UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara LÍVIA ALVES CORRÊA MORETTI LIGAS DE TiNbZr COM SUPERFÍCIES BIOATIVAS: CARACTERIZAÇÃO TOPOGRÁFICA E AVALIAÇÃO DO CONTATO ÓSSEO IN VIVO. Araraquara 2017 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara LÍVIA ALVES CORRÊA MORETTI LIGAS DE TiNbZr COM SUPERFÍCIES BIOATIVAS: CARACTERIZAÇÃO TOPOGRÁFICA E AVALIAÇÃO DO CONTATO ÓSSEO IN VIVO. Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Implantodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para título de Doutor em Odontologia. Orientador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior Co-orientador (a): Profa. Dra. Ana Lúcia R. Ribeiro Araraquara 2017 Moretti, Lívia Alves Corrêa Ligas de TiNbZr com superfícies bioativas: caracterização topográfica e avaliação do contato ósseo in vivo. / Lívia Alves Corrêa Moretti.-- Araraquara: [s.n.], 2017 114 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado em Implantodontia) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Roselino Ribeiro 1. Titânio 2. Propriedades de superfície 3. Osseointegração I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ana Cristina Jorge, CRB-8/5036 Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP LÍVIA ALVES CORRÊA MORETTI LIGAS DE TiNbZr COM SUPERFÍCIES BIOATIVAS: CARACTERIZAÇÃO TOPOGRÁFICA E AVALIAÇÃO DO CONTATO ÓSSEO IN VIVO. Comissão Julgadora Tese para obtenção do grau de Doutor Presidente e Orientador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior 2o Examinador: Prof. Dr. Rubens Moreno de Freitas 3o Examinador: Prof. Dr. Walter Martins Junior 4o Examinador: Profa. Dra. Laiza Maria Grassi Fais 5o Examinador: Prof. Dr. Roberto Henrique Barbeiro Araraquara, 17 de março de 2017. DADOS CURRICULARES LÍVIA ALVES CORRÊA MORETTI NASCIMENTO: 01/09/1983 – Ribeirão Preto – SP FILIAÇÃO: Antonio Luiz Moretti Silvia Alves Corrêa Moretti  2004 – 2007 Graduação em Odontologia Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo.  2008 – 2009 Pós Graduação em Periodontia – Nível Especialização Associação Odontológica de Ribeirão Preto – AORP.  2010 – 2012 Pós Graduação em Periodontia – Nível Mestrado Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo.  2013 – 2017 Pós Graduação em Implantodontia – Nível Doutorado Faculdade de Odontologia de Araraquara Universidade Estdual Paulista Júlio de Mesquita - UNESP.  2015 - 2016 Pós Graduação – Doutorado “Sanduíche” Departamento de Prótese Faculty of Odontology, Malmö University, Suécia. Dedicatória especial Aos meus pais, Antonio Luiz e Silvia, pela constante demonstração de carinho, incentivo, amor, compreensão e apoio incondicional durante toda minha vida. Meu eterno amor, gratidão e admiração. À minha irmã Raquel, pelo apoio, amor e carinho, sempre torcendo pelo meu sucesso, mesmo as vezes longe, estando tão perto. E a toda minha família, que sempre esteve ao meu lado, me apoiando e torcendo por mim. Dedico este trabalho à vocês ! Agradecimentos Especiais Ao Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior, pela confiança desde o primeiro momento de trabalho em conjunto, quando me recebeu em Araraquara e por guiar meu trabalho de maneira generosa e paciente. Seus conselhos, profissionais e pessoais, farão sempre parte de minha trajetória. Obrigada por sempre me tratar de maneira carinhosa e por incentivar meus passos. À Profa. Dra. e amiga Ana Lúcia Roselino Ribeiro, pelos ensinamentos, incentivos, comprometimento e orientação durante estes anos em que trabalhamos juntas. Serei sempre grata por todos seus auxílios e dedicação. À Profa. Dra. Ann Wennerberg, por toda a receptividade em minha estadia na Malmö Högskola, por abrir as portas de seu departamento e me permitir sentir acolhida. Agradeço todo o apoio pessoal e profissional que foram fundamentais não só no desenvolvimento deste estudo, mas que serão também de grande valia no decorrer de minha vida. À Profa. Dra. Laiza Maria Grassi Fais, pela ajuda e contribuição com seus ensinamentos, conhecimento e comprometimento. Sua ajuda e sua orientação também são responsáveis pela conclusão deste trabalho. Aos meus colegas e amigos do departamento de Periodontia, pelos incontáveis bons momentos de convivência diária, pela ajuda e colaboração nas horas difíceis e por torná-las mais agradáveis, pelos inesquecíveis momentos de descontração que tivemos durante estes anos e pela amizade que construímos. Em especial, agradeço a um grande amigo que Araraquara me deu... Obrigada Cássio pelo companheirismo e amizade durante todos estes anos. Aos amigos e colegas do doutorado e pós-doutorado, Luana, Mário, Cássio e Fernando , pela ajuda durante os meses de biotério. Obrigada pela dedicação e pelas horas de descontração. Aos Docentes do Programa de Periodontia da FOAr, Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior, Prof. Dr. José Eduardo Cezar Sampaio, Profa. Dra. Rosemary Adriana Chiérici Marcantonio, Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli, Prof. Dr. Carlos Rossa Junior, Profa. Dra. Silvana Regina Perez Orrico, Profa. Dra. Daniela Leal Zandim-Barcelos agradeço pelos ensinamentos transmitidos. Agradeço a disponibilidade, a confiança, e o carinho. Agradecimentos À Faculdade de Odontologia de Araraquara, na pessoa de sua Diretora, Profª. Drª. Elaine Maria Sgavioli Massucato, e Vice-Diretor Prof. Dr Edson Alves de Campos. À Escola de Engenharia de Lorena (EEL)
 Universidade de São Paulo (USP), em especial ao Prof. Dr. Carlos Angelo Nunes e ao técnico Geraldo (em memória), pelo auxílio no desenvolvimento das ligas metálicas utilizadas neste estudo. À Faculdade de Odontologia de Malmö, por ceder seus laboratórios e materiais para que esta pesquisa pudesse ser concluída. Aos demais professores e funcionários do departamento de prótese, em especial ao Prof. Dr. Thomas Albrektsson por incentivar nosso modo de pensar de maneira crítica durante nossos “PhD meetings” e ao Prof. Dr. Andreas Stavropoulos por me receber no departamento de periodontia e permitir que eu participasse de seus “study clubs”. Ao coordenador do Curso de Pós-Graduação em Odontologia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, Prof. Dr. Carlos Rossa Junior, e a todos os docentes do Curso de Pós- Graduação, pela formação e exemplo. À Claudinha, pela ajuda preciosa, mesmo à distância em agilizar e enviar minhas peças anatômicas para a Suécia, além de toda dedicação, ensinamento e convivência durante estes 4 anos. Muito obrigado pela dedicação! À todos os funcionários da Disciplina de Periodontia em especial para Maria José (Zezé), Isabela (Isa) e Suleima, pela convivência e carinho. Aos demais funcionários e colegas do Departamento de Diagnóstico e Cirurgia da Faculdade de Odontologia de Araraquara. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação pela paciência e admirável interesse em nos ajudar. À todos os meus amigos e colegas de departamento da Universidade de Malmö, por terem me acolhido de braços abertos, pelo compartilhamento cultural e intelectual que tivemos. E a todas as pessoas que de alguma forma cruzaram meu caminho durante minha estada em Araraquara ou na Suécia, muito obrigada. Ao Centro de Tecnologia das Radiações, do Instituo de Pesquisas Energéticas e Nucleares / Centro Nacional de Energia Nuclear. (CTRD/IPEN/CNEN- SP), pela esterilização das amostras utilizadas neste estudo. À CAPES, e ao CNPq, pelo apoio financeiro concedido, indispensável para a realização deste trabalho. Em memória do Dr. Elcio Marcantonio “Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.” (Cora Coralina) Moretti LAC. Ligas de TiNbZr com superfícies bioativas: caracterização topográfica e avaliação do contato ósseo in vivo. [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2017. RESUMO O foco principal deste estudo centrou-se sobre as propriedades da superfície do titânio comercialmente puro, Ti6Al4V e novas ligas de TiNbZr, quando empregada técnica de modificação de superfície por anodização anódica com cálcio e fósforo. Foram avaliadas tanto a caracterização topográfica dos metais como sua relevância com interações com estruturas ósseas adjacentes. As técnicas de caracterização de superfície: rugosidade superficial, MEV, MFA e interferometria ótica foram utilizadas para determinar os padrões topográficos específicos para cada uma das amostras utilizada neste estudo e, para análise das interções biológicas, avaliou-se em conjunto a porcentagem de contato ósseo das novas superfícies funcionais in vivo, em coelhos. A anodização promoveu formação de uma multicamada de poros com incorporação de íons cálcio e fósforo nas superfícies do Ti cp e das ligas Ti6Al4V, Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr. A liga Ti35Nb10Zr foi considerada moderadamente rugosa (1.061µm ±0.179) e apresentou os melhores paramâmetros de rugosidade, o que pode ter influenciado em maior porcentagem de contato ósseo, quando comparadas aos demais grupos deste estudo. Comprovamos que as ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr, em especial a liga Ti35Nb10Zr anodizada, apresentam boas propriedades biológias que permitirão que estes materiais possam ser empregados, em um futuro próximo, na confecção de novos sistemas de implantes. Palavras-chave: Titânio. Propriedades de superfície. Osseointegração Moretti LAC. TiNbZr alloys with bioactive surfaces: topographic characterization and bone contact evaluation in vivo. [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2017. ABSTRACT The focused of this stydy was based on surface properties of commercially pure titanium, Ti6Al4V and new TiNbZr alloys with surface modification technique by anodic anodization with Ca and P. Topographic characterization of metals and biological interactions relevance were evaluated. Surface characterization techniques: surface roughnesses, SEM, AFM, optical interferometry were performed to determine specific topographic patterns for each samples used in this study and additionally, the percentage of bone contact of new functional surfaces was evaluated in vivo by histometry. Anodization technique promoted a multilayer pores with calcium and phosphorus incorporation on the surfaces: cp Ti and Ti6Al4V, Ti35Nb5Zr and Ti35Nb10Zr alloys. Ti35Nb10Zr alloy was considered with moderately rough (1.061µm ±0.179) and showed the best roughness parameters, may trigger suitable biological responses when compared to other groups of this study. It was concluded that Ti35Nb5Zr and Ti35Nb10Zr alloys, especially anodized Ti35Nb10Zr alloy, exhibit biocompatible properties that allow these materials can be used to make new implant systems in a short future. Keywords: Titanium. Surface properties. Osseointegration. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14 2 PROPOSIÇÃO ................................................................................................... 21 3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................. 22 4 METODOLOGIA ................................................................................................ 41 5 RESULTADO ..................................................................................................... 60 6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 92 7 CONCLUSÃO ................................................................................................... 104 REFERÊNCIAS ..................................................................................................105 ANEXO .............................................................................................................. 114 14 1 INTRODUÇÃO O uso de biomateriais com a finalidade de reparar e/ou regenerar estruturas danificadas do corpo representa um papel fundamental na sociedade atual, como é evidenciado pelo aumento do número de pesquisas sobre o desenvolvimento de novos materiais e o esforço contínuo para a compreensão dos mecanismos de interação entre ambos22,42,46,51. A maior dificuldade, entretanto no desenvolvimento de novos biomateriais resulta no fato de que muitos materiais implantados em tecidos vivos podem provocar respostas não favoráveis ao tecido do hospedeiro51. Um dos principais objetivos da reabilitação com implantes dentários é conseguir uma rápida integração com o osso adjacente objetivando uma firme ancoragem. Tanto a topografia quanto a química de superfície são comprovadamente responsáveis pela aposição e formação óssea ao redor dos implantes8,11,20,21,68,99 e numerosas modificações vêm sendo realizadas para contribuir e potencializar o fenômeno que conhecemos por osseointegração51. A osseointegração é baseada em considerações puramente mecânicas, mas é totalmente dependente do processo de interações biológicas com a superfície do metal. Este processo começa com o molhamento da superfície e rápida adsorção de moléculas biologicamente ativas seguido pelo recrutamento de células osteoprogenitoras que, finalmente, orquestram a regeneração do tecido ao redor do metal46. A resposta do osso ao redor de um implante dentário pode estar relacionada a seis possíveis fatores propostos por Albrektsson e Bränemark7, em 1981. Estes seis fatores são: material do implante, desenho do implante, qualidade da superfície do implante, qualidade do leito ósseo receptor, técnica cirúrgica e cargas que serão depositadas sobre o implante. Estes fatores são aceitos até hoje como especialmente importantes para o estabelecimento de uma osseointegração favorável. A superfície do implante é o primeiro componente a interagir com o hospedeiro e por este motivo diversas modificações têm sido extensivamente 15 investigadas com a intenção de proporcionar uma melhor cicatrização óssea ao redor dos implantes dentários112. Assim alterar a textura da superfície e realizar modificações na química destas superfícies são métodos comumente utilizados com a finalidade de estimular e potencializar as respostas biológicas ao redor dos implantes17. O metal de escolha utilizado para a fabricação do conjunto implante- componente é o titânio (Ti) devido as suas excelentes propriedades, tais como: baixa densidade, elevada resistência mecânica e à corrosão, além de apresentar um sistema intrinsicamente biocompatível com os tecidos adjacentes447,9,52,55,71,72,114. Com o intuito de melhorar as propriedades mecânicas do titânio, elementos de liga podem ser adicionados ao titânio comercialmente puro (Ti cp). Um exemplo é a liga Ti6Al4V que é comercializada e bastante utilizada, principalmente em aplicações biomédicas. Sabe-se que a liga em si é biocompatível, porém é conhecida a toxicidade dos elementos alumínio (Al) e vanádio (V) na forma de íons e partículas de desgaste14, 85, o que poderá comprometer a osseointegração. O Al contribui para a patogênese de doenças neurológicas, como o mal de Alzheimer91. A toxicidade do V é controversa. Há estudos que relacionam o V com o mal de Parkinson67 e outros com o comprometimento da reprodução, gestação e lactação107. Portanto, torna-se válido o estudo de novas ligas que sejam biocompatíveis e que tenham maior durabilidade. Estes não precisam necessariamente ser fabricados a partir de novos materiais, mas sim, modificados para a obtenção de melhores propriedades, como por diversificação das composições químicas, tratamentos térmicos e alterações de superfície dos materiais já existentes51. Segundo o diagrama de fases, o Ti possui duas estruturas cristalinas, conhecidas como fases α e β. A fase α está relacionada à estrutura estável em temperatura ambiente, a qual é denominada estrutura hexagonal compacta (hc). Ao elevar a temperatura a aproximadamente 883°C, a fase α transforma-se em β, representada por uma estrutura cúbica de corpo centrado (ccc)15, 38,87,89. Essa temperatura é conhecida como a β-transus do titânio, que corresponde a menor temperatura em que o material é 100% β7. 16 Com a adição de elementos de liga ao Ti, obtêm-se ligas com estruturas cristalinas estáveis em temperatura ambiente. As fases α e β são base para três tipos de ligas de Ti: α, α+β e β, que têm suas estruturas relacionadas com o tipo de elemento de liga utilizado16. Os elementos de liga podem ser classificados como α- estabilizador, β-estabilizador e neutro. O primeiro promove o aumento da temperatura de transformação da fase α para a fase β quando adicionado ao Ti, o segundo diminui essa temperatura e o terceiro não altera a transformação de fases38, 75. Como exemplos de α-estabilizadores têm-se: alumínio (Al), oxigênio (O) e nitrogênio (N) e, de β-estabilizadores têm-se: vanádio (V), tântalo (Ta), nióbio (Nb), molibdênio (Mo), magnésio (Mg) e ferro (Fe)87-89. O zircônio (Zr) e o estanho (Sn) são elementos neutros38. As ligas α são formadas a partir de elementos α-estabilizadores e, em temperatura ambiente, apresentam apenas a fase α e, portanto tem estrutura hc. Essas ligas têm características satisfatórias de resistência mecânica, tenacidade e soldabilidade15, as quais não podem ser melhoradas a partir de tratamentos térmicos38. As ligas α+β frequentemente contêm elementos α e β-estabilizadores, mas podem conter apenas β-estabilizadores. Essas ligas são formuladas para que a fase α coexista com a fase β, em temperatura ambiente89. As propriedades das ligas α+β podem ser modificadas por meio de tratamentos térmicos15-16. As ligas β são formadas quando elementos β-estabilizadores são adicionados ao Ti e, dependendo da quantidade desses elementos e dos tratamentos térmicos aplicados, obtém-se melhoria nas propriedades mecânicas desse tipo de liga34. À temperatura ambiente, essas ligas apresentam predominância da fase β, e a estabilização da estrutura ccc está relacionada com as características de baixo módulo de elasticidade, e elevada resistência mecânica89. Os tratamentos térmicos promovem transformação de fases e mudança na microestrutura das ligas de Ti, que estão relacionadas com o aprimoramento das suas propriedades16. As ligas que contém baixo teor de elementos β- estabilizadores,além de apresentarem as duas fases sólidas estáveis, α e β, podem levar à formação de fases metaestáveis, correspondentes às fases martensíticas (α -́ 17 fase martensítica do tipo hexagonal compacta e α ́ -́ fase martensítica do tipo hexagonal ortorrômbica) e ω (fase metaestável do tipo hexagonal compacta ou trigonal), durante o tratamento térmico94, 103,115-116. O módulo de elasticidade é um fator importante quando o material é desenvolvido para substituir ou interagir com o osso. Este deve ter um valor semelhante ao do tecido ósseo ao redor do implante para possibilitar a reparação e a remodelação óssea80,84. O Ti cp e a liga Ti6Al4V possuem módulo de elasticidade de aproximadamente 105 GPa70, que é mais elevado que o módulo do tecido ósseo, entre 10 e 30 GPa37,69,72,80. Estudos mostram que as ligas β possuem módulo de elasticidade mais próximo ao do osso72. De acordo com estes dados, nos últimos anos, esforços estão sendo feitos para o desenvolvimento de novas ligas de titânio que apresentem alta resistência e que possam ser intrinsicamente biocompatíveis com os tecidos adjacentes, como por exemplo, as ligas de TiNbZr89,107. Novas ligas de Ti, a partir do sistema TiNbZr, têm sido investigadas, para serem utilizadas nas áreas médica e odontológica. Porém ainda não existe um consenso quanto à porcentagem em massa desses metais bem como o processo de fabricação51. O Zr, além de neutro, é um agente endurecedor de solução sólida e possui propriedades semelhantes às do Ti. O Nb é um elemento estabilizador de fase β, que está relacionado com a melhora das propriedades mecânicas do material38. Em 2009, integrantes do grupo de pesquisa desse presente trabalho desenvolveram duas novas ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr para serem utilizadas na confecção de implantes e componentes protéticos dentários88 Na elaboração das ligas de Ti, quanto às proporções dos elementos Nb e Zr, considerou-se a importância do baixo módulo de elasticidade para biomateriais utilizados como implantes cirúrgicos37,44,88. E, como citado anteriormente70, as ligas de Ti tipo β possuem tal propriedade. O Nb mostrou-se eficiente como β estabilizador a 35%. Porém, o Nb também promove a precipitação de fase ω, a qual aumenta o módulo de elasticidade88. O Zr além da função de solidificador de fase sólida, também inibe a formação da fase ω. Consequentemente, o Zr foi utilizado em duas concentrações, 5 e 10%, para verificar a sua atuação nas ligas. 18 Em um primeiro momento, as ligas foram fundidas e caracterizadas quanto às suas propriedades mecânicas, físicas e químicas87-89. Os resultados mostraram composição química final muito semelhante à nominal. A liga Ti35Nb5Zr apresentou fases α e β em sua estrutura, e a liga Ti35Nb10Zr, apenas fase β. Apesar da diferença microestrutural, os resultados dos testes de dureza, tração e ciclagem mecânica sugeriram que as duas ligas eram promissoras. As ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr apresentam propriedades mecânicas87, de resistência à corrosão89 e à tribocorrosão88 semelhantes ou até mesmo superiores quando comparadas à liga comercial Ti6Al4V. Comparadas com a liga comercial Ti6Al4V, as novas ligas de TiNbZr demonstraram melhores resultados de resistência a corrosão em saliva artificial a 37°C e também melhor comportamento frente a tribocorrosão (efeito sinérgico causado pela ação combinada da corrosão com o mecanismo de desgaste) nessas mesmas condições87,89. Estes resultados assim como a osseointegração estão diretamente relacionados com as características das superfícies dos materiais. No entanto, a influência de cada propriedade de superfície na ocorrência de cada um dos fenômenos pode ser conflituosa. Um balanço biológico deve ser conseguido de forma que processos de inflamação/infecção sejam evitados promovendo uma boa interação entre as células ósseas e a superfície36-37. Sabe-se atualmente que as características da superfície do material que é confeccionado o implante como: topografia em diferentes níveis (nano e micro-escala), composição química, tipos de proteínas que são aderidas ou a composição da película salivar, estrutura das camadas e a energia de superfície são parâmetros que influenciam fortemente a interação dos implantes com células e micro-organismos31, 36-37. A resposta biológica é também dependente de pequenas variações na composição química e/ou na estrutura cristalina da camada superficial de óxidos de titânio58. O tratamento de passivação eletroquímica das superfícies de titânio e de suas ligas, também denominado tratamento anódico ou anodização, consiste na formação, sob condições controladas, de um revestimento contínuo e aderente de óxido sobre a superfície do metal de base98. Este processo se resume, basicamente, na imersão de peças metálicas em soluções químicas de ácidos fortes (H2SO4, H3PO4, HNO3, HF), controlando-se a temperatura e o potencial (e/ou a corrente aplicada). A densidade de corrente ou o potencial aplicado são bastante elevados 19 (200 A/m2 ou 100 V, respectivamente). O objetivo é fazer com que a película de óxido cresça e aumente a resistência à corrosão do material; e, além disto, promover o endurecimento superficial do metal melhorando sua resistência ao desgaste40. Quando ácidos fortes são utilizados em uma solução eletrolítica, a camada de óxidos é dissolvida ao longo das linhas de convecção da corrente, sendo novamente formadas em outras regiões do material. Esta dissolução pode acarretar na formação de micro e nano poros na superfície do titânio. Dessa maneira, o processo de anodização modifica a microestrutura e cristalinidade da camada óxida do titânio. A camada de óxidos formada por este processo pode ser densa ou porosa, cristalina ou amorfa, de acordo com os parâmetros do processo40. Óxidos de titânio com a estrutura de anatase parecem ser mais adequados para a promoção da atividade osteogênica97. Uma vantagem desse processo é a possibilidade de incorporar íons, como cálcio (Ca) e fósforo (P) na superfície do titânio51. A funcionalização de superfícies com Ca e P por técnicas de anodização eletroquímica ou de deposição têm sido investigadas nos últimos anos no intuito de produzir superfícies biomiméticas alternativas aos revestimentos de hidroxiapatita produzidos por pulverização por plasma53, 104. Sul et al.97 (2003), e Ravanetti et al.86 (2010), observaram que filmes de TiO2 dopados com Ca e P, produzidos por anodização, promovem uma melhor resposta biológica in vitro e in vivo, resultando numa adesão mais rápida dos osteoblastos. O aumento da camada de óxido do titânio aumenta também a rugosidade de superfície dos implantes, que é um fator importante no processo de adesão e diferenciação celular, melhorando, portanto a resposta do tecido ósseo e a ancoragem do implante9. Ao pesquisar novos materiais, sugere-se seguir etapas. A primeira etapa consistiu em estudar as propriedades fundamentais físicas, químicas e mecânicas das ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr. A segunda etapa foi dirigida ao estudo das propriedades relacionadas com a sua aplicação, como a resistência à corrosão e ao desgaste quando no desenvolvimento de materiais para confecção de conjuntos implantes-componentes protéticos. As características mecânicas das ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr, relacionadas à primeira e a segunda etapa já foram publicadas87-89. Seguindo esse objetivo, o presente estudo costituiu na caracterização topográfica da superfície bem como testes biológicos para 20 avaliarmos, principalmente, a capacidade de osseointegração destes novos materiais após funcionalização da superfície. A partir dos conceitos citados, tivemos a premissa de desenvolver duas novas ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr para serem futuramente utilizadas na confecção de sistema de implantes, bem como a funcionalização dessas superfícies. Seguindo estas propostas, o foco principal deste projeto centrou-se sobre as propriedades da superfície dos metais testados, sua caracterização topográfica bem como sua relevância com interações biológicas. Além disso, mostrou-se uma das atuais estratégias destinadas com a finalidade de projetar superfícies funcionais atráves da técnica de anodização que poderá modular a resposta do hospedeiro. A liga comercial Ti6Al4V e Ti cp foram estudadas nas mesmas condições, com a finalidade de comparação. 21 2 PROPOSIÇÃO Este estudo teve como objetivo: - Caracterizar micro e nanoestruturalmente o efeito da anodização sobre as ligas de Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr. - Avaliar a porcentagem de contato osso-implante, por análise histométrica, dos materiais testados, usinados e com superfícies modificadas. 22 3 REVISÃO DE LITERATURA Diversas áreas da saúde, bem como da engenharia estão envolvidas no processo de desenvolvimento de um biomaterial. Este capítulo de revisão de literatura visa demonstrar a importância do conhecimento e elucidar a resposta do tecido ósseo frente ao biomaterial. Outros fatores, que serão destacados para dar maior embasamento teórico a esta pesquisa, referem-se ao titânio e suas ligas, superfície do implante e técnica de caracterização de superfície, os quais podem influenciar no processo de osseointegração. Biomateriais Dentre os implantes das áreas médica e odontológicas, 70 a 80% são confeccionados de biomateriais metálicos. Biomateriais metálicos são notavelmente importantes na reconstrução de tecidos duros danificados, melhorando a qualidade de vida do paciente (Niinomi 72, 2008). Os materiais utilizados para a fabricação de dispositivos médicos e odontológicos podem ser classificados conforme a composição química em: metais, cerâmicos e polímeros. Quanto ao tipo da resposta biológica que estes apresentam em relação aos tecidos, são classificados como biotolerante, bioinerte ou bioativo (Jordeiro, Barão46, 2016). A resposta típica do tecido ósseo com relação a materiais bioinertes é a encapsulação do implante por uma camada de tecido fibroso, visto que não formam uma ligação química com o organismo receptor. Os bioativos permitem a formação de um novo osso e a troca de íons com o tecido, conduzindo as ligações químicas na interface osso-implante, sem que ocorra o encapsulamento fibroso (Jordeiro, Barão46, 2016). Como exemplo de materiais biotolerantes podemos citar: ouro, ligas Co-Cr (cobalto-cromo), aço inoxidável, zircônio, nióbio, tântalo e politilmetacrilato. Os bioinertes são as cerâmicas de alumina (Al2O3) de alta densidade, aço inoxidável, óxido de zircônio, carbono, nitreto de silício, óxidos de Ti, titânio e suas ligas. Para os bioativos têm-se: a hidroxiapatita, tricálcio fosfato, tetracálcio fosfato, pirofosfato de cálcio, fluorapatita, brushita, carbono vítreo, carbono-silício e biovidros (Rigo et al.90, 1999). 23 O uso do titânio e suas ligas em aplicações biomédicas vêm aumentando devido à sua maior taxa resistência-peso, superior biocompatibilidade e resistência à corrosão, boas propriedades mecânicas e baixo módulo de elasticidade quando comparado a outros biomateriais metálicos (De Andrade et al.22, 2015; Jordeiro, Barão46, 2016; Ribeiro et al.87-89, 2009, 2012, 2013). Com o objetivo de apresentar maior durabilidade, não apresentar rejeição e manter suas funcionalidades, um biomaterial deve possuir os seguintes atributos: Biocompatibilidade Materiais biocompatíveis não devem causar irritação às estruturas biológicas adjacentes, não devem provocar resposta inflamatória anormal e tão pouco provocar reações alérgicas ou imunológicas ao hospedeiro. Outras características de compatibilidade que podem ser importantes na função de um implante incluem: propriedades mecânicas adequadas, propriedades óticas apropriadas e densidade adequada. O sucesso de um biomaterial é dependente principalmente do tipo de reação do corpo humano ao implante (Parr et al.78, 1985; Williams114, 1985). Propriedades mecânicas As propriedades mecânicas de maior importância são: dureza, resistência à tração, ao desgaste (ciclagem mecânica) e ao módulo de elasticidade (Ribeiro87, 2009). A resposta do material a repetidos ciclos de carga ou tensão determina o sucesso em longo prazo de um implante sujeito a cargas cíclicas. Se um implante sofre fratura devido a diferenças entre propriedades mecânicas existentes entre o osso e o implante, isto é chamado de incompatibilidade biomecânica (Geetha et al.37, 2009). O módulo de elasticidade do osso varia de 4 a 30 GPa, dependendo do tipo de osso e direção em que é realizada a medida (De Andrade et al.22, 2015; Kirmanidou et al.51, 2016; Siddiqi et al.94, 2011). Os materiais utilizados atualmente possuem rigidez maior que a do osso, prejudicando a transferência de cargas entre osso e implante, o que pode resultar em reabsorção óssea e consequente um prognóstico ruim para a osseointegração (Geetha et al.37, 2009; Jordeiro, Barão46, 2016). Esta incompatibilidade mecânica que leva à morte de células ósseas é 24 chamada de efeito de blindagem de tensão (Geetha et al.37, 2009). Portanto, de modo a garantir um sucesso para a osseointegração em longo prazo, deve-se optar por materiais que combinem alta resistência e módulo de elasticidade que possuam valores mais próximos ao do osso (Geetha et al.37, 2009). A baixa resistência à corrosão e ao desgaste dos implantes dentários em ambiente corpóreo resulta na liberação de componentes que podem causar reações adversas ao organismo, como alergia e reações tóxicas (Hallab at al.41, 2005). A baixa resistência ao desgaste também pode resultar em perda da osseointegração, e os detritos do degaste podem se depositar sobre os tecidos, causando também reações adversas (Geetha et al.37, 2009; Hallabet al.41, 2005). Titânio Comercialmente Puro O titânio é o nono elemento mais abundante na crosta terrestre. Sua abundância é aproximadamente cinco vezes menor que a do ferro e cem vezes maior que a do cobre, no entanto, o uso anual do titânio em aplicações estruturais é 200 vezes menor que a do cobre e 2000 vezes menor que a do ferro (Zhao et al.118, 2005). O titânio conhecido como comercialmente puro (Ti cp) apresenta teores de pureza que variam de 98 a 99,5%. Suas propriedades físicas podem variar de acordo com a quantidade de impurezas, de elementos residuais ao processo de purificação, tais como: oxigênio (O), ferro (Fe), nitrogênio (N), carbono (C) e hidrogênio (H) (Ribeiro et al.89, 2013). As impurezas determinam a classificação dos quatro tipos de titânio denominados comercialmente puros (Wang, Zheng107, 2010). Apesar da pequena quantidade de O, Fe, N, C e H presentes no “titânio puro”, consideráveis mudanças em algumas propriedades mecânicas podem ocorrer, principalmente devido ao O e ao Fe. Isto porque, estes elementos passam a ocupar áreas dentro do arranjo cristalino (interstício) e causam desalojamento parcial dos átomos de titânio, o que acarreta em um “travamento”, diminuindo o eventual deslizamento dos átomos quando sujeitos a forças externas, aumentando desta forma a resistência a possíveis deformações plásticas (Wang, Zheng107, 2010). O titânio e suas ligas têm seus arranjos cristalinos nas formas: hexagonal 25 compacta, também chamada de fase alfa (α), cúbica de corpo centrado ou fase beta (β), além da mistura das duas fases α e β (Collings18, 1984). O titânio puro apresenta-se na fase α abaixo de 882°C. Acima dessa temperatura a estrutura cristalina modifica-se para cúbica de corpo centrado (β), mas quando resfriado o titânio retorna a sua estrutura original (Donachie27, 1988). Titânio e Suas Ligas Para prolongar o tempo de vida do implante, prevenindo a reabsorção óssea, é necessário que o módulo de elasticidade do implante seja próximo ao do osso. Existem basicamente dois modos de reduzir o módulo de elasticidade em ligas de titânio, que são: introdução de poros e controle da microestrutura (Niimoni72, 2008; Oh et al.73, 2003). Embora o módulo de elasticidade possa ser facilmente controlado variando- se o teor de porosidade, tendo seu valor reduzido conforme o aumento do teor de poros, e um tamanho apropriado de poros propicie uma melhor indução de crescimento ósseo, a resistência mecânica tem seu valor reduzido drasticamente (Niimoni72, 2008; Oh et al.73, 2003). Adicionalmente, sabe-se que os poros são importantes pontos de nucleação de trincas e fadiga que podem levar à falha, diminuindo a vida útil do biomaterial (Long, Rack61, 1998). A adição de elementos de liga visa basicamente a manutenção da fase α e/ou β (De Andrade et al.22, 2015; Kirmanidou et al.51, 2016; Ribeiro et al.87, 2009). A manipulação microestrutural das ligas de titânio por meio de tratamentos térmicos baseia-se na nucleação e crescimento da fase α a partir de β ao se resfriar o material. A transformação martensítica é possível quando a fase β é resfriada rapidamente. Dois tipos de martensita podem ser formados: α' (hexagonal compacta) e α" (ortorrômbica) (Schneider92, 2001). Elementos estabilizadores da fase α são: alumínio, oxigênio, nitrogênio e carbono, que agem aumentando a temperatura de transição β. Elementos estabilizadores da fase β diminuem a temperatura de transição β e são classificados como isomorfos ou eutetóides. Os isomorfos são: molibdênio, vanádio, nióbio, tântalo e tungstênio, e os eutetóides são: ferro, cromo, silício, níquel, cobalto, cobre 26 e manganês. Existem ainda os neutros, tais como o zircônio e estanho (Geetha et al.37, 2009; Scneider92, 2001). Conforme a quantidade de fase α e β presente, as ligas podem ser classificadas como ligas α, ligas próximo de α (near-α), ligas α+β, ligas próximo de β (near-β) e ligas β (Minagar et al.66, 2012). As ligas α, e near-α exibem superior resistência à corrosão, porém a aplicação como dispositivo de implante é limitada pela sua baixa resistência mecânica. As ligas com microestrutura α+β exibem alta resistência mecânica em virtude da presença das duas fases (Assis et al.6, 2006; Liu et al.62, 2010). Ligas de titânio tipo β e near-β possuem alta resistência mecânica, boa conformabilidade e alta temperabilidade. Essas ligas oferecem uma combinação de baixo módulo de elasticidade com superior resistência à corrosão. A composição das ligas associada ao controle de processamento termomecânico têm permitido a produção de ligas destinadas a implantes com propriedades otimizadas (Assis et al.6, 2006; Liu et al.62, 2010). As interfaces α/β constituem uma barreira eficiente ao movimento das discordâncias e à propagação de trincas no interior dos grãos de α ou de β. É a distribuição da fase α primária que exerce as maiores influências sobre as propriedades mecânicas (Kirmanidou et al.51, 2016). Quando esta se encontra na forma de plaquetas (ou de Widmanstätten), ela é particularmente favorável à resistência mecânica, mas prejudicial à ductilidade da liga. Quando sua morfologia é equiaxial ou globular, ela geralmente é benéfica à ductilidade em tração, reduzindo porém a resistência mecânica (Minagar et al.66, 2012). A fase α secundária, obtida por envelhecimento, influencia diretamente o nível de resistência mecânica. A precipitação final desta fase no interior dos grãos β aumenta significativamente seu valor, sendo que uma fina dispersão destas fases no interior dos grãos β afeta diretamente a tenacidade à fratura e a ductilidade da liga (Minagar et al.66, 2012). A liga de titânio mais comumente comercializada e utilizada é a Ti6AL4V (6% de alumínio e 4% de vanádio) devido às suas excelentes propriedades mecânicas 27 (Ribeiro et al.87, 2009). Esta condição se deve a formação de duas fases, α e β, à temperatura ambiente, ao contrário do que ocorre com o titânio comercialmente puro. Assim, esta melhoria das propriedades se deve ao fato do alumínio (Al) ser um estabilizador da fase alfa e o vanádio (V) um estabilizador da fase beta, fazendo com que a liga apresente, em temperatura ambiente, ambas as fases (Kim et al48, 1997; Lemire, Appanna57, 2011). Apesar da concentração relativamente pequena de Al e V na liga Ti6Al4V, esta apresenta uma mudança positiva na resistência à fratura, limite de escoamento, dureza, microestrutura, padrão de fratura e alongamento. Entretanto, o módulo de elasticidade apresenta-se quase inalterado em relação ao titânio comercialmente puro (Niinomi69, 1998). Todas essas características fazem do Ti6Al4V, liga α + β, uma das mais estudadas, sendo também a mais indicada para a fabricação de dispositivos protéticos onde é necessária alta resistência, em substituição ao Ti cp (Kirmanidou et al.51, 2016; Okabe, Hero74, 1995; Ribeiro87, 2009). A liga Ti6Al4V foi a primeira liga de titânio padronizada como material para implantes pela ASTM [American Society for Testing and Materials (F-136-84)]. A sua grande utilização foi em razão da larga disponibilidade e em virtude das propriedades apropriadas como: alta resistência mecânica, menor módulo de elasticidade quando comparado com aço inox e ligas Co-Cr, boa biocompatibilidade e excelente resistência à corrosão (Assis et al.6, 2006; Gueeta et al.37, 2009). Quanto a biocompatibilidade, o uso da liga Ti6Al4V vem sendo questionado por alguns pesquisadores. Durante seu uso, íons de V e de Al podem ser liberados e esses são apontados como elementos de alta toxicidade, sendo o alumínio associado ao mal de Alzheimer (Lemire, Appanna57, 2011). Além disso, esses íons podem ocasionar descamação da mucosa do trato respiratório e ainda prejudicar a produção sanguínea. Isto pode ser agravado pela diminuição da resistência à corrosão da liga quando exposta por muito tempo aos fluidos corpóreos (Assis et al.6, 2006; Gueeta et al.37, 2009; Okabe, Hero74, 1995; Ribeiro et al.87, 2009). Em razão da citotoxicidade do vanádio e estudos que associam distúrbios neurológicos ao alumínio, novas ligas de titânio tipo β compostas por elementos não-tóxicos e não 28 alérgicos foram desenvolvidas (Assis et al.6, 2006; Gueeta et al.37, 2009). Há inúmeros elementos estabilizadores de fases que podem ser combinados com o titânio, os α-estabilizadores mais usados são: Al, estanho (Sn), O e N. Já os β-estabilizadores encontrados com maior freqüência são: V, molibdênio (Mo), cobre (Cu), Fe, nióbio (Nb) e o tântalo (Okabe, Hero74, 1995). Sendo assim, vários pesquisadores buscam por elementos não tóxicos que substituam tanto o Al quanto o V, mas que mantenham as excelentes propriedades mecânicas da liga Ti6Al4V (De Andrade et al.22, 2015; Jordeiro, Barão46, 2016; Kirmanidou et al.51, 2016; Ribeiro et al.87-89, 2009, 2012, 2013). Estudos teóricos, realizados por Long61 et al. (1998), demonstraram que Nb, Zr, Mo e Ta são os elementos de liga que mais se adequam à função de reduzir o módulo de elasticidade da fase β do Ti sem comprometer a resistência ( Geetha et al.37, 2009; Liu et al.62, 2010). A liga TiNbZr é uma liga near-β desenvolvida no início da década de 1990 com o objetivo de aplicações ortopédicas devido ao seu baixo módulo de elasticidade e composição apresentando somente elementos considerados não- tóxicos (Henriques et al.43, 2010; Muller et al.68, 2008). O nióbio atua como estabilizador da fase β e o Zr, apesar de apresentar comportamento neutro, estudos realizados por Tang103 et al. (2000) e por Geetha36 et al. (2001), mostraram que a adição de Zr contribui na estabilização da fase β, já que é um elemento isomorfo, ou seja, estabiliza tanto a fase alfa ou beta no sistema ternário TiNbZr. Nióbio e Seu Papel Estratégico O nióbio foi descoberto em 1801 por Charles Hatchett, que na época o denominou colúmbio, quando o isolou a partir de um mineral chamado columbita. Anos mais tarde o químico alemão Heinrich Rose, desconhecendo o trabalho de Hatchett e pensando haver encontrado um novo elemento ao separá-lo do tântalo, deu-lhe o nome de nióbio em homenagem a Níobe, filha do mitológico rei Tântalo, que foi adotado oficialmente pela União Internacional de Química Pura e Aplicada apenas em 1950 (De Matos23, 2007). 29 Até o final da década de 50, o nióbio era obtido como um subproduto do tratamento das columbitas e tantalitas, minerais pouco abundantes, o que implicava em elevado preço e uso restrito na produção de um tipo especial de aço inoxidável e de algumas superligas. Com as descobertas de significativas reservas de pirocloro, com destaque para aquelas de Araxá-MG, e diante da viabilidade técnica de seu aproveitamento no início da década de 60, ocorreu uma transformação radical no cenário de oferta, preços e da disponibilidade nos mercados (DNPM25, 2017). O Brasil concentra as maiores reservas mundiais de nióbio e segundo o Departamento Nacional de Produção Mineral – DNPM, também é líder na produção mundial, sendo a Companhia Brasileira de Metalurgia e Mineração – CBMM, responsável por 78,3% da produção nacional de concentrado de nióbio e a Mineração Catalão, pelos 21,7% restantes. Em ligas de titânio, o nióbio é um elemento de liga do tipo β-estabilizador muito eficiente. Ligas de Ti contendo até 15% em peso de Nb e submetidas a resfriamento brusco permite a obtenção de estrutura essencialmente martensítica do tipo α’ (hexagonal) acicular. Ao se elevar o teor para valores entre 17,5 a 25% peso de Nb, o resfriamento rápido conduz à formação de martensita do tipo α” (ortorrômbica). Utilizando valores próximos a 27,5% e resfriando rapidamente a microestrutura desse material é constituída de fase β metaestável, sendo possível obter uma estrutura constituída de fase β estável utilizando teores acima de 30% (Aleixo2, 2009). Comportamento Eletroquímico Do Titânio e Suas Ligas Todos os metais e ligas estão sujeitos à corrosão quando em contato com fluídos corpóreos (Ribeiro et al.89, 2013), pois o ambiente corpóreo é muito agressivo devido à presença de íons cloreto e proteínas. Uma grande variedade de reações químicas ocorre na superfície de um material implantado. Apesar de existirem muitas formas de danos ocasionados pela corrosão, a taxa de corrosão é geralmente muito baixa devido à presença de filmes passivos na superfície da maioria dos materiais metálicos utilizados como implantes (Geetha et al.37, 2009). Embora os metais usados em implantes apresentem boa resistência à corrosão, ocorre migração de íons metálicos para os tecidos, ou fluídos corpóreos. A 30 quantidade de íons liberados está relacionada com a resistência à corrosão do metal, condições de ambiente (por exemplo, pH, concentração de íons cloretos, etc.), fatores mecânicos (trincas pré-existentes, abrasão de superfície, adesão do filme), efeitos eletroquímicos (potencial, efeitos galvânicos, corrosão), e concentração de células próximas ao implante (Choubey et al.16, 2005; De Andrade et al.22, 2015; Jordeiro, Barão46, 2016; Ribeiro et al.89, 2013). Fluídos corpóreos apresentam uma composição bastante complexa, sendo constituídos por íons cloreto, fosfato, sulfato, aminoácidos e proteínas, e esta complexidade associada à presença de gases dissolvidos como nitrogênio, dióxido de carbono e oxigênio faz com que os fluídos corpóreos sejam propícios ao desenvolvimento de processos eletroquímicos (Assis et al. 6, 2006; Kirmadou et al.51, 2016). O uso de técnicas eletroquímicas em meios que simulam os fluídos fisiológicos é uma prática bastante utilizada para a avaliação do comportamento de corrosão de materiais metálicos destinados a aplicações biomédicas (Assis et al.6, 2006; Kirmadou et al.51, 2016). O titânio é resistente à corrosão em todos os ambientes naturais, como ar (poluído ou com umidade oceânica), solo (ambiente do tipo sal mineral) e a maior parte das águas contaminadas industrialmente. Por estas razões entre 20 e 30% do consumo de titânio está concentrado em aplicações em que é necessária resistência à corrosão (Ribeiro et al.87-89, 2009, 2012, 2013; Schwanke 93, 2000). Ligas de titânio são resistentes à corrosão devido à presença de um filme composto principalmente de TiO2 que cobre o substrato metálico. Este filme é espontaneamente formado na superfície de ligas de Ti quando exposta à atmosfera (De Andrade et al.22, Jordeiro, Barão46, 2016; Kirmanidou et al.51,2016). Liga TiNbZr– Estudos Anteriores Assis6 et al. (2006) estudaram o comportamento eletroquímico das ligas Ti6Al4V, Ti6Al7Nb e Ti13Nb13Zr em solução de Hank para avaliação da resistência à corrosão em solução fisiológica artificial. Foi analisada a variação do potencial de corrosão com o tempo, curvas de polarização potenciodinâmica e espectroscopia de 31 impedância eletroquímica. Baixas densidades de corrente foram obtidas para todas as ligas, indicando comportamento típico de material passivo. Os resultados de espectroscopia de impedância exibiram comportamento capacitivo com ângulos de fase próximos a -90°C e altos valores de impedância em baixas e médias frequências, indicativos da formação de um filme altamente estável nestas ligas para esta solução teste. Schneider92 et al. (2001), estudaram a liga ternária TiNbZr obtida por fusão a arco utilizando diferentes composições, Ti-XNb-13Zr (X= 5, 10, 15, 20) e tratamentos térmicos com taxas de resfriamento diferentes - ao ar (AC) e rápido em água (WQ), obtendo menores valores de módulo de elasticidade na condição resfriado rápido em água, sendo a composição Ti5Nb13Zr a que apresentou menor valor, 64 GPa. Os valores de dureza Vickers variaram entre 240 e 340 HV, sendo observado na condição AC aumento na dureza conforme o aumento do teor de Nb até a composição contendo 15%, e para a condição WQ valores próximos, exceto para composição contendo 20% de Nb. As ligas na condição WQ apresentavam microestrutura martensítica α’ (HC) e, na condição AC apresentavam microestrutura Widmanstätten α+β, exceto para composição com 20% de Nb, que apresentou as fases ω e β. Oliveira76 et al. (2006) analisaram o comportamento eletroquímico das ligas Ti50Zr e Ti13Nb13Zr nas condições forjada e após tratamento térmico em diferentes eletrólitos que simulavam ou não o meio fisiológico. Análises do potencial a circuito aberto das ligas indicaram que os materiais apresentaram tendência de formação espontânea de um filme de óxido protetor em suas superfícies nas condições forjada e após tratamento, sendo mostrado que o tratamento térmico não modificou as características protetoras destes filmes. Os voltamogramas cíclicos mostraram que a liga Ti13Nb13Zr, tanto na condição forjada, quanto após tratamento, não apresentou transpassivação até o potencial de 8V (versus Eletrodo de Calomelano Saturado - ECS) em soluções contendo cloreto, enquanto a liga Ti50Zr sofre corrosão localizada em potenciais abaixo de 2V (versus ECS). Apesar de o tratamento térmico modificar a estrutura das ligas, não influenciou no comportamento de corrosão dos materiais. O objetivo do estudo de Müller68 et al. (2007) foi sugerir um tratamento de superfície químico para a liga Ti13Nb13Zr a fim de iniciar a formação de hidroxiapatita (HCA) durante teste bioativo in vitro em fluído de corpo simulado 32 (SBF). Pó de Ti, Nb e Zr após a remoção de hidrogênio foram misturados, compactados e sinterizados. Em seguida, as amostras foram atacadas por HCl, H3PO4 e por uma mistura de HF + HNO3, respectivamente, e, subsequentemente, pré-tratadas em NaOH. Foram utilizados MEV, EDS, FTIR e análise gravimétrica para a avaliação da influência do ataque ácido na microestrutura da liga e, ainda, na taxa de formação de HCA. A liga sinterizada exibiu microestrutura de Widmannstätten, ou seja, uma estrutura cristalina sem forma definida (α + β). As amostras atacadas por HCl e H3PO4, após uma semana, mostraram formação de HCA em suas superfícies, porém, nas amostras tratadas com HNO3, não houve formação de HCA. Após duas semanas, a taxa de formação de HCA aumentou, sendo a maior taxa para as amostras tratadas com HCl, seguidas pelas tratadas por H3PO4 e HNO3. Uma vez que a formação de HCA in vitro em SBF geralmente é aceita como característica típica de material bioativo, o trabalho supõe que o ataque com HCL, com subsequente tratamento com NaOH, pode aumentar a habilidade de união da liga Ti13Nb13Zr ao osso in vivo. Ribeiro87 et al. (2009) estudaram as propriedades mecânicas da liga ternária TiNbZr nas composições Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr, obtidas por fusão a arco voltaico, situadas no campo α+β e β, respectivamente. Os valores de dureza obtidos foram de 240 e 185HV, e relacionou-se a maior dureza apresentada pela liga Ti35Nb5Zr à presença de precipitados de fase α na microestrutura, enquanto a liga Ti35Nb10Zr apresentou apenas fase β. O aumento do teor de zircônio contribuiu na estabilização de maior quantidade da fase β, e é relatado que o zircônio agiu como inibidor de aumento de dureza em ligas de titânio quando estas foram tratadas termicamente. Florencio32 et al. (2010) estudaram o comportamento elástico da liga Ti13Nb13Zr obtida por fusão a arco por meio de relaxações anelásticas em função da temperatura em amostra tratada em temperatura de tratamento de solução β e resfriada rapidamente em água (WQ) e também na condição após envelhecimento. Foram obtidos valores de módulo de elasticidade de 64 e 87 GPa na condição após WQ e WQ seguido de envelhecimento, respectivamente. Após novo tratamento térmico para alívio de tensões, os valores de módulo de elasticidade foram elevados para 87 e 110 GPa, atribuindo-se à variação entre as proporções das fases presentes. 33 Henriques43 et al. (2010) estudaram propriedades mecânicas da liga Ti13Nb13Zr produzida por metalurgia do pó por método de mistura elementar de pós obtidos por hidrogenação, utilizando tempo de sinterização de 2h e variando temperatura entre 900-1400°C. Foram obtidas densidades variando entre 4,2 e 4,8g/cm3 (entre 93 e 97% da densidade teórica). O módulo de elasticidade variou entre 69 e 72 GPa, aumentando de valor conforme o aumento da temperatura utilizada e eventual aumento de densidade. Majumdar63 et al. (2011) estudaram a influência de tratamentos térmicos nas propriedades mecânicas da liga Ti13Nb13Zr, realizando tratamentos em temperaturas acima e abaixo da temperatura de transição β. Foram utilizados diferentes taxas de resfriamento, como resfriamento no forno (FC), ao ar (AC) e resfriamento rápido em água (WQ) e, os valores obtidos de dureza variaram entre 250 e 350 HV. Foi observado que as amostras resfriadas por AC obtiveram maiores valores de dureza quando comparadas às resfriadas por FC e WQ, e o tratamento de envelhecimento aumentou a dureza expressivamente. O autor cita que de acordo com estudos reportados anteriormente, a precipitação da fase α na matriz aumenta a dureza de ligas Ti-β. Ti e a Osseointegração O Ti e as suas ligas são utilizados como materiais de implante ortopédicos e dentários devido as suas propriedades mecânicas, adequadas para a substituição de tecido duro, sua excelente resistência à corrosão e biocompatibilidade conferidas pelo filme natural de óxido. No entanto são materiais bioinertes frente ao tecido ósseo (Games et al.35, 2012; Lindreberg et al.60, 2008). A osseointegração completa é um processo lento quando comparado com períodos de cicatrização para implantes, e o sucesso requer a osseointegração entre o material e do tecido ósseo. Portanto, uma fixação óssea desfavorável afeta a vida do implante. Assim, torna-se necessária a utilização de técnicas de modificação de superfície que melhorem a atividade biológica destes materiais e possam favorecer a integração óssea de maneira ideal (Grigal et al.39, 2012). Estudos recentes indicam que o processo de osseointegração depende das propriedades da superfície do biomaterial (topografia, rugosidade, composição 34 química, cargas da superfície, energia superficial e molhabilidade) (Albrektsson, Johansson8, 2001). O contato das células com a superfície do implante e a adesão celular à superfície varia com a molhabilidade da superfície do implante e esta influencia o comportamento celular. Contudo, a adesão celular à superfície de implantes não é suficiente para garantir uma osseointegração ideal. As células devem receber sinais para induzi-las a diferenciar-se e proliferar-se. Neste sistema, as características da superfície do material são importantes. A topografia do implante, a energia de superfície e a composição química desempenham um papel essencial na adesão celular em implantes dentários, especialmente em termos de adesão de osteoblastos (Albrektsson, Johansson8, 2001). Assim, adsorção, adesão e espalhamento são as primeiras fases de interação entre a célula e o biomaterial. A qualidade desta primeira fase irá influenciar a capacidade das células em contato com o material, em proliferar-se e diferenciar-se (Biggs et al.11, 2009; Choi et al.15, 2005; Conserva et al.19, 2010; De Andrade et al.22, 2015; Den Braber et al.24, 1995; Kirmanidou et al.51, 2016). Oxidação Anódica ou Anodização Tecnologias de modificação de superfície do Ti e suas ligas incluem tratamento mecânico, pulverização térmica, sol-gel, tratamento químico e eletroquímico, implantação de íons, entre outros (Grigal et al.39, 2012; Wennerberg, Albrektsson112, 2010). A anodização tem atraído atenções devido à simplicidade e reprodutibilidade da técnica. É uma técnica eletroquímica bastante utilizada para aumentar a bioatividade do Ti devido ao seu baixo custo e a obtenção de um filme na superfície do substrato (Ergun et al.29, 2007; Freese et al.33, 2001; Ishzawa, Ogino45, 1995). A oxidação anódica ou anodização é um método que visa desencadear descargas a uma tensão eletrolítica elevada para formar superfícies ásperas e porosas de óxido, sendo que estas podem ser controladas pelo tempo de anodização e potencial aplicado. Uma vantagem desse processo é a possibilidade de incorporar íons, como cálcio (Ca), fósforo (P) na superfície do titânio (Liang et al.59, 2003; Suh et al.96, 2003). O aumento da camada de óxido do titânio aumenta também a rugosidade de superfície dos implantes, que é um fator importante no 35 processo de adesão e diferenciação celular, melhorando, portanto a resposta do tecido ósseo e a ancoragem do implante (Maluf et al.64, 2007). Podem ser utilizados diferentes eletrólitos com diferentes concentrações e condições elétricas variadas, que resultam em filmes de óxido de Ti com diferentes porosidades e rugosidades. A porosidade e a rugosidade são parâmetros importantes para a qualidade da osseointegração dos implantes (Wennerberg, Albrektsson112, 2010). As interfaces porosas aumentam a fixação através do crescimento de osso em direção ao revestimento, formando um maior embricamento mecânico (Ergun et al.29, 2007; Freese et al.33, 2001; Ishizawa, Ogino45, 1995; Wennerberg, Albrektsson112, 2010). A oxidação anódica pode ser efetuada de dois modos: (a) mantendo a densidade de corrente constante, modo galvanostático, ou (b) mantendo o potencial constante, modo potenciostático (Long, Rack61, 1998). As propriedades químicas e estruturais dos óxidos anódicos variam de acordo com os diferentes ácidos utilizados como eletrólitos. Os parâmetros eletroquímicos da oxidação anódica afetam significativamente o comportamento do crescimento e as propriedades dos filmes. Tais parâmetros incluem a solução utilizada como eletrólito, a concentração de reagentes, a temperatura, os parâmetros elétricos, tempo de anodização, velocidade de agitação da solução, etc (Long, Rack61, 1998).O potencial do anodo e a corrente elétrica podem alterar o processo de transferência de ânions, durante a anodização; como também determinar a espessura, a morfologia da superfície e a microestrutura dos revestimentos anódicos (Long, Rack61, 1998). A resposta do tecido ósseo aos implantes oxidados é fortemente influenciada pela escolha dos eletrólitos da anodização. Diferentes ácidos (ácido fosfórico H3PO4, ácido-sulfúrico H2SO4, ácido acético-CH3COOH, entre outros), os sais neutros e soluções alcalinas são amplamente utilizados como eletrólitos para a anodização de titânio. O comportamento eletroquímico sobre o crescimento do óxido de titânio foi estudado por Sul97 et al. (2001), que verificou que dentre os diferentes eletrólitos analisados (H3PO4, H2SO4, CH3COOH, NaOH, Ca(OH)2) a espessura de óxido anódico em H2SO4 foi a mais elevada. Os autores também constataram 36 que eletrólitos ácidos são mais eficientes na formação de óxidos frente a soluções de hidróxidos. Funcionalização de Superfície por Técnicas de Anodização – Estudos Anteriores Ishizawa e Ogino45 (1995) caracterizaram os filmes de óxido formados na superfície do titânio por meio de anodização com eletrólitos de β-glicerofosfato e acetato de cálcio. Após o tratamento de superfície, as amostras foram caracterizadas por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), energia dispersiva de raios-X (EDS) e difração de raios-X (DRX). Os resultados das micrografias demonstraram a formação de microporos e microprojeções. A análise por DRX não detectou nenhum pico de fosfato de cálcio, mas a incorporação de íons Ca e P (também verificada em EDS) em razão equivalente à hidroxiapatita (HA), além da presença de cristais de rutilo e anatase. Por meio dos achados, os autores concluíram que a anodização de superfícies de titânio em β-glicerofosfato e acetato de cálcio possibilita a incorporação de íons Ca e P, sendo totalmente válida e possível para os dispositivos de implantes. Barrere10 et al. (2004) investigaram a nucleação e o acrescimento de fosfato de cálcio depositado em implantes após imersão em solução de fluido corpóreo simulado (SBF - água destilada; NaCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, NaHCO3 e Na2HPO4.2H2O). Quarenta amostras de titânio foram divididas em dois grupos: um grupo com superfície lisa (rugosidade máxima < 0,10µm) e outro superfície rugosa (rugosidade máxima entre 0,10 µm e 0,25 µm). Em seguida, as amostras foram imersas em SBF por períodos entre 10min a 5 h com o objetivo de induzir a formação de depósitos de Ca - P, os quais foram analisados em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de força atômica (MFA). Os resultados demonstraram que de acordo com o aumento do tempo de imersão, houve aumento nos depósitos de fosfato de cálcio cujos diâmetros iniciais eram de aproximadamente 10nn para a formação de glóbulos maiores, recobrindo a superfície das amostras de ambos os grupos. A rugosidade das superfícies não afetou o desenvolvimento dos glóbulos de fosfato de cálcio, porém houve ruptura da matriz interfacial nas amostras do grupo liso. Diante dos resultados, os autores concluíram que a nucleação de fosfato de cálcio não depende da topografia da 37 superfície, mas que a estabilidade mecânica deste tipo de revestimento requer um substrato com rugosidade superior a 0,10 µm. Zhuet120 al. (2004) investigaram os efeitos das características e composição dos óxidos em superfícies de titânio anodizadas sobre o comportamento dos osteoblastos. As amostras de titânio comercialmente puro foram tratadas por meio do processo de anodização no qual foram utilizados dois tipos diferentes de eletrólitos: ácido fosfórico e glicerofosfato de cálcio, sendo que o fósforo e o cálcio foram incorporados sob a forma de fosfato e glicerofosfato nas amostras. Faziam parte do estudo 8 grupos sendo que Grupo I- controle, Grupo II ao IV-grupo anodizado com H3PO4, e Grupo V ao VIII- grupo anodizado com Ca-GP , visto que os grupos anodizados apresentavam diferentes potenciais de voltagens aplicados de grupo para grupo. Após o preparo das amostras, as características de superfícies foram avaliadas dentre elas: rugosidade superficial, ângulo de contato e composição química. Além disso, foram realizados testes de citotoxicidade e teste de adesão de osteoblastos na superfície das amostras. Os resultados demonstraram a presença de microporos nas superficies anodizadas, com diâmetros variados de 0,5 até 2 µm, dependendo do eletrólito utilizado. Em relação a rugosidade de superfície, esta foi aumentada nos grupos anodizados com Ca - GP, e diminuída nos anodizados com H3PO4 em relação ao gupo controle. Em relação aos ângulos de contato, estes foram mais baixos para o eletrólito de Ca - GP, e maiores ângulos de contato para o eletrólito H3PO4, porém todas as superfícies se demonstraram hidrofílicas em relação ao grupo controle. Os experimentos de cultura celular apresentaram aumento da adesão de osteoblastos as superfícies anodizadas e ausência de citotoxicidade, as células mostraram um crescimento irregular e poligonal. Dessa forma, os autores concluíram que o aumento da tensão da anodização e o aumento da espessura dos óxidos promoveram o aumento da adesão celular as superfícies tratadas. Em uma pesquisa in vivo, realizada em ratos, Omar77 et al. (2010) demonstraram que a incorporação de íons cálcio decorrente da técnica de anodização da superfície do titânio pode aumentar a fixação do implante, com indícios de alterações no recrutamento de células mesenquimais e expressão de genes, como por exemplo, fosfatase alcalina e osteocalcina, envolvidos na remodelação óssea. Estudos mostram que os íons cálcio utilizados para as 38 modificações de superfície de implantes, têm sido associados à promoção de adesão de osteoblasto in vitro (Ergun29, 2007) e osseointegração em modelos in vivo (Freese33, 2001). Yu116 et al. (2011) avaliaram as características de superfície, composição de fase, biocompatibilidade e osteocondução de filmes porosos de superfícies anodizadas da liga Ti3Zr2Sn3Mo25Nb (TLM) em comparação com a liga Ti4Al4V (TAV). As superfícies de ambas as ligas foram submetidas à oxidação anódica micro-arco (MAO) em eletrólito contendo acetato de cálcio monohidratado e β- glicerofosfato de sódio pentahidratado. Para avaliar as características de superfície e fases, foram utilizados microscopia eletrônica de varredura, XRD, XPS, e EDS. Para avaliar a biocompatibilidade foram realizados testes in vitro de cultivo de osteoblasto, além de avaliação da osteocondução por meio da imersão das amostras em fluido corpóreo simulado (SBF) e em seguida implantação destas no tecido ósseo. Os resultados demonstraram superioridade da liga TLM em relação a biocompatibilidade e osteocondução quando comparada ao TAV. A formação de apatita foi induzida nas camadas de poros da liga TLM após imersão em fluido corpóreo. A camada de poros ofereceu um ambiente de afinidade para os osteoblastos que se aderiram e aumentaram sua proliferação. De acordo com os resultados, os autores concluíram que a liga TLM com a superfície modificada incorporou um filme de cálcio e fosfato poroso, que promoveu excelente resistência a corrosão, boa biocompatibilidade e osteocondução que podem promover a proliferação celular e formação óssea. Sabe-se que a osseointegração está associada à presença de uma fina camada de óxido de titânio na superfície do implante, a qual pode ser modificada para que os mecanismos envolvidos na osseointegração sejam acelerados, permitindo a colocação da prótese em menor tempo. Takebe100 et al. (2012) analisaram o método de tratamento de superfície de implantes de titânio (Ti cp) por meio de descarga de oxidação anódica com eletrólito de acetato de cálcio + β-glicerofosfato de sódio e em seguida tratamento térmico resultando na precipitação de cristais de hidroxiapatita (HA) na superfície destes implantes. Após a anodização com incorporação de íons Ca e P, e em seguida recobrimento com HA aumentando a cristalinidade das amostras e criando um filme de óxido de titânio nanoestruturado na superfície, as amostras tratadas foram 39 comparadas com amostras apenas anodizadas com íons Ca e P. As superfícies tiveram suas topografias das superfícies analisadas em microscopia eletrônica de varredura e de força atômica (MFA). Ângulos de contato e energia livre de superfície também foram avaliados. Os resultados demonstraram a formação de superfícies com filmes de óxidos nanoestruturados para ambos os tratamentos. Foram observados menores valores de ângulo de contato nas superficies anodizadas e tratadas termicamente (com HA) em comparação às superficies apenas anodizadas. Assim, os autores atestam que as superfícies tratadas com anodização e tratamento térmico podem ter um papel importante na osteoindução durante processo de osseointegração. Kim50 et al. (2013) analisaram as propriedades de superfície e a bioatividade de superfícies de titânio anodizado. Os discos de titânio cp grau II foram polidos com lixa de carbeto de silício granulação 240, lavados em ultrassom com acetona, etanol e água destilada por 10 minutos cada, para então serem divididos em dois grupos: G I- titânio usinado (sem tratamento), e G II- titânio anodizado (tratado). A anodização foi feita utilizando como eletrólito acetato de cálcio + β-glicerofosfato de cálcio por 30, 60 e 120 segundos. A morfologia de superfície foi avaliada em MEV e MFA. Foi realizado XRD, análise de rugosidade de superfície, avaliação de ângulo de contato, avaliação de resistência à corrosão e avaliação da resposta biológica. A superfície de titânio anodizada exibiu uma camada de óxido porosa e mais espessa quando comparado à superfície de titânio usinado. A esta camada de óxido mais espessa foi atribuída melhor resistência a corrosão. Não houve diferença estatística significante entre os valores de rugosidade de superfície de ambos os grupos (GI = 0,24 µm; GII = 0,28 µm). A superfície de titânio anodizada apresentou ângulo de contato mais baixo do que o titânio usinado, e maior molhabilidade, resultados que propiciaram melhor adesão celular nas superfícies dos implantes anodizados. Por meio dos resultados obtidos, os autores ainda relataram que a modificação de superfície do titânio por meio do processo de oxidação anódica proporcionou aumento na resposta das células osteoblásticas após sete dias. Dessa forma, os autores concluíram que houve aumento da atividade celular e da fosfatase alcalina em superfícies anodizadas comparadas às usinadas nos testes in vitro, e que estas propriedades poderiam favorecer aumento na resposta óssea devendo, portanto, ser avaliado in vivo. 40 Em um recente meta-análise, Chrcanovic17 et al. (2016) testaram a hipótese nula que não há nenhuma diferença nas taxas de falha, perda óssea marginal (MBL) e infecção pós-operatória em pacientes reabilitados com implantes que apresentam superfície polida versus anodizada. A busca eletrônica dos artigos foi realizada sem restrições de tempo ou de linguagem, até novembro de 2015. Os critérios de elegibilidade incluíram: estudos clínicos em humanos, randomizados ou não. Trinta e oito publicações foram incluídas. Os resultados sugerem uma razão de risco de 2.82 (95% IC, P <0 00001) para a falha de implantes usinados ou polidos, quando comparados aos implantes de superfície anodizada. Dentro das limitações das investigações existentes, o presente estudo sugere que os implantes usinados têm uma probabilidade estatisticamente maior de falhar do que os implantes de superfície anodizada, independentemente do local em que foram instalados (maxila ou mandibula). Não houve diferença estatisticamente significativa quanto a perda óssea marginal quando os dois tratamentos de superfície foram comparados. A comparação quanto a infecção pós-operatória entre os tipos de tratamento de superfície não foi possível, devido à falta de informação suficiente do estudo. 41 4 METODOLOGIA 4.1 Produção e Desenvolvimento de Superfícies Bioativas de Ti e Ligas de Ti. 4.1.1 Obtenção das Amostras Ti cp e Ti6Al4V Tanto o Ti cp como a liga Ti6Al4V, por serem materiais disponíveis no mercado, foram adquiridos comercialmente na empresa Realum (Realum Ind. Com. de Metais Puros e Ligas Ltda, São Paulo, SP, Brasil) na forma de placas, que foram usinadas em discos com 8 mm de diâmetro e 2 mm de espessura. Na Figura 1 é possível visualizar os discos de Ti cp. Figura 1 – Discos de Ti cp Fonte: Elaboração própria Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr As ligas experimentais foram obtidas por fundição dos elementos Ti, Nb e Zr, com grau de pureza comercial igual ou superior a 99,00%, conforme descrito na Tabela 1. O Ti e o Nb foram adquiridos na forma de placas e lâminas, respectivamente, e foram decapados com os reagentes descritos na Tabela 2, com o intuito de eliminar sujidades e óxidos, antes da fundição. Já o Zr foi adquirido na forma de esponja, já isento de óxido. 42 Tabela 1 – Metais utilizados para a fundição das ligas Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr, composição química, lotes e fabricantes Metal Composição química Lote Fabricante Titânio Ti: 99,745%/ C: 0,010% Fe: 0,10%/ H: 0,001% N: 0,004%/ O2: 0,140% RLM 0756 Realum Indústria e Comércio de Metais Puros e Ligas Ltda, São Paulo, SP, Brasil Nióbio > 99,800% 812990 CBMM Companhia Brasileira de Metalurgia e Mineração, Araxá, MG, Brasil Zircônio ≥ 99,000% 03517AH Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, Estados Unidos Fonte: Elaboração própria Tabela 2 – Reagentes e as proporções utilizadas nas soluções para decapagem dos metais Metal Reagentes e proporções das soluções de decapagem (em volume) Titânio H2O, HF, HNO3 (1:1:1) Nióbio H2O, HF, HNO3, H2SO4 (1:2:2:5) Fonte: Elaboração própria As ligas foram fundidas em forma de lingotes com 30g, com composições (% em massa): Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr. A fundição foi realizada em forno de fusão a arco-voltáico, com atmosfera inerte, controlada por bomba de vácuo e fluxo de argônio, alocado no Departamento de Engenharia de Materiais (DEM) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL) – USP, representado na Figura 2. Figura 2 – Forno de fusão a arco voltaico, acoplado ao cilindro de argônio (DEM/EEL/USP). Fonte: Elaboração própria A sequência de fundição está representada na Figura 3. Após a limpeza do forno com acetona, os metais foram cuidadosamente colocados em cadinho de cilindro de argônio 43 cobre, no interior do forno. Na sequência, iniciava-se o vácuo, com três intervalos para purificação do forno com argônio (purgas) até atingir o vácuo. Em seguida, teve início a fusão propriamente dita. Após a primeira fusão do lingote, esperava-se esse resfriar para então ser virado e repetir a fusão. Essa “refusão” foi realizada cinco vezes, com o intuito de garantir a homogeneidade química da liga1,87-89. Figura 3 – Sequência de fundição das ligas experimentais do sistema TiNbZr: (A) posicionamento dos metais no cadinho, (B) fechamento da tampa para ser realizado o processo de vácuo no interior do forno, (C) fusão em processo, (D) lingote fundido, (E) resfriamento do lingote, (F) lingote resfriado pronto para ser virado para refusão (5 vezes). Fonte: Elaboração própria Após a fundição, os lingotes foram submetidos a um tratamento térmico de homogeneização a vácuo a 1000°C durante 8h. Como o forno utilizado não possuía sistema de vácuo, os lingotes foram encapsulados a vácuo em tubos de quartzo (Corel resistências elétricas, Pirituba, São Paulo, Brasil). O processo de vácuo foi realizado com intervalos de purgas com argônio até atingir o vácuo. A Figura 4 representa esse procedimento, que foi realizado no Departamento de Engenharia de Materiais (DEM) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL) – USP. 44 Figura 4 – Sequência de encapsulamento e tratamento térmico: Para a manipulação do tubo de quartzo foi utilizado maçarico, (A) tanto para deixa-lo no tamanho ideal para inserir os lingotes, (B) como para uni-lo a um tubo de quartzo mais fino, onde se acoplava a mangueira do cilindro de argônio para realizar o procedimento de vácuo. (C) Ao final do procedimento de vácuo, utilizou-se mais uma vez o maçarico para fazer a vedação final do tubo do quartzo. Nota-se na Figura C que o tubo de quartzo está ainda ligado a mangueira durante o procedimento de fechamento do tubo, com intuito de preservar o vácuo no interior do mesmo. (D) Após o procedimento de vácuo, tubos vedados a vácuo com lingotes dentro. (E) Esses lingotes foram então levados a um forno de tratamento térmico, (F) onde permaneceram por 8h a 1000°C. (G) O resfriamento foi feito no interior do forno e, ao atingir a temperatura ambiente, os tubos foram retirados do forno e, então, (H) quebrados para os lingotes serem retirados. Procedimento e fotos realizadas no Departamento de Engenharia de Materiais (DEM) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL) – USP. Fonte: Elaboração própria Após o tratamento térmico de homogeneização, os lingotes foram forjados em barras de aproximadamente 9,8 mm, utilizando forja rotativa a quente no Departamento de Engenharia de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica – UNICAMP. Na sequência, as barras foram usinadas em torno para obtenção de discos com 8 mm de diâmetro e 2 mm de espessura. Em seguida, os discos usinados foram encapsulados em tubos de quartzo, como descrito anteriormente, e tratados termicamente por 1h a 1000°C a vácuo e resfriamento rápido, com o intuito de aliviar as tensões geradas durante a usinagem. Após atingir a temperatura ambiente, os tubos de quartzo foram quebrados para 45 obtermos então as amostras. A Figura 5 representa os discos dentro do tubo de quartzo e os tubos sendo retirados do forno a 1000°C para ser realizado o resfriamento rápido. Figura 5 – (A) Discos encapsulados a vácuo em tubo de quartzo, (B) tubos de quartzo sendo retirados do forno para resfriamento. Fonte: Elaboração própria 4.1.2 Acabamento e Polimento Para eliminação de riscos e defeitos oriundos do processo de usinagem, todos os discos dos diferentes materiais, Ti cp, Ti6Al4V, Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr, tiveram suas superfícies regularizadas e polidas por meio de lixamento e polimento em politriz (Aropol 2V, Arotec, Cotia, São Paulo, Brasil) na presença de água, com lixas de carbeto de silício com as seguintes granulações: 320, 600, 800, 1200, 1500 e 2500. Em seguida, os discos foram lavados em água destilada e submetidos à limpeza final por meio de ataque químico com solução de Kroll (H2O, HNO3, HF - 1: 1:1) embalados em papéis próprios para esterilização e armazenados. 4.2 Funcionalização das Superfícies (Tratamento de Superfície) Para tornar as superfícies bioativas, foi utilizada anodização eletroquímica. Na Figura 6 é possível observar a fonte de corrente utilizada (N5771A, Agilent Technologies do Brasil, São Paulo, SP, Brasil) e a célula eletroquímica confeccionada especialmente para esse fim. 46 Figura 6 – (A) Fonte de corrente modelo N5771A (Agilent Technologies do Brasil, São Paulo, SP, Brasil) e (B) célula eletroquímica. Fonte: Elaboração própria Imediatamente antes do processo de anodização, as amostras, independente do material, foram atacadas quimicamente em solução de Kroll durante 8 segundos, para remoção do filme passivo original e, limpas em ultrassom com água destilada e com álcool isopropílico e, secas. Nesse momento, as amostras estavam prontas para o processo de anodização. Para a obtenção de superfícies funcionalizadas com incorporação de Ca e P, as amostras foram anodizadas por 1min com corrente de 300 V, em eletrólito composto por acetato de cálcio monohidratado (0,35 mol/L,) e β-glicerofosfato dissódico pentahidratado (0,04 mol/L) (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, Estados Unidos), utilizando a célula eletroquímica acoplada a fonte de energia, citadas anteriormente. Após o processo de anodização, as amostras foram limpas em ultrassom com água destilada e com álcool isopropílico. Todos os materiais propostos nesse estudo foram anodizados com Ca e P, ou seja, amostras em forma de discos de Ti cp, Ti6Al4V, Ti35Nb5Zr e Ti35Nb10Zr foram preparadas para caracterização e também para as análises in vivo. Os discos foram embalados em papéis próprios para esterilização (papel grau cirúrgico) e armazenados. 4.3 Amostras Ao final das etapas de preparação das amostras obtivemos 8 grupos para experimentação neste estudo: Ti cp polido, Ti cp anodizado, Ti6Al4V polido, Ti6Al4V anodizado, Ti35Nb5Zr polido, Ti35Nb5Zr anodizado, Ti35Nb10Zr polido, Ti35Nb10Zr anodizado. Ti cp, neste estudo, foi utilizado como controle. Os grupos foram 47 numericamente divididos em: grupo 1: Ti cp, grupo 2: Ti cp anodizado, grupo 3: Ti6Al4V, grupo 4: Ti6Al4V anodizado, grupo 5: Ti35Nb5Zr, grupo 6: Ti35Nb5Zr anodizado, grupo 7: Ti35Nb10Zr e grupo 8: Ti35Nb10Zr anodizado. 4.4 Esterilização Os discos a serem utilizados nas análises de biocompatibilidade in vivo foram esterilizados por radiação gama com dose de 25 KGy, no Centro de Tecnologia das Radiações, do Instituo de Pesquisas Energéticas e Nucleares/ Centro Nacional de Energia Nuclear, São Paulo, Brasil (CTRD/IPEN/CNEN- SP). 4.5 Caracterização das Superfícies 4.5.1 Caracterização Topográfica Bidimensional Caracterização física e química: Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e EDS O MEV é considerado o padrão ouro na caracterização morfológica. A composição química bem como a microestrutura das superfícies de todos os materiais foram analisadas por MEV - (JSM-6610LV, JEOL, Tóquio, Japão), acoplado com detector EDS (Energy Dispersive X-ray), localizado na Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr-UNESP). Com isto foi possível obter informações qualitativas e quantitativas da composição das amostras na região submicrométrica. Três amostras de cada grupo foram analisadas nas dimensões: 50x, 200x, 1000x, 2000x e 5000x. Através do MEV foi possível detectar o padrão de distribuição do tratamento de superfície ao longo dos discos. Rugosidade Média A rugosidade média (Ra) das amostras foi mensurada em rugosímetro (Mitutoyo SJ, Mitutoyo Corporation, Yokohama, Kanagawa, Japão) localizado na Faculdade de Odontologia de Araraquara, com precisão de leitura de 0,01 μm, comprimento de leitura de 2,4 mm, velocidade da ponta ativa de 0,5 mm/s e raio da ponta ativa de 5 μm. Foram realizadas três medidas em cada superfície e a média entre as leituras foi determinada como o valor da Ra (μm) de cada amostra. Todas 48 as medidas foram realizadas por um único operador. 4.5.2 Caracterização Topográfica Tridimensional Interferômetro Ótico – Nível de Resolução Micrométrico. O princípio do interferômetro é que duas ondas de luz quando conduzem juntas, interfere uma na outra. Se a crista de uma onda coincide com o vale da outro, a interferência é destrutiva e as ondas se anulam. Por outro lado, se duas cristas ou dois vales coincidem entre si, as ondulação reforçam-se mutuamente. O equipamento MicroXamTM – 100 HR/AD (PhaseShift, Tucson, USA) foi utilizado para avaliação da interferometria presente na superfície dos discos testados com área de varredura de 200X260 μm. As análises por interferometria ótica foram realizadas na Faculdade de Odontologia de Malmö, na Suécia, sob orientação da Profa. Dra. Ann Wenneberg. Dez diferentes pontos foram escolhidos aleatoriamente e 3 discos de cada grupo foram testados. Totalizando 30 aferições por grupo. Com a finalidade específica de determinar os padrões de rugosidade das superfícies testadas. As imagens foram processadas utilizando o software MountainMap Universal 6.2 (Digital Surf, Besanc’on, France) e erros, formas e ondas foram subtraídas das imagens utilizando um filtro Gaussiano (50x50 μm). Para este estudo, três diferentes parâmetros de rugosidade foram calculados: Sa (μm), Sdr (%) e Sds (1/μm2 ), como determinado por Wenneberg et al110. em 2000. Todas as aferições foram realizadas por um único operador. O interferômetro possui uma resolução lateral de 0,3 μm e uma resolução vertical de 0,05 nm. A faixa máxima de mensuração vertical é de 5 mm. Este instrumento é capaz de avaliar estruturas a nível micrométrico em altura e direções espaciais; e em nível subnanométrico em altura. Microscopia de Força Atômica (MFA) – Nível de Resolução Nanométrico. A caracterização da superfície em microscopia de força atômica foi utilizada para avaliar a superfície dos discos testados com uma resolução a nível nanométrico. Em contraste com o princípio do interferômetro, as medições realizadas pelo MFA requerem contato entre a sonda utilizada para varredura e a superfície da amostra. O princípio da MFA depende do modo de operação 49 selecionado: contato, não contato e modo intermitente. Neste trabalho o modo - não contato- foi o utilizado. Um cantilever é ligado a um cristal piezo que oscila na direção vertical no intervalo de 100-400 kHz. Quando a ponta se aproxima da amostra, a oscilação do cantilever é amortecida. A oscilação do cantilever é monitorada por um fotodiodo. O microscópio possui uma resolução lateral de 2 nm e uma resolução vertical em nível atômico, como por exemplo: nível picométrico. A análise por MFA (XE-100, Park Systems Corp, Suwon, Korea) foram realizadas na Faculdade de Odontologia de Malmö, na Suécia, sob orientação da Profa. Dra. Ann Wenneberg. O modo de avaliação selecionado foi o modo não contato, utilizando sondas específicas para este modo (Digital Instruments, Santa Barbara, USA), com comprimentos de cantilever de 125nm e frequência de ressonância de 290kHz. Áreas de digitalização de 1,0 X 1,0 μm foram definidas como padrão e selecionadas. As imagens obtidas foram capturadas em uma velocidade de escaneamento de 0,20 Hz e analisadas utilizando o software MountainMap Universal 6.2 (Digital Surf, Besanc’on, France). 10 diferentes pontos foram escolhidos aleatoriamente e 3 discos de cada grupo foram testados. Totalizando 240 imagens escaneadas. Erros, formas e ondas foram subtraídas das imagens utilizando um filtro Gaussiano (0,25x025 μm). Seleção do Filtro Os dados brutos obtidos pelos equipamentos utilizados para análise topográfica foram processados para separação da forma, ondulação e rugosidade de cada imagem obtida. Um filtro passa-alta Gaussiano foi utilizado para as aferições obtidas tanto por interferometria ótica quanto por microscopia de força atômica. O filtro Gaussiano é adequado para superfícies lisas que apresentem recursos avançados. Nas medidas realizadas por MFA pequenas ondulações superficiais podem, as vezes, dominados pelos ruídos do scanner, criar medidas observáveis entre as linhas de varredura. Um método de ajuste denominado least mean square (LMS) subtrai uma função polinomial - função dada por um polinômio - de cada linha de varredura individual com uma grau polinomial definido. Portanto, neste caso, nas medições por MFA, uma terceira ordem de ajustes de correção foi selecionada, como determinado por Wenneberg et al.110 (2000). 50 Parâmetros topográficos tridimensionais: Os parâmetros de rugosidade tridimensionais podem ser separados em quatro diferentes grupos dependendo das características da superfície que eles quantificam, de acordo com Stout et al.95(1993). 1. Parâmetros de amplitude 2. Parâmetros espaciais 3. Parâmetros híbridos 4. Parâmetros funcionais Neste presente estudo, um parâmetro de amplitude, um híbrido e um espacial foram utilizados para caracterizar a rugosidade das superfícies testadas, como foi recomendado por Wennerberg e Albrektsson110 em 2000. Sa – parâmetro de amplitude – corresponde ao desvio médio aritmético em altura, e representa a área de superfície; Sdr – parâmetro híbrido – representa a relação entre a área da superfície tratada e uma referência plana e Sds – parâmetro espacial - que equivale ao número de picos por unidade de área. 4.6 Avaliação da Biocompatibilidade (Modelo Animal – in vivo) A realização desta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr-UNESP) - processo número: CEUA n. 41-2014 (Anexo). 4.6.1 Modelo animal, Anestesia e Cuidados No protocolo experimental utilizou-se 48 coelhos, machos, adultos (New Zealand) com peso médio de 3 à 4 kg, mantidos no Biotério da Faculdade de Odontologia de Araraquara localizado no Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, em gaiolas individuais, com acesso ad libitum à água e à ração. Um período de 30 dias para aclimatação dos animais nas instalações do biotério foi respeitado. Os animais foram anestesiados com uma combinação de quetamina (Quetamina Agener®; Agener União S.A. - 0,35 ml/Kg) e xilazina 2% (Dopaser® 51 Laboratórios Calier S.A. Barcelona, Espanha - 0,5 ml/Kg). Em seguida, os animais receberam anestesia local (Scandicaine® 2% Spécialités Septodont, Sain - Maur, França) para inibir qualquer estímulo doloroso local e também para permitir uma vasoconstrição periférica diminuindo o sangramento local, facilitando assim, o procedimento cirúrgico para instalação dos discos. Antes da cirurgia, as áreas a serem operadas foram submetidas à tricotomia e limpas com solução antisséptica de PVPI a 9%. Após a cirurgia, os animais receberam uma dose única de antibiótico (Pentabiótico®, Wyeth-Whitehall Ltda, São Paulo, Brasil - 0,1 ml/Kg) e de analgésico Tramal (0,1 ml/kg como medicação pós-operatória). A cicatrização do leito cirúrgico foi examinada diariamente. Peso, comportamento e condições de saúde geral foram monitorados durante todo o estudo. Após 2, 4 e 8 semanas os animais foram sacrificados por aprofundamento anestésico. 4.6.2 Procedimento Cirúrgico A sequência cirúrgica está representada na Figura 8. Inicialmente, após anestesia, tricotomia e assepsia na área selecionada (A e B), foram realizadas incisões bilaterais de aproximadamente 5 cm de comprimento na face interna da pata traseira do coelho, logo abaixo do joelho (B e C). Em seguida, foi realizada dissecção delicada (D e E) e a superfície óssea da metáfise tibial foi exposta (F), para que os leitos cirúrgicos fossem preparados. Para marcar os locais de inserção dos discos, duas marcações de orientação extremamente superficiais foram criadas utilizando uma broca trefina (8 mm de Ø) (G), posteriormente uma escavação plana de 0,2 mm de profundidade foi criada (H) para que os discos pudessem ser encaixados e fixados, sem que os mesmo se deslocassem, uma vez que anatomicamente a tíbia não favorece a acomodação dos discos, pequenas perfurações (I) foram realizadas para que houvesse nutrição na área cirúrgica (J). Cada animal recebeu quatro discos (dois em cada metáfise tibial). Os discos foram selecionados por um critério de aleatorização. Para cada grupo de animais foram testados todos os grupos experimentais – Ti cp anodizado, Ti6Al4V polido, Ti6Al4V anodizado, Ti35Nb5Zr polido, Ti35Nb5Zr anodizado Ti35Nb10Zr polido, Ti35Nb10Zr anodizado. Ti cp neste estudo foi utilizado como controle. Cada animal recebeu ao 52 todo quatro discos de titânio, dois discos em cada metáfise tibial. Para isso foram utilizados dois animais por grupo, sendo um total de oito grupos e dezesseis animais por período. Houve três períodos de sacrifício (2, 4 e 8 semanas), totalizando 48 animais. Para garantir a estabilidade dos discos sobre a tíbia, foram confeccionados dispositivos em silicone, no formado dos discos (Figura 7), que funcionaram como arcabouço, e este conjunto – arcabouço/disco - foram fixados utilizando fios de sutura cirúrgico em aço inoxidável 316L, não absorvível, estéril de construção monofilamentar (Aciflex® – Johnsson & Johnsson, Ethicon), transpassados pela tíbia e pela fíbula (K) e estabilizados para que o disco se mantivesse em posição durante todos os períodos experimentais (L e M). Em seguida, os tecidos moles foram suturados plano a plano, o primeiro plano com fio de poliglactina (Vycril 4-0, Johnsson & Johnsson) (N) e o segundo com fio de nylon (Nylon 4-0, Johnsson & Johnsson) (O)82-83. Figura 7 - Dispositivos em silicone, no formado dos discos, que funcionaram como arcabouço para estabilização dos discos sobre a metáfise tibial Fonte: Elaboração própria 53 Figura 8 – Sequência do procedimento cirúrgico: tricotomia e assepsia na área selecionada (A); anestesia local (B); incisões bilaterais em dois planos de aproximadamente 5 cm de comprimento na face externa (C) e interna da pata traseira (D); dissecção delicada (E) e exposição da metáfise tibial (F); marcação dos locais de inserção dos discos com broca trefina (G); escavação plana para estabilização dos discos (H); perfurações para nutrição da área cirúrgica (I) e (J); fios de aço cirúrgico transpassados pela tíbia e pela fíbula (K); inserção e estabilização dos discos (L) e (M); sutura dos tecidos moles plano a plano (N) e (O). Fonte: Elaboração própria A B C D E F G H I J K L M N O 54 Após 2, 4 e 8 semanas, os animais foram sacrificados por aprofundamento anestésico. As peças anatômicas foram limpas, e os tecidos moles ao redor dos discos foram removidos. As peças foram inseridas em recipientes hermeticamente fechados, armazenadas em formol 10%, acondicionadas em embalagens acreditadas pelo Ministério da Agricultura do Brasil e enviadas para a Suécia para análise na Faculdade de Odontologia de Malmö. 4.7 Método de Avaliação da Resposta Óssea - Histometria Um total de 192 amostras foram preparadas para a análise histológica. Os tecidos moles circundantes foram removidos e as peças anatômicas foram imersas inicialmente em paraformaldeído 4%, seguindo o processo de desidratação das espécimes, como inicialmente descrito por Donath28 (1993). Os blocos foram desidratados em uma série crescente de etanol (70%, 80%, 95% e álcool absoluto), e mantidos a vácuo, respeitando-se período de troca de 10 dias entre cada processo de desidratação e mantidos em temperatura ambiente. Posteriormente a etapa de desidratação, as peças foram incluídas em resina fotopolimerizável (Technovit 7200 VLC, Kultzer Heraus GmbH & CO., Wehrheim, Alemanha) também respeitando-se uma série crescente de infiltração ( 30% resina – 70% álcool absoluto, 50% resina – 50% álcool absoluto, 70% resina – 30% álcool absoluto, 100% Resina – primeira fase, 100% Resina – segunda fase), sempre mantidos a vácuo, em oscilação, respeitando-se um período de 10 dias entre cada processo de inclusão; e os frascos mantidos preferencialmente com temperaturas em torno de 5 graus. Após este processo inicial de inclusão, as peças foram posicionadas em formas específicas, incluídas em nova resina (Technovit 7200 VLC, Kultzer Heraus GmbH & CO., Wehrheim, Alemanha) e polimerizadas em luz branca por 2 horas e luz azul por 4 horas (Histolux – Exact). A etapa seguinte correspondeu aos cortes e polimentos envolvidos na preparação das amostras descalcificadas com as amostras in situ. Os blocos de resina foram divididos em um único ponto mais central, com a finalidade de avaliarmos a porção com maior contato osso-disco, devido a anatomia da tíbia dos animais. O corte foi realizado com uma serra própria (Exakt Apparatebeau, Hamburgo, Alemanha) para o processo. Eventuais irregularidades do processo de corte foram removidas com a finalidade de obtenção de uma superfície mais uniforme após o corte. Em uma politriz (Exakt 400 CS da Exakt), uma lixa d’água de 55 carbeto de silício com granulação #80 foi utilizada inicialmente para arredondar as bordas das amostras e remover os excessos de resina. Em seguida, as amostras foram fixadas em lâmina de vidro. Uma mistura de Technovit 4000 (2 partes de Sirup I e 1 parte de Sirup II + Pó) foi colocada sobre cada amostra e fixada em uma lâmina de acrílico específica e mantida a vácuo por 10 minutos. Após este processo, as superfícies das amostras foram polidas novamente na politriz com lixa d’água de carbeto de silício com granulação #800 sobre uma oscilação constante e velocidade constante para obtermos uma superfície nivelada. A seguir, a superfície de cada amostra foi limpa com álcool absoluto e deixou-se cada amostra secar completamente. A etapa seguinte consistiu da aferição da espessura deste “sanduíche” com auxílio de paquímetro digital. Um primer específico - ou qualquer solução à base de silicone para proteger a superfície metálica e reduzir o risco de descolamento da amostra de metal - foi aplicado apenas sobre cada disco e 5 minutos de espera foram necessários para a completa secagem do primer para que assim, a cola (Technovit 7210 VLC) fosse aplicada. Aplicou-se uma camada fina de cola sobre a superfície de cada amostra e em seguida cada bloco foi levado para a polimerização em luz azul por 15 minutos. A espessura da cola foi calculada com auxílio de paquímetro digital. Em seguida, os blocos foram cortados novamente e foi reduzido em uma lâmina com espessura entre 100 a 300 μm, aproximadamente. Com o objetivo de atingir a espessura desejada, o desgaste e o polimento das lâminas foram realizados empregando-se lixas de carbeto de silício de granulometria decrescente (800, 1000, 1200, 2500), verificando a espessura que foi desgastada com auxílio de um paquímetro digital. A espessura final para este estudo foi de 40 μm de modo a não ocorrer sobreposição de camadas celulares. Para garantir boa penetração do corante, uma leve descalcificação das lâminas foi feita colocando-se as mesmas em solução de H2O2 30% por 15 a 30 minutos com o objetivo de remover poucos micrômetros de cálcio da secção, permitindo melhor penetração do corante dentro do osso. As amostras foram novamente lavadas em água corrente e seca com papéis absorvíveis. A coloração em si foi realizada colocando as amostras em frascos contendo Azul de Toluídina, como sugerido por Donath em 1982, por 40 minutos. Após o tempo de coloração as amostras foram levadas em água corrente e deixadas para secar por 24 horas. No dia seguinte, as amostras foram limpas com Xylen (Histolab Products AB) e uma pequena gota de Pertex (Monteringsmedel Pertex® - Histolab Products AB) foi aplicada sobre a superfície das amostras para, 56 em seguida, a lâmina de cobertura ser aplicada. A lâmina então foi limpa com etanol, para remoção de excesso de resina ou cola. Inspeções qualitativas foram realizadas com auxílio de microscópio ótico (Nikon Eclipse 80i – Câmera DS-Ri2, sensor de imagem CMOS colorido FX-