DNA total ................................................................................................................................ 39 3.3 Amplificação dos genes mitocondriais e região nuclear .............................................................................. 40 3.4 Purificação e sequenciamento ..................................................................................................................... 41 3.5 Análise das sequências ................................................................................................................................ 42 3.5.1 Delimitação de espécimes do Grupo Nasutitermes jaraguae ............................................................... 42 3.5.2 Análise populacional e filogeográfica de Nasutitermes jaraguae ........................................................ 43 3.5.3 Análise filogenética do gênero Nasutitermes ....................................................................................... 44 4 RESULTADOS .................................................................................................................................................. 46 4.1 Delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae ......................................................................... 46 4.2 Análise populacional e filogeográfica de Nasutitermes jaraguae ............................................................... 53 4.3 Análise filogenética do gênero Nasutitermes .............................................................................................. 60 5 DISCUSSÃO ...................................................................................................................................................... 66 5.1 Delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae ......................................................................... 66 5.2 Análise populacional e filogeográfica de Nasutitermes jaraguae ............................................................... 69 5.3 Análise filogenética do gênero Nasutitermes .............................................................................................. 71 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................................................. 78 REFERÊNCIAS .................................................................................................................................................... 80 APÊNDICE A - Amostras do Grupo Nasutitermes jaraguae utilizadas nesse estudo, seu número de identificação (voucher) na Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE), número de referência na Coleção de Isoptera do Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZUSP) ou na Coleção de Isoptera do Laboratório de Termitologia (LabTermes) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). Localidade de coleta, suas coordenadas geográficas e data de obtenção das amostras. ........................................................... 99 APÊNDICE B - Distância genética entre os haplótipos do Grupo Nasutitermes jaraguae (N. jaraguae, N. ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4. A nomenclatura corresponde à utilizada na Tabela 7. ................................................................................................................... 103 APÊNDICE C - Distância genética entre as populações de Nasutitermes jaraguae. .......................................... 111 13 1 INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos gerais de cupins e espécies de estudo Os cupins são insetos eussociais, ou seja, apresentam divisão reprodutiva do trabalho, sobreposição de gerações e cuidado cooperativo com a prole (WILSON, 1971). As castas apresentam adaptações morfológicas e funções distintas dentro da colônia, sendo os reprodutores capazes de se dispersar e reproduzir, enquanto os soldados são responsáveis pela defesa da colônia e os helpers (operários verdadeiros ou estágios imaturos) pelo forrageamento, alimentação dos imaturos e construção dos ninhos (ROISIN, 2000). Apresentam grande importância ecológica, pois se alimentam de matéria orgânica vegetal em diferentes estágios de decomposição, participam dos processos de ciclagem de nutrientes e fixação de nitrogênio, bem como contribuem com a formação e areação do solo (BLACK; OKWAKOL, 1997; LAVELLE et al., 1997; DONOVAN; EGGLETON; BIGNELL, 2001). Apresentam ainda importante papel na base da cadeia alimentar, sendo consumidos por diversas espécies animais, como formigas, aranhas, aves e mamíferos (HIGASHI; ABE, 1997). Algumas espécies são consideradas pragas agrícolas e urbanas, de modo que apresentam também grande importância econômica (CONSTANTINO, 2002; FONTES; MILANO, 2002). Os cupins normalmente constroem ninhos e esta característica de insetos sociais contribui com o desenvolvimento da colônia, pois os ninhos estão associados a proteção e a formação de um microclima adequado para o seu desenvolvimento (NOIROT; DARLIGTON, 2000). De acordo com o tipo de ninho e o hábito de forrageamento, os cupins podem ser classificados em one-piece, quando a colônia se alimenta e se desenvolve em um único pedaço de madeira, observado nas famílias Termopsidae, Kalotermitidae e em alguns Rhinotermitidae (Prorhinotermes); ou multiple-piece, nos quais os ninhos são construídos independentes da fonte de alimento, observado nas famílias Mastotermitidae, Rhinotermitidae, Hodotermitidae, Serritermitidae e Termitidae (KORB, 2008). Os ninhos podem ser classificados em (i) ninhos dentro de madeira, em que poucos pedaços de madeira são conectados por galerias subterrâneas; (ii) ninhos subterrâneos, quando construídos completamente abaixo do nível do solo; (iii) ninhos epígeos, construídos acima do nível do solo; (iv) ninhos arborícolas, construídos em troncos de árvores e ligados ao solo por galerias; e (v) inquilinos, quando espécies ocupam ninhos construídos por outras espécies (NOIROT, 1970; NOIROT; DARLIGTON, 2000). Esta diversidade de ninhos está associada à evolução 14 da vida social, com aspectos relacionados ao aumento da colônia, diversificação do alimento e estratégias de forrageamento (NOIROT; DARLIGTON, 2000). Os cupins formam um grupo monofilético irmão ao grupo de baratas Cryptocercidae, sendo por isso agrupados atualmente não mais em uma ordem, mas alocados na infraordem Isoptera, dentro de Blattodea, a qual, junto de Mantodea, compõe o grupo Dictyoptera (LO et al., 2000, 2007; KLASS, 2003; KLASS; MEIER, 2006; INWARD; BECCALONI; EGGLETON, 2007; LEGENDRE et al., 2015). Em relação à diversidade e distribuição dos cupins, estes estão entre os artrópodes de solo mais abundantes dos ecossistemas tropicais, representando cerca de 10% da biomassa animal e até 95% da biomassa de insetos de solo (LAVELLE et al., 1997; BIGNELL, 2006; JOUQUET et al., 2011). A infraordem Isoptera apresenta 3.154 espécies descritas, compreendendo extintas e atuais, distribuídas em 359 gêneros (CONSTANTINO, 2018). Considerando apenas as espécies atuais, a infraordem Isoptera compreende nove famílias, dentre elas a família Termitidae Latreille, 1802, na qual está inserida cerca de 70% das espécies de cupins (ENGEL, 2011; KRISHNA et al., 2013a). A grande diversificação de Termitidae está associada à sua capacidade de digerir lignocelulose, a mais abundante molécula orgânica dissolvida no solo (NORKRANS, 1963; DIXON et al., 1994). Esta família encontra-se distribuída por todas as regiões biogeográficas, especialmente florestas tropicais e savanas, as quais apresentam predominantemente membros da família Termitidae (EGGLETON, 2011). A família Termitidae se divide em oito subfamílias (ENGEL, 2011), dentre elas está Nasutitermitinae Hare, 1937. Esta subfamília ocorre em todas as regiões biogeográficas e apresenta 619 espécies distribuídas em 81 gêneros, sendo a mais abundante da família (CONSTANTINO, 2018). Dentre os gêneros da subfamília Nasutitermitinae, encontra-se Nasutitermes Dudley, 1890, o qual é considerado o gênero com a maior riqueza de espécies e a maior distribuição geográfica, com 257 espécies descritas (JONES; EGGLETON, 2011; KRISHNA et al., 2013b; CONSTANTINO, 2018). Está distribuído em todas as regiões biogeográficas e algumas espécies ocorrem em mais de uma região, sendo 76 espécies encontradas na Região Neotropical, 19 na Região Australiana, uma na Região Neártica, 19 na Região da Etiópia, 118 na Região Oriental, 14 na Região Paleártica e 21 na Região da Papua-Nova Guiné (CONSTANTINO, 2018). Nasutitermes ainda é um gênero de taxonomia bastante confusa, provavelmente há várias sinonímias entre suas espécies (E. Cancello com. pess.) e a dificuldade na identificação morfológica de muitas espécies deste gênero resulta, em alguns 15 casos, em listas de morfoespécies em levantamentos. Também se pode sugerir que a existência de complexos de espécies crípticas seja bem provável. Além disso, há espécies que poderão ser transferidas para outros gêneros, como foi o caso de táxons transferidos recentemente para os gêneros Cortaritermes e Sandsitermes (CUEZZO; CARRIJO; CANCELLO, 2015; CUEZZO; CANCELLO; CARRIJO, 2017), de modo que as espécies atualmente incluídas no gênero Nasutitermes não representam um grupo monofilético (INWARD; VOGLER; EGGLETON, 2007). Este fato está relacionado à história taxonômica do gênero, uma vez que as espécies que possuíam soldados nasutos (aquelas que apresentam um prolongamento da cápsula cefálica onde está inserida a abertura da glândula frontal, denominado tubo frontal ou naso) foram alocadas inicialmente em um mesmo gênero, o qual corresponde ao que é conhecido hoje como a subfamília Nasutitermitinae (BOULOGNE et al., 2017). O gênero Nasutitermes é apontado ainda como dominante no bioma Mata Atlântica e possui várias espécies que se distribuem por toda a região (CONSTANTINO; ACIOLI, 2006; CANCELLO et al., 2014). Entre elas, encontra-se a espécie Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910), que ocorre em todo o Domínio Atlântico sensu lato (sl), já tendo sido registrada nos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Espírito Santo, Bahia (REIS; CANCELLO, 2007; CANCELLO et al., 2014), Rio de Janeiro (REIS; CANCELLO, 2007; TREVISAN; MARQUES; CARVALHO, 2008; CANCELLO et al., 2014), Minas Gerais (GALBIATI; DESOUZA; SCHOEREDER, 2005), Pernambuco (BANDEIRA et al., 2003; BANDEIRA; VASCONCELLOS, 2004), Paraíba (ERNESTO et al., 2014; ARAÚJO; SILVA; VASCONCELLOS, 2015), Rio Grande do Sul (FLORENCIO; DIEHL, 2006; DIEHL et al., 2014; DIEHL; DIEHL-FLEIG; JUNQUEIRA, 2015) e Goiás, onde foi identificada como Nasutitermes cf. jaraguae (SANTOS, 2008). Até o momento, não se conhece o ninho de N. jaraguae, o que sugere que este seja subterrâneo. Esta espécie é encontrada forrageando em madeira ou dentro de galerias e estudos realizados para avaliar o nível de consumo de diferentes tipos de madeiras, em ambientes naturais, demostraram que N. jaraguae tem preferência por madeiras mais macias (PERALTA et al., 2004; TREVISAN; MARQUES; CARVALHO, 2008). Os soldados de N. jaraguae apresentam cerca de 5 mm, com coloração da cabeça entre amarelada e avermelhada (Figura 1), sendo morfologicamente muito semelhante a outras espécies que ocorrem nas mesmas localidades, como N. ehrhardti, N. itapocuensis, N. auriantacus e N. auriantacoides, bem como a algumas espécies ainda não nomeadas, tais como as morfoespécies aqui chamadas de Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, 16 Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4 e que serão investigadas neste estudo. Todas estas formam um grupo de espécies denominado Grupo Nasutitermes jaraguae (E. Cancello com. pess.; “Laboratório de Ortopteroides MZUSP”, 2017). Figura 1. Visão dorsal da cabeça de um espécime de Nasutitermes jaraguae, na qual podem ser observados aspectos morfológicos, como formato da cabeça e do naso e coloração. Fonte: Tiago Fernandes Carrijo. 1.2 História biogeográfica da Mata Atlântica Como relatado anteriormente, a Mata Atlântica abriga várias espécies do gênero Nasutitermes, o qual é considerado como dominante neste bioma (CONSTANTINO; ACIOLI, 2006; CANCELLO et al., 2014). O bioma Mata Atlântica se estende por cerca de 3.300 km da costa brasileira e em pequenas áreas no Paraguai e Argentina (GALINDO LEAL; CÂMARA, 2003; TABARELLI et al., 2010). O Domínio Mata Atlântica é composto por diferentes fitofisionomias, sendo cerca de 79% de sua área coberta por formações florestais e o restante dividido entre zonas de tensão ecológica, encraves de cerrado, formações pioneiras e refúgios ecológicos (CAPOBIANCO, 2001) (Figura 2). A Mata Atlântica é um dos 34 hotspots globais, ou seja, uma área de grande diversidade e endemismo e que apresenta alta vulnerabilidade, além disso, está entre um dos cinco hotspots com maior número de espécies endêmicas (MYERS et al., 2000; MITTERMEIER et al., 2004; BROOKS et al., 2006). Entretanto, é considerado um dos biomas mais degradados e ameaçados e, atualmente, aparece distribuído em remanescentes florestais, muitas vezes pequenos e distantes entre si, somando apenas cerca de 12% de sua extensão original (RIBEIRO et al., 2009). 17 Figura 2. Mapa da distribuição das fitofisionomias na Mata Atlântica brasileira. Fonte: Digitalização do Mapa de vegetação do Brasil, FIBGE, 1993, escala 1.500.000 - Instituto Socioambiental/Fundação SOS Mata Atlântica. A formação da Mata Atlântica iniciou-se no Período Cretáceo, quando a América do Sul já se encontrava distante da África, o Oceano Atlântico apresentava características semelhantes às atuais e o clima, antes seco, tornava-se bastante úmido (MORLEY, 2000). Como aponta o registro fóssil, durante este período ocorreu a diversificação das angiospermas (a partir de 80 Ma), de modo que a presença de árvores próprias de florestas com dossel fechado indica a provável existência de uma floresta tropical na costa leste da América do Sul, ou seja, uma Mata Atlântica ancestral (MORLEY, 2000). 18 No final do Cretáceo, há 65 Ma, ocorreu um grande evento de extinção da biota, incluindo os dinossauros e cerca de 40% das espécies de plantas, devido à queda de um meteorito, entretanto, o clima predominantemente quente e úmido no final do Paleoceno e início do Eoceno, há cerca de 50 Ma, contribuiu com a recuperação da diversidade das angiospermas, assegurando a manutenção de florestas úmidas na América do Sul (MORLEY, 2000). Estas florestas cobriam todo o território, do Pacífico ao Atlântico, no entanto, o esfriamento e ressecamento global e os ciclos glaciais-interglaciais a partir do Plioceno (cerca de 5 Ma), levaram a expansão de áreas abertas savânicas, como a Diagonal de formações abertas, separando a Mata Atlântica das outras florestas sul-americanas (MORLEY, 2000). O isolamento da Mata Atlântica resultou em um alto nível de endemismo devido à alta diversificação que ocorreu dentro de seus limites (DASILVA; PINTO-DA- ROCHA; SOUZA, 2016). Entretanto, a maioria das espécies animais e vegetais não são encontradas em toda a extensão da Mata Atlântica, sendo restritas a porções menores que podem ser delimitadas com base no padrão de endemismo de diversos grupos biológicos (DASILVA; PINTO-DA-ROCHA; SOUZA, 2016). Estudos filogeográficos tem mostrado a separação de espécies ou populações de diferentes grupos de organismos que ocorrem ao norte e ao sul da Mata Atlântica, tais como insetos (Melipona quadrifasciata, BATALHA- FILHO et al., 2010; Dinoponera lucida, RESENDE et al., 2010; dípteros, AMORIM; SANTOS, 2017), anfíbios (Hypsiboas albomarginatus, H. semilineatus e H. faber, CARNAVAL et al., 2009; complexo Thoropa miliaris, FITZPATRICK et al., 2009; grupo Rhinella crucifer, THOMÉ et al., 2010), aves (Xiphorhynchus fuscus, CABANNE; SANTOS; MIYAKI, 2007; CABANNE et al., 2008), mamíferos (Metachirus nudicaudatus, Micoureus spp., COSTA, 2003; Bradypus variegatus, MORAES-BARROS et al., 2006; Cerdocyon thous, TCHAICKA et al., 2007; Desmodus rotundus, MARTINS et al., 2009), répteis (Gymnodactylus darwinii; PELLEGRINO et al., 2005; complexo Bothrops jararaca, GRAZZIOTIN et al., 2006) e plantas (Dalbergia nigra, RIBEIRO et al., 2011). Ainda não é possível se determinar um padrão filogeográfico geral para os organismos da Mata Atlântica, porém os estudos citados apontam para a existência de três descontinuidades recorrentes, sendo (i) localizada na região norte do estado de São Paulo, (ii) observada na região norte de Minas Gerais e Espírito Santo, próximo ao Vale do Rio Doce e (iii) situada na região norte da Bahia e Alagoas (Figura 3) (BATALHA-FILHO; MIYAKI, 2011). 19 Figura 3. Localização geográfica aproximada das principais descontinuidades filogeográficas na Mata Atlântica. Fonte: BATALHA-FILHO; MIYAKI (2011). A área em cinza corresponde ao território original da Mata Atlântica e as linhas pontilhadas (i, ii e iii) representam as descontinuidades observadas para diferentes grupos biológicos. Estas descontinuidades podem ser explicadas pela Hipótese de Refúgios Florestais do Pliocenos-Pleistoceno (HAFFER, 1969; VANZOLINI; WILLIAMS, 1970; MAYR; O’HARA, 1986), a qual tem sido a mais utilizada para explicar a existência de áreas de endemismo na América do Sul. Segundo esta hipótese, alterações climáticas deixaram o clima mais frio e seco a partir do Plioceno e, especialmente, durante o Pleistoceno, levando a retração das áreas florestais e expansão das áreas abertas, o que resultou no isolamento das manchas florestais e consequente especiação das populações isoladas (HAFFER, 1969). A alteração do clima para um período mais quente e úmido permitiu a expansão das áreas florestais e a reconexão dos fragmentos, onde habitavam novas espécies decorrentes da especiação por isolamento ou populações geneticamente distintas devido à ausência de fluxo gênico (HAFFER, 1969). Posteriormente, assumiu-se que as oscilações climáticas ocorridas durante o Terciário também tiveram amplitude e duração suficientes para promover fragmentação florestal e especiação (HAFFER, 1993). Embora poucos estudos tenham abordado hipóteses alternativas, os padrões de distribuição de espécies na Mata Atlântica podem estar relacionados também à outras 20 teorias de especiação em florestas tropicais (LARA; GEISE; SCHNEIDER, 2005). Dentre as teorias de especiação alopátrica está a Hipótese de Isolamento em Montanhas, a qual pressupõe que o isolamento de remanescentes florestais em montanhas durante períodos secos acarretou em divergência e especiação (MOREAU, 1966), como por exemplo na Serra do Espinhaço, Serra da Mantiqueira, Serra do Mar e Serra dos Órgãos (LARA; GEISE; SCHNEIDER, 2005). Outra teoria de especiação alopátrica é a Hipótese de Rios como Barreiras, observada principalmente na Amazônia, segundo a qual teria ocorrido especiação entre populações que se tornaram geograficamente isoladas por rios (WALLACE, 1852), tais como o Rio Jequitinhonha e o Rio Doce (LARA; GEISE; SCHNEIDER, 2005). Já a principal teoria baseada em especiação parapátrica é a Hipótese dos Gradientes Ecológicos, a qual assume que a seleção divergente entre gradientes ambientais é suficiente para que ocorra diferenciação e especiação em ambientes transicionais, como ecótonos e gradientes latitudinais, mesmo que não haja restrição completa do fluxo gênico (ENDLER, 1977; RICE; HOSTERT, 1993; SMITH et al. 1997; ORR; SMITH, 1998). Dessa forma, a utilização de diferentes grupos biológicos como modelos para estudos filogeográficos permite a melhor compreensão dos processos responsáveis pelo padrão de distribuição das espécies. Entretanto, estudos biogeográficos com invertebrados ainda são escassos na Mata Atlântica, havendo pesquisas desenvolvidas apenas com abelhas (BATALHA-FILHO et al., 2010), vespas (SILVA; NOLL, MORALES-CORRÊA E CASTRO, 2018), formigas (RESENDE et al., 2010; CARDOSO et al., 2015), dípteros (AMORIM; SANTOS, 2017) e a espécie de cupim Nasutitermes corniger, a qual não apresentou diferenças genéticas que resultassem em estruturação entre as populações distribuídas ao longo da Mata Atlântica (SANTOS et al., 2017). 1.3 Estudos genéticos 1.3.1 Delimitação de espécies com base em dados moleculares A espécie é uma unidade fundamental para a biologia, entretanto, existem diversos conceitos e definições, os quais consideram diferentes aspectos (biológicos, morfológicos, ecológicos, entre outros), que podem levar a diferenças na delimitação de uma espécie (MAYDEN, 1997; DE QUEIROZ, 2007). Dentre os muitos conceitos existentes, alguns levam em consideração a relação de ancestralidade-descendência, como o Conceito Evolutivo de Espécie, o qual sugere que espécies são linhagens que evoluem separadamente 21 de outras, com suas próprias tendências e histórias evolutivas (SIMPSON, 1951; WILEY, 1978; MAYDEN, 1997) e o Conceito Filogenético de Espécie, que apresenta diferentes classes, porém todas relacionadas com a sistemática filogenética ou cladística, de modo que espécies seriam resultantes de seleção natural, sendo as menores entidades biológicas que são diagnosticáveis e/ou monofiléticas (ROSEN, 1979; NELSON; PLATNICK, 1981; CRACRAFT, 1983; DONOGHUE, 1985; MISHLER, 1985; NIXON; WHEELER, 1990). A biologia molecular tem sido uma ferramenta muito utilizada em estudos de reconhecimento e delimitação de espécies, considerando aspectos genéticos e filogenéticos. Recentemente, diversos estudos têm permitido a separação de espécies crípticas e a determinação da diversidade de espécies de cupins, por meio de genes mitocondriais e nucleares ou marcadores microssatélites (JENKINS et al., 2001; ROY et al., 2006, 2014; COPREN, 2007; MONAGHAN et al., 2009; HAUSBERGER et al., 2011; SCICCHITANO et al., 2017a). 1.3.2 Genética de populações e filogeografia A genética de populações é uma área que diz respeito à origem, quantidade e distribuição da variação genética presente em populações e o destino desta variação no tempo e no espaço (TEMPLETON, 2011). Sequências variantes de um mesmo segmento de DNA (cópias homólogas) são denominadas haplótipos e podem ser geradas por meio de mutações ou por recombinação, de modo que a variação genética pode ser estudada por meio destes polimorfismos (FUTUYMA, 2005). Já a interação entre os eventos de mutação, deriva genética, fluxo gênico e seleção natural determinam as frequências alélicas nas populações ao longo do tempo e também no espaço, sendo o agrupamento de populações diferenciadas conhecido como estrutura populacional (HARTL; CLARK, 2010; TEMPLETON, 2011). A área de estudos que se preocupa em compreender os princípios e explicar os processos que norteiam a distribuição geográfica de linhagens genealógicas é a filogeografia (AVISE, 2000). Por meio de estudos filogeográficos é possível elaborar hipóteses sobre os processos responsáveis pela formação da biota de uma região, uma vez que a estrutura populacional de uma espécie revela os eventos históricos sofridos não apenas por suas populações, mas por toda a biota e, desse modo, podem-se ainda detectar possíveis áreas de endemismo (AVISE, 1992; ALLENDORF; LUIKART; AITKEN, 2012). Para tal, grupos específicos de animais e plantas têm sido utilizados, sendo os processos extrapolados para 22 outros táxons, entretanto, a análise se torna mais sensível e eficiente quando incluídos táxons não relacionados entre si (SIGRIST; CARVALHO, 2008). As análises filogeográficas eram realizadas inicialmente pela sobreposição de redes de haplótipos e mapas, buscando padrões entre a filogenia e a geografia (AVISE et al., 1987). Posteriormente, desenvolveu-se a análise de clados filogeograficamente aninhados (Nested Clade Phylogeographic Analysis - NCPA) (TEMPLETON; ROUTMAN; PHILLIPS, 1995), que foi o primeiro método a utilizar testes estatísticos, embora este não seja considerado um método de filogeografia estatística por muitos autores (KNOWLES; MADDISON, 2002). A NCPA é uma análise que permite quantificar as associações entre a geografia, o tempo e a rede de haplótipos, com base em uma rede haplotípica aninhada (TEMPLETON; ROUTMAN; PHILLIPS, 1995). Por meio da NCPA pode-se inferir uma relação de descendência entre os haplótipos, em que haplótipos ou clados aninhados que se localizam nas pontas serão sempre mais recentes que haplótipos ou clados que se encontram no interior da rede haplotípica (TEMPLETON, 2011). Além disso, a distribuição espacial pode ser correlacionada por meio da distância entre os clados (Dc), que mede quão espacialmente disperso um clado é, e da distância do clado aninhado (Dn), que quantifica quão distante um haplótipo ou clado está em relação aos haplótipos ou clados aos quais ele está evolutivamente mais relacionado (TEMPLETON, 2011). Assim, eventos passados como isolamento por distância, fragmentação alopátrica ou expansão de distribuição, podem ser inferidos com base nos valores significantes de Dc e Dn (TEMPLETON, 2011). Estas inferências são então consideradas hipóteses que deverão ser testadas por meio de outros métodos (CUNHA; SOLÉ-CAVA, 2012). A indicação de fragmentação alopátrica pela NCPA pode corresponder a um evento de especiação ou a diferenciação das populações com uma descontinuidade geográfica abrupta entre elas (CUNHA; SOLÉ-CAVA, 2012) podendo ser testada por meio de análises filogenéticas ou da Análise de Variância Molecular (AMOVA) (COCKERHAM, 1969, 1973; WEIR; COCKERHAM, 1984; LONG, 1986), a qual separa a variância molecular em níveis hierárquicos e testa diferentes hipóteses de estruturação com base na estatística Φ, análoga a estatística F (WRIGHT, 1978). A expansão da distribuição inferida pela NCPA pode refletir um aumento na distribuição ou crescimento populacional (CUNHA; SOLÉ-CAVA, 2012), podendo ser testada por meio de uma análise de distribuição das diferenças (mismatch distribution analysis), a qual apresenta uma distribuição unimodal do número de diferenças entre pares de sequências para populações que exibirem crescimento populacional súbito, enquanto populações estáveis apresentam distribuições multimodais (ROGERS; HARPENDING, 1992). Efeitos da 23 expansão populacional também podem ser detectados por meio de testes de neutralidade (TAJIMA, 1989; FU; LI, 1993; FU, 1997), os quais podem indicar ainda seleção balanceadora, seleção diversificadora ou efeito Walund (RAMOS-ONSINS; ROZAS, 2002; HARTL; CLARK, 2010). Por sua vez, o isolamento por distância inferido pela NCPA pode ser confirmado pelo teste de Mantel (1967), o qual correlaciona a distância genética e a distância geográfica a fim de constatar se o fluxo gênico entre as populações diminui com o aumento da distância geográfica (CUNHA; SOLÉ-CAVA, 2012). Análises filogeográficas podem ser realizadas ainda por meio de métodos estatísticos que utilizam abordagens de Máxima Verossimilhança ou Bayesiana para verificar a probabilidade de ocorrência de modelos alternativos, sugeridos com base em hipóteses a priori sobre o passado demográfico e evolutivo de uma espécie, bem como de eventos biogeográficos que podem ter influenciado estes (CUNHA; SOLÉ-CAVA, 2012). Desse modo, a modelagem de cenários populacionais alternativos é feita com base na teoria da coalescência e na comparação entre os dados observados e os padrões esperados, obtidos com os modelos (CUNHA; SOLÉ-CAVA, 2012). Para os grupos de insetos sociais, as análises de estrutura populacional têm como unidade básica a colônia e não o indivíduo (THORNE et al., 1999; LEPAGE; DARLINGTON, 2000), de modo que, indivíduos morfologicamente heterogêneos por pertencerem a castas distintas, mas intimamente relacionados, formam colônias e estas compõem as populações (VARGO; HUSSENEDER, 2011). As colônias de cupins são fundadas, em sua maioria, por um par monogâmico, ou seja, um rei e uma rainha, sendo estas colônias classificadas como famílias simples (NUTTING, 1969; VARGO; HUSSENEDER, 2009). Existem também colônias que apresentam reprodutores secundários, os quais substituem ou suplementam os reprodutores primários, sendo as colônias formadas por múltiplas rainhas (poliginia) ou por múltiplos reis (poliandria) e classificadas em famílias estendidas ou mistas, quando os reprodutores secundários são, respectivamente, descendentes do casal real ou de diferentes casais (THORNE, 1985; ROISIN, 1993; VARGO; HUSSENEDER, 2011). Colônias de uma mesma espécie podem ainda apresentar sistemas de acasalamento distintos, contudo as razões dessa variação ainda não são bem compreendidas (VARGO; HUSSENEDER, 2011). Em relação ao gênero Nasutitermes, pesquisas com N. corniger e N. nigriceps vem demonstrando que a maior parte das colônias são formadas por um parte monogâmico (ATKINSON; ADAMS, 1997; THOMPSON; HEBERT, 1998). Estudos de genética populacional são comuns com espécies de cupins desde a década de 80, os quais objetivaram não apenas estimar a estrutura genética das populações, 24 mas também investigar o sistema de acasalamento das espécies e sua capacidade de dispersão, bem como delimitar o tamanho das colônias (REILLY, 1987; HUSSENEDER et al., 1998, 2005; THORNE et al., 1999; GOODISMAN; CROZIER, 2002; VARGO; HUSSENEDER; GRACE, 2003; VARGO, 2003; VARGO; CARLSON, 2006; YEAP; OTHMAN; LEE, 2011; BOOTH et al., 2012; HUANG et al., 2013; LUCHETTI; SCICCHITANO; MANTOVANI, 2013; FOURNIER et al., 2016). Até o momento, foram realizados estudos com três espécies do gênero Nasutitermes. Para N. nigriceps, foi observado fluxo gênico restrito entre três localidades da Jamaica e a predominância de colônias formadas por famílias simples (THOMPSON; HEBERT, 1998). Dois estudos com N. takasagoensis sugerem que esta espécie apresenta capacidade de se dispersar por alguns quilômetros, como entre ilhas do sul do Japão, porém grandes distâncias são suficientes para restringir o fluxo gênico e aumentar a distância genética, como observado entre populações do Japão e Taiwan (GARCÍA et al., 2002, 2004). Um estudo conduzido com colônias de N. corniger coletadas no Panamá mostrou que estas não apresentaram associação entre grau de relacionamento e agressividade dos espécimes, sugerindo que erros de reconhecimento, devido a presença de colônias com múltiplos reis e rainhas não relacionados, poderiam levar a formação de colônias com estruturas complexas (ADAMS; ATKINSON; BULMER, 2007). Outro estudo realizado com N. corniger mostrou uma alta estruturação genética entre populações distribuídas ao longo da América Central e do Sul, com haplótipos restritos a diferentes biomas (SANTOS et al., 2017). Os cupins podem ser considerados como modelos excelentes para estudos filogeográficos, devido à forte dependência com o local de formação das colônias, e assim permitem a compreensão dos fatores geográficos que influenciam no padrão de dispersão não apenas do grupo, mas de todo o bioma ao qual está inserido. O padrão de distribuição de espécies do gênero Reticulitermes vem sendo amplamente investigado na América do Norte, Europa e Ásia, demonstrando a influência de glaciações e eventos geológicos na distribuição atual das espécies ou de suas populações (SZALANSKI et al., 2008; KUTNIK et al., 2004; PARK et al., 2006; TRIPODI et al., 2006; MCKERN et al., 2007; AUSTIN et al., 2008; LEFEBVRE et al., 2008, 2016; VELONÀ et al., 2010; DEDEINE et al., 2016; SCICCHITANO et al., 2017b). Estudos filogeográficos também foram desenvolvidos com espécies de Coptotermes, nos quais foram identificados os centros de origens de populações encontradas nos Estados Unidos, Porto Rico e Austrália (JENKINS et al., 2007) e na Ásia (LI et al., 2009), e também com espécies de Heterotermes nas Ilhas do Caribe (SZALANSKI et al., 2004), Schedorhinotermes na África (WILFERT et al., 2006), Amitermes na Austrália 25 (OZEKI et al., 2007), Macrotermes na Ásia (VEERA SINGHAM; OTHMAN; LEE, 2017) e Kalotermes na Europa (SCICCHITANO et al., 2017a). Já o gênero Nasutitermes foi abordado em um estudo que englobou espécies encontradas na região tropical do Oceano Pacífico, no qual não foi possível afirmar se a origem do gênero seria anterior a separação de Gondwana ou se teriam havido eventos de dispersão para América do Sul e Austrália a partir do Velho Mundo (MIURA; ROISIN; MATSUMOTO, 2000). Outro estudo com o gênero Nasutitermes demonstrou que a espécie N. corniger originou-se na América Central e se dispersou para a América do Sul, com novos haplótipos ocupando distintos biomas, como a Mata Atlântica, Cerrado e Caatinga (SANTOS et al., 2017). 1.3.3 Reconstrução filogenética As relações entre os organismos podem ser inferidas por diferentes abordagens, tais como a abordagem fenética, a qual utiliza parâmetros de similaridade entre os organismos, como a distância genética, e não é baseada em um modelo evolutivo (PAGE; HOLMES, 1998). Já as abordagens cladísticas e estatísticas, por sua vez, estão pautadas em modelos evolutivos (PAGE; HOLMES, 1998), sendo Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana as metodologias mais utilizadas para inferências filogenéticas. A Máxima Parcimônia foi desenvolvida originalmente para dados morfológicos (HENNIG, 1966) e seleciona a árvore (ou árvores) que necessita do menor número de mudanças evolutivas, ou seja, a árvore mais parcimoniosa (PAGE; HOLMES, 1998). Nesta análise são considerados apenas os sítios informativos, ou seja, sítios que apresentam pelo menos dois tipos de nucleotídeos representados, sendo cada um deles exibido ao menos duas vezes na amostra (FITCH, 1977). Esta análise é livre de hipóteses pré- determinadas por modelos de substituição de nucleotídeos assumidos previamente, o que pode contribuir para que uma árvore mais próxima da verdadeira seja encontrada, quando a divergência entre as sequências é baixa (MIYAMOTO; CRACRAFT, 1991; NEI; KUMAR, 2000). Entretanto, quando o número de nucleotídeos analisados é muito pequeno e as sequências apresentam alta divergência ou substituições não homoplásicas, a análise de parcimônia pode gerar uma topologia incorreta (NEI; KUMAR, 2000), devido aos fenômenos de atração de ramos longos (HENDY; PENNY, 1989) e atração de ramos curtos (NEI, 1996). A Máxima Verossimilhança analisa a probabilidade de diferentes topologias, considerando um conjunto de sequências e um modelo de substituição assumido 26 previamente, sendo escolhida a árvore que apresente a probabilidade máxima (NEI; KUMAR, 2000), ou seja, a árvore com maior probabilidade de ter dado origem aos dados analisados (PAGE; HOLMES, 1998). Dessa forma, uma topologia incorreta pode ser selecionada quando a taxa de substituição nucleotídica varia consideravelmente de um ramo para outro, mesmo com grandes conjuntos de dados (HUELSENBECK, 1995). Entretanto, a Máxima Verossimilhança é uma das metodologias mais robustas para reconstruções filogenéticas, uma vez que a inclusão de um modelo de substituição adequado ao conjunto de dados permite a correção de eventos mutacionais entre sequências que foram separadas há muito tempo ou estão evoluindo rapidamente (HOLDER; LEWIS, 2003). A Inferência Bayesiana busca a árvore com maior probabilidade posterior, ou seja, considera a probabilidade de modo semelhante a Máxima Verossimilhança multiplicada pela probabilidade resultante de hipóteses inferidas à priori, como modelo e taxa de substituição de nucleotídeos, entre outras (HOLDER; LEWIS, 2003). Este método é amplamente utilizado nos dias de hoje, uma vez que fornece medidas de suporte mais rápido que a Máxima Verossimilhança (bootstrap) (HOLDER; LEWIS, 2003) bem como permite a inclusão de modelos complexos de evolução, como a estimativa de tempos de divergência (THORNE; KISHINO; PAINTER, 1998). Em relação à filogenia do gênero Nasutitermes, até o momento foram desenvolvidos trabalhos baseados em dados moleculares apenas com grupos de regiões específicas ou contendo alguns representantes do gênero em trabalhos que abrangeram toda a família Termitidae ou a Infraordem Isoptera. Estudos voltados para o gênero Nasutitermes foram desenvolvidos com 17 espécies que ocorrem na região tropical do Oceano Pacífico, utilizando os genes mitocondriais COII e 16S (MIURA; ROISIN; MATSUMOTO, 2000) e com 16 espécies presentes na Guiana Francesa, também por meio dos genes mitocondriais COII e 16S e do fragmento nuclear ITS2 (Internal Transcribed Spacer) (ROY et al., 2014). Espécies australianas foram analisadas por meio dos genes mitocondriais COII e 16S em um estudo filogenético que englobou quatro espécies de Nasutitermes e três de Tumulitermes, os quais não foram recuperados como monofiléticos, sugerindo que as características morfológicas utilizadas para estabelecer as relações entre estas espécies não correspondem às relações filogenéticas (BERGAMASCHI et al., 2007). Posteriormente, 86 espécies australianas de Nasutitermitinae, sendo 45 de Nasutitermes, foram analisadas por meio dos genes mitocondriais COII, 16S e 12S e da região nuclear ITS1 (ARAB et al., 2017). Neste estudo foram observados eventos de evolução paralela, em que o hábito de construção 27 de ninhos e tipo de alimentação surgiram em diferentes momentos, o que é consistente com períodos de alterações climáticas e provavelmente contribuíram para o sucesso do grupo. Trinta e um gêneros de ocorrência asiática das famílias Termitidae e Rhinotermitidae foram utilizados para uma análise filogenética, por meio do gene mitocondrial COII, e as 14 espécies de Nasutitermitinae não-mandibulados, sendo sete Nasutitermes, foram agrupadas em um clado monofilético, uma vez que esta subfamília abrigava também os mandibulados, pertencentes hoje a subfamília Syntermitinae (OHKUMA et al., 2004). A história evolutiva da família Termitidae foi inferida em diferentes estudos, primeiramente, foram analisadas 321 espécies, sendo 28 de Nasutitermes, por meio dos genes COII, 12S e 28S (INWARD; VOGLER; EGGLETON, 2007). Posteriormente, dois estudos utilizaram o genoma mitocondrial, sendo que o primeiro englobou sequências de 66 espécies da família Termitidae, das quais quatro eram do gênero Nasutitermes, e o segundo incluiu 384 amostras de Termitidae, sendo 44 Nasutitermes (BOURGUIGNON et al., 2015, 2017). Por fim, a análise filogenética da infraordem Isoptera foi reconstruída por meio dos genes COI, COII, Cyt b, 12S, 16S, 18S e 28S, englobando 40 espécies, das quais uma é do gênero Nasutitermes (LEGENDRE et al., 2008). Contudo, a maioria das espécies utilizadas nos estudos citados não são coincidentes entre estes, o que inviabiliza a comparação e o entendimento mais amplo das relações filogenéticas entre as espécies do gênero Nasutitermes e dos eventos que levaram ao padrão de distribuição observado atualmente para este gênero, o qual acredita-se que seja decorrente de processos de diversificação, irradiação e dispersão, associados às condições ambientais regionais (EGGLETON; TAYASU, 2001; DAVIES et al., 2003). A princípio, foi proposta a hipótese da origem do gênero Nasutitermes na América do Sul, anteriormente a divisão de Gondwana, sugerindo uma separação inicial entre as espécies neotropicais e australianas, seguida das australianas e da Nova Guiné (MIURA; ROISIN; MATSUMOTO, 2000). Entretanto, trabalhos mais recentes, utilizando uma visão geral da família, vem demonstrando que Termitidae se originou na África e sua diversificação é posterior a divisão de Gondwana (ENGEL; GRIMALDI; KRISHNA, 2009; BOURGUIGNON et al., 2015), ocorrendo, num primeiro momento, eventos de dispersão para América do Sul e Ásia há 35- 23 Ma e, posteriormente, eventos de dispersão da América do Sul para Ásia e Austrália e da Ásia de volta para a África há 23-5 Ma, possivelmente por meio de troncos flutuantes (BOURGUIGNON et al., 2017). Dessa forma, este trabalho buscou reunir o maior número possível de táxons do gênero Nasutitermes, a fim de abranger sua amplitude de ocorrência, para assim, compreender o processo de diversificação geográfica de suas espécies. 28 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais Este trabalho teve como objetivos gerais diferenciar, por meio de ferramentas moleculares, as espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae; definir os processos responsáveis pelo padrão de distribuição da variabilidade genética da espécie N. jaraguae e entender as relações filogenéticas e os processos de diversificação das espécies do gênero Nasutitermes. 2.2 Objetivos específicos Com o intuito de atingir o objetivo geral de diferenciar as espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae, este trabalho propôs:  verificar se as distintas espécies que compõem o Grupo N. jaraguae, definidas com base em caracteres morfológicos, podem ser consideradas unidades evolutivas diferentes;  analisar a relação entre os haplótipos do Grupo N. jaraguae e a conectividade entre eles;  avaliar a amplitude da distância genética entre os haplótipos do Grupo N. jaraguae. A fim de atingir o objetivo geral de definir os processos responsáveis pelo padrão de distribuição da variabilidade genética da espécie N. jaraguae, este trabalho visou:  caracterizar geneticamente as populações de N. jaraguae;  analisar filogeograficamente as populações de N. jaraguae, estabelecendo uma correlação entre a variabilidade genética destas e sua distribuição espacial;  analisar a relação filogenética entre os espécimes de N. jaraguae e determinar o tempo de divergência de seus haplótipos;  propor eventos ocorridos que possam ter contribuído para a estruturação das populações de N. jaraguae;  verificar se N. jaraguae se enquadra em modelos de distribuição biogeográfica para a Mata Atlântica já conhecidos para outros grupos. 29 Com o propósito de alcançar o objetivo geral de entender as relações filogenéticas e os processos de diversificação das espécies do gênero Nasutitermes, este trabalho pretendeu:  propor uma filogenia molecular para as espécies do gênero Nasutitermes, utilizando uma abordagem estatística;  compreender os processos que contribuíram com a distribuição atual das espécies do gênero Nasutitermes nas diferentes regiões zoogeográficas. 30 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material biológico 3.1.1 Espécimes utilizados na análise de delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae Para a análise de delimitação de espécies foram utilizados espécimes identificados morfologicamente como Nasutitermes jaraguae, Nasutitermes ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4. Estas espécies foram selecionadas por apresentarem grande similaridade morfológica entre si, mas com algumas diferenças sutis que as distinguem, como presença e quantidade de pelos e cerdas nos tergitos e formato do pronoto e da cabeça. Embora as espécies N. auriantacus, N. auriantacoides e N. itapocuensis também façam parte do Grupo N. jaraguae, estas não foram encontradas nas coletas recentes e assim, não puderam ser incluídas nas análises, pois as amostras disponíveis encontravam-se armazenadas em álcool 80% há mais de 40 anos, inviabilizando a análise molecular. Foram utilizados espécimes coletados ao longo da Mata Atlântica entre 2014 e 2017, bem como espécimes provenientes de coletas anteriores (1993 a 2012), sendo todos identificados pela Profa. Dra. Eliana Marques Cancello e depositados na Coleção de Isoptera do Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZUSP), onde encontram-se armazenados, respectivamente, em álcool 100% e 80%. Foram utilizados também espécimes depositados em álcool 80% na Coleção de Isoptera do Laboratório de Termitologia (LabTermes) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), identificados pelo Prof. Dr. Alexandre Vasconcellos, Profa. Dra. Flávia Maria da Silva Moura e Msc. Matilde Vasconcelos Ernesto. Posteriormente, as amostras receberam um número de identificação (voucher) na Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE) (Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista - FCAV-UNESP) (Tabela 1 e Apêndice A). 31 Tabela 1. Espécies utilizadas na análise de delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae. Espécie N Voucher Nasutitermes jaraguae 82 262, 265, 266, 432, 433, 434, 435, 436, 461, 462, 464, 466, 467, 484, 485, 516, 517, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 578, 579, 607, 609, 610, 611, 612, 626, 627, 628, 629, 688, 690, 691, 692, 694, 696, 698, 699, 700, 710, 717, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 735, 740, 741, 742, 744 Nasutitermes ehrhardti 6 552, 555, 558, 621, 739, 747 Nasutitermes sp. 1 11 424, 518, 554, 556, 557, 559, 560, 561, 623, 624, 738 Nasutitermes sp. 2 16 425, 519, 553, 562, 563, 564, 565, 566, 568, 571, 573, 574, 575, 576, 577, 620 Nasutitermes sp. 3 2 520, 542 Nasutitermes sp. 4 5 567, 569, 570, 572, 743 Espécies identificadas com base em caracteres morfológicos, número de espécimes utilizados (N) e números de identificação (voucher) da Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE). 3.1.2 Espécimes utilizados nas análises populacionais e filogeográficas de Nasutitermes jaraguae Para as análises populacionais e filogeográficas, foram selecionados os espécimes identificados como Nasutitermes jaraguae pela análise de delimitação de espécies, ou seja, aqueles que pertenceram à mesma unidade evolutiva com base nos dados moleculares. Dessa forma, foram utilizados um total de 76 espécimes provenientes dos estados do Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Tabela 2, Figura 4 e Apêndice A). A fim de se amostrar colônias distintas, as amostras foram coletadas a uma distância mínima de 50 metros umas das outras, sendo as colônias de cada localidade consideradas como populações. Todos os espécimes foram utilizados para amplificação do gene mitocondrial COII, enquanto para a região ITS2 foram selecionados espécimes distribuídos ao longo da área de ocorrência da espécie e que correspondessem a haplótipos distintos para o gene COII (Tabela 2). 32 3 2 Tabela 2. Localidades amostradas nas análises populacionais e filogeográficas de Nasutitermes jaraguae, número de colônias amostradas em cada localidade (N) e número de identificação (voucher) da Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE). Estado Município Localidade N Voucher Rio Grande do Norte Nísia Floresta Floresta Nacional de Nísia Floresta 2 719, 720 Paraíba João Pessoa Área de Preservação Permanente Mata do Buraquinho 1 728 João Pessoa Universidade Federal da Paraíba 1 612 Mamanguape Reserva Biológica Guaribas 2 610, 611 Pernambuco Brejo da Madre de Deus Reserva Particular do Patrimônio Natural Estadual Fazenda Bituri 2 725, 726 Alagoas Ibateguara Usina Serra Grande 1 721 Bahia Boa Nova - 1 710 Ilhéus Mata da Esperança 3 262, 516, 609 Itambé - 1 696 Maracás Ferbasa 2 723, 724 Poções - 6 435, 688, 690, 691, 692, 694 Vitória da Conquista Fazenda Raul Ferraz 1 467 Minas Gerais Alfenas Sítio Vale do Sol 1 729 Juiz de Fora Reserva Biológica Municipal do Poço D'Anta 2 628, 629 Morro da Água Quente - 1 526 Santa Bárbara - 5 524, 525, 537, 562, 627 Espírito Santo Afonso Cláudio - 1 432 Linhares Reserva Biológica de Sooretama 4 265, 434, 527, 528 Santa Teresa Reserva Augusto Ruschi 1 735 Rio de Janeiro Santa Maria Madalena Parque Estadual do Desengano 2 740, 742 Santa Maria Madalena Horto (Cede Parque Estadual do Desengano) 1 744 Amostras destacadas em negrito tiveram a região ITS2 analisadas além do gene mitocondrial COII. Continua. 33 3 3 Tabela 2. Continuação. Estado Município Localidade N Voucher São Paulo Cajati - 1 529 Campinas Área de Relevante Interesse Ecológico Mata de Santa Genebra 2 547, 548 Cananéia Parque Estadual da Ilha do Cardoso 7 436, 461, 462, 484, 485, 579, 607 São Paulo Parque Estadual da Cantareira, Núcleo Engordador 1 698 Salesópolis Estação Biológica de Boracéia 1 699 Ubatuba Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Picinguaba 3 464, 466, 717 Vargem Grande do Sul Horto 1 700 Paraná Morretes - 2 266, 433 Santa Catarina Apiúna - 1 530 Cunha-Porã - 1 546 Indaial - 1 578 Iraceminha - 1 536 Orleans - 1 532 Tubarão - 1 531 Rio Grande do Sul Boa Vista das Missões - 1 545 Cambará do Sul Parque Nacional de Aparados da Serra 5 521, 533, 539, 540, 543 Cambará do Sul - 3 517, 534, 544 São Leopoldo - 2 522, 535 Amostras destacadas em negrito tiveram a região ITS2 analisadas além do gene mitocondrial COII. 34 Figura 4. Mapa de distribuição das amostras de Nasutitermes jaraguae utilizadas nas análises populacionais e filogeográficas. 3.1.3 Táxons amostrados na análise filogenética do gênero Nasutitermes Esta análise englobou 70 espécies e 54 morfoespécies do gênero Nasutitermes (Tabela 3). Foram utilizadas amostras depositadas em álcool 100% na coleção de Isoptera do MZUSP, bem como sequências disponíveis no banco de dados GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Como grupo externo e para fins de calibração das árvores, foram utilizados dois gêneros também pertencentes à subfamília Nasutitermitinae (Cortaritermes e Sandsitermes), dois gêneros da subfamília Termitinae (Amitermes e Neocapritermes), dois gêneros da subfamília Syntermitinae (Embiratermes e Syntermes), todos pertencentes à família Termitidae, e um gênero da família Rhinotermitidae (Heterotermes) (Tabela 3). Os representantes do grupo externo foram selecionados com base em relações filogenéticas apresentadas com o gênero Nasutitermes (INWARD; VOGLER; EGGLETON, 2007). 35 3 5 Tabela 3. Espécies do gênero Nasutitermes e grupo externo utilizados nas análises filogenéticas; regiões zoogeográficas de ocorrência (Procheş e Ramdhani, 2012); número de identificação (voucher) da Coleção Molecular de Isoptera do Laboratório de Biologia Evolutiva (LaBE) ou número de acesso no banco de dados GenBank. Espécies Região Zoogeográfica Local de coleta COII 16S 12S ITS2 Referências Nasutitermes acajutlae (Holmgren, 1910) Neotropical + Caribe Guiana Francesa KC631022 KF724760 - KF724834 Roy et al. (2014) Nasutitermes acangussu Bandeira e Fontes, 1979 Neotropical Brasil 144 144 144 144 LaBE Nasutitermes anamalaiensis Snyder, 1933 Indo-Malásia Índia - KU574659 - - Vidyashree et al. Nasutitermes aquilinus (Holmgren, 1910) Neotropical Brasil 427 427 427 427 LaBE Nasutitermes arborum (Smeathman, 1781) Afrotropical Burundi KY224603 KY224603 KY224603 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes banksi Emerson, 1925 Neotropical Brasil 145 145 145 145 LaBE Nasutitermes bikpelanus Roisin e Pasteels, 1996 Nova-Guiné Indonésia KP026296 KP026296 KP026296 - Bourguignon et al. (2015) Nasutitermes bivalens (Holmgren, 1910) Neotropical Brasil 137 137 137 137 LaBE Nasutitermes callimorphus Mathews, 1977 Neotropical Brasil 428 428 428 428 LaBE Nasutitermes carnarvonensis (Hill, 1942) Australiana Austrália KX011792 KX011714 KX011636 - Arab et al. (2017) Nasutitermes centraliensis (Hill, 1925) Australiana Austrália KX011808 - KX011651 - Arab et al. (2017) Nasutitermes ceylonicus (Holmgren, 1911) Indo-Malásia Sri Lanka DQ442175 - DQ441745 - Inward et al. (2007) Nasutitermes coalescens (Mjöberg, 1920) Australiana Austrália KX011783 KX011705 KX011628 - Arab et al. (2017) Nasutitermes corniger (Motschulsky, 1855) Neotropical + Caribe + Neártica Brasil Guiana Francesa 156 - 156 - 156 - - KF724765 LaBE Roy et al. (2014) Nasutitermes coxipoensis (Holmgren, 1910) Neotropical Guiana Francesa KC630994 KF724737 - KF724774 Roy et al. (2014) Nasutitermes dasyopsis Thorne, 1989 Neotropical Costa Rica DQ442177 - DQ441747 - Inward et al. (2007) Nasutitermes diabolus (Sjöstedt, 1907) Afrotropical R. D. Congo KY224393 KY224393 KY224393 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes dixoni (Hill, 1932) Australiana Austrália KX011842 KX011759 KX011681 - Arab et al. (2017) Nasutitermes ehrhardti (Holmgren, 1910) Neotropical Brasil 558/424 558/424 558/424 558/424 LaBE Nasutitermes ephratae (Holmgren, 1910) Neotropical + Caribe Brasil 146 146 146 146 LaBE Nasutitermes eucalypti (Mjöberg, 1920) Australiana Austrália DQ442182 - - EF078995 DQ441752 - - - Inward et al. (2007) Bergamaschi et al. (2007) Nasutitermes exitiosus (Hill, 1925) Australiana Austrália KY224624 KY224624 KY224624 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes fulleri Emerson, 1928 Afrotropical Guiana Francesa DQ442183 - DQ441753 - Inward et al. (2007) Nasutitermes fumigatus (Brauer, 1865) Australiana Austrália KX011830 KX011747 KX011671 - Arab et al. (2017) Nasutitermes gaigei Emerson, 1925 Neotropical Brasil 147 147 147 147 LaBE Nasutitermes glabritergus Snyder e Emerson, 1949 Neotropical Costa Rica DQ442184 - DQ441754 - Inward et al. (2007) Nasutitermes globiceps (Holmgren, 1910) Neotropical Brasil 22 57 56 22 LaBE Nasutitermes graveolus (Hill, 1925) Australiana + Nova-Guiné Austrália KY224439 KY224439 KY224439 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes guayanae (Holmgren, 1910) Neotropical + Caribe Brasil 130 115 115 115 LaBE Nasutitermes indicola (Holmgren and Holmgren, 1917) Indo-Malásia Índia - KU574660 - - Vidyashree et al. Nasutitermes infuscatus (Sjöstedt, 1902) Afrotropical Quênia DQ442186 - DQ441756 - Inward et al. (2007) Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910) Neotropical Brasil 521/530/578 521/530/578 521/530/578 521/530/578 LaBE Nasutitermes johoricus (John, 1925) Indo-Malásia Tailândia/Japão AB109491 - - - Ohkuma et al. (2004) Nasutitermes kemneri Snyder e Emerson, 1949 Neotropical Brasil 458 458 458 458 LaBE Nasutitermes kinoshitai (Hozawa, 1915) Paleártica Taiwan - KT372052 - Liang e Li Nasutitermes lacustris (Bugnion, 1912) Indo-Malásia Sri Lanka DQ442187 - DQ441757 - Inward et al. (2007) Nasutitermes latifrons (Sjöstedt, 1896) Afrotropical R. D. Congo KY224631 KY224631 KY224631 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes longinasus (Holmgren, 1913) Indo-Malásia Malásia Borneo - DQ442189 AB037356 - - DQ441759 - - Miura et al. (2000) Inward et al. (2007) Nasutitermes longipennis (Hill, 1915) Australiana Austrália KY224483 KY224483 KY224483 - Bourguignon et al. (2017) Continua. 36 3 6 Tabela 3. Continuação. Espécies Região Zoogeográfica Local de coleta COII 16S 12S ITS2 Referências Nasutitermes longirostris (Holmgren, 1913) Indo-Malásia Brunei KY224397 KY224397 KY224397 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes lujae (Wasmann, 1911) Afrotropical R. D. Congo KY224441 KY224441 KY224441 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes macrocephalus (Silvestri, 1903) Neotropical Brasil 148/426 148/426 148/426 148/426 LaBE Nasutitermes magnus (Froggatt, 1898) Australiana Austrália KX011787 KX011709 KX011632 - Arab et al. (2017) Nasutitermes major (Holmgren, 1906) Neotropical Brasil 140 140 140 140 LaBE Nasutitermes matangensis (Haviland, 1898) Indo-Malásia + Wallaceana Tailândia KY224423 KY224423 KY224423 KY224423 Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes matangensis matangensis (Holmgren, 1913) Indo-Malásia + Wallaceana Tailândia/Japão AB109489 - - - Ohkuma et al. (2004) Nasutitermes mauritianus (Wasmann, 1910) Madagascar República da Maurícia - DQ442198 EU253765 - - DQ441769 - - Legendre et al. (2008) Inward et al. (2007) Nasutitermes neoparvus Thapa, 1982 Indo-Malásia Brunei KY224526 KY224526 KY224526 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes nigriceps (Haldeman, 1854) Neotropical + Caribe Venezuela Guiana Francesa AB037329 - AB037346 - - DQ441764 - - Miura et al. (2000) Inward et al. (2007) Nasutitermes novarumhebridarum (Holmgren e Holmgren, 1915) Nova-Guiné Papua Nova-Guiné AB037325 AB037340 - - Miura et al. (2000) Nasutitermes obscurus (Holmgren, 1906) Neotropical Guiana Francesa KC631008 KF724754 - KF724806 Roy et al. (2014) Nasutitermes octopilis Banks, 1918 Neotropical Brasil 149 149 149 149 LaBE Nasutitermes parvonasutus (Nawa, 1911) Paleártica Taiwan FJ232062 - - AB037354 - - - - Matsuura; Yashir Miura et al. (2000) Nasutitermes perparvus Ahmad, 1965 Indo-Malásia Tailândia/Japão AB109490 - - - Ohkuma et al. (2004) Nasutitermes nr. perparvus Ahmad, 1965 Indo-Malásia Tailândia KP026261 KP026261 KP026261 - Bourguignon et al. (2015) Nasutitermes pinocchio Roisin & Pasteels, 1996 Nova-Guiné Indonésia AB037336 AB037353 - - Miura et al. (2000) Nasutitermes pluvialis (Mjöberg, 1920) Australiana Austrália KX011778 - - - Arab et al. (2017) Nasutitermes princeps (Desneux, 1905) Australiana + Nova-Guiné + Wallaceana Indonésia AB037334 AB037351 - - Miura et al. (2000) Nasutitermes regularis (Haviland, 1898) Indo-Malásia Indonésia AB037338 AB037355 - - Miura et al. (2000) Nasutitermes rippertii (Rambur, 1842) Caribe - - AY623091 - - Scheffrahn et al. (2005) Nasutitermes rotundatus (Holmgren, 1906) Neotropical Brasil 630 630 630 630 LaBE Nasutitermes similis Emerson, 1935 Neotropical Brasil 3 15 15 15 LaBE Nasutitermes smithi (Hill, 1942) Australiana Austrália KX011781 KX011702 KX011625 - Arab et al. (2017) Nasutitermes surinamensis (Holmgren, 1910) Neotropical Brasil 150 150 150 150 LaBE Nasutitermes takasagoensis (Nawa, 1911) Indo-Malásia + Paleártica Japão KP026260 KP026260 KP026260 - Bourguignon et al. (2015) Nasutitermes torresi (Hill, 1942) Australiana + Nova-Guiné Austrália KX011776 KX011764 KX011620 - Arab et al. (2017) Nasutitermes triodiae (Froggatt, 1898) Australiana + Nova-Guiné Austrália NC018131 NC018131 NC018131 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes unduliceps Mathews, 1977 Neotropical Guiana Francesa KC631009 KF724755 - KF724809 Roy et al. (2014) Nasutitermes walkeri (Hill, 1942) Australiana AB037332 AB037349 AB037332 - Nasutitermes wheeleri Emerson, 1925 Neotropical Brasil 135 135 135 135 LaBE Nasutitermes sp. 1 Neotropical Brasil 518/552/ 555/561 518/552/ 555/561 518/552/ 555/561 518/552/ 555/561 LaBE Nasutitermes sp. 2 Neotropical Brasil 519/569 519/569 519/569 519/569 LaBE Nasutitermes sp. 3 Neotropical Brasil 520/541/542 520/541/542 520/541/542 520/541/542 LaBE Nasutitermes sp. 4 Neotropical Brasil 570/572 570/572 570/572 570/572 LaBE Nasutitermes sp. 6 Neotropical Brasil 138/613 138/613 138/613 138/613 LaBE Nasutitermes sp. 7 Neotropical Brasil 139 139 139 139 LaBE Nasutitermes sp. 9 Neotropical Brasil 141/614 141/614 141/614 141 LaBE Continua. 37 3 7 Tabela 3. Continuação. Espécies Região Zoogeográfica Local de coleta COII 16S 12S ITS2 Referências Nasutitermes sp. 10 Neotropical Brasil - 142 - - LaBE Nasutitermes sp. 13 Neotropical Brasil 143 143 143 143 LaBE Nasutitermes sp. 14 Neotropical Brasil 151 152 152 152 LaBE Nasutitermes sp. 15 Neotropical Brasil 429 429 429 429 LaBE Nasutitermes sp. 16 Neotropical Brasil - 430 - 430 LaBE Nasutitermes sp. 17 Neotropical Brasil - 431 - 431 LaBE Nasutitermes sp. 19 Neotropical Brasil 615 615 615 615 LaBE Nasutitermes sp. 20 Neotropical Brasil 616 616 616 616 LaBE Nasutitermes sp. 21 Neotropical Brasil 617 617 617 617 LaBE Nasutitermes sp. 22 Neotropical Brasil 618 618 618 618 LaBE Nasutitermes sp. 23 Neotropical Brasil 622 622 622 622 LaBE Nasutitermes sp. 24 Afrotropical R. D. Congo KY224431 KY224431 KY224431 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 25 Neotropical Colômbia KY224489 KY224489 KY224489 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 26 Neotropical Guiana Francesa KY224500 KY224500 KY224500 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 27 Indo-Malásia Tailândia KY224571 KY224571 KY224571 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 28 Indo-Malásia Tailândia KY224576 KY224576 KY224576 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 29 Indo-Malásia Índia KY224628 KY224628 KY224628 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 30 Indo-Malásia Tailândia KY224664 KY224664 KY224664 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 31 Indo-Malásia Índia KY224666 KY224666 KY224666 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 32 Neotropical Colômbia KY224678 KY224678 KY224678 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 33 Neotropical Guiana Francesa KY224704 KY224704 KY224704 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 34 Indo-Malásia Tailândia KY224707 KY224707 KY224707 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 35 Australiana Austrália KY224713 KY224713 KY224713 - Bourguignon et al. (2017) Nasutitermes sp. 36 Neotropical Equador DQ442178 - DQ441748 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 37 Neotropical Equador DQ442179 - DQ441749 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 38 Neotropical Equador DQ442180 - DQ441750 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 39 Neotropical Equador DQ442181 - DQ441751 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 40 Neotropical Guiana Francesa DQ442173 - DQ441743 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 41 Madagascar Madagascar DQ442196 - DQ441766 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 42 Madagascar Madagascar DQ442195 - DQ441767 - Inward et al. (2007) Nasutitermes sp. 43 Indo-Malásia Malásia - JQ429116 - - Bujang_et_al_2013 Nasutitermes sp. 44 Neotropical Bellevue KC630992 KF724735 - KF724771 Roy et al. (2014) Nasutitermes sp. 45 Caribe Ilhas do Caribe - KP253936 - - Kartzinel; Pringle (2015) Nasutitermes sp. 46 Indo-Malásia Malásia AY940140 - - - Jenkins et al. Nasutitermes sp. 47 Neotropical Costa Rica EU236539 - - - Warnecke et al. (2007) Nasutitermes sp. 48 Paleártica China HQ012036 - - - Huang et al. (2011) Nasutitermes sp. 49 Madagascar Madagascar FJ818924 - - - Monaghan et al. (2009) Nasutitermes sp. 50 Madagascar Madagascar FJ818930 - - - Monaghan et al. (2009) Nasutitermes sp. 51 Madagascar Madagascar FJ818931 - - - Monaghan et al. (2009) Nasutitermes sp. 52 Madagascar Madagascar FJ818933 - - - Monaghan et al. (2009) Nasutitermes sp. 53 Australiana Austrália KX011818 KX011736 KX011661 - Arab et al. (2017) Nasutitermes sp. 54 Australiana Austrália - KX011700 KX011622 - Arab et al. (2017) Continua. 38 3 8 Tabela 3. Continuação. Espécies Região Zoogeográfica Local de coleta COII 16S 12S ITS2 Referências Amitermes amifer Silvestri, 1901 Neotropical Brasil 212 212 212 212 LaBE Cortaritermes intermedius Banks, 1919 Neotropical Brasil Guiana Francesa 619 - 619 - 619 - - KF724787 LaBE Roy et al. (2014) Cortaritermes sp. Neotropical Brasil 549/550/551 549/550/551 549/550/551 - LaBE Embiratermes brevinasus (Emerson & Banks, 1957) Neotropical Brasil 225 225 225 225 LaBE Heterotermes tenuis (Hagen, 1858) Neotropical KU925233 KU925233 KU925233 KX954176 Bourguignon et al. (2016) Neocapritermes opacus (Hagen, 1858) Neotropical Brasil 242 242 242 242 LaBE Sandsitermes robustus (Holmgren, 1906) Neotropical Brasil LaBE 136 136 136 LaBE Syntermes spinosus (Latreille, 1804) Neotropical Brasil 258 258 258 258 LaBE 39 As áreas de ocorrência das espécies foram determinadas com base no tratado de Krishna et al. (2013b) e no catálogo online de Constantino (2018), de acordo com as divisões zoogeográficas apresentadas por Procheş e Ramdhani (2012) (Figura 5). Figura 5. Divisões geográficas consideradas para as análises filogenéticas. Fonte: PROCHEŞ; RAMDHANI (2012). 3.2 Extração do DNA total O DNA total foi extraído da cabeça dos soldados, preferencialmente, ou dos operários quando necessário. Para as amostras armazenadas em álcool absoluto, o DNA foi obtido pelo método de extração descrito por Liu e Beckenbach (1992). Já para as amostras armazenas em álcool 80%, ou seja, em condições não adequadas para a preservação do material genético, foram testados métodos adicionais, a fim de verificar qual o método mais eficiente nestas condições. Foram realizadas extrações de DNA por meio do conjunto de reagentes DNA, RNA, and Protein Purification NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel), DNeasy Tissue Kit (Qiagen), Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), como também pelo método descrito por Bruford et al. (1992) (adaptado por David Vieites) e Gentra Puregene Protocol (adaptado), este último utilizado no laboratório do Prof. Dr, Edward Vargo durante a realização do doutorado sanduíche na Texas A&M University, EUA. O método descrito por Liu e Beckenbach (1992) foi selecionado para as extrações, pois foi o que resultou na maior quantidade de DNA, embora este se encontrasse fragmentado. 40 3.3 Amplificação dos genes mitocondriais e região nuclear Um fragmento do gene mitocondrial COII foi utilizado nas análises de delimitação de espécies do Grupo N. jaraguae, enquanto que para as análises populacionais e filogeográficas de N. jaraguae, utilizou-se também a região ITS2 (Internal Transcribed Spacer) do rDNA nuclear (Tabela 4). Para as amostras armazenadas em álcool 80%, cujo DNA obtido apresentou-se muito degradado, foram desenhados novos primers para o gene COII (Tabela 5), a fim de se obter fragmentos menores da região de estudo. As sequências obtidas para os espécimes armazenados em álcool 100% foram utilizadas como molde, empregando-se a ferramenta Primer3Plus (UNTERGASSER et al., 2007). A formação de dímeros foi verificada por meio da ferramenta Multiple Primer Analyzer - Thermo Scientific Web Tools (https://goo.gl/YU7BA7). Tabela 4. Primers utilizados nos testes de amplificação dos genes empregados nas análises de delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae e análises filogeográficas, populacionais e filogenéticas. Região Primer Sequência (5’-3’) Comprimento aproximado ITS2 400 pb Forward ITS2F1 TGTGAACTGCAGGACACAT Reverse ITS2Rnas2 GCTTAAATTCAGMGGGTAGTC COII 730 e 780 pb Forward F-Leu3 TCTAATATGGCAGATTAGTGC Modified A-tLeu4 CAG ATA AGT GCA TTG GAT TT Reverse R-Lys3 GAGACCAGTACTTGCTTTCAGTCATC B-tLys5,6 GTT TAA GAG ACC AGT ACT TG 16S 400 e 780 pb Forward 16SF7 TTACGCTGTTATCCCTAA Reverse 16SAr8 CGCCTGTTTATCAAAAACAT 16S-R44 TCTGGTTTTTCAAGAAATGA 12S 450 pb Forward SR-J-141999 TACTATGTTACGACTTAT Reverse SR-N-145949 AAACTAGGATTAGATACCC 1Jenkins et al. (2001); 2Roy et al. (2014); 3Whiting (2002); 4Miura, Roisin e Matsumoto (2000); 5Liu e Beckenbach (1992); 6Simon et al. (1994); 7Kambhampati (1995); 8Xiong e Kocher (1991); 9Kambhampati e Smith (1995). Tabela 5. Primers desenhados para a amplificação de fragmentos menores do gene COII, suas respectivas sequências e posição em relação a uma sequência referência de Nasutitermes corniger. Região Primer Sequência (5’-3’) Posição em N. corniger3 Frag 1 Modified A-tLeu 1 CAGATAAGTGCATTGGATTT 3022–3042 COII_Frag1_R ATCGTCTGGTTTGYT 3455-3441 Frag 2 COII_Frag2_F ATCTTCTTCCAHGAY 3356-3370 COII_Frag2_R KCTTCAGTATCAYTGG 3616-3601 Frag 3 COII_Frag3_F GAYGAAATCCACAACC 3557-3572 COII_Frag3_R CGAGAATCTCATTTGG 3850-3835 Frag 4 COII_Frag4_F CTACCAAYAAAYTCACC 3725-3741 B-tLys2 GTTTAAGAGACCAGTACTTG 4017-3998 1Miura, Roisin e Matsumoto (2000); 2Liu e Beckenbach (1992); Simon et al. (1994); 3Número de acesso no Genbank: NC_026115. 41 Para as demais espécies, utilizadas na análise filogenética, foram amplificados fragmentos dos genes mitocondriais COII, 16S rRNA e 12S rRNA e a região ITS2 do rDNA nuclear por meio de conjuntos de primers (Tabela 4) e condições de amplificação específicas (Tabela 6). Tabela 6. Condições de amplificação dos genes utilizados nas análises de delimitação de espécies do Grupo N. jaraguae, análises filogeográficas e filogenéticas. Região gene Desnaturação inicial Desnaturação Anelamento Extensão Extensão final Número de ciclos ITS21 96 (5 min) 96 (30 s) 50 (1 min) 72 (1 min 30 s) 72 (5 min) 45 COII1 94 (3 min) 94 (30 s) 45 (1 min) 72 (3 min) 72 (10 min) 35 COII2 94 (2 min) 94 (1 min) 45-53 (30 s) 72 (1 min 15 s) 72 (7 min) 40 16S1 94 (3 min) 94 (30 s) 45 (1 min) 72 (3 min) 72 (10 min) 35 16S2 94 (2 min) 94 (1 min) 50 (1 min) 72 (1 min 15s) 72 (7 min) 40 12S3 95 (3 min) 95 (30 s) 40 (1 min) 72 (1 min) 10 95 (30 s) 50 (1 min) 72 (1 min) 72 (7 min) 25 Condições descritas por: 1Roy et al. (2014), para o conjunto de primers ITS2F e ITS2Rnas; Modified A-tLeu e B-tLys; 16SF e 16S-R4 2Legendre et al. (2008) para o conjunto de primers F-Leu e R-Lys; Modified A-tLeu e COII_Frag1_R; COII_Frag2_F e COII_Frag2_R; COII_Frag3_F e COII_Frag3_R; COII_Frag4_F e B-tLys; 16SF e 16SAr 3Kambhampati e Smith (1995) As reações de PCR ocorreram em um volume final de 25 μL, sendo 12,5 μL de 2X GoTaq® Green Mastex Mix ou 2X GoTaq® Colorless Mastex Mix (Promega), 0,4 μM de cada primer e 2,5-10 uL de DNA total (~50 ng). Estas foram realizadas no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrária e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista - FCAV-UNESP), em termociclador PTC-100 (MJ Research™), enquanto a amplificação das amostras armazenadas em álcool 80% foi realizada no Rollins Urban and Structural Entomology Facility (Departamento de Entomologia, Texas A&M University, EUA), em termociclador T100™ (Bio-Rad). 3.4 Purificação e sequenciamento Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% e corados com brometo de etídio (1ng/mL) a fim de confirmar a amplificação. Os produtos foram então purificados por meio do kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) ou com as enzimas Exo-SAP (Exonuclease I e Shrimp Alkaline Phosphatase). O sequenciamento foi realizado em sequenciador automático ABI 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, California - CA) no Centro de Recursos Biológicos (CREBIO), na FCAV-UNESP ou em sequenciador automático ABI 3500 DNA Analyzer 42 (Applied Biosystems, Foster City, California - CA) no Rollins Urban and Structural Entomology Facility (Departamento de Entomologia, Texas A&M University, EUA), utilizando o conjunto de reagentes Big Dye (Perkin-Elmer). 3.5 Análise das sequências 3.5.1 Delimitação de espécimes do Grupo Nasutitermes jaraguae As sequências do fragmento do gene mitocondrial COII das espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae (N. jaraguae, N. ehrhardti, Nasutitermes sp. 1, Nasutitermes sp. 2, Nasutitermes sp. 3 e Nasutitermes sp. 4) (Tabela 1) foram lidas com o programa CodonCode Aligner v.5.1.5 (CodonCode Corporation) e editadas no programa BioEdit v.7.2.6.1 (HALL, 1999), no qual foram geradas as sequências consensus. O alinhamento das sequências foi efetuado com o software MUSCLE (EDGAR, 2004; MCWILLIAM et al., 2013). O número de haplótipos foi obtido com o software DnaSP v.5.10 (LIBRADO; ROZAS, 2009) e a distância genética entre os haplótipos foi obtida com o programa MEGA v.6.06 (TAMURA et al., 2013). Uma rede de haplótipos foi construída com o software TCS v.1.21 (CLEMENT; POSADA; CRANDALL, 2000). A filogenia por inferência Bayesiana foi reconstruída com o pacote BEAUti e BEAST v.1.8.2 (DRUMMOND et al., 2012), considerando a taxa de substituição nucleotídica igual a 1,87x10-9 ± 1,05×10-11 (VELONÀ et al., 2010). Para tal, foram realizadas 100 milhões de simulações MCMC, utilizando o modelo tree prior Speciation: Yule process (YULE, 1925; GERNHARD, 2008). O modelo de substituição nucleotídica mais adequado foi HKY+I+G, obtido com o programa jModelTest v.3.0, utilizando-se Bayesian Information Criterion (POSADA; CRANDALL, 1998). A espécie Nasutitermes corniger foi utilizada como grupo externo. Os resultados dos programas jModelTest e BEAST foram obtidos por meio do servidor CIPRES Science Gateway v.3.3 (MILLER; PFEIFFER; SCHWARTZ, 2010). Os parâmetros foram checados no software Tracer v.1.6 (RAMBAUT et al., 2016). A árvore de máxima credibilidade dos clados foi obtida utilizando-se o software TreeAnnotator v.1.8.2 (RAMBAUT; DRUMMOND, 2015), considerando o valor do burn-in igual a 10% do total de árvores geradas no BEAST, sendo esta visualizada e editada com o software FigTree v.1.4.2 (RAMBAUT, 2016). 43 3.5.2 Análise populacional e filogeográfica de Nasutitermes jaraguae As sequências do fragmento do gene mitocondrial COII e da região ITS2 dos espécimes identificados na análise de delimitação de espécies como N. jaraguae foram lidas com o programa CodonCode Aligner v.5.1.5 (CodonCode Corporation), editadas no programa BioEdit v.7.2.6.1 (HALL, 1999), no qual foram geradas as sequências consensus e alinhadas com o software MUSCLE (EDGAR, 2004; MCWILLIAM et al., 2013). Com o programa DnaSP v.5.10.01 (LIBRADO; ROZAS, 2009) foram realizadas as análises descritivas, obtendo-se o número de sítios polimórficos (S) e de haplótipos (h), diversidade haplotípica (Hd), diversidade nucleotídica (π) e o número médio de diferenças nucleotídicas (k) para cada população. A composição nucleotídica e a distância genética entre as populações foram obtidas através do programa MEGA v.6.06 (TAMURA et al., 2013) e a distância, em linha reta, entre as localidades foi estimada por meio da ferramenta disponível no Google My Maps. O teste de Mantel (1967), que correlaciona duas matrizes (distância genética e distância geográfica), foi realizado com o programa TFPGA v.1.3 (MILLER, 1997). Neste, são testadas permutações aleatórias entre linhas e colunas das matrizes, gerando coeficientes de correlação e um resultado significativo é inferido se ao menos 95% das estatísticas geradas aleatoriamente forem maiores ou menores do que o valor observado (z-values). Uma rede de haplótipos foi construída com o software TCS v.1.21 (CLEMENT; POSADA; CRANDALL, 2000) e os clados aninhados segundo a metodologia de Templeton, Boerwinkle e Sing (1987). A correlação entre os clados aninhados e a localização geográfica dos haplótipos foi analisada por meio do programa GeoDis v.2.6 (POSADA; CRANDALL; TEMPLETON, 2000), sendo os índices testados na chave de inferência filogenética (TEMPLETON, 2004) disponibilizada pelo mesmo programa (darwin.uvigo.es/software/geodis.html). A filogenia por inferência Bayesiana foi reconstruída com o pacote BEAUti e BEAST v.1.8.2 (DRUMMOND et al., 2012) a fim de se obter o tempo de divergência entre os grupos de haplótipos. As espécies Nasutitermes corniger, Hospitalitermes hospitalis, Amitermes amifer, Neocapritermes opacus, Embiratermes brevinasus, Syntermes spinosus e Reticulitermes flavipes foram utilizadas como grupo externo. Para calibrar o relógio molecular foram utilizadas as datações fósseis de 18 ± 2,5 Ma (WARE; GRIMALDI; ENGEL, 2010) para Nasutitermes, 30 ± 2,5 Ma para Nasutitermitinae (BOURGUIGNON et al., 2015), 55 ± 2,5 Ma para Termitidae (THORNE; GRIMALDI; KRISHNA, 2000; WARE; 44 GRIMALDI; ENGEL, 2010) e 65,5 ± 2,5 Ma para o clado que agrupa Termitidae e Rhinotermitidae (BOURGUIGNON et al., 2015), sem inferência de monofilia em nenhum dos pontos. Foram realizadas 500 milhões de simulações MCMC, utilizando o modelo tree prior Coalescent: Constant Size (KINGMA