RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 12/04/2026. 1 IATÃ DO CARMO MENDONÇA Quimiodiversidade de Humicola fuscoatra, fungo endofítico isolado da alga marinha Asparagopsis taxiformis: co-cultura e uso de modificadores epigenéticos visando alteração do perfil metabólico Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Química para obtenção do título de Doutor em Química. Orientadora: Dulce Helena Siqueira Silva Araraquara 2024 2 3 IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA Este trabalho corrobora a versatilidade de microrganismos marinhos em pesquisas de bioprospecção, pela ativação de vias metabólicas em experimentos de co-cultivo ou uso de moduladores epigenéticos, ampliando a quimiodiversidade, contribuindo para a descoberta de substâncias bioativas e preservação dos ecossistemas marinhos em consonância aos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável ODS 3, 6, 9, 12 e 14. POTENCIAL IMPACT OF THIS RESEARCH This work corroborates the versatility of marine microorganisms in bioprospecting research, by activating metabolic pathways in co-culture experiments or using epigenetic modulators, expanding chemodiversity, contributing to the discovery of bioactive substances and preservation of marine ecosystems in line with Sustainable Development Goals SDGs 3, 6, 9, 12 and 14. 4 5 DADOS CURRICULARES DADOS PESSOAIS Nome: Iatã do Carmo Mendonça Filiação: Oscar José Vaz Mendonça e Vera Regina do Carmo Mendonça Nascimento: 15/05/1994 – Volta Redonda-RJ-Brasil. Endereço Profissional: NuBBE “Núcleo de Bioensaio, Biossíntese e Ecofisilogia de Produtos Naturais”. Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química de Araraquara – Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” - UNESP, Araraquara - SP. Endereço eletrônico: iata.mendonca@hotmail.com FORMAÇÃO ACADÊMICA 2012-2016 Graduação: Bacharel em Química Instituição: Universidade Federal Fluminense-RJ 2016-2018 Mestrado: Química, Área de Concentração - Química Orgânica Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” - UNESP- Instituto de Química de Araraquara- SP. Dissertação: Prospecção química e biológica do endófito Humicola fuscoatra associado a alga vermelha Asparagopsis taxiformis para obtenção de metabólitos secundários bioativos. Orientadora: Profª. Drª. Dulce Helena Siqueira Silva 2019-2024 Doutorado: Química, Área de Concentração - Química Orgânica Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” - UNESP- Instituto de Química de Araraquara- SP. Tese: Quimiodiversidade de Humicola fuscoatra, fungo endofítico isolado da alga marinha Asparagopsis taxiformis: co-cultura e uso de modificadores epigenéticos visando alteração do perfil metabólico. Orientadora: Profª. Drª. Dulce Helena Siqueira Silva 6 PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos: Rossoni R. D.; Barros, P. P.; Mendonça, I. C.; Medina, R. P.; Silva, D.H. S.; Fuchs, B. B.; Junqueira, J. C.; Mylonakis E. The Postbiotic Activity of Lactobacillus paracasei 28.4 Against Candida auris. Front Cell Infect Microbiol. V. 4, n. 10, p. 397, 2020. doi: 10.3389/fcimb.2020.00397. PMID: 32850495; PMCID: PMC7417517. Trabalhos ou resumos em eventos científicos: Iatã do Carmo Mendonça.; Alana Evangelista Honório.; Rebeca Previate Medina.; Dulce Helena Siqueira Silva. Optimization of growth conditions and chemical prospection of Nodulisporium sp., an endophyte of Asparagosis taxiformis. 6th BCNP Brazillian Conference on Natural Products/xxxii RESEM. Victoria-ES, 2017. Iatã do Carmo Mendonça; Alana Evangelista Honório; Rebeca Previate Medina; Dulce Helena Siqueira Silva. Chemical prospection of Humicola fuscoatra, an endophyte of marine red alga Asparagopsis taxiformis. 41ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Foz do iguaçu-PR, 2018. Iatã do Carmo Mendonça; Victor Hugo Lino Rufino; Givaldo Souza da Silva; Rafael Viana da Silva; Dulce Helena Siqueira Silva. Estudo de metabólitos secundários de fungos endofíticos isoladas de alga marinha vermelha utilizando GNPS molecular networking. 2° Simpósio Regional Sudeste de Farmacognosia. 27 a 30 de abril de 2022. Penedo – RJ. Iatã do Carmo Mendonça; Givaldo Souza da Silva; Victor Hugo Lino Rufino; Edelson de Jesus Sá Dias; Lucas Henrique Silva Moura; Dulce Helena Siqueira Silva. Induction of secondary metabolites through Coculture of endophytic fungi strains isolated from marine red algae. 46° Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química. 28 a 31 de maio de 2023. Águas de Lindóia – SP. 7 Participação em eventos científicos: Apresentação oral do trabalho intitulado “Estudo de metabólitos secundários de fungos endofíticos isoladas de alga marinha vermelha utilizando GNPS molecular networking” no 2° Simposio Regional Sudeste de Farmacognosia. 27 à 30 de abril de 2022. Penedo – RJ. Apresentação oral do trabalho intitulado “Induction of secondary metabolites through Coculture of endophytic fungi strains isolated from marine red algae” na 46° Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química. 28 à 31 de maio de 2023. Águas de Lindóia – SP. Atividades extracurriculares: Iniciação Científica: Introdução a Modelagem Molecular. Bolsista Jovens Talentos da Ciência. Universidade Federal Fluminense. Juliane Yoneda, 2013-2014. Iniciação Científica: Modelagem Molecular de Compostos com Atividade frente ao Trypanossoma cruzi e Leishmania sp. Bolsista da FAPERJ. Universidade Federal Fluminense. Juliane Yoneda, 2014-2015. Minicurso “A Química dos Alcaloides Aporfinoides e Propriedades Farmacológicas”. 30 de setembro e 01 de outubro de 2020, 5 horas. Participação no evento “Introdução a rede de interações moleculares e a utilização da plataforma GNPS”. 20 de julho de 2020. Curso “Docência no ensino superior: fundamentos e práticas pedagógicas”, oferecido na modalidade a distância por meio do Instituto de Educação e Pesquisa em Práticas Pedagógicas - IEP³ - Unesp, 19 de janeiro de 2021, 30 horas. Participação no Programa de Aperfeiçoamento e Apoio à Docência no Ensino Superior - PAADES, na disciplina de Química Orgânica III, de responsabilidade do 8 Departamento de Bioquímica e Química Orgânica do Câmpus de Araraquara - Unesp, 22 de abril a 20 de agosto de 2021, 30 horas. Participação no Programa de Aperfeiçoamento e Apoio à Docência no Ensino Superior - PAADES, na disciplina de Química Orgânica I, de responsabilidade do Departamento de Bioquímica e Química Orgânica do Câmpus de Araraquara - Unesp, 19 de novembro de 2021 a 28 de janeiro de 2022, 30 horas. Curso “Comunicação e escrita científica” oferecido na modalidade a distância por meio da ACS Publications, 25 de outubro, 01 e 09 de novembro de 2023, 4,5 horas. 9 Aos meus pais Oscar e Vera, por todo o apoio e carinho durante esta jornada. 10 AGRADECIMENTOS À minha família, pelo amor e apoio incondicionais em todos os momentos da minha vida. À minha namorada Adriana Barbosa por todo amor, carinho e compreensão durante essa caminhada. Por estar ao meu lado nos momentos bons e ruim e por ser um exemplo de dedicação e perseverança, me fazendo quere evoluir sempre e me tornar uma pessoa cada vez melhor. Aos meus amigos de infância e da graduação, que mesmo com o passar dos anos sempre me receberam com todo amor e carinho. Aos amigos e colegas de pesquisa do NuBBE, por todo o aprendizado e companheirismo. Em especial agradeço aos amigos do grupo dos marinhos por toda a ajuda na pesquisa, apoio nos momentos de angústia e pelos momentos de alegria. Aos professores do IQ-UNESP por todo conhecimento e ensinamentos transmitidos. Aos funcionários do IQ-UNESP pelo excelente trabalho, sem o qual não seria possível realizar esta pesquisa. Em especial gostaria de agradecer ao João Bronzel e a Juliana Rodrigues, por todo o apoio e dedicação e ao Nivaldo, responsável pelo laboratório de RMN, pela paciência e por todos os ensinamentos. À minha orientadora, Professora Dra. Dulce, pelos ensinamentos e por todo apoio nessa jornada. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. Por fim agradeço a todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para minha formação pessoal e profissional, me ajudando a concluir mais uma etapa da minha vida. 11 O ontem é história, o amanhã é um mistério, mas o hoje é uma dádiva. É por isso que se chama presente. Mestre Oogway (Kung Fu Panda - 2008) Ver o mundo e os perigos que virão, ver por trás dos muros, chegar mais perto, encontrar o outro e sentir. Esse é o propósito da vida. A Vida Secreta de Walter Mitty (2013) 12 RESUMO Os produtos de origem natural vêm auxiliando a humanidade a lidar com enfermidades desde os primórdios das civilizações, e atualmente despertam interesse tanto científico quanto econômico, pois incluem amplo espectro de substâncias bioativas. Dentre as fontes mais promissoras, destacam-se os organismos marinhos, que apresentam biodiversidade comparável às florestas tropicais e grande potencial para bioprospecção. Neste trabalho, investigamos microrganismos do bioma marinho, por sua elevada capacidade de biossintetizar estruturas orgânicas complexas e ampla quimiodiversidade, bem como a possibilidade de cultivo em laboratório, o que reduz a necessidade de coletas e permite realizar variações nas condições de cultivo para estimular a ativação de vias metabólicas, eventualmente silenciadas, em função da falta de estímulos externos. Neste contexto, este estudo objetivou aprofundar a prospecção química do fungo endofítico Humicola fuscoatra, isolado da alga vermelha Asparagopsis taxiformis (estágio Falkenbergia), utilizando diferentes metodologias para estimular possíveis vias metabólicas silenciadas. O experimento de co-cultivo com o fungo endofítico H. fuscoatra e outro endófito isolado do mesmo hospedeiro, identificado como Nemania bipapillata, forneceu um extrato, cuja análise por CLUAE- EM e uso da plataforma GNPS permitiu, quando comparado aos extratos de monocultivo, a anotação de 8 substâncias, incluindo um sesquiterpeno, detectado apenas no extrato do co-cultivo. O experimento levou ao isolamento de 4 substâncias, as isocumarinas 5-carboxi-4,8-hidroxi-3-metil-3,4- diidroisocumarina (P01), 5-hidroxi- 8-hidroxi-3-metil-3,4- diidroisocumarina (P03) e 3,5-dimetil-8-hidroxi-3,4-dihidro- isocumarina (P04) e um policetídeo, 8-formil-3,4-dihidroxiiundeca-1,5,7,9-tetraen-1-il 3-(hidrox(imino)metoxi)-4-(5-hidroxi-4,7a-dimetil-1-oxo-3a,4,5,7a-tetraidro-1H- isoindol-3a-il)-2-metileno-butanoato, inédito (P02). O cultivo dos endófitos com os moduladores epigenéticos butirato de sódio e cloridrato de procaína forneceu extratos, cuja análise por CLUAE-EM e GNPS, levou à anotação de 15 substâncias e o isolamento e identificação da dicetopiperazina Ciclo(Leu-Pro) (P05) e de um policetídeo, metil-4-amino-4-(3,4,6-trihidroxi-5-metil-3,4-diidro-2H-pirano-3-il)but-2- enoato, (P06) também inédito. Os ensaios de atividade antibiofilme e citotóxica dos extratos analisados mostraram atividade moderada a fraca no ensaio com biofilme e aumento da atividade contra células de câncer colorretal para o extrato obtido com ambos os moduladores, corroborando a influência de moduladores epigenéticos sobre a ativação de rotas metabólicas, e a decorrente produção de novas substâncias ou maior quantidade de substâncias potencialmente bioativas. Assim, concluiu-se que ambas as abordagens se mostraram eficientes no estímulo de vias metabólicas silenciadas, permitindo anotar, isolar e/ou caracterizar substâncias possivelmente bioativas, e avaliar de forma mais detalhada a produção metabólica da linhagem H. fuscoatra. Este estudo evidencia também a importância de se intensificar a exploração do potencial metabólico dos fungos isolados de algas marinhas, e assim contribuir para aprofundar o conhecimento sobre suas interações ecológicas, essenciais para ações voltadas à preservação deste importante bioma, além de contribuir para o desenvolvimento científico cada vez mais alinhado com as propostas de sustentabilidade representadas pelos ODS-ONU. Palavras-chave: Algas Vermelhas, Fungos Marinhos, Epigenética, Produtos Naturais, Técnicas de Cocultura. 13 ABSTRACT Natural products have been helping humanity deal with illnesses since the dawn of civilizations and currently arouse both scientific and economic interest, as they include a broad spectrum of bioactive compounds. Among the most promising sources, marine organisms stand out, due to their biodiversity comparable to tropical forests and great potential for bioprospecting. In this work, we investigated microorganisms from the marine biome, due to their ability to biosynthesize highly complex organic structures and broad chemodiversity, as well as the possibility of laboratory cultivation, which reduces the need for collections and allows variations in growth conditions which may trigger activation of metabolic pathways, eventually silenced, due to the lack of external stimuli. In this context, this study aimed to deepen the chemical prospecting of the endophytic fungus Humicola fuscoatra, isolated from the red alga Asparagopsis taxiformis (Falkenbergia stage), using different approaches to trigger possibly silenced metabolic pathways. The co-cultivation experiment with H. fuscoatra and another endophyte isolated from the same host, identified as Nemania bipapillata, provided an extract, which was analyzed by UHPLC-MS and the GNPS platform, and allowed, when compared to monoculture extracts, the annotation of 8 compounds, including a sesquiterpene, previously detected only in the co-cultivation extract. In addition, the experiment led to the isolation of 4 compounds, the isocoumarins 5-carboxy-4,8- hydroxy-3-methyl-3,4-dihydroisocoumarin (P01), 5-hydroxy-8-hydroxy-3-methyl-3,4- dihydroisocoumarin (P03) and 3,5-dimethyl-8-hydroxy-3,4-dihydroisocoumarin (P04) and a new polyketide: 8-formyl-3,4-dihydroxyundeca-1,5,7,9-tetraen-1-yl-3- (hydroxy(imino)methoxy)-4-(5-hydroxy-4,7a-dimethyl-1-oxo-3a,4,5,7a-tetrahydro-1H- isoindol-3a-yl)-2-methylenebutanoate (P02). The cultivation of endophytes with the epigenetic modulators sodium butyrate and procaine hydrochloride provided extracts, which were analyzed by UHPLC-MS and the GNPS platform, and led to the annotation of 15 compounds, in addition to the isolation and identification of the diketopiperazine Cyclo(Leu-Pro) (P05) and a novel polyketide: methyl-4-amino-4-(3,4,6-trihydroxy-5- methyl-3,4-dihydro-2H-pyran-3-yl)but-2-enoate (P06). The antibiofilm and cytotoxic activity assays of the extracts under investigation showed moderate to weak activity in the biofilm assay and increased activity against colorectal cancer cells for the extract obtained with both epigenetic modulators, corroborating their influence on the activation of metabolic pathways, and the resulting production of new compounds or greater amounts of potentially bioactive substances. Such results evidenced that both methodologies proved to be efficient in triggering silenced metabolic pathways, which allowed the annotation, isolation and characterization of possibly bioactive compounds, in addition to a more comprehensive assessment of H. fuscoatra metabolic production. This study also highlights the importance of intensifying the exploration of the metabolic potential of marine fungi, which may lead to deepening knowledge about their ecological interactions, essential for actions aimed at preserving this important biome, in addition to contributing to the development of scientific research increasingly aligned with sustainability proposals as stated by the UN-SDGs. Keywords: Red Algae, Marine Fungi, Epigenetics, Natural Products, Co-culture Techniques. 14 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Novos fármacos aprovados de 1981 a 2019 categorizados por suas fontes de origem (“B”: Macromoléculas biológicas; “N”: Produtos naturais “NB”: Formulações botânicas; “ND”: Derivados de produtos naturais; “S”: Fármacos sintéticos; “S*”: Fármacos sintéticos com grupo farmacofórico baseado em produtos naturais)........ 25 Figura 2: Número de novas substâncias relatadas por filo de organismo marinho de 2017 a 2021. ............................................................................................................. 29 Figura 3: Representação do grau de compactação das histonas (Heterocromatina e Eucromatina). ............................................................................................................ 36 Figura 4: Representação das interações entre a comunidade científica de produtos naturais, as bibliotecas espectrais e os conjuntos de dados do GNPS. .................... 39 Figura 5: Comparação de espectros de quatro substâncias agrupadas em uma análise utilizando a plataforma GNPS. ...................................................................... 40 Figura 6: Gráfico das massas de extrato obtidas para os tempos de cultivo da curva de crescimento das linhagens At-04, At-05 e At-07. ................................................. 52 Figura 7: Curva de crescimento das linhagens At-04, At-05 e At-07. ....................... 53 Figura 8: Rede molecular construída a partir dos dados de CLUAE-EM de alta resolução, em modo positivo, provenientes dos extratos da linhagem At-04 em diferentes tempos de crescimento. ............................................................................ 56 Figura 9: Grupos moleculares da rede formada pelos extratos da curva de crescimento da linhagem At-04. ................................................................................ 56 Figura 10: Rede molecular construída a partir dos dados de CLUAE-EM de alta resolução em modo negativo provenientes dos extratos da linhagem At-04 em diferentes tempos de crescimento. ............................................................................ 57 Figura 11: Rede molecular construída a partir dos dados de CLUAE-EM de alta resolução, em modo positivo, provenientes dos extratos da linhagem At-05 em diferentes tempos de crescimento. ............................................................................ 60 Figura 12: Grupos moleculares da rede formada pelos extratos da curva de crescimento da linhagem At-05 em modo positivo. ................................................... 60 Figura 13: Rede molecular construída a partir dos dados de CLUAE-EM de alta resolução, em modo negativo, provenientes dos extratos da linhagem At-05 em diferentes tempos de crescimento. ............................................................................ 61 15 Figura 14: Rede molecular construída a partir dos dados de CLUAE-EM de alta resolução, em modo positivo, provenientes dos extratos da linhagem At-07 em diferentes tempos de crescimento. ............................................................................ 65 Figura 15: Rede molecular construída a partir dos dados de CLUAE-EM de alta resolução, em modo negativo, provenientes dos extratos da linhagem At-07 em diferentes tempos de crescimento. ............................................................................ 66 Figura 16: Co-cultivo (visão superior e inferior da placa) em meio sólido (BDA) das linhagens At-02 e At-05. ............................................................................................ 68 Figura 17: Rede molecular construída com auxílio da plataforma GNPS utilizando os dados de CLUAE-EM de alta resolução (QTOF) em modo positivo dos extratos de co- cultivo e mono-cultivo das linhagens At-02 e At-05. .................................................. 72 Figura 18: Rede molecular construída com auxílio da plataforma GNPS utilizando os dados de CLUAE-EM de alta resolução (QTOF) em modo negativo dos extratos de co-cultivo e mono-cultivo das linhagens At-02 e At-05 .............................................. 72 Figura 19: Grupo molecular de possíveis terpenos observados apenas no extrato obtido por co-cultura das linhagens At-02 e At-05 e estrutura da substância anotada. .................................................................................................................................. 73 Figura 20: Cromatograma do extrato CAT-02/05 em gradiente exploratório por CLAE- DAD (coluna Phenomenex Luna C-18; fase móvel com 5 a 100% ACN:H2O a 1 mL.min-1, 45 min.; 254 nm)....................................................................................... 73 Figura 21: Cromatograma da fração 40% ACN/H20 CAT-02/05 em gradiente por CLAE-DAD (coluna Phenomenex Luna C-18; fase móvel com 5 a 60% ACN:H2O a 4 mL.min-1, 60 min.; 254 nm)....................................................................................... 74 Figura 22: Espectro de UV-Vis da substância P01 (MeCN/H2O). ............................ 75 Figura 23: Estrutura proposta para a substância P01. ............................................. 76 Figura 24: Espectro de RMN de 1H da substância P01 (MeOH-d4, 600 MHz). ........ 77 Figura 25: Espectro de RMN DEPT-135 da substância P01 (MeOH-d4, 150 MHz). 78 Figura 26: Mapa de contorno de HSQC da substância P01 (MeOH-d4, 600 MHz). . 79 Figura 27: Mapa de contorno de HMBC da substância P01 (MeOH-d4, 600 MHz). . 80 Figura 28: Espectro de UV-Vis da substância P02 (MeCN/H2O) ............................. 81 Figura 29: Proposta do primeiro fragmento da estrutura da substância P02............ 82 Figura 30: Proposta do segundo fragmento da estrutura da substância P02. .......... 84 Figura 31: Proposta da estrutura da substância P02. .............................................. 85 16 Figura 32: Espectro de RMN de 1H da substância P02 (MeOH-d4, 600 MHz). ........ 87 Figura 33: Espectro de DEPT-135 da substância P02 (MeOH-d4, 150 MHz). .......... 89 Figura 34: Mapa de contorno de HSQC da substância P02 (MeOH-d4, 600 MHz). . 90 Figura 35: Mapa de contorno de HMBC da substância P02 (MeOH-d4, 600 MHz). . 91 Figura 36: Espectro de UV-Vis da substância P03 (MeCN/H2O). ............................ 92 Figura 37: Estrutura proposta para a substância P03. ............................................. 93 Figura 38: Espectro de RMN de 1H da substância P03 (MeOH-d4, 600 MHz) ......... 94 Figura 39: Espectro de DEPT-135 da substância P03 (MeOH-d4, 150 MHz). .......... 95 Figura 40: Mapa de contorno de HSQC da substância P03 (MeOH-d4, 600 MHz). . 96 Figura 41: Mapa de contorno de HMBC da substância P03 (MeOH-d4, 600 MHz). . 97 Figura 42: Espectro de UV-Vis da substância P04 (MeCN/H2O). ............................ 98 Figura 43: Estrutura proposta para a substância P04. ............................................. 99 Figura 44: Espectro de RMN de 1H da substância P04 (MeOH-d4, 600 MHz). ...... 100 Figura 45: Espectro de DEPT-135 da substância P04 (MeOH-d4, 150 MHz). ........ 101 Figura 46: Mapa de contorno de HSQC da substância P04 (MeOH-d4, 600 MHz).102 Figura 47: Mapa de contorno de HMBC da substância P04 (MeOH-d4, 600 MHz). ................................................................................................................................ 103 Figura 48: Teste de viabilidade celular da linhagem At-02 com os moduladores 5- azacitidina (1 e 2) e butirato de sódio (3 e 4). ......................................................... 105 Figura 49: Teste de viabilidade celular da linhagem At-05 com os moduladores 5- azacitidina (1 e 2) e butirato de sódio (3 e 4). ......................................................... 105 Figura 50: Rede molecular construída a partir das análises de CLAE-EM de baixa resolução dos extratos obtido pelos testes de viabilidade celular para cada modulador epigenético pré-selecionado.................................................................................... 107 Figura 51: Rede molecular construída a partir das análises de CLUAE-EM em modo positivo dos extratos obtido pelo crescimento do endófito At-02 com moduladores epigenéticos. ........................................................................................................... 109 Figura 52: Rede molecular construída a partir das análises de CLUAE-EM em modo negativo dos extratos obtido pelo crescimento do endófito At-02 com moduladores epigenéticos. ........................................................................................................... 109 Figura 53: Rede molecular construída a partir das análises de CLUAE-EM em modo positivo dos extratos do crescimento em escala ampliada do endófito At-02 com os moduladores epigenéticos cloridrato de procaína e butirato de sódio. .................... 114 17 Figura 54: Rede molecular construída a partir das análises de CLUAE-EM em modo negativo dos extratos do crescimento em escala ampliada do endófito At-02 com os moduladores epigenéticos cloridrato de procaína e butirato de sódio. .................... 114 Figura 55: Comparação do extrato At-02PB, linha azul, com o extrato controle At-02, linha preta (coluna Phenomenex Luna C-18; fase móvel com 5 a 100% ACN:H2O a 1 mL.min-1, 45 min.; 254 nm)..................................................................................... 117 Figura 56: Comparação do cromatograma da fração Fr06 (linha azul), com o extrato bruto At-02PB (linha rosa), e com o extrato controle At-02 (linha preta) (coluna Phenomenex Luna C-18; fase móvel com 5 a 100% ACN:H2O a 1 mL.min-1, 45 min.; 254 nm). .................................................................................................................. 118 Figura 57: Estrutura proposta para a substância P05. ........................................... 121 Figura 58: Espectro de RMN de 1H da substância P05 (MeOH-d4, 600 MHz). ...... 122 Figura 59: Mapa de contorno de COSY da substância P05 (MeOH-d4, 600 MHz). 123 Figura 60: Mapa de contorno de HSQC da substância P05 (MeOH-d4, 600 MHz).124 Figura 61: Mapa de contorno de HMBC da substância P05 (MeOH-d4, 600 MHz). ................................................................................................................................ 125 Figura 62: Proposta do primeiro fragmento da estrutura da substância P06.......... 127 Figura 63: Proposta do segundo fragmento da estrutura da substância P06. ........ 127 Figura 64: Estrutura proposta para a substância P06. ........................................... 128 Figura 65: Espectro de RMN de 1H da substância P06 (MeOH-d4, 600 MHz). ...... 129 Figura 66: Mapa de contorno de COSY da substância P06 (MeOH-d4, 600 MHz). 130 Figura 67: Mapa de contorno de HSQC da substância P06 (MeOH-d4, 600 MHz).131 Figura 68: Mapa de contorno de HMBC da substância P06 (MeOH-d4, 600 MHz). ................................................................................................................................ 132 Figura 69: Espectro de DOSY da substância P06 (MeOH-d4, 600 MHz). .............. 133 18 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Linhagens fúngicas isoladas da alga vermelha A. taxiformis. ................... 44 Tabela 2: Concentração dos moduladores epigenéticos em cada poço da placa utilizada para o teste de viabilidade celular das linhagens At-02 e At-05. ................. 46 Tabela 3: Substâncias anotadas a partir da análise das redes moleculares provenientes dos extratos da linhagem At-04 em diferentes tempos de crescimento. .................................................................................................................................. 55 Tabela 4: Substâncias anotadas a partir da análise das redes moleculares provenientes dos extratos da linhagem At-05 em diferentes tempos de crescimento. .................................................................................................................................. 58 Tabela 5: Substâncias anotadas a partir da análise das redes moleculares provenientes dos extratos da linhagem At-07 em diferentes tempos de crescimento. .................................................................................................................................. 63 Tabela 6: Substâncias anotadas a partir da análise da rede molecular proveniente dos extratos das linhagens At-02, At-05 e do extrato de Co-cultivo. ................................ 70 Tabela 7: Tempos de retenção e massas das substâncias obtidas na purificação da fração 40% ACN/H2O do extrato CAt-02/05 por CLAE-DAD semi-preparativo. ........ 74 Tabela 8: Deslocamentos químicos de RMN de hidrogênio (δH) e carbono (δC) e correlações do mapa de contorno HMBC observados para a substância P1 (MeOH- d4, 600 MHz; 150 MHz). ............................................................................................ 76 Tabela 9: Deslocamentos químicos de hidrogênio (δH) e carbono (δC) e correlações do mapa de contorno HMBC observados para a substância P02 (MeOH-d4, 600 MHz; 150 MHz). .................................................................................................................. 86 Tabela 10: Deslocamentos químicos de hidrogênio (δH) e carbono (δC) e correlações do mapa de contorno HMBC observados para a substância P03 (MeOH-d4, 600 MHz; 150 MHz). .................................................................................................................. 93 Tabela 11: Deslocamentos químicos de RMN de hidrogênio (δH) e carbono (δC) observados para a substância P04 (MeOH-d4, 600 MHz; 150 MHz). ....................... 99 Tabela 12: Massa dos extratos obtidos para cada poço do teste de viabilidade celular das linhagens At-02 e At-05. ................................................................................... 106 Tabela 13: Massas dos extratos obtidos com o crescimento da linhagem At-02 utilizando os moduladores epigenéticos butirato de sódio (At-02B) e cloridrato de procaina (At-02P) separadamente e juntos (At-02PB). ........................................... 108 19 Tabela 14: Substâncias anotadas a partir da análise das redes moleculares construídas com os dados de CLUAE-EM dos extratos obtidos pelo crescimento da linhagem At-02 com moduladores epigenéticos. ..................................................... 110 Tabela 15: Substâncias anotadas a partir da análise das redes moleculares construídas com os dados de CLUAE-EM do extrato obtido pelo crescimento em escala ampliada da linhagem At-02 na presença dos moduladores Cloridrato de procaína e Butirato de sódio (At-02PB) ................................................................... 115 Tabela 16: Massas das frações obtidas pela purificação do extrato At-02PB por MPLC-DAD. ............................................................................................................. 118 Tabela 17: Massas das subfrações obtidas pela separação da fração Fr06 em coluna aberta com fase estacionária Sephadex LH20. ....................................................... 119 Tabela 18: Massas das subfrações obtidas pela separação da fração Fr05 em coluna de bancada com Sephadex LH20. .......................................................................... 119 Tabela 19: Deslocamentos químicos de RMN de hidrogênio (δH) e carbono (δC) observados para a substância P05 (MeOH-d4, 600 MHz; 150 MHz). ..................... 121 Tabela 20: Deslocamentos químicos de RMN de 1H(δH) e de 13C(δc) observados para a substância P06 (MeOH-d4, 600 MHz; 150 MHz). ......................................... 128 Tabela 21: Redução de biofilme de S. epidermidis ATCC 35984 pelos extratos fúngicos resultantes do co-cultivo e obtidos com moduladores epigenéticos, a 512 mg/L. ....................................................................................................................... 134 Tabela 22: Atividades citotóxicas dos extratos fúngicos do co-cultivo e obtidos com moduladores epigenéticos para HCT-116. .............................................................. 135 20 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS H Deslocamento químico de 1H (em ppm) C Deslocamento químico de 13C (em ppm) 𝝺 Comprimento de onda BDA Batata Dextrose Ágar BHIB Caldo de infusão cérebro coração C-18 Sílica gel de fase reversa tipo octadecil silano CC Cromatografia em Coluna CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLMP Cromatografia Líquida de média pressão CLUAE Cromatografia Líquida de Ultra-alta Eficiência d Dubleto DAD Detector Arranjo de Diodos dd Duplo Dubleto ddd Duplo Duplo Dubleto dquart Duplo quarteto dquint Duplo quinteto DNA Ácido Desoxirribonucleico DNMT DNA metiltransferase ELSD Detector Evaporativo com Espalhamento de Luz ESI Ionização por Eletrospray FDA Food and Drug Administration GNPS Global Natural Products Social Molecular Networking HAT Histona acetiltransferase HCT-116 Linhagem de células de adenocarcinoma de cólon humano HDAC Histona desacetilase HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation - Correlação heteronuclear a múltiplas ligações (1H x 13C) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation - Correlação heteronuclear a uma ligação (1H x 13C) IC50 Concentração Inibitória J Constante de acoplamento m Multipleto 21 MeOH Metanol MeCN Acetonitrila min. Minutos m/z Relação massa/carga ODS Objetivos de desenvolvimento sustentável ppm Partes por milhão quart. Quarteto quart.d Quarteto de dubletos quint. Quinteto Q-TOF Analisador quadrupolo tempo de voo RMN Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear UV Espectroscopia Ultravioleta s Singleto sl Singleto largo SAHA Ácido hidroxâmico suberoilanilida t Tripleto T Tesla TMS Tetrametilsilano TSA Tricostatina A 22 Sumário 1 INTRODUÇÃO: ....................................................................................... 24 1.1 PRODUTOS NATURAIS .................................................................. 24 1.2 ORGANISMOS MARINHOS ............................................................ 26 1.2.1 Algas vermelhas ......................................................................... 27 1.2.2 Microrganismos marinhos ........................................................ 28 1.3 FUNGOS .......................................................................................... 31 1.3.1 Fungos associados .................................................................... 32 1.3.2 Co-cultivo.................................................................................... 35 1.3.3 Epigenética no cultivo de microrganismos ............................. 36 1.4 GLOBAL NATURAL PRODUCTS SOCIAL MOLECULAR NETWORKING (GNPS)......................................................................................... 39 2 OBJETIVOS ............................................................................................ 42 2.1 GERAL ................................................................................................. 42 2.2 ESPECÍFICOS ..................................................................................... 42 3 METODOLOGIA ..................................................................................... 43 3.1 COLETA DO MATERIAL .................................................................. 43 3.2 OBTENÇÃO E CULTIVO DO ENDÓFITO........................................ 43 3.3 CURVA DE CRESCIMENTO FÚNGICO .......................................... 45 3.4 TESTE DE VIABILIDADE CELULAR ............................................... 45 3.5 PREPARAÇÃO E PARTIÇÃO DO EXTRATO BRUTO .................... 46 3.6 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO E POSTERIOR ISOLAMENTO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS .............................................. 47 3.6.1 Cromatografia em coluna (CC) ................................................. 47 3.6.2 Cromatografia Líquida de média pressão (CLMP) .................. 47 3.6.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diodos (CLAE-DAD) ...................................................................... 47 23 3.6.4 Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência com detector de espectrômetro de massas de alta resolução (CLUAE-EM) ........................... 48 3.7 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE HIDROGÊNIO E DE CARBONO (RMN DE 1H E RMN DE 13C).............................................................. 48 3.8 ORGANIZAÇÃO DOS DADOS DE CLUAE-EM E ANOTAÇÃO DE COMPOSTOS ATRAVÉS DA CONSTRUÇÃO DE REDES MOLECULARES. ..... 49 3.9 PERFIL BIOLÓGICO ........................................................................ 50 3.9.1 Ensaio antibiofilme .................................................................... 50 3.9.2 Ensaio Citotóxico ....................................................................... 51 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 52 4.1 CURVA DE CRESCIMENTO DAS LINHAGENS AT-04, AT-05 E AT- 07 52 4.1.1 Análise dos dados de CLUAE-EM dos extratos da linhagem At- 04 pela construção de redes moleculares utilizando a plataforma GNPS. . 54 4.1.2 Análise dos dados de CLUAE-EM dos extratos da linhagem At- 05 pela construção de redes moleculares utilizando a plataforma GNPS. . 57 4.1.3 Análise dos dados de CLUAE-EM dos extratos da linhagem At- 07 pela construção de redes moleculares utilizando a plataforma GNPS. . 62 4.2 CO-CULTIVO DAS LINHAGENS AT-02 E AT-05 ............................ 68 4.2.2 Elucidação estrutural da substância P01................................. 75 4.2.3 Elucidação estrutural da substância P02................................. 81 4.2.4 Elucidação estrutural da substância P03................................. 92 4.2.5 Elucidação estrutural da substância P04................................. 98 4.3 MODULADORES EPIGENÉTICOS ............................................... 104 4.3.1 Teste de viabilidade celular com os moduladores epigenéticos 104 4.3.2 Crescimento do endófito At-02 utilizando os moduladores epigenéticos em escala reduzida ................................................................. 108 24 4.3.3 Crescimento do endófito At-02 utilizando os moduladores epigenéticos em escala ampliada ................................................................. 113 4.3.4 Isolamento das substâncias do extrato At-02PB obtido em escala ampliada. ............................................................................................. 117 4.3.5 Elucidação estrutural da substância P05............................... 120 4.3.6 Elucidação estrutural da substância P06............................... 126 4.4 TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA ........................................... 134 5 CONCLUSÃO ....................................................................................... 136 REFERÊNCIAS ............................................................................................ 139 24 1 INTRODUÇÃO: 1.1 PRODUTOS NATURAIS A humanidade vem recorrendo aos produtos de origem natural para fins medicinais desde os seus primórdios. Diversos registros do uso de plantas já foram encontrados: o mais antigo, uma placa de argila suméria, com aproximadamente 5 mil anos, descreve 12 preparos compostos por uma grande variedade de plantas. Outro registro notável é o livro chines “Pen T’Sao”, datando de 2500 a.C., que apresenta cerca de 365 preparos de plantas medicinais, sendo muitos utilizados até os dias atuais. (PETROVSKA, 2012; SÜNTAR, 2020) Sendo a natureza uma fonte renovável de compostos variados, o estudo da biodiversidade de um país pode levar a avanços em diversos setores, como alimentício, farmacêutico e cosmético, contribuindo para o desenvolvimento científico e tecnológico do país. (BOLZANI, 2016). No desenvolvimento de novos fármacos, por exemplo, os produtos naturais estão associados a cerca de 65% dos medicamentos constituídos de moléculas com estruturas químicas pequenas aprovados pelo FDA nos últimos 39 anos, incluindo aqueles de origem natural ou compostos sintéticos com estruturas baseadas em produtos naturais (Figura 1) (NEWMAN; CRAGG, 2020). 25 Figura 1: Novos fármacos aprovados de 1981 a 2019 categorizados por suas fontes de origem (“B”: Macromoléculas biológicas; “N”: Produtos naturais “NB”: Formulações botânicas; “ND”: Derivados de produtos naturais; “S”: Fármacos sintéticos; “S*”: Fármacos sintéticos com grupo farmacofórico baseado em produtos naturais). Fonte: NEWMAN; CRAGG, 2020. Vale ressaltar que, com a evolução e adaptação das espécies, as estruturas das moléculas orgânicas de origem natural também se modificaram, por meio da seleção para desempenhar funções biológicas específicas, sendo possível destacar a regulação de funções endógenas e as interações com outros organismos, como defesa, comunicação ou predação, resultando em produtos naturais que apresentam grande impacto no desenvolvimento, principalmente, de fármacos para tratar doenças infecciosas e cânceres. (ATANASOV et al., 2021) 26 1.2 ORGANISMOS MARINHOS As plantas têm grande destaque como fonte de produtos naturais, porém outros organismos como fungos, insetos, organismos marinhos e bactérias são também fontes importantes de substâncias biologicamente ativas, e sendo a Terra coberta por grandes extensões de águas, doces ou salgadas, estes ecossistemas merecem destaque por apresentar enorme diversidade de organismos (BARREIRO; BOLZANI, 2009; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). A biodiversidade de ecossistemas marinhos é comparável à observada nas florestas tropicais, sendo esta riqueza de espécies capaz de produzir substâncias com enorme variedade de estruturas químicas com potencial elevado para descoberta de novos fármacos. Porém, as pesquisas envolvendo organismos de origem marinha só ganharam força com o desenvolvimento de tecnologias de mergulho para coleta dos organismos, sendo, em geral, mais recentes que as pesquisas envolvendo produtos naturais terrestres. No início dos anos 50 foram isolados dois nucleosídeos com atividade citotóxica de uma esponja marinha (Tectitethya crypta), a espongotimidina (1) e a espongouridina (2), que posteriormente, nos anos 70, deram origem aos medicamentos adenina-arabinosídeo (ara-A) e a citosina-arabinosídeo (ara-C). Estas descobertas são relativamente recentes se compararmos com a morfina por exemplo, um analgésico que foi isolada pela primeira vez cerca de 150 anos antes, em 1804, da planta terrestre Papaver somniferum (HAQUE et al., 2022; MOLINSKI et al., 2009). Dentre os fármacos de origem marinha já aprovados pelo FDA, pode-se destacar também o analgésico ziconotídeo (PRIALT®) (3), aprovado em 2004, sendo um peptídeo isolado do caracol marinho Conus magus, e a trabectedina (YONDELIS®) (4), um alcaloide isolado da ascídia Ecteinascidia turbinata com atividade anticâncer, utilizado no tratamento de sarcomas de tecido mole e câncer de ovário em combinação com outros medicamentos (HAQUE et al., 2022). 27 1.2.1 Algas vermelhas Dentre os organismos marinhos pode-se destacar as algas do tipo bento (macroalgas) como fonte de produtos naturais devido a sua grande variedade de espécies, podendo ser divididas em três grupos, as algas verdes (Chlorophyta), apresentando cerca de 4500 espécies, as pardas (Phaeophyta), compostas por aproximadamente 2000 espécies e as vermelhas (Rhodophyta), sendo o grupo mais representativo, com cerca de 7000 espécies. Além disso as Rhodophytas são reconhecidas também como as maiores produtoras de substâncias bioativas dentre as algas, se destacando pela produção de substâncias halogenadas, além de diversas atividades biológicas já relatadas e aplicações biotecnológicas. (AZIZ et al., 2021; GUIRY, 2012) A alga vermelha Asparagopsis taxiformis (Família Bonnemaisoniaceae), por exemplo, da qual os endófitos estudados neste trabalho foram isolados, apresenta diversas atividades biológicas já relatadas para seu extrato, como antifúngica (GENOVESE et al., 2013), antibacteriana (GENOVESE et al., 2012; JHA et al., 2013), antileishmania (GENOVESE et al., 2009), anti-incrustante e anticianobactéria (MANILAL et al., 2010), se mostrando também tóxica para peixes e crustáceos. Além disso, produzem metabólitos secundários bioativos, principalmente halogenados, como as ciclopentenonas mahorone (5) e 5-bromomahorone (6), que apresentaram atividade citotóxica em um ensaio ecotoxicológico e atividade moderada frente a uma linhagem de bactéria patógena humana (Acinetobacter baumannii). (GREFF et al., 2014). 28 Devido à frequente competição entre organismos marinhos e a necessidade de sobrevivência em um ambiente inóspito e com limitações de nutrientes, estes seres desenvolveram sistemas de defesa buscando a preservação da própria espécie. Dentre estes pode-se citar a uma grande diversidade de metabólitos secundários. Também é comum o compartilhamento destes mecanismos entre os seres que habitam o mesmo ecossistema, como ocorre em recifes de corais, ou pela simbiose entre macro e micro- organismos (FELÍCIO; OLIVEIRA; DEBONSI, 2012). 1.2.2 Microrganismos marinhos Os microrganismos vêm ganhando cada vez mais destaque como fonte de produtos de origem natural. Um exemplo são as pesquisas envolvendo fungos marinhos, que apresentaram cerca de duas vezes mais novas substâncias reportadas que os demais filos nos últimos anos (Figura 2) (CARROLL et al., 2023). 29 Figura 2: Número de novas substâncias relatadas por filo de organismo marinho de 2017 a 2021. Fonte: CARROLL et al., 2023. Das substâncias isoladas recentemente de microrganismos marinhos pode-se destacar o meroterpenoide acremoclorina A (7), isolado, juntamente a outros 12 meroterpenoides inéditos, do fungo Acremonium sclerotiaenum, endófito de um coral, que foi capaz de inibir o crescimento de células de câncer de mama triplo negativo (CMTN) apresentando baixa toxicidade (LUO et al., 2021). Destacam-se ainda o macrolídeo poliênico actinospeno (8), isolado da bactéria Actinokineospora spheciospongiae, com alta atividade antifúngica frente a diversas linhagens de patógenos vegetais (TANG et al., 2021), e o lipopeptídeo hoshinoamida C (9), isolado da cianobactéria Caldora penicillata, que apresentou capacidade de inibição do crescimento dos parasitas responsáveis pela doença do sono e pela malária (IWASAKI et al., 2021), entre outros. 30 31 1.3 FUNGOS Os fungos são seres eucariontes, podendo se apresentar nas formas unicelular (leveduriformes) ou multicelular (filamentosos). São encontrados em praticamente todo o ambiente que nos cerca, sendo responsáveis, principalmente, por decompor resíduos orgânicos, transformando em substâncias assimiláveis pelas plantas. Estes microrganismos apresentam grande interesse econômico, sendo estudados e utilizados por diversas áreas, como medicina, farmácia, nutrição, agricultura, biotecnologia, entre outras (MARIA; MORAES; PAES, 1995). Diversas substâncias naturais de uso terapêutico já foram identificadas e isoladas de espécies de fungos, como penicilinas (10) e cefalosporinas, utilizadas como antibióticos, a mevinolina (11) e outras estatinas, utilizadas como agentes redutores de colesterol, e ainda, bleomicinas, daunorrubicinas (12) e análogos, utilizados como agentes antitumorais, dentre outras. Assim, os fungos filamentosos, grupo no qual estão incluídos os fungos endofíticos, têm como característica a capacidade de biossintetizar uma vasta quantidade de metabólitos secundários (CAFÊU et al., 2005). 32 1.3.1 Fungos associados Os fungos endofíticos representam um grupo de microrganismos ainda pouco estudados, se comparados as plantas por exemplo, sendo uma importante fonte de metabólitos secundários que costumam apresentar as mais variadas classes estruturais, como esteroides, xantonas, fenóis, isocumarinas, quinonas, peptídeos, terpenoides, policetídeos, alcaloides, dentre outras classes de produtos naturais (RAJAMANIKYAM et al., 2017). Fungos endofíticos são encontrados em simbiose com outros organismos, onde, em alguma fase de seu ciclo de vida, estes microrganismos habitam o interior dos tecidos do hospedeiro, sem lhe causar nenhum dano aparente e podendo desempenhar funções importantes, como por exemplo, a produção de substâncias que protegem o hospedeiro contra patógenos ou auxiliando no desenvolvimento do mesmo. Para o microrganismo, a simbiose também é vantajosa, pois estes encontram no hospedeiro um habitat rico em nutrientes e com menor competição por parte de outros microrganismos (NETO; AZEVEDO; CAETANO, 2004). Apesar dos mecanismos envolvidos na relação endófito-hospedeiro ainda não serem bem elucidados, sabe-se que alguns destes micro-organismos são capazes de produzir metabólitos característicos de seus hospedeiros, sendo uma propriedade importante para agregar valor aos produtos naturais, já que pode levar a redução da coleta de plantas ou algas que apresentam crescimento lento ou ameaça de extinção. Além disso, a fermentação microbiana como meio de produção de substâncias bioativas, apresenta muitas vantagens sobre a utilização de hospedeiros, em vista da possibilidade de variações nas condições de cultivo, buscando otimizar vias biossintéticas desejadas visando metabólitos específicos, maior facilidade em aumentar a produção e melhor resposta a técnicas rotineiras de cultura (SPECIAN et al., 2014). Neste trabalho foram utilizadas linhagens de fungos endofíticos isolados da alga vermelha Asparagopsis taxiformis, dentre as quais pode-se destacar uma linhagem de Humicola fuscoatra, pertencente ao gênero Humicola (Família Chaetomiaceae), que engloba microrganismos conhecidos por produzirem diversas enzimas extracelulares, como amilases (BARNETT; FERGUS, 1971), celulases (YOSHIOKA; ANRAKU; HAYASHIDA, 1982), xilanases (MONTI; TERENZI; JORGE, 1991), entre outras, apresentando grande interesse biotecnológico e industrial. Neste contexto, os fungos do gênero Humicola vêm se mostrando fontes muito interessantes de metabólitos 33 secundários também, devido à grande variedade de estruturas dos compostos já isolados e às diversas atividades biológicas já reportadas (ANDRIOLI, 2008; IBRAHIM et al., 2021) Dentre os estudos dos metabólitos produzidos pela espécie H. fuscoatra pode-se citar o artigo publicado por SMETANINA e colaboradores (2004), que apresenta três metabólitos secundários do fungo endofítico isolado de uma colônia de ascídias. Os compostos isolados incluíram um sesquiterpeno conhecido como fuscoatrol A (13), um sesterpeno denominado 11-epi-terpestacina (14) e o ácido β-nitro propiônico (15). O trabalho realizado por WICKLOW e colaboradores (1998), que isolaram, do fungo H. fuscoatra, cinco compostos com atividade antifúngica, sendo eles o monordeno (16) e um análogo (17), a monocillina IV (18), o cerebrosídeo C (19) e o cerebrosídeo D (20). 34 E a dissertação de mestrado realizada pelo próprio autor que possibilitou o isolamento e identificação de 7 substâncias, sendo uma dicetopiperazina, duas isocumarinas três valerolactamas inéditas uma cicloexadienona inédita (Mendonça, I. C., 2018). Apesar da capacidade dos fungos de sintetizar compostos com grande diversidade estrutural, as metodologias comuns de fermentação utilizadas em laboratório não são favoráveis para reproduzir seu comportamento em condições naturais de crescimento. Isso ocorre pois na natureza os microrganismos estão expostos a diversos fatores de estresse biótico e abiótico, como outros organismos predadores ou competitivos, luz solar e agentes oxidativos, sendo necessária a produção de substâncias que auxiliem na manutenção do bem-estar do fungo combatendo esses fatores. Dessa forma, os clusters de genes responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, denominados clusters de genes biossintéticos (biosynthetic gene clusters - BGCs), permanecem silenciados quando não estimulados, dificultando uma análise completa do potencial de produção de compostos bioativos destes microrganismos (PFANNENSTIEL; KELLER, 2019; PILLAY et al., 2022). 35 1.3.2 Co-cultivo Para superar esta limitação algumas abordagens foram desenvolvidas, dentre elas o co-cultivo, que consiste em cultivar dois ou mais microrganismos visando provocar as sinalizações e interações semelhantes às que ocorrem no habitat natural dos mesmos, e assim estimular a ativação de vias metabólicas silenciadas e a produção de novos compostos (BERTRAND et al., 2014). Em um estudo publicado por COSTA e colaboradores (2023), foi explorada a produção metabólica de dois fungos endofíticos associados à planta Eugenia jambolana Lam. (Myrtaceae) em co-cultivo, que possibilitou o isolamento e identificação de 8 compostos, incluindo ácidos carboxílicos, terpenos e isocumarinas, além de um composto inédito na literatura, o ácido (6R,7S,2E,4E)-6,7-di hidroxi-4,6-dimetilocta-2,4- dienoico (21). Outro estudo explorou o co-cultivo de endófitos isolados das folhas do ipê-roxo (Handroanthus impetiginosus), sendo possível, a partir da co-cultura dos fungos Talaromyces purpurogenus e Phanerochaete sp., isolar o meroterpenoide austina (22), que apresentou atividade tripanocida (IC50 36.6 ± 1.2 μg/mL) frente ao parasita Trypanosoma cruzi (DO NASCIMENTO et al., 2020). 36 1.3.3 Epigenética no cultivo de microrganismos Outra abordagem utilizada para estimular a produção de metabólitos secundários é a epigenética, que consiste em mudanças hereditárias na expressão gênica, sem alteração na sequência do DNA. Essas modificações ocorrem pela variação da compactação do mesmo dentro do núcleo celular, regida por proteínas denominadas histonas, e demais proteínas acessórias, em um conjunto chamado cromatina. Essas estruturas podem apresentar duas formas de compactação, uma “aberta”, na qual a interação entre o DNA e histonas é mais fraca, denominada eucromatina e uma “fechada”, na qual a interação entre DNA e histonas é mais forte, denominada heterocromatina. Estas diferenças de conformação afetam a capacidade de transcrição do DNA visto que, para a eucromatina, o mesmo não pode ser acessado pela maquinaria de transcrição: RNA polimerase II e fatores de transcrição. O grau de compactação da cromatina pode ser alterado a partir de modificações químicas nas estruturas do DNA e das histonas (Figura 3) (CICHEWICZ, 2010; PONS et al., 2009). Figura 3: Representação do grau de compactação das histonas (Heterocromatina e Eucromatina). Fonte: Adaptado de PONS et al. (2009). Os mecanismos de modificação epigenética mais estudados são a metilação do DNA, que ocorre pela atuação das enzimas DNA metiltransferases (DNMTs), e modificações nas histonas. Dentre estas, as mais estudadas são a acetilação e desacetilação do grupo 3-amino da lisina, catalisadas pelas enzimas histona 37 acetiltransferase (HAT) e histona desacetilase (HDAC), respectivamente (CICHEWICZ, 2010; PONS et al., 2009). Buscando modificar o grau de compactação das cromatinas, foram desenvolvidas moléculas conhecidas como moduladores epigenéticos. Estas substâncias podem inibir semi-seletivamente ou seletivamente as enzimas DNA metiltransferases (DNMTs) ou a histona desacetilase (HDAC), permitindo a expressão de genes anteriormente silenciados, e modificando a produção de metabólitos secundários (CHERBLANC et al., 2013). Alguns exemplos de moléculas utilizadas para este fim são a 5-azacitidina, um inibidor das enzimas DMNTs (WILLIAMS et al., 2008), o ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), o butirato de sódio e a Tricostatina A (TSA), inibidores de HDACs (ABRAHAM et al., 2012; BEAU et al., 2012; CHUNG et al., 2013). Estudos empregando modificadores epigenéticos para estimular a expressão gênica em fungos filamentosos têm mostrado ótimos resultados, como por exemplo o trabalho desenvolvido por WANG e colaboradores (2010), no qual o tratamento de culturas de Penicillium citreonigrum com o modulador 5-azacitidina levou a um grande enriquecimento de sua produção metabólica, possibilitando a identificação de seis azafilonas: esclerotiorina (23), ocrefilona (24), decloroisocromofilona III (25), decloroisocromofilona IV (26), e6-((3E,5E)-5,7-dimetil-2-metilenenona-3,5-dienil)-2,4- diidroxi-3-metilbenzaldeído (27), esclerotioramina (28), a maleimida denominada pencolídeo e um derivado metilado (29 e 30, respectivamente), e dois meroterpenos: atlantinonas A e B (31 e 32, respectivamente). 38 Outro estudo que alcançou ótimos resultados com a utilização de modificadores epigenéticos para alteração da produção metabólica de fungos filamentosos foi o apresentado por BEAU e colaboradores (2012), que, ao tratar o fungo marinho Leucostoma persoonii com butirato de sódio, um inibidor de HDAC, observou um aumento na produção das citosporonas B (33), C (34) e E (35) em 360%, 580% e 890% respectivamente, além do isolamento da citosporona R (36) que ainda não havia sido descrita para a espécie. 39 1.4 GLOBAL NATURAL PRODUCTS SOCIAL MOLECULAR NETWORKING (GNPS) Com o desenvolvimento de novas técnicas de análise e acessibilidade a equipamentos, a geração de dados em pesquisas envolvendo produtos naturais tem aumentado significativamente. Observando, por exemplo, experimentos de espectrometria de massas em tandem (MS/MS), a análise de uma única amostra pode gerar algumas centenas de espectros, e ao longo de um projeto milhares destes dados são adquiridos. Assim, o volume final de informações acaba sendo extenso demais para uma análise manual e grande parte delas acabam inutilizadas. Visando a necessidade de um mecanismo eficaz de análise destes dados foi desenvolvido o Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS; http://gnps.ucsd.edu), uma plataforma online para armazenamento, análise e compartilhamento de conhecimentos de espectros de MS/MS, de alta relevância para a identificação de constituintes químicos em mistura. A plataforma permite a análise automatizada, compartilhamento de espectros, comparação com as bases de dados espectrais disponíveis, organização e visualização dos dados por similaridade espectral (Figura 4) (OLIVON et al., 2017; WANG et al., 2016). Figura 4: Representação das interações entre a comunidade científica de produtos naturais, as bibliotecas espectrais e os conjuntos de dados do GNPS. Fonte: Adaptado de Wang et al. (2016). 40 A comparação dos espectros obtidos por MS/MS ocorre por um processo denominado alinhamento espectral, no qual para cada espectro de fragmentação são gerados vetores baseados nos valores de massa dos íons fragmentos e suas intensidades. Em seguida estes são comparados e o cosseno do ângulo formado entre os vetores resultantes é calculado para definir sua similaridade (Figura 5), sendo utilizado normalmente o valor de cosseno de 0,7 para limitar o pareamento das substâncias em um determinado grupo (WATROUS et al., 2012). O cálculo do valor de cosseno também é utilizado para comparação dos espectros da amostra com os bancos de dados da plataforma, sendo utilizado valor de cosseno maior ou igual a 0,7 para indicar a anotação da substância analisada. Além disso, outras informações são utilizadas para tornar a comparação mais robusta, como possíveis variações de massa do pico do íon molecular e a classificação dos espectros das bases de dados de acordo com a qualidade e confiabilidade das anotações, sendo divididos em três categorias: ouro, prata e bronze. A categoria ouro indica que os espectros foram obtidos de estruturas sintetizadas com caracterização estrutural completa por RMN e outros métodos, apresentando alta confiabilidade. A categoria prata é composta por dados de moléculas isoladas ou anotadas a partir de extratos brutos apresentados em publicações científicas. E a categoria bronze consiste em espectros com caracterização incompleta ou não publicados em revistas científicas. Figura 5: Comparação de espectros de quatro substâncias agrupadas em uma análise utilizando a plataforma GNPS. Fonte: Adaptado de Watrous et al. (2012). 41 Neste contexto, foram realizados estudos químicos com extratos da espécie Humicola fuscoatra, uma linhagem de fungo endofítico isolada da alga marinha Asparagopsis taxiformis, visando aprofundar o conhecimento sobre a quimiodiversidade e potencial biológico antibacteriano e citotóxico. Para tanto, foram realizados cultivos do fungo H. fuscoatra juntamente à outra linhagem de endófito, pertencente a espécie Nemania bipapillata, isolado do mesmo hospedeiro, além do emprego de modificadores epigenéticos visando alterar a produção metabólica para eventual obtenção de novas substâncias. A análise dos extratos obtidos foi realizada por cromatografia, incluindo CLAE acoplada a diferentes detectores, além de espectroscopia de RMN e espectrometria de massas. Empregou-se também a plataforma GNPS para acelerar a anotação de constituintes químicos dos extratos analisados e otimizar a análise comparativa e de diferenças de perfil químico decorrentes do uso de modificadores epigenéticos para a obtenção dos extratos do fungo Humicola fuscoatra. 136 5 CONCLUSÃO O estudo da curva de crescimento das linhagens At-04 (Microascus sp.), At-05 (Nemania bipapillata) e At-07 (Microascus sp.), mostrou-se uma abordagem muito importante para entender o comportamento dos fungos ao longo de seu desenvolvimento, visto que diferentes linhagens podem apresentar comportamentos distintos quanto ao tempo de crescimento, além de diferenças na produção de metabólitos secundários, que, quando bem conhecidas, permitem um melhor planejamento dos ensaios que se deseja realizar. Além disso, a obtenção de extratos dos endófitos ao longo do crescimento aliada a técnicas de análise, como o CLUAE-EM, e ferramentas de organização e análise dos dados, como as redes moleculares por meio da plataforma GNPS, permitiram explorar de forma mais aprofundada as diferenças na produção de metabólitos secundários durante o crescimento das linhagens fúngicas, levando a anotação de 17 substâncias de diferentes classes, como alcaloides, dipeptídeos e terpenoides, demonstrando a variedade e o potencial da produção de metabólitos secundários dos endófitos estudados, o que possibilitou escolher de forma embasada a linhagem At-05 para a realização das etapas subsequentes do trabalho, que incluíram experimentos de co-cultivo e de uso de modificadores epigenéticos para a obtencao de extratos fúngicos. No experimento de co-cultivo em meio sólido foi possível observar interação dos endófitos At-02 (Humicola fuscoatra) e At-05 (Nemania bipapillata), sendo esta do tipo “zone-line”, na qual ocorre a produção de um precipitado escuro na região de contato das zonas de crescimento dos microrganismos. Então, com a realização do experimento de co-cultivo em meio líquido, pode-se comparar o extrato obtido com os extratos do crescimento dos endófitos em monocultivo, utilizando análises de CLUAE- EM e a plataforma GNPS, o que permitiu concluir que a interação entre os dois endófitos induziu a produção de diversas substâncias cujas rotas biossintéticas possivelmente se encontravam silenciadas nas condições padrão de crescimento em laboratório. Dentre os compostos produzidos apenas no co-cultivo pode-se anotar um deles, sendo possivelmente o sesquiterpenoide, 5,8-diidroxi-1,5,8-trimetil- 4,5a,6,7,8a,9-hexahidro-3aH-azuleno[6,5-b]furan-2-ona Pode-se também anotar outras 7 substâncias, sendo dois dipeptídeos, um monoterpeno, dois sesquiterpenos, um diterpeno e uma isocumarina. Além disso, a 137 partir do extrato obtido por meio do co-cultivo dos endófitos em escala ampliada foi possível isolar quatro substâncias, sendo três isocumarinas (P01, P03 e P04) e um policetídeo inédito (P02). Com a realização do experimento de crescimento da linhagem At-02 juntamente aos moduladores epigenéticos cloridrato de procaína e butirato de sódio, pode-se observar um aumento significativo na massa de extrato obtida, principalmente no cultivo com os dois moduladores em conjunto. Então, após a análise dos extratos por CLUAE-EM e construção de redes moleculares, observou-se a indução da produção de substâncias, confirmando novamente a existência de vias biossintéticas pouco ou não expressas nas condições padrão de cultivo para a linhagem de Humicola fuscoatra. Além disso, indicou que a utilização de moduladores epigenéticos que apresentam diferentes mecanismos de ação é possivelmente uma abordagem benéfica para a ativação destas vias, e relevante para a pesquisa de bioprospecção, já que contribui para a ativação de vias biossintéticas e a decorrente produção de novos metabólitos especializados. A utilização da plataforma GNPS permitiu também, pela comparação dos espectros de massas obtidos com as bases de dados, a anotação de 15 substâncias de diferentes classes, sendo duas antraquinonas, uma xantona, três dipeptídeos, dois derivados de meleína, uma azafilona e um sesquiterpenoide. Além disso, a partir do fracionamento e purificação de substâncias do extrato da linhagem At-02 com os moduladores epigenéticos em escala ampliada, pode-se isolar e identificar duas substâncias, uma dicetopiperazina (P05) e um policetídeo inédito (P06). Por fim foram realizados os ensaios de atividade antibiofilme e citotóxica com os extratos oriundos do co-cultivo e do cultivo com os moduladores, sendo possível observar, para o extrato com ambos os moduladores, uma atividade citotóxica moderada, frente a células de câncer colorretal, sendo maior que a atividade do extrato obtido nas condições padrão de crescimento. Esses resultados indicaram que, pela ativação de vias metabólicas anteriormente silenciadas, ocorreu a produção de novas substâncias ou de uma maior quantidade de substâncias potencialmente ativas. Dessa forma, tanto o co-cultivo quanto a utilização de moduladores epigenéticos apresentaram grande potencial como metodologias de cultivo para o aumento da quimiodiversidade na produção de metabólitos secundários, possibilitando também uma análise mais completa da produção metabólica destes microrganismos. Além de facilitar e tornar mais robustas as pesquisas envolvendo 138 produtos naturais bioativos de fungos, estes resultados evidenciam alinhamento da abordagem adotada neste tipo de estudo de diversos princípios e metas propostos pelos objetivos de desenvolvimento sustentável (ODS - ONU), dentre os quais destacamos a redução do gasto de solventes e reagentes químicos devido ao aumento da produção de extratos por litro de meio de cultura (Saúde e bem estar – ODS 3, Água potável e saneamento – ODS 6, Consumo e produção responsáveis – ODS 12), em consonância com a exploração sustentável da biodiversidade, responsável por contribuir de maneira marcante para as pesquisas de bioprospecção por meio da descoberta de novos compostos bioativos (Indústria, inovação e infraestrutura – ODS 9). Adicionalmente, estas abordagens exaltam o potencial das pesquisas envolvendo organismos marinhos, e contribuem para a ampliação sobre o conhecimento químico de microrganismos e seus desdobramentos sobre as relações ecológicas entre as algas hospedeiras e os fungos endofíticos, essenciais para ações voltadas à preservação deste importante bioma (Vida na água – ODS 14). 139 REFERÊNCIAS ABRAHAM, A. L. et al. Genetic Modifiers of Chromatin Acetylation Antagonize the Reprogramming of Epi-Polymorphisms. PLoS Genetics, v. 8, n. 9, 2012. ANDRIOLI, W. J. Otimização das condições de cultivo de Humicola grisea var . thermoidea , visando produção e isolamento de metabólitos secundários biologicamente ativos Otimização das condições de cultivo de Humicola grisea var . thermoidea , visando produção e isolament. [s.l.] Universidade de São Paulo, 2008. ATANASOV, A. G. et al. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. 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