GRACIELE FERNANDA DE SOUZA PINTO FITOTOXICIDADE E ANÁLISE FITOQUÍMICA A PARTIR DE FOLHAS DE CINCO ESPÉCIES DE CERRADO ASSIS 2015 GRACIELE FERNANDA DE SOUZA PINTO FITOTOXICIDADE E ANÁLISE FITOQUÍMICA A PARTIR DE FOLHAS DE CINCO ESPÉCIES DE CERRADO Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Letras de Assis – UNESP – Universidade Estadual Paulista para a obtenção do título de Mestra em Biociências (Área de Conhecimento: Caracterização e Aplicação da Diversidade Biológica). Orientadora: Dra. Rosana Marta Kolb ASSIS 2015 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da F.C.L. – Assis – UNESP Pinto, Graciele Fernanda de Souza P659f Fitotoxicidade e análise fitoquímica a partir de folhas de cinco espécies de Cerrado /Graciele Fernanda de Souza Pinto. Assis, 2015 67 f. ; il. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Ciências e Letras de Assis - Universidade Estadual Paulista. Orientador: Drª Rosana Marta Kolb 1. Alelopatia. 2. Germinação. 3. Metabolismo secundário. 4. Fitoquímica. 5. Ecofisiologia vegetal. I.Título. CDD 581.1 Àqueles que me esperam, de braços abertos, depois de meus cansaços e comemoram comigo as minhas conquistas. Dedico a minha mãe Maria Aparecida, e aos meus irmãos Claudio e Cristiane. Ao meu pai Sebatião Braz (in memoriam), que me ensinou a amar e o sentido da vida. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a meu Deus e Pai por todas as coisas boas que Ele permitiu em minha vida, por que sei que o bem apenas dele é que vem. O que vivi de ruim em minha vida, foi por ignorância, estupidez e escolha minha. Mas minha felicidade eu só devo ao Pai! Agradeço a paciência e o entendimento de todas as pessoas que amo, pela minha ausência, ausência que não escolhi, mas necessária na busca pelos meus sonhos. Agradeço a minha família. A pessoa mais importante da minha vida, a razão da minha existência e dos meus sonhos, minha base, meu lar e amor, minha mãe Maria. Ao meu pai Sebastião (in memoriam) por tudo que sou e que tenho. Aos meus irmãos Claudio e Cristiane, pelo apoio em tantas horas e pela confiança; as tantas vitórias de minha vida, não seriam possíveis sem vocês. Aos meus sobrinhos José, Carol, Duda, Carla e Camila, por quem quero ser cada vez melhor. À Dra. Rosana Marta Kolb, minha orientadora, por me guiar na busca pelo conhecimento científico, mas principalmente pela oportunidade e por me ensinar a acreditar. Aos companheiros e amigos de laboratório, Raquel, Carina, Henrique, Lucas, Luiz Felipe, Milena, Suellen e Thaís, por toda ajuda na execução deste trabalho, pelas tantas conversas agradáveis, pelos risos e cantos, por se permitirem fazer parte da minha história. Agradecimento especial ao meu amigo Jonathan por ter sido meu ombro, meu amigo em tantas horas, minha gratidão, por sempre estar lá quando eu precisava. As minhas amigas Mírian, Vanessa, Yara e Veronica, por terem contribuído de alguma forma com este trabalho, mas principalmente por serem minhas companheiras de tantas horas. Aos Professores: Dra. Catarina dos Santos, Dra. Renata Giassi Udulutsch, Dr. Regildo Márcio Gonçalves da Silva, Dr. Luis Octávio Regasini e Dr. Luiz Fernando Rolim de Almeida, pelas leituras atentas, críticas e sugestões que colaboraram para a melhor realização deste trabalho. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, Escritório de Pesquisa e Biblioteca da Faculdade de Ciências e Letras de Assis, pela atenção e disponibilidade quando solicitados. À FAPESP, pelo auxilio financeiro que permitiu minha dedicação a esta dissertação, e às valiosas contribuições de seus pareceristas. “Javé, o rei se alegra com tua força, e como exulta com tua vitória! Concedeste o desejo do seu coração, e não lhe negaste o pedido de seus lábios.” (Salmo 21) PINTO, Graciele Fernanda de Souza. Fitotoxicidade e análise fitoquímica a partir de folhas de cinco espécies de Cerrado. 2015. 67 f. Dissertação (Mestrado em Biociências). – Faculdade de Ciências e Letras, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Assis, 2015. RESUMO A alelopatia é usualmente definida como qualquer processo que envolva a produção de metabólitos secundários, por plantas e/ou microrganismos, que influenciam o desenvolvimento de sistemas biológicos. Há uma imensa variedade de compostos com este tipo de atividade, sendo sua produção alterada por fatores ambientais. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito fitotóxico de extratos aquosos de folhas de Byrsonima intermedia, Gochnatia polymorpha, Luehea candicans, Miconia chamissois e Qualea cordata, coletadas em diferentes períodos do ano (estação seca e chuvosa), sobre a germinação e o crescimento inicial de uma monocotiledônea, Zea mays L. (milho), e de uma eudicotiledônea, Cucumis sativus L. (pepino). Para tanto, foram realizados experimentos de germinação e crescimento inicial com extratos das cinco espécies de Cerrado, sendo avaliada a porcentagem de germinação, a velocidade de germinação e o sincronismo das sementes-alvo bem como o comprimento da raiz primária, da parte aérea e o número de raízes secundárias das plântulas-alvo. De modo geral, tanto a germinação quanto o crescimento inicial foram alterados pelos extratos analisados. Isto foi observado tanto para milho quanto para pepino. Além disso, a sazonalidade climática influenciou na atividade fitotóxica dos extratos, entretanto, os efeitos variaram de acordo com a espécie avaliada. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que os extratos aquosos foliares das espécies estudadas são fitotóxicos e que a sazonalidade climática influencia na sua fitotoxicidade. Palavras-chave: Alelopatia. Germinação. Metabolismo secundário. Fitoquímica. Ecofisiologia vegetal. PINTO, Graciele Fernanda de Souza. Phytotoxicity and phytochemical analysis of leaves from five species of Cerrado. 2015. 67 f. Dissertation (Master’s degree in Biosciences). – Faculty of Sciences and Languages of Assis, São Paulo State University, Assis, 2015. ABSTRACT Allelopathy is usually defined as any process involving the production of secondary metabolites by plants and/or microorganisms that influence the development of biological systems. There is a great variety of compounds with this type of activity, being their production altered by environmental factors. In this study aimed to evaluate the phytotoxic effect of aqueous extracts of leaves of Byrsonima intermedia, Gochnatia polymorpha, Luehea candicans, Miconia chamissois and Qualea cordata, collected in different seasons (dry and rainy seasons), on germination and early growth of a monocot, Zea mays L. (corn), and a eudicot, Cucumis sativus L. (cucumber). Thus, we carried out germination and early growth experiments with extracts of five species of Cerrado, being evaluated the germination percentage, the germination speed and the synchronism of the target seeds and the primary root length, shoot and the number of secondary roots of target seedlings. In general, both the germination and the early growth were altered by analyzed extracts. This was observed for both maize and cucumber. In addition, the seasonality influenced in the phytotoxic activity of extracts, however the effects varied with the species studied. According to the results, it is concluded that the leaf aqueous extracts of species studied are phytotoxic and that the seasonality influences in their phytotoxicity. Keywords: Allelopathy. Germination. Secondary metabolism. Phytochemistry. Plant ecophysiology. LISTA DE ILUSTRAÇÕES INTRODUÇÃO Figura 1. Ciclo biossintético dos metabólitos secundários segundo modelo proposto por Santos (2010) ................................................................................ 12 Figura 2. Mecanismos de liberação dos aleloquímicos...................................... 13 Figura 3. Biomas brasileiros (escala 1:25 000 000, IBGE, 2014)....................... 15 Figura 4. Fruto e arbusto de Byrsonima intermedia A. Juss............................... 17 Figura 5. Face adaxial e abaxial de folhas de Gochnatia polymorpha (Less) Cabr..................................................................................................................... 17 Figura 6. Arbusto com fruto de Luehea candicans Mart..................................... 18 Figura 7. Arbusto com fruto de Miconia chamissois Naud.................................. 19 Figura 8. Arbusto de Qualea cordata Spreng..................................................... 20 LISTA DE TABELAS Efeito da sazonalidade sobre o potencial fitotóxico de cinco espécies nativas do Cerrado Tabela 1. Rendimento dos extratos aquosos de folhas de espécies do Cerrado coletadas na estação seca e chuvosa................................................................. 46 Tabela 2. Valores de pH e potencial osmótico dos extratos aquosos................. 46 Tabela 3. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata na germinação de sementes de milho. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão……………………..................................................................................... 47 Tabela 4. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata na germinação de sementes de pepino. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão…………………………….......................................................................... 48 Tabela 5. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata no crescimento inicial de plântulas de milho. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão……………………..................................................................................... 49 Tabela 6. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata no crescimento inicial de plântulas de pepino. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão…….……………….................................................................................... 50 Tabela 7. Triagem fitoquímica de extratos aquosos de folhas de Byrsonima intermedia (EB); Gochnatia polymorpha (EG); Luehea candicans (EL); Miconia chamissois (EM) e Qualea cordata (EQ); correspondente à estação seca (ES) e estação chuvosa (EC)…………………………................................................... 51 SUMÁRIO INTRODUÇÃO..................................................................................................... 11 1 Efeito da sazonalidade sobre o potencial fitotóxico de espécies nativas do Cerrado.......................................................................................................... 21 1.1 Resumo.......................................................................................................... 22 1.2 Introdução...................................................................................................... 23 1.3 Material e métodos......................................................................................... 24 1.4 Resultados..................................................................................................... 27 1.5 Discussão....................................................................................................... 33 1.5 Referências.................................................................................................... 39 CONCLUSÕES.................................................................................................... 52 REFERÊNCIAS................................................................................................... 54 APÊNDICE........................................................................................................... 59 11 INTRODUÇÃO Evidências e observações sobre interações entre plantas datam mais de dois mil anos, especulações sobre estas interações foram expostas por Theophrastus (300 a.C.), Virgílio (70-19 a.C.) e Plínio “o velho” (23-79 a.C.); “interações maléficas” entre os vegetais foram descritas no primeiro tratado sobre agricultura que se conhece (WILLIS, 2007). O pesquisador Hans Molisch, em 1937, cunhou a palavra alelopatia, derivada de duas palavras gregas “allelon” e “pathos”, que significam “mútuo” e “prejuízo”, respectivamente (EINHELLIG, 1995). A alelopatia como campo de pesquisa apresentou considerável progresso, embora lento, em meados de 1970. Crescimento significativo em termos de publicações foi evidenciado após a fundação da Sociedade Internacional de Alelopatia em 1994 (DAKSHINI et al., 1999). Esta sociedade, em 1996, definiu a alelopatia como sendo qualquer processo que envolve produção de metabólitos secundários por plantas, algas, bactérias ou fungos que influencia o crescimento e o desenvolvimento de sistemas agrícolas e biológicos. Os metabólitos secundários são compostos químicos que quando possuem propriedade alelopática são denominados aleloquímicos. Os efeitos destes compostos podem ser intra e interespecíficos, e podem proporcionar vantagem ao organismo produtor (doador) como vantagem ou desvantagem ao organismo receptor. Estudos descrevem que os aleloquímicos estão presentes em todas as partes das plantas: nas raízes (VILES; REESE, 1996; TSANUO et al., 2003), caules (SMITH, 1990; GATTI et al., 2004), folhas (OLIVEIRA et al., 2004; OLIVEIRA; CAMPOS, 2006), flores (BALLESTER et al., 1982; TEFERA, 2002), frutos (NOGUSHI; TANAKA, 2004; OLIVEIRA et al., 2004), sementes (NOOR et al., 1995) e pólen (MURPHY, 2000). Sabe-se que todos os órgãos das plantas possuem potencial para armazenar aleloquímicos, entretanto, a quantidade e os mecanismos pelos quais as substâncias são liberadas ao meio diferem de espécie para espécie (FRIEDMAN, 1995). Os metabólitos secundários, por muito tempo, foram considerados produtos de excreção vegetal, que possuíam algumas vezes estrutura química e propriedades biológicas interessantes. Atualmente, no entanto, são conhecidos muitos dos metabólitos que estão envolvidos nos mecanismos de adequação do seu produtor 12 ao ambiente. Muitas das substâncias pertencentes ao metabolismo secundário já tiveram suas funções reconhecidas, por exemplo, a defesa contra herbívoros e microrganismos, a proteção contra os raios UV, a atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes e a participação em processos alelopáticos. Assim, esses metabólitos, que podem ou não ser liberados no meio externo, frequentemente apresentam atividades biológicas interessantes com importância comercial para a área farmacêutica, alimentar, agronômica, de perfumaria, entre outras (SANTOS, 2010). A grande diversidade de metabólitos, originados de plantas, que podem ser utilizados como fonte de novas substâncias, se deve principalmente as diversas rotas de origem no metabolismo das plantas (OLIVEIRA, 2009). A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do metabolismo da glicose, através de dois intermediários principais, o ácido chiquímico e o acetato (Figura 1). Figura 1 – Biossíntese dos metabólitos secundários. Fonte: Santos (2010). Os compostos químicos sintetizados pelas plantas podem tornar-se disponíveis no ambiente de maneiras variadas. O modo de liberação desses 13 compostos para o meio é determinado principalmente pela localização e natureza dos compostos. Assim, os aleloquímicos podem ser liberados por meio de exsudação, volatilização, lixiviação e/ou decomposição dos resíduos (Figura 2) (NUÑEZ et al., 2006). A concentração, taxa de fluxo, idade e estágio fisiológico da planta, clima, estação do ano e condições ambientais são fatores que determinam a toxicidade e/ou concentração desses compostos na planta e/ou no ambiente (GNIAZDOWSKA; BOGATEK, 2005). Figura 2 – Mecanismos de liberação dos aleloquímicos. Fonte: SÁNCHEZ (2002). Existem duas hipóteses sobre a transferência dos aleloquímicos da planta doadora para a planta receptora. Os aleloquímicos podem ser transferidos por contato célula-célula ou através do contato físico da raiz da planta alvo com o composto alelopático, sendo essa última à forma de absorção mais importante (INDERJIT; DUKE, 2003). Bioensaios de laboratório que visem novos compostos ativos, como herbicidas, por exemplo, devem ser padronizados e reprodutíveis. As espécies selecionadas como alvo devem apresentar germinação rápida e uniforme e seu crescimento deve ser relativamente rápido. Dentre muitas outras, as espécies Lactuca sativa L. (alface) e Agrostis stolonifera L. (gramínea) são exemplos de eudicotiledônea e monocotiledônea, respectivamente, utilizadas para determinar a seletividade das substâncias testadas (DAYAN; DUKE, 2006). Outros fatores também devem ser observados em bioensaios, tais como o substrato utilizado, a 14 concentração total de compostos químicos, o tamanho da semente-alvo (WEIDENHAMER et al., 1989), o potencial osmótico e pH do extrato avaliado (DAYAN et al., 2009). Todo bioensaio é embasado na habilidade de medir parâmetros que respondam a presença do composto testado. Assim, os parâmetros adotados são: a germinação, o comprimento da parte aérea e da parte radicular (DAYAN et al., 2000). Os aleloquímicos podem afetar muitos processos fisiológicos (SILVA et al., 2014). Modificações do crescimento e desenvolvimento vegetal podem ser explicadas através de alterações moleculares, ultraestruturais e de processos fisiológicos e bioquímicos ocasionados em resposta aos aleloquímicos (GNIAZDOWSKA; BOGATEK, 2005). O Brasil possui uma das maiores biodiversidades do mundo, sendo importante fonte de exploração na busca por novos compostos com propriedades alelopáticas e/ou fitotóxicas. Dentre seus biomas, o Cerrado é o segundo maior em extensão (Figura 3). O Cerrado possui 204 milhões de hectares, compreendendo cerca de 25% do território brasileiro, onde as plantas são fortemente influenciadas pelas limitações do regime de chuvas, e pelas características do solo, que é pouco fértil (AVIDOS; FERREIRA, 2000). O Cerrado apresenta grande diversidade faunística e florística, em torno de 30% da diversidade do país (PAGOTTO et al., 2006), ameaçada por causa da intensa ocupação de suas áreas, pela agricultura e invasão urbana (AVIDOS; FERREIRA, 2000). Diante da rápida redução das áreas do Cerrado (Figura 3) e sua grande diversidade florística, poucos estudos foram realizados sobre a atividade alelopática/fitotóxica de plantas nativas na germinação e desenvolvimento de plântulas de outras espécies (PERIOTTO et al., 2004). Neste contexto, não foram encontradas informações na literatura sobre o potencial fitotóxico das espécies avaliadas neste estudo; poucas informações foram encontradas sobre as principais classes de compostos químicos que ocorrem nas mesmas. 15 Figura 3 – Biomas brasileiros (escala 1:25 000 000). Fonte: IBGE (2014). Estudos realizados com extratos obtidos a partir de folhas demonstraram que diversas espécies do Cerrado apresentam compostos com propriedades alelopáticas, dentre algumas delas, Stryphnodendron obovatum (SALGADO et al., 2013), Anadenanthera falcata, Davilla elliptica, Miconia albicans, Siparuna guianensis, Xylopia aromatica (GATTI et al., 2007), Qualea grandiflora, Ouratea spectabilis, Pouteria ramiflora, Stryphnodendron adstringens (SILVA; AQUILA, 2006) e Aristolochia esperanzae (GATTI et al., 2004). Apesar da produção desses compostos ser de ordem genética, diversos fatores ambientais podem alterar o metabolismo secundário das plantas. Dentre esses fatores, a sazonalidade climática, trazendo consigo diferenças de temperatura, luminosidade e de disponibilidade hídrica, pode causar variações no conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários. Além da 16 quantidade, a natureza dos compostos produzidos pode não ser igual durante todo o ano, sendo dependente das condições ambientais (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Considerando a sazonalidade climática do Cerrado, o déficit hídrico é o fator mais relevante. Processos fisiológicos críticos como fotossíntese, mobilização de reservas e crescimento vegetal podem ser alterados sob estresse hídrico, desencadeando alterações no metabolismo secundário (TAIZ; ZEIGER, 2008). O estresse hídrico pode alterar a produção de vários tipos de metabólitos secundários, dependendo do período em que a seca ocorre e se ela é de curta ou longa duração (GERSHENZON, 1984; HORNER, 1990; JUNG, 2004). Assim, em estudos com plantas de Cerrado, a sazonalidade deve ser levada em conta ao se avaliar seu potencial alelopático e/ou fitotóxico. Estudos tem comprovado que muitas das plantas utilizadas na medicina popular apresentam potencial alelopático (FUJII et al., 2003; ALVES et al., 2011; SILVESTRE et al., 2013), indicando que estas podem ser boas candidatas a serem estudadas dentre as espécies que ocorrem no Cerrado. Dentre as espécies de Cerrado, a espécie Byrsonima intermedia A. Juss. (Malpighiaceae) (Figura 4) é conhecida popularmente por canjica ou murici. B. intermedia é um arbusto grande de até 4 m de altura, os ramos partindo do xilopódio robusto. Suas folhas são simples, opostas, subsésseis, obovais ou oblanceoladas com base aguda a cuneada, decorrente no pecíolo, as folhas possuem ápice arredondado, às vezes obtuso, acuminado ou emarginado. Suas flores são amarelas, dispostas em racemos densos, geralmente terminais, com frutos do tipo drupa, sendo globosa e amarela. Esta espécie ocorre em fisionomias campestres de Cerrado, em cerrado típico e em cerradão, em todo o Estado de São Paulo (DURIGAN et al., 2004). As folhas de B. intermedia são utilizadas na medicinal popular no combate de desordens gastrointestinais (SANTOS et al., 2012a). As principais classes de compostos químicos descritas para a espécie Byrsonima intermedia são: esteroides, flavonoides e taninos (SANNOMIYA et al., 2007; MOREIRA et al., 2011). 17 Figura 4 – Fruto e arbusto de Byrsonima intermedia A. Juss. Fonte: FLORA DO CERRADO (2014); ÁRVORES DE SÃO PAULO (2014). A espécie Gochnatia polymorpha (Less) Cabr. (Figura 5) pertencente à família Asteraceae, de nome popular cambará ou candeia, é uma árvore de médio porte, tronco e ramos tortuosos, casca muito espessa com fendas sinuosas, entrelaçadas, seus ramos são branco-tomentosos quando jovens. Suas folhas são simples, alternadas, ovais, lanceoladas ou oblongo-lanceoladas, com base arredondada e ápice agudo, com pilosidade esbranquiçada na face inferior, discolores. As flores são pálidas reunidas em capítulos, dispostos em panículas amplas e o fruto aquênio viloso e quase cilíndrico. Esta espécie ocorre em cerrado típico, em cerradão e em outras formações florestais (DURIGAN et al., 2004). Suas folhas são utilizadas na medicina popular para a confecção de chás e xaropes administrados contra gripes, resfriados, tosses e outras afecções do sistema respiratório (STEFANELLO et al., 2006). A família Asteraceae é o maior grupo das Eudicotiledôneas (CUNHA; BORTOLOTTO, 2011); para a espécie foram descritos sesquiterpenos, triterpenos, ácidos fenólicos e flavonoides (FARIAS et al., 1984; MOREIRA et al., 2000). Figura 5 – Face adaxial e abaxial de folhas de Gochnatia polymorpha (Less) Cabr. Fonte: FLORA DIGITAL (2014). 18 Popularmente conhecida como açoita-cavalo, a espécie Luehea candicans Mart. (Tiliaceae) (Figura 6) é uma árvore de casca áspera, finamente sulcada, com ramos pubescentes. Suas folhas são simples, alternadas, tri-nervadas, ovais a largamente ovais, de base obtusa a arredondada, ápice agudo a acuminado, a margem é irregularmente serreado-dentada, a face inferior recoberta por pilosidade esbranquiçada. Suas flores são brancas, grandes, estames muito longos e numerosos, em inflorescência terminal com uma a três flores. O fruto cápsula oblonga, angulosa, 5-locular, escura, cerca de quatro centímetros de comprimento. Ocorre em cerradão e na floresta estacional semidecidual (DURIGAN et al., 2004). A espécie L. candicans também possui registros e indicações de uso na medicina popular. Sua casca é indicada para o tratamento de reumatismo e contra disenteria. Em forma de infusão possui efeito adstringente na limpeza de úlceras internas e feridas. Suas folhas e casca são utilizadas por índios de várias etnias nos estados do Paraná e Santa Catarina para descolorir o cabelo, no tratamento de bronquite, no combate aos vermes, na cura do câncer, gastrite e má digestão (CARVALHO, 2008). Os principais constituintes químicos encontrados em L. candicans foram triterpenos, esteroides, flavonoides e lignana glicosilada (SILVA et al., 2012). Figura 6 – Arbusto com fruto de Luehea candicans Mart. Fonte: KEW ROYAL BOTANIC GARDENS (2014a). Espécie lenhosa típica do estado de São Paulo, a Miconia chamissois Naud. (Melastomataceae) (Figura 7) é conhecida popularmente como folha-de-bolo, é um arbusto lenhoso, de até 3 m de altura, possui ramos obtusos, tetrágonos, glabros. Suas folhas são simples, opostas cruzadas, curto-pecioladas, ovado-elípticas, base arredondada, aguda ou atenuada, glabras, nervuras acródromas supra-basais. Suas flores são brancas pequenas, de cálice viscoso, dispostas em panículas terminais 19 grandes e piramidais. O fruto é baga subglobosa vermelha a preta, cerca de 1 cm de diâmetro. M. chamissois ocorre em terrenos permanentemente úmidos, especialmente em mata de brejo e mata-galeria (DURIGAN et al., 2004). A espécie apresenta potencial antimicrobiano; seu extrato metanólico inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus, Bacilus cereus e de Candida albicans (BARROS et al., 2006). Em outro gênero da família foi descrito o isolamento das seguintes classes de compostos químicos: fitoesteroides, triterpenos, flavonoides, taninos e benzoquinonas (SANTOS et al., 2012b). Figura 7 – Arbusto com fruto de Miconia chamissois Naud. Fonte: KEW ROYAL BOTANIC GARDENS (2014b). A espécie Qualea cordata Spreng. (carvãozinho ou dedaleira-preta) (Figura 8), pertencente à família Vochysiaceae, é uma árvore de casca espessa, com fendas sinuosas, gerando cristas entrelaçadas. Suas folhas são simples, opostas, sésseis ou subsésseis, ovais, base cordada, ápice agudo a acuminado, glabras em ambas as faces, com a margem levemente ondulada. As flores são brancas, com uma pétala parcialmente vinácea, dispostas em racemos terminais ou axilares. O fruto cápsula lenhosa deiscente, ovóide, cerca de 2 cm de comprimento. A espécie ocorre em Cerrado típico e em Cerradão (DURIGAN et al., 2004). As cascas e folhas são utilizadas na medicina popular e os frutos como fonte de material corante. O pó da casca de seu tronco é indicado para a limpeza de úlceras e feridas externas, suas sementes possuem quantidades significativas de ácido láurico e o extrato de suas 20 folhas possui ação depressora sobre o sistema nervoso central, efeito analgésico e anticonvulsivo. O extrato etanólico da casca de Q. cordata exibe ação antiulcerogênica (NEGRELLE, 2011). Em outro estudo, foram identificadas flavononas na espécie Q. cordata (NETO et al., 2013). Figura 8. Arbusto de Qualea cordata Spreng. Fonte: FLORA DE MISIONES (2014). OBJETIVOS 1. Avaliar a fitotoxicidade de extrato aquoso de folhas de cinco espécies do Cerrado (Qualea cordata, Luehea candicans, Gochnatia polymorpha, Miconia chamissois e Byrsonima intermedia); 2. Avaliar a influencia da sazonalidade sobre a fitotoxicidade de extrato aquoso de folhas de cinco espécies do Cerrado (Qualea cordata, Luehea candicans, Gochnatia polymorpha, Miconia chamissois e Byrsonima intermedia); 3. Identificar as principais classes químicas de metabólitos secundários presentes nas plantas, em ambas às estações do ano. 21 1 Título do artigo Efeito da sazonalidade sobre o potencial fitotóxico de cinco espécies nativas do Cerrado Graciele Fernanda de Souza Pinto, Rosana Marta Kolb Programa de Pós-Graduação em Biociências, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Univ Estadual Paulista – UNESP. Av. Dom Antônio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil Endereço de e-mail Graciele Fernanda de Souza Pinto gracinanda@hotmail.com Rosana Marta Kolb rosanakolb@hotmail.com Endereço para correspondência Graciele Fernanda de Souza Pinto 22 1.1 Resumo Metabólitos secundários fitotóxicos produzidos por plantas vem sendo estudados como possíveis fontes de bioerbicidas. Contudo, vários fatores ambientais podem alterar o metabolismo secundário das plantas e assim, a produção destes compostos. Dentre estes fatores, a sazonalidade, trazendo diferença de disponibilidade hídrica, pode causar variações no conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários. Neste estudo, o efeito fitotóxico dos extratos aquosos de folhas coletadas na estação seca e estação chuvosa, de Byrsonima intermedia, Gochnatia polymorpha, Luehea candicans, Miconia chamissois e Qualea cordata (espécies típicas de Cerrado), foram avaliados sobre a germinação e o crescimento inicial de milho e pepino. Os parâmetros avaliados foram afetados pelos extratos de folhas coletadas em ambas as estações, tendo havido influência da sazonalidade do Cerrado sobre a fitotoxicidade dos mesmos. A triagem fitoquímica dos extratos de folhas coletadas em ambas as estações do ano permitiu a identificação de antraquinonas, triterpenoides, saponinas e taninos. Os resultados mostraram que as espécies estudadas têm potencial fitotóxico e que a sazonalidade do Cerrado deve ser considerada em estudos que buscam avaliar a fitotoxicidade de espécies deste bioma. Palavras-chave Alelopatia; Metabolismo secundário; Triagem fitoquímica; Extratos aquosos. 23 1.2 Introdução Os produtos naturais biologicamente ativos são fontes para novas estruturas químicas, pois são utilizados no desenvolvimento de moléculas com importância comercial para a área farmacológica, agronômica, entre outras. É crescente o interesse em metabólitos secundários derivados da comunicação química entre os organismos (Macías et al. 2008; Imatomi et al. 2013). Promissor na busca por compostos bioativos, o Cerrado é uma das formações vegetacionais de maior biodiversidade no Brasil, onde as plantas são fortemente influenciadas pelas limitações do regime de chuvas, e pelas características do solo que é pouco fértil. O clima deste bioma é marcadamente sazonal, com episódios de seca de abril a setembro (Imatomi et al. 2013). Considerando a sazonalidade climática do Cerrado, o déficit hídrico é o fator mais relevante. Processos fisiológicos críticos como fotossíntese, mobilização de reservas e crescimento vegetal podem ser alterados sob estresse hídrico, desencadeando alterações no metabolismo secundário (Taiz e Zeiger 2009). Assim, o estresse hídrico pode alterar a produção de vários tipos de metabólitos secundários, dependendo do período em que a seca ocorre e se ela é de curta ou longa duração (Gershenzon 1984; Horner 1990; Jung 2004). Estudos demonstram que plantas submetidas a estresse biótico ou abiótico produzem grandes quantidades de compostos bioativos (Chaves e Escudero 1999). O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial fitotóxico de extratos aquosos de folhas de Byrsonima intermedia (A. Juss.), Gochnatia polymorpha (Less.) Cabrera, Luehea candicans Mart., Miconia chamissois Naudin e Qualea cordata Spreng. (espécies típicas de Cerrado), e o efeito da sazonalidade (estação seca e chuvosa) sobre o potencial fitotóxico dos mesmos. O efeito dos extratos foi avaliado sobre a germinação e o crescimento inicial de uma monocotiledônea, Zea mays L. (milho), e de uma eudicotiledônea, Cucumis sativus L. 24 (pepino). Além disso, foi realizada triagem fitoquímica nos extratos para identificar os principais metabólitos secundários em cada estação. 1.3 Material e métodos Material vegetal As folhas foram coletadas em agosto de 2013 (estação seca) e abril de 2014 (estação chuvosa) em área de Cerrado na Estação Ecológica de Assis, cidade de Assis, estado de São Paulo, Brasil (22º33’20” a 22º37’41”S e 50°24’48” a 50°21’27”W). As folhas foram coletadas de, no mínimo, cinco indivíduos por espécie e por estação, secas à sombra e trituradas em moinho de facas; o pó obtido foi acondicionado em recipientes de polietileno e armazenado a temperatura de 4°C até a sua utilização. Preparo dos extratos Os extratos foram obtidos na proporção de 1:10 p/v, (pó das folhas: água destilada) e armazenados a 4°C durante 24 horas no escuro, para completa extração dos compostos ativos (Borghetti et al. 2013). Posteriormente, os extratos foram filtrados em papel de filtro, armazenados em recipientes de polietileno e congelados até a sua utilização. Rendimento dos extratos Para cálculo do rendimento (Tabela 1), 50 mL do extrato aquoso de cada espécie, proporção 1:10 (p/v), correspondentes à estação seca e chuvosa, foram colocados em béqueres, previamente pesados, e acondicionados em estufa a ± 50°C até evaporação total do solvente. Posteriormente, os béqueres foram pesados novamente e realizado o cálculo de resíduos de acordo com a equação (1): Resíduo = (Pf-Pi)/Vext (1) 25 onde: Pf: peso final do béquer de ensaio; Pi: peso inicial do béquer de ensaio e Vext: volume de extrato utilizado. Características físico-químicas dos extratos O pH e potencial osmótico dos extratos foram determinados com auxílio do pHmetro (TEC-2, Tecnal, Brasil) e um refratômetro de bancada tipo Abbe, respectivamente. O potencial osmótico foi determinado por meio da avaliação de soluções osmóticas obtidas com uso de PEG 6000 (Villela et al. 1991), nas quantidades indicadas para obtenção de potenciais osmóticos de -0,001 a -0,01 MPa e calculados de acordo com a equação (2): y= – 3,7765x2 – 10,237x + 0,195 onde: � = Índice de Refração em (Brix). Influência do pH dos extratos sobre as espécies-alvo A influência do pH dos extratos sobre as espécies-alvo foi avaliada através de bioensaios de germinação e crescimento inicial em solução aquosa acidificada com HCl 0,1 N até pH=3,69. Espécies-alvo Foram utilizadas duas espécies alvo, pepino verde comprido (ISLA) (Cucumis sativus L.) e milho híbrido duplo cultivar SHS 4080 (Zea mays L.), para testar o potencial fitotóxico dos extratos sobre os parâmetros de germinação e crescimento inicial. Estas espécies foram selecionadas por apresentarem germinação rápida e uniforme, crescimento inicial rápido e por terem um grau de sensibilidade que permite expressar os resultados com baixas concentrações de compostos bioativos (Rice 1979; Ferreira e Aquila 2000). (2) 26 Bioensaio de germinação Os bioensaios foram realizados em caixas tipo gerbox (11 x 11 x 3,5 cm), contendo duas folhas de papel filtro umedecidas com 10 mL de extrato para os bioensaios realizados com sementes de pepino e 15 mL de extrato para os bioensaios realizados com milho, ou água destilada (controle). Para cada tratamento foram montadas cinco repetições contendo 20 sementes de pepino ou de milho, totalizando 100 sementes. As caixas tipo gerbox foram mantidas em estufa B.O.D. (Eletrolab, modelo 102 FC) a 25ºC (±1°C) com fotoperíodo de 12 h. A contagem das sementes foi realizada a cada 12 h totalizando 96 h para as sementes de milho e 120 h para as de pepino. Foram consideradas germinadas as sementes que apresentaram 1 mm de protrusão radicular. Os parâmetros analisados foram porcentagem e velocidade de germinação e sincronismo (Ranal e Santana 2006). Bioensaio de crescimento inicial Os bioensaios foram realizados em caixas tipo gerbox (11 x 11 x 3,5 cm), contendo duas folhas de papel filtro umedecidas com 10 mL de extrato ou água destilada (controle). Para cada tratamento foram realizadas três repetições contendo 20 sementes previamente germinadas (2 mm de protrusão radicular) de pepino ou de milho (n=60). As caixas tipo gerbox foram incubadas em estufa B.O.D. nas condições já descritas. Os bioensaios totalizaram 96 h para sementes de milho e 120 h para pepino. Os parâmetros analisados foram comprimento da raiz principal e parte aérea e número de raízes secundárias. Triagem fitoquímica Os extratos aquosos de folhas coletadas na estação seca e chuvosa, proporção 1:10 (p/v), foram submetidos à triagem fitoquímica. Para identificar alcaloides foram utilizados os reativos de Hager, Mayer e Dragendorff. A identificação de antraquinonas foi feita com 27 NaOH, a de cumarinas com KOH, a de esteroides e triterpenoides com (CH3CO)2O e H2SO4. Para revelar flavonoides utilizou-se AlCl3 e para taninos solução de gelatina (Matos 1997; Marins et al. 2011). Análise estatística A porcentagem e velocidade média de germinação, sincronismo, comprimento da parte aérea e da raiz primária e o número de raízes secundárias foram calculados como diferença percentual em relação ao controle (Chung et al. 2001). Os valores positivos representam estímulo e valores negativos inibição. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Os dados foram testados quanto à normalidade dos resíduos (teste de Shapiro-Wilk, p>0.05) e quanto à homogeneidade de variâncias (teste de Levene, p>0.05). Sempre que atendidas as premissas, as médias foram comparadas pelo teste t de Student e quando não, pelo teste de Mann-Whitney, a 5% de probabilidade de erro. 1.4 Resultados Características físico-químicas dos extratos O pH da água destilada (controle) utilizada neste estudo foi de 6,01 enquanto que o pH dos extratos variou de 3,69 a 6,22 (Tabela 2). A germinação e o crescimento inicial das espécies- alvo não foram significativamente influenciados por solução aquosa acidificada pH = 3,69 (dados não mostrados). O potencial osmótico dos extratos variou de -0,031 a -0,008 MPa (Tabela 2). Bioensaio de germinação 28 Os extratos de folhas de B. intermedia não causaram alterações significativas no comportamento germinativo de milho em relação ao controle, em ambas às estações. Observou-se apenas que houve tendência do sincronismo de milho ser estimulado na estação seca e reduzido na estação chuvosa (Tabela 3). Os extratos de folhas de B. intermedia não afetaram a germinabilidade de pepino em ambas estações, porém, o extrato de folhas da estação chuvosa reduziu significativamente a velocidade média de germinação de pepino em relação ao controle (Tabela 4). Já o sincronismo de pepino aumentou significativamente na presença de extratos de ambas às estações, em relação ao controle; sendo este efeito mais acentuado no extrato de folhas coletadas na estação chuvosa (Tabela 4). De acordo com os resultados obtidos, o extrato de B. intermedia apresentou maior fitotoxicidade quando as folhas foram coletadas na estação chuvosa (Tabela 3 e 4). Os extratos de folhas de G. polymorpha, coletadas em ambas às estações, reduziram significativamente a porcentagem e a velocidade média de germinação de milho, em relação ao controle, sem diferenças significativas entre as estações (Tabela 3). A porcentagem de germinação em pepino não foi alterada pelos extratos enquanto que sua velocidade média de germinação foi reduzida significativamente em relação ao controle, quando considerado o extrato obtido de folhas coletadas na estação chuvosa (Tabela 4). Não houve diferenças significativas em relação ao sincronismo das sementes de milho e pepino (Tabela 3 e 4). Assim, considerando-se as duas espécies analisadas, observou-se que o extrato de folhas de G. polymorpha coletadas na estação chuvosa apresentou maior fitotoxicidade (Tabela 3 e 4). O extrato de folhas de L. candicans coletadas na estação chuvosa reduziu significativamente a porcentagem de germinação de milho em relação ao controle (Tabela 3), contudo, os extratos de ambas as estações não afetaram sua velocidade média de germinação. O sincronismo de milho aumentou significativamente em relação ao controle, apenas no extrato de folhas coletadas na estação seca (Tabela 3). A porcentagem e a velocidade média 29 de germinação de pepino foram reduzidas significativamente em relação ao controle, no extrato de folhas de L. candicans coletadas na estação chuvosa, enquanto que o sincronismo de pepino foi aumentado significativamente em relação ao controle no mesmo extrato (Tabela 4). Assim, observou-se que o extrato de folhas de L. candicans coletadas na estação chuvosa apresentou maior fitotoxicidade (Tabela 3 e 4). O extrato de folhas de M. chamissois coletadas na estação seca reduziu significativamente a velocidade média de germinação de milho em relação ao controle, e estimulou significativamente o sincronismo destas sementes (Tabela 3). Os extratos reduziram significativamente a velocidade média de germinação de pepino em relação ao controle, em ambas às estações (Tabela 4). O sincronismo de pepino foi estimulado significativamente em relação ao controle apenas no extrato de folhas coletadas na estação seca (Tabela 4). A porcentagem de germinação de ambas as sementes não foi alterada significativamente pelos extratos (Tabela 3 e 4). Deste modo, observou-se que o extrato de M. chamissois apresentou maior fitotoxicidade quando as folhas foram coletadas na estação seca (Tabela 3 e 4). O extrato de folhas de Q. cordata coletadas na estação seca reduziu significativamente à velocidade média de germinação de milho e aumentou o sincronismo destas sementes em relação ao controle; a porcentagem de germinação não foi alterada (Tabela 3). O extrato de folhas de Q. cordata coletadas na estação seca reduziu significativamente a porcentagem de germinação de pepino e aumentou significativamente o sincronismo destas sementes em relação ao controle (Tabela 4). Ademais, os extratos de Q. cordata reduziram significativamente a velocidade média de germinação de pepino em relação ao controle em ambas às estações (Tabela 4). Observou-se que o extrato de folhas de Q. cordata coletadas na estação seca apresentou maior fitotoxicidade (Tabela 3 e 4). Bioensaio de crescimento inicial 30 Os extratos de folhas de B. intermedia coletadas em ambas às estações reduziram, em proporção semelhante, o comprimento da raiz primária de milho em relação ao controle (Tabela 5). O comprimento da parte aérea de milho foi significativamente reduzido no extrato de folhas coletadas na estação seca e estimulado no extrato de folhas coletadas na estação chuvosa, em relação ao controle (Tabela 5). Houve redução significativa do número de raízes secundárias de milho em relação ao controle no extrato de folhas coletadas na estação seca (Tabela 5). O comprimento da raiz primária, da parte aérea e o número de raízes secundárias de pepino reduziram significativamente em relação ao controle, em ambas às estações, entretanto, observou-se que o extrato de folhas de B. intermedia coletadas na estação chuvosa foi mais fitotóxico para o crescimento do pepino que o da estação seca (Tabela 6). De acordo com os resultados obtidos, o extrato de B. intermedia apresentou fitotoxicidade em ambas às estações, sendo maior na estação seca para o milho e maior na estação chuvosa quando considerado o pepino (Tabela 5 e 6). O comprimento da raiz primária de milho foi significativamente reduzido nos extratos de folhas de G. polymorpha coletadas em ambas às estações, mas o extrato de folhas coletas na estação seca foi o mais fitotóxico (Tabela 5). A parte aérea de milho foi significativamente estimulada em relação ao controle no extrato de folhas coletadas na estação chuvosa. O número de raízes secundárias de milho não foi alterado pelos extratos (Tabela 5). Os extratos de folhas de G. polymorpha coletadas em ambas às estações reduziram significativamente o comprimento da raiz primária de pepino em relação ao controle, porém o efeito do extrato de folhas coletadas na estação seca foi mais pronunciado (Tabela 6). A parte aérea de pepino foi significativamente reduzida na estação seca e estimulada na estação chuvosa em relação ao controle. O número de raízes secundárias de pepino reduziu significativamente em relação ao controle em ambas as estações (Tabela 6). Assim, observou-se que o extrato de G. 31 polymorpha apresentou fitotoxicidade em ambas às estações, quando o órgão analisado foi a raiz; a parte aérea foi estimulada pelo extrato da estação chuvosa (Tabela 5 e 6). Os extratos de folhas de L. candicans coletadas em ambas às estações estimularam significativamente o comprimento da raiz primária, da parte aérea e o número de raízes secundárias de milho, em relação ao controle (Tabela 5). No entanto, o extrato de folhas coletadas na estação seca foi o que causou mais resposta na raiz primária destas plântulas (Tabela 5). Os extratos de folhas de L. candicans coletadas em ambas às estações reduziram significativamente o comprimento da raiz primária de pepino em relação ao controle; a parte aérea não foi afetada (Tabela 6). O número de raízes secundárias de pepino reduziu significativamente em relação ao controle, nos extratos de ambas às estações (Tabela 6). O extrato de L. candicans apresentou maior fitotoxicidade quando as folhas foram coletadas na estação seca em milho e na chuvosa considerando o pepino (Tabela 5 e 6). O comprimento da raiz primária de milho foi significativamente reduzido nos extratos de folhas de M. chamissois coletadas em ambas às estações em relação ao controle; verificou-se que o extrato de folhas coletadas na estação seca causou maior redução (Tabela 5). A parte aérea e o número de raízes secundárias de milho foram significativamente reduzidos no extrato de folhas coletadas na estação seca e estimulados no extrato de folhas coletadas na estação chuvosa, em relação ao controle (Tabela 5). Os extratos de folhas de M. chamissois coletadas em ambas às estações reduziram significativamente o comprimento da raiz primária de pepino, entretanto o extrato de folhas coletadas na estação seca causou maior redução (Tabela 6). A parte aérea de pepino foi significativamente reduzida no extrato de folhas coletadas na estação seca em relação ao controle e, o número de raízes secundárias foi significativamente reduzido em ambas às estações, sendo a maior redução causada pelo extrato de folhas coletadas na estação seca (Tabela 6). Assim, verificou-se que o extrato de 32 folhas de M. chamissois coletadas na estação seca apresentou maior fitotoxicidade (Tabela 5 e 6). Os extratos de folhas de Q. cordata, coletadas em ambas às estações, reduziram significativamente o comprimento da raiz primária de milho em relação ao controle, porém o extrato de folhas coletadas na estação seca causou maior redução (Tabela 5). A parte aérea de milho foi significativamente reduzida no extrato de folhas coletadas na estação seca e estimulada no extrato de folhas coletadas na estação chuvosa, em relação ao controle. O número de raízes secundárias de milho reduziu significativamente em relação ao controle, apenas no extrato de folhas coletadas na estação seca (Tabela 5). Os extratos de folhas de Q. cordata coletadas em ambas às estações reduziram significativamente o comprimento da raiz primária, da parte aérea e o número de raízes secundárias de pepino, em relação ao controle (Tabela 6). Observou-se que o extrato de folhas coletas na estação seca foi o mais fitotóxico para a parte aérea de pepino (Tabela 6). De acordo com os resultados obtidos, o extrato de Q. cordata apresentou maior fitotoxicidade quando as folhas foram coletadas na estação seca (Tabela 5 e 6). Triagem fitoquímica Os testes realizados identificaram algumas das principais classes de metabólitos secundários nos extratos de folhas das cinco espécies de Cerrado coletadas em ambas às estações (Tabela 7): a) extratos de B. intermedia foram positivos para: antraquinonas na estação seca, triterpenoides (maior intensidade na estação seca em relação à chuvosa), saponinas na estação chuvosa e taninos (em maior intensidade na estação seca em relação à chuvosa); 33 b) extratos de G. polymorpha foram positivos para: antraquinonas e triterpenoides (ambos com maior intensidade na estação seca em relação à chuvosa) e saponinas em ambas às estações; c) extratos de L. candicans foram positivos para: triterpenoides (maior intensidade na estação chuvosa em relação à seca), saponinas e taninos em ambas às estações; d) extratos de M. chamissois foram positivos para: antraquinonas (maior intensidade na estação chuvosa em relação à seca), triterpenoides e taninos (ambos com maior intensidade na estação seca em relação à chuvosa) e saponinas na estação seca; e) extratos de Q. cordata foram positivos para: antraquinonas na estação chuvosa, triterpenoides (maior intensidade na estação chuvosa em relação à seca), saponinas e taninos (ambos com maior intensidade na estação seca em relação à chuvosa). 1.5 Discussão Os extratos brutos de plantas podem conter substâncias como açúcares, aminoácidos e ácidos orgânicos que exercem influência sobre o pH e são osmoticamente ativas mascarando um fenômeno alelopático e/ou um efeito fitotóxico. Assim, torna-se necessário avaliar o pH e o potencial osmótico dos extratos (Ferreira e Aquila 2000). O extrato de Q. cordata (estação seca) foi o que obteve menor valor de pH = 3,69 (Tabela 2). Dados da literatura apontam que tanto a germinação quanto o desenvolvimento radicular são afetados negativamente, em condições de extrema acidez ou extrema alcalinidade (Souza Filho et al. 1996). Entretanto, em bioensaios de germinação e crescimento inicial com as espécies-alvo, verificou-se que nem a germinação e nem o crescimento inicial foram significativamente influenciados pelo pH avaliado (3,69) (dados não mostrados), sendo as respostas observadas de origem fitotóxica. 34 Os efeitos do potencial osmótico também podem ser observados sobre o comportamento germinativo e crescimento das plântulas (Ferreira e Aquila 2000), sendo que em potencial osmótico acima de -0,9 MPa a germinação é severamente reduzida e acima de -1,5 MPa totalmente inibida (Eberlein 1987). Levando em conta os valores de potencial osmótico obtidos (Tabela 2), pode-se considerar que estes não influenciaram a atividade fitotóxica dos extratos, sendo as alterações causadas por compostos do metabolismo secundário das plantas avaliadas. Os resultados dos bioensaios confirmam que as espécies de Cerrado B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata apresentam atividade fitotóxica, sobre a germinação e o crescimento inicial de milho e pepino. Estudos têm demonstrado que espécies de Cerrado apresentam atividade fitotóxica sobre a germinação e crescimento inicial de alface, tomate, cebola, rabanete, pepino e trigo, sendo a porcentagem e/ou a velocidade de germinação, e o crescimento da raiz primária, os parâmetros mais afetados das espécies-alvo (Novaes et al. 2013). Os dados aqui obtidos corroboram com os resultados encontrados nestes estudos. A ação dos metabólitos secundários sobre a germinação e o crescimento inicial de espécies ainda permanece obscura, no entanto, a ação destes sobre a germinação parece ser mediada principalmente através da interrupção do metabolismo celular normal. Um dos efeitos pode ser sobre a mobilização de reservas, que normalmente ocorre rapidamente durante os primeiros estágios de germinação de sementes, que pode atrasar ou diminuir por causa da fitotoxicidade (Gniazdowska e Bogatek 2005). A extensão dos efeitos de compostos secundários sobre o crescimento inicial de plântulas é diversificada e pode afetar diferentes funções fisiológicas, tais como, a divisão celular (Silva et al. 2014) e processos metabólicos, como a fotossíntese (Qian et al. 2009) e a respiração (Hejl e Koster 2004; Mushtaq et al. 2013). 35 As diferenças encontradas para extratos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata coletadas na estação seca e chuvosa, indicam que a sazonalidade influencia a fitotoxicidade, afetando a composição e a concentração dos metabólitos secundários. As plantas normalmente apresentam maior fitotoxicidade na estação seca, como consequência do estresse hídrico, contudo, a produção de metabólitos secundários pode depender do grau de estresse e do período em que ele ocorre (Gobbo-Neto e Lopes 2007). No presente estudo, observou-se este comportamento de maior fitotoxicidade na estação seca para M. chamissois e Q. cordata, independente se avaliada a germinação ou o crescimento inicial das espécies alvo analisadas. Já as outras três espécies apresentaram maior fitotoxicidade na estação chuvosa, quando considerados os parâmetros de germinação, ou em diferentes estações, quando consideradas as diferentes espécies alvo. Essas respostas sugerem que certas espécies de Cerrado podem apresentar maior fitotoxicidade em situação de estresse hídrico enquanto que outras podem ter a produção de metabólitos secundários favorecida ou sua composição alterada pela maior disponibilidade de água no ambiente. Assim, o efeito da sazonalidade sobre o potencial fitotóxico de espécies de Cerrado deve ser considerado, devendo-se realizar estudos em diferentes épocas do ano a fim de constatar o real potencial fitotóxico de suas espécies. A triagem fitoquímica realizada nos extratos aquosos de folhas de B. intermedia levou a identificação de triterpenoides e taninos, além de antraquinonas na estação seca e saponinas na estação chuvosa (Tabela 7). Em outros estudos, foram relatados esteroides, flavonoides e taninos em extrato metanólico (Sannomiya et al. 2007), e catequina e flavonoides em extrato aquoso bruto, frações de acetato de etila e frações aquosas de folhas de B. intermedia (Moreira et al. 2011). Assim, a presença de taninos foi o único achado em comum com a literatura para a espécie. Respostas oriundas de bioensaios com extratos de plantas são complexas e, alterações de comportamento (estímulo x inibição) em função de diferentes 36 estações podem ser resultado de compostos distintos ou então de mesmos compostos, mas presentes em diferentes concentrações nas estações. No extrato de B. intermedia, a germinação foi mais inibida na estação chuvosa (Tabelas 3 e 4), na qual houve a detecção de saponinas (Tabela 7); é possível então que as saponinas estejam relacionadas com esta maior resposta de inibição. Foi sugerido em outro estudo com sementes de algodão, que saponinas atuam reduzindo a taxa respiratória das sementes, devido a menor difusão do oxigênio através do tegumento, inibindo sua germinação (Marchaim et al. 1974). O crescimento das plantas alvo foi afetado pelo extrato de B. intermedia de ambas às estações (Tabelas 5 e 6); os compostos químicos detectados em ambas às estações foram os triterpenoides e os taninos (Tabela 7). Um estudo recente mostrou que triterpenoides foram responsáveis pela inibição do crescimento da raiz de Echinochloa crus-galli, Amaranthus hypochondriacus e Lactuca sativa (González-Coloma et al. 2011). Similarmente, taninos foram relatados como sendo os prováveis responsáveis pela redução da germinação e por suprimir a parte aérea e raízes de Parthenium hysterophorus (Javaid e Shah 2007). Sendo assim, é possível que tanto triterpenoides quanto taninos estejam relacionados com os efeitos observados. A análise fitoquímica dos extratos aquosos de folhas de G. polymorpha levou a identificação de antraquinonas, triterpenoides e saponinas (Tabela 7). Em outros estudos, foram caracterizados terpenos no extrato hexânico do tronco e casca (Farias et al. 1984) e ácidos fenólicos e flavonoides, em fração acetato de etila de folhas (Moreira et al. 2000) de G. polymorpha. Portanto, a presença de triterpenoides foi o único achado em comum com a literatura para G. polymorpha. Os extratos de G. polymorpha causaram respostas diversas, dependendo da estação, é possível que a maior inibição da raiz primária causada pelo extrato obtido na estação seca (Tabelas 5 e 6) tenha ocorrido devido a maior quantidade de antraquinonas e/ou triterpenoides encontrados neste extrato (Tabela 7), enquanto que o estímulo da parte aérea pode ter decorrido da menor quantidade dos mesmos compostos 37 presentes no extrato da estação chuvosa (Tabelas 5 e 6). Triterpenoides e antraquinonas são reconhecidos como compostos biologicamente ativos (Bessa et al. 2013); compostos de antraquinona exibiram atividade inibitória sobre o crescimento de plântulas de Lactuca sativa, Amaranthus viridis e Phleum pratense (Inoue e Nishimura 1992). A análise química dos extratos aquosos de folhas de L. candicans levou a identificação de triterpenoides, saponinas e taninos (Tabela 7). Em outro estudo, os principais constituintes químicos encontrados foram triterpeno em fração hexânica e clorofórmica, uma mistura de esteroides na fração clorofórmica, flavonoide e lignana glicosilada na fração metanólica e flavonoide na fração acetato de etila de folhas de L. candicans (Silva et al. 2012). Assim, os estudos apresentaram em comum apenas triterpenoides. O extrato de folhas de L. candicans coletadas na estação chuvosa apresentou maior fitotoxicidade sobre os parâmetros de germinação das espécies-alvo (Tabelas 3 e 4). Acredita-se que os triterpenoides sejam os principais responsáveis pelo efeito fitotóxico observado, já que sua quantidade aumentou na estação chuvosa (Tabela 7). Resultado semelhante foi encontrado por Martins et al. (2010), onde triterpenoides e esteroides foram relatados como sendo inibidores da germinação de sementes de Lactuca sativa. A análise fitoquímica dos extratos aquosos de folhas de M. chamissois levou a identificação de antraquinonas, triterpenoides e taninos em ambas às estações e saponinas na estação seca (Tabela 7). Há na literatura relato da presença de triterpenos, identificados a partir do extrato diclorometânico e flavonoides identificados a partir do extrato etanólico das partes aéreas de outro gênero da família Melastomataceae (Santos et al. 2012). Assim, os gêneros estudados apresentaram em comum os triterpenoides. O extrato de folhas de M. chamissois coletadas na estação seca exibiu maior fitotoxicidade sobre as espécies-alvo, tanto para a germinação (Tabelas 3 e 4) quanto para o crescimento inicial (Tabelas 5 e 6). É possível que estes efeitos sejam o resultado da maior quantidade de triterpenoides e/ou taninos 38 identificados neste extrato; estes efeitos podem ter sido intensificados pela presença de saponinas, as quais foram detectadas apenas neste extrato. A análise fitoquímica dos extratos aquosos de folhas de Q. cordata levou a identificação de triterpenoides, saponinas e taninos em ambas às estações e antraquinonas apenas na estação chuvosa (Tabela 7). Noutro estudo, foram identificadas flavanonas na fração acetato de etila de folhas de Q. cordata (Neto et al. 2013). Assim, não foram encontrados compostos em comum considerando os diferentes extratos da mesma espécie. O extrato de folhas de Q. cordata coletadas na estação seca apresentou maior fitotoxicidade sobre as espécies-alvo (Tabelas 3, 4, 5 e 6). Provavelmente saponinas e/ou taninos sejam os compostos químicos responsáveis pelo efeito fitotóxico observado, já que a presença destes compostos aumentou na estação seca (Tabela 7). Por outro lado, observou-se estímulo da parte aérea de milho na estação chuvosa (Tabela 5); este efeito pode ser decorrente da menor quantidade de saponinas e/ou taninos neste extrato, ou pela maior quantidade de triterpenoides ou ainda pela presença de antraquinonas, detectadas apenas no extrato desta estação (Tabela 7). Um estudo anterior mostrou que triterpenos e esteroides podem estimular o crescimento de plantas de Lactuca sativa, Lycopersicon esculentum, Allium cepa e Hordeum vulgare (Macías et al. 1997), entretanto, o mecanismo de ação destes compostos permanece desconhecido. Concluindo, nossos resultados mostram que os extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, Q. cordata, L. candicans e M. chamissois possuem potencial fitotóxico. O efeito fitotóxico das espécies estudadas, bem como a quantidade e composição de metabólitos secundários, difere em função da sazonalidade (estações seca e chuvosa), demonstrando a importância de se considerar este fator em estudos de alelopatia e fitotoxicidade. No entanto, estudos adicionais são necessários para esclarecer quais são os metabólitos secundários específicos responsáveis pelos efeitos fitotóxicos observados, a fim de que estes possam ser mais bem avaliados como possíveis novas fontes de bioerbicidas. 39 Agradecimentos Agradecemos ao Instituto Florestal do Estado de São Paulo por permitir a realização das coletas na Estação Ecológica de Assis e a empresa Santa Helena Sementes, pela doação das sementes de milho. Este estudo foi apoiado pela concessão 2013/14413-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). 1.6 Referências Bessa, N.G.F.de, Borges, J.C.M., Beserra, F.P., Carvalho, R.H.A, Pereira, M.A.B., Fagundes, R., Campos, S.L., Ribeiro, L.U., Quirino, M.S., Chagas Junior, A.F., Alves, A. 2013. Prospecção fitoquímica preliminar de plantas nativas do cerrado de uso popular medicinal pela comunidade rural do assentamento vale verde – Tocantins. Revista Brasileira de Plantas Medicinais 15(4): 692–707. doi: 10.1590/S1516-05722013000500010. Borghetti, F., Lima, E.C., e Silva, L.C.R. 2013. A simple procedure for the purification of active fractions in aqueous extracts of plants with allelopathic properties. Acta Botanica Brasílica 27(1): 50–53. doi: 10.1590/S0102-33062013000100007. Chaves, N., e Escudero, C. 1999. Variation of flavonoid syntheis induced by ecological factors. In Inderjit, K.M.M. Dakshini, and C.L. Edited by Foy. 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Espécies Resíduos (g/mL) Estação seca Estação chuvosa Byrsonima intermedia 0,016 0,011 Gochnatia polymorpha 0,012 0,007 Luehea candicans 0,005 0,008 Miconia chamissois 0,019 0,012 Qualea cordata 0,012 0,006 Tabela 2. Valores de pH e potencial osmótico dos extratos aquosos. Parâmetros Extratos Estação Seca Chuvosa pH Byrsonima intermedia 4,72 4,98 Gochnatia polymorpha 5,59 6,22 Luehea candicans 5,47 5,75 Miconia chamissois 3,93 4,48 Qualea cordata 3,69 4,09 Potencial osmótico (MPa) Byrsonima intermedia -0,025 -0,022 Gochnatia polymorpha -0,008 -0,008 Luehea candicans -0,011 -0,011 Miconia chamissois -0,031 -0,008 Qualea cordata -0,025 -0,011 47 Tabela 3. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata na germinação de sementes de milho. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão. Parâmetros † Extratos Estação Seca Chuvosa G (%) Byrsonima intermedia -6,00±5,70 (a) -11,00±11,94 (a) Gochnatia polymorpha -26,00±22,80 (a*) -36,00±11,51 (a*) Luehea candicans 0,00±2,24 (a) -42,00±31,94 (b*) Miconia chamissois -2,00±6,12 (a) -8,00±8,94 (a) Qualea cordata -14,00±12,94 (a) -8,00±8,22 (a) V (%) Byrsonima intermedia -12,75±8,08 (a) -4,91±4,58 (a) Gochnatia polymorpha -18,35±10,32 (a*) -19,76±6,28 (a*) Luehea candicans 1,41±8,44 (a) -8,34±9,05 (a) Miconia chamissois -18,78±3,72 (a*) -3,71±4,26 (b) Qualea cordata -32,26±9,46 (a*) -9,02±7,47 (b) Byrsonima intermedia 29,76±12,84 (a) -6,88±7,67 (b) Gochnatia polymorpha 14,79±17,24 (a) 16,92±18,96 (a) U (%) Luehea candicans 28,91±23,89 (a*) -23,06±46,48 (a) Miconia chamissois 55,25±27,46 (a*) 32,41±12,37 (a) Qualea cordata 52,01±33,36 (a*) 4,53±26,18 (b) G – germinabilidade; V – velocidade de germinação; U – sincronismo.* Diferença significativa entre o controle (água destilada) e o tratado; † Para a mesma espécie, médias seguidas de letras iguais não diferem significativamente de acordo com o teste t (α = 0,05). 48 Tabela 4. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata na germinação de sementes de pepino. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão. Parâmetros † Extratos Estação Seca Chuvosa G (%) Byrsonima intermedia -1,00±4,47 (a) -3,00±4,47 (a) Gochnatia polymorpha -1,00±4,47 (a) -4,00±4,18 (a) Luehea candicans 1,00±0,00 (a) -7,00±8,94 (b*) Miconia chamissois 3,00±2,24 (a) -2,00±2,74 (a) Qualea cordata -5,00±5,00 (a*) 0,00±0,00 (b) V (%) Byrsonima intermedia -17,07±5,64 (a) -30,12±5,19 (b*) Gochnatia polymorpha -6,19±8,24 (a) -23,17±8,70 (b*) Luehea candicans -8,91±12,46 (a) -26,06±9,32 (b*) Miconia chamissois -13,38±6,27 (a*) -19,17±6,53 (a*) Qualea cordata -18,23±6,54 (a*) -10,75±5,57 (a*) Byrsonima intermedia 23,67±14,11 (a*) 68,01±32,37 (b*) Gochnatia polymorpha 57,35±57,49 (a) 51,82±27,05 (a) U (%) Luehea candicans 63,67±49,27 (a) 60,44±21,70 (a*) Miconia chamissois 32,43±7,89 (a*) 24,51±3,86 (a) Qualea cordata 57,97±22,30 (a*) 17,58±17,30 (b) G – germinabilidade; V – velocidade de germinação; U – sincronismo.* Diferença significativa entre o controle (água destilada) e o tratado; † Para a mesma espécie, médias seguidas de letras iguais não diferem significativamente de acordo com o teste t ou teste de Mann-Whitney (α = 0,05). 49 Tabela 5. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois and Q. cordata no crescimento inicial de plântulas de milho. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão. Parâmetros † Extratos Estação Seca Chuvosa Comprimento da raiz primária (%) Byrsonima intermedia -71,05±15,81 (a*) -66,38±19,26 (a*) Gochnatia polymorpha -51,73±12,76 (a*) -11,97±17,22 (b*) Luehea candicans 78,33±39,36 (a*) 27,43±34,22 (b*) Miconia chamissois -62,49±19,87 (a*) -14,02±37,36 (b*) Qualea cordata -69,03±12,66 (a*) -39,04±27,17 (b*) Comprimento da parte aérea (%) Byrsonima intermedia -19,38±19,41 (a*) 20,08±22,26 (b*) Gochnatia polymorpha -2,02±24,39 (a) 11,67±17,57 (b*) Luehea candicans 52,16±47,20 (a*) 40,90±39,09 (a*) Miconia chamissois -22,04±20,03 (a*) 57,04±26,52 (b*) Qualea cordata -29,13±18,21 (a*) 27,58±29,66 (b*) Número de raízes secundárias (%) Byrsonima intermedia -34,87±45,80 (a*) -6,02±41,77 (b) Gochnatia polymorpha -11,18±25,95 (a) 7,55±23,85 (a) Luehea candicans 24,06±23,10 (a*) 18,80±19,15 (a*) Miconia chamissois -57,32±42,97 (a*) 19,55±19,64 (b*) Qualea cordata -44,74±40,12 (a*) 9,77±32,08 (b) * Diferença significativa entre o controle (água destilada) e o tratado; † Para a mesma espécie, médias seguidas de letras iguais não diferem significativamente de acordo com o teste t ou teste de Mann-Whitney (α = 0,05). 50 Tabela 6. Efeito da sazonalidade na fitotoxicidade de extratos aquosos de folhas de B. intermedia, G. polymorpha, L. candicans, M. chamissois e Q. cordata no crescimento inicial de plântulas de pepino. Dados apresentados como porcentagem média de redução ou estímulo ± desvio padrão. Parâmetros † Extratos Estação Seca Chuvosa Comprimento da raiz primária (%) Byrsonima intermedia -93,06±2,46 (a*) -94,35±3,45 (b*) Gochnatia polymorpha -71,53±11,10 (a*) -42,25±11,95 (b*) Luehea candicans -57,51±12,45 (a*) -63,15±8,00 (b*) Miconia chamissois -90,86±5,32 (a*) -58,73±10,72 (b*) Qualea cordata -93,20±3,11 (a*) -93,44±2,95 (a*) Comprimento da parte aérea (%) Byrsonima intermedia -21,37±23,02 (a*) -48,29±22,17 (b*) Gochnatia polymorpha -21,13±25,39 (a*) 41,59±39,10 (b*) Luehea candicans 6,55±43,27 (a) -5,06±34,47 (a) Miconia chamissois -61,36±8,46 (a*) -1,95±18,94 (b) Qualea cordata -56,72±15,65 (a*) -36,89±16,24 (b*) Número de raízes secundárias (%) Byrsonima intermedia -71,31±14,40 (a*) -65,94±17,93 (a*) Gochnatia polymorpha -40,36±20,11 (a*) -39,38±16,23 (a*) Luehea candicans -33,83±16,28 (a*) -41,09±13,55 (b*) Miconia chamissois -84,27±15,43 (a*) 0,00±22,72 (b*) Qualea cordata -77,05±13,11 (a*) -79,27±17,85 (a*) * Diferença significativa entre o controle (água destilada) e o tratado; † Para a mesma espécie, médias seguidas de letras iguais não diferem significativamente de acordo com o teste t (α = 0,05). 51 Tabela 7. Triagem fitoquímica de extratos aquosos de folhas de Byrsonima intermedia (EB); Gochnatia polymorpha (EG); Luehea candicans (EL); Miconia chamissois (EM) e Qualea cordata (EQ); correspondente à estação seca (ES) e estação chuvosa (EC). Teste químico EB EG EL EM EQ ES EC ES EC ES EC ES EC ES EC Alcaloides* - - - - - - - - - - Antraquinonas + - ++ + - - + ++ - + Cumarinas - - - - - - - - - - Esteroides - - - - - - - - - - Triterpenoides ++ + ++ + + ++ ++ + + ++ Flavonoides - - - - - - - - - - Saponinas - ++ + + ++ ++ + - ++ + Taninos ++ + - - + + ++ + ++ + Chave: (-): Teste negativo; (+): Teste positivo fraco e (++): Teste positivo.*Testado por reagentes de Dragendorff, Hager e Mayer. 52 CONCLUSÕES Diante dos resultados obtidos, conclui-se que: 1. As folhas das espécies de Cerrado estudadas (Byrsonima intermedia, Gochnatia polymorpha, Luehea candicans, Miconia chamissois e Qualea cordata) apresentam potencial fitotóxico; 2. O potencial fitotóxico das espécies de Cerrado foi influenciado pelo período de coleta das folhas (estação seca e estação chuvosa); 3. O potencial fitotóxico de Byrsonima intermedia sobre a germinação foi maior quando as folhas foram coletadas na estação chuvosa. O efeito observado pode estar relacionado com a presença de saponinas identificadas apenas na estação chuvosa. O potencial fitotóxico de B. intermedia sobre o crescimento inicial das espécies-alvo foi semelhante em ambas às estações. O efeito observado pode estar relacionado com a presença de triterpenoides e/ou taninos detectados em ambas às estações; 4. O extrato de folhas de Gochnatia polymorpha coletadas na estação seca causou maior inibição da raiz primária. O efeito observado pode estar relacionado com a maior quantidade de antraquinonas e/ou triterpenoides na estação seca. Estímulo da parte aérea foi observado no extrato de folhas coletadas na estação chuvosa. O efeito observado pode estar relacionado com a menor quantidade de antraquinonas e/ou triterpenoides na estação chuvosa; 5. O potencial fitotóxico de Luehea candicans foi maior quando as folhas foram coletadas na estação chuvosa. O efeito observado pode estar relacionado com o aumento de triterpenoides na estação chuvosa; 6. O potencial fitotóxico de Miconia chamissois foi maior quando as folhas foram coletadas na estação seca. O efeito observado pode estar relacionado com o aumento de triterpenoides e/ou taninos na estação seca, intensificado pela presença de saponinas (que podem ser de origem triterpênicas) identificadas apenas nesta estação; 7. O potencial fitotóxico de Qualea cordata foi maior quando as folhas foram coletadas na estação seca. O efeito observado pode estar relacionado com o 53 aumento de saponinas (que podem ser de origem triterpênicas) e/ou taninos na estação seca. O estímulo da parte aérea de milho foi observado na estação chuvosa, este efeito pode estar relacionado com a menor quantidade de saponinas (que podem ser de origem triterpênicas) e/ou taninos ou com a maior quantidade de triterpenoides nesta estação ou ainda com a presença de antraquinonas detectadas apenas na estação chuvosa. 54 REFERÊNCIAS ALVES, L. L.; OLIVEIRA, P. V. A.; FRANÇA, S. C.; ALVES, P. L. C.; PEREIRA, P. S. Atividade alelopática de extratos aquosos de plantas medicinais na germinação de Lactuca sativa L. e Bidens pilosa L. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 13, p. 328-336, 2011. ÁRVORES DE SÃO PAULO. Disponível em: < http://arvoresdesaopaulo.files.wordpress.com/2011/07/pico-do-jaraguc3a1-e-seus- campos-cerrados-murici-do-campo-byrsonima-intermedia-foto-de-ricardo-cardim- direitos-reservados.jpg>. Acesso em 23 de outubro 2014. AVIDOS, M. F. D.; FERREIRA, L. T. Frutos do Cerrado: preservação gera muitos frutos. 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All manuscripts should contain a title page (p. 1), an abstract (p. 2), followed by the body of the paper, an Acknowledgements section, plus references, tables, figure captions, and appendices, in that order. (See descriptions of particular manuscript parts, below.) Tables and figure captions should be on separate pages. Primary headings (set in bold font) indicate the major sections of the paper (Introduction, Materials and methods, Results, Discussion, Acknowledgements, References). Secondary headings (set in italic font) indicate major divisions within a primary section. Tertiary headings (underlined) indicate divisions within a secondary heading. Presenting a manuscript to maximize its online discoverability Authors can structure their manuscript to maximize its online discoverability by following a few simple guidelines. Because the Title and Abstract are freely available to all readers and because most search engines give extra weight to keyword phrases in headings and to repeated phrases, wording of the Title and Abstract is especially important to increase the chance your paper will be highlighted. Consider the instructions below when writing your Title and Abstract; include key phrases you feel a reader would use when conducting a literature search in the subject area of your paper. Title Titles not only provide information for alerting and information retrieval services, they are also the most heavily weighted element of a paper for online search engines. Therefore titles should contain important descriptive phrases that 60 relate to the topic, stating information such as the experimental organism used, specific behaviour, modifying agent, and key result or concept. Titles should be brief and clear. Common names and correct taxonomic names should be included if the organism is not well known, as in the example “The cuticle of tephritid fruit flies (Urophora spp.)”. In the title, the names of organisms should be either in the vernacular or in Latin without their authority names. Title page The title page should contain the following. (i) The full title of the paper. (ii) Authors listed in the order in which they are to appear at the head of the printed article. (iii) Affiliation and address (including e-mail address) for each author. This should reflect the affiliation and address at the time of the study. Indicate in a footnote current affiliations and addresses (including e-mail addresses) that differ from those in the by-line. (iv) Name, address, telephone and fax numbers, and e-mail address of the author responsible for correspondence. Abstract An abstract is required for every contribution. Its content is particularly important for alerting retrieval services, search engines, and for readers, who scan the abstract to decide whether to download and read the rest of the paper. The abstract should be well written and contain three to four descriptive keyword phrases that will draw the reader to the content. Because search engines look for duplication of terms, repeating keyword phrases in the title and abstract increases the chance that a paper will be highlighted during an online sea