UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP Instituto de Química - Câmpus de Araraquara HENRIQUE MAZIERO FOGARIN PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS A PARTIR DA BORRA DE CAFÉ POR PRÉ-TRATAMENTO HIDROTÉRMICO E ÁCIDO: BIOATIVIDADES, IMPACTO NA MICROBIOTA E ANÁLISE DO CICLO DE VIDA Araraquara 2025 HENRIQUE MAZIERO FOGARIN PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS A PARTIR DA BORRA DE CAFÉ POR PRÉ-TRATAMENTO HIDROTÉRMICO E ÁCIDO: BIOATIVIDADES, IMPACTO NA MICROBIOTA E ANÁLISE DO CICLO DE VIDA Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Biotecnologia Industrial e Ambiental Orientadora: Profa. Dra. Kelly Johana Dussán Medina Araraquara 2025 IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA A pesquisa inova ao otimizar o processo de extração de oligossacarídeos a partir da borra de café através do pré-tratamento hidrotérmico e com ácido sulfúrico diluído, determinar o impacto ambiental das condições avaliadas, avaliar as bioatividades dos oligossacarídeos extraídos, bem como o impacto na microbiota da formulação em hidrogel. Esta pesquisa está alinhada os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS) 3 (Saúde e bem-estar), 9 (Indústria, inovação e infraestrutura) e 12 (Consumo e produção responsável) por produzir compostos que trazem benefícios à saúde humana através do aproveitamento de um resíduo agroindustrial na perspectiva de biorrefinarias. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH The research innovates by optimizing the process of extracting oligosaccharides from spent coffee grounds through hydrothermal and dilute sulfuric acid pretreatments, determining the environmental impact of the conditions evaluated, evaluating the bioactivities of the extracted oligosaccharides, as well as the impact on the microbiota of the hydrogel formulation. This research is in line with Sustainable Development Goals (SDGs) 3 (Health and well-being), 9 (Industry, innovation and infrastructure) and 12 (Responsible consumption and production) by producing compounds that benefit human health through the use of an agro-industrial residue from the perspective of biorefineries. DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO HENRIQUE MAZIERO FOGARIN 12/10/1993 Nacionalidade brasileira Nome em citações bibliográficas: Fogarin, Henrique M. Fogarin, H. M. Fogarin, Henrique Endereço profissional Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Campus de Araraquara Departamento de Engenharia Química Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, Araraquara – SP CEP 14800-900 Telefone: (19) 99402-3322 Currículo Lattes http://lattes.cnpq.br/4950180005522074 ORCID https://orcid.org/0000-0002-4842-3649 FORMAÇÃO ACADÊMICA 2014/2020 Graduação em Engenharia Química Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara. 02/2024 – 06/2024 Bolsa estágio de pesquisa no exterior (BEPE) – FAPESP Centro de Biotecnologia e Química Fina, Universidade Católica Portuguesa, Porto, Portugal. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA 1) Henrique Maziero Fogarin, Sarha Lucia Murillo-Franco, Matheus Costa Monteiro dos Santos, Debora Danielle Virginio da Silva, Kelly Johana Dussán. Acid hydrolysis pretreatment for extraction of oligosaccharides derived from spent coffee grounds: valorization of a promising biomass. Environmental Science and Pollution Research, 2025. https://doi.org/10.1007/s11356-025-36417-0. 2) Matheus Costa Monteiro dos Santos, Henrique Maziero Fogarin, Sarha Lucia Murillo- Franco, Jonas Paulino de Souza, Erica Regina Filletti, Kelly Johana Dussán. Artificial Neural https://doi.org/10.1007/s11356-025-36417-0 Networks (ANN’s) to Predict the Behavior of Sugars Obtained by Acid Hydrolysis Process from Spent Coffee Grounds (SCG). Waste and Biomass Valorization. Submetido em 10/2024. 3) Naira Linhares Sabino, Henrique Maziero Fogarin, Sarha Lucia Murillo-Franco, Mariana Oliviera Bérgamo, Leticia Vicente Moreno, Debora Danielle Virginio da Silva, Cristiano Soleo Funari, Kelly Johana Dussán. Investigating the influence of solvents and extraction methods on the efficacy of phenolic compound recovery from spent coffee grounds. Separation and Purification Technology, 2025. https://doi.org/10.1016/j.seppur.2025.131793 4) Souza, J.P., Fogarin, H.M., Almeida, S.G.C., Santos, B.C.S., Silva, D.D.V., Dussán, K.J. Fermentation of Sugarcane Biomass Hemicellulosic Hydrolysate by Yeast-Producer of Xylitol and Ethanol Isolated from the Atlantic Forest and the Brazilian Amazon Forest. Waste & Biomass Valorization, 2024. https://doi.org/10.1007/s12649-024-02535-y 5) De Almeida, S.G.C., Souza, J.P., Fogarin, H.M., Franca, B.V., Dussán, K.J. Assessment of lipid synthesis from sugarcane biomass by adaptive strains of Rhodosporidium toruloides. Biomass Conversion and Biorefinery, 2024. https://doi.org/10.1007/s13399-024-05499-0 6) De Almeida, S.G.C.; Fogarin, H.M.; Costa, M.A.M.; Dussán, K.J. Study of sugarcane bagasse/straw combustion and its atmospheric emissions using a pilot-burner. Environmental Science and Pollution Research, 2023. https://doi.org/10.1007/s11356- 023-28171-y 7) Dos Santos, M.G.; Fogarin, H.M.; da Silva, D.D.V.; Dussán, K.J. Bioprocess development for levulinic acid production using sugarcane biomass. Sustainable Chemistry and Pharmacy, 2023. https://doi.org/10.1016/j.scp.2023.101085 PARTICIPAÇÃO EM BANCAS E ORIENTAÇÕES Bancas de trabalhos de conclusão Não possui Orientações Não possui PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS Congresso internacional de microbiologia em língua Portuguesa, 2024. (Vídeo Conferência). Potencial de biomassas de cogumelos na modulação da microbiota intestinal. 2024. (Apresentação Oral). https://doi.org/10.1016/j.seppur.2025.131793 https://doi.org/10.1007/s12649-024-02535-y https://doi.org/10.1007/s13399-024-05499-0 https://doi.org/10.1007/s11356-023-28171-y https://doi.org/10.1007/s11356-023-28171-y https://doi.org/10.1016/j.scp.2023.101085 11th International Conference on Sustainable Solid Waste Management, 2024, (Rhodes). Neural Network-Enhanced Hydrolysis Process for Valorizing Spent Coffee Grounds. 2024. (Pôster) 11th International Conference on Sustainable Solid Waste Management, 2024, (Rhodes). Enhanced extraction of oligosaccharides from spent coffee grounds using dilute acid hydrolysis. 2024. (Apresentação Oral) 53rd Annual Meeting of the Brazilian Society of Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2024, (Águas de Lindóia). Artificial Neural Networks Coupled Genetic Algorithm as a Strategy for Optimizing Xylitol Production by Xylose Fermenting. 2024. (Pôster) 10th International Conference on Sustainable Solid Waste Management, 2023, (Chania). Obtaining high value-added bioproducts from a by-product of the coffee production chain. 2023. (Pôster) 10th International Conference on Sustainable Solid Waste Management, 2023, (Chania). Co- production of ethanol and xylitol from sugarcane hemicellulose hydrolysate by yeasts isolated from the Atlantic Forest and the Brazilian Amazon Forest. 2023. (Apresentação Oral) 10th International Conference on Sustainable Solid Waste Management, 2023, (Chania). Growth characterization of adapted Rhodosporidium toruloides in sugarcane biomass hemicellulosic hydrolysate. 2023. (Apresentação Oral) Dedico este trabalho... aos meus pais, Luzia Dulce Maziero Fogarin e Luiz Carlos Fogarin; à minha irmã, Letícia Maziero Fogarin; e a todos que estiveram presente e fizeram parte desta jornada. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente aos meus pais, Luzia Dulce Maziero Fogarin e Luiz Carlos Fogarin, por todos os sacrifícios que fizeram para que pudesse ter a melhor educação possível, muitas vezes deixando de realizar sonhos próprios para que seus filhos pudessem ter seus sonhos realizados. Agradeço também por todo o carinho e pelos ensinamentos por eles transmitidos e por serem meu ponto de apoio ao qual sempre pude voltar nos momentos de incertezas e dificuldades. Agradeço à minha irmã, por quem tenho admiração pela sua resiliência e força de vontade. Pelas trocas de experiências e conhecimentos que nos fazem crescer juntos e pelas conversas e conselhos pessoais e profissionais que tivemos nos últimos anos, que me fizeram ter foco e tranquilidade em momentos de decisão. Agradeço aos meus colegas do grupo de pesquisa APIBIL pelos ensinamentos, trocas de experiências, pela ajuda no desenvolvimento e escrita de trabalhos científicos, pelas risadas e presentes das viagens (principalmente os doces), e pela oportunidade de poder trabalhar com um grupo de pessoas que contribuíram no desenvolvimento deste projeto. Agradeço à Professora Doutora Kelly Johana Dussán Medina, minha orientadora, pela oportunidade de trabalhar em seu grupo de pesquisa, por todo o conhecimento transmitido e pelas oportunidades geradas por este trabalho. Pessoa a quem admiro pelo seu comprometimento, força de vontade, por toda a sua trajetória e sabedoria. Agradeço aos meus colegas do grupo de pesquisa Bioactives and Bioproducts Research, do Centro de Biotecnologia e Química Fina, laboratório associado da Universidade Católica Portuguesa, Porto, por toda ajuda na condução do projeto de estágio no exterior, possibilitando o meu desenvolvimento pessoal e como pesquisador, pelos momentos de descontração durante os dias de longas jornadas de trabalho e também durantes os almoços. Agradeço às Professoras Doutoras Manuela Pintado e Raquel Madureira, por terem aberto as portas para o meu estágio de pesquisa no exterior, por todo a disponibilidade e recursos disponibilizados durante a minha estadia no Centro de Biotecnologia e Química Fina, que foram de grande importância para o meu desenvolvimento crítico como pesquisador. Ao Instituto de Química de Araraquara, à Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” e aos funcionários que possibilitaram e contribuíram para a realização e conclusão deste projeto. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho através da Chamada CNPq nº 07/2022 – processo # 131120/2022-0 e do processo # 316230/2023-5. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro, concedido por meio do Projeto FAPESP Processo # 2022/03000-0 e dos Processos # 2023/01752-8, 2023/15075-8. “Sua META é ser o melhor do mundo naquilo que você faz. Não existem alternativas” (Campos, 2004, p. 11)* 1 CAMPOS, Vicente Falconi. Gerenciamento da rotina do trabalho do dia-a-dia. Nova Lima: INDG Tecnologia e Serviços Ltda., 2004. 266 p. RESUMO O café é uma das principais commodities globais. No entanto, seu processamento gera grandes volumes de resíduos, principalmente borra de café (BCF), que é descartada em aterros, causando impactos ambientais. Para mitigar esses impactos, é necessário implementar a valorização da BCF através da economia circular. A BCF possui aproximadamente 50% em massa seca de hemicelulose e celulose, a fração hemicelulósica é rica em galactomananas e arabinogalactanas, possibilitando a produção de manano-oligossacarídeos (MOS), que possuem potencial prebiótico. Entretanto, a BCF possui uma estrutura complexa. Assim, este trabalho teve como objetivo caracterizar BCF, otimizar a etapa de pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído para obtenção de OS utilizando um modelo Box-Behnken 34 com 29 ensaios, avaliando os fatores: temperatura (140-190 °C), relação sólido/líquido (S/L) (1:40-1:4 g/mL), tempo de reação (20-120 min) e concentração de ácido sulfúrico (0-2% v/v), realizar análise do ciclo de vida, avaliar o potencial prebiótico por ensaios in vitro, a bioacessibilidade e biodisponilidade através do protocolo INFOGEST, e o impacto na microbiota dos OS através de ensaios in vitro de fermentação colônica e análises de metagenômica. A BCF utilizada neste estudo apresentou como principais frações a hemicelulose, compostos extrativos, lignina e celulose, respectivamente. Tendo a manose (aproximadamente 25% em massa seca) como principal açúcar. Foi possível produzir oligossacarídeos (OS) através do pré-tratamento com ácido diluído, sendo as variáveis mais influentes: a relação sólido/líquido (S/L), a concentração de ácido e a temperatura. Concentrações de ácido abaixo de 1,5% v/v foram mais eficientes, favorecendo a despolimerização da hemicelulose. Sob a condição ótima (169 °C, S/L - 1/40, 20 min e 1,43% H2SO4) foi possível obter 21,40 g de OS por 100 g de BCF seca, com proporção de 1:1:1 (manose:galactose:arabinose), sendo a manobiose o principal OS. O ácido cítrico também se mostrou eficiente, abrindo caminho para estudos de otimização. A Avaliação do Ciclo de Vida (ACV) indicou que as etapas de precipitação dos OS e recuperação de solventes impactaram significativamente, sendo o ensaio 23 (165 °C, S/L - 1/4, 70 min e 0% H2SO4) a de menores impactos ambientais em relação aos ensaios de pré-tratamento hidrotérmico. O pré- tratamento hidrotérmico revelou-se eficaz na extração de oligossacarídeos e polissacarídeos proveniente de arabinogalactanas, com 76,25 ± 5,86 g de galactose por 100g de OS. Apesar da presença de ácido clorogênico, os oligossacarídeos do ensaio 23 (OS-23) apresentaram baixa capacidade antioxidante pelos métodos ABTS, DPPH e ORAC. O OS-23 (0,50% m/v) demonstrou potencial prebiótico ao promover o crescimento de Bifidobacterium, Lacticaseibacillus e Lactobacillus. No entanto, L. acidophilus LA-5 e B. animalis Bo apresentaram crescimento reduzido em concentrações superiores a 0,50% (m/v), sugerindo um possível estresse microbiano. A formulação de hidrogel com 1,5% m/v de pectina foi a que apresentou resultados mais adequados. Ensaios in vitro demonstraram que o Hydrogel OS-23 resiste à digestão e alcança o intestino onde será fermentado pela microbiota intestinal. A fermentação colônica in vitro demonstrou que o hidrogel contendo os OS-23 (Hydrogel OS-23) aumentou a diversidade microbiana e estimulou o crescimento de Bifidobacterium e Bacteroides, promovendo a produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), especialmente acetato. O Hydrogel OS-23 teve efeitos similares ao hidrogel contendo fruto-oligossacarídeos, indicando sinergia entre pectina e OS-23 na modulação da microbiota intestinal. Este estudo contribui para o entendimento da extração de OS da fração hemicelulósica da BCF, bem como suas bioatividades, potencial prebiótico e impacto sinérgico entre a matriz péctica e os OS da BCF na microbiota, representando um avanço significativo na valorização deste resíduo. Palavras-chave: café-resíduos; economia circular; prebióticos; hemicelulose; metagenômica. ABSTRACT Coffee is one of the most tradable commodities. However, its processing generates large quantities of waste, primarily spent coffee grounds (SCG), which are often discarded in landfills, leading to environmental impacts. To mitigate these impacts, the valorization of SCG through circular economic approaches is essential. SCG consists of approximately 50% (dry weight) hemicellulose and cellulose, with the hemicellulosic fraction being rich in galactomannans and arabinogalactans, enabling the production of mannan-oligosaccharides (MOS) with potential prebiotic properties. However, the complex structure of SCG presents challenges for its valorization. The objectives of this study were to characterize SCG and optimize the dilute sulfuric acid pretreatment for oligosaccharide (OS) production using a Box- Behnken 34 model with 29 experiments. The evaluated factors include temperature (140–190 °C), solid/liquid ratio (S/L) (1:40–1:4 g/mL), reaction time (20–120 min), and sulfuric acid concentration (0–2% v/v). Additionally, a life cycle assessment (LCA) was conducted, along with in vitro evaluations of prebiotic potential, bioaccessibility and bioavailability through the INFOGEST protocol, and microbiota impact via in vitro colonic fermentation and metagenomic analyses. The SCG used in this study was primarily comprised hemicellulose, extractives, lignin, and cellulose, with mannose as the predominant sugar (approximately 25% dry weight). OS production was achieved through dilute acid pretreatment, with the most influential variables being the S/L ratio, acid concentration, and temperature. Acid concentrations below 1.5% v/v were more efficient, enhancing hemicellulose depolymerization. Under optimal conditions (169 °C, S/L – 1/40, 20 min, and 1.43% H2SO4), 21.40 g of OS per 100 g of dry SCG was obtained, with a monosaccharide ratio of 1:1:1 (mannose:galactose:arabinose), predominantly mannobiose. Citric acid also demonstrated efficiency, indicating potential for further optimization. LCA results indicated that OS precipitation and solvent recovery stages had the highest environmental impact, with assay 23 (165 °C, S/L – 1/4, 70 min, and 0% H2SO4) showing the lowest environmental burden among hydrothermal pretreatment assays. Hydrothermal pretreatment proved effective in extracting oligosaccharides and polysaccharides derived from arabinogalactans, yielding 76.25 ± 5.86 g of galactose per 100 g of OS. Despite the presence of chlorogenic acid, the oligosaccharides from assay 23 (OS-23) exhibited low antioxidant capacity in ABTS, DPPH, and ORAC assays. The OS-23 at 0.50% m/v demonstrated prebiotic potential by promoting the growth of Bifidobacterium, Lacticaseibacillus, and Lactobacillus. However, L. acidophilus LA-5 and B. animalis Bo exhibited reduced growth at concentrations exceeding 0.50% (m/v), suggesting microbial stress. The hydrogel formulation with 1.5% m/v pectin showed the most suitable properties. The in vitro assays confirmed that the hydrogel containing the OS-23 (Hydrogel OS-23) resists digestion and reaches the colon, where it undergoes fermentation by gut microbiota. In vitro colonic fermentation revealed that Hydrogel OS-23 enhanced microbial diversity and stimulated the growth of Bifidobacterium and Bacteroides, leading to increased production of short-chain fatty acids (SCFAs), particularly acetate. Hydrogel OS-23 exhibited effects similar to the hydrogel containing fructooligosaccharide, indicating synergy between pectin and OS- 23 in gut microbiota modulation. This study contributes to the understanding of OS extraction from the hemicellulosic fraction of SCG, as well as its bioactivities, prebiotic potential, and the synergistic impact between pectic matrix and SCG-derived OS on gut microbiota, marking a significant advancement in SCG valorization. Keywords: coffee-residues; circular economy; prebiotics; hemicellulose; metagenomics. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura da fração lignocelulósica, composta pela hemicelulose, celulose e lignina. .................................................................................................................................................. 32 Figura 2 - Cascata de valorização da biomassa de acordo com o valor agregado de cada setor. .................................................................................................................................................. 36 Figura 3 – Principais classes de compostos prebióticos classificados de acordo com as evidências de benefícios a saúde humana. ................................................................................ 49 Figura 4 - Diagrama do trato gastrointestinal humano. ........................................................... 56 Figura 5 – Principais modelos estáticos e dinâmicos de fermentação in vitro da MIH. ......... 62 Figura 6 - Fronteiras do sistema para o cenário de valorização da BCF em OS de acordo com uma abordagem do berço ao portão. ......................................................................................... 74 Figura 7 - Fluxograma da simulação pelo Aspen Plus do processo de produção dos OS utilizando ácido sulfúrico diluído na etapa de pré-tratamento. ................................................ 74 Figura 8 - Fluxograma da simulação pelo Aspen Plus do processo de produção dos OS utilizando água na etapa do pré-tratamento. ............................................................................. 75 Figura 9 - Fluxograma das etapas de produção de OS a partir da BC baseados nos procedimentos experimentais. .................................................................................................. 75 Figura 10 - Disposição da microplaca para ensaio de eliminação do radical livre estável. .... 77 Figura 11 - Disposição da microplaca para ensaio de absorção de radicais de oxigênio. ....... 80 Figura 12 - Viscosímetro rotacional (B-ONE PLUS, Lamy Rheology, França) para determinação da viscosidade das amostras desenvolvidas. ...................................................... 82 Figura 13 – Fluxograma das etapas do protocolo INFOGEST 2.0. ........................................ 83 Figura 14 – Fermentadores em batelada contendo: (I-II) Hydrogel OS-23, (III-IV) Hydrogel FOS; (V-VI) Hydrogel Matriz, (VII-VIII) controle de inóculo (IC). ....................................... 85 Figura 15 - Fermentador em batelada com controle de pH, temperatura e agitação, utilizado nos ensaios in vitro de fermentação colônica. .......................................................................... 86 Figura 16 - Estimativa dos efeitos (com 95% de confiança) usando o gráfico de Pareto do planejamento Box-Behnken 34 para a otimização da extração de OS a partir do pré-tratamento da BCF. L = variável linear, Q = variável quadrática. ............................................................. 99 Figura 17 - Gráficos de contorno da função desejabilidade de acordo com o planejamento Box- Behnken 34, para a variável resposta EF-OS (g OS/100 g BCF seca) para (a) Relação S/L (g/mL) vs. Temperatura (°C); (b) Tempo (min) vs. Temperatura (°C); (c) Tempo (min) vs. Relação S/L (g/mL); (d) %H2SO4 (v/v) vs. Temperatura (°C); (e) %H2SO4 (v/v) vs. Relação S/L (g/mL) e (f) %H2SO4 (v/v) vs. Tempo (min). ........................................................................................ 102 Figura 18 - Superfícies de resposta tridimensional de acordo com o planejamento Box-Behnken 34, para a variável resposta EF-OS (g OS/100 g BCF seca) para (a) Temperatura (°C) vs. %H2SO4; (b) Temperatura (°C) vs. Relação S/L (g/mL); (c) Temperatura (°C) vs. Tempo (min); (d) Relação S/L (g/mL) vs. %H2SO4; (e) Relação S/L (g/mL) vs. Tempo (min) e (f) Tempo (min) vs. %H2SO4 (v/v). ......................................................................................................... 103 Figura 19 - Espectro da análise de MALDI-TOF-MS da matriz e dos OS obtidos com a condição ótima do modelo. ..................................................................................................... 110 Figura 20 - Contribuição global para as categorias de impacto da produção de OS derivados da BCF. ........................................................................................................................................ 113 Figura 21 - Espectro da análise de MALDI-TOF-MS da matriz e dos OS obtidos com o ensaio 23 do planejamento Box-Behnken 34. .................................................................................... 120 Figura 22 - Curvas de crescimento das cepas (a) L. acidophilus LA-5, (b) L. rhamnosus Lcr35, (c) L. casei 01, (d) B. animalis Bo, e (e) B. longum BG3, em meio MRS-cys suplementado com OS-23 1,0%, OS-23 2,0%, OS-23 3,0%, FOS 2,0% e glicose 2,0% (m/v). ........................... 130 Figura 23 - Curvas de crescimento das cepas (a) L. acidophilus LA-5, (b) L. rhamnosus Lcr35, (c) L. casei 01, (d) B. longum BG3, em meio MRS-cys suplementado com OS-23 0,25%, OS- 23 0,50%, OS-23 1,00% e FOS 0,50% (m/v). ........................................................................ 132 Figura 24 - Curvas de crescimento das cepas (a) L. acidophilus LA-5, (b) L. rhamnosus Lcr35, (c) L. casei 01, (d) B. animalis Bo, (e) B. longum BG3 e (f) B. lactis Bb12, em meio MRS-cys suplementado com OS-23 0,50%, FOS 0,50%, Gli 0,50% e Gli 2,00% (m/v). ..................... 135 Figura 25 - Contagem da viabilidade celular para (a) L. acidophilus LA-5, (b) L. rhamnosus Lcr35, (c) L. casei 01, (d) B. animalis Bo, (e) B. longum BG3 e (f) B. lactis Bb12 em meio MRS-cys contendo OS-23 0,50%, FOS 0,50%, Glic 0,50% e Glic 2,00% (m/v). ................. 136 Figura 26 - Viscosidade (mPa.s) das matrizes hidrogéis contendo 1,0%, 1,5% e 2,0% (m/v) de pectina, Pear Organic Fruit Purée (Clearspring) e Tasty Turtle – Maça e pera com iogurte (Holle), aferida à temperatura ambiente. ................................................................................ 140 Figura 27 - Concentração total de nitrogênio amoniacal ao longo das 48 h de fermentação colônica para as amostras Hydrogel OS-23, Hydrogel FOS, Hydrogel Matriz e o IC. .......... 143 Figura 28 – (a) Diagrama de flor para todos os grupos de amostras nos diferentes tempos de fermentação (0, 24 e 48 h); (b) Análise de α-diversidade usando o índice de diversidade de Shannon e (c) Análise de α-diversidade usando o índice de diversidade de Chao1. .............. 147 Figura 29 - Análise de coordenadas principais (PCoA) considerando as distâncias Unifrac não ponderadas. ............................................................................................................................. 150 Figura 30 - Análise de abundância relativa das diferentes amostras testadas (Hydrogel OS-23, Hydrogel FOS, Hydrogel Matriz) e IC, nos diferentes tempos de fermentação (0, 24 e 48 h) (a) para os 10 principais táxons de cada amostra a nível dos filos; (b) para os 30 principais táxons de cada amostra a nível dos gêneros e espécies; (c) para os 10 principais táxons de cada grupo de amostra a nível dos filos; (d) para os 30 principais táxons de cada grupo de amostra a nível dos gêneros e espécies. ........................................................................................................... 153 Figura 31 - Comparação das abundâncias relativas de espécies bacterianas com diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, baseada no teste t para (a) Hydrogel OS-23 e IC às 24 h; (b) Hydrogel OS-23 e IC às 48 h; (c) Hydrogel OS-23 e Hydrogel Matriz às 24 h; (d) Hydrogel OS-23 e Hydrogel Matriz às 48 h. .......................................................................... 158 Figura 32 - Concentrações dos AGCC majoritários (acetato, propionato e butirato) (μmol de AGCC por g de amostra fermentada) para as diferentes amostras avaliadas ao longo dos ensaios de fermentação colônica. ........................................................................................................ 160 Figura 33 - Concentrações dos AGCC minoritários (isobutitato, isovalerato e valerato) (μmol de AGCC por g de amostra fermentada) para as diferentes amostras avaliadas ao longo dos ensaios de fermentação colônica. ........................................................................................... 164 Figura 34 - Resíduos versus valores preditos para os 29 ensaios do planejamento Box-Behnken 34. ............................................................................................................................................ 185 Figura 35 – Gráfico de probabilidade normal para os 29 ensaios do planejamento Box-Behnken 34. ............................................................................................................................................ 185 Figura 36 - Perfil dos compostos fenólicos extraídos do OS-23, determinados por CLAE acoplado com um detector UV/Vis – PDA. ........................................................................... 218 Figura 37 – Composição dos monossacarídeos presentes nos OS-23 determinada por HPAEC- PAD. ....................................................................................................................................... 218 Figura 38 - Composição dos OS presentes no Hydrogel OS-23 antes do ensaio in vitro da digestão do TGI determinada por HPAEC-PAD. ................................................................... 219 Figura 39 - Composição dos OS presentes no Hydrogel OS-23 após o ensaio in vitro da digestão do TGI determinada por HPAEC-PAD. ................................................................... 219 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Teor de manose de diferentes resíduos agrícolas. Os dados são expressos em porcentagem de peso, em uma base seca. ................................................................................. 34 Tabela 2 - Vantagens e desvantagens dos principais métodos de pré-tratamento de biomassas lignocelulósicas. ....................................................................................................................... 39 Tabela 3 - Principais resultados obtidos através da ACV para diferentes aplicações da BCF. .................................................................................................................................................. 46 Tabela 4 – Oligossacarídeos disponíveis comercialmente e suas aplicações. ......................... 49 Tabela 5 - Estudos da avaliação da propriedade prebiótica dos MOS obtidos de diferentes fontes através de ensaios fermentativos in vitro. ...................................................................... 50 Tabela 6 - Estudos da suplementação de MOS na dieta de animais de corte e os principais resultados obtidos. .................................................................................................................... 53 Tabela 7 - Comparação entre os fatores relevantes na escolha do tipo de método in vitro. .... 57 Tabela 8 - Principais bioatividades observadas para os AGCC. ............................................. 63 Tabela 9 - Curva padrão de Trolox para ensaio de eliminação do radical livre estável. ......... 77 Tabela 10 - Curva padrão de Trolox para ensaio de absorção de radicais de oxigênio. .......... 79 Tabela 11 - Composição química (g/100 g de BCF seca) da BCF seca de acordo com o método NREL/TP-510-42618 (Sluiter et al., 2008b). ........................................................................... 91 Tabela 12 - Concentrações dos compostos fenólicos presentes na borra de café in natura a partir das análises de CLAE em triplicata. ............................................................................... 93 Tabela 13 – Matriz do planejamento Box-Behnken 34 com 5 repetições no ponto central para o estudo da influência das variáveis: temperatura, razão S/L, tempo e concentração de H2SO4, no processo de obtenção dos OS a partir do pré-tratamento da BCF. ...................................... 98 Tabela 14 - ANOVA para a variável dependente EF-OS (g OS/100g BCF seca) para o planejamento Box-Behnken 34 com 5 repetições no ponto central para a otimização da extração de OS a partir do pré-tratamento da BCF. .............................................................................. 100 Tabela 15 - Modelo matemático, gerado de acordo com o panejamento Box-Behnken 34, e validação empregando a condição otimizada e uma condição aleatória. ............................... 104 Tabela 16 – Proporção em mols de manose, galactose e arabinose dos oligossacarídeos, após a hidrólise total com H2SO4 4% m/v, obtidos em cada ensaio do planejamento Box-Behnken 34. ................................................................................................................................................ 108 Tabela 17 - Intensidades dos picos obtidos através da análise de MALDI-TOF-MS dos OS obtidos com a condição ótima do modelo. ............................................................................. 110 Tabela 18 - Emissões de GEE (kg de CO2 eq. por kg de produto) para a produção de OS. . 115 Tabela 19 - Toxicidade humana por kg de produto, para a produção de OS a partir da BCF. ................................................................................................................................................ 117 Tabela 20 - Acidificação do solo por kg de produto, para a produção de OS a partir da BCF. ................................................................................................................................................ 119 Tabela 21 - Intensidades dos picos obtidos através da análise de MALDI-TOF-MS dos OS obtidos com a ensaio 23.......................................................................................................... 120 Tabela 22 - Composição química dos OS-23 em base seca. ................................................. 122 Tabela 23 - Composição dos minerais presentes nos OS-23 extraídos da BCF. ................... 123 Tabela 24 - Capacidade antioxidante dos OS-23 obtidos por pré-tratamento hidrotérmico da BCF. ........................................................................................................................................ 126 Tabela 25 - Concentração dos OS presentes no Hydrogel OS-23 antes e após a digestão do TGI.......................................................................................................................................... 142 Tabela 26 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 1. ....................................................... 186 Tabela 27 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 2. ....................................................... 187 Tabela 28 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 3. ....................................................... 188 Tabela 29 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 4. ....................................................... 189 Tabela 30 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 5. ....................................................... 190 Tabela 31 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 6. ....................................................... 191 Tabela 32 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 7. ....................................................... 192 Tabela 33 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 8. ....................................................... 193 Tabela 34 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 9. ....................................................... 194 Tabela 35 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 10. ..................................................... 195 Tabela 36 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 11. ..................................................... 196 Tabela 37 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 12. ..................................................... 197 Tabela 38 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 13. ..................................................... 198 Tabela 39 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 14. ..................................................... 199 Tabela 40 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 15. ..................................................... 200 Tabela 41 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 16. ..................................................... 201 Tabela 42 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 17. ..................................................... 202 Tabela 43 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 18. ..................................................... 203 Tabela 44 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 19. ..................................................... 204 Tabela 45 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 20. ..................................................... 205 Tabela 46 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 21. ..................................................... 206 Tabela 47 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 22. ..................................................... 207 Tabela 48 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 23. ..................................................... 208 Tabela 49 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 24. ..................................................... 209 Tabela 50 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 25. ..................................................... 210 Tabela 51 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 26. ..................................................... 211 Tabela 52 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 27. ..................................................... 212 Tabela 53 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 28. ..................................................... 213 Tabela 54 - Inventário do ciclo de vida para o ensaio 29. ..................................................... 214 Tabela 55 - Inventário utilizado para os 29 ensaios, de acordo com o Ecoinvent 3. ............. 215 Tabela 56 - Dados pessoais, alimentares e médicos dos doadores voluntários. .................... 217 Tabela 57 - Hábitos e uso de medicamentos dos doadores voluntários. ............................... 217 Tabela 58 - Dados das fezes coletadas e preparo do inóculo. ............................................... 217 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 5-HMF 5-hidroximetilfurfural AAPH Dicloridrato de 2,2′-Azobis(2-metilpropionamidina) ABTS Ácido 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) ACGs Ácidos clorogênicos ACV Avaliação do ciclo de vida AE Extração assistida por enzima AGCC Ácidos graxos de cadeia curta AICV Avaliação do impacto do ciclo de vida AU Extração assistida por ultrassom AUE Extração assistida por ultrassom e enzima BAL Bactérias ácido-láticas BCF Borra de café BCF-LE Borra de café livre de extrativos CAGR Taxa de crescimento anual composta CFU Unidades formadoras de colônias CG Cromatografia gasosa CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência DHB 2,5-dihidroxibenzóico DMSO Dimetilsulfóxido DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo EC Economia Circular EF-OS Eficiência de extração de oligossacarídeos FDA Administração Federal de Alimentos e Medicamentos FOS Fruto-oligossacarídeos GABA Ácido gama-aminobutírico GC-FID Cromatografia gasosa equipado com detector de ionização de chama GEE Gases de efeito estufa GOS Galacto-oligossacarídeos HM Alto teor de metoxilação HPAEC- PAD Cromatografia de troca aniônica de alta eficiência acoplado com um detector de pulso amperométrico Hydrogel FOS Hidrogel contendo 0,5% (m/v) de FOS Hydrogel Matriz Hidrogel de pectina Hydrogel OS-23 Hidrogel contendo 0,5% (m/v) dos OS-23 IC Controle de inóculo ICV Inventário do ciclo de vida ITU Infecções do trato urinário MALDI- TOF-MS Espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz MIH Microbiota intestinal humana MOS Manano-oligossacarídeos MRS Caldo De Man, Rugosa e Sharpe MRS-cys Caldo De Man, Rugosa e Sharpe suplementado com 0,1% (m/v) de L-cisteína-HCl NREL Laboratório Nacional de Energia Renovável OD Densidade óptica ODS Objetivos de Desenvolvimento Sustentável ONU Organização das Nações Unidas ORAC Capacidade de absorção de radicais de oxigênio OS Oligossacarídeos OS-23 Oligossacarídeos da condição 23 liofilizados PBS Solução salina de tampão fosfato PCoA Análise de Coordenadas Principais PIB Produto interno bruto qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa ROI Retorno sobre o investimento S/L Sólido-líquido TGI Trato gastrointestinal UP Ultrapura VSA Variantes de sequência de amplicon SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 24 2. REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 29 2.1. PRODUÇÃO DE CAFÉ E SEUS RESÍDUOS ............................................................ 29 2.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA BORRA DE CAFÉ ........................................ 31 2.3. APLICAÇÕES DA BORRA DE CAFÉ ....................................................................... 34 2.4. PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA ...................................................................... 36 2.5. ECONOMIA CIRCULAR (EC) E ANÁLISE DO CICLO DE VIDA (ACV) ............ 43 2.6. OLIGOSSACARÍDEOS E SUAS BIOATIVIDADES ................................................ 47 2.7. AVALIAÇÃO DA BIOACESSIBILIDADE E BIODISPONIBILIDADE ................. 54 2.8. FERMETAÇÃO COLÔNICA ...................................................................................... 58 3. OBJETIVOS .................................................................................................................... 65 3.1. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 65 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 65 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 66 4.1. COLETA E ARMAGENAGEM DA MATÉRIA-PRIMA .......................................... 66 4.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA BORRA DE CAFÉ ........................................ 66 4.2.1. Remoção, quantificação e caracterização dos compostos extrativos ..................... 66 4.2.2. Quantificação dos carboidratos estruturais, lignina e cinzas ................................. 67 4.3. PRÉ-TRATAMENTO DA BORRA DE CAFÉ ........................................................... 68 4.3.1. Pré-tratamento da BCF-LE com ácido cítrico ....................................................... 68 4.4. PRECIPITAÇÃO DOS OLIGOSSACARÍDEOS ........................................................ 69 4.5. CARACTERIZAÇÃO DOS OLIGOSSACARÍDEOS ................................................ 69 4.5.1. Determinação da proporção em mols dos carboidratos ......................................... 70 4.5.2. Caracterização dos graus de polimerização ........................................................... 70 4.5.3. Determinação da umidade e cinzas ........................................................................ 70 4.5.4. Determinação do teor de proteínas ........................................................................ 71 4.5.5. Quantificação dos minerais .................................................................................... 71 4.5.6. Determinação da composição dos açúcares monoméricos .................................... 72 4.5.7. Determinação dos compostos fenólicos ................................................................. 72 4.6. ANÁLISE DO CICLO DE VIDA ................................................................................ 73 4.6.1. Objetivo e escopo .................................................................................................. 73 4.6.2. Unidade funcional .................................................................................................. 73 4.6.3. Fronteiras do sistema ............................................................................................. 73 4.6.4. Inventário do ciclo de vida (ICV) .......................................................................... 74 4.6.5. Avaliação do impacto do ciclo de vida .................................................................. 76 4.7. AVALIAÇÃO DAS BIOATIVIDADES DOS OLIGOSSACARÍDEOS .................... 76 4.7.1. Ensaio de eliminação do radical livre estável ABTS ............................................. 76 4.7.2. Ensaio de eliminação do radical livre estável DPPH ............................................. 78 4.7.3. Ensaio da capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC) .................... 78 4.7.4. Ensaio in vitro em microplaca para atividade prebiótica ....................................... 80 4.7.5. Avaliação da concentração celular ........................................................................ 81 4.8. DESENVOLVIMENTO DE MATRIZ PÉCTICA....................................................... 81 4.9. ENSAIO IN VITRO DA DIGESTÃO DO TRATO GASTROINTESTINAL ............. 82 4.10. FERMENTAÇÃO COLÔNICA ................................................................................... 84 4.10.1. Preparação do inóculo fecal ................................................................................... 84 4.10.2. Ensaio in vitro de fermentação colônica ................................................................ 85 4.10.3. Determinação da concentração total de nitrogênio amoniacal .............................. 86 4.10.4. Quantificação dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) .................................... 87 4.10.5. Extração do DNA bacteriano e análise de metagenômica ..................................... 88 4.11. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ...................................................................................... 89 4.11.1. Otimização da etapa de pré-tratamento da BCF .................................................... 89 4.11.2. Bioatividades, desenvolvimento da matriz péctica, digestão do TGI e fermentação colônica 89 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 90 5.1. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA BORRA DE CAFÉ (BCF) ............................. 90 5.2. OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS (OS) ........................ 96 5.2.1. Pré-tratamento com ácido cítrico empregando os parâmetros da condição ótima 105 5.3. AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA DOS OLIGOSSACARÍDEOS (OS) EXTRAÍDOS DA BORRA DE CAFÉ (BCF) .............................................................. 107 5.4. ANÁLISE DO CICLO DE VIDA (ACV) DA PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS (OS) ................................................................................................ 111 5.4.1. Impactos globais médios ...................................................................................... 112 5.4.2. Mudanças climáticas ............................................................................................ 113 5.4.3. Toxicidade humana .............................................................................................. 116 5.4.4. Acidificação do solo ............................................................................................ 118 5.5. CARACTERIZAÇÃO DA MELHOR CONDIÇÃO DO PONTO DE VISTA AMBIENTAL ......................................................................................................................... 120 5.6. AVALIAÇÃO DAS BIOATIVIDADES DOS OS-23 ............................................... 125 5.6.1. Avaliação da capacidade antioxidante ................................................................. 125 5.6.2. Avaliação do potencial prebiótico ....................................................................... 128 5.7. DESENVOLVIMENTO DA MATRIZ PÉCTICA .................................................... 139 5.8. ENSAIO IN VITRO DA DIGESTÃO DO TRATO GASTROINTESTINAL ........... 141 5.9. FERMENTAÇÃO COLÔNICA E METAGENÔMICA ........................................... 142 5.9.1. Determinação da concentração total de nitrogênio amoniacal ............................ 143 5.9.2. Riqueza da diversidade da população bacteriana: avaliação da α-diversidade.... 144 5.9.3. Riqueza da diversidade da população bacteriana: avaliação da β-diversidade .... 149 5.9.4. Análise de abundância relativa bacteriana ........................................................... 150 5.9.5. Análise da concentração dos AGCC .................................................................... 159 6. CONCLUSÕES.............................................................................................................. 166 REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 167 APÊNDICE A – TESTE DE NORMALIDADE PLANEJAMENTO BB 34 ................... 185 APÊNDICE B - INVENTÁRIO DO CICLO DE VIDA (ICV) ........................................ 186 APÊNDICE C – INVENTÁRIO ECOINVENT 3 ............................................................. 215 APÊNDICE D – INFORMAÇÕES SOBRE DOADORES E INÓCULO FECAL ........ 217 APÊNDICE E – CROMATOGRAMAS COMPLEMENTARES ................................... 218 24 1. INTRODUÇÃO O café é uma das principais commodities globais, com destaque para as espécies Coffea arabica e Coffea canephora, e os maiores exportadores de café são o Brasil, Vietnã e Colômbia, que juntos exportaram mais de 85 milhões de sacas na safra 2023/2024 (ICO, 2024). O processamento do café pode ser realizado por via seca, processo mais simples, ou por via úmida, que exige maior consumo de água, porém resulta em café de qualidade superior (Hoseini et al., 2021). Além disso, países desenvolvidos, como Alemanha, Bélgica, Estados Unidos e Itália, transformam o café verde em produtos de maior valor agregado, como café torrado e solúvel, fomentando a reexportação e o comércio internacional (Vegro; de Almeida, 2020). A produção e o consumo de café geram grandes volumes de resíduos, especialmente borra de café (BCF), estimada em 20 milhões de toneladas anuais (Kafková et al., 2023). A maior parte dessa biomassa é descartada em aterros, gerando impactos econômicos e ambientais significativos, devido ao alto custo de manejo dos aterros (Werderits Silva; da Silva César; Conejero, 2021) e à presença de compostos tóxicos, como polifenóis e cafeína (Sanjay Gurav; Mudoi, 2022). Para mitigar esses impactos, é necessário explorar rotas alternativas de valorização da BCF, convertendo-a em produtos de maior valor agregado. O ponto de partida para essa valorização está na caracterização química da BCF, permitindo identificar compostos de interesse comercial, estimar custos de extração e avaliar a viabilidade técnica e econômica das alternativas propostas (Sarghini et al., 2021; Zhao et al., 2024). Além disso, essa biomassa é promissora para o desenvolvimento de produtos de maior valor agregado devido ao seu baixo custo e composição química diversificada (Gonçalves et al., 2023). Sua composição é influenciada por fatores como processamento, torrefação e preparo da bebida, resultando em variações nas frações químicas. A BCF contém uma complexa mistura de polissacarídeos (hemicelulose e celulose), lignina, lipídios, proteínas, polifenóis e minerais. Entre esses componentes, os polissacarídeos predominam, correspondendo a cerca de 50% em base seca, sendo seguidos pela lignina (25–33%), lipídios (10–20%) e proteínas (6–14%) (Arya et al., 2022; Bhaturiwala; Modi, 2020). A fração lipídica da BCF contém ácidos graxos de interesse industrial, como linoleico (39–44%), palmítico (30–35%), oleico (7–11%) e esteárico (6–8%), que podem ser utilizados em setores como cosméticos, farmacêuticos e biocombustíveis (Veitía-de-Armas et al., 2024). Já os compostos fenólicos, incluindo ácidos clorogênicos e ácido gálico, apresentam propriedades antioxidantes, antimicrobianas e anti-inflamatórias, tornando-se relevantes para 25 aplicações na indústria farmacêutica (Bouhzam et al., 2023; Solomakou et al., 2022). A diversidade química desses componentes reforça a versatilidade da BCF como matéria-prima. A fração lignocelulósica, que inclui hemicelulose, celulose e lignina, possui características estruturais relevantes para usos industriais. A hemicelulose, predominante na BCF, é formada principalmente por galactomananas, que possuem ampla aplicabilidade em biopolímeros, alimentos e outras indústrias devido à sua estrutura rica em manose e galactose (Nguyen et al., 2019). A alta concentração de mananas na BCF, em comparação com outros resíduos agroindustriais, destaca sua relevância como uma fonte valiosa de carboidratos estruturais (Awasthi et al., 2022). A BCF apresenta grande potencial como matéria-prima em biorrefinarias devido à presença de compostos bioativos, óleos, açúcares, taninos, antioxidantes e cafeína, entre outros. Sua valorização não apenas reduz os impactos ambientais gerados pelo descarte inadequado, mas também promove o desenvolvimento de produtos de maior valor agregado, como biocombustíveis Kamil et al. (2020), biochar Zhang, Shiqi et al. (2021) e compostos funcionais Franca; Oliveira (2022). As biorrefinarias desempenham um papel crucial ao transformar subprodutos agroindustriais, como a BCF, em insumos para setores alimentícios, farmacêuticos e energéticos, contribuindo para uma economia mais sustentável (Forcina et al., 2023) e gerando benefícios econômicos e sociais, como aumento na renda regional e criação de empregos (Murthy; Madhava Naidu, 2012). A introdução da BCF como matéria-prima em biorrefinarias segue uma cascata de valorização, priorizando a obtenção de compostos de alto valor agregado para a indústria farmacêutica, alimentícia e de rações animais. A alta concentração de mananas na fração hemicelulósica da BCF tem atraído atenção para a produção de manano-oligossacarídeos (MOS), com potencial prebiótico e potencial para aplicação como aditivos nutricionais (Sarghini et al., 2021; Tian et al., 2017). Adicionalmente, a crescente demanda por ingredientes naturais e alimentos funcionais reforça a relevância da BCF como uma biomassa promissora. O pré-tratamento adequado dessa biomassa é essencial para transformar a fração lignocelulósica em produtos de maior valor agregado, promovendo uma alternativa sustentável ao seu descarte e contribuindo para o desenvolvimento de novos produtos que serão introduzidos aos portfólios das empresas, construção de novas biorrefinarias e geração de oportunidades de trabalho, especialmente em países em desenvolvimento. Entre os métodos disponíveis, destacam-se os físicos, químicos, físico-químicos e biológicos, cada qual com vantagens e limitações (Baruah et al., 2018). Os métodos físicos, 26 como moagem e ultrassom, são utilizados para reduzir o tamanho das partículas e romper estruturas poliméricas, sendo geralmente etapas preparatórias para outros tipos de pré- tratamento (Li et al., 2022). Já os biológicos, que empregam microrganismos e enzimas, apresentam baixo impacto ambiental, mas possuem limitações como tempos de reação mais longos e a necessidade de controle rigoroso das condições do processo (Awasthi et al., 2022). Os métodos físico-químicos, como explosão a vapor e processos hidrotérmicos, combinam forças mecânicas e reações químicas, proporcionando uma abordagem eficiente, mas com custos energéticos elevados (Baksi et al., 2023; Prasad; Padhi; Ghosh, 2023). O pré-tratamento químico, em especial com ácidos diluídos, é amplamente utilizado devido à sua eficiência na extração da fração hemicelulósica (Li et al., 2022). Este método baseia-se na quebra das ligações glicosídicas entre hemicelulose e celulose, utilizando ácidos inorgânicos e orgânicos. O uso de ácidos diluídos é particularmente vantajoso em escala industrial, pois reduz a formação de compostos inibidores e a corrosão de equipamentos, superando algumas limitações associadas ao pré-tratamento com ácidos concentrados (Lorenci Woiciechowski et al., 2020). Estudos demonstram resultados promissores na obtenção de oligossacarídeos (OS) com diferentes ácidos: Sarghini et al. (2021) obtiveram OS, como trissacarídeos e tetrassacarídeos, utilizando ácido clorídrico; enquanto Jin Cho et al. (2022) utilizaram ácido acético diluído para extrair galactomanana. Outros métodos, como a auto-hidrólise, destacam-se pela ausência de reagentes químicos, mas enfrentam desafios relacionados à eficiência. Apesar de não haver um método único que atenda a todos os critérios ideais de pré- tratamento, o uso de ácidos diluídos sob condições controladas tem se mostrado eficaz na valorização da BCF. Esse processo, além de ser mais econômico e menos corrosivo, permite a extração de oligossacarídeos com propriedades funcionais, que podem ser aplicados nas indústrias alimentícia e farmacêutica. Os prebióticos são classificados como compostos presentes na dieta que não são degradados pelas enzimas do trato digestório humano, além de promoverem benefícios à saúde do paciente através da estimulação do crescimento seletivo de certos microrganismos presentes na microbiota intestinal (Gibson et al., 2004; Tian et al., 2017). Dentre os prebióticos, os oligossacarídeos (OS) têm recebido maior destaque na última década por conseguirem atingir o intestino grosso, promoverem o crescimento da microbiota intestinal e consequentemente liberam metabólitos que controlam diferentes processos fisiológicos (Catenza; Donkor, 2021). 27 Atualmente, os Fruto-oligossacarídeos (FOS) e os Galacto-oligossacarídeos (GOS) são os oligossacarídeos funcionais mais utilizados dentro da indústria de alimentos (Catenza; Donkor, 2021). Além destes dois oligossacarídeos citados, os MOS têm demonstrado ser capazes de atuar e mitigar diversas desordens metabólicas como: diabetes tipo 2, disbiose intestinal, inflamações autoimunes e câncer colorretal (Kango et al., 2022). Contudo, o processo de produção dos MOS através da hidrólise ácida da biomassa não garante que estes possuam características de oligossacarídeos prebióticos. Além disso, a grande maioria dos estudos tem como foco principal a produção dos oligossacarídeos, deixando de lado as avaliações de bioacessibilidade, a biodisponibilidade no trato digestório e quais os impactos na microbiota gastrointestinal (de Carvalho et al., 2023). Porém os testes de bioacessibilidade e de biodisponibilidade são de suma importância quando são avaliados compostos com potenciais prebióticos, isso devido às possíveis interações entre os compostos e a matriz alimentar em que será introduzido, que podem acarretar diferentes resultados quando os ingredientes funcionais interagem com a microbiota intestinal. Assim, a valorização da BCF, por meio de sua caracterização química e da etapa de pré- tratamento eficiente, pode agregar valor a este subproduto e promover uma economia circular (EC) sustentável. A transição de um modelo linear de produção “extrair-produzir-descartar” para a EC é fundamental para mitigar os impactos ambientais e econômicos associados à geração de resíduos, especialmente no setor alimentício, responsável por um terço do desperdício global de alimentos (Schmidt Rivera et al., 2020). Nesse contexto, a valorização de subprodutos, como a BCF, surge como uma estratégia promissora dentro das biorrefinarias, que integram a produção de compostos de maior valor agregado, como fibras alimentares e oligossacarídeos prebióticos. Para otimizar esses processos, a Avaliação do Ciclo de Vida (ACV) desempenha um papel crucial ao quantificar os impactos ambientais e orientar decisões que promovam maior eficiência e sustentabilidade (de Oliveira Fernandes et al., 2025). Dessa forma, a aplicação conjunta da EC, biorrefinarias e ACV fomenta a criação de processos produtivos mais sustentáveis, alinhados aos princípios de redução de resíduos, economia de recursos naturais e contribuição para os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável. Assim este trabalho inova em otimizar o processo de extração de oligossacarídeos a partir da borra de café através do pré-tratamento hidrotérmico e com ácido diluído, identificando os principais parâmetros do processo. Além disso, a otimização dos parâmetros juntamente com as análises de impacto ambiental possibilita identificar condições que sejam ambientalmente mais amigáveis para a sua aplicação em biorrefinarias e consequentemente 28 gerando uma economia circular. Outro ponto de inovação deste trabalho é a introdução dos oligossacarídeos da borra de café em uma matriz hidrogel de pectina e avaliação do impacto sobre a microbiota humana, trazendo uma alternativa de aplicação dos oligossacarídeos obtidos em formulações direcionadas para as indústrias alimentícias e farmacêuticas. Por fim, este trabalho se enquadra dentro das ODS: 3 (Saúde e bem-estar), 9 (Indústria, inovação e infraestrutura) e 12 (Consumo e produção responsável); por produzir composto que promove e diversidade da microbiota, que traz benefícios à saúde humana, a partir de um resíduo agroindustrial, além de desenvolver uma nova forma de aplicação em uma matriz hidrogel. 29 2. REVISÃO DA LITERATURA Nesta seção serão apresentadas as revisões bibliográficas referentes aos temas: produção do café e seus resíduos, caracterização química da borra de café, aplicações da BCF, pré- tratamento da biomassa, Economia Circular (EC) e Avaliação do ciclo da vida (ACV), Oligossacarídeos (OS) e suas bioatividades, avaliação da bioacessibilidade, biodisponibilidade, e fermentação colônica. 2.1. PRODUÇÃO DE CAFÉ E SEUS RESÍDUOS O café está entre as principais commodities negociadas ao redor do mundo, além de ser uma das bebidas mais apreciadas (Yeoh; Ng, 2022). As espécies Coffea arabica (Arábica) e Coffea canephora (Robusta) são as duas principais espécies cultivadas nos países produtores, sendo o cultivo da variedade Arábica correspondente à aproximadamente 62,4% do total de grãos produzidos e da variedade Robusta, os 37,6% restantes, durante a safra de 2023/2024 (ICO, 2024). O cultivo desta commodity é impactado diretamente pelas condições regionais como: temperatura do ar, precipitação da chuva, déficit de água, fotoperíodo e incidência da radiação solar, sendo a temperatura do ar e o déficit de água os fatores mais impactantes por interferirem nos processos fisiológicos da planta (Lorençone et al., 2023). Por ser uma das principais commodities e ser dependente das condições regionais, a produção e exportação dos grãos de café possuem um grande impacto no Produto Interno Bruto (PIB) e na balança comercial dos países produtores (Al-Abdulkader et al., 2018; Lorençone et al., 2023). As regiões da América do Sul e Ásia são as principais exportadoras de café, sendo o Brasil, o Vietnam e a Colômbia os principais países exportadores e sendo responsáveis por exportarem na safra de 2023/2024 respectivamente 49,03 milhões de sacas (1 saca = 60 kg), 24,96 milhões de sacas e 11,91 milhões de sacas (ICO, 2024). Ou seja, as principais regiões produtoras são caracterizadas pela presença de países em desenvolvimento, enquanto os principais mercados consumidores são caracterizados por economias desenvolvidas (Vegro; de Almeida, 2020). O processamento dos grãos de café para a produção dos grãos verdes, que representaram 90,1% do total de sacas exportadas na safra de 2023/2024 (ICO, 2024), pode ser realizado através dos métodos por via seca ou por via úmida. O processamento pela via seca é um processo mais tradicional, de menor complexidade, haja visto que os grãos de café são secos ao sol e posteriormente são enviados para os descascadores para a remoção da casca e da polpa 30 (Hoseini et al., 2021). Enquanto o processamento pela via úmida produz um café de maior qualidade e possui diversas etapas, incluindo uma etapa de fermentação microbiológica, que são responsáveis por remover a polpa, o pergaminho e mucilagem, e consequentemente utiliza grandes quantidade de água (Mussatto et al., 2011b). Ademais, em países como: Alemanha, Bélgica, Estados Unidos e Itália, os grãos de café verdes são transformados em produtos de maior valor agregado (café torrado, café solúvel e cápsulas), que representaram 9,9% do total de sacas exportadas na safra de 2023/2024 (ICO, 2024), e são novamente exportados (reexportação), gerando mais oportunidades de trocas comerciais (Vegro; de Almeida, 2020). Entretanto, o processamento dos grãos de café e a produção do café solúvel são responsáveis pela geração de resíduos como: grãos defeituosos, pele de prata, polpa, casca e borra do café (Hoseini et al., 2021). A BCF se caracteriza como sendo um dos principais resíduos da produção agroindustrial do café, sendo gerada pelo consumo do café como bebida em restaurantes, cafeterias especializadas e nas casas, e pela produção industrial do café solúvel (Jin Cho et al., 2022; Murthy; Madhava Naidu, 2012; Sarghini et al., 2021). Estima-se que anualmente a quantidade gerada de BCF seja de aproximadamente 20 milhões de toneladas em base úmida ou 9 milhões de toneladas em base seca (Kafková et al., 2023), sendo que aproximadamente 0,91 tonelada de BFC, em base seca, são produzidas para cada 1 tonelada de grãos torrados de café (Singh et al., 2023) e para cada 1 tonelada de café instantâneo produzido, são geradas 2 toneladas de BFC em base úmida (Forcina et al., 2023). Toda essa quantidade gerada de BFC anualmente é em sua maioria enviada diretamente para os aterros sanitários, junto com os resíduos sólidos urbanos, devido ao baixo potencial de aproveitamento deste subproduto como fertilizante, ração para animais de criação ou compostagem (Jin Cho et al., 2022). Levando em consideração que o custo de operação de um aterro sanitário seja entre US$ 20 – 40 por tonelada de resíduo sólido urbano (Werderits Silva; da Silva César; Conejero, 2021), o descarte deste subproduto agroindustrial, em base úmida, resultaria em um custo anual entre US$ 400 – 800 milhões. Além do impacto financeiro, o descarte inadequado da BFC em aterros proporciona preocupações quanto aos impactos ambientais gerados por essa atividade, isso porque a borra contém compostos que podem contaminar o solo, como: os polifenóis, a cafeína, taninos (Mussatto et al., 2011b; Sanjay Gurav; Mudoi, 2022; Sarghini et al., 2021), além de possuir uma alta umidade e a presença de fenóis livres (Murthy; Madhava Naidu, 2012). E estes impactos causam ainda mais preocupações nos países em desenvolvimento (Tian et al., 2017), 31 devido a gestão adequada dos resíduos e a construção de aterros sanitários não serem uma realidade para toda a população (Werderits Silva; da Silva César; Conejero, 2021). Desta forma, há a necessidade de se buscar rotas alternativas para o aproveitamento e valorização desta biomassa, que hoje é considerada um resíduo agroindustrial, de forma a produzir produtos de maior valor agregado, diminuindo o descarte da borra em aterros sanitários e consequente os impactos econômicos e ambientais gerados (Murthy; Madhava Naidu, 2012; Sarghini et al., 2021; Zhao et al., 2024). E o primeiro passo para esta valorização é a caracterização química da BFC, possibilitando entender quais compostos podem ser extraídos, os custos de obtenção de cada composto, suas aplicações, os parâmetros de escalabilidade do processo e a viabilidade econômica de cada rota. 2.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA BORRA DE CAFÉ A grande quantidade de subprodutos agroindustriais gerados anualmente, entre eles a BFC, representa um potencial fonte de matéria-prima de baixo custo para a produção de compostos de maior valor agregado (Gonçalves et al., 2023), e para isso a caracterização química destes materiais é de extrema importância para identificar possíveis aplicações. Como foi citado anteriormente, a composição dos grãos de café sofre a interferência das condições regionais durante o seu cultivo. No caso da BFC, a sua composição química também pode variar de acordo com o processamento do grão, da torrefação e do preparo da bebida (Machado et al., 2023). Fazendo com que diferentes estudos obtenham valores diferentes para cada uma das frações. A BFC possui uma estrutura complexa e por isso contém uma variedade de componentes como: polissacarídeos (hemicelulose e celulose), lignina, polifenóis, proteínas, lipídios e minerais (Arya et al., 2022; Bhaturiwala; Modi, 2020; Machado et al., 2023; Nguyen et al., 2019). Os polissacarídeos são os compostos majoritários da BFC correspondendo a aproximadamente 50% (m/m) em base seca, onde a hemicelulose representa 30 – 40% (m/m) e a celulose 8 – 13% (m/m), seguidos pela lignina (25 – 33 % m/m), lipídios (10 – 20 % m/m), proteínas (6 – 14 %), polifenóis (2 – 3% m/m) e menores quantidades de minerais (Arya et al., 2022; Bhaturiwala; Modi, 2020; Sharma; Ray; Singhal, 2021). Uma das frações mais relevantes da BFC são os lipídios, os estudos de Go et al. (2020), Sharma, Ray e Singhal, (2021) e Veitía-de-Armas et al. (2024), determinaram os principais ácidos graxos presentes na fração lipídica da BFC. Os pesquisadores identificaram que os ácidos linoleico (39 – 44% m/m) e palmítico (30 – 35,0% m/m) são os principais ácidos graxos 32 presentes, seguidos pelos ácidos oleico (7 – 11% m/m) e esteárico (6 – 8% m/m), e menores concentrações dos ácidos araquidônico, docosanoico e heptadecenóico. Por conter os ácidos oleico, linoleico e palmítico, a fração lipídica da BFC pode ser utilizada nas indústrias de cosmético, farmacêutica, nutricional e biocombustíveis (Veitía-de-Armas et al., 2024). Outra classe de compostos encontrados na BFC são os compostos fenólicos, estes compostos são metabólitos secundários encontrados em plantas e podem possuir apenas 1 anel fenólico (ácidos fenólicos) ou múltiplos anéis fenólicos (polifenóis) (Zhao et al., 2024). Estes compostos são de grande interesse, principalmente para as indústrias farmacêuticas, por apresentarem naturalmente propriedades como: antioxidante, antialérgica, antimicrobiana, antidiabético, anti-inflamatória, entre outras (Bouhzam et al., 2023; Caballero-Galván et al., 2018; Gil-Martín et al., 2022; Solomakou et al., 2022). Dentre os compostos fenólicos presentes na BFC, os ácidos clorogênicos (ACGs) e o ácido gálico são os que estão presentes em maiores concentrações, respectivamente (Abbasi- Parizad et al., 2021; Rodrigues da Silva et al., 2022). E os principais grupos dos ACGs presentes na BFC são: ácidos cafeoilquínicos, ácidos dicafeoilquínicos, ácidos feruloilquínicos, ácidos p- cumaroilquínicos e ácidos cafeoilferuloilquínicos (Bouhzam et al., 2023). A fração lignocelulósica, apresentada na Figura 1, é a porção mais abundante na BCF e é composta pela hemicelulose, celulose e lignina, e esta estrutura contendo esses três componentes está fortemente associada devido a ligações não covalentes e covalentes (Baruah et al., 2018). Figura 1 - Estrutura da fração lignocelulósica, composta pela hemicelulose, celulose e lignina. Fonte: Adaptado de Jensen et al. (2017). A celulose possui uma estrutura cristalina formada por camadas de glicose ordenadamente empilhadas, formando uma estrutura rígida com interações intra- e intermoleculares através das ligações de hidrogênio nas cadeias celulósicas e interações de Van der Waals entre as cadeias (Ávila et al., 2021). Além disso, a celulose é constituída de cadeias 33 poliméricas com grau de polimerização entre 4000 e 6000 monômeros, que é um fator importante para a característica recalcitrante do material lignocelulósico (Chakraborty et al., 2024). A lignina possui uma estrutura fenólica altamente polimerizada e interpola a celulose e a hemicelulose (Baruah et al., 2018). Esta estrutura possui um grau de polimerização entre 450 e 550 unidades, e é composta principalmente por três álcoois 4-hidroxicinamil que contêm compostos aromáticos como: p-hidroxifenil, siringil e guaiacil (Chakraborty et al., 2024). Além disso, ela possui um papel importante na proteção das plantas com relação a proteção contra patógenos e insetos, bem como no fortalecimento das estruturas de crescimento das plantas (Li et al., 2022). A hemicelulose é a estrutura de maior relevância na borra de café por ser a que possui a maior proporção dentre todas as frações, como foi citado anteriormente. Esta possui uma estrutura hetero polimérica com grau de polimerização entre 100 e 200 unidades de monossacarídeos (Chakraborty et al., 2024) e é composta por principalmente hexoses (manose e galactose) e pentoses (arabinose e xilose) (Jin Cho et al., 2022), podendo ser ramificadas ou não. Com relação a esta estrutura hetero polimérica, esta é formada pelas arabino- galactomananas de tipo II e as galactomananas (Nguyen et al., 2019; Simões et al., 2010; Tian et al., 2017), esta última representa cerca de 20 – 30% da borra em base seca (Bhaturiwala; Modi, 2020). Tendo principalmente a manose e a galactose como os açúcares monoméricos principais das cadeias poliméricas (Tian et al., 2017). As galactomananas são mananas que possuem mais de 5% de galactoses em sua cadeia, além de serem compostas por uma cadeia linear de manoses ligadas entre si por ligações β(1- 4) com ramificações formadas por galactoses no carbono C-6, o grau de polimerização e a relação manose:galactose varia de acordo com a fonte e por isso a proporção manose:galactose podem variar de 1:1 à 4:1 (Singh; Singh; Arya, 2018; Voiniciuc, 2022). Enquanto as arabino- galactomananas de tipo II são caracterizadas pela presença de resíduos de galactose ligados por interações (1→3)- e (1→3,6)-, assim como resíduos de arabinose ligados por interações (1 → 5), aproximadamente 3% (Simões et al., 2010). Além disso, em estudo realizado com o café torrado, (Moreira; Filho, 2008) determinaram a composição dos grupos acetil, galactose e arabinose presentes nas cadeias de mananas, estimando as concentrações de galactose e arabinose em 3,2 mol% e 0,9 mol%, respectivamente. Além da BCF, outros resíduos agroindústrias também possuem majoritariamente mananas em sua estrutura lignocelulósica, os principais são: o farelo de coco, a palha de milho, 34 a casca da batata e a torta de palma (Awasthi et al., 2022). Quando comparada com outras fontes de mananas, a fração hemicelulósica da borra de café possui aproximadamente 39% em base seca de mananas, enquanto a torta de palma (dendê) e o farelo do coco que possuem 57% e 21%, respectivamente (Singh; Ghosh; Goyal, 2018), o que demonstra que a BCF está entre as principais fontes de mananas e consequentemente manose. A Tabela 1 apresenta a concentração de manose presente em diferentes resíduos agroindustriais. Desta forma, a borra de café apresenta um grande potencial para ser usada com matéria-prima no desenvolvimento de produtos de alto valor agregado. Tabela 1 - Teor de manose de diferentes resíduos agrícolas. Os dados são expressos em porcentagem de peso, em uma base seca. Matéria prima Manose (g/100 g) Referências Sementes de açaí 47,09 Monteiro et al. (2019) Farelo de coco 46,67 Antia et al. (2023) Torta de palma 39,23 Antia et al. (2023) Borra de café 19,07 Ballesteros; Teixeira; Mussatto (2014) Madeira de Pinus pinaster 12,30 López et al. (2020) Pinheiro radiata 11,30 Otieno, Daniel Obed e Ahring (2012) Fonte: Elaborada pelo Autor (2025). 2.3. APLICAÇÕES DA BORRA DE CAFÉ A borra de café, devido a presença de compostos bioativos, óleos, açúcares, taninos, corantes, antioxidantes, cafeína entre outros compostos que podem ser extraídos, tem grande potencial para ser introduzida como matéria-prima dentro de uma biorrefinaria, dando, ao que atualmente é considerado um resíduo, uma destinação mais adequada e reduzindo os impactos ambientais gerados pelo alto volume de material descartado e pelo descarte inadequado. As biorrefinarias são responsáveis por transformar subprodutos dos setores alimentícios e agroindustriais, como a BCF, em produtos de maior valor agregado através de iniciativas que visam uma produção mais sustentável (Forcina et al., 2023). Além disso, o desenvolvimento de biorrefinarias contribui para o desenvolvimento de uma economia mais sustentável, gerando empregos, aumentando a renda da região onde estas biorrefinarias forem instaladas e aumentando o ciclo de vida da borra de café (Murthy; Madhava Naidu, 2012). Nos últimos anos a BCF vem sendo mais explorada por pesquisadores, e este interesse está relacionado com 4 fatores principais: a composição química da BCF, que pode gerar matérias-primas para as indústrias alimentícia, farmacêutica e de energia (Sanjay Gurav; Mudoi, 2022; Sharma; Ray; Singhal, 2021), também devido ao fato da quantidade que é gerada desta biomassa (aproximadamente 1,88 kg de BCF úmida por kg de grãos de café consumidos) (Schmidt Rivera et al., 2020), por ser uma biomassa disponível em diversas localidades, e por 35 ser uma biomassa que não possui problemas quanto a sazonalidade (Rajabi Hamedani et al., 2022). A primeira abordagem é o aproveitamento da borra de café como matéria-prima na produção de biocombustíveis, passando por processos de extração, transesterificação, hidrólise, fermentação e pirólise, é possível obter biogás, biodiesel, biochar, bio-óleo, pellets e bioetanol (Franca; Oliveira, 2022; Kamil et al., 2020; Nguyen et al., 2019; Zhang, Shiqi et al., 2021). No entanto, de acordo com a “cascata de valorização da biomassa” apresentada na Figura 2, as rotas de valorização das correntes de resíduos devem priorizar a produção de compostos para as indústrias farmacêutica, alimentícia e de ração animal, respectivamente, devido ao seu maior valor agregado. Seguindo essa perspectiva, a indústria de alimentos também pode se beneficiar da valorização da borra de café em biorrefinarias. Isso porque esta biomassa é uma fonte em potencial de compostos funcionais, compostos estes que possuem ações anti-oxidante, prebiótica e anti-inflamatória (Arya et al., 2022; Sharma; Ray; Singhal, 2021). Ademais, com a crescente demanda por alimentos mais saudáveis e que possuam em suas formulações ingredientes naturais, a indústria de alimentos vem se reinventando para atender as demandas do mercado e o aproveitamento da BCF para a obtenção de compostos funcionais sem competir com a produção de alimentos é a grande chave para o sucesso (Ávila et al., 2021; Sarghini et al., 2021). Um exemplo prático do aproveitamento integral da borra de café através do processamento em biorrefinarias é a comercialização de fibras de café modificadas pela empresa AQIA, que possui aplicações nas indústrias farmacêuticas e de alimentos (Strieder et al., 2023). Além disso, algumas startups têm desenvolvido projetos de aproveitamento da borra de café com o objetivo de atender as indústrias de alimentos e cosméticos como por exemplo: a startup Kaffe Bueno (óleo, farinha sem glúten e fibras), UpCicle (cosméticos) e GroCycle (substrato para crescimento de cogumelos) (Best Coffee, 2021). 36 Figura 2 - Cascata de valorização da biomassa de acordo com o valor agregado de cada setor. Fonte: Adaptado de Lange et al. (2012). Devido ao alto teor de mananas presente na fração hemicelulósica, a BCF vem ganhando destaque para o seu aproveitamento na produção de oligossacarídeos, no caso da borra de café, os manano-oligossacarídeos (MOS) (Bhaturiwala; Modi, 2020; Nguyen et al., 2019; Sarghini et al., 2021; Tian et al., 2017). Estes oligossacarídeos possuem propriedades prebióticas (Arya et al., 2022), podendo ser utilizados na forma integral, pela indústria farmacêutica, ou como um aditivo nutricional em produtos alimentícios (Sarghini et al., 2021). Assim, conhecer a estrutura geral da porção hemicelulósica é de extrema importância para se prever a composição de hexoses e pentoses dos mono- e oligossacarídeos presentes no hidrolisado. Desta maneira, por conta da fração lignocelulósica possuir uma estrutura complexa e estarem presentes compostos que tenham potencial para serem utilizados como percursores de produtos de alto valor agregado, é necessário aplicar um método de pré-tratamento da borra de café que seja capaz de extrair a matiz hemicelulósica da fração lignocelulósica e transformar a cadeia polimérica da hemicelulose em compostos de maior valor agregado. 2.4. PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA A primeira e essencial etapa para promover a valorização da BCF é realizar testes em escala de laboratório para avaliar diferentes rotas de valorização, alinhadas com avaliações técnicas, econômicas e ambientais para determinar as alternativas mais viáveis (Ingrao et al., 2022). Pela visão de uma biorrefinaria, o processamento da biomassa deve tentar recuperar ao máximo todos os compostos disponíveis na biomassa para que possam ser transformados em Fármacos Nutrição humana e animal Bioplásticos e polímeros Compostos químicos e combustíveis Energia e calor 37 produtos de maior valor agregado, sem gerar novos resíduos provenientes do processo de aproveitamento. As etapas de extração e recuperação dos compostos do material lignocelulósico irão depender da origem da matéria-prima e devem primeiramente recuperar compostos que serão destinados a produção de fármacos ou alimentos, para evitar possíveis contaminações, e posteriormente os compostos de maior valor agregado (Mata; Martins; Caetano, 2018). Desta forma, o pré-tratamento é um processo vital quando buscamos o aproveitamento integral da biomassa lignocelulósica. Principalmente quando o objetivo é poder introduzir a biomassa, neste caso a BCF, como matéria-prima para biorrefinarias. Nesse âmbito o método de pré-tratamento ideal deve ser capaz de cumprir três objetivos principais: (1) produzir oligo- ou monossacarídeos com alta eficiência de extração da matriz hemicelulósica; (2) ser capaz de reduzir os custos de operação através da redução do tempo de reação e diminuir os processos de downstream; (3) remover a lignina, lipídios e outros compostos que não sejam açúcares (Nguyen et al., 2019). Entretanto, não há nenhum método de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica que consiga atender idealmente todos os 3 objetivos, sendo necessário escolher o pré-tratamento de acordo com as propriedades da biomassa que será utilizada, provenientes das análises de caracterização, para obter a máxima eficiência do pré-tratamento (Li et al., 2022). Atualmente os métodos de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica podem ser classificados, principalmente em: físico (moagem, micro-ondas, ultrassom, extrusão), químico (ácidos, bases, solventes e compostos oxidantes), físico-químico (explosão por vapor, CO2 supercrítico, hidrotérmicos e explosão da fibra por amônia) e biológico (enzimático, microrganismos e enzimas imobilizadas) (Awasthi et al., 2022; Baruah et al., 2018). Os métodos físicos de pré-tratamento são baseados no princípio da redução do tamanho das partículas, através da moagem mecânica ou da radiação, fazendo com que haja a quebra das ligações intramoleculares presentes nas estruturas poliméricas das frações celulósica, hemicelulósicas e da lignina (Li et al., 2022). Entretanto, estes métodos são geralmente utilizados como uma etapa prévia ou de coprocessamento de pré-tratamentos químicos, físico- químicos ou biológicos (Chakraborty et al., 2024). Por conta da estrutura complexa e rígida da biomassa lignocelulósica, o fracionamento desta necessita além do remodelamento físico, de reações químicas. Nesse quesito, os métodos de pré-tratamento físico-químicos contemplam tanto as forças de cisalhamento, que remodelam a estrutura, quanto reação químicas (Prasad; Padhi; Ghosh, 2023) e estes métodos podem ser 38 realizados utilizando tanto por líquidos, quanto por vapor à altas temperaturas (Baksi et al., 2023). Os métodos que utilizam vapor para realizar o fracionamento da fração lignocelulósica, operam em faixas de temperatura entre 60 e 260 °C, e a altas pressões (6,9–48,3 bar), fazendo com que as moléculas dos reagentes vaporizados penetrem na estrutura da biomassa e a rápida liberação do vapor, faz com que haja o rompimento das fibras (Baruah et al., 2018). No caso dos métodos hidrotérmicos, estes são realizados entre 150 e 230 °C, a pressões que variam entre 4,9 e 20 bar, e o princípio fundamental é a autoionização da água em H3O + (Baksi et al., 2023). Os métodos biológicos de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica geralmente utilizam bactérias, fungos, uma combinação de microrganismos, ou as enzimas produzidas por estes microrganismos (Prasad; Padhi; Ghosh, 2023). Existem dois sistemas enzimáticos extracelulares envolvidos nos microrganismos, um sistema hidrolítico (responsável pela degradação da celulose e das hemiceluloses) e outro ligninolítico (responsável por despolimerizar a lignina) (Baruah et al., 2018). Estes métodos são considerados os de menores impactos ao meio ambiente, por não usar reagentes químicos e por raramente produzir subprodutos (Basak et al., 2023). Entretanto, o pré-tratamento biológico é principalmente influenciado por fatores como: condições físicas (temperatura, tamanho das partículas), químicas (pH) e biológicas (bactérias ou fungos) (Prasad; Padhi; Ghosh, 2023), além de que os processos enzimáticos necessitam de um processo prévio de remoção de impurezas e controles da viscosidade e da densidade do hidrolisado, o que se caracteriza como uma desvantagem em relação à hidrólise química que não possui a necessidade deste processo adicional (Du et al., 2011). Os métodos de pré-tratamentos químicos geralmente são baseados na modificação da estrutura cristalina da celulose e na remoção das frações de hemicelulose e lignina da biomassa utilizando diferentes reagentes químicos, incluindo ácidos, bases, solventes e outros compostos oxidantes (Sai Bharadwaj et al., 2023). O pré-tratamento químico é o método comumente utilizado em processos industriais devido a sua simplicidade de aplicação e operação, e por serem métodos que possuem alta eficiência (Li et al., 2022). Entretanto, estes métodos possuem comumente duas desvantagens principais: a geração de inibidores e a necessidade da neutralização dos resíduos gerados (Basak et al., 2023). Com relação aos métodos de pré-tratamento alcalinos, estes são frequentemente utilizados quando o foco é a solubilização da lignina, e o hidróxido de sódio é o reagente que possui a maior eficiência (Chakraborty et al., 2024). A solubilização da lignina e de fragmentos dá hemicelulose ocorre devido à reação de saponificação entre o reagente alcalino e as lições 39 intermoleculares de ésteres presentes entre a lignina e a hemicelulose, causando a quebra destas ligações (Baruah et al., 2018). Por outro lado, quando o foco do pré-tratamento é a extração da fração hemicelulósica, os métodos químicos utilizando ácidos diluídos são os mais utilizados, principalmente pela capacidade dos ácidos em quebrar as ligações glicosídicas entre as porções hemicelulósicas e celulósicas devido a presença dos íons hidrônios formados em solução, que rompem estas ligações (Baruah et al., 2018). A Tabela 2 apresenta um resumo das vantagens e desvantagens dos principais métodos de pré-tratamento de biomassas lignocelulósicas. Tabela 2 - Vantagens e desvantagens dos principais métodos de pré-tratamento de biomassas lignocelulósicas. Métodos de pré- tratamento Vantagens Desvantagens Referências Físicos: Moagem Aumenta a área superficial; Não há a produção de inibidores; Redução do grau de polimerização da celulose; Tempo operacional curto. Alto consumo energético; Alto custo dos equipamentos. Prasad, Padhi e Ghosh (2023) Micro- ondas Baixo consumo energético; Tempo operacional curto; Fácil operação; Mínima formação de inibidores. Baixa penetração na estrutura lignocelulósica. Necessidade de processos de pré-tratamento adicional. Baruah et al. (2018) Ultrassom Tempo operacional curto; Processo seguro; Baixo consumo de reagentes. Alto consumo energético; Necessidade de processos de pré-tratamento adicional. Li et al. (2022) Extrusão Mínima formação de inibidores e compostos de degradação; Processo de fácil escalabilidade; Não utiliza reagentes. Controle da temperatura inadequado; Alto consumo energético; Alto custo de operação; Necessidade de processos de pré-tratamento adicional. Chakraborty et al. (2024) Químicos: Ácido Alta solubilização da hemicelulose e parcial da lignina; Tempo de reação curto; Adequado para biomassas com baixo teor de lignina. Processo é perigoso; Causa corrosão dos equipamentos; Formação de compostos inibidores. Prasad, Padhi e Ghosh, (2023) 40 Ácido diluído Alta solubilização da hemicelulose e parcial da lignina; Menor formação de compostos inibidores; Processo de fácil escalabilidade; Menor corrosão dos equipamentos. Formação de compostos inibidores; Corrosão dos equipamentos; Alto custo de recuperação do ácido. Lorenci Woiciechowski et al. (2020); Pasquier, du, Paës e Perré (2023) Alcalino Alta eficiência de remoção da lignina; Aumento da área superficial; Diminuição do grau de polimerização e cristalinidade. Tempo de residência longos; Alto custo de recuperação dos reagentes. Baruah et al. (2018) Líquidos Iônicos Baixa ou pouca formação de inibidores; Diminuição da cristalinidade da celulose recuperada; Recuperação da lignina. Alto custo dos reagentes; Processos de downstream complexos. Prasad, Padhi e Ghosh (2023) Solventes orgânicos Recuperação de lignina de alta qualidade; Fácil recuperação dos solventes. Necessidade de secagem e recuperação dos solventes; Formação de furfural; Alto custo dos solventes; Necessidade de condições controlada de operação. Baksi et al. (2023) Ozônio Não a formação de inibidores; Reação ocorre em condições ambiente; Separação efetiva da lignina. Grande quantidade de ozônio requerida; Alto custo operacional. Li et al. (2022); Prasad, Padhi e Ghosh, (2023) Físico- químicos: Explosão por vapor Não utiliza reagentes químicos; Baixo impacto ambiental; Alta eficiência energética; Não é preciso reciclar os reagentes. Alto tempo de residência; Formação de inibidores; Baixa remoção da lignina; Depende da umidade da biomassa; Dependente do tamanho das partículas. Baruah et al. (2018) CO2 supercrítico Baixo impacto ambiental; Não há a formação de inibidores; Altas taxas de conversão. Necessidade de altas pressões; Alto custo de operação. Chakraborty et al. (2024) Hidrotérmicos Não utiliza catalizadores ou reagentes; Baixa eficiência energética; Alto consumo de água; Li et al. (2022) 41 Processo de fácil operação; Processo de baixo custo. Baixo rendimento dos produtos. Explosão da fibra por amônia Tempo de reação curto; Baixa formação de inibidores. Parcialmente quebra a lignina e a hemicelulose; Alto consumo de amônia; Não recomendado para biomassas com alto teor de lignina; Promove a corrosão dos equipamentos. Li et al. (2022); Prasad, Padhi e Ghosh (2023) Biológicos: Bactérias Baixo consumo energético; Não utiliza catalisadores ou reagentes; Não há formação de inibidores; Ambientalmente amigável. Longo tempo de reação; Necessidade da remoção da lignina; Hidrólise parcial de hemicelulose; Consumo dos açúcares do meio reacional; Influenciado por parâmetros físicos. Baksi et al. (2023); Sai Bharadwaj et al. (2023) Fungos Baixo consumo energético; Não utiliza catalisadores ou reagentes; Capaz de degradar lignina, celulose e hemicelulose de acordo com as espécies; Não há formação de inibidores; Ambientalmente amigável. É preciso diferentes espécies para diferentes biomassas; Longo tempo de reação; Aumento dos custos operacionais; Maior risco de contaminção Baksi et al. (2023); Sai Bharadwaj et al. (2023) Fonte: Elaborada pelo Autor (2025). Além disso, o pré-tratamento realizado visando a extração da porção hemicelulósica por ácido é favorecido, principalmente em escala industrial, em relação aos métodos que utilizam solventes orgânicos, por conta do alto custo dos solventes, da necessidade de recuperar, formação de compostos tóxicos e reciclar os solventes após a hidrólise; em relação ao método de explosão a vapor devido a solubilização parcial da hemicelulose, e em relação a auto hidrólise devido ao alto consumo energético (Lorenci Woiciechowski et al., 2020). Em geral, podem ser utilizados diferentes ácidos orgânicos como: ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico e ácido málico; e inorgânicos: ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e ácido clorídrico (Awasthi et al., 2022). Os ácidos inorgânicos vêm sendo estudados extensivamente com o objetivo de extrair a hemicelulose de biomassas lignocelulósicas, 42 permitindo que estes ácidos possam ser aplicados em processos industriais em razão da maior compreensão do modo de ação e das suas vantagens e desvantagens. Dentre os ácidos inorgânicos citados, o ácido sulfúrico é preferencialmente utilizado, isso porque ele é mais barato comparado aos ácidos nítrico e fosfórico, além de ser menos nocivo aos equipamentos industriais (Lorenci Woiciechowski et al., 2020), aumentando sua eficiência econômica em relação aos outros ácidos inorgânicos. Apesar do processo de pré-tratamento ácido ser demasiadamente eficiente na extração da fração hemicelulósica de biomassas lignocelulósicas, este processo possui uma desvantagem, que é a formação de compostos indesejados, inibidores e compostos corrosivos que acabam deteriorando os equipamentos (Yue et al., 2022). Entre os compostos inibidores formados, pode-se citar os mais relevantes: furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF), ácido acético, ácidos fenólicos e aldeídos (Baruah et al., 2018). O ácido acético, o 5-HMF e o furfural são conhecidos por serem inibidores de micro- organismos, principalmente de leveduras que utilizam o hidrolisado como meio fermentativo, provocando a piora no rendimento da fermentação quando estes compostos estão acima de 2,0 g/L, 1,0 g/L e 1,0 g/L, respectivamente (Lorenci Woiciechowski et al., 2020). Entretanto, esta desvantagem pode ser superada utilizando ácidos diluídos, ou seja, reações mais brandas, fazendo com que a corrosão dos equipamentos seja menor, além de diminuir a formação de compostos indesejados como o furfural, ácido acético e o 5-HMF. Diversos estudos verificaram a eficiência da etapa de pré-tratamento da borra de café com o intuito de determinar quais as melhores condições de extração da hemicelulose e aproveitamento desta biomassa. Jin Cho et al. (2022) utilizou diversas etapas com o objetivo de fazer o aproveitamento integral da borra de café, a extração da hemicelulose foi realizada através da hidrólise com ácido acético diluído, os autores diminuíram a concentração total de açúcares de 49,22% para 42,93% em base seca devido a extração da galactomanana presente na hemicelulose. Sarghini et al. (2021) realizou a hidrólise ácida com ácido clorídrico, tendo resultados promissores quanto a produção de OS, principalmente trissacarídeos (71,60 – 79,23% m/m), tetrassacarídeos (15,75 – 20,14% m/m) e pentasacarídeos (4,59 – 7,41% m/m). Em outro estudo, Ballesteros, Teixeira e Mussatto (2017) fizeram a auto hidrólise da borra de café e obtiveram um rendimento de 29,29% (g/g) de polissacarídeos quando aplicaram a condição otimizada, a 160°C, por 10 min e uma relação sólido/líquido de 1 g:15 ml. Entretanto, até o momento, não foram encontrados na literatura estudos que tenham avaliado o uso de ácido sulfúrico no pré-tratamento da borra de café com o objetivo de obter oligossacarídeos (OS). 43 2.5. ECONOMIA CIRCULAR (EC) E ANÁLISE DO CICLO DE VIDA (ACV) Desde a revolução industrial, as empresas têm seguido um processo de produção linear tradicional, também conhecido pelo seu modelo de produção que consiste em “extrair-produzir- descartar”, no qual as matérias-primas são extraídas de recursos naturais, transformadas em produtos consumíveis e descartadas ao final de sua vida útil (Neves; Marques, 2022). O processo de produção linear tem causado a degradação ambiental, em grande parte devido à geração de resíduos e às emissões de gases de efeito estufa (Neves; Marques, 2022; Talekar et al., 2023; Tiwari; Si Mohammed, 2024). A geração de resíduos do setor alimentício, que representa aproximadamente um terço do total de alimentos produzidos, tem recebido maior atenção nas últimas décadas devido às suas implicações financeiras (estimadas em aproximadamente US$ 990 bilhões) e ao seu impacto ambiental (equivalente a 3,3 bilhões de toneladas de CO2) (Patel et al., 2019). Além disso, à medida que a população global cresce, a demanda por recursos alimentares continuará a aumentar (Gusmerotti et al., 2019). Consequentemente, os resíduos produzidos se tornaram uma preocupação econômica e ambiental significativa, com projeções indicando que poderão chegar a 3,40 bilhões de toneladas até 2030 (Talekar et al., 2023). Dessa forma, para mitigar esses possíveis danos, é necessário adotar uma metodologia sustentável que incorpore o gerenciamento e a valorização de resíduos. Isso pode ser feito transformando os subprodutos do setor alimentício, os resíduos agroindustriais e da pecuária em produtos de maior valor agregado (Forcina et al., 2023; Rajabi Hamedani et al., 2022; Schmidt Rivera et al., 2020). Esta valorização está alinhada com o novo modelo econômico que foi denominado como EC, que tem um potencial significativo para abordar os problemas ambientais e econômicos associados ao paradigma tradicional de produção “extrair-produzir- descartar” (Neves; Marques, 2022; Tiwari; Si Mohammed, 2024). O conceito de EC é abrangente e considera todos os setores da sociedade. A premissa fundamental desse modelo é estabelecer ciclos de retroalimentação nos quais os fluxos de resíduos são reintegrados ao processo de produção, com o objetivo de prolongar a retenção de materiais e recursos dentro do próprio processo de produção. Isso, por sua vez, serve para reduzir a geração de resíduos e os impactos ambientais associados (Grafström; Aasma, 2021; Ren; Albrecht, 2023; Schmidt Rivera et al., 2020). A transição do conceito de produção linear para o circular é realizada seguindo os princípios dos 10 Rs (recuperar