UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS CONTENDO PALMITATO DE RETINOL: CONTROLE MICROBIOLÓGICO, AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA NO TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO CUTÂNEO MARLUS CHORILLI ARARAQUARA – SP 2007 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS CONTENDO PALMITATO DE RETINOL: CONTROLE MICROBIOLÓGICO, AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA NO TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO CUTÂNEO MARLUS CHORILLI Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dr. Maria Virgínia Scarpa Co-orientadora: Prof. Dr. Gislaine Ricci Leonardi ARARAQUARA – SP 2007 Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Câmpus de Araraquara Chorilli, Marlus C551d Desenvolvimento e caracterização físico-química de sistemas nanoestruturados contendo palmitato de retinol: controle microbiológico, avaliação da segurança e eficácia no tratamento do envelhecimento cutâneo. / Marlus Chorilli. – Araraquara, 2007. 174 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Maria Virgínia Costa Scarpa Co-orientador: Gislaine Ricci Leonardi . 1. Sistemas nanoestruturados. 2. Palmitato de retinol. 3. Controle microbiológico. 4. Avaliação de segurança. 5. Farmacotécnica. I. Scarpa, Maria Virgínia Costa, orient. II. Título. CDD: 616.0145 CAPES: 40300005 Página de Aprovação ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli Autor: Marlus Chorilli Título: Desenvolvimento e caracterização físico-química de sistemas nanoestruturados contendo palmitato de retinol: controle microbiológico, avaliação da segurança e eficácia no tratamento do envelhecimento cutâneo. Trabalho apresentado e aprovado pela Comissão Julgadora em sessão realizada em 03/12/2007. ___________________________________________ Prof. Dr. Sílvia Stanisçuaski Guterres 1º examinador ___________________________________________ Prof. Dr. Hérida Regina Nunes Salgado 2º examinador ___________________________________________ Prof. Dr. Telma Mary Kaneko 3º examinador ___________________________________________ Prof. Dr. Leila Aparecida Chiavacci 4º examinador ___________________________________________ Prof. Dr. Maria Virgínia Scarpa Orientadora/Presidente Epígrafe ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli “Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós.” Fernando Pessoa Dedicatória ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli DedicatóriaDedicatóriaDedicatóriaDedicatória AAAA Deus Deus Deus Deus Pela minha vida, pelas oportunidades recebidas, pela proteção e por me dirigir em todas as circunstâncias. “Porque desde a antiguidade não se ouviu, nem com ouvidos se percebeu, nem com os olhos se viu Deus além de Ti, que trabalha para aquele que nele espera” (Is. 64:4). Aos meus paisAos meus paisAos meus paisAos meus pais Luiz Antonio e Cleide, que sempre me guiaram pelo caminho do amor e da verdade, que sempre entenderam e apoiaram os meus sonhos, por serem os grandes responsáveis pela minha formação humana e intelectual. Meu eterno agradecimento. Aos meus avôsAos meus avôsAos meus avôsAos meus avôs Linda, Nilza e Luiz (in memorian), pelo apoio, carinho e por se fazerem sempre tão presentes na minha vida. Obrigado por tudo. Aos meus irmãosAos meus irmãosAos meus irmãosAos meus irmãos Graziele e Giovani, pelos bons momentos passados juntos, e à minha sobrinha Gabrielle, que em tão pouco tempo tem nos trazido incomparáveis alegrias. Agradecimentos ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos À minha orientadora, Prof. Dr. Maria Virgínia Scarpa, por ser uma segunda mãe, uma amiga, uma conselheira e, principalmente, pela confiança de uma segunda orientação. Obrigado por fazer parte da minha história, por propiciar uma jornada inesquecível e que deixa recordações memoráveis. À minha amiga e co-orientadora, Prof. Dr. Gislaine Ricci Leonardi, pela confiança, pelo estímulo nos momentos difíceis, pelos conselhos e por tudo o que representa na minha trajetória profissional. Muito obrigado. Aos amigos da Pós-Graduação Andréa Lima, Andréa Moreno, Arnóbio, Bruna, Cris, Daniele Michelin, Daniela Longo, Greici, Juliane, Karen, Ketylin, Luana, Nelson, Rubiana, Traudi e Thalita, pelos bons momentos de descontração e, principalmente, pelo conhecimento que compartilharam comigo. Sem dúvida a amizade de vocês foi essencial para que eu conseguisse trilhar esse caminho com maior tranqüilidade. Aos meus amigos, especialmente Adriana, Alessandro, Ângela, Cíntia, Cristhian, Diogo, Franceli, Francyne, Leandro, Lucas, Luciana, Márcio, Mônica, Paulo, Rita, Rodrigo, Silvia e Simone – “Mesmo que as pessoas mudem e suas vidas se reorganizem, os amigos devem ser amigos para sempre, mesmo que não tenham nada em comum, somente compartilhar as mesmas recordações.” (Vinícius de Moraes). Ao meu amigo Rodrigo Sanches pelo auxílio nas resoluções das imagens e elaboração da arte da capa da tese. Aos Profs. Drs. Sílvia Stanisçuaski Guterres, Telma Mary Kaneko, Hérida Regina Nunes Salgado e Leila Aparecida Chiavacci pelas valiosas contribuições apresentadas na sessão de defesa da tese. Ao Prof. Dr. Maria Luiza Ozores Polacow pelas enriquecedoras discussões no exame geral de qualificação. Ao Prof. Dr. Paulo Cerri pela imensa ajuda na confecção das lâminas histológicas. Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Corrêa pela amizade, pelas longas conversas, pelos ensinamentos e pelo incentivo. À Prof. Dr. Hérida Regina Nunes Salgado pelos ensinamentos nas disciplinas, pela amizade e pelo auxílio nas análises microbiológicas. Ao Prof. Dr. Victor Hugo Sarmento pela colaboração nas análises de reologia. Agradecimentos ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli Aos Profs. Drs. Adélia Emília de Almeida, Ana Dóris de Castro, Anselmo Gomes de Oliveira, Chung Man Chin, Maria Palmira Gremião, Raul César Evangelista e Vera Borges Isaac pelo exemplo de profisisonalismo. Aos Profs. Drs. Míriam Elias Cavallini, Neusa Maria Osti e Nelci Fenalti Höehr pela confiança e amizade. Ao Prof. Dr. Celso Santilli, do Instituto de Química da Unesp – Araraquara, por permitir a utilização do reômetro. Ao Dr. Álvaro Gomes, da Dow Corning, por acreditar neste projeto e fornecer sempre com muito boa vontade as matérias-primas necessárias. Aos técnicos Maria de Fátima Rodrigues, Luis Potenza e Margareth Modolo (Unesp) e Maria Cristina Prado Ribeiro (Unimep) pela imprescindível colaboração. Às secretárias da Seção de Pós-Graduação – Cláudia, Sônia e Laura e ao pessoal da portaria – Olívia e Sebastiana, pela atenção constante. Aos funcionários da biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, especialmente Ana Lúcia, Ana Cristina, Moacir, Irani, Rita e Sônia, pelo auxílio e ajuda em diversas situações. Aos meus ex e atuais alunos – sem dúvida vocês me motivaram a chegar até aqui. Obrigado por cada gesto de amizade e por me propiciarem a certeza que me realizo completamente na área acadêmica. Aos alunos Paula Souza Prestes, Roberta Balansin Rigon e Pedro Melo Cartezani pela responsabilidade com que assumiram sua parcela neste projeto, e por fazerem com tamanha determinação o que se comprometeram. Às voluntárias da pesquisa, pela confiança que em nós depositaram e pela seriedade e dedicação durante a realização deste trabalho. A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a concretização deste sonho, cujos nomes estão ausentes neste texto, mas presentes na memória e no coração. Agradecimentos ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli “Tudo é loucura ou sonho no começo. Nada do que o homem fez no mundo teve início de outra maneira. Mas já tantos sonhos se realizaram que não temos o direito de duvidar de nenhum”. Monteiro Lobato Sumário IX ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli SUMÁRIO Lista de abreviaturas XII Lista de símbolos, unidades e/ou grandezas XIV Lista de tabelas XV Lista de figuras XII Resumo XXII Abstract XXIII I. INTRODUÇÃO 01 II. REVISÃO DE LITERATURA 04 2.1. Envelhecimento cutâneo 04 2.2. Rugas 06 2.3. Palmitato de retinol (Vitamina A palmitato) 18 2.4. Sistemas nanoestruturados 20 2.4.1. Microemulsão: diagrama de fases 24 2.5. Cristais líquidos 28 2.6. Caracterização física dos sistemas nanoestruturados 34 2.6.1. Condutividade iônica 35 2.6.2. Densidade relativa 35 2.6.3. Estabilidade de formulações cosméticas 36 2.6.3.1. Teste de estabilidade preliminar (TEP) 36 2.6.4. Microscopia de luz polarizada 37 2.6.5. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) 38 2.6.6. Comportamento reológico 41 2.6.6.1. Ensaios mecânico-dinâmicos ou de oscilação 45 2.7. Controle de qualidade microbiológico 47 2.8. Potencial de irritação de formulações tópicas 48 III. OBJETIVOS 50 3.1. Objetivo principal 50 3.2. Objetivos secundários 50 IV. CASUÍSTICA & MÉTODOS 51 4.1. Material 51 4.1.1. Substâncias e reagentes 51 4.1.2. Equipamentos e vidrarias 52 4.1.3. Microrganismos 53 4.1.4. Animais 53 4.2. Métodos 54 4.2.1. Preparação das formulações 54 4.2.1.1. Diagrama de fases 54 4.2.2. Caracterização físico-química dos sistemas 55 4.2.2.1. Determinação da densidade relativa 55 4.2.2.2. Determinação da condutividade iônica 56 4.2.2.3. Teste de estabilidade preliminar (TEP) 56 4.2.2.3.1. Teste de centrifugação 57 4.2.2.3.2. Microscopia de luz polarizada para as formulações selecionadas 57 4.2.3. Sistemas acrescidos de palmitato de retinol 57 4.2.3.1. Desenvolvimento das formulações 57 4.2.3.1.1. Formulações selecionadas 57 Sumário ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 4.2.3.2. Teste de estabilidade das formulações 58 4.2.3.2.1. Características organolépticas 58 4.2.3.2.2. Determinação da densidade relativa 58 4.2.3.2.3. Teste de centrifugação 59 4.2.3.2.4. Determinação do pH 59 4.2.3.2.5. Determinação da condutividade iônica 59 4.2.4. Análise estrutural das formulações acrescidas de PR 60 4.2.4.1. Microscopia de luz polarizada 60 4.2.4.2. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) 60 4.2.4.3. Determinação do comportamento reológico 60 4.2.4.3.1. Ensaios de escoamento 61 4.2.4.3.2. Ensaios mecânico-dinâmicos ou de oscilação 61 4.2.5. Controle de qualidade microbiológico 61 4.2.5.1. Validação do método de estimativa do número de microrganismos viáveis 62 4.2.5.2. Estimativa do número de microrganismos viáveis 62 4.2.5.3. Pesquisa de Salmonella sp. e Escherichia coli 62 4.2.5.4. Pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa 63 4.2.5.5. Avaliação da eficácia das formulações nanoestruturadas como sistema conservante 63 4.2.5.5.1. Teste de desafio 64 4.2.5.5.2. Cálculo do valor D 64 4.2.6. Estudo de irritação das formulações tópicas 65 4.2.6.1. Irritação dérmica primária 65 4.2.6.1.1. Animais 65 4.2.6.1.2. Áreas de tratamento 66 4.2.6.1.3. Protocolo para verificação de irritação dérmica primária 66 4.2.6.1.3.1. Método de avaliação 66 4.2.6.2. Análise histológica 67 4.2.6.2.1. Grupos experimentais 67 4.2.6.2.2. Contenção dos animais 68 4.2.6.2.3. Processamento histológico 68 4.2.6.2.4. Análise histométrica e histopatológica 69 4.2.6.2.4.1. Análise histométrica 69 4.2.6.2.4.2. Análise histopatológica 69 4.2.7. Avaliação da eficácia na pele humana das formulações selecionadas 70 4.2.7.1. Triagem das voluntárias 70 4.2.7.2. Descrição da metodologia empregada no estudo 70 4.2.7.3. Análise estatística 72 V. RESULTADOS & DISCUSSÃO 73 5.1. Preparação das formulações 76 5.2. Caracterização físico-química dos sistemas 87 5.2.1. Formulações selecionadas 87 5.2.2. Determinação da densidade relativa 88 5.2.3. Determinação da condutividade iônica 88 5.2.4. Teste de estabilidade preliminar (TEP) 92 5.2.4.1. Teste de centrifugação 93 5.2.4.2. Microscopia de luz polarizada para as formulações selecionadas 93 X Sumário ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 5.3. Sistemas acrescidos de palmitato de retinol 97 5.3.1. Desenvolvimento das formulações 97 5.3.1.1. Diagrama de fases 97 5.3.1.2. Formulações selecionadas 99 5.3.2. Teste de estabilidade das formulações 100 5.3.2.1. Características organolépticas 100 5.3.2.2. Determinação da densidade relativa 100 5.3.2.3. Teste de centrifugação 101 5.3.2.4. Determinação do pH 101 5.3.2.5. Determinação da condutividade iônica 102 5.4. Análise estrutural das formulações acrescidas de PR 103 5.4.1. Microscopia de luz polarizada 103 5.4.2. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) 108 5.4.3. Determinação do comportamento reológico 112 5.4.3.1. Ensaios de escoamento 112 5.4.3.2. Ensaios mecânico-dinâmicos ou de oscilação 115 5.5. Controle de qualidade microbiológico 122 5.5.1. Validação do método de estimativa do número de microrganismos viáveis 122 5.5.2. Estimativa do número de microrganismos viáveis 123 5.5.3. Pesquisa de Salmonella sp. e Escherichia coli 124 5.5.4. Pesquisa de Sthaphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa 124 5.5.5. Avaliação da eficácia das formulações nanoestruturadas como sistema conservante 126 5.5.5.1. Teste de desafio 126 5.5.5.2. Cálculo do valor D 128 5.6. Estudo de irritação das formulações tópicas 136 5.6.1. Irritação dérmica primária 136 5.6.2. Análise histológica 138 5.6.2.1. Análise histométrica da epiderme 138 5.6.2.2. Análise histopatológica da derme 144 5.7. Avaliação da eficácia na pele humana das formulações objeto de estudo 149 VI. CONCLUSÕES 154 VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 156 VIII. ANEXOS 172 Anexo I – Parecer no 10/2007 – Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP. 173 Anexo II – Protocolo no 73/05 – Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Metodista de Piracicaba. 174 XI Lista de abreviaturas XII ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli LISTA DE ABREVIATURAS A água ABC Associação Brasileira de Cosmetologia ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária A/O água em óleo AS ágar Sabouraud CMC concentração micelar crítica CTFA The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association EHL equilíbrio hidrófilo-lipófilo EMB ágar eosina azul de metileno EPM erro pdrão da média FIP Federation Internacionale Pharmaceutiqué LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncroton Mod. modelo O/A óleo em água OD olho direito OE olho esquerdo PBFO brometo de perfluorooctila PBLG poli-benzil-L-glutamato PFS poliéter funcional siloxano pH potencial hidrogeniônico PMNs leucócitos polimorfonucleares PR palmitato de retinol rpm rotações por minuto SANS espalhamentos de nêutrons a baixo ângulo SAXS espalhamento de raios-X a baixo ângulo SFCP silicone fluido de co-polímero glicol SLT sistema líquido transparente SVT sistema viscoso transparente SLO sistema líquido opaco SVO sistema viscoso opaco ST sistema semi-transparente Lista de abreviaturas XIII ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli SF separação de fases TCLE termo de consentimento livre e esclarecido TEP teste de estabilidade preliminar TSA ágar soja caseína TSB caldo soja caseína TSI ágar inclinado ferro-três açúcares UFC unidade formadora de colônia UI unidade internacional UV radiação ultravioleta UVA radiação ultravioleta A VA vitamina A VAP vitamina A palmitato XLD ágar xilose-lisina-desoxicolato Lista de símbolos, unidades e/ou grandezas XIV ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli LISTA DE SÍMBOLOS, UNIDADES E/OU GRANDEZAS Å ângstron G' módulo de estocagem G'' módulo de perda M molar mM milimolar  marca registrada HI fase hexagonal normal HII fase hexagonal reversa Hz hertz MHz megahertz II fase cúbica micelar Lαααα fase lamelar µµµµS microSiemens mPa.s milipascal N Newton Pa Pascal λλλλ comprimento de onda R2 coeficiente de correlação δ densidade ηηηη viscosidade [ ] concentração s-1 segundo recíproco t temperatura absoluta VI fase cúbica bicontínua Lista de tabelas XV ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição dos diagramas ternários. 55 Tabela 2. Formulações selecionadas. 58 Tabela 3. Formulações preparadas com concentração fixa de tensoativo e variações nas proporções de fase aquosa e oleosa. 88 Tabela 4. Densidade relativa (g/cm3) das três formulações estudadas para cada sistema (n=3). 88 Tabela 5. Composição e concentração dos componentes nas formulações selecionadas. 99 Tabela 6. Densidade relativa das formulações estudadas (g/cm3). 100 Tabela 7. Valores referentes ao pH das formulações 24 horas após a manipulação, armazenadas em temperatura ambiente (25 ± 2 ºC). 101 Tabela 8. Valores de condutividade iônica em µS/cm para as formulações estudadas. 102 Tabela 9. Contagem de microrganismos mesófilos aeróbios (bactérias e fungos) nas formulações. 124 Tabela 10. Desafio das formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com E. coli. 126 Tabela 11. Desafio das formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com S. aureus. 126 Tabela 12. Desafio das formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com P. aeruginosa. 126 Tabela 13. Desafio das formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com C. albicans. 127 Tabela 14. Desafio das formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com A. niger. 127 Tabela 15. Contagem de microrganismos nas formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com E. coli. 128 Tabela 16. Contagem de microrganismos nas formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com S. aureus. 128 Tabela 17. Contagem de microrganismos nas formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com P. aeruginosa. 129 Tabela 18. Contagem de microrganismos nas formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com C. albicans. 129 Tabela 19. Contagem de microrganismos nas formulações F1, F1v, F4 e F4v contaminadas com A. niger. 129 Tabela 20. Valor D, equação da reta e coeficiente de correlação para P. aeruginosa. 133 Tabela 21. Valor D, equação da reta e coeficiente de correlação para C. albicans. 133 Tabela 22. Valor D, equação da reta e coeficiente de correlação para A. niger. 133 Tabela 23. Eritema observado no estudo de irritação dérmica primária, segundo escala de Draize, após 4 e 72 horas de tratamento com as formulações F1, F1v, F4, F4v e controle (n=5), aplicadas no dorso dos coelhos. 136 Tabela 24. Espessura da camada córnea nos diferentes grupos experimentais. 138 Tabela 25. Espessura da epiderme nos diferentes grupos experimentais. 139 Tabela 26. Número de fibroblastos nos diferentes grupos experimentais na derme papilar. 144 Tabela 27. Número de leucócitos nos diferentes grupos experimentais na derme papilar. 146 Tabela 28. Constituição das formulações utilizadas nos estudos de avaliação de 150 Lista de tabelas XVI ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli eficácia. Tabela 29. Áreas* com traços de rugas na região periorbital dos olhos direito (OD) e esquerdo (OE) das voluntárias, dos diferentes grupos estudados, antes e depois do tratamento. * áreas de 1,2 cm2 em imagens com aumento de 10x. 150 Lista de figuras ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli XII LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ptose das sobrancelhas. 07 Figura 2. Rugas dinâmicas frontais. 08 Figura 3. Ptose da ponta do nariz. 09 Figura 4. Diferenças anatômicas existentes entre o sulco nasogeniano de uma criança (A) e de um idoso (B). 10 Figura 5. Comparação do papo de peru (A) com o desenho de uma papada normal de um jovem (B). 11 Figura 6. Rugas entrelaçadas em uma mulher de 65 anos. 12 Figura 7. Linhas horizontais na testa de um homem de 75 anos. 12 Figura 8. Pés de galinha na lateral dos olhos de um homem de 58 anos. 13 Figura 9. Rugas atróficas. 13 Figura 10. Rugas elásticas. 14 Figura 11. Rugas de expressão na testa e nas bochechas de uma senhora. 14 Figura 12. Estrutura química do palmitato de retinol. 20 Figura 13. Estrutura das gotículas de microemulsão A/O e O/A. 23 Figura 14. Digrama de fases – (a) titulação com fase aquosa; (b) representação dos pontos de titulação e regiões do diagrama de fases. 26 Figura 15. Emulsões obtidas com diferentes concentrações do tensoativo polietilenoglicol perfluroalquilado com a fase oleosa brometo de perflurooctila (BPFO). Representação da classificação de Winsor. (A) Winsor I (fase oleosa em equilíbrio com fase emulsionada). (B) Winsor III (fase emulsionada em equilíbrio com fase aquosa e fase oleosa). (C) Winsor II (fase aquosa em equilíbrio com fase emulsionada). (D) Winsor IV (emulsão homogênea). (E) Microemulsão. 27 Figura 16. Esquema ilustrativo do aparecimento das mesofases líquido- cristalinas. 30 Figura 17. Arranjo estrutural de uma mesofase colestérica. 31 Figura 18. Esquema ilustrativo de cristais líquidos liotrópicos – representação de moléculas anfifílicas solúveis em água com formação de micelas. 32 Figura 19. Representação esquemática das principais fases líquido-cristalinas liotrópicas, respectivamente cristal líquido lamelar, cristal líquido hexagonal e cristal líquido cúbico. 33 Figura 20. Diagrama esquemático de SAXS e difração dos raios X. 40 Figura 21. Representação esquemática do efeito de cisalhamento, sendo em (a) o cubo hipotético sujeito à aplicação de força e em (b) o cubo sujeito a uma força tangencial na camada superior. 42 Figura 22. Representação gráfica dos diferentes tipos de comportamentos reológicos. 44 Figura 23. Reograma produzido por um material tixotrópico pseudoplástico em (a) e reograma produzido por um material reopético em (b). 45 Figura 24. Representação esquemática do módulo de elasticidade complexo G* (ω), seus componentes em fase G' (ω), fora de fase G'' (ω) e do ângulo de fase δ. 46 Figura 25. Caixa de contenção com inclinação de 45º na parte frontal. 68 Figura 26. Caixa de contenção com parte superior vazada. 68 Lista de figuras ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli Figura 27. Fotografia de uma voluntária configurada com grade de 1,2cm2 de área (imagem com aumento de 10 vezes). 71 Figura 28. Estrutura química básica dos silicones, sendo que R1 e R2 são usualmente os radicais orgânicos: metil, fenil, vinil, fluoropropil, hidroxila e halogênio. 74 Figura 29. Estrutura química do polissorbato 80. 75 Figura 30. Diagrama de fases pontual do sistema S1 constituído por DC 5329 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193 (fase oleosa), no qual: • SLT = sistema líquido transparente; • SVT = sistema viscoso transparente; ■ ST = sistema semi-transparente; ▼ SLO = sistema líquido opaco; ▼ SVO = sistema viscoso opaco; ■ SF= separação de fases. 77 Figura 31. Diagrama de fases fechado do sistema S1 constituído por DC 5329 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193 (fase oleosa), no qual: SLT = sistema líquido transparente; SVT = sistema viscoso transparente; ST = sistema semi-transparente; SLO = sistema líquido opaco; SVO = sistema viscoso opaco; SF= separação de fases. 78 Figura 32. Diagrama de fases pontual do sistema S2 constituído por Hostaphat KL30 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193 (fase oleosa), no qual: • SLT = sistema líquido transparente; • SLO = sistema líquido opaco; ▼ ST = sistema semi-transparente; ▼ SF = separação de fases. 79 Figura 33. Diagrama de fases fechado do sistema S2 constituído por Hostaphat KL30 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193 (fase oleosa), no qual: SLT = sistema líquido transparente; SLO = sistema líquido opaco; ST = sistema semi-transparente; SF = separação de fases. 80 Figura 34. Diagrama de fases pontual do sistema S3 constituído por Tween 80 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193 (fase oleosa), no qual: • SLT = sistema líquido transparente; • SVT = sistema viscoso transparente; ▼ ST = sistema semi-transparente. 81 Figura 35. Diagrama de fases fechado do sistema S3 constituído por Tween 80 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193 (fase oleosa), no qual: SLT = sistema líquido transparente; SVT= sistema viscoso transparente; ST= sistema semi-transparente. 82 Figura 36. Diagrama de fases pontual do sistema S4 constituído por DC 5329 (tensoativo), água (fase aquosa) e Ceraphyl 230 (fase oleosa), no qual: • SLT = sistema líquido transparente; • ST = sistema semi- transparente; ▼ SVT = sistema viscoso transparente; ▼ SLO = sistema líquido opaco; ♦ SF= separação de fases. 83 Figura 37. Diagrama de fases fechado do sistema S4 constituído por DC 5329 (tensoativo), água (fase aquosa) e Ceraphyl 230 (fase oleosa), no qual: SLT = sistema líquido transparente; SVT = sistema viscoso transparente; SLO = sistema líquido opaco; ST = sistema semi- transparente; SF = separação de fases. 84 Figura 38. Diagrama de fases pontual do sistema S5 constituído por DC 193 (tensoativo), água (fase aquosa) e Ceraphyl 230 (fase oleosa), no qual: • SLT = sistema líquido transparente; • SF = separação de fases. 85 XIII Lista de figuras ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli Figura 39. Diagrama de fases fechado do sistema S5 constituído por DC 193 (tensoativo), água (fase aquosa) e Ceraphyl 230 (fase oleosa), no qual: SLT = sistema líquido transparente; SF = separação de fases. 86 Figura 40. Efeito da variação de porcentagem de fase aquosa nos valores de condutividade iônica das formulações F1, F2 e F3 do sistema S1, constituído de silicone fluido de co-polímero glicol (fase oleosa), poliéter funcional siloxano (tensoativo) e água (fase aquosa). 89 Figura 41. Efeito da variação de porcentagem de fase aquosa nos valores de condutividade iônica das formulações F1, F2 e F3 do sistema S2, constituído de silicone fluido de co-polímero glicol (fase oleosa), trilauril- 4 fosfato (tensoativo) e água (fase aquosa). 89 Figura 42. Efeito da variação de porcentagem de fase aquosa nos valores de condutividade iônica das formulações F1, F2 e F3 do sistema S3, constituído de silicone fluido de co-polímero glicol (fase oleosa), polissorbato 80 (tensoativo) e água (fase aquosa). 90 Figura 43. Efeito da variação de porcentagem de fase aquosa nos valores de condutividade iônica das formulações F1, F2 e F3 do sistema S4, constituído de adipato de diisopropila (fase oleosa), poliéter funcional siloxano (tensoativo) e água (fase aquosa). 90 Figura 44. Efeito da variação de porcentagem de fase aquosa nos valores de condutividade iônica das formulações F1, F2 e F3 do sistema S5, constituído de adipato de diisopropila (fase oleosa), silicone fluido de co-polímero glicol (tensoativo) e água (fase aquosa). 91 Figura 45. Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F1 do sistema S1 (silicone fluido de co-polímero glicol, poliéter funcional siloxano e água) observado 24 horas após manipulação à temperatura ambiente (25 ± 2 °C) (400x). 94 Figura 46. Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F1 do sistema S1 (silicone fluido de co-polímero glicol, poliéter funcional siloxano e água) observado 15 dias após manipulação: (a) à temperatura ambiente (25 ± 2 °C), (b) em geladeira (5 ± 2 °C) e (c) em estufa (37 ± 2 °C) (200x). 94 Figura 47. Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F1 do sistema S4 (adipato de diisopropila, poliéter funcional siloxano e água) observado 24 horas após manipulação à temperatura ambiente (25 ± 2 °C) (400x). 95 Figura 48. Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F1 do sistema S4 (adipato de diisopropila, poliéter funcional siloxano e água) observado 15 dias após manipulação: (a) à temperatura ambiente (25 ± 2 °C), (b) em geladeira (5 ± 2 °C) e (c) em estufa (37 ± 2 °C) (200x). 95 Figura 49. Diagrama de fases do sistema S1 constituído por DC 5329 (tensoativo), água (fase aquosa) e DC 193/PR (fase oleosa), no qual: • SF (separação de fases); • SVO (sistema viscoso opaco); ▼ SLO (sistema líquido opaco); ▼ SVT (sistema viscoso transparente); ■ SLT (sistema líquido transparente). 98 Figura 50. Fotomicrografias sob luz polarizada da formulação F1 do sistema S1. A. tempo 24 horas (T1); B. tempo trinta dias (T30) na temperatura 104 XIX Lista de figuras ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli ambiente (25 ± 2 °C); C. tempo trinta dias (T30) em estufa (37 ± 2 °C); D. tempo trinta dias (T30) em geladeira (5 ± 2 °C) (200x). Figura 51. Fotomicrografias sob luz polarizada da formulação F1v do sistema S1. A. tempo 24 horas (T1); B. tempo trinta dias (T30) na temperatura ambiente (25 ± 2 °C); C. tempo trinta dias (T30) em estufa (37 ± 2 °C); D. tempo trinta dias (T30) em geladeira (5 ± 2 °C) (200x). 105 Figura 52. Fotomicrografias sob luz polarizada da formulação F4 do sistema S1. A. tempo 24 horas (T1); B. tempo trinta dias (T30) na temperatura ambiente (25 ± 2 °C); C. tempo trinta dias (T30) em estufa (37 ± 2 °C); D. tempo trinta dias (T30) em geladeira (5 ± 2 °C) (200x). 106 Figura 53. Fotomicrografias sob luz polarizada da formulação F4v do sistema S1. A. tempo 24 horas (T1); B. tempo trinta dias (T30) na temperatura ambiente (25 ± 2 °C); C. tempo trinta dias (T30) em estufa (37 ± 2 °C); D. tempo trinta dias (T30) em geladeira (5 ± 2 °C) (200x). 107 Figura 54. Comparação da evolução das curvas de SAXS para as formulações F1, F1v, F4 e F4v à temperatura ambiente. 109 Figura 55. Evolução das curvas de SAXS para a formulação F1 nas diversas condições de armazenamento. 109 Figura 56. Evolução das curvas de SAXS para a formulação F1v nas diversas condições de armazenamento. 110 Figura 57. Evolução das curvas de SAXS para a formulação F4 nas diversas condições de armazenamento. 110 Figura 58. Evolução das curvas de SAXS para a formulação F4v nas diversas condições de armazenamento. 111 Figura 59. Evolução das curvas de SAXS para a formulação F5 nas diversas condições de armazenamento. 111 Figura 60. Variação da tensão de cisalhamento em função da velocidade de cisalhamento para as diferentes formulações armazenadas à temperatura ambiente por 24 horas (a) e por 30 dias (b), mantidas em estufa (c) e geladeira (d) após 30 dias de manipulação. Símbolos vazios representam a curva decrescente (diminuição da velocidade de cisalhamento). 114 Figura 61. Variação do módulo de armazenagem (G') e de perda (G'') em função da freqüência para as diferentes formulações mantidas à temperatura ambiente após 24 horas de manipulação. 117 Figura 62. Variação do módulo de armazenagem (G') e de perda (G'') em função da freqüência para as diferentes formulações mantidas à temperatura ambiente após 30 dias de manipulação. 119 Figura 63. Variação do módulo de armazenagem (G') e de perda (G'') em função da freqüência para as diferentes formulações mantidas em estufa após 30 dias de manipulação. 120 Figura 64. Variação do módulo de armazenagem (G') e de perda (G'') em função da freqüência para as diferentes formulações mantidas em geladeira após 30 dias de manipulação. 122 Figura 65. Perfil de letalidade – log UFC/g x tempo (horas) de P. aeruginosa nas formulações F1 (A), F1v (B), F4 (C) e F4v (D). 130 Figura 66. Perfil de letalidade – log UFC/g x tempo (horas) de C. albicans nas formulações F1 (A), F1v (B), F4 (C) e F4v (D). 131 XX Lista de figuras ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli Figura 67. Perfil de letalidade – log UFC/g x tempo (horas) de A. niger nas formulações F1 (A), F1v (B), F4 (C) e F4v (D). 132 Figura 68. Teste de irritação dérmica primária em coelhos após 4 horas. 137 Figura 69. Teste de irritação dérmica primária em coelhos após 72 horas. 137 Figura 70. Espessura da camada córnea nos diferentes grupos experimentais (símbolos iguais representam médias estatisticamente não diferentes). 139 Figura 71. Espessura da epiderme nos diferentes grupos experimentais (símbolos iguais representam médias estatisticamente não diferentes). 140 Figura 72. Fotomicrografias evidenciando a camada córnea e a epiderme de coelhos após os tratamentos: (A) – controle; (B) – F1; (C) – F1v; (D) – F4; (E) – F4v (200x). 143 Figura 73. Número de fibroblastos nos diferentes grupos experimentais na derme papilar (símbolos iguais representam médias estatisticamente não diferentes). 144 Figura 74. Fotomicrografias evidenciando a derme papilar dos grupos: (A) – Controle; (B) – F1v. Observa-se maior número de fibroblastos (seta) no grupo em que se aplicou a formulação F1v (1000x). 145 Figura 75. Número de leucócitos nos diferentes grupos experimentais na derme papilar (símbolos iguais representam médias estatisticamente não diferentes). 146 Figura 76. Áreas* com traços de rugas das voluntárias, em seus diferentes grupos, antes e depois do tratamento (símbolos iguais representam médias estatisticamente não diferentes). 151 XXI Resumo ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli XXII RESUMO O estudo de sistemas nanoestruturados tem chamado a atenção de um número cada vez maior de pesquisadores das áreas farmacêutica e cosmética, devido às inúmeras vantagens conferidas, como aumento da estabilidade e eficácia de princípios ativos. Os efeitos desses sistemas na pele são dificilmente relatados na literatura científica. Os objetivos deste trabalho foram: desenvolver e caracterizar fisico-quimicamente sistemas nanoestruturados contendo palmitato de retinol (PR); realizar os testes de estabilidade preliminares (TEP) para as formulações selecionadas; realizar o controle microbiológico bem como o teste de desafio para eficácia conservante para as formulações empregadas; verificar o efeito irritativo das formulações segundo escala de Draize e por análise histológica, além de avaliar a eficácia das formulações no tratamento do envelhecimento cutâneo. As formulações preparadas com silicone fluido de co-polímero glicol (SFCG), poliéter funcional siloxano (PFS) e água (S1) e com adipato de diisopropila, PFS e água (S4) apresentaram fases líquido-cristalinas do tipo lamelar. Os TEPs evidenciaram que as formulações F1, F2 e F3 de todos os sistemas desenvolvidos se mantiveram estáveis durante o período do estudo. As formulações do sistema S1 apresentaram maior formação e estabilidade de cristais líquidos no decorrer do experimento, sendo selecionadas para incorporação de PR. As formulações F1, F1v, F4 e F4v do sistema S1 e a formulação F5 do sistema S4 apresentaram-se como fluidos pseudoplásticos não–Newtonianos. A formulação F5 foi a mais tixotrópica, seguido pelas formulações F1v e F1. As condições de armazenamento, de acordo com os ensaios de escoamento e mecânico- dinâmicos, interferem na estruturação do sistema. As formulações F1, F1v, F4 e F4v não apresentaram contaminação microbiana, evidenciado pela estimativa do número de microrgasmos viáveis e pela pesquisa de patógenos. O teste de desafio e o cálculo do valor D se mostraram métodos eficientes para a avaliação da propriedade conservante das formulações. As formulações F1, F1v, F4 e F4v não ocasionaram irritação dérmica de acordo com a escala de Draize e análises histológicas, as quais demonstraram que a formulação F1v promoveu aumento significativo do número de fibroblastos na derme. Os estudos de eficácia na pele humana evidenciaram que as formulações acrescidas de PR proporcionaram redução nas rugas periorbiculares das voluntárias, sugerindo a sua eficácia no tratamento do envelhecimento cutâneo. Palavras-chave: sistemas nanoestruturados; palmitato de retinol; controle microbiológico; avaliação de segurança. Abstract ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli XXIII ABSTRACT The study of nanostructured systems has interested an inreasing number of pharmaceutical and cosmetic areas researchers, due to the great advantage, as increase of the stability and effectiveness of active substances. The effects of those systems in the skin poorly reported on the scientific literature. The aims of this work were: to develop and to characterize physico- chemically nanostructured systems containing retynil palmitate (RP); to carry out a preliminary stability tests (PST) for the selected formulations; to carry through the microbiological control as well the challenge test for preservative effectiveness for the used formulations; to evaluate the irritation effect of the formulations according to Draize scale and histological analysis, besides to evaluate the effectiveness of the formulations in the treatment of the cutaneous aging. The formulations prepared with silicon glycol copolymer (SGC), polyether functional siloxane (PFS) and water (S1) and with diisopropyl adipate, PFS and water (S4) presented liquid-crystalline phases with lamellar arrangement. The PST evidenced that the formulations F1, F2 and F3 of all the developed systems remained stable throughout the period of study. The formulations of the S1 system presented higher formation of liquid crystals and better stability, being selected for incorporation of RP. The formulations F1, F1v, F4 and F4v of the S1 system and the formulation F5 of the S4 system presented as not- Newtonian pseudoplastic fluids. The formulation F5 was the most thixotropic, followed by the formulations F1v and F1. The storage conditions, in accordance with draining and mechanic- dynamic assays, interfere with the structure of the system. The formulations F1, F1v, F4 and F4v did not present microbiological contamination, evidenced by the estimate of the number of viable microorganisms and by the presence of pathogens. The challenge test and the calculation of D value showed efficient methods for the evaluation of the preservative property of the formulations. The formulations F1, F1v, F4 and F4v did not cause dermic irritation in accordance with Draize scale and histological analysis, which demonstrated that the formulation F1v caused significant increase of the number of fibroblasts in dermis. The studies of effectiveness in the skin human evidenced that the formulations added of PR provided to reduction in orbicular wrinkles of the volunteers, suggested its effectiveness in the treatment of the cutaneous aging. Keywords: nanostructured systems; retynil palmitate; microbiological control; safety evaluation. Introdução ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 1 I. INTRODUÇÃO Durante os últimos anos, muita atenção tem sido dada ao desenvolvimento de novos veículos com o objetivo não só de aumentar a eficácia terapêutica de uma substância ativa, como também permitir a redução da sua dose total necessária, minimizando os efeitos colaterais tóxicos (URBAN, 2004). A aplicação de sistemas nanoestruturados como sistemas de liberação de fármacos tem sido alvo de crescente interesse dado às inúmeras vantagens que oferecem, como o aumento da solubilidade e da estabilidade de fármacos, possibilidade de incorporação de substâncias hidrofílicas ou lipofílicas, capacidade de ação como sistemas reservatórios, diminuição da toxicidade, aumento da eficácia, bem como alteração da disponibilidade de fármacos, dependendo da forma de interação entre fármaco e sistema (BRINON et al., 1999). Dentre os vários sistemas de transporte e liberação de princípios ativos na superfície cutânea, existem os cristais líquidos e as microemulsões. Os cristais líquidos apresentam propriedades de sólidos e líquidos, em virtude de possuirem ordem estrutural, rigidez e ligações definidas como os sólidos, além de mobilidade, regiões desordenadas e fluidas como os líquidos (SANTOS, 2006). As microemulsões, por sua vez, podem ser definidas como emulsões transparentes, nas quais um óleo é disperso num meio aquoso (ou vice-versa), contendo um tensoativo, associado ou não a um co-tensoativo apropriado, gerando um sistema termodinamicamente estável. Além disso, elas possuem gotículas da fase interna na ordem de nanômetros (nm). As substâncias ativas podem ser veiculadas nas microemulsões quando são solubilizadas na fase oleosa ou aquosa (OLIVEIRA & SCARPA, 2001; OLIVEIRA et al., 2002). A elucidação da estrutura interna de um sistema naoestruturado é muito complexa. Técnicas sofisticadas são necessárias para atingir este objetivo, como espalhamento de raios- X a baixo ângulo – SAXS (RAMAN et al., 2003) e espalhamento de luz (light scattering) (SINTOV & SHAPIRO, 2004). Outros métodos como a condutividade iônica (SINTOV & SHAPIRO, 2004), viscosidade (SPICLIN et al., 2003) e microscopia de luz polarizada (KREILGAARD, 2002) também são freqüentemente utilizados para o estudo do comportamento físico-químico de tais sistemas. Em virtude do grande número de citações na literatura científica, a indústria cosmética, bem como a farmacêutica, têm se mostrado interessadas no desenvolvimento de Introdução ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 2 sistemas nanoestruturados, uma vez que podem promover maior hidratação à pele, além de aumentar a eficácia e estabilidade de substâncias ativas (PARK & KIM, 1999; CUNHA JUNIOR et al., 2003; SINTOV & SHAPIRO, 2004). Neste contexto, há relatos de que os cristais líquidos podem aumentar a hidratação cutânea, melhorar a estabilidade e/ou ação de fármacos. SPICLIN e colaboradores (2003) verificaram que sistemas nanoestruturados podem ser utilizados como transportadores para a liberação tópica do fosfato de ascorbil sódico. SANTOS e colaboradores (2005) observaram aumento da estabilidade de sistemas líquido-cristalinos contendo óleo de calêndula. Apesar do crescente interesse por sistemas líquido-cristalinos, dificilmente encontram- se informações sobre estudos que avaliam histologicamente o efeito de formulações acrescidas de alta concentração de tensoativo na pele, que possivelmente podem ocasionar irritação cutânea. A evidência e interpretação de possíveis efeitos indesejáveis no tecido cutâneo podem ser realizadas por meio de avaliação histopatológica e histométrica, uma vez que permitem a análise do tecido epitelial, da derme e também das características celulares. Além disso, ainda pode auxiliar o delineamento experimental para a realização de estudos de eficácia da derme e no desenvolvimento de novos produtos cosméticos (MAIA CAMPOS et al., 1999; SILVA & MAIA CAMPOS, 2000). Na preparação de sistemas nanoestruturados geralmente não são empregados conservantes microbiológicos, pois acredita-se que grandes quantidades de tensoativos podem dificultar o desenvolvimento de microrganismos (AL-ADHAM et al., 2003). Quando se considera a qualidade microbiológica de produtos farmacêuticos não estéreis e cosméticos se admite a presença de um número limitado de microrganismos, tendo em vista as características de sua utilização. Freqüentemente, o critério é a pesquisa de microrganismos indicadores que, quando presentes em uma formulação, podem fornecer informações sobre o nível de sua contaminação e as condições higiênico-sanitárias durante o processamento, produção ou armazenamento (BRASIL, 1999). No Brasil, os limites microbianos para medicamentos são estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da Resolução no 481/99 (BRASIL, 1999). Uma vez que os cosméticos têm a probabilidade de serem expostos a contaminantes microbiológicos, é importante que estes tenham uma resistência própria contra o crescimento Introdução ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 3 microbiano. Para isto, é necessário que o sistema conservante seja adequado e eficaz para assegurar a estabilidade microbiológica, evitando-se os riscos eventuais da ação de toxinas e metabólitos microbianos. Assim, considerando-se que as fórmulas com alta concentração de tensoativos geralmente são desprovidas de conservantes, é de extrema importância que se tenha um controle microbiológico destas, para se assegurar um produto de boa qualidade, livre de determinados microrganismos, principalmente os potencialmente prejudiciais ao usuário, bem como garantir uma preparação estável, que permaneça como tal, mesmo após o uso contínuo pelo consumidor (LORENZETTI, 1984; CONSTÂNCIO, 1993). Uma das alternativas para verificação da eficácia conservante das formulações é o método de regressão linear, o qual baseia-se no teste de desafio pela inoculação de microrganismos e verificação da redução daqueles que são viáveis, em diferentes tempos (OLIVEIRA, 1999). Assim, este trabalho se propôs a desenvolver e caracterizar fisico-quimicamente sistemas nanoestruturados contendo palmitato de retinol, realizar os testes de estabilidade preliminares para as formulações selecionadas, estudar o comportamento reológico das formulações por meio dos ensaios de escoamento e mecânico-dinâmicos, realizar o controle microbiológico bem como o teste de desafio para as formulações selecionadas, verificar o efeito irritativo na pele de coelhos das formulações por meio da avaliação de eritema e edema segundo escala de Draize e determinação de medidas histométricas e histopatológicas, além de avaliar a eficácia das formulações no tratamento do envelhecimento cutâneo, mediante aplicação das formulações na pele de mulheres que apresentam rugas periorbiculares. Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 4 II. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Envelhecimento cutâneo A face é a parte do corpo que mantém um relacionamento mais direto com o mundo. É principalmente através das expressões que o ser humano externa seus sentimentos e emoções como preocupação, raiva, alegria, dor e angústia. A busca por uma boa aparência, por uma imagem jovem, bela e desejada vem se generalizando e se tornando necessária tanto para o relacionamento profissional como pelo benefício estético. Por esta razão, há uma crescente preocupação das pessoas, de um modo geral, com relação aos cuidados estéticos (TAKACS et al., 2002). A discussão relacionada à qualidade estética da pele tem-se tornado amplamente aceita e praticada. Um arsenal de produtos tem sido anunciado como fonte de rejuvenescimento, mas poucos deles têm apresentado comprovações científicas de real eficácia (FARAGE et al., 2007). Todos os organismos chegam a uma fase regressiva de seu ciclo vital, que se manifesta por modificações anátomo-fisiológicas, as quais são conhecidas como envelhecimento. A pele, sendo um órgão de superfície, sofre as agressões do meio ambiente e ação de fatores extrínsecos, particularmente das radiações solares, as quais têm um papel relevante no envelhecimento cutâneo. Além disso, está sujeita à ação de fatores intrínsecos ou cronológicos, como hormonais, nutricionais e vasculares, os quais podem estar relacionados com as alterações no tecido conjuntivo da derme (ORIÁ et al., 2003). O processo de envelhecimento altera a estrutura e a função dos órgãos e, no caso da pele, modifica também seu aspecto. Os sinais clínicos e fisiológicos do envelhecimento cutâneo são numerosos e variados (TRELLES et al., 1998). O envelhecimento intrínseco provavelmente resulta de um declínio programado geneticamente nas funções e capacidades fisiológicas. Clinicamente, o envelhecimento intrínseco é atrófico e resulta na perda progressiva da elasticidade, na atrofia da pele e no aumento das linhas de expressão. Os sinais fisiológicos do envelhecimento intrínseco incluem a atrofia epidérmica, o achatamento da junção dermo-epidérmica, a atividade metabólica mais lenta e o aumento do tamanho dos queratinócitos com a idade. Especificamente, a camada córnea permanece relativamente inalterada, mas a epiderme afina-se com um achatamento da junção dermo-epidérmica que é refletida por um aumento da fragilidade cutânea. Há Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 5 considerável diminuição na espessura da derme e na vascularização, assim como uma redução no número e capacidade biossintética de fibroblastos. Finas fibras elásticas dérmicas espessam com a idade e, então, desaparecem (MAUREL et al., 1980; TSUJI & HAMADA, 1981; LAPIÈRE, 1990; MARGELIN et al., 1993; BERNSTEIN et al., 1996; MORAGAS et al., 1998; ASHCROFT et al., 1999; BISCHOFF et al., 2000; BATISTELA et al., 2007). O termo envelhecimento extrínseco e fotoenvelhecimento são freqüentemente utilizados como sinônimos, embora outros fatores extrínsecos, diferentes da radiação solar, como o fumo, possam afetar a pele (KAMBAYASHI et al., 2003; VELASCO et al., 2004; WULF et al., 2004). À medida que a pele envelhece, modificações como afinamento da derme e diminuição do conteúdo de colágeno, não podem ser evitadas. Essas alterações são aceleradas pela exposição crônica aos raios ultravioleta (UV), gerando a formação de radicais livres; com isso, há uma elevação no número de lesões oxidativas não reparadas, que alteram o metabolismo e são responsáveis pelo envelhecimento precoce (AZULAY et al., 2003; VELASCO et al., 2004). As mudanças clínicas resultantes do fotoenvelhecimento causadas pelos efeitos acumulativos das exposições solares freqüentes e prolongadas, especificamente da radiação UV, superposta ao envelhecimento intrínseco, podem abranger: enrugamento, aspereza ao toque, lividez, manchas hiperpigmentadas irregulares, telangiectasia e em alguns casos, queratose actínica e neoplasma cutâneo. Além disso, o fotoenvelhecimento altera a estrutura e a função da epiderme e da derme, provocando alterações perceptíveis como espessamento da camada córnea, indução de sudorese e produção de melanina (SANTORO, 2000). Observa-se na pele severamente fotodanificada perda da polaridade epidérmica (maturação ordenada) e atipia dos queratinócitos, principalmente nas camadas mais inferiores da epiderme. Outras mudanças significativas ocorrem na derme, como degeneração das fibras elásticas e colágenas, aparecimento de rugas, sulcos e manchas pigmentadas, além de coloração amarelada na pele e ocorrência de lesões pré-malignas ou malignas (NARDIN & GUTERRES, 1999; KAMBAYASHI et al., 2003; VELASCO et al., 2004). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 6 2.2. Rugas KAMBAYASHI e colaboradores (2003) afirmam que as mudanças nos componentes da derme podem ser o maior fator de estimulação da formação das rugas, que resultam na modificação de algumas propriedades físicas da pele. Estudos mostraram que o mecanismo de formação das rugas é estimulado pela radiação UV e que a acumulativa exposição à luz solar induz ao aumento da produção das elastases pelos fibroblastos, levando à degeneração da elastina e à perda das fibras elásticas lineares, resultando na perda da elasticidade cutânea e formação das rugas faciais (AKAZAKI & IMOKAWA, 2001). DZUBOW (2000) e STEINER (2000) afirmam que a formação das rugas faciais é um reflexo do conjunto de alterações ocorridas nas camadas da pele, que trazem como conseqüência o aumento anatômico da face, perda do tônus adequado, sulcos e flacidez cutânea. À medida que o tecido subcutâneo, tecido muscular e o volume ósseo diminuem, o estresse físico acumulado produz as alterações posteriores associadas com aparência envelhecida. Tradicionalmente, a pele não consegue retornar ao seu lugar de origem, levando ao acúmulo de dobras com ou sem sulcos ou depressões associados. O tecido perde seu suporte tornando-se ptótico. Para melhor entendimento de tais alterações, pode-se dividir a face em terços e observar as alterações nela ocorridas durante o envelhecimento facial. Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 7 Terço superior do rosto O estresse dinâmico da testa é gerado pelas alterações configuracionais dos músculos frontais, sendo a mais comum a ptose da sobrancelha decorrente da atividade excessiva dos músculos frontais chamados de corrugador e prócerus. A diminuição do coxim gorduroso da sobrancelha se torna posteriorizada em relação à camada muscular desta, combinado com a presença de pele sobressalente e a atrofia óssea, provocando a ptose das sobrancelhas (Figura 1). Estas alterações levam à aparência aprofundada e submersa desta região. Os músculos frontais são freqüentemente utilizados para elevar as sobrancelhas ptosadas produzindo mais rugas dinâmicas frontais (Figura 2). Outra alteração muito comum no envelhecimento é o aparecimento de linhas radiais no canto dos olhos, conhecidas popularmente como pés-de- galinha. Elas surgem devido ao efeito do movimento de um dos músculos periorbitais oculares incapazes de manter a sustentação deste contorno após o contínuo movimento de esticar e puxar (DZUBOW, 2000). Figura 1. Ptose das sobrancelhas (DZUBOW, 2000). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 8 Figura 2. Rugas dinâmicas frontais (DZUBOW, 2000). Terço medial do rosto As modificações no terço medial da face pela idade compreendem as pálpebras, bochechas e nariz. A ptose palpebral é resultante do alongamento e falta de elasticidade dos tendões dos cantos lateral e medial das pálpebras associado à diminuição do tônus do músculo orbital, produzindo uma instabilidade da posição da pálpebra, a qual pode levar ao desenvolvimento ectrópio ou endotrópio. O nariz também sofre alterações estruturais. A ponta do nariz cai causando ptose da ponta do nariz (Figura 3), devido ao esticamento e falta de elasticidade do sistema que sustenta esta região. As bochechas também caem por causa da perda do coxim gorduroso bucal (HATZIS, 2004). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 9 Figura 3. Ptose da ponta do nariz (DZUBOW, 2000). Terço inferior do rosto As alterações do terço inferior facial são mais drásticas. A diminuição do volume ósseo associada a ação gravitacional puxam a pele para baixo promovendo um excesso de tecido facial caído chamado de papadas. O sulco nasogeniano formado é derivado das intersecções dos músculos elevadores do lábio no tecido dérmico do sulco naso-labial. À medida que o tecido subcutâneo diminui com a idade e a pele excessiva se forma, o tecido redundante escorre sobre o ponto de inserção muscular no sulco (HATZIS, 2004). A Figura 4 apresenta as diferenças anatômicas existentes entre o sulco nasogeniano de uma criança (A) e de um idoso (B). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 10 Figura 4. Diferenças anatômicas existentes entre o sulco nasogeniano de uma criança (A) e de um idoso (B) (DZUBOW, 2000). De acordo com DZUBOW (2000), a deformidade em pescoço de peru decorre da redundância da pele (rugas gravitacionais) em conjunto com uma separação congênita dos músculos do platisma e protusão da gordura submentoniana (Figura 5). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 11 Figura 5. Comparação do papo de peru (A) com o desenho de uma papada normal de um jovem (B) (DZUBOW, 2000). KLIGMAN e colaboradores (1985) classificaram as rugas em dois tipos: rugas entrelaçadas e rugas lineares do rosto. HATZIS (2004) afirma que as rugas entrelaçadas aparecem na pele que sofreu degeneração causada pela radiação solar, caracteristicamente no pescoço (Figura 6), enquanto as rugas lineares são as primeiras a tomarem o lugar das linhas Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 12 de expressão e são consideradas as pioneiras no envelhecimento da pele. Elas aparecem preferencialmente perpendiculares às fibras musculares do rosto. No caso de pele de pessoas jovens, este tipo de ruga desaparece quando os músculos faciais são contraídos; em peles envelhecidas, tornam-se permanentes. As rugas lineares faciais são diferenciadas de acordo com quatro padrões (HATZIS, 2004): � Linhas horizontais da testa (Figura 7); � Sulcos na lateral dos olhos, conhecidos como pés de galinha (Figura 8); � Rugas que nascem no nariz e ao redor da boca; � Rugas faciais em fumantes, que representam um tipo especial de rugas prematuras, que também aparecem mais freqüentemente em mulheres. Figura 6. Rugas entrelaçadas em uma mulher de 65 anos (HATZIS, 2004). Figura 7. Linhas horizontais na testa de um homem de 75 anos (HATZIS, 2004). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 13 Figura 8. Pés de galinha na lateral dos olhos de um homem de 58 anos (HATZIS, 2004). Uma classificação de rugas mais recente foi descrita por PIÉRARD e colaboradores (2003), que distinguiram quatro tipos de rugas, de acordo com seu aspecto histológico e patogênico: atróficas, elásticas, de expressão e gravitacionais, sendo que as maiores diferenças estruturais entre elas podem ser encontradas principalmente na derme. As rugas atróficas são rugas finas, paralelas entre si e que desaparecem quando colocada uma tensão transversal na pele (Figura 9). Elas se formam de acordo com a postura do corpo e aparecem devido à atrofiação dos feixes de colágeno da camada dérmica reticular e da margem conectiva da epiderme. A presença de rugas está associada à diminuição da propriedade mecânica da pele e elasticidade (PIÉRARD et al., 2003). Figura 9. Rugas atróficas (PIERARD et al., 2003). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 14 As rugas elásticas tornam-se linhas permanentes pela ação da exposição solar. Quando estão totalmente desenvolvidas, tornam a pele mais rígida. São encontradas tipicamente nas bochechas, acima dos lábios e no nariz (Figura 10). A acumulação de elastose pode torná-las marcas permanentes, sendo este tipo de ruga muito menos proeminente em pessoas com pele escura que em peles claras (PIÉRARD et al., 2003). Figura 10. Rugas elásticas (PIÉRARD et al., 2003). As rugas de expressão se tornam linhas permanentes principalmente de acordo com as forças impostas nos músculos faciais (Figura 11). As linhas do franzimento da testa e as linhas periorbiculares são exemplos típicos deste tipo de rugas e possuem sua raiz no local conectivo da hipoderme com as margens (PIÉRARD et al., 2003). Figura 11. Rugas de expressão na testa e nas bochechas de uma senhora (PIÉRARD et al., 2003). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 15 As rugas gravitacionais são denominadas assim porque são resultantes da força gravitacional imposta no tecido que induz à formação de dobras e vergações da pele que perdeu sua rigidez por causa da perda da remodelação do tecido na hipoderme (PIÉRARD et al., 2003). Um grande número de técnicas vem sendo desenvolvidas para a avaliação de rugas, como profilometria, técnicas tridimensionais, técnica de microscopia eletrônica e técnicas de microscopia confocal (AKAZAKI & IMOKAMA, 2001; AKAZAKI et al., 2002; ASPRES et al., 2003). AKAZAKI e colaboradores (2002) citam como técnicas modernas empregadas a profilometria bidimensional com análise de imagens, observação da pele em microscópio eletrônico de varredura, ultra-sonografias, ressonância magnética, tomografia óptica, lasers e outras tecnologias digitais que mapeam a pele e ajudam a transcrevê-la em esculturas. A ultra-sonografia cutânea mostra as alterações nas camadas celulares causadas pela ação da luz solar e envelhecimento cutâneo, indicando a evolução da resposta imune inflamatória, fibrose causada pela exposição da pele à radiação ionizante e até mesmo o grau de hidratação cutânea. A ressonância magnética capta imagens de diferentes regiões do corpo com o auxílio de um computador. É mais utilizada para estudar as reações alérgicas, efeito vasoconstritivo dos corticosteróides e no diagnóstico diferencial de tumores da pele, além de montar imagens das camadas da pele, sem precisar de uma biópsia ou exame laboratorial invasivo. A tomografia óptica permite a diferenciação do estrato córneo, epiderme e derme em um indivíduo (ASPRES et al., 2003). Os métodos profilométricos são métodos clássicos que reproduzem modelos dos enrugamentos da pele, mostrando a impressão da superfície cutânea e a interface dos enrugamentos. São muito utilizados para medição do tamanho das rugas através da aplicação de silicone sobre a superfície da pele do indivíduo, de forma a obter uma escultura da pele analisada (HATZIS, 2004). Os métodos de microscopia eletrônica podem medir a profundidade e a largura das rugas, enquanto os métodos de microscopia confocal medem apenas a largura das mesmas. Já os métodos tridimensionais permitem a obtenção do volume, área superficial, profundidade, largura, comprimento e número de rugas. Porém, a metodologia empregada neste método pode acarretar alguns erros técnicos indesejáveis, como o aparecimento de deformações Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 16 causadas pela opressão do material durante a sua aplicação e penetração dos reagentes usados nos experimentos nas partes profundas das rugas (AKAZAKI & IMOKAWA, 2001). A profundidade e largura das rugas na região dos olhos são freqüentemente medidas pelo método tridimensional direto. AKAZAKI e colaboradores (2002) compararam as medidas de rugas obtidas por este método com a medida obtida pelo método de escultura. A profundidade em µm de cada ruga determinada pelo método tridimensional direto in vivo demonstrou que esta medida é sempre maior, o que permite concluir que o método de escultura não atinge as partes finas das rugas, sugerindo a superioridade do método tridimensional direto. Por outro lado, obteve-se o mesmo tamanho de largura das rugas nas duas técnicas. O método tridimensional direto também pode apresentar algumas dificuldades como interferência da difusão da luz na morfologia tridimensional das rugas; manutenção da projeção da luz em um ângulo constante e redução da precisão da medida por interferência da pigmentação epidérmica. Existe também outra dificuldade mecânica que é a existência de finas fendas interrompidas por grandes rugas, que tornam as linhas obtidas na imagem descontínuas, causando a imprecisão das medidas (AKAZAKI et al., 2002). Outra técnica empregada é a fotografia de filme 35 mm. Trata-se de uma técnica tradicional que representa a condição da pele do modo como é visualizada macroscopicamente, além de ser fácil e de grande utilidade para arquivo médico, aprendizagem e fins diagnósticos. A fotografia ultravioleta (UV) é mais avançada e utiliza o princípio da absorção da radiação UVA através da melanina da pele até atingir a derme, estimulando a emissão de fluorescência das fibras colágenas. Logo, é de extrema importância na documentação de mudanças na pigmentação da pele e danos causados pela radiação solar (ASPRES et al., 2003). Atualmente, são muito empregadas as fotografias digitais, que possuem inúmeras aplicações clínicas, como a detecção de lesões na pele que podem ser guardadas e monitoradas pelo dermatologista através da sobreposição destas imagens na tela do computador, permitindo a verificação de possíveis alterações cutâneas durante um tratamento dermatológico e até mesmo em diagnóstico de tumores epiteliais. A ultra-sonografia a laser é uma análise espectrofotométrica da pele que envolve a sua iluminação com diferentes microondas no espectro visível e infravermelho. Sabendo que diferentes tecidos produzirão Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 17 diferentes leituras no espectro, com a ajuda de um computador, pode-se construir a imagem digital de cada estrutura cutânea (ASPRES et al., 2003). Outro método aceito para avaliação de rugas e outras estruturas humanas é a planimetria por contagem de pontos. Esse é um método acurado e rápido, no qual utiliza-se sistemas, como grades, com pontos em intervalos regulares. Cada ponto corresponde a um polígono, cuja área deve ser conhecida (MANDARIM-DE-LACERDA, 1994). Atualmente, observam-se vários tipos de tratamentos com a finalidade de retardar o envelhecimento, amenizando as rugas. Tais tratamentos podem ser divididos em tratamentos físicos e químicos. Dentre os físicos, a estimulação microgalvânica tem sido muito utilizada, uma vez que permite a compilação dos efeitos intrínsecos da corrente galvânica e da inflamação aguda para a recuperação tecidual (GUIRRO & GUIRRO, 2002). Tais métodos, todavia, apresentam uma série de inconvenientes, principalmente relacionados ao fato de serem invasivos, o que faz com que haja menor adesão ao tratamento. Logo, pode-se recorrer aos tratamentos químicos, os quais geralmente são não invasivos e, conseqüentemente, de grande aceitação pela população. Dentre os tratamentos químicos destacam-se o peeling químico, o peeling físico, a aplicação de toxina botulínica e utilização de produtos cosméticos. O peeling químico, também chamado de quimioesfoliação, baseia-se na aplicação de agentes cáusticos à pele, produzindo destruição controlada da epiderme e sua reepitelialização. Propicia melhoramento da aparência da pele danificada por fatores extrínsecos, intrínsecos e também por cicatrizes remanescentes. Pode ser dividido em peeligns superficiais, médios e profundos e geralmente são empregadas como substâncias ativas os alfa-hidroxiácidos (AHAs), beta-hidroxiácidos (ácido salicílico), ácido tricloroacético (TCA), resorcinol, ácido azelaico, solução de Jessner, dióxido de carbono (CO2) sólido e tretinoína (VELASCO, 2004). O peeling físico consiste na aplicação de produtos que contêm substâncias abrasivas, como microesferas de polietileno ou sílica, para remover células mortas e aumentar a permeabilidade cutânea para absorção de outros princípios ativos (AYHAN et al., 1998). A toxina botulínica tipo A (Botox) trata-se de um complexo de proteínas produzido pela bactéria Clostridium botulinum. Pequenas doses da toxina botulínica purificada injetável podem bloquear a liberação pelas células nervosas de acetilcolina, a qual sinaliza a contração muscular normalmente. Ao interferir seletivamente com a capacidade de contração dos músculos, as linhas de expressão são suavizadas (DASTOOR et al., 2007). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 18 Além disso, cosméticos contendo substâncias ativas que visam tornar a pele mais saudável, regulando a produção de queratinócitos e o sistema de pigmentação, corrigir o processo de deterioração das fibras elásticas e colágenas e combater os radicais livres, como é o caso do palmitato de retinol, têm sido muito empregados (KEDE & SABATOVICH, 2004). 2.3. Palmitato de retinol (Vitamina A palmitato) As primeiras observações relativas à vitamina A (VA) aparecem no período que se estende do fim do século XIX à Primeira Guerra Mundial (MAIA CAMPOS, 1990). A VA foi a primeira vitamina lipossolúvel a ser reconhecida, fato ocorrido em 1913, e desde então numerosos estudos vêm sendo conduzidos a fim de elucidar suas funções. Inicialmente, seu papel era apenas reconhecido na fisiologia do sistema visual. Atualmente, ela também é usada topicamente para o controle e prevenção de rugas, celulite, estrias e acne (SHAPIRO & SALIOU, 2001; GOMES et al., 2005). As fontes alimentares mais comuns de VA são os órgãos de animais (coração, rins, fígado), os ovos, os lacticínios e os peixes. Sua atividade também deriva de alguns carotenóides vegetais que ocorrem nas cenouras e nas verduras. Só os carotenóides que possuem pelo menos um anel não hidrosilado de β-ionona (α-, β- e γ-caroteno e criptoxantina) podem ser convertidos em VA e, portanto, podem ser chamados de pró-vitamina A (MAIA CAMPOS, 1990; ROBBERS et al., 1997). A VA atua sobre a visão, sobre o crescimento e diferenciação tecidual. Sua deficiência pode acarretar várias doenças, entre as quais cegueira noturna, xeroftalmia, hiperqueratose cutânea, retardo do crescimento e pouca resistência à infecção. A função da VA na diferenciação tecidual pode ter relação com a síntese de glicoproteínas específicas (receptores ou reguladores celulares). Estudos indicam que a sua deficiência provoca um declínio no nível plasmático de uma macroglobulina que inibe as colagenases e outras proteinases da córnea. A conseqüência disso pode ser o desenvolvimento de lesões da córnea (ROBBERS et al., 1997; FU et al., 2002). Pode-se dizer que a VA é a designação dada a todos os derivados da β-ionona (exceto os carotenóides) que possuem atividade biológica do trans-retinol. Logo, o termo geral para a VA (retinol) e seus derivados é retinóide (ROBBERS et al., 1997). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 19 A função principal dos retinóides na pele relaciona-se à hiperproliferação da epiderme com aumento de estrato espinhoso e granuloso. Os efeitos estimulantes da VA e de seus derivados, na pele, tendem a combater as mudanças que ocorrem com o envelhecimento. A pele envelhecida mostra epiderme mais fina, camada de queratina também fina, malformada e reduzida a uma única camada de células contendo grânulos de queratina. Todos esses sinais de atividade reduzida tendem a ser combatidos pela aplicação tópica de doses adequadas de VA ou seus derivados, que contribuem para deixar a pele mais lisa e macia e, conseqüentemente, com aparência mais jovem e saudável (COUNTS et al., 1988; LEONARDI, 2004). O retinol é a principal forma natural dessa vitamina, mas entre suas formas conhecidas estão os ésteres de acetato e palmitato de álcool e produtos de oxidação como o retinol, o ácido retinóico e o 3-deidrorretinol. As formas de ésteres têm boas características de estabilidade e os ésteres de acetato e palmitato do trans-retinol sinteticamente preparados são as principais formas comerciais de vitamina A (ROBBERS et al., 1997). A isotretinoína ou ácido 13-cis-retinóico pode ser empregado por via oral em situações especiais. Seu uso é aprovado para acne cística recalcitrante. O uso desse produto deve ser acompanhado de perto, pois são comuns as reações indesejáveis, que podem exigir a interrupção do uso (ROBBERS et al., 1997). A tretinoína ou ácido trans-retinóico, por sua vez, é encontrada em várias fórmulas (creme, gel e solução) para uso tópico. Ela parece aumentar a mitose e a rotatividade das células da epiderme, sendo usada para tratar a acne vulgaris (ROBBERS et al., 1997). Assim, o ácido retinóico estimula os queratinócitos e a proliferação de fibroblastos, resultando em aumento na produção de colágeno, sendo responsável pela firmeza, maior espessura e resistência de traumas na derme, o que explica a atenuação das linhas de expressão e das rugas. A melhora da proliferação e maturação de queratinócitos resulta em uma textura mais lisa da superfície cutânea (SHAPIRO & SALIOU, 2001). A vitamina A palmitato, ou palmitato de retinol (PR), por combater mudanças que ocorrem durante o envelhecimento e devido à sua maior estabilidade em relação à forma álcool, tem sido uma substância bastante empregada em produtos cosméticos (LEONARDI, 2004; MAIA CAMPOS, 1990). Sua fórmula molecular é C36H60O2 e sua massa molar é 524,9 g/mol. O Parecer Técnico no 3, de 22 de março de 2002, da Câmara Técnica de Cosméticos, que dispõe sobre a utilização de retinóides em produtos cosméticos, orienta que o PR seja Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 20 incorporado às preparações cosméticas na concentração máxima de 10.000 unidades internacionais – UI/g do produto acabado (BRASIL, 2002). A Figura 12 apresenta a estrutura química do PR. Figura 12. Estrutura química do palmitato de retinol (MAKENI CHEMICALS, 2004). 2.4. Sistemas nanoestruturados Em soluções diluídas abaixo da concentração micelar crítica, as moléculas de tensoativo se auto-organizam formando soluções de agregados sejam em água ou em óleo. Aumentando a concentração de tensoativo, muitos sistemas isotrópicos e anisotrópicos poderão ser formados. O comportamento de fase torna-se mais estruturado quando estão presentes água, óleo e tensoativo, formando os mais variados tipos de sistemas, como emulsões, microemulsões e mesofases líquido-cristalinas (cristais líquidos) de diferentes geometrias (URBAN, 2004). De acordo com GUTERRES e colaboradores (2007), os sistemas nanoestruturados, como nanoesferas, nanocápsulas, nanoemulsões, nanopartículas lipídicas sólidas, microemulsões, lipossomas e niossomas, têm sido desenvolvidos como uma alternativa aos promotores químicos clássicos de permeação cutânea, modulando e modificando a permeação de substâncias ativas. Dentre os sistemas nanoestruturados, destacam-se as microemulsões. As microemulsões e emulsões são sistemas cujas interfaces são isentas de qualquer tipo de ordem orientacional, enquanto que os cristais líquidos caracterizam-se essencialmente pela presença dessa ordem orientacional (URBAN, 2004). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 21 O termo microemulsão foi introduzido na literatura na década de 1940, mais precisamente em 1943, por Hoar e Schulman para definir um sistema fluido e translúcido obtido pela titulação até o ponto de clarificação de uma emulsão simples (óleo e água eram misturados com quantidades grandes de tensoativo iônico), com um álcool de cadeia média como o hexanol ou o pentanol. No ponto de clarificação não foi necessária agitação e uma dispersão transparente foi formada espontaneamente (OLIVEIRA et al., 2004). Segundo CUNHA JUNIOR e colaboradores (2003), Hoar e Schulman observaram, através de microscopia eletrônica, que as dispersões transparentes formadas eram constituídas de microgotículas de óleo em água (O/A) ou água em óleo (A/O) cercadas por um filme interfacial misto de tensoativo e co-tensoativo. O tamanho das gotículas variava de 100 a 600 nm, significativamente menor que o das emulsões simples iniciais, justificando seu aspecto transparente e o termo microemulsão. Este termo foi revisado muitas vezes e a definição de Danielsson e Lindman em 1981 tem sido a mais aceita, a qual descreve que “as microemulsões são soluções líquidas, opticamente isotrópicas e termodinamicamente estáveis, compostas de água, óleo e tensoativo” (CUNHA JUNIOR et al., 2003). As microemulsões podem vir associadas ou não a um co-tensoativo (OLIVEIRA et al., 2002; CUNHA JUNIOR et al., 2003; SINTOV & SHAPIRO, 2004). Segundo WARR (1995), microemulsões são líquidos que se compõem de água, óleo imiscível e um tensoativo localizado na interface entre os dois líquidos como uma monocamada. Enquanto as emulsões são estabilizadas por agentes emulsivos comuns (tensoativos), as microemulsões podem conter co-tensoativos, cuja função é diminuir a tensão interfacial para valores abaixo dos limites proporcionados pelo tensoativo comum. No entanto, nos casos em que os tensoativos são capazes de cumprir integralmente essa função, a presença dos co- tensoativos não é necessária (OLIVEIRA et al., 2004). Os co-tensoativos também promovem fluidificação do filme interfacial formado pelo tensoativo, o que impede a elevação significativa da viscosidade do sistema obtido. Os principais co-tensoativos utilizados no preparo das microemulsões são álcoois e glicóis de baixa massa molecular e que apresentam uma cadeia carbônica entre dois e dez carbonos (OLIVEIRA et al., 2002; CUNHA JUNIOR et al., 2003; SINTOV & SHAPIRO, 2004). VALENTA & SCHULTZ (2004), por sua vez, afirmam que alguns sistemas isotrópicos podem ser formados por tensoativos sem a necessidade da adição de um co- Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 22 tensoativo, sendo comprovada a estabilidade das microemulsões sem a presença deste componente. Este fato é muito interessante para aplicações tópicas, pois muitos dos co- tensoativos possivelmente podem levar a efeitos irritativos na pele. Logo, quanto menos tensoativo, menor a possibilidade de irritação mediante uso tópico. Microemulsões são consideradas sistemas reservatórios, onde o fármaco encontra-se separado do meio de dissolução através de um revestimento, uma membrana ou simplesmente uma interface, a qual deve ser transposta para liberação do fármaco para o meio. Elas proporcionam um ambiente dimensionalmente restrito, com propriedades particulares, capazes de ligar ou associar moléculas de diferentes grupos de fármacos, com o objetivo de solubilizar, modular estabilidade ou melhorar o perfil de biodisponibilidade (OLIVEIRA & SCARPA, 2001). No conceito de interface, pode-se imaginar uma superfície, a partir da qual duas regiões podem ser descritas: uma região externa representada pelo meio dispersante e que, geralmente, é de natureza aquosa e outra representada pela própria interface, com características particulares e propriedades físico-químicas bastante diferentes das do meio dispersante. Microemulsões representam bons exemplos de interface em cuja superfície uma série de fenômenos pode ocorrer, sendo considerado um sistema transportador capaz de direcionar a substância ativa para sítios específicos onde devem exercer seu efeito farmacológico, além de poder modular a velocidade de liberação, em função do tempo, sem alterar a estrutura química da molécula transportadora (OLIVEIRA & SCARPA, 2001). De acordo com SINTOV & SHAPIRO (2004), o aspecto óptico desses sistemas resulta do fato de que as gotículas da fase dispersa são menores do que ¼ do comprimento de onda da luz incidente, ou seja, aproximadamente 150 nm. Logo, as partículas não espalharão luz, resultando num sistema opticamente transparente. O diâmetro das gotículas de microemulsões estáveis normalmente é entre 10-100 nm (100Å-1000Å), enquanto que o diâmetro de uma emulsão comum é da ordem de 5000Å. A orientação para que o sistema seja O/A ou A/O é dependente das propriedades físico-químicas do tensoativo, traduzidas principalmente pelo seu equilíbrio hidrófilo-lipófilo – EHL (OLIVEIRA et al., 2004). A Figura 13 representa esquematicamente a organização das microemulsões. Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 23 Figura 13. Estrutura das gotículas de microemulsão A/O e O/A (OLIVEIRA et al., 2004). A escala de EHL foi introduzida pela primeira vez em 1948 por Griffin, permitindo classificar, numericamente, um composto segundo suas características de hidrofilia e lipofilia (BARATA, 1995; PRISTA et al., 2002). Segundo CUNHA JUNIOR (2003), os valores da escala variam de zero a vinte, em função do tamanho da cadeia polar presente nas moléculas do tensoativo. Para PRISTA e colaboradores (2002), os valores de EHL variam de 1 a 50, aumentando estes à medida que a substância se torna mais hidrófila. A partir da escala Griffin as substâncias são classificadas como agentes antiespuma (EHL entre 1 a 3); agentes tensoativos A/O (EHL entre 3 a 9); agentes tensoativos O/A (EHL entre 8 a 16) e agentes solubilizantes (EHL entre 16 a 18) (PRISTA et al., 2002). Os valores inferiores a 10 indicam predominância da parte apolar, o que significa que essas substâncias são adequadas para o preparo de emulsões A/O enquanto àquelas que possuem valores superiores a 10 apontam a prevalência da região polar e, conseqüentemente, o seu emprego na obtenção de emulsões O/A (CUNHA JUNIOR et al., 2003). O tratamento tópico de muitas doenças é freqüentemente limitado pela baixa permeabilidade cutânea das substâncias ativas. Muitos trabalhos têm indicado que os sistemas nanoestruturados, dependendo dos componentes utilizados na sua constituição, podem alterar a liberação cutânea e transdérmica de substâncias ativas hidrofílicas e lipofílicas quando comparadas com outras formulações tópicas convencionais, como pomadas, cremes, géis e loções (DREHER et al., 1997; SCHMALFU et al., 1997). O aumento da liberação de princípios ativos pode ser explicado por meio de diferentes mecanismos. A composição e a estrutura desses sistemas possibilitam a incorporação de grandes quantidades de substâncias ativas, além de apresentarem alto potencial de solubilização de substâncias poucos solúveis (BAROLI et al., 2000; PELTOLA et al., 2003). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 24 Outro mecanismo pode estar relacionado à potencialidade desses sistemas em criarem um ambiente favorável para partição da substância ativa para a pele e favorecer sua penetração no estrato córneo (BAROLI et al., 2000; ALVAREZ-FIGUEROA & BLANCO MENDEZ, 2001). Além disso, dependendo dos constituintes dos sistemas e pelo fato de apresentarem baixa ou nula tensão interfacial, a barreira difusional da pele pode ser modificada de maneira a facilitar a penetração no estrato córneo, aumentando a absorção percutânea (PARK & KIM, 1999; BAROLI et al., 2000; LEHMANN et al., 2001; PAOLINO et al., 2002; GUTERRES et al., 2007). Outro ponto a ser destacado é a capacidade dos sistemas microemulsionados melhorarem a solubilidade e estabilidade dos fármacos, além de proporcionarem ação prolongada, vetorização diferenciada para determinados tecidos ou órgãos do organismo e poderem veicular substâncias ativas com diferentes graus de hidrofilia/lipofilia na mesma formulação (OLIVEIRA et al., 2002; CUNHA JUNIOR et al., 2003; SINTOV & SHAPIRO, 2004). A presença de tensoativos aumenta a permeabilidade da membrana celular, o que facilita a absorção do fármaco, possibilitando uma maior biodisponibilidade. Além disso, devido à formação espontânea desses sistemas, fatores como intensidade e duração da agitação, temperatura, tempo de emulsificação, entre outros, podem ser evitados (CUNHA JUNIOR et al., 2003). Estes sistemas espontaneamente formados possuem propriedades físico-químicas específicas como transparência e estabilidade termodinâmica (SINTOV & SHAPIRO, 2004). Esses fatores tornam os sistemas nanoestruturados bastante atrativos do ponto de vista da produção farmacêutica (CUNHA JUNIOR et al., 2003). Contudo, é importante considerar também que, devido às altas concentrações de tensoativos presentes nas microemulsões, estas podem levar à irritação cutânea. Dessa forma, torna-se necessário desenvolver veículos que facilitem o transporte de substâncias ativas através da pele por aumentar a penetração no estrato córneo sem causar maiores danos ao tecido (THEVENIN et al., 1996). 2.4.1. Microemulsão: diagrama de fases Quando se modifica a composição de uma mistura de solventes miscíveis, as mudanças que se produzirão na solução podem acarretar importantes variações nas Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 25 propriedades termodinâmicas dos compostos que a compõe. Por outro lado, as observações dessas propriedades e sua evolução com a composição da solução podem fornecer informações específicas sobre a estrutura do meio (OLIVEIRA & SCARPA, 2001). As microemulsões, com o aspecto de solução homogênea, mas com estrutura micro- heterogênea, constituem um campo de aplicação desse tipo de estudo. Nos sistemas microemulsionados, o objetivo principal é obter uma combinação entre os componentes, de modo a conseguir uma "solubilização" máxima da fase interna ou dispersa. O diagrama de fases descreve em que condição experimental é possível se obter microemulsões e as regiões limites de transição entre emulsões, separações de fases e microemulsões O/A e A/O (OLIVEIRA et al., 2004). O modo mais usual de descrever esses sistemas, que podem apresentar de três a quatro componentes, é através do diagrama de fases pseudoternário, onde fase aquosa, fase oleosa e mistura de tensoativo/co-tensoativo são representadas nos vértices do triângulo. Esse tipo de diagrama também suporta outras misturas, como por exemplo, óleo, co-tensoativo e água/tensoativo (OLIVEIRA et al., 2004). Outra forma de representar o sistema é por meio do diagrama de fases quaternário, onde tensoativo, co-tensoativo e água estão representados nos vértices do triângulo e o óleo na projeção bidimensional do mesmo. Neste caso, o primeiro triângulo corresponde a zero de óleo e, portanto, a um sistema de micelas mistas contendo água e tensoativo/co-tensoativo. Por isso, muitas vezes as microemulsões são tratadas como uma extensão de soluções micelares (OLIVEIRA & SCARPA, 2001). Se a água e o óleo forem misturados com um tensoativo capaz de produzir uma emulsão leitosa, e essa emulsão for titulada com um co-tensoativo apropriado até formar um sistema opticamente transparente, pode-se determinar a relação tensoativo/co-tensoativo ideal para a obtenção da microemulsão (OLIVEIRA et al., 2004). Segundo OLIVEIRA e colaboradores (2004), o diagrama de fases é definido para cada relação tensoativo/co-tensoativo. Para isso, pode-se preparar misturas binárias dos componentes, correspondentes a cada lado do triângulo. Um exemplo é uma mistura de tensoativo (T) com fase oleosa (O) em várias proporções, titulando-se com a fase aquosa (A). Essas titulações são representadas, no diagrama, pelas linhas traçadas direcionadas ao infinito de fase aquosa, isto é, convergentes ao vértice do triângulo que representa 100% de fase aquosa (Figura 14a). O mesmo Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 26 procedimento pode ser utilizado para a mistura de tensoativo (T) com fase aquosa (A) titulada com a fase oleosa (O). Figura 14. Diagrama de fases – (a) titulação com fase aquosa; (b) representação dos pontos de titulação e regiões do diagrama de fases (OLIVEIRA et al., 2004). Normalmente, esses dois procedimentos são suficientes para se definir o diagrama de fases (Figura 14b). Os pontos da titulação referem-se às modificações verificadas no sistema, tais como separação de fases, sistema transparente líquido, sistema transparente gel, sistema opaco, etc. Esses pontos são calculados a partir das novas proporções entre os componentes da microemulsão depois da titulação (OLIVEIRA et al., 2004). A região denominada de microemulsão, na Figura 14b, representa o domínio da existência do sistema opticamente transparente. As regiões 1-5 da Figura 14b descrevem as condições experimentais da existência dos diferentes tipos de sistemas (OLIVEIRA et al., 2004). A região 1 representa um grande predomínio de fase aquosa, podendo-se observar pequena concentração relativa de tensoativo (<20%), representando microemulsão O/A. Numa diluição infinita com fase aquosa o sistema tende à formação de micelas mistas da mistura emulsiva, contendo a fase oleosa dissolvida em seu interior hidrofóbico. A região 2, na qual predomina a fase oleosa, é pobre em fase aquosa e em mistura emulsiva, representando microemulsão A/O. Numa diluição infinita tende a formar micelas reversas, compostas por grande parte de fase externa oleosa, com fase aquosa dissolvida nas micelas inversas. A região 3 é rica em mistura emulsiva, contém pouca fase aquosa e fase oleosa (Figura 14b). A estrutura que melhor representa essa região consiste de uma fase contínua onde a Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 27 mistura de tensoativo/co-tensoativo, óleo e água encontram-se em fase lamelar, em que tensoativo e co-tensoativo organizam-se na interface contínua óleo/água, separando ambas as fases. A região 4 é intermediária entre as duas regiões (1 e 2) que possuem estruturas bem definidas (Figura 14b). A microestrutura do sistema corresponde a fases bicontínuas, as quais podem explicar a passagem gradual de um sistema O/A para A/O. Esse fenômeno pode ser acompanhado facilmente medindo-se a variação da condutividade, utilizando-se como parâmetro a adição de óleo numa microemulsão A/O ou de água numa microemulsão O/A. A região 5 corresponde à região onde o sistema é muito instável e ocorre separação entre as fases aquosa e oleosa (Figura 14b). A mistura dos constituintes da microemulsão nem sempre conduzirá a um sistema disperso homogêneo, podendo existir diferentes estruturas. Dependendo da natureza e do número de fases líquidas presentes, esses sistemas podem ser classificados no diagrama de fases de acordo com Winsor, que caracterizou alguns sistemas como: Região Winsor I – há equilíbrio entre fase oleosa com uma emulsão; Winsor II – constituída de uma fase aquosa em equilíbrio com uma emulsão; Winsor III – trifásica, contendo uma fase aquosa e outra oleosa, separadas por uma fase emulsionada; Winsor IV – região monofásica, representada por uma emulsão homogênea, conforme pode ser observado na Figura 15 (OLIVEIRA et al., 2004). Figura 15. Emulsões obtidas com diferentes concentrações do tensoativo polietilenoglicol perfluroalquilado com a fase oleosa brometo de perflurooctila (BPFO). Representação da classificação de Winsor. (A) Winsor I (fase oleosa em equilíbrio com fase emulsionada). (B) Winsor III (fase emulsionada em equilíbrio com fase aquosa e fase oleosa). (C) Winsor II (fase aquosa em equilíbrio com fase emulsionada). (D) Winsor IV (emulsão homogênea). (E) Microemulsão (OLIVEIRA et al., 2004). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 28 2.5. Cristais Líquidos Os cristais líquidos (CLs) são conhecidos desde 1889, quando Lehmann descreveu um estado intermediário na transformação térmica a partir do estado sólido para o líquido. Em 1922, G. Friedel usou o termo “estado mesomórfico” (mesos – intermediário e morphé – forma) para definir este quarto estado da matéria; com isso, os cristais líquidos passaram a ser denominados como fases mesomórficas ou mesomórficas cristalinas. Apresentam, portanto, propriedades e características de sólidos e líquidos (FERRARI, 1998; FERRARI et al., 2004; MORAIS, 2006). Esta fase intermediária apresenta propriedades características tanto de sólidos quanto de líquidos. Possui ordem estrutural, rigidez e ligações definidas como os sólidos e mobilidade, regiões desordenadas e fluidas como os líquidos, ou seja, esta mesofase tem propriedades mecânicas típicas do estado líquido, como fluidez e tensão superficial, mas certa ordem molecular; dessa forma, constitui uma fase fluida ordenada. A mesofase líquido- cristalina pode ainda, de acordo com o seu arranjo, exibir outras propriedades ópticas típicas do estado cristalino, como anisotropia (direção óptica), birrefringência e dicromismo (FERRARI, 1998; FERRARI et al., 2004; MORAIS, 2006). Um sistema é anisotrópico quando todas as direções de propagação da luz não são equivalentes no seu interior e se a mesma propriedade é observada com intensidade variável em função da direção pela qual é avaliada (FERRARI, 1998). A birrefringência, também conhecida como refração dupla, é encontrada em cristais, CLs ou em qualquer sistema anisotrópico. Ela é ocasionada pela variação da velocidade de uma onda de luz em diferentes direções. Um feixe individual de luz branca penetrando em um material separa-se em dois feixes, os quais são polarizados e vibram a ângulos retos, um em relação ao outro (FERRARI et al., 2004). O dicromismo ocorre quando um componente de luz polarizada é absorvido mais fortemente que o outro. Em parte, ele irradia para o CL quando este é iluminado com luz natural. A coloração que apresenta, ao microscópio polarizado, é resultado da estrutura ordenada das moléculas, que por sua vez é semelhante àquela dos cristais verdadeiros. Quando a luz é branca, uma mistura de todas as cores reluz sobre um cristal líquido, a maioria das cores consegue atravessá-lo e uma pequena faixa de comprimento de onda é refletida e o cristal parece com a cor desses comprimentos de onda (FERRARI et al., 2004). Revisão de literatura ___________________________________________________________________________________________ Marlus Chorilli 29 A fase líquida cristalina é termodinamicamente estável e representa o estado de fusão incompleto. A maioria dos compostos que apresentam este comportamento tem moléculas alongadas e possuem um ou mais grupos polares. Tais moléculas tendem a arranjarem-se paralelamente, mantendo-se próximas por forças de Van der Waals (FERRARI et al., 2004; MORAIS, 2006). Pode-se dividir os CLs em duas principais classes: os termotrópicos e os liotrópicos. Os termotrópicos são formados pela influência da temperatura, são pouco estáveis e são substâncias orgânicas com estrutura molecular simbolizada pelos ésteres colestéricos (FERRARI, 1998; FERRARI et al., 2004; MORAIS, 2006). Os parâmetros relevantes nas transições de fase são basicamente a temperatura, e em menor grau a pressão, de onde vem a denominação termotrópica (BECHTOLD, 2005). As estruturas líquido-cristalinas termotrópicas podem apresentar polimorfismo de fases, ou seja, o sistema pode passar por várias mesofases entre o sólido e o líquido isotrópico pela ação do calor. As transições de fase podem ser enantiotrópicas (quando a transição se dá tanto no ciclo de aquecimento quanto no de resfriamento) ou monotrópicas (quando a transição só é obtida no ciclo de resfriamento) (DUARTE, 2000). Existem três subclasses de cristais líquidos intrínsecos: esmético; nemático (empregado principalmente para demonstrativos de aparelhos como relógios, calculadoras, televisão) e nemáticos quirais ou colestéricos, indicados para produtos cosméticos (SANTOS, 2006). No caso de CLs esméticos, as moléculas estão arranjadas em camadas, isto é, com grau de ordem translacional. Nas camadas, os eixos moleculares se orientam preferencialmente ao longo de uma única direção. São conhecidos mais de dez tipos de mesofases q