UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA CÂMPUS DE ILHA SOLTEIRA FABIO GOMES ASSIS JUNIOR PODEM OS INIBIDORES DE BOMBA DE EFLUXO REVERTER O FENÓTIPO DE RESISTÊNCIA MULTIDROGAS EM Pyricularia oryzae? Ilha Solteira 2023 Campus de Ilha Solteira PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA FABIO GOMES ASSIS JUNIOR PODEM OS INIBIDORES DE BOMBA DE EFLUXO REVERTER O FENÓTIPO DE RESISTÊNCIA MULTIDROGAS EM Pyricularia oryzae? Dissertação apresentada à Faculdade de En- genharia de Ilha Solteira – Unesp como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre. Prof. Dr. Paulo Cezar Ceresini Orientador Ilha Solteira 2023 Assis JuniorPodem os inibidores de bomba de efluxo reverter o fenótipo de resistência multidrogas em Pyricularia oryzae?Ilha Solteira2023 43 Não Dissertação (mestrado)Engenharia AgronômicaEngenharia Agronômica, Genética, melhoramento vegetal e propagação de plantasNão . . FICHA CATALOGRÁFICA Desenvolvida pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Assis Junior, Fabio Gomes. Podem os inibidores de bomba de efluxo reverter o fenótipo de resistência multidrogas em Pyricularia oryzae? / Fabio Gomes Assis Junior. -- Ilha Solteira: [s.n.], 2023 43 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira. Área de conhecimento: Sistemas de Produção, 2023 Orientador: Paulo Cezar Ceresini Inclui bibliografia 1. Brusone do trigo. 2. DMI. 3. SDHI. 4. Cloridrato de verapamil. 5. Reversão de resistência. A848p Elaborada por Raiane da Silva Santos - CRB/8 9999 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Ilha Solteira PODEM OS INIBIDORES DE BOMBA DE EFLUXO REVERTER O FENÓTIPO DE RESISTÊNCIA MULTIDROGAS EM PYRICULARIA ORYZAE? TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: FABIO GOMES ASSIS JUNIOR ORIENTADOR: PAULO CEZAR CERESINI Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Agronomia, especialidade: Sistemas de Produção pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. PAULO CEZAR CERESINI (Participaçao Presencial) Departamento de Fitossanidade, Engenharia Rural e Solos / Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira - UNESP Profa. Dra. ANA CAROLINA FIRMINO (Participaçao Virtual) Departamento de Produção Vegetal / Faculdade de Ciencias Agrarias e Tecnologicas - UNESP Dra. TATIANE CARLA SILVA (Participaçao Virtual) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto / Universidade de São Paulo - USP Ilha Solteira, 21 de agosto de 2023 Faculdade de Engenharia - Câmpus de Ilha Solteira - Av. Brasil Centro, 56, 15385000 www.feis.unesp.br/#!/ppgaCNPJ: 48.031.918/0015-20. RESUMO A linhagem Triticum de Pyrircularia oryzae (PoTl) é um importante patógeno da cultura do trigo, apresentando níveis de resistência a diversos fungicidas registrados para a cultura, como QoIs e DMIs. Pesquisas conduzidas com populações deste ascomiceto amostradas nas regiões Centro-Oeste, Sudeste e Sul do Brasil nos anos de 2012 e 2018 elucidaram características importantes quanto ao mecanismo de resistência em PoTl, como a baixa ou nula participação das substituições sinônimas e não-sinônimas nos genes que expressam os sítios-alvo dos fungicidas e respostas a substratos de transportadores membranares, fortalecendo a hipótese de um mecanismo pré exis- tente e inespecífico de resistência, dentre os quais destacam-se as bombas de efluxo. Desta forma, submetemos 14 isolados de PoTl a testes de reversão do fenótipo de resistência utilizando o inibidor de bombas de efluxo do tipo ATP-Binding Cassette, cloridrato de verapamil (VER), associando-o a dois fungicidas com modos de ação distintos. A maior limitação para o uso do VER como inibidor é a baixa tolerância deste patógeno à concentrações superiores a 1 mg.mL-1, para as quais a atividade metabó- lica decresce drasticamente. Embora existam indícios da contribuição das bombas de efluxo na resistência a fungicidas em PoTl, a utilização de VER não foi definitivamente capaz de reverter os fenótipos de resistência encontrados. Esta constatação destaca a complexidade dos desafios na reversão da resistência em PoTl e a necessidade de explorar alternativas eficazes para enfrentar essa questão. Palavras-chave: brusone do trigo; DMI; SDHI; cloridrato de verapamil; reversão de resistência. ABSTRACT The Triticum lineage of Pyricularia oryzae (PoTl) is a significant pathogen of wheat crops, exhibiting levels of resistance to various registered fungicides for the crop in Brazil, such as QoIs and DMIs. Research conducted on populations of this ascomycete sampled in the Central-West, Southeast, and South regions of Brazil in the years 2012 and 2018 revealed important characteristics regarding the resistance mechanism in PoTl. This includes the low or null involvement of synonymous and non-synonymous substitutions in genes that express the fungicides' target sites, as well as responses to substrates of membrane transporters, reinforcing the hypothesis of a pre-existing and nonspecific resistance mechanism, among which efflux pumps stand out. Accordingly, we subjected 14 isolates of PoTl to resistance phenotype reversion tests using the ATP-Binding Cassette-type efflux pump inhibitor, verapamil hydrochloride (VER), in combination with two fungicides with distinct modes of action. The major limitation for using VER as an inhibitor is the low tolerance of this pathogen to concentrations ex- ceeding 1 mg.mL-1, at which metabolic activity drastically decreases. Despite strong indications of efflux pumps’ contribution to fungicide resistance in PoTl, ultimatelly VER was not capable of reverting resistance phonotypes found. This finding underscores the complexity of challenges in reversing resistance in PoTl and the need to explore effective alternatives to address this issue. Keywords: wheat blast; DMI; SDHI; verapamil hydrochloride; resistance reversal. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Determinação da DMT do cloridrato de verapamil por análise con- junta de variância no crescimento de quatro isolados de P. ory- zae, dois da linhagem Triticum e dois da linhagem Oryza............................................................................................. 24 Figura 2 - Comparação de médias para os tratamentos com VER, TBC e VER+TBC em 14 isolados de P. oryzae......................................... 28 Figura 3 - Comparação de médias para os tratamentos com VER, FLX e VER+FLX em 14 isolados de P. oryzae......................................... 29 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Nomenclatura dos isolados, espécies, local, ano de amostragem populacional e fenótipos de resistência previamente identifica- dos................................................................................................. 20 Tabela 2 - Isolados utilizados e doses testadas para DMT de VER............... 22 Tabela 3 - Representação esquemática da distribuição dos tratamentos por isolado........................................................................................... 22 Tabela 4 - Análise de variância do efeito dos tratamentos com VER, FLX, TBC, suas combinações sobre os isolados e perfis de sensibili- dade observado............................................................................. 25 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ABC ATP-Binding Cassette CHX Cicloheximidina CR Crescimento relativo DMI Inibidor da esterol-14-demetilase DMT Dose máxima tolerada EC50 Concentração efetiva 50 FLC Fluconazol FLX Fluxapiroxade MDR Resistência multidrogas (multidrug resistance) MFS Major Facilitator Superfamily MID Dose mínima inibitória (minimum inhibitory dose) PD Dextrose de batata (potato dextrose) PoTl Linhagem Triticum de Pyricularia oryzae QoI Inibidor de quinona Rh123 Rodamina 123 RH6G Rodamina 6G RZ Resazurina SDHI Inibidor da succinato desidrogenase TBC Tebuconazol TOL Tolftanato TPCL Cloreto de trifenilestanho VER Cloridrato de verapamil SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................... 15 2.1 DESCRIÇÃO DO PATÓGENO................................................................... 15 2.2 DESCRIÇÃO DA DOENÇA....................................................................... 15 2.3 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA E A LINHAGEM Triticum DE Pirycula- ria oryzae................................................................................................... 16 2.4 BOMBAS DE EFLUXO COMO MECANISMO DE RESISTÊNCIA MULTI- DROGAS................................................................................................... 17 2.5 CLORIDRATO DE VERAPAMIL COMO INIBIDOR DOS TRANSPORTA- DORES ATP-Binding Cassette................................................................ 18 2.6 RESAZURINA COMO INDICADOR DA ATIVIDADE METABÓLICA FÚN- GICA......................................................................................................... 19 3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 20 3.1 ISOLADOS DA LINHAGEM Triticum DE Pyricularia oryzae....................... 20 3.2 PREPARO DO MATERIAL BIOLÓGICO, MEIOS DE CULTURA E CON- DIÇÕES DE INCUBAÇÃO......................................................................... 20 3.3 RESAZURINA, LEITURAS DE ABSORBÂNCIA E CONCENTRAÇÕES DOS COMPOSTOS.................................................................................... 21 3.3.1 DOSE MÁXIMA TOLERADA DE CLORIDRATO DE VERAPAMIL E TESTE DE REVERSÃO DE FENÓTIPO.................................................... 21 3.4 TRATAMENTO DE DADOS....................................................................... 22 3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS........................................................................ 23 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 24 4.1 DOSE MÁXIMA TOLERADA DE CLORIDRATO DE VERAPAMIL............ 24 4.2 RESPOSTA DA LINHAGEM Triticum DE P. oryzae AOS TRATAMEN- TOS........................................................................................................... 26 4.2.1 RESPOSTA AO TEBUCONAZOL (DMI)..................................................... 25 4.2.2 RESPOSTA AO FLUXAPIROXADE (SDHI)............................................... 26 4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS PERFIS DE RESISTÊNCIA NA LINHAGEM Triticum DE Pyricularia oryzae, BOMBAS DE EFLUXO E EFEITO DO CLORIDRATO DE VERAPAMIL................................................................. 29 5 CONCLUSÕES.......................................................................................... 31 REFERÊNCIAS.......................................................................................... 32 11 1 INTRODUÇÃO A espécie Pirycularia oryzae consiste de um complexo de linhagens morfologi- camente semelhantes, porém geneticamente distintas, as quais adaptaram-se a dife- rentes hospedeiros de espécies cultivadas, como a linhagem Oryzae em arroz (PoOl), Triticum em trigo (PoTl), Lolium em azevém (PoLl) e outras gramíneas de importância econômica (BRUNO; URASHIMA, 2001; CHAKRABORTY et al., 2021). A brusone do trigo (wheat blast), causada pela linhagem Triticum desse asco- miceto, é reconhecidamente um dos principais fatores limitantes para a expansão da triticultura no Brasil desde suas primeiras observações no estado do Paraná em 1985 (URASHIMA et al., 1993). A importância do patógeno reside na susceptibilidade de grande parte das cultivares de trigo disponíveis; em sua ampla distribuição no território nacional, já tendo sido amostrado em São Paulo, Mato Grosso do Sul, Distrito Federal, Goiás e Minas Gerais; na persistência de seus inóculos em ampla variedade de espé- cies da família Poaceae, incluindo Chloris distichophylla, Cynodon spp., Digitaria in- sularis, Equinochloa crusgalli, Panicum maximum, Rhynchelytrum repens e Sorghum sudanense; na dispersão a distâncias moderadas por via aérea e, principalmente, em sua consistente resistência às principais moléculas fungicidas disponíveis para a cul- tura do trigo (URASHIMA et al., 2007; MACIEL et al., 2008; CASTROAGUDÍN et al., 2015; CASTROAGUDÍN et al. 2017; OLIVEIRA et al., 2015; POLONI et al., 2021; VI- CENTINI et al., 2022). Atualmente, o patógeno é motivo de preocupação internacional, pois alguns países importadores de trigo brasileiro registraram a ocorrência da brusone em anos recentes, como é o caso de Bangladesh no ano de 2016, onde a doença causou per- das significativas, com médias de aproximadamente 70% no distrito de Meherpur, 44% em Chuadanga e 37% no distrito de Jessore. Acredita-se que a introdução neste país asiático tenha ocorrido via grãos de trigo importados do Brasil. (ISLAM et al., 2016; CALLAWAY, 2016). Na África, a infecção por Pyricularia oryzae em trigo foi observada pela primeira vezem 2018, no Zâmbia, durante a estação chuvosa. Apesar de neste caso específico não ter sido possível identificar a fonte do inóculo, a hipótese mais provável permanece a de importação de grãos infectados (TEMBO et al., 2020). No Brasil, as perdas causadas podem chegar, em peso por espiga, nas ordens de 46 a até 72,5%, com menores perdas observadas na infecção tardia e maiores quando a infecção é precoce (GOULART; PAIVA, 2000; GOULART et al., 2007). 12 Além da já referida susceptibilidade da maioria das cultivares de trigo disponí- veis ao patógeno, há grande preocupação quanto ao manejo da doença em virtude do uso generalizado de fungicidas com sítios-alvo específicos sem a adoção de es- tratégias a fim de evitar a seleção de genótipos resistentes, levando à queda da efici- ência destas moléculas (CERESINI et al., 2018; PAGANI et al., 2014). Evidentemente, lançar mão de qualquer das duas alternativas de manejo isoladamente implacavel- mente resulta em grande prejuízo ao agricultor. A utilização de fungicidas com sítio-alvo específicos para o controle da doença tem apresentado níveis preocupantes de ineficácia (CRUZ et al., 2018). Atribuem-se como fatores o ambiente e clima favoráveis ao desenvolvimento da doença no Brasil, complicações para alcançar os locais nas espigas em que a infecção se inicia e, prin- cipalmente, a sensibilidade reduzida ou resistência do patógeno, fenótipos já encon- trados em isolados de PoTl (CASTROAGUDÍN et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2015; POLONI et al., 2021). Os mecanismos de resistência mais comuns a fungicidas com sítio-alvo espe- cíficos são alterações na expressão das proteínas atingidas por essas moléculas, das quais destacam-se alterações na estrutura molecular, tornando a ligação entre prote- ína e fungicida dificultada ou impossível; ou sua superexpressão, levando à síntese em grandes quantidades ao ponto de manter a via metabólica ativa (CASTROAGUDÍN et al., 2015). Contudo, considerando o sítio-alvo dos DMIs, populações de PoTl estu- dadas até o momento não apresentaram alterações estruturais na esterol-14-demeti- lase ou em regiões promotoras do gene, evidenciando que o mecanismo para este patógeno deve ser mais abrangente e inespecífico do que as mutações mais comuns (POLONI et al., 2021). A resistência multidrogas (Multidrug Resistance - MDR) é um fenômeno no qual um organismo, desenvolve redução de sensibilidade a múltiplas drogas não relacio- nadas. Isso frequentemente é causado pela superexpressão de bombas de efluxo, ou seja, transportadores membranares responsáveis por bombear uma miríade de subs- tâncias presentes no citosol para o meio extracelular, sendo a própria característica de inespecificidade destes componentes estruturais aos seus substratos um dos prin- cipais argumentos a favor deste mecanismo (KRETSCHMER et al., 2009; OMNRANE et al., 2015; FISCHER et al., 2018; WANG et al., 2018). Há duas principais classes de transportadores capazes de agir como bombas de efluxo para moléculas fungicidas: os transportadores ABC (ATP-binding cassette), 13 utilizadores de ATP no transporte de moléculas na membrana, e os MFS (major faci- litator superfamily), os quais utilizam gradiente de prótons na transferência de molé- culas (PERLIN et al., 2014). Essas duas classes correspondem a aproximadamente metade de todos os genes codificadores de transportadores membranares dos fungos (PAULSEN et al., 1998). As duas categorias de transportadores ocorrem em diferen- tes tipos de membranas, como vacuolares, do retículo endoplasmático, peroxissomas e das mitocôndrias (ESQUIVEL; WHITE, 2017; PERLIN et al., 2014; SUN et al., 2006; THOMAS; TAMPÉ, 2020). Dentre possíveis substâncias candidatas, o cloridrato de verapamil (VER) se mostrou um potencial inibidor dos transportadores do tipo ABC. Gupta e colaborado- res (2013), expondo Mycobacterium tuberculosis ao antibiótico rifampicina in vitro, en- contraram quantidade duas vezes maior da molécula dentro das células bacterianas tratadas com VER em contraste com as testemunhas. Para o fungo Candida albicans, doses de VER inibiram o transporte da adesina Hwp1, associada ao desenvolvimento de hifa e sua adesão (YU et al., 2014). Utilizando isolados de populações de PoTl com níveis de sensibilidade ao fun- gicida da classe DMI tebuconazol (TBC) e ao SDHI fluxapiroxade (FLX) conhecidos, atingir a reversão de fenótipo resistente para um fenótipo sensível ao expô-los à estas moléculas associadas ao VER seria uma forte evidência do papel das bombas de efluxo no mecanismo de resistência deste patógeno. Uma vez observada a resistência multidrogas em P. oryzae linhagem Triticum, assim como a ausência de algumas das principais mutações para resistência às prin- cipais classes fungicidas, o objetivo deste trabalho foi testar o cloridrato de verapamil como inibidor de transportadores da família ABC em busca da reversão do fenótipo de resistência. 14 2 REVISÃO DE BIBLIOGRAFIA 2.1 DESCRIÇÃO DO PATÓGENO Em Pyricularia oryzae, os conídios assexuais são caracterizados pela forma de pera, os quais consistem de três células com núcleos idênticos, apresentando colora- ção transparente a cinza claro, já a forma sexuada produz ascósporos de quatro cé- lulas com um peritécio relativamente comprido (CRUZ; VALENT, 2017). A espécie é auto-incompatível e o cruzamento apenas ocorre no encontro de dois tipos sexual- mente compatíveis (mating type) e férteis (KANG et al., 1994), entretanto, somente sua forma assexuada ocorre naturalmente (HAYASHI; NAITO, 1997). O potencial evo- lutivo para aquisição de resistência a fungicidas na espécie tem como um de seus principais mecanismos o fluxo gênico e genotípico (MACIEL et al., 2014) associados à grande dispersão ocorrida via vento e por sementes infectadas (CERESINI et al., 2018). Quando em superfícies úmidas, os conídios germinam e formam apressórios. Em folhas cobertas com orvalho, por exemplo, os apressórios exercem uma pressão de turgor consideravelmente alta para penetrar a planta e colonizá-la. Quando em espécies não hospedeiras, o fungo exibe dificuldade em penetrar os tecidos vegetais e, mesmo nos casos em que obtém sucesso na tentativa, as plantas exibem reações de hipersensibilidade, demonstrando a alta especificidade de suas linhagens (ARA- ÚJO et al., 2016). 2.2 DESCRIÇÃO DA DOENÇA A ocorrência da brusone do trigo é favorecida em umidade relativa elevada, na ordem de 90%, e em temperaturas na faixa dos 28ºC, condições nas quais a produção dos conídios é intensificada (ALVES; FERNANDES, 2006). O patógeno é capaz de infectar todos os órgãos da planta, mas é mais importante na espiga, onde causa os maiores danos do ponto de vista produtivo (PRESTES et al., 2007). As lesões da folha são de cor marrom escuro e centro acinzentado. Nas espigas, há descoloração na porção imediatamente superior ao ráquis, principal ponto de infecção, o qual adquire aspecto escuro (LIMA, 2004). As espigas produzem grãos pequenos, murchos e de- formados que não são adequados para consumo humano (MALAKER et al., 2016). 15 Se a infecção ocorrer antes da antese ou no início desta, pode levar à esterilidade total das espigas e abortamento dos grãos (URASHIMA et al., 2009). 2.3 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA E A LINHAGEM Triticum DE Pyricularia ory- zae Pode-se classificar a resistência de duas formas: primária e secundária. A re- sistência primária, também chamada intrínseca, é observada como correndo natural- mente nos microrganismos sem exposição prévia à molécula antifúngica testada. A resistência secundária é fruto de seleção, ou seja, após populações suscetíveis serem continuamente expostas aos fungicidas, fenótipos com sensibilidade reduzida emer- gem, sendo em grande parte graças a alterações na expressão gênica (JAMIU et al., 2021). No que diz respeito às principais moléculas fungicidas utilizadas na cultura, os DMIs - inibidores da esterol-14-demetilase - têm sido utilizados desde 1989, enquanto os QoIs - inibidores de quinona -, desde 2001, apresentando níveis significativos de ineficácia (CRUZ et al., 2018). A resistência aos fungicidas QoI está diretamente rela- cionada à mutação no citocromo B, com a alteração do aminoácido glicina (G) por alanina (A) na posição 143 da proteína (G143A), encontrada em P. oryzae e outras espécies e gêneros de fungos (CASTROAGUDÍN et al., 2015). Diante disto, não se fez necessário investigar o mecanismo de resistência a QoIs em PoTl. A resistência aos fungicidas DMIs, ou azóis, para a maioria das espécies estu- dadas com a finalidade de descrever mecanismos de resistência, como Cercospora beticola (SPANNER, 2021), são atribuídas a uma mutação não sinônima no sítio-alvo esterol 14-demetilase. Esta alteração, associada à expressão constitutiva do transpor- tador ABC1, é um mecanismo importante na resistência a DMIs em Candida spp (MA- RICHAL et al., 1999; LAMPING et al., 2009). Uma vez que a maioria das substituições nos isolados brasileiros de PoTl são sinônimas e as não sinônimas não interferem em sua sensibilidade, levantou-se a hipótese de que o fenótipo resistente tenha sua ori- gem na superexpressão do CYP51, causada por inserções em sua região promotora, porém tais inserções não foram encontradas em CYP51A e CYP51B, tornando o me- canismo de resistência a azóis ainda passível de elucidação (POLONI et al., 2021). Populações de PoTl amostradas nos anos de 2012 e 2018 nos estados de Mi- nas Gerais, São Paulo e Paraná, demonstraram elevados níveis de insensibilidade ao 16 QoI azoxistrobina (89% dos 157 isolados) e ao TBC (100% dos isolados), isolada e cumulativamente, observação que demonstra como a característica está presente em populações geograficamente distintas e pôde persistir por pelo menos seis anos em áreas de cultivo. A ausência de sensibilidade em PoTl se estende a moléculas às quais as populações do patógeno ainda não haviam sido expostas em campo (VICEN- TINI et al., 2021). Este é o caso da sensibilidade reduzida a FLX, molécula da classe das carbo- xamidas (SDHI), inibidoras da succinato desidrogenase, um importante componente da cadeia respiratória mitocondrial. Ainda neste trabalho conduzido por Vicentini e colaboradores (2021), o fenótipo de sensibilidade reduzida foi observado em 91,6% dos isolados de 2012. Para os isolados de populações de 2018, após a introdução dos SDHIs no país, foi observada redução na sensibilidade em aproximadamente 50% desses, além de cinco isolados altamente resistentes ao fluxapiroxade. Os autores sequenciaram o material genético dos isolados e não foram encontradas variações não sinônimas nos genes sdhB, sdhC e sdhD. Uma vez que há populações do pató- geno apresentando este comportamento para uma molécula à qual ainda não haviam sido expostas e não foram identificadas mutações nos genes sdhB, sdhC e sdhD, levanta-se a hipótese de um mecanismo pré-existente e inespecífico para explicar tal fenótipo. 2.4 BOMBAS DE EFLUXO COMO MECANISMO DE RESISTÊNCIA MULTIDRO- GAS As bombas de efluxo apresentam a peculiar característica de serem capazes de transportar diversos substratos química e estruturalmente não relacionadas, como as próprias moléculas fungicidas, herbicidas, lipídeos, esteroides etc (PRASAD et al., 2019) e as principais classes de transportadores são ATP-binding cassette (ABC) e Major Facilitator Superfamily (MFS) (PERLIN et al., 2014). A superexpressão de bombas de efluxo da classe ABC tem papel fundamental na resistência a DMIs em Candida albicans, em particular as proteínas CDR1 e CDR2 (TAVAKOLI et al., 2010). Já em Candida krusei, a resistência a esta classe está as- sociada à superexpressão das bombas de efluxo CkABC1 e CkABC2, homólogas das CDR1 e CDR2, porém não foi identificado nenhum transportador da classe dos MFS nesta espécie (KATIYAR; EDLIND, 2001). 17 Na linhagem Oryza de P. oryzae, Lee e colaboradores (2005) estudando o gene ABC2, observaram aumento significativo na expressão deste na presença de DMIs - tebuconazol incluso, concluindo que os transportadores ABC desempanham papel decisivo na resistência à estes fungicidas. Ao testar a hipótese de bombas de efluxo como mecanismo da MDR em 16 isolados de PoTl, Vicentini e colaboradores (2022) utilizaram quatro compostos anti- fúngicos já caracterizados como substratos destes transportadores, sendo eles tolnaf- tato (TOL), cicloheximida (CHX), rodamina 6G (RH6G) e cloreto de trifenilestanho (TPCL). A CHX serve como substrato para transportadores ABC e MFS e a maioria dos isolados apresentou sensibilidade, contudo, dois isolados que apresentaram ní- veis de insensibilidade não mostraram relação com a MDR. Para o TPCL e a RH6G, sete isolados apresentaram insensibilidade apenas à RH6G e nove a ambos, com boa correlação entre a concentração de eficiência necessária para reduzir o desenvolvi- mento do microrganismo em 50% (EC50) destes substratos e a EC50 de DMI, ou seja, evidenciando a MDR como mecanismo de resistência plausível neste caso, com par- ticipação importante do tipo ABC, pois a RH6G é substrato específico desta classe (SILVA et al., 2013). Alguns isolados resistentes a FLX mostraram fenótipo de sensi- bilidade a TBC e um isolado de PoOl se mostrou resistente a TBC e sensível a FLX, colocando o mecanismo de resistência aos inibidores da succinato desidrogenase em situação ambígua. 2.5 CLORIDRATO DE VERAPAMIL COMO INIBIDOR DE BOMBAS DE EFLUXO EM PATÓGENOS COM RESISTÊNCIA MULTIDROGAS O cloridrato de verapamil (VER), antagonista dos canais de cálcio da classe das fenilalquilaminas, é utilizado na área da saúde nos tratamentos de hipertensão e angina de peito (KAPLAN, 1989; BROGDEN; BENFIELD, 1996). Vega-Chacón e co- laboradores (2021) estudaram a inibição das bombas de efluxo em isolados resisten- tes e sensíveis ao DMI fluconazol (FLC) C. albicans por VER, sua ação conjunta com FLC e o efeito do inibidor na sobrevivência de larvas de Galleria mellonella (traça-da- cera). O efeito isolado do VER em concentrações superiores à mínima inibitória (MID = 4 mg/mL) reduziu a atividade metabólica dos biofilmes de ambos isolados, sensíveis e resistentes. A combinação de VER com FLC a 64 μg.mL-1, dose inferior à MID deste fungicida, foi capaz de reduzir de forma significativa o crescimento dos isolados 18 resistentes, porém não houve efeito significativo sobre os suscetíveis, explicado pela expressão regular de transportadores membranares. Corroborando este resultado, foi possível observar, a partir do uso do substrato de bombas de efluxo rodamina 123 (Rh123), que este composto foi encontrado em maiores quantidades no interior das células dos isolados sensíveis quando comparado com os resistentes. Não obstante, o uso de VER e Rh123 foi capaz de aumentar a retenção intracelular da droga nos resistentes. 2.6 RESAZURINA COMO INDICADOR DA ATIVIDADE METABÓLICA FÚNGICA A resazurina (RZ) é um indicador metabólico visual (corante) utilizado ampla- mente em experimentos de sensibilidade a diversos compostos em bactérias, fungos e células de mamíferos (MANIA et al., 2010). Trata-se de um composto não tóxico que age como receptor intermediário de elétrons na cadeia transportadora na mitocôndria, sem interferir em no transporte normal dos elétrons (PAGE et al., 1993). Nestes expe- rimentos, a atividade metabólica é verificada inicialmente pela coloração da amostra, uma vez que a forma reduzida apresenta aspecto róseo, enquanto sua forma oxidada possui coloração azul, portanto, amostras com coloração rosa apresentam atividade normal, enquanto as azuladas indicam redução ou paralização da respiração celular (PRAKASH et al., 2018; O’BRIEN et al., 2000). Estas variações geralmente são me- didas com auxílio de espectrofotômetro, utilizando comprimentos de onda de 569 nm (BALBAIED; MOORE, 2020). 19 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 ISOLADOS DA LINHAGEM Triticum DE Pyricularia oryzae Foram selecionados 14 isolados da linhagem Triticum de P. oryzae, classifica- dos de acordo com seus níveis de resistência ao TBC e ao FLX, oriundos de popula- ções amostradas nos anos de 2012 e 2018 nos estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Paraná e no Distrito Federal (Tabela 1). Tabela 1 - Nomenclatura dos isolados, espécies, local, ano de amostragem popula- cional e fenótipos de resistência previamente identificados Isolado Espécie Locala Ano Fenótipo FLXb Fenótipo TBCb 12.1.045i PoTl SP 2012 SR R 12.1.130 PoTl MS 2012 SR AR 12.1.037 PoTl DF e GO 2012 SR R 12.1.299 PoTl PR 2012 MR R 12.1.015 PoTl MG 2012 SR R 12.1.183 PoTl MS 2012 MR R 12.1.165 PoTl DF e GO 2012 S R 12.1.312 PoTl PR 2012 MR R 12.1.005 PoTl MG 2012 S R 18SPK6 PoTl SP 2018 SR R 18SPC10 PoTl SP 2018 MR R 18MGH19 PoTl MG 2018 SR R 18MGH25 PoTl MG 2018 SR MR 18MGF3 PoTl MG 2018 MR R Nota: aDF = Distrito Federal, GO = Goiás, MG = Minas Gerais, MS = Mato Groso do Sul, PR = Paraná, SP = São Paulo; bNíveis de resistência identificados em trabalhado anterior de Vicentini e colaborado- res (2022), para os quais S = sensível, SR = sensibilidade reduzida, MR = moderadamente resistente, R = resistente e AR = altamente resistente. Fonte: 3.2 PREPARO DO MATERIAL BIOLÓGICO, MEIOS DE CULTURA E CONDI- ÇÕES DE INCUBAÇÃO Os testes de reversão do fenótipo de resistência foram conduzidos em micro- placas de fundo chato com 96 poços cada (KASVI, Índia). O protocolo utilizado se fundamentou na obtenção de fragmentos de micélio como matéria-prima biológica (PELAÉZ et al., 2006; BRITO et al., 2020). O micélio foi preparado após reativação dos isolados em meio meio ágar aveia (30 g.L-1 de aveia integral em flocos finos, 25 g.L-1 de ágar e 0,1 g.L-1 do antibiótico 20 cloranfenicol), submetidas à temperatura constante de 25 ºC e fotoperíodo de 12 ho- ras em incubadora tipo BOD (biochemical oxygen demand) pelo período de dez dias. Após a incubação, extraiu-se o micélio das colônias, transferindo-o para microtubos com 1,5 mL de capacidade, contendo 0,5 mL em volume de esferas de vidro estéreis com 2 mm de diâmetro e 1 mL de água destilada. A matéria fúngica foi fragmentada utilizando fast-prep ajustado para a velocidade 4.0 (4 m.s-1) durante 20 segundos. As suspensões foram diluídas para o volume final de 10 mL, sendo ajustadas para 104 fragmentos por mL tomando por base contagens em câmara de Neubauer. Os fungicidas foram testados em suas doses mínimas inibitórias (MDI), sendo mistu- rados em meio de cultura líquido à base de dextrose de batata (PD) preparados com 0.025M de solução tampão de fosfato, com pH final ajustado para 5,0. Finalmente, cada poço da microplaca recebeu 50 µL da suspensão biológica e 100 µL de meio de cultura líquido PD, com concentrações variáveis dos inibidores e fungicidas, sendo vedada com plástico filme e mantida sem exposição à luz sob 25ºC de temperatura e à agitação de 150 rpm por cinco dias. 3.3 RESAZURINA, LEITURAS DE ABSORBÂNCIA E CONCENTRAÇÕES DOS COMPOSTOS Os poços das microplacas receberam, individualmente, 50 μL de RZ em con- centração de 150 μM após o período de incubação final, a qual foi automaticamente corrigida para 40 μM nos 200 μL totais de solução em cada poço. As leituras de ab- sorbância no tempo zero (T0), imediatamente após a retirada das amostras de seu período de incubação, foram feitas com utilização de um leitor de microplacas (Fotô- metro de Microplacas Multiskantm FC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) calibrado para 569 nm. As leituras finais ocorreram da mesma maneira no mesmo comprimento de onda, após 4h de reação (T4) mantidas em BOD sob temperatura de 25ºC sem exposição à luz. As operações se repetiram para todos os experimentos descritos a seguir. 21 3.3.1 DOSE MÁXIMA TOLERADA DE CLORIDRATO DE VERAPAMIL E TESTE DE REVERSÃO DE FENÓTIPO O trabalho foi conduzido em duas etapas. Na primeira, procuramos determinar a DMT de VER (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) utilizando quatro isolados de P. oryzae, dois da linhagem Triticum e dois da linhagem Oryza, obtidos da coleção exis- tente no laboratório de genética molecular da Faculdade de Engenharia de Ilha Sol- teira (FEIS). O uso de linhagens diferentes garante ao resultado uma abrangência maior, subsidiando a confiabilidade do uso posterior do inibidor de bombas de efluxo exclusivamente na linhagem Triticum (Tabela 2). Na segunda etapa, foram conduzidos experimentos de reversão de fenótipo para cada isolado constante na Tabela 1 (N=14). As duas etapas foram conduzidas em delineamento inteiramente casualizado. Os seis tratamentos para cada isolado nos experimentos de reversão de fenótio de resistência constam na Tabela 3. Tabela 2 – Isolados utilizados e doses testadas para DMT de VER Isolados PoTl VER (mg.mL-1)b 18MGH11 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 18MGF3 Isolados PoOla VER (mg.mL-1) 421 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 656 Nota: aPoOl = linhagem Oryza de Pyricularia oryzae; bDoses testadas com base em experimentos com C. albicans (VEGA-CHACÓN, 2020). Tabela 3 – Representação esquemática da distribuição dos tratamentos por isolado Isolado PoTl – VERa –b FLXd TBCe –c FLXd TBCe Nota: aCloridrato de verapamil = 1,0 mg.mL-1; btratamento controle ou testemunha; ctratamento apenas com VER; ddose fluxapiroxade = 5,0 µg.mL-1; ddose tebuconazol = 1,0 µg.mL-1. 22 3.4 TRATAMENTO DE DADOS Em posse dos valores brutos obtidos nas leituras de absorbância, foi estimada a redução da RZ para cada tratamento da seguinte maneira: ∆C = 𝐶𝑡0 − 𝐶𝑡4 (1) Na qual Ct0 é a leitura imediatamente após a adição da RZ na amostra após cinco dias de incubação, e Ct4, após as quatro horas depois da adição do corante. O Crescimento Relativo (CR) foi determinado para cada isolado individual- mente como forma de tratamento de dados para uma verificação mais objetiva em contraste à testemunha, comparando-a às leituras com VER e suas combinações com fungicidas, cuja fórmula se apresenta abaixo: CR = ∆C𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 ∆C𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒𝑚𝑢𝑛ℎ𝑎 ∗ 100 (2) 3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS Os CRs de cada isolado nas duas etapas (DMT e reversão de fenótipo) foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk para verificação de normalidade nos experimen- tos de determinação da DMT e de reversão de fenótipo, não sendo verificada signifi- cância (p = 0,05). A seguir, realizamos análise de variância pelo teste F, para então aplicar o teste Scott-Knott de comparação de médias com 5% de probabilidade. Os resultados estatísticos estão representados graficamente em bloxpots. To- das as análises, testes e plotagem de gráficos foram feitos com o software R, lançando mão da biblioteca stats e função shapiro.test para avaliação da normalidade, bibliote- cas agricolae e laercio para análise de variância e, por fim, biblioteca tidyverse 1.3.1 , pacotes ggplot2 3.3.5, purrr 0.3.4, tribble 3.1.6, dplyr 1.0.7, tidyr 1.1.4, stringr 1.4.0, readr 2.1.0 e forcats 0.5.1 e funções ggplot, geom_boxplot, stat_summary, geom_jit- ter, ggtitle, theme e geom_text. 23 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 DOSE MÁXIMA TOLERADA DE CLORIDRATO DE VERAPAMIL A análise de variância (ANOVA) para o experimento de determinação da DMT do VER para o patógeno estudado indicou diferença significativa pelo teste F a 5% de probabilidade, desta forma, foi realizado teste Scott-Knott para comparação de médias, os quais podem ser verificados nos boxplots (figura 1), ficando estabelecida a dose de 1 mg.mL-1 como máxima tolerada. Figura 1 – Determinação da DMT do cloridrato de verapamil por análise conjunta de variância no crescimento de quatro isolados de P. oryzae, dois da linhagem Triticum e dois da linhagem Oryza Nota: A imagem apresenta Boxplots com as medianas representadas por linhas pretas horizontais, a média como circulo em vermelho saturado e os pontos com dados dispersos em roxo e laranja com brilho reduzido para evitar sobreposição. O crescimento relativo está representado verticalmente, com limite superior de 200%, enquanto as variações na dose de VER, de 0 a 4 mg.mL-1 se encontram no eixo hoizontal. O teste F para as diferentes doses do inibidor de bombas de efluxo foi significante a, no mínimo, 5% de probabilidade. Boxplots com a mesma letra (A ou B) indicam que o crescimento relativo dos isolados conjuntamente não variaram conforme a dose de VER foi incrementada de acordo com teste de comparação de médias de Scott-Knott a, pelo menos, 5% de probabilidade. Fonte: O estabelecimento da DMT em 1 mg.mL-1 se deve, além do subsídio estatístico, à intenção de inibir o máximo possível as bombas de efluxo supostamente presentes nos isolados estudados. Não bostante, fica evidenciada a semelhança entre o crescimento relative dos isolados em dose zero até a DMT, as quais não diferiram pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Desta forma, as análises estatísticas da segunda etapa de experimentos compararam três tratamentos cada: VER, FLX e VER com FLX (Figura 1); VER, TBC e VER com TBC (Figura 2). Concentração de VER C re sc im en to R el at iv o 24 4.2 RESPOSTA DA LINHAGEM Triticum DE P. oryzae AOS TRATAMENTOS O crescimento dos isolados estudados não diferiu estatisticamente pelo teste F entre a dose zero e a DMT de VER para os 14 isolados estudados. A análise de variância (ANOVA) indicou que, para a maioria dos isolados de PoTl, houve diferença significativa para o crescimento relativo entre os tratamentos (Tabela 4). Resultados similares foram encontrados por Vicentini e colaboradores (2022), os quais, segundo os autores, são indicativos da presença de outro mecanismo de resistência além das bombas de efluxo. Os perfis foram classificados de acordo com o CR para fungicida, sendo sensíveis (S) quando CR foi igual a 0%, sensibilidade reduzida (SR) para CR entre 1 e 50%, moderadamente resistente (MR) quando CR esteve entre 50 e 75% e resistente (R) para CR maior que 75%. Tabela 4 – Análise de variância do efeito dos tratamentos com VER, FLX, TBC, suas combinações sobre os isolados e perfis de sensibilidade observado Isolado PoTl Fcalc FLX p FLX PSFLX a Fcalc TBC p TBC PSTBC 12.1.045i 335,81 0,00* SR 1,96 0,16ns MR 12.1.130 1,89 0,17ns R 1,79 0,19ns R 12.1.037 1,99 0,16 ns R 0,13 0,87ns R 12.1.299 477,86 0,00* SR** 8,92 0,00* R 12.1.015 96,11 0,00* SR 0,87 0,43 ns R 12.1.183 6,40 0,00* R 0,39 0,67 ns R 12.1.165 30,52 0,00* SR 2,45 0,11 ns R 12.1.312 136,83 0,00* SR 0,72 0,50 ns R 12.1.005 573,15 0,00* SR 3,75 0,04* R** 18SPK6 84,72 0,00* SR 14,34 0,00* R 18SPC10 314,1 0,00* SR 0,48 0,62 ns R 18MGH19 868,05 0,00* SR 0,42 0,66ns R 18MGH25 15,22 0,00* SR 0,001 0,99ns R 18MGF3 1437,20 0,00* SR 3,10 0,06ns R Nota: *Significativo pelo teste F a 5% de probabilidade; nsnão significativo; **Observada reversão do fenótipo estatística; aPS = Perfil de Sensibilidade. Fonte: 4.2.1 RESPOSTA AO TEBUCONAZOL (DMI) Para 11 dos 14 isolados estudados não houve diferença significativa quanto ao crescimento para os três principais tratamentos, sendo indicativo de resistência ao 25 TBC. A diferença significativa nas médias do isolado 12.1.005 corresponde a siner- gismo entre VER e TBC (Figura 2), com reversão do fenótipo, porém não suficiente para reduzir o crescimento relativo para quase zero, com CR de 75%. O teste de mé- dias significativo para o isolado 12.1.299 não se tratou de reversão de fenótipo, sendo, na realidade, observada resistência ao TBC, uma vez que o crescimento para trata- mento com VER associado ao TBC (CR = 77,75%) não diferiu do tratamento apenas com TBC (CR = 67,38%) (Figura 2). Por fim, o tratamento apenas com VER no isolado 18SPK6 teve média significativamente inferior (CR = 80,75%) aos outros dois trata- mentos, com TBC (CR = 123,82%) e associação de ambos (CR = 109,21%). O isolado 12.1.045i apresentou fenótipo moderadamente resistente (50% < CR ≤ 75%), o qual potencialmente poderia resultar em reversão de fenótipo, porém este resultado não foi observado. A resposta geral dos isolados ao TBC, portanto, é predominantemente de re- sistência moderada ou completa (CR > 50%), ainda que com adição de VER, com identificação de reversão do fenótipo para o isolado 12.1.005. 4.2.2 RESPOSTA AO FLUXAPIROXADE (SDHI) O fenótipo predominante nos isolados estudados foi de sensibilidade ao FLX, com nove de 14 apresentando CR ≤ 10%, contudo, ao considerar aqueles com sensi- bilidade reduzida (CR ≤ 50%), a quantidade de isolados sobe para 12 do total. Para os dois isolados cujo CR foi superior a 50% (12.1.130 e 12.1.037), não foi identificada diferença significativa entre os tratamentos testados (Figura 3). Houve diferença significativa podendo indicar reversão de fenótipo para um iso- lado (12.1.299), contudo, seu crescimento relativo no tratamento com VER sem adição de fungicida foi igual a 99,5%, enquanto com FLX sem VER foi 9,47% e a combinação de VER com FLX foi 1,80%. Portanto, o isolado já apresenta nível intrínseco de sen- sibilidade, a qual foi intensificada pela presença do VER. Outro isolado (12.1.015) apresentou médias estatisticamente diferentes para todos os tratamentos (Figura 3), contudo, a menor média foi para o tratamento apenas com FLX (CR = 5,97%), a intermediária para a associação VER com FLX (CR = 37%) e a maior, VER sem FLX (CR = 95%), indicando que a presença do inibidor interferiu de maneira antagônica, aumentando a sobrevivência do isolado. Comportamento dis- tinto foi observado para o isolado 12.1.183, no qual o tratamento apenas com inibidor 26 teve média inferior aos outros dois (CR = 84,75%), os quais não diferiram (Figura 3), contudo, tal resultado poderia ser devido a fatores não previstos no desenvolvimento do isolado em questão. Em suma, o perfil majoritário dos isolados à exposição ao FLX é de sensibili- dade (CR ≤ 50%), com fenótipo de resistência para os isolados 12.1.183, 12.1.037 e 12.1.130 (CR > 75%), havendo pouca interferência do VER nestes casos. Isto é expli- cado pela ausência de mutações nas subunidades da succinato desidrogenase, às quais estão diretamente ligadas à resistência aos SDHIs em diversos patógenos, tais como Alternaria solani, Botrytis cinerea, Corynespora casiicola, Sclerotinia sclerotio- rum e Zymoseptoria tritici, (SANG; LEE, 2020), às quais não foram encontradas em PoTl. 27 Figura 2 – Comparação de médias para os tratamentos com VER, TBC e VER+TBC em 14 isolados de P. oryzae Nota: Boxplots com a mesma letra não possuem médias diferentes pelo teste de Scott-Knott a, pelo menos, 5% de probabilidade. Tratamentos encontram-se no eixo horizontal e crescimento relativo, no vertical. Fonte: Elaborado pelo autor. 28 Figura 3 – Comparação de médias para os tratamentos com VER, FLX e VER+FLX em 14 isolados de P. oryzae. Nota: Boxplots com a mesma letra não possuem médias diferentes pelo teste de Scott-Knott a, pelo menos, 5% de probabilidade. Tratamentos encontram-se no eixo horizontal e crescimento relativo, no vertical. Fonte: Elaborado pelo autor. 29 4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS PERFIS DE RESISTÊNCIA NA LINHAGEM Triticum DE Pyricularia oryzae, BOMBAS DE EFLUXO E EFEITO DO CLORIDRATO DE VE- RAPAMIL De maneira geral, os isolados apresentaram padrão de crescimento similar ao classificado por Poloni e colaboradores (2021) e Vicentini e colaboradores (2022) quando expostos aos fungicidas, com predomínio de fenótipos resistentes a TBC e sensíveis a FLX, sendo este último resultado esperado da baixa exposição do pató- geno à molécula e à ausência de mutações não sinônimas no sítio-alvo (VICENTINI et al., 2022). Soma-se isto à observação de isolados cujo crescimento não diferiu es- tatisticamente entre o tratamento controle e a exposição ao SDHI testado, como 12.1.130 e 12.1.037, obtidos na região Centro-Oeste no ano de 2012, resulta em for- talecimento da hipótese de um mecanismo inespecífico e pré-existente de resistência não diretamente associado à pressão de seleção. As poucas divergências parecem ser resultado da acurácia metodológica, sendo o uso da RZ na avaliação metabólica dos isolados tanto ou mais precisa que o uso de espectrofotometria sem corante indi- cador (SILVA et al., 2023), além do uso de dose inibitória (5 µg.mL-1) superior à EC50 (3 µg.mL-1) estudada por Vicentini e colaboradores (2022). Considerando a verificação de reversão parcial do fenótipo de resistência para apenas dois dos 14 isolados ora estudados, sendo um para TBC (12.1.005) e um para FLX (12.1.299), é possível que no caso das bombas de efluxo como importante me- canismo de redução de sensibilidade em PoTl, o VER não seja um inibidor adequado, visto que a baixa concentração da DMT não seria suficiente para inibir os transporta- dores de forma a reverter o fenótipo dos outros isolados resistentes, ao passo que concentrações maiores inibem o crescimento do fungo per se (VEGA-CHACÓN et al., 2021; YU et al., 2014). A resistência a fungicidas com sítios-alvo de ação específicos em PoTl pode ser resultado de uma combinação diversificada de mecanismos. A depender da linha- gem e da população, a resistência varia para substâncias quimicamente não relacio- nadas, devido à maneira como essas substâncias são reconhecidas pelos sistemas de efluxo dos patógenos (POLONI et al., 2021). A resistência a DMIs em C. albicans, por exemplo, ocorre pela combinação de alterações na estrutura do sítio-alvo, bem como sua superexpressão, superexpressão de bombas de efluxo (CaCDR1/CaCDR2 e MDR1), via metabólica alternativa, aneuploidia e perda de heterozigosidade (JAMIU 30 et al., 2021). Em Zymoseptoria tritici, transportadores do tipo MFS foram identificados e descritos como uma das causas da resistência a várias moléculas inibidoras da suc- cinato desidrogenase, incluindo o FLX (OMRANE et al., 2017), sendo a duplicação de um parálogo do SdhC fator relevante neste fenótipo (STEINHAUER et al., 2019). Pos- síveis inibidores da classe MFS incluem as drogas inibidoras de bombas de prótons, como omeprazol e pantoprazol, sendo este último capaz de agir sinergicamente com DMIs em C. albicans, reduzindo sua resistência (EL-GANINY et al., 2023). As evidências citadas e apresentadas neste trabalho sugerem participação de um mecanismo de resistência não específico em PoTl. Há indícios significativos de que esse mecanismo esteja relacionado às bombas de efluxo quanto ao TBC, dadas as respostas observadas na presença de substratos específicos desses transportado- res (VICENTINI et al., 2022) e a ausência de alterações significativas no CYP51 e seus análogos (POLONI et al., 2021). Contudo, considerando que as duas reversões encontradas não são representativas para o quadro completo, e que os isolados pos- suem perfis de sensibilidade e resistência consideravelmente distintos para os dois fungicidas estudados, outros mecanismos devem estar envolvidos de maneira tão im- portante quanto as bombas de efluxo. 31 5 CONCLUSÕES O uso do inibidor de bombas de efluxo, VER, não se demonstrou definitiva- mente capaz de reverter fenótipos de resistência para qualquer uma das duas classes de fungicidas avaliadas. Este resultado pode ser consequência tanto da interferência direta da substância no metabolismo do patógeno, quanto da impossibilidade de tes- tes em concentrações mais altas do inibidor. Os isolados apresentaram padrão majoritário de sensibilidade ao fungicida SDHI fluxapiroxade – sendo a ausência das mutações no sítio-alvo um fator de grande relevância – em contraste com o fungicida DMI tebuconazol, ao qual demonstraram resistência. Há indícios de que a resistência em PoTl, em especial para DMIs, envolve uma combinação complexa de mecanismos, incluindo bombas de efluxo e outros fatores genéticos e moleculares além de substituições não sinônimas e alterações em regiões promotoras, sendo necessário que estudos avaliando outros mecanismos sejam per- formados para identifica-los. 32 REFERÊNCIAS ALVES, K. J. P.; FERNANDES, J. M. C. Influência da temperatura e da umidade re- lativa do ar na esporulação de Magnaporthe grisea em trigo. 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