MARIANA TEODORO TEIXEIRA Localização dos barorreceptores e análise das respostas cronotrópicas decorrentes de alterações pressóricas induzidas em teleósteos com e sem respiração aérea São José do Rio Preto - SP 2019 MARIANA TEODORO TEIXEIRA Localização dos barorreceptores e análise das respostas cronotrópicas decorrentes de alterações pressóricas induzidas em teleósteos com e sem respiração aérea Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique Florindo Coorientador: Prof. Dr. Tobias Wang São José do Rio Preto 2019 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. 1. Barorrecepção. 2. Barorreflexo. 3. Traíra. 4. Jeju. 5. Truta arco-íris. I. Título. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientador: Luiz Henrique Florindo Coorientador: Tobias Wang Teixeira, Mariana Teodoro Localização dos barorreceptores e análise das respostas cronotrópicas decorrentes de alterações pressóricas induzidas em teleósteos com e sem respiração aérea / Mariana Teodoro Teixeira. -- São José do Rio Preto, 2019 82 f. : il., tabs. T266l MARIANA TEODORO TEIXEIRA Localização dos barorreceptores e análise das respostas cronotrópicas decorrentes de alterações pressóricas induzidas em teleósteos com e sem respiração aérea Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Prof. Dr. Luiz Henrique Florindo UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientador Profª. Drª. Kênia Cardoso Bícego UNESP – Câmpus de Jaboticabal Profª. Drª. Diana Amaral Monteiro UFScar – Câmpus de São Carlos Profª. Drª Monica Jones Costa UFScar – Câmpus de Sorocaba Prof. Dr. Francisco Tadeu Rantin UFScar – Câmpus de São Carlos São José do Rio Preto 08 de março de 2019 Dedico esse trabalho ao meu avô Nico, que sempre se preocupou com o meu futuro e morará para sempre no meu coração. AGRADECIMENTOS Ao meu orientador Prof. Dr. Luiz Henrique Florindo, por todas as oportunidades, confiança, pelos inúmeros ensinamentos, e principalmente pela grande amizade e parceria de todos esses anos. Ao meu coorientador, Tobias Wang, pela oportunidade incrível de pesquisar em seu laboratório em Aarhus me proporcionando umas das melhores experiências de vida tanto profissional quanto pessoal. Agradeço também todo o carinho, ensinamentos e amizade recebidos antes, durante e depois de minha estadia na Dinamarca. Aos integrantes da banca examinadora por terem aceitado o convite, pela análise do trabalho e pelas importantes considerações Aos meus queridos pais, Luiz e Vera, pela dedicação e amor incondicional, pelo conforto, carinho, paciência e compreensão não apenas ao longo desses anos, mas por toda a minha vida. Ao meu noivo, Marcos, por todo o amor e apoio nos momentos bons e ruins de cada etapa, pela dedicação, pela ajuda, e especialmente por ser esse companheiro incrível com quem eu quero compartilhar a minha vida inteira. Aos meus familiares e amigos, pelo amor e carinho e por estarem sempre presentes de alguma forma durante toda essa jornada. Ao Professor Dr. Mark Bayley pelas valiosas discussões e contribuições durante minha estadia na Dinamarca, além é claro pelo convívio e amizade. Aos meus amigos de laboratório, minha família LZCV: Ariela, Vinicius, Victor, Leonardo, Isadora, Natália, Igor, Gabrielle e Gabriela pelo convívio, pelo companheirismo e principalmente pelas boas risadas e pelo apoio nas horas difíceis. Aos meus colegas de laboratório na Aarhus University: Catherine, Rasmus, Charlie, Mikkel, John, Heidi e Claus, por todo o suporte, pelos ensinamentos e pelo carinho durante meus 4 meses de doutorado sanduíche, que fizeram com que essa etapa se tornasse ainda mais especial. Além é claro, do Vinicius, meu companheiro de todos os dias, de muitas aventuras e momentos inesquecíveis. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida e à Fundação de Apoio à Pesquisa e Extensão de São José do Rio Preto (FAPERP) pelo auxílio financeiro da presente pesquisa (Processo FAPERP 001/2016). À Profa. Dra. Diana Amaral Monteiro e ao Prof. Dr. Francisco Tadeu Rantin pela doação dos espécimes de Hoplias malabaricus A todos que, apesar de não citados nominalmente, de alguma forma contribuíram para o meu crescimento profissional e pessoal ao longo de todos esses anos. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 “Eu faço parte dos que pensam que a Ciência é belíssima. ” Marie Curie RESUMO O barorreflexo é um dos mecanismos mais importantes de regulação da pressão arterial que permite valores de pressão de perfusão estáveis e homeostasia cardiovascular nos vertebrados. Existem amplas evidências de que a frequência cardíaca em peixes teleósteos responde reciprocamente à alterações de pressão sanguínea e, enquanto os barorreceptores foram localizados nas brânquias desses animais, permanece incerto se receptores em outros locais estão envolvidos. Além disso, não há praticamente nenhuma informação sobre a regulação da pressão arterial em peixes que respiram ar. O presente estudo, portanto, teve como objetivo investigar a localização de barorreceptores em dois peixes estreitamente relacionados pertencentes à família Erythrinidae, onde Hoplias malabaricus é uma espécie exclusivamente aquática, enquanto Hoplerythrinus unitaeniatus é um respirador aéreo facultativo. Como grupo externo foi escolhido Oncorhynchus mykiss, devido ao seu habitat ser distinto dos demais, o que o torna um animal com um histórico de vida diferente, submetido a pressões evolutivas também distintas. Além disso, as respostas cardiorrespiratórias da truta arco-íris também são bem definidas e descritas. Para caracterizar a ocorrência do reflexo barostático, analisou-se a frequência cardíaca derivada do eletrocardiograma antes e depois das infusões intraperitoneais do agonista alfa-adrenérgico fenilefrina (100 μg kg-1) para causar vasoconstrição e do doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (250 μg kg-1) para causar vasodilatação (grupo IN). Para localizar os barorreceptores responsáveis por essas respostas, as manipulações farmacológicas da pressão arterial foram repetidas após a desnervação (grupo G4) de todos os nervos branquiais. Os resultados revelam que os reflexos barostáticos estavam ausentes no grupo G4 em H. malabaricus, H. unitaeniatus e O. mykiss, o que demonstra que os barorreceptores estão localizados exclusivamente nos arcos branquiais nas três espécies estudadas. Palavras-chave: Barorrecepção. Frequência cardíaca. Barorreflexo. Traíra. Jeju. Truta arco- íris. ABSTRACT The barostatic reflex is one of the most important blood pressure regulating mechanisms that enables stable perfusion pressures and cardiovascular homeostasis in vertebrates. There is ample evidence that heart rate in teleost fish responds reciprocally to blood pressure, and while baroreceptors have been located in the gills, it remains uncertain whether receptors at other locations are involved. Furthermore, there is virtually no information on blood pressure regulation in air-breathing fishes. The present study, therefore, was designed to investigate the localization of baroreceptors in two closely related fish belonging to the Erythrinidae family, where Hoplias malabaricus is an exclusively water breathing species, while Hoplerythrinus unitaeniatus is a facultative air-breather that uses the swimbladder for gas exchange. We chose Oncorhynchus mykiss as an outgroup due to the distribution / habitat distinct from the other, thus presents a very different life history and consequently suffered different evolutionary pressures, besides its cardiorespiratory responses are well-known. To characterize the cardiac limb of the barostatic reflex, heart rate was derived from the eletrocardiogram before and after intraperitoneal infusions of the alpha-adrenergic agonist phenylephrine (100 µg kg-1) to cause vasoconstriction and the vasodilating nitric oxide donor sodium nitroprusside (250 µg kg-1). Both drugs were infused through a cannula inserted into the peritoneal cavity through a small cutaneous incision under anaesthesiaon the previous day. To locate the baroreceptors responsible for these responses, the pharmacological manipulations of blood pressure were repeated after denervation (G4 group) of all branchial nerves. The results reveal that barostatic reflexes were absent in the G4 group in H. malabaricus, H. unitaeniatus and O. mykiss which demonstrates that baroreceptors are exclusively located in the gill arches in these three species. Key words: Barorreception. Heart rate. Barorreflex. Trahira. Jeju. Raibow trout. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Esquema mostrando os mecanismos de retroalimentação do barorreflexo em situações de pressão arterial reduzida (A) e aumentada (B). DC: débito cardíaco; RVS: resistência vascular sistêmica; SNC: sistema nervoso central Fonte: adaptada de Klabunde (2011) e Armelin (2015). .............................................................................................................. 23 Figura 2 – Eventos sequenciais por meio dos quais a ingestão de sal aumenta a pressão arterial. Fonte: GUYTON e HALL (2011) ............................................................................. 25 Figura 3. Componentes de um nervo craniano em um peixe. O ramo faríngeo, para o revestimento da faringe, e o pequeno ramo prétremático, para a frente da fenda faríngea, transportam fibras sensitivas viscerais. O ramo dorsal da pele é composto de fibras sensitivas somáticas. O ramo pós-tremático que percorre a parte posterior da fenda faríngea inclui fibras sensitivas e motoras. A parte rostral está à direita da figura. .................................................. 27 Figura 4. Derivação filogenética dos nervos cranianos. A. Condição ancestral hipotética. Cada fenda faríngea era inervada por um nervo. O primeiro nervo ou nervo terminal (T) inervava um arco anterior que foi perdido precocemente na evolução dos vertebrados. B. Inervação para arcos branquiais associados. Os nervos cranianos V, VII, IX e XXI inervam os seguintes: mandibular (1), hioide (2), terceiro (3) e quarto ao sétimo (4 a 7) arcos, respectivamente. Essas associações entre os nervos cranianos e seus derivados permanecem estáveis em todos os teleósteos e tetrápodes. Fendas branquiais perdidas nos gnatostomados (0, 0’), fendas branquiais habitualmente presentes nos gnatostomados (1 a 5), fenda espiracular (S). Fonte: KARDONG, 2015. ............................................................................ 28 Figura 5 – Fotografia de um exemplar de O. mykiss. Fonte: KOTTELAT e FREYHOF (2007) ...................................................................................................................................... 33 Figura 6 – Fotografia de um exemplar de H. malabaricus. Fonte: AMAZON WATERS (2018) ...................................................................................................................................... 33 Figura 7 – Fotografia de um exemplar de H. unitaeniatus. Fonte: LEAL et al., (2010) .................................................................................................................................................. 35 Figura 8 Fotografia de um exemplar de H. malabaricus logo após o término da inserção dos eletrodos de ECG e cânula intraperitoneal. O eletrodo de eletrocardiograma principal (+) está conectado ao cabo vermelho, enquanto o eletrodo de referência (-) está conectado ao cabo branco. A cânula intraperitoneal está indicada pela seta. Fonte: elaborada pela autora. ...................................................................................................................................................39 Figura 9. Fotografia de um exemplar de H. unitaeniatus logo após o término da inserção dos eletrodos de ECG e cânula intraperitoneal. O eletrodo de eletrocardiograma principal (+) está indicado pela letra A, enquanto o eletrodo de referência (-) está indicado pela letra B. A cânula intraperitoneal está indicada pela seta branca. Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................................................................. 40 Figura 10. Fotografia de um exemplar de O. mykiss logo após o término da inserção dos eletrodos de ECG e cânula intraperitoneal. O eletrodo de eletrocardiograma principal (+) está conectado ao cabo vermelho, enquanto o eletrodo de referência (-) está conectado ao cabo branco. A cânula intraperitoneal está indicada pela seta. Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................................................................. 40 Figura 11. Esquema do encéfalo e nervos cranianos de um teleósteo (A), com os nervos glossofaríngeo (IX) e vago (X) em detalhe, as linhas vermelhas indicam onde foram realizadas as secções (B). Fotografias das autópsias de O. mykiss mostrando que no grupo G4 o nervo glossofaríngeo e todos os ramos branquiais do nervo vago foram seccionados bilateralmente (C) (D). Fonte: adaptado de MILSOM et al., (2002) e ARMELIN (2015). .................................................................................................................................................. 42 Figura 12. Fotografias das cavidades operculares esquerda (E) e direita (D) realizadas post- mortem em um exemplar de H. malabaricus do grupo G4, confirmando a transecção correta dos nervos. Fonte: elaborada pela autora. ............................................................................... 43 Figura 13. Fotografias das cavidades operculares esquerda (E) e direita (D) realizadas post- mortem em um exemplar de H. unitaeniatus do grupo G4, confirmando a transecção correta dos nervos. Fonte: elaborada pela autora. ............................................................................. 43 Figura 14. Fotografias das cavidades operculares esquerda (E) e direita (D) realizadas post- mortem em um exemplar de O. mykiss do grupo G4, confirmando a transecção correta dos nervos. Fonte: elaborada pela autora. ................................................................................... 43 Figura 15. Eletrocardiograma de um exemplar intacto e sob efeito de nenhum fármaco de H. malabaricus (A), H. unitaeniatus (B) e O. mykiss (C). Fonte: elaborada pela autora. ....................................................................................................... ........................................... 45 Figura 16. Representação esquemática demonstrando os grupos experimentais, o número de indivíduos para cada grupo, a ordem do protocolo experimental e os tempos de recuperação. Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................. 47 Figura 17. Gráficos descritivos mostrando a fH de H. malabaricus (A, B), H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F) antes e depois da administração de fenilefrina em animais intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. ...................................................................................................................................... 50 Figura 18. Gráficos descritivos mostrando a fH de H. malabaricus (A, B), H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F) antes e depois da administração de SNP em animais intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. ................................................................................................................................................. 51 Figura 19. fH antes e depois das administrações farmacológicas de animais intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4) em H. malabaricus (A, B) H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F). Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0,05). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................. 53 Figura 20. fH pós-infusão farmacológica em porcentagem relativa à fH-pré infusão farmacológica (fH pós / fH pré X 100) em animais intactos (IN), e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4) de H. malabaricus, (A,B), H. unitaeniatus (C,D) e O. mykiss (E,F) Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0,05); Um asterisco indica diferença significativa em relação a uma linha de base de 100%. Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................................................................. 54 Figura 21. Variabilidade total do intervalo R-R (RMSSD) de H. malabaricus (A, B), H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F) intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4). Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0,05). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................................................................. 56 Figura 22. Tempo decorrido até a resposta cronotrópica barorreflexa máxima de H. malabaricus (A), H. unitaeniatus (B) e O. mykiss (C), em animais intactos (IN) e falso- operados (SH). Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0.05). Não há dados acerca dos indivíduos submetidos à desnervação dos quatro pares de arcos branquiais (G4) e ao teste salina (SA) porque esses não apresentaram reflexo barostático. Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................................................................. 60 Figura 23. Localização da artéria branquial aferente (A) e do sistema arteriovenoso caudal (B) em teleósteos. Fonte: (A) Imagem modificada de Armelin, 2015; Sandblom e Axelsson (2005); (B) Esquema adaptado de Acesso em maio de 2018. .................................................................................................................... 62 Figura 24. Representação esquemática dos arcos branquiais, pseudobrânquias e sua inervação. Visão lateral esquerda do suprimento nervoso para os arcos branquiais e pseudobrânquias dos nervos cranianos (VII, IX e X). PB = Pseudobrânquias em teleósteos; VA = aorta ventral; DA = aorta dorsal. Estruturas branquiais são inervadas por divisões pós- ganglionares (vermelhas) de ramos pré-trematicos (pr) e pós-trematicos (po). Fonte: adaptado de JONZ e NURSE (2008). ..................................................... ................................................ 66 Figura 25. Esquema mostrando a localização dos barorreceptores nos grandes grupos de vertebrados estudados até o presente estudo, em fase adulta. Os círculos vermelhos representam os barorreceptores já mencionados na literatura, círculos amarelos representam os barorreceptores localizados no presente estudo. Fonte: adaptada de BAGSHAW (1985) e ARMELIN (2015). .................................................................................................................. 68 Figura 26. Diagrama ilustrando a distribuição dos barorreceptores nos principais grupos de vertebrados, suas inervações e suas origens embrionárias, com base na literatura científica e o nos dados do presente estudo Círculos vermelhos: derivação do 3º arco faríngeo embrionário; Círculos amarelos: derivação do 4º arco faríngeo embrionário; Círculos verdes: derivação do 5º arco faríngeo embrionário; Círculos azuis: derivação do 6º arco faríngeo embrionário; AF: arco faríngeo embrionário; SRA: superfície de respiração aérea. Fonte: adaptada de MILSOM e BURLESON (2007). ............................................................................................................ 69 Figura 27. Filogenia dos principais grupos de Sarcopterygii. As 3 famílias viventes de Dipnoi estão inclusas na Ordem Ceratodontiformes. Fonte: NELSON et al., 2016 ........................... 71 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Receptores dos neurotransmissores autonômicos e suas principais funções. Fonte: adaptado de RANG et al., 2007 .............................................................................................. 23 Tabela 2. Frequência cardíaca de H. malabaricus, H. unitaeniatus e O. mykiss intactos (IN), falso-operados (SH) e teste salina (SA). Valores expressos em média ± EPM. Nenhuma diferença significativa foi detectada entre os grupos IN, SH e SA nas três espécies estudadas, assim como anteriormente e posteriormente o tratamento com solução salina isotônica (ANOVA de via única complementada pelo teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer; P ≤ 0,05). Fonte: elaborada pela autora. ......................................................................................... 57 Tabela 3. fH pós-administração farmacológica em porcentagem relativa à fH pré- administração farmacológica (fH pós-administração / fH pré-administração × 100) H. malabaricus, H. unitaeniatus e O. mykiss em animais intactos (IN), falso-operados (SH) e teste salina (SA). Valores expressos em média ± EPM. Nenhuma diferença significativa foi detectada entre os grupos IN, SH e SA nas três espécies estudadas, um asterisco indica diferença estatisticamente significativa para com uma linha de base de 100% (p ≤ 0,05). Fonte: elaborada pela autora. .................................................................................................. 58 Tabela 4. Variabilidade total do intervalo RR (RMSSD) de H. malabaricus, H. unitaeniatus e O. mykiss intactos (IN), falso-operados (SH) e teste salina (SA). Valores expressos em média ± EPM. Nenhuma diferença significativa foi detectada entre os grupos IN, SH e SA nas três espécies estudadas, assim como anteriormente e posteriormente o tratamento com solução salina isotônica (ANOVA de via única complementada pelo teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer; P ≤ 0,05). Fonte: elaborada pela autora. ......................................................................... 58 Tabela 5. Regiões barossensíveis em vertebrados, suas origens embrionárias e inervações. * Exceto nos anfíbios urodelos. Fonte: KARDONG, 2015. ................................................... 69 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS bpm Batimento por minuto ECG Eletrocardiograma G4 Grupo de peixes com os quatro pares de arcos branquiais desnervados fH Frequência cardíaca IN Grupo de peixes com os arcos branquiais intactos min Minuto(s) ms Milissegundo(s) N Número de réplicas PE 50 Polietileno calibre 50 ORA Órgão de respiração aérea SA Grupo de peixes intactos e tratados com solução salina SH Grupo de peixes com as inervações branquiais expostas e não desnervadas SNP Nitroprussiato de sódio SNA Sistema nervoso autônomo SNC Sistema nervoso central SUMÁRIO 1 - INTRODUCÃO...................................................................................................................... 19 1.1 Sistema cardiovascular e a pressão sanguínea ................................................................... 19 1.2 Regulação da pressão arterial............................................................................................... 21 1.3 Evolução do barorreflexo em vertebrados ........................................................................... 26 1.4 Acerca dos modelos experimentais ....................................................................................... 31 2 - OBJETIVOS ........................................................................................................................... 37 2.1 Objetivos gerais ...................................................................................................................... 37 2.2 Objetivos específicos .............................................................................................................. 37 3 - MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 38 3.1 Animais ................................................................................................................................... 38 3.2 Procedimentos cirúrgicos ...................................................................................................... 38 3.3 Fármacos ................................................................................................................................ 44 3.4 Protocolo Experimental ......................................................................................................... 45 3.5 Confirmação dos resultados: Teste Salina e Grupo SH .................................................... 46 3.6 Resumo do delineamento experimental ............................................................................... 46 3.7 Análise das respostas barorreflexas ..................................................................................... 47 3.8 Análise estatística ................................................................................................................... 49 4- RESULTADOS ....................................................................................................................... 50 4.1 Grupos IN e G4 ...................................................................................................................... 50 4.2 Grupo SH e Teste Salina ....................................................................................................... 57 5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 61 5.1 – Crítica ao método ................................................................................................................ 61 5.2 – Localização dos barorreceptores e respostas barorreflexas ........................................... 62 5.3 – Evolução do barorreflexo em vertebrados ........................................................................ 68 6. CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 72 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 73 Introdução 19 1 - INTRODUCÃO 1.1 Sistema cardiovascular e a pressão sanguínea O sistema cardiovascular possui a importante função de suprir as necessidades dos tecidos corporais dos animais, sendo responsável pelo transporte rápido de oxigênio, dióxido de carbono, nutrientes, excedentes orgânicos, hormônios, agentes do sistema imune, calor, além de outras substâncias através do corpo. Isto torna este sistema um dos principais responsáveis pelo bom funcionamento de um organismo, pois mantém o ambiente adequado em todos os líquidos teciduais para que as células possam sobreviver e realizar suas funções adequadamente (GUYTON e HALL, 2011; HILL et al., 2012). Nos vertebrados e em alguns invertebrados, o sangue, líquido pelo qual os diversos elementos citados acima são transportados, é conduzido no interior de vasos e sua propulsão é determinada por um gradiente de pressão criado por um órgão contrátil que atua como uma bomba, o coração (HILL et al., 2012). Esses vasos sanguíneos podem possuir características morfofisiológicas diferentes, apresentando, portanto, a seguinte classificação (GUYTON e HALL, 2011):  Artérias: Formam a primeira fase do transporte sanguíneo, recebem sangue bombeado pelo coração em altas pressões e o conduzem para o restante do corpo. A pressão arterial também está envolvida em outros processos fisiológicos muito importantes, como a movimentação de plasma do sangue para os espaços intersticiais, por meio do endotélio capilar, manutenção do fluxo linfático e a filtração glomerular nos rins, entre outros. Neste contexto a aorta é a principal artéria por funcionar como reservatório de pressão.  Arteríolas e Metarteríolas: são os ramos terminais do sistema arterial, cujos diâmetros são continuamente controlados pelos tecidos adjacentes, variando de acordo com as necessidades metabólicas desses tecidos, regulando assim o fluxo sanguíneo disponibilizado para os capilares que os irrigam.  Capilares: são vasos muito finos e altamente permeáveis, sendo sua principal função possibilitar a difusão de líquidos, gases respiratórios, nutrientes, eletrólitos, hormônios e outras substâncias entre o sangue e os tecidos adjacentes. A região dos capilares é a porção do sistema vascular que apresenta resistência mais elevada, sendo, portanto, a região que mais promove redução da pressão sanguínea proveniente do sistema arterial. Essa Introdução 20 resistência também é responsável por fazer com que o fluxo sanguíneo capilar seja lento, o que promove uma difusão maior dos fatores citados anteriormente.  Vênulas: são vasos muito finos que coletam o sangue dos capilares e se agregam progressivamente formando as veias.  Veias: transportam o sangue de volta ao coração, constituem a porção pós circulação capilar e por essa razão, as vênulas e veias apresentam pressão sanguínea baixa, porém geralmente suficiente para promover o retorno venoso. Tanto as vênulas quanto as veias possuem paredes delgadas e com camada reduzida de músculo liso. Para uma perfusão de órgãos e tecidos adequada, a pressão arterial deve ser suficiente para superar a resistência ao fluxo sanguíneo oriunda de toda a vasculatura, assim como exceder a força da atração gravitacional nos vasos em que o fluxo sanguíneo é ascendente (LILLYWHITE, 1996; GUYTON; HALL, 2011). Porém, essa pressão também não pode ser muito elevada, pois pressões excessivamente altas provocam desequilíbrio hidroeletrolítico, edemas, rompimento de vasos sanguíneos e danos graves a órgãos mais sensíveis à hipertensão (como o cérebro e os rins) (GUYTON; HALL, 2011; KLABUNDE, 2011). A relação entre a pressão arterial e a perfusão sanguínea tecidual é extremamente importante. Sabe-se que a magnitude do fluxo sanguíneo para os tecidos não é constante, pois caso fosse, o mesmo teria de ser mantido alto o bastante para suprir as necessidades teciduais ainda que em momentos de atividade metabólica elevada – situação essa que poderia exigir um fluxo de sangue maior do que o coração é capaz de bombear. Dessa forma, o fluxo sanguíneo para cada tecido é precisamente mantido no nível mínimo necessário para o suprimento de suas necessidades, fazendo com que o trabalho do coração seja sempre o menor possível (GUYTON; HALL, 2011). A regulação do fluxo sanguíneo tecidual é realizada por meio de constrições e dilatações das metarteríolas, que podem ser induzidas por substâncias vasoativas secretadas pelos tecidos vizinhos e também por um déficit nutricional local. A primeira situação ocorre quando o aumento metabólico do tecido diminui a disponibilidade de nutrientes no local, o que induz as células a liberarem substâncias vasodilatadoras que se difundem até as metarteríolas e promovem um aumento do fluxo sanguíneo naquela região. A segunda situação, por sua vez, é caracterizada por uma vasodilatação causada apenas pela carência nutricional local, que faz com que a musculatura lisa das metarteríolas perca tonificação até que o maior fluxo sanguíneo nutrifique esses tecidos novamente (GUYTON E HALL, 2011). Introdução 21 Em algumas situações o controle de fluxo sanguíneo tecidual local impõe um trabalho cardíaco muito intenso, como por exemplo durante atividade física e/ou digestão. Durante uma atividade física, a resistência vascular nos músculos esqueléticos diminui em consequência da elevada atividade metabólica desses tecidos, o que aumenta o fluxo sanguíneo para os mesmos e, consequentemente, exige um maior trabalho cardíaco – pois a quantidade de vasos dilatados é muito grande (LAUGHLIN, 1999). Do mesmo modo, durante a digestão, a taxa metabólica do sistema gastrointestinal aumenta por conta das diversas alterações fisiológicas e mecânicas relacionadas ao processo digestório (a chamada ação dinâmica específica ou SDA), resultando em uma dilatação na grande quantidade de vasos sanguíneos que o sistema gastrointestinal apresenta (SECOR, 2009). Ante os fatos apresentados, as vasodilatações e vasoconstrições locais ocasionadas pelo controle do fluxo sanguíneo tecidual podem modificar expressivamente a pressão arterial, de acordo com a amplitude das alterações na resistência vascular. Considerando que as demandas teciduais oscilam de forma ininterrupta, torna-se evidente que a preservação da pressão sanguínea em valores ideais trata-se de uma condição imprescindível para a homeostase de um indivíduo (GUYTON e HALL, 2011). Sendo assim, devido a essa necessidade de valores pressóricos estáveis, importantes mecanismos reguladores da pressão sanguínea foram selecionados durante a história evolutiva dos animais, estando presentes em todos os vertebrados atuais (HILL et al., 2012; BAGSHAW, 1985; ARMELIN et al., 2016; WEST e VAN VLIET,1994; LILLYWHITE e DONALD, 1994; ZENA et al., 2016a; ADAMS, 1962; HAGENSEN et al., 2010). 1.2 Regulação da pressão arterial Como estabelecido no item anterior, os mecanismos reguladores da pressão arterial visam manter a estabilidade pressórica frente às diversas situações que podem alterá-la, assegurando que as funções relacionadas a essa variável não sejam prejudicadas. Tais ajustes pressóricos podem ocorrer a curto, médio e longo prazo (GUYTON e HALL, 2011). A regulação a curto prazo é modulada predominantemente pelo sistema nervoso autônomo (SNA), enquanto as demais estão muito relacionadas com hormônios, mecanismos renais de eliminação ou retenção de água e solutos, e com a base neural da sede e do apetite por sal. Os ajustes de curto prazo são chamados de barorreflexos e acontecem em poucos Introdução 22 segundos/minutos. Já aqueles que possuem outra origem estão mais associados à homeostasia do volume de líquido corporal e podem ser verificados em horas e até mesmo dias (KLABUNDE, 2011). O reflexo barorreceptor é o mecanismo nervoso de controle da pressão arterial mais conhecido (BAGSHAW, 1985). Esse reflexo é desencadeado por receptores de estiramento, os chamados barorreceptores, os quais possuem conexões neurais aferentes para o encéfalo, ao qual enviam constantemente informações sobre o estado da pressão arterial (BAGSHAW, 1985; GUYTON e HALL, 2011). Qualquer aumento ou redução da pressão em relação a seu ponto de funcionamento normal (set-point) promove inputs aferentes para o sistema nervoso central, onde a informação é integrada e gera uma resposta extremamente rápida, caracterizada principalmente por: (1) alteração da frequência cardíaca e da força contrátil do coração, de forma a modular a quantidade de sangue que este órgão envia para a circulação a cada minuto, o chamado débito cardíaco; (2) dilatação ou constrição dos vasos sanguíneos, que por consequência tendem a retornar a pressão arterial ao seu estado normal modificando a resistência vascular (DAMPNEY, 1994; ALTIMIRAS et al., 1998; BIANCHI-DA-SILVA et al., 2000; SANDBLOM e AXELSSON, 2005; SANDBLOM e AXELSSON, 2011; KLABUNDE, 2011; ZENA et al., 2016b). A bradicardia, a taquicardia e as regulações vasomotoras associadas aos barorreflexos são respostas induzidas pelo SNA por meio de duas vias antagônicas, a simpática e a parassimpática, que atuam respectivamente através da liberação de noradrenalina e acetilcolina (BAGSHAW, 1985; RANDALL et al., 2000). O aumento reflexo da pressão arterial está relacionado à ampliação do tônus simpático cardíaco e vascular e à redução do tônus parassimpático cardíaco, que resulta em vasoconstrição sistêmica, elevação da frequência cardíaca e aumento da contratilidade miocárdica. Por outro lado, a redução da pressão arterial é consequência dos efeitos inversos (Figura 1) (PANG, 2001; KLABUNDE 2011). É importante ressaltar que tais respostas são desencadeadas pela interação dos neurotransmissores autonômicos com receptores específicos, por exemplo os α1-adrenérgicos, β1-adrenérgicos e os muscarínicos-colinérgicos – sendo que os dois primeiros apresentam afinidade pela noradrenalina e o último pela acetilcolina (SMITH e GANNON, 1978; RANG et al., 2007). Tais receptores podem estar localizados nos mais diversos tecidos de um organismo. Os receptores α1-adrenérgicos estão localizados na vasculatura sistêmica e quando Introdução 23 estimulados promovem vasoconstrição, já os receptores β1-adrenérgicos e muscarínicos- colinérgicos são encontrados no coração e modulam a frequência cardíaca, aumentando-a ou diminuindo-a, respectivamente, quando estimulados. Os β2-adrenérgicos por sua vez, estão localizados na vasculatura, principalmente do músculo esquelético, e promovem vasodilatação quando ativados (RANG et al., 2007). Na tabela 1 podemos observar a relação dos receptores conhecidos e suas principais funções em Vertebrados. Figura 1. Esquema mostrando os mecanismos de retroalimentação do barorreflexo em situações de pressão arterial reduzida (A) e aumentada (B). DC: débito cardíaco; RVS: resistência vascular sistêmica; SNC: sistema nervoso central. Fonte: adaptada de Klabunde (2011) e Armelin (2015). Tabela 1. Receptores dos neurotransmissores autonômicos e suas principais funções Tipos de Receptores Ao serem estimulados promovem: α1-adrenérgicos Vasoconstrição, Contração Uterina, Constrição Brônquica. α2-adrenérgicos Redução na Liberação de Catecolaminas e de Insulina (Feedback Negativo). β1-adrenérgicos Taquicardia, Aumento do Débito Cardíaco e Liberação de Renina. β2-adrenérgicos Dilatação Brônquica, Vasodilatação no Músculo Esquelético, Lipólise. β3-adrenérgicos Estimulação da Lipólise. Muscarínicos - Colinérgicos Bradicardia e Redução da Força de Contratilidade Miocárdica. Fonte: adaptado de RANG et al., (2007). A atuação do barorreflexo é bastante rápida e eficiente, pois mesmo alterações mínimas na pressão arterial, derivadas de oscilações praticamente insignificantes na demanda por fluxo sanguíneo de algum órgão ou tecido, induzem alterações cronotrópicas que podem acontecer no período compreendido entre um batimento do coração e outro (GUYTON e A B Introdução 24 HALL, 2011). Portanto, como as demandas por fluxo sanguíneo de órgãos e tecidos oscilam de forma constante, o mesmo é observado com a frequência cardíaca por conta do barorreflexo, constituindo diferenças no tempo de duração de cada ciclo cardíaco – a chamada variabilidade de curto prazo (ou de alta frequência) da frequência cardíaca. Existem outros fatores que também podem exercer grande influência sobre essa variabilidade, como por exemplo, a arritmia sinusal respiratória e o quimiorreflexo, porém o barorreflexo constitui um de seus componentes predominantes (ALTIMIRAS, 1999). Por outro lado, os denominados ajustes de médio e longo prazo, como mencionado anteriormente, apresentam potentes mecanismos para a regulação da pressão arterial ao longo de semanas e até meses. Esses tipos de controle da pressão arterial, estão mais relacionados à homeostasia do volume de líquido corporal, determinado pelo balanço entre a ingestão e a eliminação de líquido. Para que haja esse controle a longo prazo, a ingestão e a eliminação de líquido precisam ser rigorosamente balanceadas. Tal função é realizada por múltiplos controles nervosos e hormonais, além de sistemas de controle local nos rins, que regulam a excreção de sal e água (GUYTON e HALL, 2011). Os três principais mecanismos de controle de pressão a médio prazo, ou seja, que agem após vários minutos são: (1) o mecanismo vasoconstritor da renina-angiotensina, (2) o relaxamento por estresse da vasculatura e (3) o deslocamento de líquido capilar, através das paredes capilares para dentro ou fora da circulação, reajustando o volume de sangue, de acordo com a necessidade (GUYTON e HALL, 2011). O mecanismo vasoconstritor da renina-angiotensina tem como principal função permitir que o indivíduo consuma quantidades muito pequenas ou grandes de sal, sem ocasionar grandes variações na pressão arterial ou no volume de líquido extracelular (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Essa função é explicada pela figura 2, que expressa o efeito primário do aumento da ingestão de sal – que é elevar o volume do líquido extracelular – que por sua vez eleva a pressão arterial (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Logo, a pressão arterial elevada aumenta o fluxo sanguíneo pelos rins, isso então diminui a secreção de renina para um nível muito mais baixo, e provoca sequencialmente a redução de retenção de água e sal, o que tende a normalizar o volume do líquido extracelular e, consequentemente, a pressão arterial. (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Introdução 25 Sendo assim, o sistema renina-angiotensina é um mecanismo de feedback automático que coopera para a manutenção da pressão arterial em níveis normais mesmo quando a ingestão de sal aumenta ou diminui em demasia (GUYTON e HALL, 2011). Figura 2. Eventos sequenciais por meio dos quais a ingestão de sal aumenta a pressão arterial Fonte: GUYTON e HALL (2011). O mecanismo do relaxamento por estresse, por sua vez, pode ser claramente entendido pelo seguinte exemplo: quando a pressão nos vasos sanguíneos se eleva muito, esses vasos são ininterruptamente estirados por minutos ou até horas; como resultado, a pressão nesses vasos sanguíneos retorna ao normal (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Esse estiramento contínuo dos vasos, chamado de relaxamento por estresse, pode atuar como “tampão” da pressão que age por períodos intermediários (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Já o mecanismo do deslocamento de líquido capilar ocorre da seguinte forma: quando a pressão capilar diminui a níveis muito baixos, o líquido é reabsorvido pelas membranas capilares dos tecidos para a circulação, aumentando o volume sanguíneo e a pressão na circulação (GUYTON e HALL, 2011). De maneira oposta, quando a pressão capilar sobe excessivamente, o liquido é perdido da circulação para os tecidos, diminuindo assim o volume sanguíneo, bem como a pressão na circulação (GUYTON e HALL, 2011). Introdução 26 Esses 3 mecanismos de médio prazo são ativados principalmente depois de 30 minutos até várias horas. Durante esse período, os mecanismos nervosos (de curto prazo) em geral vão perdendo a eficácia, portanto essas medidas não nervosas de controle da pressão nesses períodos intermediários são de extrema importância (GUYTON e HALL, 2011). Por fim, o mecanismo rim-volume sanguíneo de controle da pressão, que leva algumas horas para começar a apresentar resposta significativa, é considerado o principal mecanismo de regulação de pressão a longo prazo (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Tal mecanismo também envolve a participação da angiotensina, porém de maneira mais indireta. (GUYTON e HALL, 2011). Quando o sistema renina-angiotensina é ativado, a intensidade da secreção de aldosterona em geral se eleva; uma importante função subsequente da aldosterona é ocasionar um aumento acentuado da reabsorção de sódio pelos túbulos renais, elevando sua concentração no liquido extracelular (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Essa elevação, por sua vez, causa retenção de água, aumentando o volume do liquido extracelular e provocando de forma secundária uma elevação maior ainda da pressão arterial a longo prazo (GUYTON, 1991; COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). Desse modo, tanto o efeito direto da angiotensina sobre os rins quanto o efeito indireto por meio da aldosterona são importantes no controle da pressão arterial a longo prazo (GUYTON e HALL, 2011). Portanto, podemos concluir que o controle da pressão arterial começa a agir por meio de medidas emergenciais pelos mecanismos nervosos (de curto prazo), continua com características de sustentação pelos mecanismos de médio prazo da pressão e por fim é estabilizado pelo mecanismo rim-líquidos corporais (de longo prazo) (COWLEY, 1992; GUYTON e HALL, 2011). 1.3 Evolução do barorreflexo em vertebrados É importante destacar que a regulação a curto prazo da pressão arterial parece ser evolutivamente conservada nos vertebrados, atuando em uma grande quantidade de animais dos táxons inclusos nesse subfilo, excetuando-se os ciclostomados (BAGSHAW, 1985; WEST e VAN VLIET, 1994; NILSSON, 2011; TAYLOR et al., 2014). Ademais, a organização dos nervos cranianos também demonstra ser bastante semelhante nos diferentes táxons. Do ponto de vista filogenético, é pressuposto que os nervos cranianos tenham evoluído a partir de nervos dorsais e ventrais de alguns nervos espinais anteriores, que se Introdução 27 incorporaram a caixa craniana. Os nervos dorsais e ventrais se unem no tronco, mas não na cabeça, e geram duas séries: nervos cranianos dorsais (V, VII, IX e X) e nervos cranianos ventrais (III, IV, VI e XII) (KARDONG, 2015). Todos os nervos cranianos que suprem as bolsas branquiais formavam três ramos por bolsa: pré-tremático, pós-tremático e faríngeo (figura 23). Nos amniotas, esses nervos tendem a ser perdidos, ou suas homologias se tornam incertas. Tal como os nervos espinais, os nervos cranianos inervam tecidos somáticos e viscerais e transmitem a informação sensorial e motora geral. Alguns nervos cranianos consistem apenas em fibras sensitivas ou apenas em fibras motoras. Outros nervos são mistos, contendo ambos os tipos (KARDONG, 2015). Figura 3. Componentes de um nervo craniano em um peixe. O ramo faríngeo, para o revestimento da faringe, e o pequeno ramo prétremático, para a frente da fenda faríngea, transportam fibras sensitivas viscerais. O ramo dorsal da pele é composto de fibras sensitivas somáticas. O ramo pós-tremático que percorre a parte posterior da fenda faríngea inclui fibras sensitivas e motoras. A parte rostral está à direita da figura. Fonte: KARDONG, 2015 O glossofaríngeo (IX), por exemplo, é um nervo misto que inerva o terceiro arco branquial. Contém fibras sensoriais das papilas gustativas, da primeira bolsa branquial e do revestimento faríngeo adjacente, enquanto as fibras motoras inervam músculos do terceiro arco branquial. O vago (X), por sua vez, também é um nervo misto e acertadamente recebe esse nome em latim que significa perambulação, visto que segue um trajeto bastante sinuoso, inervando áreas da boca, da faringe e da grande maioria das vísceras. É formado pela união de várias raízes por meio de diversos segmentos da cabeça e, em certas situações, nervos adicionais da linha lateral também se fundem com o nervo vago. (KARDONG, 2015). Introdução 28 Quando associado ao arco branquial, cada nervo craniano exibe fidelidade com aquele arco específico e seus músculos. Em todos os vertebrados podemos observar que o primeiro arco (arco mandibular) é sempre inervado pelo nervo trigêmeo (V) ; o segundo (hióideo), pelo nervo facial (VII); o terceiro, pelo nervo glossofaríngeo (IX); e os arcos remanescentes, pelos nervos vago (X) e acessório espinal (XI) (figura 24) (KARDONG, 2015). Figura 4. Derivação filogenética dos nervos cranianos. A. Condição ancestral hipotética. Cada fenda faríngea era inervada por um nervo. O primeiro nervo ou nervo terminal (T) inervava um arco anterior que foi perdido precocemente na evolução dos vertebrados. B. Inervação para arcos branquiais associados. Os nervos cranianos V, VII, IX e XXI inervam os seguintes: mandibular (1), hioide (2), terceiro (3) e quarto ao sétimo (4 a 7) arcos, respectivamente. Essas associações entre os nervos cranianos e seus derivados permanecem estáveis em todos os teleósteos e tetrápodes. Fendas branquiais perdidas nos gnatostomados (0, 0’), fendas branquiais habitualmente presentes nos gnatostomados (1 a 5), fenda espiracular (S). Fonte: KARDONG, 2015 Em relação ao reflexo barostático, embora o mesmo pareça evolutivamente conservado, a localização dos barorreceptores envolvidos permanece elusiva em muitos grupos de vertebrados ectotérmicos (BAGSHAW, 1985; WEST e VAN VLIET , 1994; NILSSON, 2011; TAYLOR et al., 2014; JONES e MILSOM, 1982). Em peixes, os primeiros indícios da existência de barorreflexo são oriundos de estudos que verificaram ocorrência de bradicardia em resposta a estimulações branquiais em elasmobrânquios e teleósteos. O pioneiro foi o trabalho de McWilliam (1885), que constatou Introdução 29 que estimulações elétricas, mecânicas, químicas e térmicas nas brânquias de Anguilla anguilla causavam bradicardia reflexa de origem autonômica, a qual podia ser eliminada por meio de desnervações branquiais. Algumas décadas depois, Lutz (1930) observou que estimulações elétricas e mecânicas realizadas nas brânquias e no coração também resultavam em bradicardia reflexa em um elasmobrânquio (Scyllium canícula), e que a mesma era estabelecida por um aumento no tônus parassimpático. Posteriormente, Lutz e Wyman (1932a), utilizando metodologias que permitiam modificar a perfusão sanguínea nas brânquias, demonstraram a ocorrência de diminuição na frequência cardíaca relacionada ao aumento súbito da pressão de perfusão branquial em Squalus acanthias. Anos mais tarde, a pesquisa de McWilliam (1885) foi retomada por Mott (1951), que comprovou que não só a estimulação elétrica das inervações branquiais ou do ramo cardíaco do vago causavam uma bradicardia reflexa, como também diminuía a pressão arterial em A. anguilla. Embora esses estudos apresentem poucos indícios que relacionem os fenômenos observados com o barorreflexo propriamente dito, eles demonstram a existência de um controle rápido da frequência cardíaca em elasmobrânquios e teleósteos, que é fundamental para a ocorrência de uma regulação a curto prazo da pressão arterial, além da possível existência de barorreceptores nas brânquias. As evidências iniciais que sugeriram de fato a presença de controle a curto prazo da pressão arterial foram decorrentes de observações secundárias, durante pesquisas que apresentavam outros objetivos centrais. Estes estudos verificaram, em diferentes espécies de peixes, que uma administração de adrenalina produzia um aumento da pressão arterial seguido de uma bradicardia transitória de origem parassimpática (HELGASON e NILSSON, 1973; RANDALL e STEVENS, 1967; STEVENS et al., 1972). Fato que foi ratificado posteriormente por Wood e Shelton (1980). Farrell (1986) também relatou a ocorrência de bradicardia reflexa em Hemitripterus americanus, quando estes eram submetidos a condições que elevavam a pressão arterial. Bagshaw (1985) sugeriu então que o controle reflexo da pressão arterial em teleósteos parece ser baseado essencialmente em ajustes da frequência cardíaca, e que esta regulação passou a envolver atividades vasomotoras apenas nos vertebrados mais derivados. Posteriormente, Conklin et al. (1997), Olson et al. (1997) e Zhang et al. (1998) demonstraram que peixes possuem sim mecanismo para modular a capacitância venosa, apesar de não relacionar esta ocorrência com barorreflexos. Sandblom e Axelsson (2005, 2011), por sua vez, Introdução 30 constataram que ambos os mecanismos podem ser desencadeados por barorreflexos na truta, Oncorhynchus mykiss, e atestaram a importância destes para a homeostase cardiovascular dos peixes. Os resultados de Mott (1951), Ristori (1970), Ristori e Dessaux (1970), Sandblom e Axelsson (2005, 2011), e a revisão de Sundin e Nilsson (2002) trouxeram evidências fundamentais de que as brânquias são a principal região de barossensibilidade em teleósteos, pois revelaram que alterações na pressão sanguínea intrabranquial, geradas por oclusões temporárias nas aortas ventral e dorsal, acarretaram uma bradicardia ou taquicardia reflexa. Por fim, recentemente o estudo de Armelin e colaboradores (2016) demonstrou que no teleósteo Colossoma macropomum, os barorreceptores são de fato exclusivamente intrabranquiais e encontram-se dispersos por todos os arcos branquiais. Além disso, nessa espécie, as aferências barorreceptoras são constituídas pelos nervos glossofaríngeo e vago (cranianos IX e X), similarmente à maioria dos vertebrados. Embora os barorreceptores tenham sido localizados na região das brânquias nos animais dos estudos supracitados, ainda permanece incerto se há o envolvimento de receptores alocados fora desta região (OLSON et al., 1997, SUNDIN e NILSON, 2002; SANDBLOM et al., 2016). Atrelado a isso, as informações acerca das regulações pressóricas em peixes com respiração aérea são quase inexistentes Porém, nenhum desses trabalhos tinha como objetivo localizar os barorreceptores e, portanto, não apresentavam metodologias que permitissem tais conclusões. Apenas recentemente, com o trabalho de Armelin e colaboradores (2016), cujo objetivo do trabalho foi determinar a localização dos barorreceptores em uma espécie de teleósteo (tambaqui), essas suspeitas foram ratificadas. Entretanto, apesar do estudo apresentar uma metodologia adequada para localizar e entender o funcionamento dos barorreceptores, o estudo abrangeu apenas uma espécie de teleósteo, sendo, portanto, necessário mais estudos investigando esse assunto em peixes, ainda mais por se tratar de um grupo tão antigo e tão diverso (NELSON et al., 2016). Já em relação aos anfíbios, existem muitas evidências indicando que os barorreceptores também estão localizados na vasculatura central, mais especificamente nos arcos aórticos, arcos pulmocutâneos e artérias carótidas, em anuros (WEST e VAN DE VLIET, 1994). Nos urodelos, as poucas evidências existentes apontam para as brânquias e para a vasculatura pulmonar como sítios barossensíveis (LUTZ e WYMAN, 1932b; JOHANSEN, 1963). Já gimnofiónios, até o presente momento não existem estudos que apresentem evidências sobre a localização dos barorreceptores. Introdução 31 Por sua vez, em répteis, tanto Chelonia quanto Squamata (Lacertilia e Ophidia) parecem apresentar o truncus arteriosus como sítio barorreceptor principal (FEDELE, 1937; ADAMS 1962; BAGSHAW, 1985; LILLYWHITE e DONALD, 1994; SEYMOUR e ARNDT, 2004). Nos crocodilianos, não foi encontrada nenhuma evidência sobre a localização dos barorreceptores na literatura científica. Em relação às aves e mamíferos, existe um grande volume de trabalhos acerca da localização dos barorreceptores e da resposta barorreflexa. Esses estudos indicam que nesses dois grupos de vertebrados a localização dos barorreceptores é muito similar. Nos dois táxons os barorreceptores se encontram nas artérias carótidas e nos arcos aórticos e na raiz de grandes vasos (GREEN, 1953; AUMONIER, 1972; KIRCHHEIM,1976; ABDEL-MAGIED et al., 1982; JONES, 1973; TAHA et al., 1983; BAGSHAW, 1985). 1.4 Acerca dos modelos experimentais Nesse trabalho foram estudadas 3 espécies de peixes teleósteos, duas delas de clima neotropical e uma espécie de clima temperado. Essa diferença de distribuição/habitat indica que essas espécies tenham evolutivas muito distintas, e consequentemente sofreram pressões evolutivas diferentes. Além disso, as três espécies também apresentam diferenças anatômicas e fisiológicas em relação ao sistema respiratório, o que amplia ainda mais a robustez do estudo. (KOTTELAT e FREYHOF, 2007; GRAHAM, 1997). As duas espécies neotropicais Hoplias malabaricus Bloch, 1794 e Hoplerythrinus unitaeniatus Spix & Agassiz, 1829 pertencem à família Erythrinidae (OYAKAWA, 2003). H. malabaricus apresenta respiração exclusivamente aquática enquanto que H. unitaeniatus possui respiração aérea facultativa, sendo, portanto, um respirador bimodal (GRAHAM, 1997). Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792 por sua vez, pertence à família Salmonidae, também apresenta respiração exclusivamente aquática, e diferentemente das outras duas espécies, possui pseudobrânquias (KOTTELAT e FREYHOF, 2007; LAURENT e ROUZEAU, 1972). O. mykiss, foi utilizada como um grupo externo nesse estudo. Além das razões supracitadas, essa espécie foi escolhida pelo fato de ser um modelo experimental muito utilizado em estudos sobre fisiologia animal, portanto suas respostas cardiorrespiratórias são amplamente descritas (LAURENT e ROZEAU, 1972; PERRY et al., 1999; REID e PERRY. 2003; SANDBLOM et al., 2005; GOLD et al. 2015). Introdução 32 A espécie é popularmente conhecida como truta arco-íris, sendo nativa do América do Norte, desde o norte do México (Rio Santa Domingo) até rios do sul do Alasca e do Canadá (Kuskokwim River, Mackenzie River e rios dos estados de Alberta e British Columbia) (PAGE e BURR, 1991). Porém, a espécie foi introduzida em diversas outras regiões de clima temperado, principalmente na Europa (PAGE a BURR, 1991; KOTTELAT e FREYHOF, 2007). O habitat natural da truta arco-íris é a água doce a uma temperatura de cerca de 12⁰C, sendo tolerante a temperaturas de 0 a 25°C (GALL e CRANDELL, 1992). Porém, a espécie sobrevive em água do mar após atingir um tamanho mínimo, mas essa tolerância parece depender de vários fatores e diferir de indivíduo para indivíduo (GALL e CRANDELL, 1992). Esses peixes apresentam corpo alongado e a coloração varia de acordo com o habitat, sendo de coloração mais escura em água doce, e mais prateada em água salgada, além de poder variar de acordo com o tamanho e fase do ciclo reprodutivo (SPILLMAN, 1961). Além disso, o nome popular “truta arco-íris” se deve à presença de uma faixa larga bastante característica, de tonalidade que oscila de rosa a vermelho, da cabeça à base da cauda (Figura 3) (SPILLMAN, 1961; KOTTELAT e FREYHOF, 2007). Tanto as formas anádromas quanto as de água doce podem migrar longas distâncias para os realizar a desova (KOTTELAT e FREYHOF, 2007). A espécie realiza comportamento de corte e os ovos ficam depositados em ninhos construídos pela fêmea (GALL e CRANDELL, 1992). É uma espécie carnívora que se alimenta de invertebrados, principalmente cefalópodes quando estão em água salgada, e/ou peixes de menor tamanho (KOTTELAT e FREYHOF, 2007). Já a espécie neotropical H. malabaricus, popularmente conhecida como traíra, ocorre principalmente em ambientes lênticos de água doce desde a Argentina até a Costa Rica (PAIVA, 1974; BUCKUP et al., 2007). No Brasil, apresenta ampla distribuição, pois pode ser encontrada nas Bacias do Amazonas, São Francisco, Doce, Paraná, Paraíba e Paranaíba (LEITÃO, 1947; PAIVA, 1974). Introdução 33 Figura 5. Fotografia de um exemplar de O. mykiss. Fonte: KOTTELAT e FREYHOF (2007). A traíra possui um leve prognatismo na boca e o corpo com coloração variando de parda a marrom (Figura 4) (BRITSKI et al., 1988). As nadadeiras dorsais, anais e caudais possuem listras escuras alternadas com claras, as nadadeiras peitorais são manchadas e não apresenta nadadeira adiposa (BRITSKI et al., 1988). Em relação ao comportamento reprodutivo, a espécie realiza fecundação externa com desova parcelada e apresenta cuidado parental (PRADO e FROEHLICH, 2006). Quanto à alimentação, na fase larval se alimenta de plâncton, é insetívora na fase juvenil; e piscívora na fase adulta (AZEVEDO e GOMES, 1943; PAIVA, 1974). A espécie não apresenta hábitos migratórios na fase adulta e é bem adaptada a viver em populações pequenas e isoladas, sendo muito resistente a condições adversas, como por exemplo, suporta longos períodos de jejum além de sobreviver em ambientes de águas rasas e com pouco oxigênio dissolvido (PAIVA, 1974; SANTOS et al., 2009). Figura 6. Fotografia de um exemplar de H. malabaricus Fonte: AMAZON WATERS (2018). Introdução 34 Por sua vez, a espécie H. unitaeniatus, conhecida vulgarmente como jeju, também ocorre em ambientes de água doce por quase toda a América do Sul, com uma distribuição que abrange Peru, Bolívia, Venezuela, Guianas, Brasil e Paraguai (FOWLER, 1950; GODOY, 1987) No Brasil, o jeju pode ser encontradado nas bacias dos rios São Francisco, Amazonas e Paraná-Paraguai (GRAÇA e PAVANELLI, 2007). Possui corpo alongado com uma faixa longitudinal escura sobre a linha lateral (do opérculo até o pedúnculo caudal), e uma mancha escura arredondada no opérculo (Figura 5) (OYAKAWA, 2003; GRAÇA e PAVANELLI, 2007). É uma espécie de hábitos sedentários e se alimenta de invertebrados aquáticos e peixes de menor tamanho (SANTOS, 1981; NOMURA, 1984, GODOY, 1987; HAHN et al., 2004). Em relação ao comportamento reprodutivo, também é uma espécie que realiza fecundação externa e apresenta cuidado parental (SATO et al., 2003). A espécie utiliza a bexiga natatória como órgão de respiração aérea (ORA) (WEIBEZAHN, 1967). Estudos mais detalhados mostraram que essa bexiga natatória é do tipo esponjosa e composta por uma câmara anterior e uma posterior (KRAMER, 1978). A porção posterior é ricamente vascularizada e apresenta uma organização epitelial característica de superfícies de trocas gasosas (KRAMER, 1978; HÖFLING et al., 1980). Em normóxia o jeju extrai cerca de 30% de O2 por meio da bexiga natatória, enquanto que em situações de hipóxia aquática o animal passa a respirar quase que exclusivamente ar atmosférico. (STEVENS e HOLETON; 1978). Sendo assim, torna-se evidente a importância do ORA, pois a espécie normalmente ocorre e corpos d’água rasos e com pouca corrente que com freqüência apresentam períodos de hipóxia aquática (GRAHAM, 1997; PLANQUETTE et al., 1996). Ao subir a superfície para capturar o ar atmosférico, parte do ar engolido imediatamente escapa pelos opérculos, passando pelas brânquias (KRAMER, 1978). Além disso, nos intervalos entre uma respiração aérea e outra, o animal solta o excedente de ar pela boca e opérculos (expiração) (CARTER e BEADLE, 1931; KRAMER, 1978). Desta forma, considerando os estudos que apontam para as brânquias como o principal sítio de barorrecepção dos teleósteos, o processo de respiração aérea, ao promover a passagem de ar pelas brânquias (o qual é menos denso que a água), possivelmente interfere na barorrecepção – podendo inclusive ter alterado a importância das brânquias na barorrecepção ao longo da história evolutiva dos peixes de respiração aérea. Introdução 35 Além disso, estudos de Zaccone e colaboradores (2003) utilizando técnicas imunohistoquímicas observaram a presença de inervação nitrérgica na bexiga natatória de Heteropneustes fossilis. Porém, com essa metodologia não foi possível confirmar se essas inervações eram relacionadas a mecano, quimio ou barorrecepção. Ainda assim, trata-se de um forte indício de presença de barorreceptores em um órgão de respiração aérea. Um último motivo para a escolha do jeju é o fato de pertencer à mesma família da traíra, o que torna as observações e as discussões acerca do funcionamento e localização dos barorreceptores muito mais completa e pertinente. Figura 7. Fotografia de um exemplar de H. unitaeniatus Fonte: LEAL, M.E. et al. (2010). Por fim, a escolha das 3 espécies se sustenta no fato de que o recente aumento da temperatura global pode infligir sérios danos aos corpos d’água em que essas espécies habitam, principalmente as 2 espécies de região subtropical. Esta condição eleva a atividade e a abundância de uma grande variedade de microrganismos, o que pode alterar a disponibilidade de oxigênio e a quantidade de matéria orgânica na água, assim como ampliar a síntese bacteriana de compostos orgânicos tóxicos como o sulfeto de hidrogênio (AFFONSO et al., 2002; ANTTILA et al., 2013; STEAD, 2013). Somado a tudo isso, o calor também promove um aumento no metabolismo dos peixes, o que juntamente a possíveis contaminações ambientais com xenobióticos pode resultar em significantes desbalanceamentos na homeostase destes animais (KENNEDY e WALSH, 1997; REID et al., 1997; SANDBLOM et al., 2016). Sendo assim, o melhor entendimento da fisiologia dessas espécies torna-se muito importante para a fundamentação Introdução 36 de futuros estudos que sejam relacionados à tolerância destes peixes às mudanças ambientais e à sua conservação. Em vista disso, o presente estudo visou investigar se a localização e o funcionamento dos barorreceptores é pariforme em teleósteos, com e sem respiração bimodal, que além de possuírem estratégias respiratórias diferentes, apresentam histórias de vida bastante distintas. Objetivos 37 2 - OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais O presente estudo teve como objetivo investigar se a localização dos barorreceptores é estritamente branquial, extrabranquial ou mista e se essa localização é semelhante nessas 3 espécies de teleósteos. E também analisar as respostas barorreflexas quando estes animais são submetidos a aumento ou redução da pressão arterial. 2.2 Objetivos específicos a) averiguar se os barorreflexos ocorrem em peixes com as aferências branquiais intactas e seccionadas, de forma a evidenciar a localização dos barorreceptores. b) verificar quais os reflexos induzidos pela administração de um vasoconstritor e um vasodilatador em animais “intactos” e desnervados, assim como suas intensidades. c) verificar se existem diferenças na localização dos barorreceptores e nas respostas barorreflexas entre H. malabaricus (respiração aquática), H. unitaeniatus (respiração bimodal), O. mykiss (respiração aquática, grupo externo). Material e métodos 38 3 - MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais A primeira etapa do estudo foi realizada no Brasil, no Laboratório de Zoofisiologia Comparativa dos Vertebrados da UNESP de São José do Rio Preto com autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais da mesma instituição (Protocolo CEUA n⁰ 111/2015). Foram utilizados 18 espécimes de H. malabaricus (massa entre 100 e 310 gramas) e 14 espécimes de H. unitaeniatus (massa entre 50 e 110 gramas) de ambos os sexos, obtidos em pisciculturas. Depois de transportados para a Universidade, os animais foram mantidos em caixas d’água de polietileno de 500 litros abastecidas com água normóxica, sem cloro, constantemente aerada, termostatizada a 25 ± 1°C. Os indivíduos ficaram expostos a um fotoperíodo natural e a alimentação foi realizada 3 vezes por semana com carne bovina e ração comercial para peixes. Um período de aclimatação mínimo de 30 dias foi realizado previamente a qualquer procedimento experimental. A segunda etapa foi realizada na Dinamarca, no Departamento de Zoofisiologia da Aarhus University, na cidade de Aarhus, de acordo com as normas do Danish Ministry of Food, Agriculture and Fisheries. Nessa etapa foram utilizados 18 espécimes de O. mykiss de ambos os sexos, com massa entre 210 e 860 g obtidos em pisciculturas do país. Após serem transferidos para a Universidade, os animais foram mantidos em caixas d’água de fibra de vidro de 5000 litros abastecidas com água normóxica, sem cloro, constantemente aerada, termostatizada a 19 ± 1°C. Os indivíduos ficaram expostos a um fotoperíodo artificial (12 h de claro/ 12 h de escuro) e a alimentação foi realizada com ração comercial para peixes diariamente. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dinamarquesas de experimentação e bem-estar animal. Todos os animais passaram por um período de jejum de dois dias antes dos experimentos, para evitar a eliminação de fezes nas câmaras experimentais, assim como possíveis influências da digestão nos parâmetros fisiológicos que foram coletados. 3.2 Procedimentos cirúrgicos Para a indução da anestesia, os peixes foram colocados em um recipiente abastecido com solução aquosa de benzocaína (0,1 g.L-1) até apresentarem perda de equilíbrio e ausência Material e métodos 39 de movimentos operculares. Em seguida, foram transferidos para uma mesa cirúrgica onde foram ventilados artificialmente com uma solução aquosa aerada menos concentrada de benzocaína (0,05g.L-1) com o intuito de se manter a anestesia. Tais procedimentos anestésicos foram adotados por Sundin et al. (1999) e Lopes et al. (2010). Foram implantados dois eletrodos de eletrocardiograma (ECG) de acordo com o modelo descrito por Rantin et al. (1992). O eletrodo principal (+) foi introduzido na região ventral, próxima à região cardíaca, sem atingir o coração. O segundo eletrodo – eletrodo de referência (-) – foi implantado lateralmente alguns centímetros próximo à nadadeira pélvica. Os eletrodos foram fixados à pele por pontos cirúrgicos. Esses eletrodos e mais um terceiro colocado na água da câmara experimental (eletrodo “terra”) foram utilizados para aferir a frequência cardíaca (fH). Para a administração de fármacos, uma cânula de polietileno (PE 50) preenchida com solução salina (0,9% de NaCl) foi introduzida na cavidade peritoneal, por meio de uma punção por agulha realizada próximo ao segundo eletrodo, de acordo com os procedimentos descritos por McKenzie et al. (2007). Assim como os eletrodos, a cânula foi sutura à pele por um ponto cirúrgico (Figuras 6, 7 e 8) Figura 8. Fotografia de um exemplar de H. malabaricus logo após o término da inserção dos eletrodos de ECG e cânula intraperitoneal. O eletrodo de eletrocardiograma principal (+) está conectado ao cabo vermelho, enquanto o eletrodo de referência (-) está conectado ao cabo branco. A cânula intraperitoneal está indicada pela seta. Fonte: elaborada pela autora. Material e métodos 40 Figura 9. Fotografia de um exemplar de H. unitaeniatus logo após o término da inserção dos eletrodos de ECG e cânula intraperitoneal. O eletrodo de eletrocardiograma principal (+) está indicado pela letra A, enquanto o eletrodo de referência (-) está indicado pela letra B. A cânula intraperitoneal está indicada pela seta branca. Fonte: elaborada pela autora. Figura 10. Fotografia de um exemplar de O. mykiss logo após o término da inserção dos eletrodos de ECG e cânula intraperitoneal. O eletrodo de eletrocardiograma principal (+) está conectado ao cabo vermelho, enquanto o eletrodo de referência (-) está conectado ao cabo branco. A cânula intraperitoneal está indicada pela seta. Fonte: elaborada pela autora. Posteriormente, o opérculo dos animais foi mantido aberto e uma pequena incisão foi realizada no epitélio do teto opercular logo acima do primeiro e segundo arcos branquiais – permitindo acesso ao nervo craniano IX (glossofaríngeo) e aos ramos branquiais do nervo craniano X (vago). Para a desnervação branquial completa (Grupo G4) as inervações de todos Material e métodos 41 os arcos branquiais foram expostas e seccionadas (nervo craniano IX e ramo pré e pós- tremático do nervo craniano X que inerva os quatro arcos branquiais) (Figura 9). No Grupo Intacto (Grupo IN) a cavidade opercular não passou por nenhum procedimento. É importante salientar que o ramo cardíaco e visceral do nervo vago foi mantido intacto em todos os casos. Todas as desnervações foram confirmadas post-mortem por autópsia e fotografadas (Figura 10, 11 e 12). Depois da cirurgia, os animais foram ventilados com água aerada até apresentarem sinais do término da indução anestésica, e transferidos para uma câmara de contenção individual feita de PVC, com dimensões levemente superiores à dos animais, a qual foi colocada em uma câmara experimental maior (aproximadamente 20 litros). A câmara de contenção apresentava inúmeros orifícios que permitiam a passagem de água e da cânula. No momento da transferência dos peixes, a câmara maior foi abastecida com água em condições semelhantes à utilizada na aclimatação, ademais, houve um ciclo constante de água durante a permanência dos animais na mesma, através de um influxo de água nova no sistema e um efluxo do excedente (o que a manteve livre de metabólitos e com pH estável). Assim como nos protocolos de desnervação utilizados por Milsom et al. (2002), Florindo et al. (2004), Florindo et al. (2006), Lopes et al. (2010) todos os procedimentos supracitados foram completados em aproximadamente 40 minutos e um período de recuperação pós-operatório de 24 horas foi dado aos animais antes dos experimentos. Esse período de recuperação foi reduzido para 12 horas para os experimentos com O. mykiss e H. unitaeniatus, devido ao fato de que os indivíduos dessas espécies submetidos a desnervação não sobreviviam mais do que 30 horas, portanto foi necessário reduzir o protocolo experimental. Tal redução não comprometeu os resultados visto que diversos estudos utilizando metodologias semelhantes obtiveram valores de fH próximos ao obtidos nesse estudo (levando em consideração a massa dos animais e temperatura em que o protocolo experimental foi conduzido) (VERA e PRIEDE 1991; REID e PERRY. 2003; MCKENZIE et al., 2007). Material e métodos 42 Figura 11. Esquema do encéfalo e nervos cranianos de um teleósteo (A), com os nervos glossofaríngeo (IX) e vago (X) em detalhe, as linhas vermelhas indicam onde foram realizadas as secções (B). Fotografias das autópsias de O. mykiss mostrando que no grupo G4 o nervo glossofaríngeo e todos os ramos branquiais do nervo vago foram seccionados bilateralmente (C) (D). Fonte: A e B adaptado de MILSOM et al. (2002) e ARMELIN (2015); C e D elaborada pela autora. Rostral Caudal C D D Material e métodos 43 Figura 12. Fotografias das cavidades operculares esquerda (E) e direita (D) realizadas post-mortem em um exemplar de H. malabaricus do grupo G4, confirmando a transecção correta dos nervos. E D Fonte: elaborada pela autora. Figura 13. Fotografias das cavidades operculares esquerda (E) e direita (D) realizadas post-mortem em um exemplar de H. unitaeniatus do grupo G4, confirmando a transecção correta dos nervos. E D Fonte: elaborada pela autora. Figura 14. Fotografias das cavidades operculares esquerda (E) e direita (D) realizadas post-mortem em um exemplar de O. mykiss do grupo G4, confirmando a transecção correta dos nervos. E D Fonte: elaborada pela autora. Material e métodos 44 3.3 Fármacos Todos os fármacos utilizados (SNP, fenilefrina e benzocaína) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Para produzir as soluções anestésicas (0, 05g.L-1 e 0, 1g.L-1), a benzocaína foi pré-dissolvida em 3 ml de álcool 100% e posteriormente diluída em volume conhecido de água. O SNP e a fenilefrina foram dissolvidos em solução salina isotônica (0,9%). As doses de benzocaína utilizada para indução e manutenção da anestesia já foram amplamente utilizadas em outros estudos com peixes (SUNDIN et al., 1999; REID et al.2003; LOPES et al., 2010). Por sua vez, as doses de fenilefrina e SNP foram baseadas em estudos prévios com anuros (ZENA et al., 2016b) e nos trabalhos de Sandblom e colaboradores (2016) e Armelin e colaboradores (2016) que utilizaram teleósteos como modelos experimentais. 3.4 Protocolo Experimental Os eletrodos de ECG foram conectados a um sistema de aquisição de dados (BIOPAC MP36 – BIOPAC Systems Inc.) que realizou um registro contínuo da fH dos animais (taxa de amostragem de 1000 Hz) em um computador. A fH foi acessada por meio da contagem dos complexos QRS, em batimentos por minuto (bpm) (Figura 13). Após a recuperação da cirurgia, a fH dos animais foi coletada por 15 minutos anteriormente a qualquer intervenção farmacológica. Em seguida, agonista α1-adrenérgico cloridrato de fenilefrina (100 µg kg-1) foi administrado por meio da cânula intraperitoneal seguido de um flush de solução salina isotônica (0,4 ml), e a fH foi monitorada por mais 15 minutos. Depois disso, os peixes passaram por outro período de recuperação de 24h (12h para H. unitaeniatus e O. mykiss) para que os efeitos da fenilefrina cessassem. Então, o protocolo foi repetido, porém ao invés de fenilefrina houve a administração do vasodilatador SNP (250 µg kg-1) também seguido de um flush de solução salina isotônica (0,4 ml). As soluções de fenilefrina e SNP foram preparadas momentos antes da administração. As administrações desses compostos tiveram a finalidade de induzir desbalanços na pressão arterial dos animais (aumenta-la e reduzi-la, respectivamente) para que a via cronotrópica do barorreflexo pudesse ser observada. Material e métodos 45 Figura 15. Eletrocardiograma de um exemplar intacto e sob efeito de nenhum fármaco de H. malabaricus (A), H. unitaeniatus (B) e O. mykiss (C) Fonte: elaborada pela autora. Material e métodos 46 3.5 Confirmação dos resultados: Teste Salina e Grupo SH Para confirmar se os resultados obtidos não foram induzidos pelo veículo dos fármacos ou pelo estresse derivado da administração farmacológica, 4 animais do grupo IN foram submetidos ao teste salina (Grupo SA). Esses animais foram previamente submetidos a um protocolo experimental praticamente idêntico ao descrito no item 3.4, porém substituindo- se a infusão de fenilefrina e SNP pelos seus veículos puros (solução salina isotônica). Logo após a infusão da solução salina a fH foi monitorada por 15 minutos e então depois de 1 hora iniciou-se o protocolo experimental exatamente como descrito no item 3.4. Por fim, um outro grupo de peixes passou por um procedimento de falsa operação, ou sham-operated (Grupo SH, n=4), na qual as inervações branquiais foram expostas, mas não transeccionadas, a fim de se observar se a exposição dos nervos ao ambiente externo já era suficiente para alterar os parâmetros coletados e/ou as respostas fisiológicas aos fármacos. 3.6 Resumo do delineamento experimental É importante ressaltar que os protocolos descritos nos itens 3.3 e 3.4 foram realizados nas 3 espécies (H. malabaricus, H. unitaeniatus e O. mykiss). Para facilitar o entendimento da metodologia proposta, os grupos experimentais e a ordem do protocolo experimental estão representados no fluxograma a seguir (Figura 14). Além disso, tanto na etapa realizada no Brasil quanto na realizada na Dinamarca, ao final de cada experimento os animais de todos os grupos foram eutanasiados. E como já mencionado, nos animais do grupo G4 foram realizadas autópsias para a confirmação das desenervações. Material e métodos 47 24 h 24 h 12 h 12 h 24 / 12 h 1 h 24 / 12 h Figura 16. Representação esquemática demonstrando os grupos experimentais, o número de indivíduos para cada grupo, a ordem do protocolo experimental e os tempos de recuperação. Fonte: elaborada pela autora. 3.7 Análise das respostas barorreflexas As respostas barorreflexas induzidas pelas infusões farmacológicas foram analisadas, em todos os grupos experimentais, de diversas maneiras. Primeiramente, a fH dos animais foi derivada do ECG e os dados foram plotados em gráficos descritivos, possibilitando uma observação completa dos resultados durante todo o protocolo experimental. Após, a média dos cinco minutos que antecederam as administrações farmacológicas e o valor de maior modificação na fH contido nos 10 minutos posteriores a tais administrações (menor fH para o experimento com fenilefrina e maior fH para o experimento com SNP) foram plotados em gráficos comparativos e utilizados na realização dos métodos estatísticos inferenciais. Ainda levando em consideração esses dados, o valor da fH pós-administração farmacológica em relação à fH pré-administração foi calculado para cada fármaco e grupo experimental, em porcentagem, por meio da equação abaixo – o que permitiu a análise das respostas barorreflexas sem a interferência das influências que as desnervações possuem na fH. H. malabaricus IN (n=7) G4 (n=7) SH (n=4) Controle e Fenilefrina Controle e SNP Autópsia grupo G4 Teste Salina (n=4 de cada espécie) Instrumentação O. mykiss e H. unitaeniatus IN (n=7 e 5) G4 (n=7 e 5) SH (n=4) Controle e Fenilefrina Autópsia grupo G4 Controle e SNP Instrumentação Controle e SNP Controle e Fenilefrina Instrumentação Solução Salina Material e métodos 48 A fim de observar a eficiência do reflexo barostático, também foi analisado o tempo necessário para que as respostas cronotrópicas induzidas pelos desbalanços pressóricos atingissem o seu máximo, observando-se o tempo compreendido entre as infusões farmacológicas e a maior modificação na fH contida nos 10 minutos após as infusões (menor fH para o experimento com fenilefrina e maior fH para o experimento com SNP). Por fim, considerando a relação existente entre o barorreflexo e a variabilidade da fH, foi calculado a variabilidade total contida nos cinco minutos que antecederam as manipulações farmacológicas e nos 10 minutos que as sucederam, como método para se mensurar o quanto a fH variou (batimento-a-batimento) nesses momentos. Para isso, foram selecionados trechos de eletrocardiograma que estivessem livres de artefatos e ruídos. Estes trechos foram escolhidos dentro do intervalo de ação farmacológica mencionado acima. Dessa forma, foram utilizados trechos contendo 256 batimentos cardíacos para os grupos IN, G4, SH e SA de todas as espécies do estudo, assegurando assim uma quantidade suficiente de ciclos de variações necessárias para a análise espectral (CAMPBELL 2004). A partir desses trechos selecionados, foram gerados tacogramas - gráficos nos quais são plotados os intervalos batimento-a-batimento ao longo do tempo no software BIOPAC Student Lab Pro v3.7 (BIOPAC Systems Incorporated, Goleta, CA, EUA). Então, por meio da raiz quadrada da média do quadrado das diferenças (RMSSD - Root Mean Square of the Successive Differences) entre os intervalos R-R no eletrocardiograma obtidos nos tacogramas foi possível calcular a variabilidade da fH em milissegundos (ms). É importante notar que os dados contidos além dos 10 minutos que prosseguem as infusões farmacológicas não foram utilizados em nenhuma análise, essa padronização foi estabelecida para garantir que mecanismos de controle a longo prazo da pressão arterial não exercessem influência nas variáveis estudadas. Material e métodos 49 3.8 Análise estatística Todas as variáveis estudadas foram submetidas ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov (p ≥ 0,1) e foram definidas como paramétricas, além disso, assumiu-se que tais dados são homocedásticos. Sendo assim, os outros procedimentos estatísticos adotados no presente estudo foram:  A análise de variância one-way, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey- Kramer, que foi utilizada para se comparar as variáveis observadas nos grupos IN, SH e SA (uma análise para cada variável).  A análise de variância one-way, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Student- Newman-Keuls, que foi utilizada para se comparar as variáveis observadas nos grupos IN e G4 (uma análise para cada variável). Além disso, na análise da fH pós-administração farmacológica em porcentagem relativa à fH pré-administração farmacológica (fH pós- administração / fH pré-administração × 100) os dados também foram comparados a uma linha de base de 100% – referente à ausência de modificação na fH derivada da intervenção farmacológica. Um p de 0,05 foi empregado em todas as análises de variância. As análises estatísticas e os gráficos foram plotados com auxílio do software Prism 5.0 (GraphPad Inc.). Todos os dados foram expressos como média ± EPM. Resultados 50 4- RESULTADOS 4.1 Grupos IN e G4 As figuras 17, 18 e 19 apresentam os valores da fH antes e depois das infusões farmacológicas nos grupos IN e G4 nas 3 espécies estudadas. A infusão de fenilefrina promoveu uma bradicardia reflexa, enquanto a de SNP induziu uma taquicardia nos indivíduos dos grupos IN. Por outro lado, nos grupos G4, tanto a infusão de fenilefrina quanto a de SNP não provocaram alterações na fH em nenhuma das espécies. Além disso, é possível notar que nas 3 espécies a fH dos grupos G4 encontram-se mais elevadas em relação à fH do respectivo grupo IN. Figura 17. Gráficos descritivos mostrando a fH de H. malabaricus (A, B), H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F) antes e depois da administração de fenilefrina em animais intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. Resultados 51 Figura 18. Gráficos descritivos mostrando a fH de H. malabaricus (A, B), H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F) antes e depois da administração de SNP em animais intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. Em H. malabaricus, no grupo IN a fH basal foi 39,43 ± 4,10 bpm, a qual reduziu para 19,86 ± 2,77 bpm posteriormente a infusão de fenilefrina. Após 24 horas, a fH basal foi 37,26 ± 4,42 bpm, e aumentou para 66,57 ± 4,03 bpm com a administração de SNP. Já os animais do grupo G4 mostraram uma fH significativamente mais alta que aquela dos demais tratamentos (79,60 ± 4,22 bpm), a qual se manteve constante independentemente da infusão de fenilefrina (78,86 ± 4,66 bpm), do período de 24 horas entre experimentos (74,89 ± 3,69 bpm) e da administração de SNP (72,43 ± 7,33 bpm). Enquanto em H. unitaeniatus, a fH basal do grupo IN foi 35,52 ± 2,31 bpm, e reduziu para 18,60 ± 3,98 bpm após a administração de fenilefrina. Depois de 12 horas a fH basal foi 35,44 ± 2,34 bpm, e subiu para 56,00 ± 4,88 bpm com a infusão de SNP. No grupo G4 a fH foi Resultados 52 ligeiramente mais elevada que aquela dos demais tratamentos (46,52 ± 3,86 bpm), a qual se manteve constante independentemente da infusão de fenilefrina (41,00 ± 5,85 bpm), do período de 12 horas entre experimentos (46,12 ± 5,76 bpm) e da infusão de SNP (52,00 ± 4,85 bpm). Finalmente, em O. mykiss o grupo IN apresentou uma fH de 86,13 ± 2,68 bpm, a qual reduziu para 63,71 ± 1,53 bpm após a infusão de fenilefrina. Depois de 12 horas, a fH foi 79,71 ± 2,81 bpm, e aumentou para 98,57 ± 2,33 bpm com a administração de SNP. Os animais do grupo G4 apresentaram uma fH significativamente mais elevada que a apresentada pelos dos demais tratamentos (115,10 ± 5,56 bpm), que se manteve constante mesmo após a infusão de fenilefrina (114,70 ± 6,25 bpm), do período de 12 horas entre experimentos (111,50 ± 4,04 bpm) e da administração de SNP (108, 00 ± 4,15 bpm). A figura 20 expressa os resultados referentes a análise das mudanças na fH frente às manipulações farmacológicas em porcentagem. Nas 3 espécies estudadas, observou-se que as infusões de fenilefrina e SNP reduziram e aumentaram a fH, respectivamente, nos animais intactos (IN). Porém, essas respostas não foram observadas nos animais dos grupos G4, em que a fH posterior às administrações farmacológicas foi semelhante à linha de base de 100% (referente a fH anterior as administrações). Na traíra, a infusão de fenilefrina reduziu a fH do grupo IN para 50,70 ± 5,44% do valor observado anteriormente à administração do fármaco. Por outro lado, a infusão de SNP aumentou essa variável para 187,19 ± 13,13% do valor observado antes dessa infusão. Já no grupo G4 a fH permaneceu inalterada frente às infusões dos fármacos (99,02 ± 2,40% pós- fenilefrina e 95,46 ± 6,27% pós-SNP). No jeju, a administração de fenilefrina diminuiu a fH do grupo IN para 50,85 ± 8,00 % do valor observado antes da administração da mesma. Enquanto a infusão de SNP elevou essa variável para 157,50 ± 7,54 % em relação ao observado previamente a essa administração. Novamente, a fH dos animais do grupo G4 permaneceu sem modificações significativas perante as administrações dos fármacos (86,42 ± 5,70 % pós fenilefrina e 115,00 ± 6,86 % pós SNP). Por fim, na truta arco-íris a administração de fenilefrina diminuiu a fH dos animais do grupo IN para 74,36 ± 2,72 % do valor observado previamente à infusão do fármaco. Já a infusão de SNP elevou a fH para 124,20 ± 3,58 % do valor observado anteriormente à infusão. Assim como nas demais espécies, a fH dos animais do grupo G4 permaneceu inalterada perante as infusões dos fármacos (99,00 ± 2,18% pós fenilefrina e 96,46 ± 2,26 % pós SNP). Resultados 53 Figura 19. fH antes e depois das administrações farmacológicas de animais intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4) em H. malabaricus (A, B) H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F). Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0,05). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. Resultados 54 Figura 20. fH pós-infusão farmacológica em porcentagem relativa à fH-pré infusão farmacológica (fH pós / fH pré X 100) em animais intactos (IN), e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4) de H. malabaricus, (A,B), H. unitaeniatus (C,D) e O. mykiss (E,F) Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0,05); Um asterisco indica diferença significativa em relação a uma linha de base de 100%. Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora. Resultados 55 Por fim, os dados acerca da variabilidade total do intervalo R-R (RMSSD) estão organizados na figura 21. A magnitude da variabilidade total em animais intactos (IN) diferiu bastante entre as 3 espécies, porém em todas elas pode-se observar uma redução muito acentuada na variabilidade total nos animais desnervados (G4), a qual não se alterou frente a nenhuma manipulação farmacológica. Em H. malabaricus, os indivíduos do grupo IN demonstraram uma variabilidade total basal de 499,2 ± 73,31 ms, e esse valor aumentou para 561,7 ± 46,75 ms após a infusão de fenilefrina. Depois das 24 horas de recuperação entre experimentos, esses animais apresentaram uma variabilidade total basal de 603,7 ± 66,51 ms, que decresceu para 403,1 ± 79,3 ms após a infusão de SNP. Previamente às manipulações farmacológicas, os animais com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4) demonstraram uma variabilidade total basal extremamente baixa (17,39 ± 3,86 ms), a qual não se alterou significativamente sob nenhuma circunstância. Os valores apresentados foram de 21,74 ± 7,01 ms após infusão de fenilefrina, de 24,99 ± 28,2 ms após 24 horas e anteriormente a infusão de SNP e de 39,46 ± 19,57 ms posteriormente a infusão de SNP. Em H. unitaeniatus, a variabilidade total basal do grupo IN foi 390,2 ± 59,39 ms e esse valor aumentou para 1044 ± 110,5 ms posteriormente a administração de fenilefrina. Após 12 horas de recuperação entre experimentos, os animais apresentaram uma variabilidade total basal de 386,0 ± 92,33 ms, que decresceu para 294,0 ± 42,46 ms após a infusão de SNP. Os animais do grupo G4 apresentaram uma variabilidade total basal muito reduzida (35,84 ± 7,944 ms) anteriormente as manipulações farmacológicas, a qual permaneceu praticamente inalterada durante todo o protocolo. Os valores demonstrados foram de 47,46 ± 12,27 ms após infusão de fenilefrina, 41,78 ± 9,27 ms após 12 horas e anteriormente a infusão de SNP e de 31,93 ± 7,929 ms posteriormente a infusão de SNP. Em O. mykiss, no grupo IN os animais apresentaram uma variabilidade total basal de 72,09 ± 11,99 ms, e esse valor aumentou para 107,0 ± 15,34 ms posteriormente a infusão de fenilefrina. Após as 12 horas de recuperação entre experimentos, esses animais demonstraram uma variabilidade total basal de 82,24 ± 11,15 ms, que permaneceu praticamente inalterada após a infusão de SNP (94,74 ± 15,29 ms). Anteriormente às manipulações farmacológicas, os animais do grupo G4 demonstraram uma variabilidade total basal bastante reduzida (17,96 ± 12,02 ms), que se alterou significativamente sob nenhuma circunstância. Os valores observados foram de 21,97 ± 15,92 ms após infusão de fenilefrina, de 14,23 ± 6,46 ms após Resultados 56 12 horas e anteriormente a infusão de SNP e de 15,54 ± 5,68 ms posteriormente a infusão de SNP. Figura 21. Variabilidade total do intervalo R-R (RMSSD) de H. malabaricus (A, B), H. unitaeniatus (C, D) e O. mykiss (E, F) intactos (IN) e com os quatro pares de arcos branquiais desnervados (G4). Valores que não compartilham uma letra superscrita são significativamente diferentes considerando uma mesma espécie (p ≤ 0,05). Dados expressos em média ± EPM (N=7 em H. malabaricus e O. mykiss; N=5 em H. unitaeniatus). Fonte: elaborada pela autora Resultados 57 4.2 Grupo SH e Teste Salina Na tabela 2 encontram-se os dados referentes a fH de animais intactos (IN), sham- operated (SH) e teste salina (SA). É possível observar que nas 3 espécies analisadas os resultados referentes ao grupo SH são muito semelhantes aos do grupo IN, em ambos ocorre uma bradicardia posterior à infusão de fenilefrina e uma taquicardia posterior ao SNP. Também é possível notar que no teste salina (SA) a substituição dos fármacos pelo veículo que os dissolviam (solução salina) não causou mudanças significativas na fH em nenhuma das espécies estudadas. Tabela 2. Frequência cardíaca de H. malabaricus, H. unitaeniatus e O. mykiss intactos (IN), falso-operados (SH) e tratados com solução salina isotônica (SA). Valores expressos em média ± EPM. Nenhuma diferença significativa foi detectada entre os grupos IN, SH e SA nas três espécies estudadas, assim como anteriormente e posteriormente o tratamento com solução salina isotônica (ANOVA de via única complementada pelo teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer; P ≤ 0,05). Grupo Pré-Fenilefrina ou Salina Pós-Fenilefrina ou Salina Pré-SNP Pós-SNP H. malabaricus IN (N = 7) 39,4 ± 4,1 19,8 ± 2,7 37,2 ± 4,4 66,5 ± 4,0 SH (N = 4) 50,3 ± 5,6 30,2 ± 4,6 46,0 ± 3,7 71,5 ± 9,8 SA (N = 4) 43,2 ± 4,8 38,0 ± 1,4 H. unitaeniatus