Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 29409161811955427 11/12/2018 870180161315 10:44 Número do Processo: BR 10 2018 075672 9 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 48031918000124 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua Quirino de Andrade, 215 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 01049-010 País: Brasil Telefone: 11 56270217 Fax: 11 56270103 Email: auin@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 11/12/2018 às 10:44, Petição 870180161315 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 1/63 Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): FORMULAÇÃO VACINAL E USO DA MESMA Resumo: A presente invenção refere-se a uma formulação vacinal contendo uma enolase recombinante de Sporothrix schenckii, a qual é purificada e associada ao adjuvante hidróxido de alumínio para uso na terapia profilática da esporotricose, especialmente contra o fungo S. brasiliensis, considerado o mais patogênico dentro do complexo. Adicionalmente, a referida formulação pode ser usada em associação ao tratamento antifúngico convencional e potencial uso em outras micoses sistêmicas auxiliando na medicina veterinária e humana. Isso devido ao fato da formulação induzir altos títulos de anticorpos antígeno específicos contra a proteína alvo (enolase recombinante – rSsEno) e um perfil de resposta imune Th1/Th2/Th17. 1Figura a publicar: Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Renan Padron Almeida Procurador: Numero OAB: Numero API: CPF/CNPJ: 33778301896 Endereço: Rua Joaquim Antunes 819 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05415012 Telefone: 1156270570 Fax: Email: renan.padron@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 11/12/2018 às 10:44, Petição 870180161315 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 2/63 Inventor 1 de 5 Nome: DEIVYS LEANDRO PORTUONDO FUENTES CPF: 23502899827 Nacionalidade: Cubana Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Avenida Ibitinga, 406, Vila Bela Vista Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14800-045 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: auin.pi@unesp.br Inventor 2 de 5 Nome: IRACILDA ZEPPONE CARLOS CPF: 05403762809 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Enfermeiro de nível superior, nutricionista, farmacêutico e afins Endereço: Avenida Benito Barbieri, 769, Vila Harmonia Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14802-570 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: auin.pi@unesp.br Inventor 3 de 5 Dados do Inventor (72) Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 11/12/2018 às 10:44, Petição 870180161315 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 3/63 Nome: LUCAS SOUZA FERREIRA CPF: 01244459186 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Enfermeiro de nível superior, nutricionista, farmacêutico e afins Endereço: Avenida Prudente de Moraes, 1506, Centro Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14801-170 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: auin.pi@unesp.br Inventor 4 de 5 Nome: DAMIANA TÉLLEZ MARTÍNEZ CPF: 23721037847 Nacionalidade: Cubana Qualificação Física: Engenheiro, arquiteto e afins Endereço: Avenida Jorge Haddad, 44, Jd Paulistano Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14810-287 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: auin.pi@unesp.br Inventor 5 de 5 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 11/12/2018 às 10:44, Petição 870180161315 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 4/63 Nome: ALEXANDER BATISTA DUHARTE CPF: 23674464829 Nacionalidade: Cubana Qualificação Física: Médico Endereço: Avenida Jorge Haddad, 440, Jd Paulistano Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14810-287 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: auin.pi@unesp.br NomeTipo Anexo Comprovante de pagamento de GRU 200 GRU 2 29409161811955427.pdf Comprovante de pagamento de GRU 200 2 955427.pdf Procuração Proc e Posse 07-2018.pdf Documento de Cessão Termo de Cessão.pdf Declaração Negativa de Acesso Declaração Negativa de Acesso.pdf Relatório Descritivo Relatório Descritivo.pdf Reivindicação Reivindicação.pdf Desenho Desenhos.pdf Resumo Resumo.pdf Documentos anexados Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica. Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 11/12/2018 às 10:44, Petição 870180161315 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 5/63 [bb.com.br] - Boleto gerado pelo sistema MPAG. 09/11/2018 16:54:55 INSTRUÇÕES: A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU no campo Número de Referência na emissão do pagamento. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Física. Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Jurídica. 00190.00009 02940.916188 11955.427171 1 77320000007000 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO CPF/CNPJ: 48031918000124 RUA QUIRINO DE ANDRADE 215, SAO PAULO -SP CEP:01049010 29409161811955427 29409161811955427 08/12/2018 70,00 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 RUA MAYRINK VEIGA 9 24 ANDAR ED WHITE MARTINS , RIO DE JANEIRO - RJ CEP: 20090910 2234-9 / 333028-1 00190.00009 02940.916188 11955.427171 1 77320000007000 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 09/11/2018 29409161811955427 DS N 09/11/2018 29409161811955427 17 R$ A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU n o campo Número de Referência na emissão do pagamento. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO CPF/CNPJ: 48031918000124 RUA QUIRINO DE ANDRADE 215, SAO PAULO-SP CEP:01049010 08/12/2018 2234-9 / 333028-1 29409161811955427 70,00 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 6/63 https://www2.bancobrasil.com.br/aapf/login.jsp?url=pagamento/867-892.jsp?codT%3D1%26dataPagamento%3D09%2F11%2F2018%26valorDocumento%3D7000%26valor%3D7000%26desconto%3D0%2C00%26juros%3D0%2C00%26campo1%3D00190%26campo2%3D00009%26campo3%3D02940%26campo4%3D916188%26campo5%3D11955%26campo6%3D427171%26campo7%3D1%26campo8%3D77320000007000%26tipoCodigoBarras%3D1 https://aapj.bb.com.br/aapj/liemp.bb?codigoTransacao=867&data=09112018&campo1=00190&campo2=00009&campo3=02940&campo4=916188&campo5=11955&campo6=427171&campo7=1&campo8=77320000007000&valorDocumento=7000&valor=7000&valorDesconto=000&valorJurosMulta=000 22/11/2018 Internet Banking https://www.santandernetibe.com.br/Paginas/Compromissos/COMPROMISSOS_DETALHE_SEG_VIA.asp?txtEntidade=0033&txtCentroAlta=023… 1/1 FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENTO DA UNESP Agência: 0239 Conta Corrente: 13-002549-6 DETALHE DO COMPROMISSO Convênio: 0033-0239-004900019792 Conta de Débito: 0239-000430023105 Tipo de Pagamento: BLQ Outros Código de Barras: 00190000090294091618811955427171177320000007000 No. compromisso banco: 1029098000100002 No. compromisso cliente: 955427/DS1 1011 Instituição Financeira Favorecida: 001 - BANCO DO BRASIL S.A. Nome/Razão Social do Beneficiário Original: INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ do Beneficiário Original: 42.521.088/0001-37 Nome/Razão Social do Pagador Original: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE CPF/CNPJ do Pagador Original: 48.031.918/0001-24 Nome/Razão Social do Pagador Efetivo: FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENT CPF/CNPJ do Pagador Efetivo: 57.394.652/0001-75 Valor Nominal: 70,00 Desc./Abat.: 0,00 Juros: 0,00 Data de Vencimento: 08/12/2018 Data de Pagamento: 21/11/2018 Situação: Efetivado No. Lista de Débito: No. Protocolo: PGTFORNB21112018900133693 Autenticação: 11CBC4E087DAACC8099EE39 Valor a Pagar: 70,00 Central de Atendimento Santander Empresarial 4004-2125 (Regiões Metropolitanas) SAC 0800 762 7777 0800 726 2125 (Demais Localidades) Ouvidoria 0800 726 0322 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 7/63 javascript:window.close(); javascript:onPrint() Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 8/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 9/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 10/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 11/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 12/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 13/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 14/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 15/63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 16/63 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 17/63 http://www.tcpdf.org 1/41 FORMULAÇÃO VACINAL E USO DA MESMA CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se insere no campo da biotecnologia e descreve uma formulação vacinal compreendendo uma enolase recombinante de Sporothrix schenckii, a qual é purificada e associada ao adjuvante hidróxido de alumínio para uso na terapia profilática da esporotricose, especialmente contra o fungo S. brasiliensis, considerado o mais patogênico dentro do complexo. A referida formulação induz altos títulos de anticorpos antígeno específicos contra a proteína alvo, enolase recombinante (rSsEno) e um perfil de resposta imune Th1/Th2/Th17. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] A esporotricose é uma micose de evolução subaguda e crônica de lesões nodulares cutâneas ou subcutâneas e, com menor frequência disseminada em pessoas com compromentimento imunológico (Barros et al., 2011). O agente causal é um fungo dimórfico chamado Sporothrix schenckii o qual faz parte de um complexo de diferentes espécies (Marimon et al., 2006; 2007; 2008). Casos de esporotricose têm sido reportados em todos os continentes, porém as regiões tropicais e subtropicais com alta temperatura e umidade exibem a maior incidência, principalmente na América Latina, Japão, Índia, África do Sul, China e Malásia (Tang et al., 2012; Carrada-Bravo e Olveras-Macias, 2013; Zhao et al., 2015). No Brasil, algumas regiões do sudeste e sul têm elevada taxa de incidência dessa micose, que é uma importante zoonose (Chakrabarti et al., 2015). A infecção tanto no ser humano quanto em animais está geralmente associada à inoculação acidental na pele de Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 18/63 2/41 materiais contaminados com o fungo, como solo, vegetais, espinhos ou outros (Barros et al., 2011; Cruz, 2013). Em 1898, Benjamin Schenck, um estudante de medicina no Hospital Johns Hopkins em Baltimore, Estados Unidos, isolou uma amostra desse fungo pela primeira vez de lesões cutâneas de um paciente de 36 anos de idade e mais tarde, o micologista Erwin F. Smith classificou-a como uma espécie relacionada ao gênero Sporotricum (Schenck, 1898). Dois anos depois, Hektoen e Perkins também isolaram esse agente etiológico de lesões cutâneas de outro paciente e por meio de estudos morfológicos foi classificado como Sporothrix schenckii (Hektoen e Perkins, 1900; Bonifaz e Vázquez, 2010). [003] No Brasil, o primeiro caso de esporotricose em humanos foi descrito em 1907 por Lutz e Splendore e desde então um aumento considerável de casos clínicos, em particular, nos últimos 15 anos tem se evidenciado fundamentalmente no Rio de Janeiro onde a doença tem assumido proporções epidêmicas alarmantes (Rodrigues et al., 2013), acometendo regiões com dificuldades socioeconômicas e ambientais (Barros et al., 2010). Nesse estado brasileiro, o risco de contrair a infecção é ainda maior devido ao fato de que o gato ser a principal fonte de infecção do fungo, estando vinculado aproximadamente a 91% dos casos de esporotricose em humanos (Cruz, 2013; Freitas et al., 2010, 2014). Entre os anos 1998 e 2009 o IPEC/Fiocruz diagnosticou a esporotricose em aproximadamente 2200 seres humanos e 3244 gatos. Mais recentemente a Secretaria de Estado de Saúde do Rio de Janeiro analisando o banco de Sistema Nacional de Agravos de Notificação (SINAN/RJ), confirmou 830 novos casos só entre os anos 2013 e 2014, o que evidencia o aumento Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 19/63 3/41 progressivo da incidência (Ministério da Saúde, 2014). A Clínica Labovet, com sede no Rio de Janeiro, no período 2005 a 2012 analisando por meio de citologia e cultivo, 741 materiais coletados da superfície de lesões cutâneas ulceradas de gatos, identificou a presença de S. schenckii em 325 amostras, perfazendo 43,86 % do total (Cruz, 2013). Reis e colaboradores (2009) demonstraram a existência de uma semelhança genética entre cepas de S. schenckii isoladas das lesões cutâneas, cavidades nasais e unhas de gatos infectados e as obtidas de seus donos com a micose, confirmando que o gato é o principal transmissor da esporotricose no estado do Rio de Janeiro. Realmente a esporotricose é uma micose negligenciada e representa um problema de Saúde Pública no Brasil (Martin, 2014; Pereira et al., 2014); a grande incidência desta micose no Rio de Janeiro levou a Secretaria Estadual de Saúde deste estado a incluir a esporotricose na lista de doenças de notificação compulsória (publicado no Diário oficial da União em 16 de julho de 2013), no entanto até o momento não é possível conhecer a real incidência ou dimensionar a endemia desta doença nesse estado (Martin, 2014). [004] A esporotricose também tem sido encontrada em Minas Gerais (de Souza Barros et al., 2013) e no estado do Rio Grande do Sul (Madrid et al., 2007), porém em menor proporção. Atualmente esta doença é a micose subcutânea mais importante que afeta os animais no estado de São Paulo. Em um estudo retrospectivo realizado no Serviço de Dermatologia de um hospital veterinário do estado de São Paulo entre janeiro de 1993 e dezembro de 2011 foi constatado que o gato, a exceção dos cães, foram os responsáveis por 45,9% da Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 20/63 4/41 infecção nos humanos e animais que com ele coabitavam (Rossi et al., 2013). Em outro estudo mais recente, entre o mês de março de 2011 a abril de 2014 foi identificado um aumento considerável de casos de esporotricose felina nas cidades de Itaquera e Itaim Paulista, com 83 e 56 casos respectivamente (Montenegro et al., 2014). Estes mesmos autores descreveram a presença de um número menor de gatos com esporotricose em outras cidades como Diadema (10 casos) e Guarulhos (17 casos), indicando a propagação da epidemia, a qual pode aumentar o risco da transmissão zoonótica nas regiões metropolitanas no estado de São Paulo. [005] As espécies do gênero Sporothrix, pertencem à Divisão Ascomycota, classe Pyrenomycetes, ordem Ophiostomatales e família Ophiostomataceae (Romeo e Criseo, 2013). O fungo S. schenckii habita regiões tropicais, com uma temperatura média entre 20 e 25°C e umidade relativa acima de 90% (Bonifaz e Velázquez, 2010), podendo ser encontrado no solo, plantas, arbustos e materiais sob condições ambientais adequadas de temperatura e umidade (Morris-Jones, 2002). É um fungo termodimórfico que em vida saprofítica ou cultivada em ágar Sabouraud a 25°C, apresenta- se na forma filamentosa, com hifas delgadas, septadas e ramificadas com 1 a 2 μm de diâmetro e aglomerados de conídios, em forma de margarida ou crisântemo (Barros et al., 2011). Em parasitismo ou quando cultivado a 37°C em meios ricos, tais como ágar infusão cérebro-coração, cresce como levedura unicelular ovalada, globosa e em forma de charuto, com 2 a 6 μm de diâmetro podendo apresentar um ou mais brotamentos (Lopes-Bezerra et al., 2006; Barros et al., 2011). Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 21/63 5/41 [006] Por muito tempo pensou-se que o fungo S. schenckii era o único agente etiológico desta doença (Barros et al., 2011; Carrada-Bravo et al., 2013), porém sobre a base de estudos de sequenciamento do gene da calmodulina, características nutricionais (como assimilação de diferentes fontes de carbono) e fenotípicas (como diâmetro das colônias e morfologia dos conídios) em distintos meios de cultura e velocidade de crescimento a diferentes temperaturas, a espécie S. schenckii passou a ser reconhecida como um complexo de espécies crípticas, das quais S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii sensu stricto são as únicas de interesse clínico (Marimon et al., 2006; 2007; 2008); sendo que S. lurei e S. pallida têm sido identificadas, mas estão menos relacionadas à ocorrência de doença (Oliveira et al., 2014). Essas espécies estão hoje organizadas em diferentes grupos ou Clades, a saber S. brasiliensis (Clade I), S. schenckii sensu stricto (Clade IIa e Clade IIb), S. globosa (Clade III), e S. luriei (Clade VI), S. mexicana (Clade IV) e S. pallida (Clade V) (Rodrigues et al., 2013; Zhou et al., 2014). [007] De modo geral, a rota de infecção, a virulência da cepa e fundamentalmente o estado imunológico do hospedeiro, influenciam no aparecimento das manifestações clínicas identificadas na esporotricose (Arenas, 2005; Kong et al., 2006; Fernandes et al., 2013). Uma vez que o fungo penetra no organismo, ele pode permanecer restrito ao local da inoculação gerando a formação de nódulos pequenos que podem ulcerar dando origem à forma cutânea fixa (Roldán- Marín et al., 2009), ou ainda pode se disseminar pelos linfonodos adjacentes desenvolvendo diferentes nódulos ao Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 22/63 6/41 longo dos canais linfáticos, podendo supurar, ulcerar e drenar pus correspondendo à forma linfocutânea (Vasquez-del- Mercado et al., 2012), a qual é responsável por 70-80 % dos casos cutâneos de esporotricose (Vikram et al., 2014). [008] Ocasionalmente, o fungo pode disseminar-se por via hematogênica, atingindo os ossos e articulações. A doença pulmonar pela inalação de conídios é rara sendo caracterizada por tosse, febre baixa, perda de peso, linfadenite mediastinal, cavitação, fibrose e outros sinais clínicos que lembram a tuberculose (Vikram et al., 2014). As formas mais graves da esporotricose têm sido associadas a pacientes alcoólatras, transplantados de órgãos, indivíduos sob corticoterapia e especialmente em pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Yelverton et al., 2006), o que sugere que o S. schenckii é um patógeno oportunista emergente (Freitas et at., 2014). Aung e colaboradores (2013) relataram que de um total de 64 casos de esporotricose pulmonar primária e 22 casos de doença multifocal afetando os pulmões, 19 mortes foram reportadas, 14 das quais devidas diretamente a complicações da infecção por S. schenckii. Segundo os autores, essa alta taxa de mortalidade poderia estar diretamente vinculada a imunossupressão destes pacientes, à demora no diagnóstico e especialmente à ineficácia do tratamento medicamentoso. [009] Nos gatos tem-se observado as formas clínicas cutânea, cutânea linfática e disseminada, mas são difíceis de diagnosticar. Na forma cutânea, aparecem lesões ulceradas profundas, geralmente com pus na cabeça, nos membros e na base do rabo (Lloret et al., 2013., Schubach et al., 2004), que costumam se generalizar rapidamente por via hematogênica Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 23/63 7/41 ou pela autoinoculação do fungo pelo próprio animal (Rosser et al., 2006). A forma linfática pode ser clinicamente evidente, mas apenas pode ser confirmada por meio do exame histológico (Lloret et al., 2013). [010] A parede celular dos fungos é uma estrutura dinâmica que mantém o equilíbrio osmótico da célula, a proteção física contra outros microrganismos ou ainda contra a ação fagocítica das células do hospedeiro (Oda et al., 1983; Latgé, 2010). A estrutura e síntese da parede celular do fungo são únicas e, muitos dos seus componentes não estão presentes nas células dos mamíferos, o que faz dela um excelente alvo para o desenvolvimento de fármacos com pouca toxicidade para os seres humanos (Bowman & Free, 2006). [011] Nos últimos anos, tem-se focado a atenção sobre os componentes da parede celular de S. schenckii que possam estar envolvidos na indução da resposta imune e no processo de adesão no tecido do hospedeiro (Fierro et al., 2014). Durante o curso de uma infecção, os microrganismos são capazes de se aderirem às células epiteliais, endoteliais, fatores solúveis do soro, componentes da matriz extracelular e materiais inertes implantados no corpo do hospedeiro. Essa adesão é mediada por componentes presentes na parede celular, reconhecidas como adesinas (Bernal et al., 2009). As adesinas são consideradas importantes fatores de virulência usados pelos patógenos durante o processo de infecção, sendo que estão sendo testadas como potenciais antígenos em várias formulações vacinais contra doenças fúngicas, entre elas, a enolase 2 fosfo-D-glicerato hidrolase de Candida albicans (Li et al., 2011), DAB-1 de Blastomyces dermatitidis (Wüthrich et al., 2002), e gp43 de Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 24/63 8/41 Paracoccidioides brasiliensis (Travassos e Taborda, 2012). [012] Atualmente o principal componente antigênico presente nessa porção proteica do complexo peptídico- polissacarídeo de S. schenckii é a glicoproteína 3- carboximuconato ciclase de 70 kDa, que se une à laminina e fibronectina (Ruiz-Baca et al., 2009; Teixeira et al., 2009, Castro et al., 2013). Esta adesina pode apresentar-se com peso molecular variando de 55 a 73 kD e ponto isoelétrico de 4.33 a 4.85 (Rodrigues et al., 2015). Recentemente foi demonstrado, que a glicoproteína de 60 kDa, previamente reportada por Ruiz-Baca e colaboradores (2011) como uma proteína imunogênica de S. schenckii também presente em S. brasiliensis (Fernandes et al., 2013) é uma variante glicosilada da proteína polimórfica gp70 (Rodrigues et al., 2015). [013] A transferência passiva de um anticorpo monoclonal IgG1 (P6E7) específico contra a gp 70 em camundongos infectados com S. schenckii (Nascimento et al., 2005, 2008) e S. brasiliensis (de Almeida et al., 2015) gerou proteção em camundongos, confirmada pela diminuição de UFC, no baço e no fígado em relação ao grupo controle. Tal fato tem demonstrado o potencial imunogênico da gp70 e tem estimulado experimentos visando uma terapia no controle da infecção (Almeida, 2012). Visando a função das adesinas na patogênese dos fungos, Teixeira e colaboradores (2014) analisaram o genoma de S. schenckii e S. brasiliensis com duas bases de dados: ProFasta (prediz proteínas da superfície celular) e FungalRV (prediz a presença de adesinas), sendo identificadas 68 e 54 proteínas de superfície celular para ambas as espécies respectivamente, e nessa ordem 61 e 63 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 25/63 9/41 proteínas provavelmente com funções de adesinas. Porém, outros estudos proteômicos mais aprofundados precisam ser feitos para confirmar a presença e função dessas moléculas de adesão na parede celular de ambas as especies. [014] A resposta imune contra os fungos requer uma adequada colaboração entre o sistema imune inato e adaptativo. As células do sistema imune inato, particularmente as células fagocíticas apresentadoras de antígenos (APCs) como dendríticas e macrófagos são capazes de reconhecer estruturas moleculares conservadas na superfície dos patógenos, PAMPs “pathogen – associated molecular patterns” por meio de receptores de reconhecimento de padrão, como os PRR “pattern recognition receptors” presentes nessas células (Abdelsadik e Trad, 2011). [015] Os PAMPs presentes no fungo, como os carboidratos (β-glucanas), glicoproteínas (mananas), ácidos nucléicos (DNA e RNA), glicolípideos (lipopolissacarídeos), peptidoglicano, lipoproteínas e outros, são reconhecidos pelo menos por um dos receptores presentes dentre as quatrograndes famílias de PRRs, a saber: 1) receptores de lectina C (CLRs), como dectina 1, dectina 2, DC-SIGN, mincle e receptor de manose; 2) receptores semelhantes a NOD (domínio de oligomerização e ligação de nucleotídeo), como o inflamassomo NALP3; 3) receptores scavenger (CD5 e CD36) e 4) fundamentalmente a família de “toll like receptor” (TLR), considerada a maior classe de reconhecimento inato em vertebrados (Netea et al., 2006; Levitz, 2010, Romani, 2011). Por outro lado as opsoninas, como as imunoglobulinas, colectinas e componentes do complemento (C3bi) aumentam o repertório de reconhecimento antigênico favorecendo a Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 26/63 10/41 internalização e morte dos microrganismos pelos macrófagos (Stuart e Ezekowitz, 2005). [016] De modo geral, a ativação dos PRRs desencadeia uma cascata de eventos intracelulares produzindo a ativação de moléculas co-estimulatórias como CD40, CD80 e CD86 nas APCs e a produção de citocinas IL-1, IL-6, TNF-α, IL-12 (Lahiri et al., 2008) e quimiocinas, cuja função é modular a reposta antifúngica (Goodridge e Underhill, 2007). [017] Alguns dos PRRs implicados no reconhecimento de S. schenckii têm sido abordados nos últimos anos identificando-se o papel imunoestimulante dos componentes da parede deste fungo. Por exemplo, Sassá e colaboradores (2009; 2012) utilizando camundongos C3H/HeJ deficientes no receptor TLR-4 avaliaram o papel deste receptor durante 10 semanas de infecção com S. schenckii. A produção de óxido nítrico (NO), TNF-α e IL-10 foi diminuída nos camundongos C3H/HeJ, demonstrando que o TLR-4 está envolvido no reconhecimento de frações lipídicas na parede celular do fungo. O receptor TLR-2 também participa no reconhecimento de componentes da parede celular de S. schenckii, sendo que Negrini e colaboradores (2013) demonstraram que os macrófagos obtidos de camundongos “knockout” para o receptor TLR-2 (TLR2-/-) apresentaram diminuição tanto na fagocitose como na produção de TNF-α, IL-1 β, IL-2 e IL-10 quando estimulados em cultura com os antígenos solúveis e lipídicos da parede celular do fungo, indicando a importância desse receptor no reconhecimento de S. schenckii. O mesmo grupo também demonstrou que a produção de IL-17 foi independente de TLR- 2 com os animais TLR-2-/-, apresentando alta produção deste mediador quando comparados aos animais selvagens, portando Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 27/63 11/41 o receptor TLR-2 (Negrini et al., 2014). [018] Os macrófagos, por exemplo, quando ativados em cultura com componentes da parede celular do fungo produzem citocinas pro-inflamatórias como IL-1, IL-6, TNF-α que estimulam a resposta fagocítica (Carlos et al., 2009) e liberam compostos intermediários do nitrogênio e do oxigênio com função fungicida (Carlos et al., 2003; Sheisa et al., 2012). Fernandes e colaboradores (2008) demonstraram in vitro a efetividade do NO na eliminação das leveduras S. schenckii, no entanto esse efeito se tornou limitado quando avaliado em modelo de esporotricose murina. Essa supressão da resposta imune contra o fungo foi previamente relatada por Carlos e colaboradores (2003), onde se evidenciou o papel do NO com uma forte participação na eliminação do S. schenckii nas primeiras três semanas da infecção, comprovada pela diminuição do crescimento do fungo no fígado e baço. Por outro lado, entre a quarta e sexta semana de infecção, a alta produção do NO, estimulada pelo IFN-γ e IL-12, aumentou a suscetibilidade dos animais à infecção nos mesmos órgãos avaliados (Carlos et al., 2003; Maia et al., 2006). [019] Atualmente os macrófagos têm sido classificados em dois grupos: a saber, a via clássica ou macrófagos M1, os quais quando ativados pela exposição a IFN-, TNF-α ou indutores dessas citocinas como os ligantes de receptores Toll (TLR-2 e TLR-4) (Benoit et al., 2008) e outros ligantes, expressam na superfície celular MHC II, CD86, CD16 e produzem citocinas pro-inflamatória e IL-12, assim como, NO e H2O2, polarizando a resposta imune para um perfil Th1 (Correa e López, 2007) e a via alternativa ou M2 que incluem os macrófagos M2a estimulados por IL-4/IL-13 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 28/63 12/41 (Mantovani et al., 2007), M2b induzidos por complexos imunes e M2c os quais são ativados por hormônios (Benoit et al., 2008), IL-10 e TGF-β (Correa e López, 2007). Os macrófagos M2 quando ativados produzem citocinas antiinflamatórias como a IL-10 e expressam na sua superfície celular arginina 1, CD206 e receptor da IL-4 (Murray e Wynn, 2011). Alegranci e colaboradores (2013) avaliaram o papel dos macrófagos M1 e M2, durante 8 semanas, em modelo murino de esporotricose experimental, quando estimulados em cultura com um peptídeo- polissacarídeo obtido da parede celular do fungo. Os resultados mostraram predomínio da subpopulação dos macrófagos M1 entre a primeira e quarta semana da infecção, evidenciada pela alta produção de IL-12 e NO, nesse período. A partir da quarta semana e até o final do modelo experimental, houve predomínio da subpopulação de macrófagos M2 sobre a M1, evidenciado pela alta expressão do receptor CD206, da atividade de arginase I e da produção significativa de IL-10 e TGF-β, o que sugere a contribuição de ambas populações no controle da infecção. [020] Tradicionalmente, a resposta imune Th1, produtora de IFN-γ e IL-12 tem sido considerada essencial para conferir imunidade protetora contra fungos, enquanto que as respostas Th2 mediadas pela IL-4 e IL-5 levam ao aumento da suscetibilidade à infecção por esses patógenos (Antachopoulos e Roilides, 2005). Já foi demonstrado o desenvolvimento de resposta imune celular durante a infecção murina por S. schenckii (Carlos et al., 1992) e, posteriormente que as respostas Th1 e Th2 são induzidas de modo antígeno-específico contra componentes da parede celular desse fungo (Maia et al., 2006). Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 29/63 13/41 [021] Células com padrão Th17 compreendem um novo subtipo de célula T que possuem um papel emergente na imunidade adaptativa para uma variedade de fungos (Romani, 2011), incluindo S. schenckii, conforme demonstrado recentemente em camundongos infectados com este fungo que conseguiram eliminar a infecção no período de 20 dias caracterizada pela alta produção da citocina IL-17 (Ferreira et al., 2015), confirmando o papel relevante deste subtipo celular na defesa contra S. schenckii. [022] A resposta imune humoral, na dependência da quantidade e qualidade dos anticorpos, pode proteger o hospedeiro contra as infecções fúngicas de diferentes formas, seja prevenindo a aderência, a neutralização de toxinas, opsonizando para favorecer o processo de fagocitose ou mediando a citotoxicidade celular dependente do complemento (Pérez et al.,2013). Essas observações têm sido suportadas por diferentes estudos; por exemplo, na identificação de anticorpos protetores e não protetores na infecção induzida por Cryptococcus neoformans e Candida albicans, indicando que a resposta imune humoral contra os fungos pode gerar anticorpos de variada eficácia (Blanco e Garcia, 2008; Edwards, 2012). No caso de S. schenckii foi demonstrado que animais tratados com um anticorpo monoclonal contra a gp70 antes e depois da infecção com o fungo foram capazes de induzir proteção, evidenciado pela diminuição na carga fúngica no baço e o fígado (Nascimento et al., 2008). [023] A escolha do tratamento antifúngico para controlar esta doença, está relacionada ao tipo de manifestação clínica desenvolvida pelo paciente. Segundo as recomendações atuais o itraconazol, apesar do seu alto custo, Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 30/63 14/41 continua sendo o fármaco de escolha para o tratamento das manifestações clínicas da esporotricose menos severas, como cutâneas fixas e linfocutâneas, onde o tratamento pode durar 4 meses (Kauffman et al., 2007). Porém o itraconazol é metabolizado no fígado pela isoenzima 3A4 do sistema enzimático citocromo P450, uma via enzimática comum para fármacos rotineiramente usados na atenção primária, como digoxina, warfarina, carbamazepina, fenobarbital e outros medicamentos (Francesconi et al., 2011; Vikram et al., 2014). [024] O iodeto de potássio, o qual tem preço mais acessível e tem sido usado nos países desenvolvidos com grande sucesso nas formas cutâneas da esporotricose, também tem mostrado sérias limitações, atribuídas ao desconhecimento do seu mecanismo de ação e à alta frequência de reações adversas, como alergias, edema pulmonar, angioderma, mialgia, linfadenopatia, urticária, vasculite, psoríase pustular, acidose metabólica e iododerma, lacrimejamento, expectoração abundante, coriza, espirros, insônia e problemas tireoidianos (Silva e Pereira, 2009). O fluconazol, sendo parte do grupo dos azóis como o itraconazol, devido a menor eficácia é utilizado apenas como uma opção terapêutica de segunda linha (Francesconi et al., 2009). [025] A terbinafina é pertencente ao grupo das alilaminas, outro fármaco alternativo ao itraconazol para o tratamento de formas menos agressivas da esporotricose devido a sua baixa ligação (aproximadamente 5%) com o sistema enzimático P450, diminuindo a probabilidade de interagir com outros fármacos metabolizados por este sistema, como foi explicado anteriormente, no entanto ainda não há consenso Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 31/63 15/41 sobre a dose e a duração do tratamento (Chapman et al., 2004, Kauffman et al., 2007; Francesconi et al., 2009). A anfotericina B lipossomal e desoxicolato são os fármacos de escolha junto com o itraconazol para o tratamento de formas graves da esporotricose, tais como a osteoarticular, pulmonar, meningeal e disseminada (Kauffman et al., 2007) que ocorrem geralmente em pacientes HIV positivos. A terapia com as diferentes formas farmacêuticas de anfotericina B nos pacientes imunodeprimidos é difícil devido às reações adversas como a hipocalemia, hipomagnesemia, anemia normocítica e principalmente nefrotoxicidade (Vikram et al., 2014). [026] Resumidamente, as principais limitações das opções terapêuticas são: a longa duração do tratamento associada com um aumento da resistência aos fármacos antifúngicos e toxicidade, as interações com outros fármacos, o custo excessivo do tratamento especialmente em pacientes imunocomprometidos que sofrem a forma disseminada da esporotricose. Tudo isso aponta à necessidade de tratamentos mais eficazes e seguros e a procura de métodos de prevenção principalmente, em populações de alto risco. [027] A Organização Mundial da Saúde (OMS) tem considerado as vacinas como uma das intervenções médicas profiláticas mais eficazes para o controle de doenças infecciosas em relação custo-benefício (Pashine et al., 2006). O principal objetivo da vacinação é preparar o sistema imune, tão logo o indivíduo vacinado se torne hospedeiro, para responder mais rápida e eficazmente contra um determinado patógeno, além de induzir uma memória imunológica de longa duração (O’Hagan, 2006). Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 32/63 16/41 [028] As vacinas tradicionais utilizam organismos inteiros vivos e/ou mortos. As primeiras são altamente imunogênicas e mais eficazes para a indução de proteção, já que a resposta imunológica a essas vacinas é muito semelhante àquela produzida em resposta à infecção natural, resultando em imunidade humoral (linfócitos B com a produção de anticorpos) e celular (linfócitos TCD4+ e linfócitos T citotóxicos, CTLs), mas seu uso está limitado pela probabilidade potencial de reversão parcial ou total ao fenótipo patogênico e causar doença particularmente em indivíduos imunodeprimidos (Moigeon et al., 2001; Coeshott et al., 2004; Tlaskalová et al., 2004). Enquanto que as vacinas que utilizam organismos mortos são menos imunogênicas e geralmente necessitam de adjuvantes para gerar a resposta imune desejada. Por outro lado, as vacinas de nova geração que contêm componentes antigênicos simples e mais bem definidos do que as vacinas convencionais, por exemplo, peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes são mais seguras quanto ao uso, porém devido a sua baixa imunogenicidade, também precisam de um adjuvante para alcançar o efeito imune desejado (Schijns, 2006). [029] O termo adjuvante originou-se da palavra latina adjuvare que significa ajudar. Neste sentido qualquer substância que possa amplificar ou intensificar a cascata de eventos imunológicos que compõem a resposta imune pode ser classificada como adjuvante (Schijns, 2006). O aumento do interesse em adjuvantes nas últimas décadas ocorreu pela necessidade de estimular a resposta imune frente às vacinas compostas por subunidades simples e seguras, porém pouco imunogênicas. Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 33/63 17/41 [030] Até o momento, os avanços mais importantes na vacinologia têm sido obtidos com a prevenção de doenças virais e bacterianas e não contra doenças antiparasitárias e antifúngicas (Portuondo et al., 2015). Durante muito tempo, a falta de compreensão nas interações ausência de visibilidade das infecções fúngicas oportunistas e endêmicas têm dificultado o desenvolvimento de vacinas para fungos (Edwards, 2012). No entanto, a incidência de doenças crônicas associadas a micoses oportunistas como exemplo, candidíase, paracoccidioidomicose, aspergilose, e mais recentemente a esporotricose, têm despertado o interesse no desenvolvimento desta alternativa terapêutica (Cutler et al., 2006; López- Romero et al., 2011; Portuondo et al., 2015). [031] Os adjuvantes podem ser utilizados para melhorar a resposta imune aos antígenos por diferentes caminhos, incluindo: potencialização da imunogenicidade de imunógenos fracos, aumento da velocidade e duração da resposta imune, modulação da especificidade, isotipo e distribuição das sub-classes de anticorpos, estimulando a resposta de linfócitos T citotóxicos, promovendo a indução da imunidade de mucosa, aumentando a resposta imune de indivíduos imunologicamente imaturos ou senescentes, reduzindo os custos das vacinas pela diminuição das doses dos antígenos e ajudando a controlar a competição de antígenos em vacinas combinadas (Singh e O’Hagan, 2003; Sivakumar et al., 2011). Singh e O’Hagan (2003), classificaram os adjuvantes de vacinas em dois grandes grupos: sistemas de liberação e imunopotencializadores. Os sistemas de liberação, tais como micropartículas, emulsões, complexos imuno estimulantes (ISCOMs), lipossomas, Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 34/63 18/41 virossomas e partículas semelhantes a vírus têm dimensões comparáveis aos patógenos e, portanto, são efetivamente capturados em uma forma mais natural pelas células apresentadoras de antígeno, facilitando assim a indução de uma potente resposta imune (Mutwiri et al., 2007, 2011). O efeito imunopotencializador, como monofosforil lipídeo e derivados sintéticos, muramildipetídeo e derivados, sequencias CpG, lipopetídeos, entre outros refere-se à ativação direta sobre as células imunes inatas, principalmente através dos receptores Toll e outras famílias de receptores (O’Hagan e Valiante, 2003; Batista- Duharte et al., 2013, 2014). [032] Muitos desses adjuvantes imunológicos têm demonstrado estimular uma proteção eficaz em modelos murinos, especialmente, contra candidíase, criptococose, coccidioidomicose, blastomicose, histoplasmose, paracoccidioidomicose, infecções causadas por Pneumocystis e, mais recentemente para a aspergilose (Torosantucci et al., 2005; Pietrella et al., 2010). [033] Apesar desses avanços, ainda nenhuma vacina antifúngica tem sido aprovada pelas agências reguladoras para imunização em humanos (Portuondo et al., 2015). Atualmente, apenas existem duas vacinas antifúngicas em fase clínica, a vacina NDV-3 contra C. albicans e Staphylococcus aureus formuladas com hidróxido de alumínio e a vacina PEV- 7 contra a vulvovaginite formulada com o adjuvante virossoma (Portuondo et al., 2015). [034] Os sais de alumínio, como o fosfato e hidróxido de alumínio, desde a sua criação em 1926 por Glenny, têm sido os adjuvantes mais amplamente utilizados em Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 35/63 19/41 seres humanos (EMEA, 2004, 2005; Simon e Edelman, 2006; Aguilar e Rodriguez, 2007). Os sais de alumínio atuam como um sistema de liberação formando um depósito no lugar da inoculação que fornece o recrutamento de células como monócitos CD11c+ e células dendríticas. Existem outras evidências que sugerem que o alumínio produz necrose celular, resultando na produção de ácido úrico, ativando os “NOD like receptor” como o NLRP3 e que este complexo seja importante no efeito imunoestimulante do alumínio (Franchi L et al., 2008; Coffman et al., 2010). Muitos adjuvantes, incluindo o hidróxido de alumínio estimulam o sistema imune, induzindo irritação local e necrose (Batista-Duharte et al., 2014). Embora os sais de alumínio sejam amplamente utilizados, sua principal limitação é que induzem uma forte resposta imune Th2, com produção de anticorpos IgE que estão associados às reações de hipersensibilidade, e além disso, a resposta imune é de curto prazo (Garçon et al., 2011). [035] Dentre os estudos pré-clínicos de vacinas existem diferentes objetivos: 1) garantir uma formulação vacinal eficaz e segura. Para isto é importante a seleção de antígenos apropriados para gerar uma adequada imunogenicidade protetora. 2) a seleção do adjuvante adequado que permita um ótimo balanço na estabilidade, imunopotenciação e baixa toxicidade com os antígenos que são formulados com ele (WHO, 2013). [036] Conforme a Agência Europeia de Medicamentos (EMEA) a avaliação da formulação antígeno-adjuvante deve ser feita comparativamente na presença ou na ausência do adjuvante (EMEA, 2004). Por exemplo, para as formulações que utilizam o adjuvante hidróxido de alumínio ou adjuvantes de Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 36/63 20/41 natureza particulada, recomenda-se avaliar a cinética de adsorção/desorção do complexo antígeno adjuvante (Lindblad, 2004; EMEA, 2004, 2005). Outro objetivo é demonstrar o efeito da vacina sobre a resposta imune utilizando modelos in vitro ou in vivo (Mastelic et al., 2013). Para isto é importante determinar a estimulação da imunidade inata e especifica incluindo estudos de citocinas pro-inflamatórias, resposta Th1/Th2/Th17, os níveis de anticorpos específicos, estudos funcionais associados aos mecanismos de defesa demonstrados contra o microrganismo em questão (Garçon et al., 2011a). Outro objetivo é estudar a segurança da formulação através de estudos in vitro para determinar a citotoxicidade direta do candidato vacinal sobre as células e também estudos in vivo como a tolerância local no sitio de inoculação que pode ser avaliada durante o próprio estudo da imunogenicidade (EMEA, 2004, 2005). Estudos mais específicos de toxicidade são geralmente realizados em etapas mais avançadas (Garçon et al., 2011b). [037] Uma vez alcançadas as evidências de imunogenicidade e segurança, devem ser realizados ensaios de proteção utilizando modelos de infecção padronizados para garantir uma adequada avaliação da capacidade profilática ou terapêutica do produto em estudo (Mastelic et al., 2013). Os estudos pré-clínicos devem combinar ensaios in vitro e in vivo, primeiro em modelos murinos, geralmente camundongos, e depois se possível, em outras espécies animais antes de se passar aos ensaios em humanos (WHO 2003; EMEA 1997, 2005; Vecchi et al., 2011; Garçon et al., 2011b). [038] Devido à necessidade atual de buscar alternativas terapêuticas mais efetivas contra S. schenckii, Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 37/63 21/41 somado a evidência de que a enolase deste fungo foi responsável, em parte, da proteção alcançada em camundongos desafiados com S. schenckii 16345 ATCC, a presente invenção surge com a possibilidade de usar a enolase obtida por via recombinante e formulada com o hidróxido de alumínio num modelo de infecção sistêmica de esporotricose em uma formulação vacinal. Os resultados obtidos são promissórios e além de evidenciar o uso potencial da tecnologia para fins terapêuticos e/ou preventivo contra a esporotricose, também poderão abrir novos caminhos para futuras preparações vacinais contra doenças de interesse na saúde pública. ESTADO DA TÉCNICA [039] O documento intitulado “A cell wall protein- based vaccine candidate induce protective immune response against Sporothrix schenckii infection”, demonstrou que o soro obtido de camundongos imunizados com uma formulação vacinal composta por nove proteínas isoladas da parede celular do fungo S. schenckii ATCC 16345 e o adjuvante hidróxido de alumínio reagiu contra duas (2) dessas proteínas. Uma proteína de 71 kDa não identificada funcionalmente e outra de 47 kDa identificada como enolase presente nas cepas S. schenckii ATCC 58251, S. schenckii 1099-18 e S. brasiliensis 5110. Nesse documento esse soro imune conferiu proteção quando transferido passivamente a camundongos desafiados com o fungo S. schenckii ATCC 16345. Esse resultado evidenciou pela primeira vez o efeito imunogênico da proteína enolase de S. schenckii e sua possível contribuição na proteção em camundongos desafiados com o fungo. Entretanto, a presente invenção difere de tal documento pelo fato da formulação vacinal composta pela Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 38/63 22/41 proteína enolase obtida por via recombinante e não com uma formulação composta por várias proteínas nativas do fungo, com a finalidade de conseguir quantidade suficiente desta proteína para a realização dos ensaios propostos. A tecnologia do DNA recombinante garante que uma sequência de DNA codificadora da proteína de interesse seja produzida em grande escala utilizando bactérias ou leveduras como biorreatores, no presente caso para fins vacinais. Os experimentos realizados contidos na presente invenção demonstraram que a enolase recombinante foi obtida com alta pureza e um peso molecular de 45 kDa próximo ao de 47 kDa previamente detectada em tal documento. Além disso, os resultados da presente invenção demonstraram que a formulação vacinal assim constituída (HA+rSsEno100) conferiu proteção em camundongos desafiados com o fungo. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [040] A presente invenção tem por objetivo propor uma formulação vacinal compreendendo uma proteína enolase de Sporothrix schenckii, obtida por via recombinante purificada e associada ao adjuvante hidróxido de alumínio. Tal formulação induz altos títulos de anticorpos antígeno específicos contra a proteína alvo, enolase recombinante – rSsEno, e um perfil de resposta imune Th1/Th2/Th17, indicando seu uso na terapia profilática da esporotricose, especialmente contra o fungo S. brasiliensis, considerado o mais patogênico dentro do complexo. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [041] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue: Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 39/63 23/41 [042] A FIG. 1 mostra graficamente a resposta de anticorpos IgG contra a rSsEno. Cada grupo de camundongos Balb/C (n=5) recebeu duas doses das formulações vacinais indicadas por via subcutânea com intervalo de 14 dias, e sete dias após a segunda imunização foi determinado no soro de cada animal o título de anticorpos IgG contra a rSsEno. A significância estatística foi determinada por ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Tukey com intervalo de confiança de 95 %. Letras distintas representam diferenças significativas entre os diferentes tratamentos (p < 0,05). [043] A FIG. 2 mostra graficamente a quantificação das citocinas IL-10, IL-4, IFN-γ e IL-17. Cada grupo de camundongos Balb/C (n=5) recebeu duas doses das diferentes formulações indicadas por via sc com intervalo de 14 dias, e sete dias após a segunda imunização, as células dos animais foram obtidas e estimuladas com rSsEno (20 μg/mL), como controle negativo do teste, o RPMI, e controle positivo, o LPS. A significância estatística foi determinada por ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Tukey com intervalo de confiança de 95 %. Letras distintas representam diferenças significativas entre os diferentes tratamentos (p < 0,05). [044] A FIG. 3 mostra graficamente a proteção conferida pela formulação HA+rSsEno100. Cada grupo de camundongos Balb/c (n=5) recebeu duas doses das diferentes formulações indicadas por via sc com intervalo de 14 dias, e sete dias após a segunda imunização os animais foram desafiados por via ip com 1x106 leveduras de S. brasiliensis Ss250 e após cinco dias, o baço (A) e o fígado (B) foram extraídos para determinação das UFCs. O grupo controle de infecção (CI) foi infectado com a mesma carga fúngica por Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 40/63 24/41 via ip. A significância estatística foi determinada por ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Tukey com intervalo de confiança de 95 %. Letras distintas representam diferenças significativas entre os diferentes tratamentos (p < 0,05). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [045] A presente invenção refere-se a uma formulação vacinal compreendendo uma enolase recombinante da parede celular do Sporothrix schenckii, a qual é purificada e associada ao adjuvante hidróxido de alumínio para uso na terapia profilática da esporotricose, especialmente contra o fungo S. brasiliensis, considerado o mais patogênico dentro do complexo. A referida formulação vacinal induz altos títulos de anticorpos antígeno específicos contra a proteína alvo, enolase recombinante (rSsEno) e um perfil de resposta imune Th1/Th2/Th17. [046] Conforme mencionado, a enolase é obtida por meio de tecnologia recombinante da seguinte maneira: Transformação da bactéria Escherichia coli DH5α com o plasmídeo recombinante pET28a::SsEno [047] Uma suspensão de células competentes DH5α, estocadas a – 80°C foi retirada e transferida para um tubo eppendorf de 1,5 mL e mantida durante aproximadamente 15 min em banho de gelo. Transcorrido esse tempo foi adicionado 2 µl do pET28a::SsEno a 100 µl das células DH5α em condições estéreis em fluxo laminar e incubada durante 30 min em gelo. Após desse tempo, a mistura foi submetida a choque térmico intercalando a incubação em banho de água a 42° C por 2 min com banho de gelo por 2 min. Após este período foi adicionado 600 µL de meio Líquido Lysogeny broth (LB, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, por litro de Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 41/63 25/41 solução a pH 7,0) e as células foram deixadas crescer à temperatura de 37° C por 45 min a 200 rpm. Após esse período de crescimento, a cultura foi centrifugada a 2500 rpm durante 2 min à 25° C, o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido em 600 mL de meio LB. Alíquotas de 100 µL foram plaqueadas em placas Petri (5 placas) contendo 20 mL de meio ágar LB 1,5% (15 g de ágar, 50 µg do antibiótico kanamicina por cada litro de meio LB líquido) e após de seladas com parafilm foram incubadas por um período de 12 a 16 horas na estufa a 37° C. O plasmídeo pET28a::SsEno contém um gene de resistência a kanamicina que permite selecionar as bactérias transformadas, ou seja, que receberam o plasmídeo. Purificação do plasmídeo pET28a::SsEno propagado nas células E. coli DH5α. [048] Após o período de incubação, os clones considerados positivos foram transferidos individualmente para tubos estéreis de 15 mL contendo 5 mL de meio líquido LB suplementado com o antibiótico kanamicina (50 µg/mL). O inóculo permaneceu incubado no período entre 12 a 16 horas no shaker a 200 rpm e 37° C. A extração e purificação do DNA plasmidial pET28a::SsEno foi realizada através do Kit IlustraTM plasmidPrep Mini Spin de acordo com as recomendações do fabricante. A autenticidade do DNA palsmidial do vetor pET28a::SsEno propagado e purificado a partir das células E. coli DH5α foi confirmado por sequenciamento e analisada através da ferramenta BLAST. Indução da expressão da enolase recombinante na bactéria E. coli BL21 [049] O procedimento empregado na transformação de células competentes de E. coli BL21 foi o mesmo descrito na Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 42/63 26/41 transformação de células DH5α. Após o período de transformação, uma colônia da cepa E. coli BL21 foi transferida para um frasco Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de meio líquido LB suplementado com antibiótico kanamicina (50 mg/mL). A cultura foi deixada crescer no shaker sob agitação de 200 rpm durante 16 horas a 37° C. Após esse período 15 mL da cultura foi transferida para outro frasco Erlenmeyer de 2 L contendo 1 litro do mesmo meio suplementado com o antibiótico e incubado nas mesmas condições de temperatura e agitação até atingir a densidade ótica DO600 de 0,6 (este intervalo de DO se corresponde à fase logarítmica de crescimento da cepa E. coli BL21). Depois de atingido o crescimento celular, a temperatura foi baixada a 30° C e a expressão da enolase recombinante SsEno foi induzida através da adição de 0,2 mM de IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside), sendo a cultura incubada por 4 horas a 200 rpm. Após a indução a cultura foi centrifugada a 8000 rpm durante 10 min a 4° C e o pellet resultante coletado foi transferido para um béquer contendo 20 mL do tampão A de lise (fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM e imidazol 20 mM, pH 7,4) acrescentado com 10 µL (5 U) de DNase e 30 µg/mL de lisossima. A suspensão foi incubada durante 30 min e ao término deste tempo a suspensão celular foi submetida à lise celular por sonicação nas condições a seguir: 30% de amplitude, 5 segundos PULSE ON e -59 segundos de PULSE OFF. [050] Em seguida o extrato bruto proveniente das células lisadas foi centrifugado a 17000 rpm durante 20 min a 4° C. O pellet foi descartado e o sobrenadante que continha a proteína recombinante foi filtrada em membrana hidrofílica Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 43/63 27/41 de 0,45 µm e em seguida a SsEno foi purificada por dois passos cromatográficos: cromatografia de afinidade ao Ni2+ e por cromatografia de exclusão molecular, ambos procedimentos descritos a seguir. [051] Cabe ressaltar que uma alíquota de 1 mL retirada da cultura antes e após da indução com IPTG foi centrifugada a 2500 rpm por 2 min e os pellets resultantes, foram individualmente ressuspendidos em 50 uL de tampão azul de corrida SDS-PAGE e congelados a -20°C. Ambas as alíquotas serviram como controles de indução e não indução da enolase recombinante. Purificação da proteína recombinante rSsEno por cromatografia de afinidade e exclusão por tamanho. [052] O sobrenadante filtrado foi inserido numa coluna de afinidade HisTrap contendo no seu interior uma matriz de níquel-sefarose, que se baseiam em esferas de agarose contendo em sua superfície íons Ni2+ imobilizados. O aminoácido de histidina apresenta uma alta afinidade pelos íons Ni2+ presentes na resina, deste modo a cauda de histidina contida na proteína recombinante SsEno permitiu a purificação desta proteína por afinidade a esse íon. A eluição da proteína SsEno foi realizada com 10 mL do tampão B (NaPO4 20 mM, NaCl 500 mM e imidazol 500 mM, pH 7,4). A separação se deu em duas etapas primeiro com 4 mL e depois com 6 mL. Ambas as amostras foram avaliadas por SDS-PAGE e constatou-se a presença da proteína na fração de 6 mL que foi conduzida a etapa de polimento por cromatografia de exclusão por tamanho. A cromatografia de exclusão molecular foi conduzida em coluna Superdex 200 pg 16/60 acoplada a um sistema HPLC preparativo previamente lavada com água Milli- Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 44/63 28/41 Q durante duas horas e pré-equilibrada com tampão Tris-HCl 25 mM, 100 mM de NaCl e 2 mM de β-mercaptoetanol, pH 7.5, sendo que a proteína foi eluida nesse mesmo tampão. Os eluatos foram coletados em frações de 1 mL empregando-se uma velocidade de fluxo de 1 mL/min. As frações contendo a proteína recombinante foram reunidas e concentradas através de tubos de filtração Amicon® Ultra-15 de 3 K conforme as orientações do fabricante e dialisadas contra PBS 7,2-7,4. O coeficiente molecular da enolase 5,4620x104 e seu peso molecular de 47584 Da foram utilizados para calcular a concentração proteica desta proteína utilizando o valor da absorbância do extrato proteico determinada em espectrofotômetro UV-Vís a 280 nm. Todas as etapas de produção e purificação da proteína foram acompanhadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). [053] Finalmente para atestar a integridade estrutural da proteína avaliou-se a estrutura secundária por meio de dicroísmo circular (CD). Os ensaios de CD foram realizados em um a J-815 espectropolarímetro acoplado a um sistema Peltier PFD 425S para controle da temperatura. A rSsEno foi testada em tampão Tris-HCl (pH=7.5), 100 mM de NaCl e 2 mM de β-mercaptoetanol na concentração de 4 µM. Em adição, para melhor compreender o estado oligomérico da proteína recém-sintetizada foram realizados ensaios de cromatografia de exclusão molecular analítica (CEMa) em coluna Superdex 200 GL 10/30 acoplada a um ÄKTA Prime Plus e equilibrada com tampão Tris-HCl (pH=7.5), 100 mM de NaCl e 2 mM de β-mercaptoetanol. Extração de proteínas da superfície celular dos Ss16345 e Ss250 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 45/63 29/41 [054] As PSC da cepa Ss16345 e do isolado de gato Ss250 foram extraídas na fase logarítmica de crescimento seguindo o protocolo descrito por Castro e colaboradores (2013) com modificações (Portuondo et al., 2016). As leveduras de ambos os fungos foram obtidas como anteriormente, só que um inoculo inicial para Ss16345 foi de 2x108 leveduras e de 2x106 leveduras no caso de Ss250, ambo os inóculos para 1 litro de meio BHI em frascos Erlenmeyer com capacidade de 2000 mL afim de obter quantidade necessária de massa celular para o procedimento de extração das proteínas. As culturas se deixaram crescer então durante 5 dias nas mesmas condições descritas anteriormente. Ao término desse tempo, ambas as culturas foram centrifugadas a 1000 x g durante 10 minutos e lavadas três vezes com 25mM de Tris-HCl pH 8,5 gelado. Em seguida, os pellets celulares correspondentes a cada fungo foram lavados três vezes com tampão Tris-HCL 25 mM, pH 8.5. Os sobrenadantes foram descartados e os pellets ressuspendidos individualmente no mesmo tampão acrescentado com 2 mM de Ditiotreitol (DTT), 1 μM de PMSF e 5 mM de EDTA. As suspensões celulares foram mantidas sob agitação leve, durante 3 horas a 4°C. Transcorrido esse tempo, os sobrenadantes foram separados por centrifugação e então filtrados com membrana de porosidade de 0,20 µm. O filtrado de cada sobrenadante contendo as PSC de Ss16345 e Ss250 foram dialisados contra água destilada a 4ºC durante 48 horas com trocas de água a cada 12 horas e em seguida concentrado 100 vezes com sistema à vácuo Amicon utilizando uma membrana de celulose YM10 (Milipore) e posteriormente com tubos de filtração Amicon® Ultra-15 de 3 K conforme as orientações do fabricante. O Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 46/63 30/41 extrato de proteínas de cada fungo foi aliquotado e estocado a -20º C. A dosagem de proteínas foi realizada pelo o método do ácido bicinconínico (BCA), segundo as orientações do fabricante, utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão de proteínas. Esse método baseia-se na redução do cobre II pelas proteínas, em meio alcalino, produzindo o cobre I e formando um complexo com o BCA o qual apresentam a máxima absorbância a 562 nm. Separação de proteínas por SDS-PAGE [055] As PSC obtidas de Ss16345 ou Ss250 assim como as amostras de proteínas obtidas em cada etapa do processo de expressão e purificação da rSsEno foram caracterizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo a técnica descrita por Laemmli (1970). A preparação do gel separador e de empilhamento foi realizada conforme os volumes dos reagentes descritos na Tabela 1 a seguir: Tabela 1: Reagentes e volume para o preparo dos géis da eletroforese. Componentes Gel separador 12% (mL) Gel de empilhamento 5 % (mL) Água 6.6 2.7 Acrilamida/bis-acrilamida 30% 8 0.67 Tris-HCl (pH 8.8) 1,5M 5.00 - Tris-HCl (pH 6.8) 0,5M - 0.5 Deodecil sulfato de sódio (SDS) 10% 0.2 0.04 Persulfato de amônio 10% 0.2 0.004 TEMED 0.008 0.004 [056] As amostras de proteínas contendo a rSsEno e o marcador de peso molecular de proteínas foram diluídas em Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 47/63 31/41 tampão da amostra “Lane Marker Sample Buffers”, contendo 0,3 M Tris-HCL, 5 % SDS, 50 % glicerol, 100 mM de DTT e corante rosa na proporção de 16 µl do tampão da amostra/ 64 µl das amostras. Após, aquecidas a 100ºC por 5 minutos, e depositadas nos poços do gel da eletroforese, a corrida foi realizada à temperatura ambiente em cuba de eletroforese em placas mini-gel (10x8) aplicando-se 100 V durante aproximadamente 2 horas até que as amostras atingissem 0,5 cm do final do gel. O marcador de peso molecular continha a Apoferritina (480 kDa), γ-Globulina (160 kDa); 3), BSA (67 kDa/), anidrase carbônica (29 kDa) e Citocromo C (12 kDa). O tampão da cuba constituiu-se de Tris base 0,25 M, glicina 2 M e SDS 1 %. Os géis foram corados com prata e Comassie blue ou prata conforme o procedimento descrito na Tabela 2 a seguir: Tabela 2: Coloração com nitrato de prata Coloração com nitrato de Prata Solução Tempo (minutos) Fixação 50% Metanol/etanol e 5% de ácido acético em água 20 Lavagem 50% Metanol/etanol em água 10 Lavagem Água bidestilada 5 Lavagem Água bidestilada 20 Sensibilização 0,025% Na2SO3 em água 1 Lavagem (2x) Água bidestilada 1 Coloração 0,15% AgNO3em água gelada 20 Lavagem (2x) Água bidestilada Rápido Revelação 3% Na2CO3 e 0,05 % de formaldeído em água Interrupção (3x) 5 % de ácido acético em água Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 48/63 32/41 Ensaio de immunoblot [057] As PSC de Ss16345 e Ss250 assim como a rSsEno foram dissolvidas em tampão de amostra Lane Marker Sample Buffers e submetidas à SDS-PAGE. Após a eletroforese, os géis de cada amostra foram transferidos para membranas de nitrocelulose de 0,45 µm, recobertos com papel de filtro e comprimidos com esponjas de poliuretano. Todos os materiais foram previamente embebidos em tampão de transferência bicarbonato de sódio e metanol pH 9,9 e em seguida encaixados em placas acrílicas perfuradas e mergulhadas na câmara de transferência contendo o mesmo tampão. A transferência foi feita durante 5 h com amperagem constante de 0,4 mA a 4° C em câmara de transferência para mini-gel 10x8 cm. As membranas de nitrocelulose contendo as PSC de Ss16345, Ss250 e a rSsEno foram cortados em tiras e incubadas com solução bloqueadora (BSA 5% em TBS-T, que contém 50 mM de Tris Base,150 mM de NaCl e 0,1% de Tween 20) por 4 horas. O soro anti-rEno proveniente dos camundongos imunizados com a rSsEno100 foi colocado individualmente sobre as tiras e deixados sob agitação, durante 16 horas à temperatura ambiente. Como controle negativo foi utilizado sCNI, ambos os soros foram diluídos 1/50 em TBS-T. Transcorrido esse tempo, as tiras foram lavadas com PBS três vezes, com trocas a cada 10 minutos, para a retirada do excesso do soro. Então, foram incubadas por 2 horas com conjugado imunoenzimático, soro anti-IgG de camundongo marcado com peroxidase na diluição de 1/500 em PBS. O excesso de conjugado foi retirado com novo ciclo de lavagens. Para evidenciar os complexos antígenos-anticorpos formados, foi acrescentado o substrato Estoque 1 % de ácido acético à 4°C Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 49/63 33/41 cromógeno, que consistiu de 0,005 g de diaminobenzidina diluída em 30 mL de PBS acrescidos de 150 µL de peróxido de hidrogênio no momento do uso. A reação foi interrompida com água destilada. Ensaio de imunorreatividade do soro anti-rSsEno com as leveduras dos fungos [058] Para este ensaio, 5 mL de uma suspensão celular de leveduras de Ss16345, Ss1099-18, Ss250 e Ss256 foi centrifugada a 1000 x g durante 5 min a 4°C. Após, os pellets celulares foram lavados duas vezes em PBS na mesma condição anterior e em seguida foi filtrado através de 8 camadas de gaze estéril contida numa seringa estéril para a obtenção de uma suspensão contendo apenas leveduras, confirmada visualmente por microscopia óptica. Após, alíquotas de 100μL contendo 106 leveduras de cada fungo foram transferidas para tubos eppendorf e incubadas por 1 h a 37°C com soro anti-rSsEno ou com sCNI como controle da marcação inespecífica, todos diluídos 1:50 em PBS. Em seguida, as suspensões foram lavadas como acima, ressuspendidas em 100μL de PBS e então incubadas por 1 h a 37ºC com um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo obtido em coelho e conjugado com FITC diluído 1:50. As amostras foram lavadas mais duas vezes para remoção dos anticorpos não ligados e então adquiridas no citômetro de fluxo BD Accuri C6 e analisadas usando o software proprietário do equipamento. O limiar de aquisição das amostras foi ajustado para 50.000 no parâmetro FSC-H (“forward scatter – height”) para exclusão do debri e pelo menos 60.000 eventos foram efetivamente incluídos em cada análise. A ligação dos anticorpos presentes nos soros testados à superfície das leveduras foi avaliada Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 50/63 34/41 pela mediana da intensidade de fluorescência (MFI). Preparação da Formulação [059] Para a preparação da referida formulação, uma concentração de 1 mg do rSsEno /0,9 mL de PBS foi misturada com 0,1 mL de hidróxido de alumínio (Al(OH)3) a 2% na forma de uma suspensão coloidal estéril, livre de pirógenos e com um conteúdo de Al3+ entre 9-11 mg/mL, ressuspendido em PBS. A mistura antígeno/adjuvante foi mantida sob agitação leve durante 15 minutos à temperatura ambiente. Imunização e Eutanásia [060] Foram definidos três grupos de camundongos contendo cinco animais por grupo para serem imunizados pela via subcutânea. Os animais foram imunizados com 100 µL das formulações, conforme descritas na Tabela 3, sendo administradas no dia 0 e no dia 14 administrada uma dose reforço. No dia 21 foi realizada a eutanásia dos animais e coleta do sangue. Tabela 3: Distribuição dos grupos de camundongos imunizados por via subcutânea (n=5 por grupo). Grupos experimentais Formulações administradas Grupo 1 PBS (pH 7.2 - 7.4) Grupo 2 1 mg de rSsEno /mL PBS (rSsEno100) Grupo 3 1 mg de rSsEno /mL PBS + 0,1 mL de HA (HA+rSsEno100) Obtenção do soro dos camundongos [061] Conforme mencionado acima, sete dias após a última imunização foi extraído o sangue de todos os camundongos após a eutanásia. O procedimento de extração foi feito por punção cardíaca com seringa e agulhas descartáveis. Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 51/63 35/41 O sangue total foi acondicionado em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL e incubado em estufa a 37 °C por 20 minutos. Em seguida foram centrifugados a 117 xg por 10 minutos, os soros colhidos e transferidos para outros tubos estéreis e armazenados a -20 °C até o momento do uso para a quantificação de anticorpos IgG anti-rSsEno. Detecção de IgG Total anti-rSsEno no soro dos camundongos imunizados [062] O soro dos animais de cada grupo experimental foi utilizado para a quantificação de anticorpos IgG totais específicos anti-rSsEno. Foram adsorvidas microplacas de 96 poços com 1µg/mL de ssEno diluídas em PBS (100 µL/poço) e incubadas por 18 horas a 4 °C. As placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,2 % de Tween-20 (PBS-T) em lavadora e em seguida bloqueadas com 200 µL/poço de tampão de bloqueio (5% de leite em PBS-T 0.2%) durante 1 hora a temperatura ambiente. [063] A placa foi lavada e diluições do soro 1/200 em tampão de bloqueio, foram adicionadas aos poços e incubadas duas horas em estufa a 37 °C. Transcorrido esse tempo a placa foi lavada e, então adicionado 100 µL do conjugado marcado com peroxidase (1/1000) em tampão de bloqueio. Após incubação de 1 hora a 37 °C, e uma nova lavagem foi realizada e então adicionado o substrato 3,3',5,5'–tetrametilbenzidina e deixado por 30 minutos a temperatura ambiente na ausência de luz. A reação foi interrompida com 50 µL de H2SO4 2N, e a densidade ótica (DO) foi lida a 450 nm utilizando leitor de ELISA UV/visível de microplacas. A leitura final foi realizada em duplicata e a média determinada. Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 52/63 36/41 [064] Como pode se observar na FIG. 1, a produção de anticorpos IgG contra a rSsEno foi alcançada tanto nos camundongos imunizados com apenas esta proteína quanto nos animais imunizados com ela formulada com HA evidenciando a capacidade imunogênica da enolase de gerar resposta imune sozinha. No entanto, como esperado, esta resposta de anticorpos foi estatisticamente superior na formulação HA+rSsEno100. Obtenção dos macrófagos peritoneais dos grupos vacinados e estimulação com a rSsEno [065] Todos os animais vacinados foram inoculados com 3,0 mL de tioglicolato de sódio a 3,0% três dias antes de serem eutanasiados em câmara de CO2. Em seguida a pele da região abdominal de cada camundongo foi retirada assepticamente em câmara de fluxo laminar Classe 100 e o peritônio exposto. Posteriormente foram inoculados 5,0 mL de PBS gelado na cavidade abdominal que foi massageada para a liberação das células peritoneais. O líquido peritoneal resultante foi coletado com seringa e agulha, transferido para um tubo cônico estéril com capacidade de 15 mL e centrifugado a 1500 x g durante 5 minutos e o sedimento celular foi lavado três vezes com 3 mL de PBS. Após a última lavagem, as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio de cultura RPMI-1640 contendo 2β-mercaptoetanol, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 U/mL, L-glutamina 2mM e 5% de soro fetal bovino (SFB), sendo o meio assim composto designado de RPMI-1640 completo (RPMI-1640-C). A suspensão celular foi contada em câmara de Neubauer e ajustada a 5x105/mL em RPMI- 1640-C e então 0,1 mL dessa suspensão foi transferida para placas de cultura de 96 poços e incubadas em estufa a 37°C Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 53/63 37/41 com 5% de CO2 durante 2 horas para a aderência dos macrófagos. Em seguida, os sobrenadantes foram descartados com o intuito de retirar as células não aderentes e um novo meio de cultura foi adicionado na proporção de 1:1 com uma solução da rSsEno (20 μg/mL). As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas em estufa com tensão constante de 5% de CO2. Ao término desse tempo, os sobrenadantes obtidos foram centrifugados a 4°C durante 10 min a 14000x g, aliquotados e estocados a -80°C até o momento da dosagem da citocina IL-10. Obtenção dos esplenócitos dos grupos vacinados e estimulação com a rSsEno [066] Após a extração das células peritoneais, o peritônio foi aberto para a extração do baço. O mesmo foi fragmentado com auxílio de pinça anatômica em placa de Petri estéril contendo 2,0 mL de RPMI-1640-C gelado para a liberação das células. O conteúdo da placa contendo a suspensão celular foi aspirado e transferido para um tubo cônico estéril de 15 mL. As hemácias foram lisadas com NH4Cl e a suspensão foi lavada três vezes em PBS estéril a 700xg por 5 min a 4°C. Após a última lavagem as células foram ressuspensas em 1 mL de meio RPMI-1640-C e contadas em câmara de Neubauer pela técnica de exclusão com azul de Trypan a 0,04%. A concentração das células foi ajustada para 5x106 células/mL em RPMI-1640-C para a realização dos testes propostos. [067] As suspensões celulares ajustadas para 5x106 células/mL, obtidas de cada animal foram distribuídas em placas de cultura de tecidos de 48 poços na proporção de 1:1 com solução da rSsEno (20μg/mL) ou Concanavalina A (0,5μg/mL) como controle positivo ou apenas com o meio RPMI-1640C como Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 54/63 38/41 controle negativo e incubadas a 37°C por 24 horas em estufa com tensão constante de 5% de CO2. Em seguida, os sobrenadantes obtidos foram centrifugados a 4°C durante 10 min a 14.000 x g, aliquotados e estocados a -80°C até o momento da dosagem das citocinas e IFN-γ, IL-4 e IL-17. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção da produção de citocinas [068] A citocina IL-12 foi quantificada no sobrenadante das culturas de macrófagos estimuladas com a ssEno e as citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-17 foram quantificadas no sobrenadante da cultura de esplenócitos estimulados com a solução de antígeno (PSC). [069] Todos os procedimentos foram feitos conforme as instruções dos fabricantes. Basicamente, placas de 96 poços foram recobertas com 100 µL/poço de solução contendo anticorpos purificados de captura, diluídos em tampão apropriado. As placas foram incubadas a 4°C por 18 horas. Após a incubação, foram realizadas três lavagens com solução PBS-Tween 20 (0,05%) e as placas foram incubadas com 200 µL/poço de solução de bloqueio (PBS contendo 10% SFB) durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas por três vezes e adicionou-se o padrão e 100 µL/poço das amostras (sobrenadante). As placas foram incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Após o tempo de incubação, as placas foram lavadas por cinco vezes e incubadas com 100 µL/poço com anticorpo anti-citocinas (anticorpo biotinilado mais Streptavidina-peroxidase) por 1 hora a temperatura ambiente. Novamente as placas foram lavadas e foram adicionados 100 µL/poço da solução do substrato. Desta vez, as placas foram incubadas sob proteção da luz durante 30 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 55/63 39/41 minutos. Após o tempo determinado a reação foi interrompida com a adição de 50 µL/poço de uma solução de H2SO4 2N. A absorvância foi lida a 450 nm em um leitor de microplaca e as concentrações das citocinas foram calculadas por meio de uma curva padrão de concentrações conhecidas das citocinas em questão. Os resultados foram expressos em pg/mL. [070] Como pode se observar na FIG. 2 (A, B, C e D), a indução das proteínas IL-10, IFN-γ, IL-4 e IL-17 não foi detectada na cultura de macrófagos ou esplenócitos, respectivamente estimulada com a rSsEno, sendo também evidente este resultado na estimulação de IL-10 para a formulação HA+rSsEno100 (FIG. 2 A). Porém, a produção de IFN-γ, IL-4 e IL-17 (FIG. 2 B, C e D) induzido no esplénocitos provenientes dos camundongos vacinados com a formulação HA+rSsEno100 sugere um padrão de reposta imune Th1, Th2 e Th17. Ensaio de imunoproteção [071] Para esse ensaio, cinco animais por grupo foram imunizados com 100 µL das formulações rSsEno100, HA+rSsEno100 ou PBS conforme mostrado anteriormente na Tabela 1. Sete dias após a segunda dose os camundongos foram infectados por via intraperitoneal com 1x106 de leveduras de Ss250 em PBS e o efeito protetor induzido pelas formulações foi avaliado pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) no baço e no fígado 5 dias após o desafio. A escolha desse dia foi feita devido a elevada carga fúngica neste modelo de infecção. [072] Para a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), o baço e o fígado dos camundongos foram removidos assepticamente e macerados com auxílio de uma Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 56/63 40/41 seringa em placa de Petri estéril contendo 2 mL de PBS. Em seguida, 200 µl de uma diluição da suspensão celular desses órgãos foram plaqueados individualmente em placas de Petri contendo meio Mycosel. O número de UFC foi contado após três e sete dias de incubação à temperatura ambiente. Os resultados foram expressos como o número de UFC/órgão. [073] Conforme pode ser observado na FIG. 3 (A e B), a eficácia das formulações vacinais de gerar proteção foi avaliado por meio da imunoprofilaxia em animais imunizados com rSsEno100 ou HA+rSsEno100 e desafiados com a cepa Ss250, representativa do clade 1 (S. brasiliensis) considerado o mais virulento dentro do complexo Sporothrix. A resposta imune induzida por ambas as formulações diminuiu drasticamente o número de UFC no baço e no fígado em comparação ao grupo controle de infecção, sugerindo que a formulação HA+rSsEno100 pode ser utilizado como um potencial candidato vacinal contra a esporotricose. [074] A proteção induzida pela formulação HA+rSsEno100 em camundongos desafiados com o fungo Ss250, reforça a hipótese de que provavelmente o perfil misto de resposta Th1/Th2/Th17 in vitro possa estar associado ao controle da infecção in vivo. É importante destacar que apesar de não ser detectada a produção in vitro das citocinas de IL-10, IL-4, IFN-γ e IL-17 no sobrenadante de macrófagos e esplenócitos provenientes dos camundongos imunizados com a rSsEno100 sozinha in vitro, provavelmente devido a dose escolhida para a estimulação, mesmo assim essa formulação reduziu a carga fúngica no baço e no fígado nos animais desafiados com Ss250, porém visualmente essa redução foi menor à gerada pela formulação com o adjuvante HA, o que Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 57/63 41/41 evidencia a importância do perfil imune gerado pela formulação HA+rSsEno100. [075] Levando em consideração a forte reatividade cruzada evidenciada entre o soro anti-rSsEno com a superfície celular das leveduras de S. schenckii (Ss16345, Ss1099-18) e os dois isolados de gatos S. brasiliensis (Ss250 e Ss256), a formulação HA+rSsEno100 constitui um promissor candidato vacinal para a imunoprofilaxia multiespécie do complexo Sporothrix, o que sugere também que a enolase de S. schenckii presente na parede celular do fungo, demonstrado na presente invenção, seja uma proteína altamente conservada no gênero Sporothrix e que suas propriedades imunogênicas e de proteção induzidas neste estudo confirmam a hipótese do seu potencial uso para estratégias vacinais e/ou terapêuticas contra a esporotricose. [076] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, está claro para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção. Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 58/63 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação vacinal caracterizada pelo fato de compreender 1 mg da enolase de de Sporothrix schenckii rSsEnoO /0,9 mL de PBS misturada com 0,1 mL de hidróxido de alumínio (Al(OH)3) a 2% na forma de uma suspensão coloidal estéril, livre de pirógenos e com um conteúdo de Al3+ entre 9-11 mg/mL, ressuspendido em PBS, em que a enolase foi obtida por via recombinante. 2. Formulação vacinal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de induz altos títulos de anticorpos antígeno específicos contra a proteína alvo, enolase recombinante (rSsEno) e um perfil de resposta imune Th1/Th2/Th17. 3. Uso da formulação vacinal conforme definida na reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato de ser para terapia profilática da esporotricose, especialmente contra o fungo S. brasiliensis, considerado o mais patogênico dentro do complexo. Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 59/63 1/3 FIG. 1 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 60/63 2/3 FIG. 2 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 61/63 3/3 FIG. 3 Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 62/63 1/1 RESUMO FORMULAÇÃO VACINAL E USO DA MESMA A presente invenção refere-se a uma formulação vacinal contendo uma enolase recombinante de Sporothrix schenckii, a qual é purificada e associada ao adjuvante hidróxido de alumínio para uso na terapia profilática da esporotricose, especialmente contra o fungo S. brasiliensis, considerado o mais patogênico dentro do complexo. Adicionalmente, a referida formulação pode ser usada em associação ao tratamento antifúngico convencional e potencial uso em outras micoses sistêmicas auxiliando na medicina veterinária e humana. Isso devido ao fato da formulação induzir altos títulos de anticorpos antígeno específicos contra a proteína alvo (enolase recombinante – rSsEno) e um perfil de resposta imune Th1/Th2/Th17. Petição 870180161315, de 11/12/2018, pág. 63/63 Peticionamento Eletrônico Formulário Comprovante de pagamento de GRU 200 Comprovante de pagamento de GRU 200 Procuração Documento de Cessão Declaração Negativa de Acesso Relatório Descritivo Reivindicação Desenho Resumo 2018-12-11T10:44:55-0200 Brasil Documento Assinado - INPI