UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA 

 

 

 

 

 

 

Iael Weissberg Minutentag 
 

 

 

 

Identificação de novos RNAs não 

codificadores (ncRNAs) associados 

com a carcinogênese colorretal 
 

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 
Botucatu, para obtenção do título de 
Doutora em Cirurgia e Medicina 
Translacional.  

 

   

 

Orientadora: Profa. Dra. Sandra Drigo Linde 

 
 

Botucatu 

2023 
 

 

 

  



                                                

 

  

Iael Weissberg Minutentag 

 

 

 

 

Identificação de novos RNAs não codificadores 

(ncRNAs) associados com a carcinogênese 

colorretal 

  

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de 

Medicina, Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 

Botucatu, para obtenção do título de 

Doutora em Cirurgia e Medicina 

Translacional 

  

   

 

 

Orientadora: Profa. Dra. Sandra Drigo Linde 

 

Botucatu 

2023 

  



M668i
Minutentag, Iael Weissberg
    Identificação de novos RNAs não codificadores
(ncRNAs) associados com a carcinogênese colorretal / Iael
Weissberg Minutentag. -- Botucatu, 2023
    75 p. : il., tabs.

    Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista
(Unesp), Faculdade de Medicina, Botucatu
    Orientadora: Sandra Drigo Linde

    1. Câncer colorretal. 2. Genética molecular. 3.
MicroRNA. I. Título.

Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da
Faculdade de Medicina, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a).

Essa ficha não pode ser modificada.



                                                

Agradecimentos 
 

À minha orientadora, Dra. Sandra A. Drigo Linde, pela dedicação, 

incentivo, organização, apoio, e suporte incondicional na realização desse 

trabalho. Por me tranquilizar quando parecia que nada ia dar certo. Por sempre 

fazer tudo prezando pela qualidade. E por ter me proporcionado aprendizado 

que vai além do laboratório. 

À Dra. Patricia Reis, pela ajuda, pelos conselhos e ideias preciosas. 

Ao Dr. Marcio de Carvalho, técnico do laboratório que sempre vai além 

de todas as expectativas e não mede esforços para nos ajudar a realizar nossos 

experimentos. 

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 

(CAPES) pela bolsa recebida e à Faculdade de Medicina de Botucatu e Unidade 

de Pesquisa Experimental (UNIPEX), pela estrutura disponibilizada para a 

concretização desse trabalho 

Aos meus amigos do laboratório Oncologia Molecular e Translacional 

e da UNIPEX que participaram junto comigo do passo a passo da realização 

desse estudo. 

Ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de 

Botucatu, em especial ao patologista Marcelo Padovani pela colaboração, 

dedicação e paciência para revisar todas as lâminas utilizadas nessa pesquisa. 

Aos colabores desse trabalho Dr. Matheus Barros-Filho, Dr. Wan L. 

Lam e Dr. Fabio Marchi cuja ajuda foi fundamental para conclusão deste 

trabalho. 

À minha querida amiga Michelle Paz com quem sempre tenho as 

melhores conversas e debates seja sobre ciência, política ou qualquer outro 

tema do universo, e está sempre disposta a me ajudar a organizar minhas ideias, 

por mais confusas que elas possam parecer. 

A todos os funcionários da Biblioteca e Seção Técnica de Pós-

Graduação, em especial a Márcia Fonseca Piagentini Cruz secretária do 

programa de Pós-Graduação em Bases Gerais da Cirurgia.  

A todos que contribuíram muito ou pouco para a realização desse 

trabalho 

Muito Obrigada!  

  



                                                

Dedicatória 
 

Aos pacientes, que aceitaram contribuir para esse estudo, fornecendo 

os seus dados e amostras, sem eles esse trabalho não teria sido possível.  

À todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a 

minha formação, todas as minhas professoras e professores de ciências e 

biologia que despertaram meu fascínio por entender como o mundo funciona.  

À minha mãe que sempre respondeu todos os meus “porquês”, que 

criou minha paixão pela leitura todas as noites antes de dormir, que é minha 

amiga e companheira em todos os momentos, que nunca duvidou do meu 

potencial e sempre me incentivou a correr atrás dos meus sonhos. 

À minha segunda mãe, minha vó, baba, não tenho palavras para 

descrever o quanto eu queria que você estivesse aqui do meu lado vendo 

finalmente eu me tornar “pressefora dotora”, sempre vou carregar comigo as 

memórias que construímos juntas, quando você lia todas as placas da rua 

quando saíamos para passear de carro, e sempre tinha um provérbio ou 

conselho pronto, você é uma parte fundamental de quem eu sou, espero que, 

onde quer que você esteja, você esteja sorrindo para mim . 

Ao meu pai que sempre ofereceu o melhor conselho “Ficar triste ou 

nervosa não vai resolver seus problemas, levante e vai encontrar uma solução” 

e está sempre disposto a me ouvir reclamar simplesmente porque estou 

precisando.  

Ao meu tio Daniel que pouco a pouco, sem que eu percebesse, me 

ensinou filosofia e pensamento científico, através de conversas e discussões que 

na época me pareciam confusas e só mais tarde fui entender a importância. 

À minha tia Nancy que estava sempre disposta a me fazer contemplar 

novas possibilidades e caminhos 

E por fim, dedico esse trabalho ao meu avô Marcos, que apesar de não 

estar mais entre nós, foi uma das pessoas que me inspirou a seguir na pesquisa 

em oncologia molecular para tentar melhorar a vida dos pacientes de câncer e 

encontrar novas soluções em terapia e diagnóstico. 

  



                                                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Ainda mais mistérios do universo permanecem ocultos. Sua 
descoberta espera os cientistas aventureiros do futuro. Eu gosto 

que seja assim” 

Vera Rubin 

 

“Como pesquisadora, os momentos inesquecíveis de minha vida são 
raros... Quando o véu que cobre os segredos da natureza parece 

erguer-se repentinamente” 

Gerty Cori  



                                                

Sumário 
Resumo .......................................................................................................................................... 1 

Abstract ......................................................................................................................................... 2 

Prefácio ......................................................................................................................................... 1 

Capítulo I ........................................................................................................................................ 2 

Introdução ..................................................................................................................................... 3 

Hipótese ...................................................................................................................................... 26 

Objetivo ....................................................................................................................................... 27 

Materiais e Métodos ................................................................................................................... 27 

Referências .................................................................................................................................. 36 

Capítulo II ..................................................................................................................................... 45 

 



                                                

1 
 

Resumo 

Os cânceres colorretais (CCRs) proximal e distal apresentam características moleculares e 

prognósticas diferentes. Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel relevante no 

câncer, sendo também associados com a carcinogênese colorretal. Novos miRNAs tecido-

específicos e ainda não anotados foram relatados em diferentes tumores, indicando que 

novos mecanismos reguladores específicos de tecido podem contribuir para a carcinogênese. 

Assim, neste estudo investigamos a expressão de novos miRNAs em CCR, comparando CCR 

proximal e distal. Dados brutos de small-RNA-Seq foram obtidos de repositórios públicos e 

avaliados pela na plataforma mirMaster para identificação dos novos miRNAs. Dados de 522 

CRC e 11 tecidos normais do TCGA (grupo de descoberta), e 35 CRC e 20 normais do GEO 

(GSE89974, grupo de validação) foram analisados. Especificidade tecidual foi avaliada 

comparando os novos miRs identificados nos tecidos normais de cólon com os miRs 

identificados pela plataforma miRMaster a partir de dados de small-RNAseq de 5 tecidos 

normais do TCGA: bexiga, fígado, cérebro, mama e pulmão. Genes alvos dos novos miRNAs 

foram identificados pela ferramenta miRDB e seus padrões de expressão foram avaliados pelo 

UCSC Xena Browser. Após sucessivas análises e filtragens identificamos 15 novos miRs 

candidatos expressos diferencialmente entre CRC e amostras normais, detectados em ambos 

os grupos de descoberta e validação. Caracterização molecular dos novos miRs mostrou 

similaridade com miRs conhecidos tais como, conteúdo de GC, tamanho, localização genômica 

em regiões contendo miRs conhecidos e em regiões de sítios frágeis cromossômicos. Quatro 

novos miRNAs se mostraram expressos diferencialmente entre CRC proximal e distal, sendo 3 

novos miRNAs com níveis mais altos nos (miR-13844-5p, nov-miR-7154-5p e nov-miR-590-5p) 

e 1 (nov-miR-5035-3p) com níveis diminuídos nos tumores distais comparados aos proximais. 

Na análise de especificidade tecidual 2 novos miRs (nov-miR-3345-5p e nov-miR-13172-3p) 

foram identificados apenas nos tecidos colorretais. Níveis mais altos de nov-miR-3345-5p e 

nov-miR-7154-5p foram associados com menor sobrevida em pacientes com tumores do 

cólon direito e reto, respectivamente. Análise de predição de alvos dos 15 novos miRNAs 

revelou 2.412 genes.  Análise de correlação dos pares miRNA-gene alvo identificou correlação 

negativa significativa entre 8 novos miRNAs (6 com expressão aumentada e 2 diminuídos) e 

81 genes alvos. A seguir, 47 dos 81 genes foram identificados com algum tipo de interação 

gênica, sendo esses genes regulados por 7 miRNAs candidatos. Os genes CACNA1B e DLG2 

mostraram o maior número de interações com outros genes sendo regulados pelo nov-miR-

8861-5p e nov-miR-13172-3p, respectivamente. O nov-miR-8861-5p aparece como o miRNA 

regulando o maior número de genes (32 genes alvos) com interações entre si. Em resumo, 

identificamos 15 novos miRs expressos em tecidos de colorretal, sendo que três candidatos 

são expressos exclusivamente em tecidos colorretais. Além disso, a detecção da expressão 

diferencial de novos miRs e seus genes alvos entre tumores de cólon direito, cólon esquerdo 

e reto sugere alterações específicas de cada localização, que podem estar associadas com as 

diferenças clínicas e de progressão desses tumores. Esses resultados indicam a potencial 



                                                

2 
 

relevância desses novos miRs para a biologia dos tumores colorretais do CCR e possíveis 

aplicações futuras como biomarcadores em CRC e alvos terapêuticos. 

Palavras-Chave: novos MicroRNAs, Adenocarcinoma Colorretal, Transcritoma, Lateralidade 

Tumoral 

Abstract 

Proximal and distal colorectal cancer (CRCs) have different molecular and prognostic 

characteristics. MicroRNAs (miRNAs) play an important role in cancer and are associated with 

colorectal carcinogenesis. Novel tissue-specific miRNAs have been reported in different 

tumors, indicating that new tissue-specific regulatory mechanisms may contribute to 

carcinogenesis. Therefore, in this study, we investigated the expression of novel miRNAs in 

CRC by comparing proximal and distal CRC. Raw small-RNA-Seq data were obtained from 

public repositories and evaluated using the mirMaster platform to identify novel miRNAs in 

CRC tissues. Data from 522 CRC and 11 normal tissues from TCGA (discovery group) and 35 

CRC and 20 normal tissues from GEO (GSE89974, validation group) were analyzed. Tissue 

specificity was evaluated by comparing the new miRs identified in normal colon tissues with 

the miRs identified by the miRMaster platform from small-RNAseq data from five normal 

tissues from TCGA: bladder, liver, brain, breast, and lung. Target genes of the novel miRNAs 

were detected using the miRDB tool and their expression patterns were evaluated using the 

UCSC Xena Browser. After successive analysis and filtering, we identified 15 new candidate 

miRNAs that were differentially expressed between CRC and normal samples, detected in both 

the discovery and validation groups. Molecular characterization of the novel miRs showed 

similarities with known miRs, such as GC content, size, and genomic location in regions 

containing known miRs and in regions of chromosomal fragile sites. Four new miRNAs were 

differentially expressed between proximal and distal CRC, with three presenting higher levels 

(miR-13844-5p, nov-miR-7154-5p, and nov-miR-590-5p) and one (nov- miR-5035-3p) 

decreased levels in distal tumors compared to proximal tumors. In the tissue specificity 

analysis, two novel miRNAs (nov-miR-3345-5p and nov-miR-13172-3p) were identified only in 

colorectal tissues. Higher levels of nov-miR-3345-5p and nov-miR-7154-5p were associated 

with shorter survival in patients with right-sided colon and rectal tumors, respectively. Target 

prediction of the 15 candidate miRNAs revealed 2,412 genes. Correlation analysis of the 

miRNA-target gene pairs showed a significant negative correlation between eight novel 

miRNAs (six upregulated and two downregulated) and 81 target genes. Next, 47/81 target 

genes regulated by seven novel miRNAs showed genetic interactions. CACNA1B and DLG2, 

regulated by nov-miR-8861-5p and nov-miR-13172-3p, respectively, showed the highest 

number of interactions with other genes. The nov-miR-8861-5p had the highest number of 

genes (32 target genes). In summary, we identified 15 novel miRNAs expressed in colorectal 

tissues, with three candidate miRNAs expressed exclusively in colorectal tissues. In addition, 

the detection of novel miRNAs and their target genes differentially expressed between right-



                                                

3 
 

sided colon, left-sided colon, and rectal tumors suggests anatomic-specific changes that might 

be associated with the clinical and progression differences of these tumors. These results 

indicate the potential relevance of these novel miRNAs in colorectal tumor biology and their 

possible future applications as CRC biomarkers and therapeutic targets. 

. 

Keywords: Novel microRNAs, Colorectal Adenocarcinoma, Transcriptome, Anatomical 

Location 



                                                

 
 

Prefácio  1 

Esta tese de doutorado está apresentada em dois capítulos: 2 

1º Capítulo. Neste capítulo será apresentada uma revisão da literatura, a hipótese do estudo, 3 

os objetivos e material e métodos detalhados, seguido das referências bibliográficas no padrão ABNT 4 

2º Capítulo. Manuscrito publicado com os principais resultados do estudo 5 

-  https://doi.org/10.3390/ncrna9060065. Com sua própria lista de referências no padrão da revista 6 

Non-Coding RNA 7 

 8 

  9 

https://doi.org/10.3390/ncrna9060065


                                                

 
 

 1 

 2 

 3 

 4 

 5 

 6 

 7 

 8 

 9 

 10 

 11 

 12 

 13 

 14 

 15 

 16 

 17 

 18 

 19 

Capítulo I 20 

 21 



                                                

3 
  

Introdução 

1. Epidemiologia E Fatores De Risco Do Câncer Colorretal  

O câncer é a segunda causa de morte no mundo, ficando atrás apenas das doenças 

cardiovasculares, sendo o câncer colorretal (CCR) o terceiro tumor mais comum e a segunda 

causa de morte por câncer. (SUNG et al., 2021). No Brasil, o CCR é o segundo câncer mais 

incidente tanto em homens quanto em mulheres, sendo estimados para o ano de 2023 45.630 

novos casos em todo o território nacional (INCA; INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR 

GOMES DA SILVA - INCA, 2022). Cerca de 20% dos pacientes apresentam metástases hepáticas 

sincrônicas ao diagnóstico (CHAN et al., 2022) 

O CCR é considerado um dos marcadores mais claros de transição econômica em 

países ocidentais. Na última década houve um aumento da incidência e da mortalidade em 

países com médio a alto índice de desenvolvimento humano (IDH), particularmente na Europa 

Ocidental, Ásia e América do Sul (ARNOLD et al., 2017).  

Uma tendencia preocupante é o aumento de casos de CCR em paciente com menos de 

50 anos. Desde o início do monitoramento dos casos de câncer na década de 90, os casos de 

CCR em pacientes jovens de 20 a 49 anos dobrou, nos Estados Unidos os casos em pacientes 

jovens já representam 13.1 a cada 100.000 casos com resultados similares observados no 

Canadá, Austrália, Reino Unido, Japão, Hong Kong e Shangai (Revisado em STOFFEL; MURPHY, 

2020). Baseando-se na atual tendencia de crescimento dos casos de CCR estima-se que em 

2030 a incidência de câncer de cólon e de reto terá aumentado em 90% e 124,2% para 

pacientes de 20 a 34 e em 27,7% e 46% para pacientes de 35 a 49 anos, respectivamente 

(BAILEY et al., 2015) . 

Por muito tempo o câncer de cólon (CC) e o câncer de reto (CR) foram considerados 

como um único tipo tumoral devido a concepção errônea que o intestino grosso é igual em 

toda sua extensão. Características importantes como diferentes funções desempenhadas no 

trato intestinal como concentração do bolo fecal, reabsorção de fluídos, transporte das fezes 

e excreção não eram consideradas. Além disso, não só a incidência de CC e RC são diferentes 

(2,5:1, respectivamente), como diferenças nos fatores de risco entre os dois tumores já são 

conhecidas (Revisado em PASCHKE et al., 2018) 

Os principais fatores de risco para os tumores de cólon proximal e transverso são 

ligados ao estilo de vida como sedentarismo, obesidade e consumo da dieta ocidental 



                                                

4 
  

caracterizada pelo alto consumo de carne vermelha e carnes processados, além de alimentos 

gordurosos e industrializados (Fig. 1), porém esses fatores não parecem afetar o risco de CR 

(Revisado em PASCHKE et al., 2018). Em contraste, os tumores de cólon distal e reto estão 

mais ligados a tabagismo, alcoolismo, susceptibilidade genética e fatores ambientais como 

ingestão de água contaminada por produtos agrícolas como compostos organofosforados, 

cloro (DENG, 2017) e metais pesados como mercúrio, cromo, bismuto e arsênico (Fig. 1)  

(ENTERLINE; DAY; MARSH, 1995; Revisado em JUNG; KIM; KIM, 2022; KIM et al., 2020; 

LEROYER et al., 2022). 

 

Figura 1. Fatores de risco de risco para CCR, em roxo estão os fatores relacionados ao estilo de vida, 
em verde os fatores ambientais e rosa fatores genéticos e intrínsecos do indivíduo 

 Esse dado é especialmente relevante para a população brasileira devido aos recentes 

desastres ambientais criados pelo rompimento das barragens de rejeitos de mineração nas 

cidades de Mariana-MG e Brumadinho-MG. Macêdo et. al. (2020) detectou a presença de 

cadmio, alumínio, ferro, manganês e mercúrio em amostras de água da região de Mariana-

MG com concentrações até 9,1 vezes mais altas após o rompimento do que as encontrados 

antes do rompimento da barragem. Esses achados foram relacionados com alterações 



                                                

5 
  

morfológicas nas guelras e fígados de peixes da região. Na região de Brumadinho-MG foram 

analisadas amostras de urina e sangue da população de moradores locais e foram encontrados 

níveis aumentados de manganês, arsênio, chumbo, mercúrio e cádmio. Essas alterações 

podem levar a um maior risco de desenvolvimento de tumores nas populações afetadas 

(MOTA et al., 2022). 

 

3. Microbioma no Câncer Colorretal  

Vários fatores genéticos e epigenéticos foram listados como importantes na 

carcinogênese colorretal e seu impacto na heterogeneidade observada nesses tumores (Fig. 

1), principalmente no que se refere às diferenças observadas associadas a lateralidade 

tumoral. 

Um fator que vem se mostrando cada vez mais importante na tumorigênese e 

progressão dos CCRs é a microbiota intestinal do paciente que já foi apontada como 

responsável por diversas alterações no perfil transcritômico dos tumores, inclusive já tendo 

sido listada como um novo hallmark da carcinogênese  (HANAHAN, 2022; SIDDIQUI et al., 

2022).  A microbiota intestinal é composta por cinco principais filos Firmicutes, Bacteroidetes, 

Actinobacteria, Proteobacteria e Verrucomicrobia (Revisado em FEHILY et al., 2021) e já foi 

descrita como sendo composta por 1013 a 1014 bactérias, um número quase igual ao número 

de células animais no corpo (GILL et al., 2006). Muitos fatores podem afetar a microbiota 

intestinal como idade, região geográfica, hábitos alimentares, genética do paciente e pressão 

do sistema imune. Por outro lado, a microbiota intestinal pode afetar a fisiologia do 

hospedeiro de diversas maneiras (Revisado em FIDELLE et al., 2020). 

No contexto do CCR já foi identificado enriquecimento dos gêneros Fusobacterium, 

Porphyromonas, Peptostreptococcus e Prevotella assim como alguns fungos. Esses achados 

foram relacionados com alterações na produção de bile e na degradação de aminoácidos 

(WIRBEL et al., 2019), porém a contribuição dessas alterações na carcinogênese ainda está 

sendo investigada. Em particular, o envolvimento da Fusobacterium nucleatum que emerge 

após a iniciação da carcinogênese já foi associada com CCRs proximais avançados, metástase, 

quimioresistência e prognóstico ruim (Revisado em FIDELLE et al., 2020).  

 



                                                

6 
  

3. Histopatologia e Aspecto Morfológicos do Câncer de Cólon e de Reto 

Os CCR são tumores bastantes heterogêneos. Nos últimos anos, uma grande 

quantidade de evidências tem indicado que os CCR proximais são entidades biológicas 

distintas dos tumores distais não só por terem origens embriológicas distintas, perfil imunes 

característicos e alterações genéticas mais frequentes, mas também por apresentarem 

desfechos clínicos diferentes (YANG et al., 2022). 

O cólon direito (cécum até a flexura esplênica) é derivado do intestino médio 

embrionário que forma o duodeno distal, jejuno, íleo, cécum, cólon ascendente e 

aproximadamente 2/3 do cólon transverso. Já o cólon esquerdo (flexura esplênica até o cólon 

sigmoide) é formado pelo intestino embrionário posterior que forma o terço distal do cólon 

transverso, o cólon descendente, o cólon sigmóide e 2/3 do canal ano-retal cuja porção final 

é formada pela membrana cloacal. Devido a essas diferentes origens o cólon proximal recebe 

suprimento sanguíneo da artéria mesentérica superior e o cólon distal da artéria mesentérica 

inferior (YANG; CHO; KIM, 2018). Como é de se esperar os tumores com origens nos diferentes 

sítios anatômicos também apresentam diferentes características clínicas e moleculares, 

começando pela incidência tumoral em cada sítio, cerca de 40% são tumores de cólon direito 

(CCD), 20% são tumores de cólon esquerdo (CCE) e 30% são tumores de reto (CR), 10% outros 

sítios (PASCHKE et al., 2018).  

Os CCDs já foram associados com risco de morte significativamente maior em tumores 

com estadiamento III e IV, (Revisado em LEE; MENTER; KOPETZ, 2017). Esses tumores são mais 

comuns em pacientes mais velhos e do sexo feminino, frequentemente apresentando um 

crescimento tumoral local maior, metástases nos linfonodos regionais e tumores pouco 

diferenciados com maior frequência dos subtipos histológicos mucinoso e de células de anel 

de sinete (BENEDIX et al., 2010)  

Os CCEs são tumores comumente diagnosticados em colonoscopias devido a 

sangramentos retais e mudanças nos hábitos intestinais ou ainda em cirurgias de emergência 

devido a complicações geradas pelo menor diâmetro da luz do cólon distal sendo ocupado 

pela massa tumoral; isso está diretamente relacionado com fato que pacientes com CCEs 

frequentemente já chegam ao serviço oncológico com diagnóstico confirmado por histologia 

e tumores em estadiamento inicial (MO YANG et al., 2019; PETRELLI et al., 2017) 



                                                

7 
  

No câncer inicial, histologicamente lesões da mucosa do tipo polipoide são mais 

frequentemente observadas no cólon do que no reto (51% CCD, 35% CCE e 14% RC) enquanto 

lesões da submucosa são mais frequentes no reto assim como lesões das mucosas com 

componentes vilosos(PASCHKE et al., 2018).  

Existem 4 principais subtipos morfológicos de CCR, adenocarcinoma típico, 

adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células de anel de sinete, adenocarcinoma 

serrilhado. (JOHNCILLA; YANTISS, 2020) 

Cerca de 85% dos CCR evoluem a partir de adenomas de alto grau e são 

adenocarcinomas típicos, esse tipo tumoral não tem preferência com relação a lateralidade 

tumoral e são ricos em mutações em KRAS (TAMAS et al., 2015)   

Os adenocarcinomas mucinosos representam cerca de 10% do CCR, são caracterizados 

por terem um volume tumoral composto de pelo menos 50% de mucina, são carcinomas 

agressivos que frequentemente apresentam deficiência nos genes de reparo a danos ao DNA 

e instabilidade de microssatélites e são mais comuns no cólon proximal.(JOHNCILLA; YANTISS, 

2020; TAMAS et al., 2015) 

Da mesma forma o carcinoma de células de anel de sinete também é mais comum no 

cólon proximal, representa cerca de 1% dos CCRs e é mais encontrado em pacientes com mais 

de 40 anos e doença inflamatória intestinal. Aproximadamente 1/3 desses tumores tem 

deficiência nos genes de reparo a danos ao DNA e são associados com um pior desfecho clínico 

(JOHNCILLA; YANTISS, 2020)  

O subtipo adenocarcinoma serrilhado é observado em 8% dos casos de CCR, ele é mais 

comum no cólon distal e reto; aproximadamente 20% tem mutação em BRAF, fenótipo 

metilador das ilhas CpG e deficiência nos genes de reparo a danos ao DNA. (JOHNCILLA; 

YANTISS, 2020). 

4. Características Moleculares dos Tumores Cólon  

O CCR é uma doença de progressão lenta, o modelo mais aceito para progressão do 

CCR é o modelo multi-hit onde o CCR seria derivado de pólipos intestinais benignos que ao 

longo do tempo acumulam mutações que levam a perda de função de genes supressores 

tumorais como APC e TP53 e ativação de oncogenes como KRAS o que leva a malignização da 



                                                

8 
  

lesão e transformação do pólipo em um adenocarcinoma invasivo (Fig 2) (FEARON; VOGELSTEIN, 

1990; LI et al., 2014; WANG; FAKIH, 2021).  

Outro fator que diferencia os CCDs e CCEs é o perfil molecular. Três principais vias 

biológicas estão presentes nos CCRs, instabilidade cromossomal (CIN) (PINO; CHUNG, 2010), 

instabilidade de microssatélites (MSI) (BATTAGLIN et al., 2018) e fenótipo metilador das ilhas 

CpG (CIMP) (MOJARAD et al., 2013). Essas e outras características como mutações em BRAF, 

KRAS, p53, APC e EGFR também estão distribuídas em diferentes proporções nos tumores ao 

longo do trato intestinal(LOREE et al., 2018). 

O consórcio The Cancer Genome Atlas (TCGA) reportou a caracterização molecular de 

276 casos CCR, identificando dois grupos de tumores baseados na taxa de mutação. Os 

tumores hipermutados (16% dos casos), sendo maioria CCD, apresentavam mutações 

frequentes em ACVR2A, APC, BRAF (V600E), TGFBR2, MSH3, MSH6, SLC9A9 e TCF7L2; além de 

MSI, com hipermetilação do gene MLH1. Os tumores não-hipermutados (84% dos casos) 

apresentavam mutações em APC, TP53, KRAS, PIK3CA, FBXW7, SMAD4, TCF7L2 e NRAS, sendo 

que os perfis de mutações eram semelhantes entre cólon e reto (THE CANCER GENOME ATLAS 

NETWORK, 2012) (Fig 3).  

Em 2015, Guinney. et al. caracterizaram a partir de 18 conjuntos de dados públicos e 

privados, 4 subtipos moleculares (consensus molecular subtype – CMS) do CCR que reuniam 

as principais características moleculares presentes nesses tumores e em 2019 esses subtipos 

foram caracterizados de acordo com as características das populações imune infiltrantes de 

seus tumores tornando essa classificação ainda mais robusta(SOLDEVILLA et al., 2019).  

O subtipo 1 (CMS1), também chamado de MSI imune, é encontrado com mais 

frequência no cólon direito e associado com melhor prognóstico. Esses tumores são 

hipermutados, comumente apresentando mutação em BRAF e KRAS. Também são 

hipermetilados com CIMP, com alta MSI e expressão de proteínas de reparo do DNA, e pouca 

prevalência de alterações somáticas no número de cópias. Apresentam forte ativação da 

resposta imune, com infiltração predominante de células T helper 1 e T citotóxicas com a 

ativação de diversas vias de escape imune como PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3 e IDO (Chan & 

Siriwardena, 2022; Llosa et al., 2015). 



                                                

9 
  

 

Figura 2. Modelo Multi-Hit de progressão do Câncer Colorretal ilustrando a progressão de um pólipo intestinal benigno para um 
adenocarcinoma invasivo 

  



                                                

10 
  

 

Figura 3. Resumo das diferentes características dos tumores de cólon esquerdo, cólon 
direito e reto. 

O subtipo 2 (CMS2), chamado de canônico, é mais presente nos tumores do cólon 

distal. Nesse subtipo é possível observar amplificação do oncogene HNF4A que atua no 

desenvolvimento do intestino e na regulação da proliferação celular através da via WNT/β-

catenina (Ni et al., 2021), que também é fortemente ativada nesse subtipo tumoral. Os 

pacientes com esse subtipo tumoral mostram maior sobrevida pós recorrência (Guinney et 

al., 2015). Esse subtipo juntamente o subtipo 3 já foram descritos como imunologicamente 

“frios”, ou seja, com pouca ou nenhuma infiltração linfoide e mieloide e baixa expressão de 

genes do complexo MHC  (SOLDEVILLA et al., 2019) . 

O outro subtipo considerado imunologicamente “frio” é o subtipo 3 (CMS3), também 

chamado de metabólico. Esse subtipo tumoral é mais raro, sendo encontrado em apenas 13% 

dos CCR e é caracterizado por apresentar desregulação de diversas vias metabólicas como a 

via MAPK e alta prevalência de mutações em KRAS, apresentando um perfil genômico 

semelhante ao subtipo estável descrito para cânceres gástricos (BASS et al., 2014; GUINNEY 

et al., 2015).  

Por fim, o subtipo 4 (CMS4) são os tumores com pior prognóstico. Sua prevalência tem 

um discreto aumento no cólon distal, porém é estável ao longo do trato intestinal (LOREE et 

al., 2018). Esses tumores são chamados de mesenquimais por apresentarem aumento de 

expressão dos genes relacionados a transição epitélio-mesênquimal (TEM), juntamente com 



                                                

11 
  

uma forte associação a ativação de TGF-β, angiogênese e vias de remodelação da matriz 

extracelular(GUINNEY et al., 2015). O perfil imune deste subtipo é inflamatório com alta 

expressão de marcadores de linfócitos, monócitos e densidade de fibroblastos, sendo 

considerados como tumores que, potencialmente, poderiam ser beneficiados por 

imunoterapia (SVEEN et al., 2018) (Fig 3). 

5. RNAS Não Codificadores 

Historicamente, o RNA, com exceção do RNA ribossomal e transportador, foi 

considerado uma ponte entre o DNA e as proteínas e restrito a função codificadora, porém o 

nosso transcritoma é composto por apenas 2% de RNA codificador, sendo que os 98% 

restantes são os RNA não codificadores (ncRNAs) que exercem diversas funções na regulação 

pós-transcricional (PALAZZO; LEE, 2015). 

Os ncRNAs são categorizados de acordo com o número de bases de sua sequência: Os 

pequenos ncRNAs incluem os microRNAs (miRNAs), tsRNAs e piRNAs. Por outro lado, os RNAs 

não traduzidos com mais de 200 nt de comprimento são os RNAs longos não codificares 

(lncRNAs), e incluem subclasses como pseudogenes e circRNAs. Os lncRNAs exercem diversas 

funções como alterar a arquitetura da cromatina regulando a expressão dos genes 

relacionados, modular a atividade de promotores e reguladores alterando a transcrição 

gênica, podem também se ligar as proteínas ligantes do RNA alterando o splicing  do RNA 

mensageiro, atuar como “esponjas” capturando outros ncRNAs por complementariedade de 

base impedindo que esse exerçam sua função regulatório, além de poderem ser 

reprocessados em outros classes de ncRNA com sequências menores.(LULLI et al., 2022) 

Os miRNAs ou miRs são o foco principal do presente trabalho. Os miRNAs são 

moléculas de RNAs não codificadores cujas sequências têm aproximadamente 23nt, são 

associados com silenciamento epigenético e altamente conservados evolutivamente, atuando 

em vários processos celulares como crescimento, diferenciação, desenvolvimento e apoptose 

(SALIMINEJAD et al., 2019a). 

Os miRNAs maduros são sequências de fita simples, porém durante o seu 

processamento eles são excisados de moléculas precursoras de fita dupla com estrutura de 

stem-loop. De acordo com o banco de dados miRBase v22, 1.917 sequências de miRNAs 

precursores e 2654 miRs maduros identificados na espécie humana(KOZOMARA; 



                                                

12 
  

BIRGAOANU; GRIFFITHS-JONES, 2019). A maioria dos miRNAs são transcritos pela RNA 

polimerase II a partir do DNA em transcritos primários pri-miRNA, que são clivados pela RNase 

III (Drosha) e a double-stranded RNA-binding protein (DGCR8) em precursores pre-miRNA de 

aproximadamente 70 nucleotídeos e estrutura de fita dupla com formato de loop. O stem-

loop é reconhecido pela proteína de transporte nuclear exportina-5 (Exp5) e transportado 

para o citoplasma, onde o pré-miRNA é reconhecido e capturado pelos domínios de RNase III 

da enzima DICER e da proteína de ligação TRBP que vão remover a estrutura de loop, criando 

um precursor de fita dupla que, por fim, são separadas em duas fitas funcionais denominadas 

5’ e 3’ que se ligam a proteína argonauta (AGO) formando o complexo de silenciamento 

induzido por RNA (RISC) (Fig. 4) (Revisado em XIONG et al., 2022). O complexo RISC irá então 

se ligar, por complementariedade de bases parcial (em humanos), à região 3’ não traduzida 

(3’-UTR) do RNA mensageiro (mRNA) alvo, levando a degradação do mRNA ou impedindo que 

este seja traduzido em uma proteína, promovendo o silenciamento gênico (Fig. 4)  

(FILIPOWICZ; BHATTACHARYYA; SONENBERG, 2008). Qualquer desbalanço nas etapas de 

biogênese dos miRNAs pode causar alterações na expressão destas moléculas, promovendo o 

surgimento de doenças, incluindo o câncer (BJERKE; YI, 2020). 

Figura 4 Síntese dos miRNAs a partir da RNA Pol II e ação silenciadora sobre o mRNA alvo. 

 



                                                

13 
  

 5.1 RNAs Não Codificadores: os miRNAs no Câncer Colorretal    

Como é de se esperar os miRNAs estão fortemente envolvidos na carcinogênese 

colorretal com possíveis aplicações na prática clínica já identificadas. Em 2018, foi proposta 

uma nova assinatura de miRNAs para predição da recorrência em pacientes com câncer 

colorretal nos estágios II e III. Foram avaliados dois conjuntos de dados públicos (TCGA e 

GSE29623 do GEO) incluindo 265 amostras de pacientes nos estágios II e III e foram 

selecionados 8 miRs (miR-744, miR-429, miR-362, miR-200b, miR-191, miR-30c2, miR-30b, 

miR-33a) que poderiam ser utilizados para predizer o risco de recorrência em ambos os 

estágios tumorais, tornando possível a estratificação de risco dos pacientes (KANDIMALLA et 

al., 2018).   

Além de biomarcadores, os miRNAs estão associados a importantes processos 

associados a carcinogênese. 

Em 2000, os pesquisadores Hanahan e Weinberg definiram os hallmarks da 

carcinogênese em seis processos biológicos fundamentais para o estabelecimento e 

sobrevivência de um câncer, sendo eles: autossuficiência de sinais de crescimento; 

insensibilidade a fator anti-crescimento; angiogênese sustentada; potencial replicativo 

ilimitado; evasão da apoptose e a capacidade de invadir e formar metástases em outros 

tecidos. Desde a publicação do primeiro estudo, os estudos da oncologia molecular avançaram 

a passos largos, levando a publicação de uma atualização em 2011, na qual foram adicionados 

quatro novos hallmarks: evasão do sistema imune; promoção de inflamação pró-tumoral; 

instabilidade genômica; e desregulação do metabolismo energético. (HANAHAN; WEINBERG, 

2011).  

Em janeiro de 2022 uma nova atualização foi publicada incluindo outros quatro 

hallmarks adicionais: a reprogramação epigenética não-mutacional; desbloqueio da 

plasticidade fenotípica; senescência celular e microbioma polimórfico, totalizando 14 

hallmarks. Ao longo dessas atualizações é possível observar que para que possamos 

realmente entender a carcinogênese é necessário estudar não só as características das células 

tumorais, mas também como elas se relacionam e são influenciadas pelo 

hospedeiro(HANAHAN, 2022). 



                                                

14 
  

Os miRNAs atuam nos diferentes processos biológicos associados ao câncer, como 

crescimento celular, diferenciação e regulação da apoptose, e portanto, estão fortemente 

envolvidos na carcinogênese. Diversos estudos já demonstraram o envolvimento dessas 

moléculas nas diversas fases do desenvolvimento tumoral e nos hallmarks da carcinogênese 

sendo classificados como oncomirs, os microRNAs que aceleram o processo da carcinogênese; 

miRs supressores tumorais, responsáveis por desacelerar o desenvolvimento tumoral, além 

dos metastamirs que estão envolvidos particularmente com o processo metastático (WIGGINS 

et al., 2022; YAN; BU, 2021). 

Os primeiros atributos chave das células tumorais são a proliferação celular 

constitutiva e evasão dos sinais de interrupção do crescimento celular. Muitos genes e 

proteínas estão envolvidos nesses processos especialmente quinases e seus receptores. As 

ciclinas dependentes de quinase (CKDs) são fundamentais na regulação do ciclo celular que 

estão frequentemente desreguladas no câncer levando ao aumento da proliferação celular, 

algumas como CDK4 e CDK6 são diretamente reguladas por diversos miRNAs.(DING et al., 

2020; WHITTAKER et al., 2017). Alguns exemplos de miRs que atuam sobre CDK4 e CDK6 são 

miR-29a-3p, miR-34a-5p, miR-34b-5p, miR-124-3p, miR-145-5p, miR-195-5p, miR-545-3p, 

miR-497-5p, let-7a-5p, miR-129-2-3p e miR-200a-3p (VAN ROOSBROECK; CALIN, 2017). 

 Outro gene que também contribui para a desregulação do crescimento celular e são 

regulados por miRs são o fator de crescimento epidermal (EGFR). O EGFR é um receptor de 

tirosina quinase e é alvo terapêutico de diversas drogas utilizadas na prática clínica, como 

cetuximab utilizado no tratamento do CCD metastático e panitumumab utilizado no 

tratamento do CCR. Esse gene é alvo de diversos miRNAs como miR-7-5p, miR-27a-3p, miR-

133b, miR-146a, miR-218-5p e miR-302a-5p. (CARVALHO et al., 2017; VAN ROOSBROECK; CALIN, 

2017) 

Outros 2 hallmarks da carcinogênese são a evasão da apoptose e indução de 

instabilidade genômica, muitos fatores pró e anti-apoptóticos atuam na regulação desse 

hallmarks, uma família de genes muito proeminente é a Bcl-2, o primeiro fármaco anti-

apoptótico aprovado pelo FDA o venetoclax atuam sobre a proteína anti-apoptótica BCL2 

(CROCE; REED, 2016). Especificamente no CCR, os miRNAs supressores tumorais que atuam na 



                                                

15 
  

regulação da BCL2 são miR-30b-5p, miR-143-3p, miR-195-5p e miR-1915-3p (VAN 

ROOSBROECK; CALIN, 2017)  

Conforme a massa tumoral aumenta de tamanho a angiogênese é fundamental para 

que o crescimento se sustente, possibilitando o transporte de oxigênio e nutrientes para as 

células cancerígenas, assim como facilitando o processo de colonização de outros tecidos e 

formação de metástases. Alguns genes fortemente envolvidos nesse processo são os genes 

da família VEGF, PDGF e FGF (CARMELIET; JAIN, 2011). A família VEGF consiste de poucos 

membros com papeis não redundantes na angiogênese. Existem 5 ligantes do VEGF (VEGFA 

até VEGFE) e 3 receptores VEGFR1, VEGFR2 e VEGFR3; entre os ligantes o VEGF-A é o mais 

importante sendo um forte estimulador da angiogênese causando proliferação celular, 

inibição da apoptose, aumento da permeabilidade vascular, vasodilatação e recrutamento de 

células imunes para o sítio tumoral. A proteína VEFG-A é secretada não apenas pelas células 

endoteliais, mas também por células tumorais, macrófagos, plaquetas, queratinócitos, entre 

outras, em resposta a deprivação de oxigênio (STANCA MELINCOVICI et al., 2018). Mais de 40 

miRRNAs já foram validados como reguladores de VEGF, sendo que no câncer colorretal já 

foram identificados os miRNAS miR-30b-5p, miR-143-3p, miR-148a-3p, miR-195-5p e miR-

1915-3p (VAN ROOSBROECK; CALIN, 2017). 

A evasão do sistema imune é outro hallmark do câncer, e ganhou maior notoriedade 

nos últimos anos devido a imunoterapia no câncer. O microambiente tumoral (TME) é 

composto por inúmeras células infiltrantes que, ainda que infiltrem o sítio tumoral com o 

papel de promover a erradicação tumoral, algumas vezes atuam de forma paradoxal 

promovendo o crescimento tumoral. A vigilância imune deficitária faz com que as células 

imunes infiltrantes forneceram às células tumorais fatores de crescimento e pró-angiogênicos. 

Esse processo é gerado em parte por subclones tumorais pouco imunogênicos e em parte por 

subclones que seriam imunogênicos, mas desenvolveram a capacidade de “desativar” 

componentes do sistema imune; por exemplo, as células tumorais podem inibir a ação do de 

linfócitos T e células NK através da secreção de TGF-β (HANAHAN; WEINBERG, 2011; REETESH; 

BELL; PAI, 2022).  

A imunoterapia vem explorando esses processos de evasão imune para modular o 

próprio sistema imune do paciente para que esse volte a combater o câncer, os inibidores de 



                                                

16 
  

checkpoints imunes são alguns dos exemplos presentes na prática clínica. As células tumorais 

são capazes de expressar o ligante PD-L1 em sua superfície causando a inibição da ação 

citotóxica das células T ao se ligar no receptor de morte celular programada-1 (PD-1), esse 

fenômeno é semelhante ao que ocorre em outro checkpoint imune o CTLA-4. As células 

tumorais afetam as células apresentadoras de antígenos (APC) do microambiente tumoral e 

dos linfonodos que drenam a região afetada, fazendo com que as APCs tenham menos fatores 

co-estimulatórios; como resultado essas células não conseguem se ligar com o receptor 

estimulatório CD28, mas sim ao receptor inibidor CTLA-4 das células T, especialmente das 

células T CD4+. Isso evita a ativação e a expansão clonal das células T e, a longo prazo, pode 

induzir anergia, ou seja, falta de resposta das células T (BRUNI; ANGELL; GALON, 2020). 

Esses processos de evasão imune também são regulados por miRNAs, tais como miR-

15a, miR-15b, miR-16, miR-195, miR-424, miR-497 e miR-507, que regulam a expressão das 

moléculas PD-L1 e CD80. A baixa expressão do miR-424 está associada com alta expressão de 

CD80 e PD-L1 e quimioresistência. Esse miR também é capaz de bloquear a ligação CD80/CTLA-

4 através da redução da expressão de CD80. O miR-138-5p com funções supressoras tumorais 

e expressão reduzida em CCR, inibe diretamente a expressão de PD-L1 ao seu ligar ao seu 

mRNA. A combinação de baixa expressão desse miR e alta expressão de PD-L1 foi relacionado 

com um desfecho clínico desfavorável em CCR (SMOLLE et al., 2017) .  

Há inúmeros estudos mostrando a expressão de ncRNAs, incluindo miRNAs em CCR. 

No entanto, estudos comparando os padrões de expressão dessas moléculas de acordo com 

a lateralidade do tumor ou ainda com sua localização anatômica são relativamente escassos. 

Para o nosso conhecimento, há 8 trabalhos publicados que relatam os perfis de ncRNAs em 

CCR de acordo com a lateralidade do tumor (Tabela 1). 

Em 2011 Slattery et al avaliaram os microRNAs diferencialmente expressos em 

tumores colorretais classificados de acordo com as localizações tumorais e características 

moleculares. Na comparação com amostras normais de cólon distal e proximal 287 miRNAs 

estavam diferencialmente expressos (DE), também na comparação com amostras normais, 

143 miRNAs DE em tumores de cólon MSI+, 129 miRNAs em tumores de cólon CIMP+, 135 

miRNAs tumores de cólon com mutação KRAS2 e 139 miRNAs em tumores de cólon com 

mutação em TP53. Foram encontrados números similares de miRNAs DE em tumores de reto, 



                                                

17 
  

porém os miRNAs eram diferentes dos observados em cólon. Foram observados 129 miRNAs 

únicos para CIMP+, 143 miRNAs únicos para mutação KRAS2 e 136 miRNAs únicos para 

mutação TP53 em tumores de reto (SLATTERY et al., 2011). 

Os microRNAs 146a e 147b foram sugeridos como possíveis biomarcadores para CCR, 

ambos foram mostrados significativamente mais expressos em CCE quando comparados com 

CCD (OMRANE et al., 2014). Outros microRNAs foram observados como alterados em CCE, 

como miR-221 e miR-30b que estavam com a expressão reduzida e miR-10b que apresentou 

expressão aumentada nestes tumores quando comparados com CCD (COEBERGH VAN DEN 

BRAAK et al., 2018). 

Slattery et al (2016) avaliaram o perfil de miRNAs de acordo com o sítio anatômico do 

tumor, subtipo molecular e prognóstico dos pacientes com CRC. Os miRNAs miR-31-5p, miR-

193b-3p, miR-214-3p, miR-28-5p e miR-99b-5 foram associados com sobrevida em câncer de 

cólon; enquanto miR-552, miR-3653, miR-520e, miR-636 e miR-192-3 associaram-se com 

sobrevida em câncer de reto (SLATTERY et al., 2016). O miR-31-5p juntamente com miR-224-

5p e miR155-5p, foram indicados como marcadores para a progressão de CCD.  

O estudo de Yang (2019) et. al. identificou 54 miRNAs diferencialmente expressos 

entre CCD e CCE, sendo que 22 miRNAs que poderiam ser utilizados como biomarcadores para 

CCD (L. Yang et al., 2019). 

Uma análise ampla multi-omica também identificou diferenças entre tumores de cólon 

direito e esquerdo, utilizando dados públicos do TCGA. Foi feita uma comparação do perfil de 

mutações, metilação do DNA, expressão gênica e miRNA. Além de 15 miRs diferencialmente 

expressos entre as localizações anatômicas, foi mostrado que sinalização cruzada de vias 

biológicas é mais prevalente em CCD, como a via PI3K que frequentemente influência nas vias 

RAS e P53 de sinalização, sugerindo que tumores de cólon direito apresentam mais 

marcadores de agressividade biológica (W. Hu et al., 2018). 

Em junho de 2020, Eneh (2020) et. al. compararam a expressão de microRNAs e suas 

vias biológicas relacionadas entre CCD e CCE, reforçando que além das grandes regiões 

anatômicas (cólon e reto), a expressão dos microRNAs também pode ser analisada de acordo 

com a lateralidade tumoral. Seis miRs foram validados como DE na comparação de CCD e CCE, 

sendo que os mirs miR-625-3p, miR-155-5p, miR- 625-5p, miR-31-5p e miR-330-5p estavam 

com a expressão aumentada em CCD, enquanto o miR-196b-5p estava com expressão 



                                                

18 
  

aumentada com CCE. Os miRNAs aumentados nos tumores do lado esquerdo regulam genes 

envolvidos nas vias de sinalização mTor, Wnt, PI3K-Akt, enquanto os miRs aumentados nos 

tumores do lado direito regulam genes envolvidos na via do TGF-β (ENEH et al., 2020).  



                                                

19 
  

Tabela 1. Trabalhos publicados que relatam os perfis de ncRNAs em CCR de acordo com a lateralidade do tumor 

Referência Descrição amostras Plataforma utilizada Resultados principais 

    

Slattery 

(2011) 

40 tumores de cólon e 30 

de reto; 30 amostras 

normais (10 cólon 

proximal, 10 cólon distal, e 

10 reto pareado com 

tumores) 

Agilent Human 

miRNA V3.0 

Microarrays 

Foram identificados 143 miRNAs diferencialmente expressos (DE) em 

tumores de cólon MSI+, 129 miRNAs em tumores de cólon CIMP+, 135 

miRNAs tumores de cólon com mutação KRAS2 e 139 miRNAs em tumores 

de cólon com mutação em TP53. Números similares de miRNAs DE em 

tumores de reto foram detectados, porém os miRNAs eram diferentes dos 

observados em cólon. Foram observados 129 miRNAs únicos para CIMP+, 

143 miRNAs únicos para mutação KRAS2 e 136 miRNAs únicos para mutação 

TP53 em tumores de reto  

Omrane 

(2014) 

25 amostras pareadas de 

CCR e mucosas normais, 11 

amostras de cólon direito e 

14 de cólon esquerdo  

miScript II reverse 

transcription Kit 

(Qiagen). 

Os miRs -21, -146a e -135a estavam mais expressos em tecidos tumorais. Os 

miRs 146a e 147b estavam mais expressos em CCE, esses dois miRs, e 

particularmente o miR-146a, são sugeridos como possíveis biomarcadores 

para CCR associados com a lateralidade do tumor.     



                                                

20 
  

Slattery 

(2016) 

1893 amostras de CRC e 

normais pareadas  

Agilent Human 

miRNA Microarray 

V19.0 

Na comparação de pacientes com câncer de reto ou cólon em estágio 1 ou 

2, nenhum miRNAs foi associado significativamente com estadio da doença. 

Dois miRNAs de expressão pouco frequentes foram associados com 

sobrevida em câncer de cólon. Nos pacientes diagnosticados com câncer de 

reto 201 miRNAs estavam associados com sobrevida. A análise de 105 

miRNAs previamente associados com prognóstico mostrou que 4 

influenciavam a sobrevida em câncer de cólon e 17 influenciavam em câncer 

de reto.    

van den 

Braak 

(2018) 

232 amostras de CCR 9-plex miRNA assay 

protocol e TaqMan 

miRNA assays 

Expressão dos miRs 221 e 30b estava significativamente reduzida ao mesmo 

tempo que a expressão do miR-10b estava significativamente aumentada em 

CCD na comparação com CCE. 

Hu (2018) Dados públicos TCGA-

COAD (grupo descoberta) 

Dados público GSE14333 

(grupo validação) 

limma package for 

R/Bioconductor, 

miRanda e 

TargetScan 

15 miRNAs estavam diferencialmente expressos entre CCD e CCE. 8 estavam 

regulados negativamente em reto enquanto 7 estavam regulados 

positivamente. 



                                                

21 
  

Yang 

(2019) 

300 amostras do TCGA: 

151 tumores de cólon 

direito e 149 de cólon 

esquerdo (grupo 

descoberta)  

14 amostras: 7 cólon 

direito e 7 cólon esquerdo 

(grupo validação)  

R-bioconductor 

package DESeq2 

 

qRT-PCR 

54 miRNAs DE, sendo 22 regulados negativamente e 32 positivamente 

estavam diferencialmente expressos entre CCD e CCE. 22 miRNAs foram 

sugeridos como biomarcadores diagnósticos ótimos para CCD.  

Xi (2019) 217 amostras com dados 

de RNA-seq depositados 

no banco de dados GDAC 

Firehose: 78 CCD, 98 CCED 

e 41 de reto  

EdgeR TMM 

normalization 

(Version 3.4) 

O prognóstico variou significativamente com relação ao sítio tumoral, 

quanto mais distal a localização tumoral, maior foi a sobrevida predita, 26 

lncRNAs foram correlacionados com os sítios de CRC.  



                                                

22 
  

Eneh 

(2020) 

24 amostras de CCD e CCE 

(grupo descoberta) 

Dados públicos miRSeq de 

201 amostras de CRC do 

TCGA (grupo validação). 

DESeq2 e 

DIANA/mirPath tool 

 

Foram validados 6 miRs diferencialmente expressos entre CCD e CCE, sendo 

5 com expressão aumentada em CCD e 1 com expressão aumentada CCE. 

 



                                                

23 
  

5.2 Novos microRNAs 1 

A caracterização inicial do transcritoma de miRNA humano foi baseada 2 

principalmente nas sequências mais abundantes de miRNA e/ou àquelas conservadas 3 

nos vários tipos de tecidos, o que limitou a descoberta de miRNAs com expressões 4 

restritas a tecidos individuais ou linhagens celulares (FRIEDLÄNDER et al., 2014).  5 

Utilizando ferramentas avançadas de bioinformática em dados de 6 

sequenciamento de nova geração (NGS) de RNAs pequenos (small-RNAseq) foram 7 

reportados 2.469 novos candidatos de miRNA humanos, dos quais 1.098 foram 8 

validados (FRIEDLÄNDER et al., 2014). Em 2015, Londin et. al. avaliaram o small-RNAseq 9 

de 1.323 amostras representativas de 13 tipos distintos de células humanas e 10 

identificaram 3.707 novos miRNAs humanos expressos em todo o genoma. Em conjunto 11 

esses dados indicam uma maior diversidade de miRNAs humanos do que previamente 12 

prevista e ainda não anotados em bancos de dados. 13 

O algoritmo miRDeep2 é uma das ferramentas utilizadas para descoberta de 14 

sequências de miRNAs não anotadas, que busca no transcritoma novos candidatos à 15 

miRNA e os compara com sequências conhecidas de miRNA (FRIEDLÄNDER et al., 2012). 16 

Outras ferramentas foram desenvolvidas, como a ferramenta online miRMaster, que 17 

além de realizar maior número de análises comparada ao miRDeep2, ainda permite 18 

maior velocidade para obtenção dos dados resultantes das análises (FEHLMANN; 19 

MEESE; KELLER, 2017). O mesmo grupo lançou em 2021 uma atualização do miRMaster, 20 

miRMaster 2.0, com várias atualizações e novos recursos, que incluem a possibilidade 21 

de análise de oito espécies (por exemplo, humano, camundongo, cachorro, etc), análise 22 

de 10 classes de ncRNAs, tais como miRNAs, piRNAs, circRNAs, etc, além de novas 23 

análises downstream, como análise de efeito em lote, bancos de dados de anotação 24 

atualizados incluídos por padrão (miRBase, Ensembl, GtRNAdb), possibilidade de análise 25 

de single-cell RNAseq, entre outras funcionalidades (FEHLMANN et al., 2021)  26 

A última atualização do miRBase (v22.1) é de 2018, e com o crescente número 27 

de novos possíveis miRNAs sendo descritos, outras plataformas com bancos de dados 28 

de miR conhecidos e preditos têm sido necessárias (LUNA BUITRAGO; LOVERING; 29 

CAPORALI, 2023) 30 



                                                

24 
  

Com o aumento considerável de dados públicos de RNAseq depositados no Gene 1 

Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), bem como de dados 2 

de RNAseq de tumores de diferentes tecidos obtidos pelo The Cancer Genome Atlas 3 

(TCGA, disponível em https://portal.gdc.cancer.gov/), estudos utilizando abordagens in 4 

silico têm sido realizados para identificação de novos miRNAs em diferentes tecidos e 5 

tumores (Tabela 2). 6 

Minatel et al (2018) analisaram dados do TCGA de small-RNAseq de 47 tecidos 7 

hepáticos normais adjacentes obtidos de pacientes com carcinoma hepatocelular 8 

utilizando a ferramenta miRDeep2. Foram identificados 103 miRNA candidatos ainda 9 

não descritos em tecidos hepáticos. Interessantemente, 83/103 miRNAs apresentaram 10 

diminuição de expressão nas amostras pareadas de carcinomas hepatocelulares, 11 

sugerindo que estes miRs devem ter um papel importante na homeostase do fígado. 12 

Análise de predição de alvos mostrou que estes novos miRNAs potencialmente regulam 13 

genes participantes de vias de regeneração tecidual e metabolismo de ácidos graxos, 14 

importantes na biologia do fígado. 15 

Em outro estudo, dados de small-RNAseq de 71 casos pareados de tecido não 16 

maligno e de carcinoma de célula renal e 502 tumores do TCGA foram analisados 17 

utilizando miRDeep2. Foram identificados 40 novos miRNAs não anotados nos tecidos 18 

não malignos e 143 nos tumores. Na etapa de validação dos achados foram detectados 19 

26/40 e 102/143 destes miRNAs avaliando o small-RNAseq em um painel de 8 linhagens 20 

celulares renais. 59 destes miRNAs expressos em ambos tecidos (normal e tumoral) 21 

foram reanalisados e destes, 30 apresentaram-se diferencialmente expressos entre 22 

tumor e tecido normal, sugerindo um potencial papel desses novos miRNAs no câncer 23 

renal. Notavelmente, dois miRNAs com altos valores de fold change (downregulated 28x 24 

e upregulated 5x) nos tumores mostraram-se associados com pior sobrevida, reforçando 25 

a importância desses novos miRNAs no desenvolvimento e progressão deste tumor 26 

(SAGE et al., 2018). Novos miRNAs também foram identificados em câncer de cabeça e 27 

pescoço (ROCK et al., 2019) e câncer de pulmão (MARTINEZ et al., 2019) 28 

 29 



                                                

25 
  

Tabela 2. Revisão dos estudos sobre descoberta de novos microRNA em tecidos 1 

humanos 2 

Estudo Tecido Analisado 
Nº de miRs 
encontrado 

Nº de miRs 
validados 

RESHMI et al., (2011) Câncer de colo uterino 13 4 

LONDIN et al., (2015) 

Plaquetas, tecido prostático, tecido mamário, 
pâncreas, células B, soro, células 

mononucleares do sangue periférico (PBMCs), 
tecido gástrico, linfócitos CD3+, tecido cerebral, 

tecido cutâneo 

3707 - 

BACKES et al., (2016) Sangue 518 11 

SAGE et al.,(2018) Carcinoma Renal e Rim 183 30 

MINATEL et al., (2018) Fígado 103 - 

BARROS-FILHO et al. (2019) Carcinoma Papilar de Tireoide 234 9 

PEWARCHUK et al., (2019) Adenocarcinoma Gástrico 170 43 

MARTINEZ et al., (2019) Mesotelioma Pleural 154 - 

ROCK et al (2019) Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço 146 - 

 3 

Outros estudos utilizaram a plataforma miRMaster para identificação de novos 4 

miRNAS e detectaram novos miRNAs preditos em câncer gástrico (PEWARCHUK et al., 5 

2019) e câncer de tireoide (BARROS-FILHO et al., 2019) (Tabela 2). Pewarchuk et al. 6 

(2019) utilizando dados públicos do TCGA (grupo de descoberta), identificaram 170 7 

novos miRNAs candidatos em tecidos gástricos, sendo que 143 DE nos tumores. Destes, 8 

43 novos miRNAs foram detectados no grupo de validação composto de 25 amostras 9 

gástricas. Em tecido não neoplásico de tireoide e em tumores papilíferos de tireoide 10 

foram detectados 234 novos miRNAs utilizando dados públicos do TCGA, sendo que 125 11 

novos miRs estavam diferencialmente expressos nos tumores. Nove novos miRs foram 12 

confirmados no grupo de validação (16 tumores e 8 tecidos normais, GSE63511) 13 

(BARROS-FILHO et al., 2019). 14 



                                                

26 
  

Desta forma, análises de dados de small-RNAseq utilizando esses algoritmos 1 

foram capazes de detectar novos miRNAs que anteriormente não haviam sido descritos. 2 

Além disso, foi possível observar que esses miRNAs recém-detectados eram tecido-3 

específicos (BACKES et al., 2016). A identificação de miRNAs anteriormente não 4 

caracterizados pode representar novos reguladores da biologia tecidual com impacto na 5 

patogênese de doenças, e ainda sendo úteis na clínica como potenciais biomarcadores 6 

e alvos terapêuticos. Notadamente, não identificamos nenhum estudo investigando 7 

novos miRNAs em CCR e relacionando a expressão desses candidatos a lateralidade 8 

tumoral, como o proposto no presente estudo.  9 

MicroRNAs se originam de diferentes regiões do genoma, a proporção de 10 

distribuição de localizações genômicas parece se manter entre os miRNAs conhecidos e 11 

novos. Em sua maioria a origem dos miRNAs são regiões intergênicas, seguida de regiões 12 

intrônicas e regiões de alta repetição. Além disso, diversos novos miRs estão localizados 13 

no braço do miRNA precursor que anteriormente era denominado de passageiro ou 14 

estrela e que se acreditava ser sem função, porém já foi mostrada ser funcionalmente 15 

relevante (LONDIN et al., 2015) Além disso, cerca de 34% dos miRNAs conhecidos estão 16 

localizados em regiões frágeis dos cromossomos, estas regiões são loci hereditários 17 

específicos suscetíveis a quebras e rearranjos cromossomais e representam cerca de 18 

26,38%  do genoma humano, e que contribuem para instabilidade genômica 19 

característica do câncer (MATHELIER; CARBONE, 2013). Novos microRNAs já foram 20 

mapeados nessas regiões e uma das hipóteses para recente descoberta dessas novas 21 

moléculas é que elas seriam transcritas mais recentemente na evolução resultantes da 22 

instabilidade genômica dos sitos frágeis (CALIN; CROCE, 2007; FROMM et al., 2013; RESHMI 23 

et al., 2011).  24 

 25 

Hipótese 26 

Existem ncRNAs, particularmente miRNAs, ainda não descritos que se expressam em 27 

tumores colorretais humanos, podendo apresentar diferenças de expressão de acordo 28 

com a lateralidade do tumor (cólon direito e esquerdo e reto). Estes miRNAs podem ser 29 



                                                

27 
  

modulados durante a carcinogênese e podem futuramente ser possíveis biomarcadores 1 

em CCR. 2 

Objetivo 3 

Identificar novos ncRNAs, especificamente miRNAs, associados com a carcinogênese 4 

colorretal em cólon direito, esquerdo e reto utilizando abordagens in silico. 5 

 6 

Objetivos Específicos 7 

1. Identificar miRNAS ainda não descritos a partir de dados de sequenciamento em 8 

larga escala de RNA obtidos de amostras de adenocarcinoma de cólon direito, cólon 9 

esquerdo e de reto disponíveis em bancos públicos do TCGA. 10 

 11 

2. Associar os novos miRNAs com a lateralidade e localização anatômica dos tumores 12 

colorretais 13 

 14 

3. Identificar potenciais genes alvos desses novos miRNAs por meio de análise de 15 

predição e redes de interação proteína-proteína baseada nos genes alvos 16 

identificados. 17 

 18 

Materiais e Métodos 19 

 20 

1. Fonte de Dados de Expressão dos RNAs não Codificadores (ncRNAs)  21 

1.1 Grupo de descoberta  22 

Dados de sequenciamento de RNA (RNAseq de tecidos colorretais foram obtidos 23 

do The Cancer Genome Atlas (TCGA) no Cancer Genomics Hub 24 

(https://portal.gdc.cancer.gov/). Os dados disponíveis publicamente de small-RNAseq 25 

são normalizados e agregados (nível 3). No entanto, para a identificação de novos 26 

miRNAs é necessário obtenção dos dados de sequenciamento brutos e não 27 

normalizados (nível 1). Assim foi obtida autorização para obtenção dos dados nível 1. A 28 

plataforma utilizada pelo TCGA é Illumina.  29 



                                                

28 
  

Foram analisadas 522 amostras de tecido colorretal, sendo 11 amostras de 1 

tecido normal adjacente aos tumores e 511 amostras de tecidos tumorais. As amostras 2 

de CCR foram classificadas de acordo com as localizações anatômicas da tabela de dados 3 

clínicos disponibilizados pelo TCGA. Desta forma, dentre os tumores foram analisadas 4 

172 amostras de CCR direito (83 ceco, 60 cólon ascendente, 12 flexura hepática e 17 5 

cólon transverso) e 257 CCR esquerdo (4 flexura esplênica, 12 cólon descendente, 98 6 

sigmóide, 66 junção reto-sigmoide e 77 tumores de reto). Em 82 amostras de tumores 7 

não consta a localização anatômica, apenas definidas como cólon, e essas amostras 8 

foram excluídas das análises onde foi considerada lateralidade do tumor. 9 

1.2 Grupo de validação  10 

 Com intuito de validar a presença de novos miRNAs em CCR, foram buscados 11 

outros estudos de miRNAs em CCR utilizado o banco de dados Gene Expression Omnibus 12 

(GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds) para comparar com os resultados obtidos 13 

com as amostras do TCGA. Foram selecionados estudos cujo sequenciamento foi 14 

realizado com a plataforma Illumina small RNA sequencing (mesma utilizada pelo TGCA), 15 

para evitar os vieses de plataformas diferentes. Além disso, foram selecionados apenas 16 

estudos com número amostral mínimo de 50 amostras (mínimo de 25 CCR) e com mais 17 

de 5Mb de reads totais. 18 

Os critérios utilizados na busca foram: 19 

Keywords: ((colon OR rectal OR colorectal OR CRC) AND (Cancer OR carcinoma OR 20 

adenocarcinoma OR tumor OR tumour OR neoplasia)) AND "Homo sapiens"  21 

Study type: Non-coding RNA profiling by high throughput sequencing 22 

Sample count: From 50 to 999999999999 23 

 24 

A busca no banco de dados GEO seguindo os critérios descritos resultou na 25 

identificação de 12 datasets (Tabela 3), sendo que apenas dois estudos atendiam 26 

inicialmente aos critérios de inclusão: GSE89974 e GSE63119. Destes, apenas os dados 27 

do estudo GSE89974 foram utilizados nas análises no miRMaster, uma vez que o estudo 28 

GSE63119 não tinha amostras de tecido normal para controle. A justificativa para 29 

exclusão dos demais estudos está mostrada na Tabela 3 30 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds


                                                

29 
  

O estudo Wu, et. al. (2018), dados depositados sob o número de acesso 1 

GSE89974, utilizou 95 amostras de tecido colorretal, sendo 20 amostras normais, 26 2 

amostras de adenoma, 35 amostras de adenocarcinoma e 14 amostras de adenoma 3 

séssil serrilhado. Os dados das 20 amostras normais e 35 amostras de adenocarcinoma 4 

do GSE89974 disponíveis no formato FASTQ foram analisados na plataforma MirMaster 5 

seguindo os mesmos critérios utilizados para o grupo de descoberta (TCGA). 6 

 7 

Tabela 3. Resultado da busca de estudos utilizando small RNAseq em CCR no banco de 8 

dados Gene Expression Omnibus (GEO). 9 

Nº de Acesso Atende aos critérios 

de inclusão 

Justificativa 

GSE118504 N Sem amostras tumorais 

GSE89974 S Incluído 

GSE110381 N Sem amostras tumorais 

GSE102855 N Apenas amostras de linhagem celular 

GSE87817 N Apenas amostras de linhagem celular 

GSE71008 N Apenas amostras de sangue 

GSE70408 N Apenas amostras de linhagem celular 

GSE66209 N Apenas sete amostras de CCR 

GSE63119 S Sem amostras normais para controle 

GSE28866 N Apenas seis amostras de CCR 

GSE16256 N Apenas amostras de linhagem celular 

 10 

 11 

 12 



                                                

30 
  

2. Métodos de Resgate de Dados e Análise  1 

Todas as sequências brutas obtidas do TCGA e do GSE89974 foram processadas 2 

para detecção de RNAs pequenos seguindo um pipeline previamente descrito 3 

(MARTINEZ et al., 2015). Arquivos BAM brutos foram convertidos em FASTQ com a 4 

ferramenta “SamToFastq” do pacote de análise Picard 5 

(http://broadinstitute.github.io/picard/). Reads não alinhados foram aparados baseado 6 

em seu escore de qualidade Phred (≥20) e alinhados de acordo com a versão mais 7 

recente do genoma humano (hg38) utilizando o alinhador Spliced Transcripts Alignment 8 

to a Reference (STAR) 9 

Para predição de miRNAs previamente não anotados utilizamos a plataforma 10 

miRMaster (https://ccb-compute.cs.uni-saarland.de/mirmaster/tutorial/), que, a partir 11 

dos arquivos FASTQ realiza a busca de novos miRNAs candidatos, juntamente com a 12 

quantificação da expressão e identificação de isoformas e variantes de miRNAs. Além 13 

disso, o miRMaster também mapeia reads de sncRNAs de vírus e bactérias a partir do 14 

banco de dados do NCBI RefSeq permitindo a identificação de contaminações, infecções 15 

e miRNAs exógenos. É possível ainda quantificar a expressão de outras classes de 16 

ncRNAs como os piRNAs, além dos rRNAs, tRNA, snRNAs, snoRNAs, scaRNAs e lincRNA. 17 

(Fehlmann et al., 2017). Um fluxograma com as etapas de análise e identificação de 18 

possíveis novos miRNAs está apresentado na Figura 5. 19 

http://broadinstitute.github.io/picard/
https://ccb-compute.cs.uni-saarland.de/mirmaster/tutorial/


                                                

31 
  

 1 

Figura 5. Fluxograma com as etapas de análise e identificação de possíveis novos 2 

miRNAs utilizando a ferramenta online miRMaster. Figura adaptada do site (https://ccb-3 

compute.cs.uni-saarland.de/mirmaster/about). 4 



                                                

32 
  

 3. Expressão diferencial dos miRNAs candidatos  1 

Para identificação de novos miRNAs diferencialmente expressos nos tumores foi 2 

adotado o critério p<0,05 e de fold-change (FC) ≥ 1,2 para que o candidato fosse 3 

considerado como mais expresso nas amostras tumorais em comparação com os tecidos 4 

normais e FC ≤ 1,1 para que o candidato fosse considerado como menos expresso nas 5 

amostras tumorais em comparação com os tecidos normais. Os valores de FC adotados 6 

nas análises se basearam no conhecimento que possíveis novos miRNAs apresentam 7 

níveis de expressão baixos, de modo que esses candidatos não fossem excluídos nas 8 

primeiras análises. Este critério foi adotado para o grupo de descoberta e de validação. 9 

Expressão diferencial dos miRs conhecidos também foi realizada comparando amostras 10 

tumorais e normais utilizando p<0,05.  11 

4. Validação in silico  dos miRs candidatos 12 

Os miRNAs identificados como diferencialmente expressos nos CCRs do grupo de 13 

descoberta foram comparados aos miRNAs diferencialmente expressos nos CCRs do 14 

grupo de validação. Foram considerados como validados apenas os miRNAs candidatos 15 

identificados nos dois grupos e que apresentavam mesmo sentido de expressão nos 16 

tumores em relação aos tecidos normais, ou seja, mais expresso nos tumores que nos 17 

normais ou menos expressos nos tumores que nos tecidos normais tanto no grupo de 18 

descoberta quanto de validação. A identificação dos novos miRNAs presentes nos dois 19 

estudos (TCGA e GSE89974) aumenta a chance da descoberta de novos miRNAs 20 

verdadeiros.  21 

Análise de especificidade Tecidual  dos miRNAs candidatos 22 

Para análise de especificidade tecidual, os novos miRs identificados em CCR 23 

foram comparados à tecidos normais de diferentes localizações. Foram incluídas nessas 24 

análises apenas amostras colorretais normais dos grupos de descoberta e validação 25 

(N=31) e comparadas às amostras de tecido normal adjacente de 5 sítios anatômicos 26 

diferentes, conforme descrito a seguir: pulmão (n=89), mama (n=90), bexiga urinária 27 

(n=19), fígado (n=59) e sistema nervoso central (n=5). Esses sítios foram escolhidos por 28 

compartilharem a mesma origem embriológica do tecido colorretal (pulmão, bexiga 29 

urinária, fígado) ou ser um sítio metastático típico dos tumores colorretais (SNC, pulmão 30 



                                                

33 
  

e fígado). Os dados brutos (nível 1) de small-RNAseq dessas amostras obtidas do TCGA 1 

foram submetidos à análise na plataforma miRMaster para identificação de novos 2 

miRNAs. Os níveis de expressão normalizados dos novos miRNAs candidatos 3 

identificados nos tecidos normais colorretais foram comparados com os novos miRs 4 

identificados nos 5 sítios anatômicos diferentes usando uma análise de redução de 5 

dimensionalidade não linear t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) no 6 

programa Orange Data Mining (DEMŠAR et al., 2013). 7 

Um heatmap com o padrão de expressão dos novos miRs identificados em cada 8 

amostra dos diferentes tecidos foi construído utilizando o pacote do R ComplexHeatmap 9 

utilizando Z-score (GU; EILS; SCHLESNER, 2016) e finalizado no Inkscape 10 

(https://inkscape.org/). 11 

Análise de componente principal (PCA) dos novos miRNAs  12 

A expressão dos miRNAs conhecidos e novos foi analisada para verificar se essas 13 

moléculas poderiam ser utilizadas para distinguir amostras normais de amostras 14 

tumorais, para esse fim utilizamos uma análise de componente principal (PCA), realizada 15 

na plataforma ClustVis (https://biit.cs.ut.ee/clustvis/). 16 

Associação da expressão dos novos miRNAs com localização anatômica 17 

A expressão dos miRNAS candidatos validados foi então analisada de acordo com 18 

o sítio anatômico de origem e estadiamento tumoral das amostras do TCGA, foram feitas 19 

análises de acordo com a lateralidade do tumor (CCR direito, que inclui ceco, cólon 20 

ascendente, flexura hepática e transverso; CCR esquerdo, incluindo flexura esplênica, 21 

cólon descendente, sigmóide e junção retosigmoide; e câncer de reto). Também foram 22 

analisados os níveis de expressão do miRNAs candidatos de acordo com a localização 23 

anatômica dos tumores, buscando ilustrar as alterações de expressões do microRNAs ao 24 

longo do trato intestinal.  25 

A análise de associação só pôde ser realizada no grupo de descoberta (TCGA), 26 

pois as amostras do grupo de validação não apresentavam dados da região anatômica 27 

de origem.  A comparação dos níveis de expressão dos novos microRNAs entre grupos 28 

foi realizada utilizando os testes de Mann-Whitney e Kruskall-Wallis. 29 

https://biit.cs.ut.ee/clustvis/


                                                

34 
  

Associação da expressão dos novos miRNAs com sobrevida 1 

As curvas de sobrevida câncer-específica para cada um dos miRNAs candidatos 2 

validados foram construídas baseadas no padrão de expressão desses miRNAS nas 3 

amostras tumorais do TCGA. Para dicotimização dos dados de expressão dos novos 4 

miRs, cada amostra foi categorizada como up-regulated ou down-regulated de acordo 5 

com z-score >2,0 ou <-2,0, respectivamente, em relação aos tecidos colorretais normais. 6 

As amostras que não atendiam esse critério foram categorizadas como expressão 7 

normal. A análise de sobrevida foi realizada pelo método de Kaplan-Meier, com o teste 8 

de log-rank para a comparação das curvas. Foram considerados estatisticamente 9 

significativos os resultados com p<0,05. Foi utilizado o programa SPSS v27 (Statistical 10 

Package for Social Science, IBM).  11 

Predição de alvos regulados pelos miRNAs candidatos 12 

Considerando se tratar de novos miRNAs, para análise de predição dos genes 13 

regulados por estes miRNAs candidatos foi necessária utilização de uma plataforma que 14 

realiza a predição de alvos a partir das sequências dos novos miRs e a 15 

complementariedade de bases entre essas sequências e os possíveis genes alvos. Para 16 

tanto foi utilizada a plataforma miRDB(http://mirdb.org/custom.html) (CHEN; WANG, 17 

2020), uma base de dados online para a previsão de alvos miRNA e anotações funcionais. 18 

Todos os alvos no miRDB são preditos pela ferramenta, MirTarget (LIU; WANG, 19 

2019), que foi desenvolvida analisando milhares de interações miRNA-alvo a partir de 20 

experiências de sequenciamento de produção. A ferramenta miRDB atribui a todos os 21 

alvos preditos um escore de predição de 50 a 100. Seguindo a recomendação dos 22 

desenvolvedores foram considerados apenas os alvos que apresentavam escore igual 23 

ou superior a 80, pois essas são as predições com maior chance de serem reais (CHEN; 24 

WANG, 2020).  25 

Análise de Expressão Gênica dos Genes Alvos 26 

Para identificar genes alvos com sentido de expressão inversa aos seus possíveis 27 

novos miRNAs reguladores, o próximo passo foi avaliar o padrão expressão gênica dos 28 

alvos das mesmas amostras tumorais utilizando dados de RNA-seq obtidos através da 29 

plataforma Xena Browser (https://xenabrowser.net/)  (GOLDMAN et al., 2020). A análise 30 

https://xenabrowser.net/


                                                

35 
  

de expressão diferencial foi realizada comparando amostras tumorais e normais dos 1 

projetos TCGA-COAD (n= 567) e TCGA-READ (n=97) para identificarmos os genes alvos 2 

diferencialmente expressos nos tumores. As amostras de tumores de cólon foram 3 

separadas em cólon esquerdo e cólon direito comparadas com a amostras normais da 4 

mesma localização anatômica. Para definir o sentido de expressão dos genes alvos foi 5 

utilizado p<0,05 e FC≥2 para os alvos considerados up-regulated e FC≤-2 para os alvos 6 

considerados down-regulated. A seguir cruzamos esses dados com os nossos candidatos 7 

e observamos quais duplas miR-alvo tinham direções opostas de FC, o que sugere que o 8 

miRNA candidato está envolvido na regulação do respectivo alvo no sítio tumoral. A 9 

seguir, todos os pares candidatos miRNAs-genes alvos foram submetidos a análise de 10 

correlação de Spearman para identificar os pares que apresentavam correlação negativa 11 

significativa (p<0,05, r≤-0,1) entre suas expressões, aumentando as chances de 12 

identificação de pares candidatos miRNAs-genes alvos reais. 13 

Construção das redes de interação entre os alvos  14 

Após identificação dos genes alvos dos miRNAs candidatos (àqueles com 15 

correlação negativa significativa), foi realizada análise de interações entre os alvos 16 

utilizando a plataforma String (https://string-db.org/) (SZKLARCZYK et al., 2023). O 17 

programa Cytoscape (SHANNON et al., 2003a) foi utilizado para construir as figuras das 18 

redes de interação dos alvos juntamente com os respectivos miRs reguladores 19 

Análise de Enriquecimento 20 

Para a análise de enriquecimento dos alvos foram divididos em 3 grupos “Alvos 21 

regulados em Cólon Esquerdo”, “Alvos regulados em Cólon Direito” e “Alvos regulados 22 

em Reto”. Esses grupos foram analisados na plataforma Enrichr 23 

(https://maayanlab.cloud/Enrichr/) utilizando 2 módulos de ontologias “GO Biological 24 

Process 2021” e “GO Molecular Function 2021” e 2 módulos de vias biológicas “KEGG 25 

Human 2021” e “Reactome 2022”.(CHEN et al., 2013; KULESHOV et al., 2016) 26 

 27 

  28 

https://string-db.org/
https://maayanlab.cloud/Enrichr/


                                                

36 
  

Referências 1 

AHMED, Z.; MAL, C. Functional role of hub molecules in miRNA and transcription factor 2 

mediated gene regulatory network of colorectal and lung cancer. Gene Reports, v. 23, 1 jun. 3 

2021.  4 

ARRIBAS, J. et al. NF-κB Mediates the Expression of TBX15 in Cancer Cells. PLoS ONE, v. 11, n. 5 

6, 1 jun. 2016.  6 

BACKES, C. et al. Prioritizing and selecting likely novel miRNAs from NGS data. Nucleic Acids 7 

Research, v. 44, n. 6, p. 53, 2016.  8 

BAILEY, C. E. et al. Increasing disparities in the age-related incidences of colon and rectal 9 

cancers in the United States, 1975-2010. JAMA surgery, v. 150, n. 1, p. 17–22, 2015.  10 

BARROS-FILHO, M. C. et al. Previously undescribed thyroid-specific miRNA sequences in 11 

papillary thyroid carcinoma. Journal of Human Genetics, v. 64, n. 5, p. 505–508, 1 maio 2019.  12 

BASS, A. J. et al. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature 13 

2014 513:7517, v. 513, n. 7517, p. 202–209, 23 jul. 2014.  14 

BATTAGLIN, F. et al. Microsatellite instability in colorectal cancer: Overview of its clinical 15 

significance and novel perspectives. Clinical Advances in Hematology and Oncology, v. 16, n. 16 

11, p. 735–747, 2018.  17 

BENEDIX, F. et al. Comparison of 17,641 patients with right- and left-sided colon cancer: 18 

Differences in epidemiology, perioperative course, histology, and survival. Diseases of the 19 

Colon and Rectum, v. 53, n. 1, p. 57–64, jan. 2010.  20 

BJERKE, G. A.; YI, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the 21 

impact of microRNAs on mammalian transcriptome. Rna, p. rna.073635.119, 2020.  22 

BRUNI, D.; ANGELL, H. K.; GALON, J. The immune contexture and Immunoscore in cancer 23 

prognosis and therapeutic efficacy. Nature Reviews Cancer, 2020. Disponível em: 24 

<https://doi.org/10.1038/>. Acesso em: 27 ago. 2020 25 

CALIN, G. A.; CROCE, C. M. Chromosomal rearrangements and microRNAs: a new cancer link 26 

with clinical implications. Journal of Clinical Investigation, v. 117, n. 8, p. 2059, 8 ago. 2007.  27 

CARMELIET, P.; JAIN, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. 28 

Nature, v. 473, n. 7347, p. 298–307, 19 maio 2011.  29 

CARVALHO, T. I. DE et al. Analysis of gene expression EGFR and KRAS, microRNA-21 and 30 

microRNA-203 in patients with colon and rectal cancer and correlation with clinical outcome 31 

and prognostic factors. Acta Cirurgica Brasileira, v. 32, n. 3, p. 243–250, 2017.  32 

CHAN, A. K. C. et al. Management of Colorectal Cancer with Synchronous Liver Metastases: An 33 

Inception Cohort Study (CoSMIC). Annals of Surgical Oncology, v. 29, 2022.  34 



                                                

37 
  

CHAN, A. K. C.; SIRIWARDENA, A. K. Practical Implications of KRAS Mutation Status and 1 

Sidedness of Primary Tumour in Patients with Colorectal Cancer and Synchronous Liver 2 

Metastases: A Subset Analysis of the CoSMIC Study. Cancers, v. 14, n. 19, 1 out. 2022.  3 

CHANG, G. et al. Hypoexpression and Epigenetic Regulation of Candidate Tumor Suppressor 4 

Gene CADM-2 in Human Prostate Cancer. Clinical cancer research : an official journal of the 5 

American Association for Cancer Research, v. 16, n. 22, p. 5390, 15 nov. 2010.  6 

CHEN, E. Y. et al. Enrichr: Interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis 7 

tool. BMC Bioinformatics, v. 14, p. 128, 15 abr. 2013.  8 

CHEN, L. et al. miR-203a-3p promotes colorectal cancer proliferation and migration by 9 

targeting PDE4D. American Journal of Cancer Research, v. 8, n. 12, p. 2387, 2018.  10 

CHEN, Y.; WANG, X. MiRDB: An online database for prediction of functional microRNA targets. 11 

Nucleic Acids Research, v. 48, n. D1, p. D127–D131, 8 jan. 2020.  12 

CHUNG, Y. et al. Nuclear Expression Loss of SSBP2 Is Associated with Poor Prognostic Factors in 13 

Colorectal Adenocarcinoma. Diagnostics, v. 10, n. 12, 1 dez. 2020.  14 

COEBERGH VAN DEN BRAAK, R. R. J. et al. Confirmation of a metastasis-specific microRNA 15 

signature in primary colon cancer. Scientific Reports, v. 8, n. 1, p. 1–11, 2018.  16 

CROCE, C. M.; REED, J. C. Finally, an apoptosis-targeting therapeutic for cancer. Cancer 17 

research, v. 76, n. 20, p. 5914, 10 out. 2016.  18 

CUI, X. et al. Homer1 is a Potential Biomarker for Prognosis in Human Colorectal Carcinoma, 19 

Possibly in Association with G3BP1 Signaling. Cancer Management and Research, v. 12, p. 20 

2899, 2020.  21 

DAI, Y. et al. TCF21 functions as a tumor suppressor in colorectal cancer through inactivation of 22 

PI3K/AKT signaling. OncoTargets and therapy, v. 10, p. 1603–1611, 14 mar. 2017.  23 

DEBACKER, K.; FRANK KOOY, R. Fragile sites and human disease. Human Molecular Genetics, v. 24 

16, n. R2, p. R150–R158, 15 out. 2007.  25 

DEMŠAR, J. et al. Orange: Data Mining Toolbox in Python Tomaž Curk Matija Polajnar Laň 26 

Zagar. Journal of Machine Learning Research, v. 14, p. 2349–2353, 2013.  27 

DENG, Y. Rectal Cancer in Asian vs. Western Countries: Why the Variation in Incidence? 28 

Current Treatment Options in Oncology, v. 18, n. 10, p. 64, 25 out. 2017.  29 

DING, L. et al. The Roles of Cyclin-Dependent Kinases in Cell-Cycle Progression and Therapeutic 30 

Strategies in Human Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences, v. 21, n. 6, 1 31 

mar. 2020.  32 

ENEH, S. et al. MicroRNAs associated with biological pathways of left- And right-sided 33 

colorectal cancer. Anticancer Research, v. 40, n. 7, p. 3713–3722, 1 jul. 2020.  34 



                                                

38 
  

ENTERLINE, P. E.; DAY, R.; MARSH, G. M. Cancers related to exposure to arsenic at a copper 1 

smelter. Occupational and Environmental Medicine, v. 52, p. 28–32, 1995.  2 

FEARON, E. R.; VOGELSTEIN, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, v. 61, n. 5, p. 3 

759–767, 1 jun. 1990.  4 

FEHILY, S. R. et al. The gut microbiota and gut disease. Internal Medicine Journal, v. 51, n. 10, 5 

p. 1594–1604, 1 out. 2021.  6 

FEHLMANN, T. et al. Web-based NGS data analysis using miRMaster: A large-scale meta-7 

analysis of human miRNAs. Nucleic Acids Research, v. 45, n. 15, p. 8731–8744, 2017.  8 

FEHLMANN, T. et al. miRMaster 2.0: multi-species non-coding RNA sequencing analyses at 9 

scale. Nucleic Acids Research, v. 49, n. W1, p. W397–W408, 2 jul. 2021.  10 

FEHLMANN, T.; MEESE, E.; KELLER, A. Exploring ncRNAs in Alzheimer’s disease by miRMaster. 11 

Oncotarget, v. 8, n. 3, p. 3771–3772, 2017.  12 

FIDELLE, M. et al. Resolving the Paradox of Colon Cancer Through the Integration of Genetics, 13 

Immunology, and the Microbiota. Frontiers in Immunology, v. 0, p. 3209, 14 dez. 2020.  14 

FILIPOWICZ, W.; BHATTACHARYYA, S. N.; SONENBERG, N. Mechanisms of post-transcriptional 15 

regulation by microRNAs: Are the answers in sight? Nature Reviews Genetics, v. 9, n. 2, p. 16 

102–114, 2008.  17 

FRIEDLÄNDER, M. R. et al. MiRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel 18 

microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research, v. 40, n. 1, p. 37–52, 2012.  19 

FRIEDLÄNDER, M. R. et al. Evidence for the biogenesis of more than 1,000 novel human 20 

microRNAs. Genome Biology, v. 15, n. 4, p. 1–17, 2014.  21 

FROMM, B. et al. Substantial Loss of Conserved and Gain of Novel MicroRNA Families in 22 

Flatworms. Molecular Biology and Evolution, v. 30, n. 12, p. 2619–2628, 1 dez. 2013.  23 

GILL, S. R. et al. Metagenomic Analysis of the Human Distal Gut Microbiome. Science (New 24 

York, N.Y.), v. 312, n. 5778, p. 1355, 2 jun. 2006.  25 

GOLDMAN, M. J. et al. Visualizing and interpreting cancer genomics data via the Xena 26 

platform. Nature BiotechnologyNature Publishing Group, , 22 maio 2020. Disponível em: 27 

<https://www.nature.com/articles/s41587-020-0546-8>. Acesso em: 24 out. 2021 28 

GU, Z.; EILS, R.; SCHLESNER, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in 29 

multidimensional genomic data. Bioinformatics, v. 32, n. 18, p. 2847–2849, 15 set. 2016.  30 

GUINNEY, J. et al. The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nature Medicine, v. 31 

21, n. 11, p. 1350–1356, 2015.  32 

HANAHAN, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discovery, v. 12, n. 1, p. 31–46, 1 33 

jan. 2022.  34 



                                                

39 
  

HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. The hallmarks of cancer. Cell, v. 100, n. 1, p. 57–70, 7 jan. 1 

2000.  2 

HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell, v. 144, n. 5, p. 3 

646–674, 2011.  4 

HU, W. et al. Multi-omics approach reveals distinct differences in left- and right-sided colon 5 

cancer. Molecular Cancer Research, v. 16, n. 3, p. 476–485, 1 mar. 2018.  6 

INCA; INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - INCA. Incidência de 7 

Câncer no Brasil 2023 - Neoplasia maligna do cólon e reto (taxas ajustadas) — Português 8 

(Brasil). [s.l: s.n.]. Disponível em: <https://www.gov.br/inca/pt-9 

br/assuntos/cancer/numeros/estimativa/por-neoplasia-taxas-ajustadas/colon-reto>. Acesso 10 

em: 28 nov. 2022. 11 

JOHNCILLA, M.; YANTISS, R. K. Histology of Colorectal Carcinoma: Proven and Purported 12 

Prognostic Factors. Surgical Pathology ClinicsW.B. Saunders, , 1 set. 2020.  13 

JUNG, K. U.; KIM, H. O.; KIM, H. Epidemiology, Risk Factors, and Prevention of Colorectal 14 

Cancer-An English Version. Journal of the anus, rectum and colon, v. 6, n. 4, p. 231–238, 2022.  15 

KANDIMALLA, R. et al. Genome-wide discovery and identification of a novel miRNA signature 16 

for recurrence prediction in stage II and III colorectal cancer. Clinical Cancer Research, v. 24, n. 17 

16, p. 3867–3877, 2018.  18 

KIM, H. et al. Dietary mercury intake and colorectal cancer risk: A case-control study. Clinical 19 

Nutrition, v. 39, n. 7, p. 2106–2113, 1 jul. 2020.  20 

KOZOMARA, A.; BIRGAOANU, M.; GRIFFITHS-JONES, S. miRBase: from microRNA sequences to 21 

function. Nucleic Acids Research, v. 47, n. D1, p. D155–D162, 8 jan. 2019.  22 

KULESHOV, M. V. et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 23 

2016 update. Nucleic Acids Research, v. 44, n. W1, p. 90–97, 8 jul. 2016.  24 

KUMAR, R. et al. HumCFS: A database of fragile sites in human chromosomes. BMC Genomics, 25 

v. 19, n. 9, p. 1–8, 18 abr. 2019.  26 

LAGANÀ, A. et al. Variability in the Incidence of miRNAs and Genes in Fragile Sites and the Role 27 

of Repeats and CpG Islands in the Distribution of Genetic Material. PLOS ONE, v. 5, n. 6, p. 28 

e11166, 2010.  29 

LAI, S. H. et al. PDE4 Subtypes in Cancer. Oncogene, v. 39, n. 19, p. 3791, 7 maio 2020.  30 

LEE, E.; CHEUNG, J.; BIALKOWSKA, A. B. Krüppel-like Factors 4 and 5 in Colorectal 31 

Tumorigenesis. Cancers, v. 15, n. 9, 1 maio 2023.  32 

LEE, M. S.; MENTER, D. G.; KOPETZ, S. Right versus left colon cancer biology: Integrating the 33 

consensus molecular subtypes. JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer 34 

Network, v. 15, n. 3, p. 411–419, 1 mar. 2017.  35 



                                                

40 
  

LEROYER, A. et al. Cancer mortality and chemical exposure in a retrospective zinc and lead 1 

smelter cohort: A 48-year follow-up. International Journal of Hygiene and Environmental 2 

Health, v. 242, p. 113955, 1 maio 2022.  3 

LI, X. et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid 4 

culture. Nature medicine, v. 20, n. 7, p. 769, 2014.  5 

LIANG, C. et al. Recent advances in the diagnostic and therapeutic roles of microRNAs in 6 

colorectal cancer progression and metastasis. Frontiers in Oncology, v. 12, p. 911856, 13 out. 7 

2022.  8 

LIU, W.; WANG, X. Prediction of functional microRNA targets by integrative modeling of 9 

microRNA binding and target expression data. Genome Biology, v. 20, n. 1, p. 1–10, 22 jan. 10 

2019.  11 

LLOSA, N. J. et al. The vigorous immune microenvironment of microsatellite instable colon 12 

cancer is balanced by multiple counter-inhibitory checkpoints. Cancer Discov, v. 5, n. 1, p. 43–13 

51, 2015.  14 

LONDIN, E. et al. Analysis of 13 cell types reveals evidence for the expression of numerous 15 

novel primate- and tissue-specific microRNAs. Proceedings of the National Academy of 16 

Sciences, v. 112, n. 10, p. E1106–E1115, 2015.  17 

LOREE, J. M. et al. Classifying colorectal cancer by tumor location rather than sidedness 18 

highlights a continuum in mutation profiles and consensus molecular subtypes. Clinical Cancer 19 

Research, v. 24, n. 5, p. 1062–1072, 2018.  20 

LULLI, M. et al. Role of Non-Coding RNAs in Colorectal Cancer: Focus on Long Non-Coding 21 

RNAs. International Journal of Molecular Sciences 2022, Vol. 23, Page 13431, v. 23, n. 21, p. 22 

13431, 3 nov. 2022.  23 

LUNA BUITRAGO, D.; LOVERING, R. C.; CAPORALI, A. Insights into Online microRNA 24 

Bioinformatics Tools. Non-Coding RNA 2023, Vol. 9, Page 18, v. 9, n. 2, p. 18, 6 mar. 2023.  25 

MACÊDO, A. K. S. et al. Histological and molecular changes in gill and liver of fish (Astyanax 26 

lacustris Lütken, 1875) exposed to water from the Doce basin after the rupture of a mining 27 

tailings dam in Mariana, MG, Brazil. Science of the Total Environment, v. 735, 15 set. 2020.  28 

MARTINEZ, V. D. et al. Unique somatic and malignant expression patterns implicate PIWI-29 

interacting RNAs in cancer-type specific biology. Scientific Reports, v. 5, 2015.  30 

MARTINEZ, V. D. et al. Discovery of previously undetected microRNAs in mesothelioma and 31 

their use as tissue-of-origin markers. American Journal of Respiratory Cell and Molecular 32 

Biology, v. 61, n. 2, p. 266–268, 1 ago. 2019.  33 

MATHELIER, A.; CARBONE, A. Large scale chromosomal mapping of human microRNA 34 

structural clusters. Nucleic Acids Research, v. 41, n. 8, p. 4392–4408, 1 abr. 2013.  35 



                                                

41 
  

METSALU, T.; VILO, J. ClustVis: a web tool for visualizing clustering of multivariate data using 1 

Principal Component Analysis and heatmap. Nucleic Acids Research, v. 43, n. W1, p. W566–2 

W570, 1 jul. 2015.  3 

MINATEL, B. C. et al. Large-scale discovery of previously undetected microRNAs specific to 4 

human liver. Human Genomics, v. 12, n. 1, p. 16, 2018.  5 

MIRCETA, M. et al. Fragile sites, chromosomal lesions, tandem repeats, and disease. Frontiers 6 

in Genetics, v. 13, 17 nov. 2022.  7 

MO YANG, K. et al. Does the Different Locations of Colon Cancer Affect the Oncologic 8 

Outcome? A Propensity-Score Matched Analysis. Annals of Coloproctology, p. 2287–9714, 9 

2019.  10 

MOJARAD, E. N. et al. The CpG island methylator phenotype (CIMP) in colorectal cancer. 11 

Gastroenterology and Hepatology from Bed to Bench, v. 6, n. 3, p. 120–128, 2013.  12 

MOTA, P. J. et al. Prevalence of metal levels above the reference values in a municipality 13 

affected by the collapse of a mining tailings dam: Brumadinho Health Project. Revista 14 

Brasileira de Epidemiologia, v. 25, n. suppl 2, 2022.  15 

NI, Z. et al. Analysis of the HNF4A isoform-regulated transcriptome identifies CCL15 as a 16 

downstream target in gastric carcinogenesis. Cancer Biology & Medicine, v. 18, n. 2, p. 530, 5 17 

maio 2021.  18 

NOETZEL, E. et al. Intermediate filament dynamics and breast cancer: aberrant promoter 19 

methylation of the Synemin gene is associated with early tumor relapse. Oncogene, v. 29, n. 20 

34, p. 4814–4825, 26 ago. 2010.  21 

OMRANE, I. et al. MicroRNAs 146a and 147b biomarkers for colorectal tumor’s localization. 22 

BioMed Research International, v. 2014, 2014.  23 

PALAZZO, A. F.; LEE, E. S. Non-coding RNA: what is functional and what is junk? Frontiers in 24 

Genetics, v. 6, n. JAN, 2015.  25 

PASCHKE, S. et al. Are colon and rectal cancer two different tumor entities? A proposal to 26 

abandon the term colorectal cancer. International Journal of Molecular Sciences, v. 19, n. 9, 27 

2018.  28 

PETRELLI, F. et al. Prognostic survival associated with left-sided vs right-sided colon cancer a 29 

systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology, v. 3, n. 2, p. 211–219, 1 fev. 2017.  30 

PEWARCHUK, M. E. et al. Upgrading the repertoire of miRNAs in gastric adenocarcinoma to 31 

provide a new resource for biomarker discovery. International Journal of Molecular Sciences, 32 

v. 20, n. 22, p. 5697, 14 nov. 2019.  33 

PINO, M. S.; CHUNG, D. C. The Chromosomal Instability Pathway in Colon Cancer. 34 

Gastroenterology, v. 138, n. 6, p. 2059–2072, 2010.  35 



                                                

42 
  

REETESH, P.; BELL, P. D.; PAI, R. K. Immune Response in Colorectal Carcinoma: A Review of Its 1 

Significance as a Predictive and Prognostic Biomarker. Histopathology, 27 jun. 2022.  2 

RESHMI, G. et al. Identification and analysis of novel microRNAs from fragile sites of human 3 

cervical cancer: Computational and experimental approach. Genomics, v. 97, n. 6, p. 333–340, 4 

1 jun. 2011.  5 

ROCK, L. D. et al. Expanding the Transcriptome of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma 6 

Through Novel MicroRNA Discovery. Frontiers in Oncology, v. 9, p. 1305, 27 nov. 2019.  7 

SAGE, A. P. et al. Expanding the miRNA Transcriptome of Human Kidney and Renal Cell 8 

Carcinoma. International Journal of Genomics, v. 2018, 2018.  9 

SALIMINEJAD, K. et al. An overview of microRNAs: Biology, functions, therapeutics, and 10 

analysis methods. Journal of Cellular PhysiologyWiley-Liss Inc., , 1 maio 2019a.  11 

SALIMINEJAD, K. et al. An overview of microRNAs: Biology, functions, therapeutics, and 12 

analysis methods. Journal of Cellular Physiology, v. 234, n. 5, p. 5451–5465, 1 maio 2019b.  13 

SEMBA, S. et al. Down-Regulation of PIK3CG, a Catalytic Subunit of Phosphatidylinositol 3-OH 14 

Kinase, by CpG Hypermethylation in Human Colorectal Carcinoma. Clinical Cancer Research, v. 15 

8, n. 12, 2002.  16 

SHANNON, P. et al. Cytoscape: A software Environment for integrated models of biomolecular 17 

interaction networks. Genome Research, v. 13, n. 11, p. 2498–2504, nov. 2003a.  18 

SHANNON, P. et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular 19 

Interaction Networks. Genome Research, v. 13, n. 11, p. 2498, nov. 2003b.  20 

SIDDIQUI, R. et al. The Pivotal Role of the Gut Microbiome in Colorectal Cancer. Biology 2022, 21 

Vol. 11, Page 1642, v. 11, n. 11, p. 1642, 9 nov. 2022.  22 

SLATTERY, M. L. et al. MicroRNAs and colon and rectal cancer: differential expression by tumor 23 

location and subtype. Genes, chromosomes & cancer, v. 50, n. 3, p. 196–206, 2011.  24 

SLATTERY, M. L. et al. Site-specific associations between miRNA expression and survival in 25 

colorectal cancer cases. Oncotarget, 2016.  26 

SMOLLE, M. A. et al. Noncoding RNAs and immune checkpoints—clinical implications as cancer 27 

therapeutics. The FEBS Journal, v. 284, n. 13, p. 1952–1966, 1 jul. 2017.  28 

SOLDEVILLA, B. et al. The correlation between immune subtypes and consensus molecular 29 

subtypes in colorectal cancer identifies novel tumour microenvironment profiles, with 30 

prognostic and therapeutic implications. European Journal of Cancer, v. 123, p. 118–129, 1 31 

dez. 2019.  32 

STANCA MELINCOVICI, C. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-key factor in normal 33 

and pathological angiogenesis. Rom J Morphol Embryol, v. 59, n. 2, p. 455–467, 2018.  34 



                                                

43 
  

STOFFEL, E. M.; MURPHY, C. C. Epidemiology and Mechanisms of the Increasing Incidence of 1 

Colon and Rectal Cancers in Young Adults. Gastroenterology, v. 158, n. 2, p. 341–353, 2020.  2 

SUNG, H. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality 3 

Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians, v. 71, n. 3, p. 4 

209–249, maio 2021.  5 

SVEEN, A. et al. Colorectal cancer consensus molecular subtypes translated to preclinical 6 

models uncover potentially targetable cancer cell dependencies. Clinical Cancer Research, v. 7 

24, n. 4, p. 794–806, 15 fev. 2018.  8 

SZCZEPANEK, J.; SKORUPA, M.; TRETYN, A. MicroRNA as a Potential Therapeutic Molecule in 9 

Cancer. Cells, v. 11, n. 6, 1 mar. 2022.  10 

SZKLARCZYK, D. et al. The STRING database in 2023: protein–protein association networks and 11 

functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Research, 12 

v. 51, n. D1, p. D638, 1 jan. 2023.  13 

TAMAS, K. et al. Rectal and colon cancer: Not just a different anatomic site. Cancer Treatment 14 

Reviews, v. 41, n. 8, p. 671–679, 2015.  15 

THE CANCER GENOME ATLAS NETWORK. Comprehensive molecular characterization of human 16 

colon and rectal cancer. Nature, v. 487, n. 7407, p. 330–337, 2012.  17 

THOMAS, J. et al. MicroRNAs: Clinical relevance in colorectal cancer. International Journal of 18 

Molecular Sciences, v. 16, n. 12, p. 28063–28076, 2015.  19 

VAN ROOSBROECK, K.; CALIN, G. A. Cancer Hallmarks and MicroRNAs: The Therapeutic 20 

Connection. Em: Advances in Cancer Research. [s.l.] Academic Press Inc., 2017. v. 135p. 119–21 

149.  22 

WANG, C.; FAKIH, M. Targeting KRAS in Colorectal Cancer. Current Oncology Reports, v. 23, n. 23 

3, p. 1–10, 1 mar. 2021.  24 

WANG, Y. et al. SSBP2 is an in vivo tumor suppressor and regulator of LDB1 stability. 25 

Oncogene, v. 29, n. 21, p. 3044, 27 maio 2010.  26 

WANG, Y. et al. Integrated Analysis of the Functions and Prognostic Values of RNA-Binding 27 

Proteins in Colorectal Cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology, v. 8, 5 nov. 2020.  28 

WANG, Y. et al. MiR-17-5p Targets and Downregulates CADM2, Activating the Malignant 29 

Phenotypes of Colon Cancer Cells. Molecular Biotechnology, v. 64, n. 12, p. 1388–1400, 1 dez. 30 

2022.  31 

WHITTAKER, S. R. et al. Inhibitors of Cyclin-Dependent Kinases as Cancer Therapeutics. 32 

Pharmacology & therapeutics, v. 173, p. 83, 1 maio 2017.  33 

WIGGINS, A. et al. MetastamiRs: The Role of MicroRNAs in the Metastatic Phenotype of 34 

Prostate Cancer. Em: SEGI, C. M. (Ed.). Metastasis. [s.l.] Exon Publications, 2022.  35 



                                                

44 
  

WIRBEL, J. et al. Meta-analysis of fecal metagenomes reveals global microbial signatures that 1 

are specific for colorectal cancer. Nature medicine, v. 25, n. 4,