UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA VICTOR GUSTAVO BALERA BRITO MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PERDA ÓSSEA ALVEOLAR INDUZIDA PELA DOENÇA PERIODONTAL EM RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS: PAPEL DO SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA E MICRORNAS ARAÇATUBA 2023 VICTOR GUSTAVO BALERA BRITO MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PERDA ÓSSEA ALVEOLAR INDUZIDA PELA DOENÇA PERIODONTAL EM RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS: PAPEL DO SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA E MICRORNAS Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para obtenção do título de Doutor em Ciências Fisiológicas. Orientadora: Prof.ª Tit. Sandra Helena Penha de Oliveira ARAÇATUBA 2023 Catalogação na Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Brito, Victor Gustavo Balera. B862m Mecanismos envolvidos na perda óssea alveolar indu- zida pela doença periodontal em ratos espontaneamente hipertensos : papel do sistema renina-angiotensina e microRNAs / Victor Gustavo Balera Brito. – Araçatuba, 2023 190 f. : il. ; tab. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profa. Sandra Helena Penha de Oliveira 1. Doenças periodontais 2. Hipertensão 3. Sistema renina-angiotensina 4. Inflamação 5. MicroRNAs I. T. CDD 612 Claudio Hideo Matsumoto CRB-8/5550 unespl!r ERRATA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ':JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Campus de Araçatuba BRITO, V. G. B. Mecanismos envolvidos na perda óssea alveolar induzida pela doença periodontal em ratos espontaneamente hipertensos: Papel do sistema renina­ angiotensina e microRNAs. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araçatuba, 2023. Folha Linha Onde se lê 1 Leia-se 10 4 A Fundação de Amparo à A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de concessão da bolsa de doutorado, da bolsa de estágio doutorado (2018/23676-3), da pesquisa no exterior e do auxílio bolsa de estágio pesquisa no pesquisa, que financiaram a exterior (2021/09597-6) e do realização deste trabalho. auxílio pesquisa (2015/03965- 2), que financiaram a realização deste trabalho. DADOS CURRICULARES VICTOR GUSTAVO BALERA BRITO Nascimento: 15 de fevereiro de 1993; Birigüi/SP. Filiação: Carlos dos Santos Brito Filiação: Cássia Rosane Balera Brito 2011/2015: Graduação em Farmácia, Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium de Araçatuba (UniSalesiano). 2016/2018: Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, nível Mestrado Acadêmico, pelo Programa de Pós-graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Foa/Unesp). 2018/2023: Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, nível Doutorado Acadêmico, pelo Programa de Pós-graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Foa/Unesp). DEDICATÓRIA Aos meus pais Cássia e Carlos e avós Dona Cida e Seu Daniel. AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Professora Sandra Helena Penha de Oliveira. Seus ensinamentos e exemplos foram fundamentais para o meu crescimento acadêmico e científico, além de pessoal. Sua determinação e comprometimento sempre me inspirarão, e serei eternamente grato pela generosidade em me dar uma oportunidade, 11 anos atrás! Tenho muito orgulho de ter seu nome em meu currículo! Obrigado por tudo, Professora Sandra! À Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP) e à Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA) pela oportunidade de realizar este trabalho. Ao Departamento de Ciências Básicas (DCB) desta Instituição, especialmente aos professores Ana Cláudia de Melo Stevanato Nakamune, Antonio Hernandes Chaves Neto, Cristina Antoniali, Doris Matsushita, João Carlos Callera e Rita Cássia Menegati Dornelles, por suas valiosas contribuições enquanto estive no DCB. Ao Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas (PPGMCF) e à Sociedade Brasileira de Fisiologia (SBFis), em particular à Professora Rita Cássia Menegati Dornelles (FOA/UNESP), coordenadora geral do PPGMCF, ao Professor Márcio Flávio Dutra Moraes (UFMG), presidente da SBFis, e à Professora Patrícia Riken Macedo Rocco (UFRJ), ex-presidente da SBFis, pelo esforço em expandir o PPGMCF. Estendo meus agradecimentos aos Coordenadores Locais do PPGMCF e aos demais Conselheiros das Instituições Nucleadoras, que compõem o Conselho Geral do PPGMCF, no qual servi como Representante Discente Geral. Também expresso meu apreço aos Representantes Discentes Locais com quem trabalhei durante meu mandato. Ao Conselho Local do PPGMCF (FOA/UNESP), no qual tive o prazer de atuar como Representante Local por três mandatos, à sua coordenadora, Profa. Sandra H. P. Oliveira, à ex-coordenadora Profa. Cristina Antoniali e aos demais membros, pelo trabalho e esforços dedicados ao desenvolvimento e reconhecimento deste Programa. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de doutorado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de doutorado, da bolsa de estágio pesquisa no exterior e do auxílio pesquisa, que financiaram a realização deste trabalho. Aos servidores da Seção Técnica de Pós-Graduação desta Instituição, Cristiane Regina Lui, Valéria de Queiroz Marcondes Zagato, Matos e Lilian Sayuri Mada, pela eficiência no trabalho e pela cordialidade com todos nós. A todos os colaboradores da FOA/UNESP, cujos trabalhos são essenciais. Em especial, gostaria de mencionar a senhora Eliseide Maria Ferreira Silva Navega, secretária do Departamento de Ciências Básicas; o senhor João Batista Alves Correa, responsável pelo Biotério Central; os servidores da Seção de Conservação e Manutenção; e a Seção Técnica de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extensão. Aos professores Cristina Antoniali, Márcio Mateus Beloti e Rita Cássia Menegati Dornelles pela disponibilidade, atenção e valiosas contribuições durante meu Exame Geral de Qualificação. Aos amigos discentes e egressos do PPGMCF pela amizade e companheirismo, em especial aos amigos do Bloco 31, pela convivência agradável e divertida que tornaram os dias mais agradáveis. Aos amigos do Laboratório de Imunofarmacologia, gostaria de expressar minha gratidão por toda a ajuda, boa vontade e bom humor constantes. Em especial, gostaria de mencionar Sabrina Frasnelli, Ayna Barreto, Bianca Ribeiro, Mariana Souza e Maria Carolina Linjardi, que tiveram um papel fundamental na realização deste trabalho. Aos meus professores de graduação do Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium de Araçatuba (UniSalesiano), Roseli Cavestre, Vilma Colli, Fausto de Souza, Milena Tonon, Maria de Fátima Sato, Valéria Rocha, André Rowe, Paulo Geraldo, Joice Cozza, Simone Terçariol, Andrea Garcia, José Zequetto, Natália Negreiros, Aparecida Tocchio, Gislene Marcelino, Rossana A. C. Rosa, Sueli da Silva, Jeferson Machado, Luiz Gustavo Lima, Rosemeire Pastor e Giselle Sailer, gostaria de agradecer por todos os ensinamentos durante minha formação. Em especial, agradeço às professoras Eliane P. Cervelatti e Ana Carolina Frade pela generosidade e amizade. Aos meus queridos amigos Fernando Barthman, Priscila Fardin, Murilo Graton, Amanda Gomes, Fernanda Demarqui e Jessica Troiano, expresso minha gratidão pela fraternidade e pelos inúmeros bons momentos que compartilhamos juntos! A minha família, agradeço por sempre estarem presentes! Obrigado por todo o carinho e suporte em todos os momentos! To the Department of Orthopedic Surgery at Washington University in St. Louis, School of Medicine, and The Musculoskeletal Research Center. I am especially grateful to Prof. Audrey McAlinden for offering me a wonderful opportunity, providing invaluable mentorship, and for her generosity and kindness throughout my journey. I would also like to extend my appreciation to the members of the McAlinden Lab, Austin Bell-Hensley, Hongjun Zheng, and Jin Liu, for their warm welcome, constant assistance, and friendship! EPÍGRAFE " Quando se começa a caminhar, o caminho aparece " - atribuído a Rumi. RESUMO BRITO, V. G. B. Mecanismos envolvidos na perda óssea alveolar induzida pela doença periodontal em ratos espontaneamente hipertensos: Papel do sistema renina-angiotensina e microRNAs. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araçatuba, 2023. RESUMO A doença periodontal (DP) é uma desordem inflamatória prevalente que afeta os tecidos de suporte e proteção dos dentes. Devido sua alta prevalência, é frequentemente associada a comorbidades, como hipertensão, que pode contribuir para sua progressão. O rato espontaneamente hipertenso (SHR) é um modelo que apresenta características semelhantes à hipertensão essencial humana, bem como comprometimento ósseo intrínseco e maior perda óssea alveolar associada à DP. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar dois mecanismos, o sistema renina- angiotensina (SRA) e a expressão de microRNAs (miRNAs), para melhor compreender o aumento da perda óssea alveolar induzida pela DP nesse modelo. Para isso, utilizamos ratos machos Wistar e SHR com 10 semanas de idade e a DP foi induzida por meio de ligadura bilateral inserida nos primeiros molares inferiores e mantida por 15 dias. Para avaliar a participação do SRA, os animais foram tratados com telmisartan (10 mg/Kg/dia) e foram realizadas análises da arquitetura óssea (microCT), expressão dos componentes do SRA, marcadores de formação, remodelamento e reabsorção óssea, bem como a produção de mediadores inflamatórios na mandíbula (RT-qPCR, ELISA e IHC-P). Para investigar a expressão diferencial de miRNAs associado a DP, foi utilizado ensaio de microarranjo e posteriormente análises bioinformáticas para identificar potenciais vias reguladas. Os resultados mostraram que o rato SHR apresentou maior perda óssea alveolar, em comparação ao Wistar (normotenso), o que foi parcialmente prevenido pelo tratamento com telmisartan. Observamos uma redução nos marcadores de osteoclastos (remodelamento e reabsorção), o que foi associada à menor produção de mediadores inflamatórios, inibição do receptor de angiotensina II tipo 1 (Agtr1) e maior expressão do receptor tipo 2 (Agt2r). Entretanto, observamos que a modulação dos componentes do SRA foi similar entre ratos Wistar e SHR, não explicando as diferenças observadas entre os modelos. De forma interessante, a análise de microarranjo revelou um perfil distinto de miRNAs relacionados à resposta imune e metabolismo ósseo nos SHR, bem como miRNAs diferencialmente modulados entre os modelos, previamente não associados à homeostase ou desordens periodontais. Resumidamente, mostramos que os componentes do SRA contribuem significativamente para a perda óssea alveolar, mas não explicam completamente a progressão aumentada observada nos SHR. No entanto, a modulação diferencial de miRNAs nos animais hipertensos sugerem seu envolvimento nessas diferenças, além de destacar potenciais alvos terapêuticos para DP, e outras desordens ósseas, que podem ser de interesse para orientar futuras pesquisas. Nesse sentido, a partir dos miRNAs diferencialmente expressos na DP, elegemos um miRNA de interesse, o miR- 127-3p, que apresenta sequência conservada entre múltiplas espécies (incluindo ratos, camundongos e humanos), cuja função na osteogênese são havia sido completamente elucidada. Demonstramos então um efeito inibitório do miR-127-3p na diferenciação osteogênica de células osteoprogenitoras humanas (células mesenquimais estromais da medula óssea), por meio da superexpressão in vitro por meio de um mímico de miRNA. Estudos adicionais são necessários para confirmar um efeito in vivo, mas nossos resultados contribuem para a compreensão da função do miR-127-3p na biologia óssea. Financiamentos: CAPES (código 001), FAPESP (2015/03965-2, 2018/23676-3 e 2021/09597-6). Palavras-chave: Doença periodontal; hipertensão; sistema renina-angiotensina; inflamação; microRNAs. ABSTRACT BRITO, V. G. B. Mechanisms associated to the periodontal disease-induced alveolar bone loss in spontaneously hypertensive rats: Role of the renin- angiotensin system and microRNAs. Thesis (Doctorate) - São Paulo State University (Unesp), School of Dentistry, Araçatuba, 2022. ABSTRACT Periodontal disease (PD) is a prevalent inflammatory disorder affecting the teeth' supporting and protective tissues. Due to its high prevalence, it is often associated with other comorbidities such as hypertension, which can contribute to its progression. The spontaneously hypertensive rat (SHR) is a model that exhibits similarities to essential hypertension in humans, as well as intrinsic bone impairment and increased alveolar bone loss associated with PD. Therefore, the aim of this study was to investigate two mechanisms, the renin-angiotensin system (RAS) and microRNA (miRNA) expression, to better understand the increased alveolar bone loss induced by PD in this model. Male Wistar and SHR rats at 10 weeks of age were used, and PD was induced by bilateral ligature placement on the lower first molars and maintained for 15 days. To evaluate the involvement of the RAS, the animals were treated with telmisartan (10 mg/kg/day), and we analyzed the alveolar bone architecture (micro-CT), RAS component expression (RT-qPCR and IHC-P), bone formation, remodeling, and resorption markers expression (RT-qPCR), and the production of inflammatory mediators in the mandible (ELISA). A microarray assay was used to investigate the differential expression of miRNAs associated with PD, followed by bioinformatics analysis to identify potential regulated pathways. The results showed that the SHR rat exhibited greater alveolar bone loss than the normotensive Wistar rat, partially prevented by telmisartan treatment. We observed a reduction in osteoclast markers, associated with decreased production of inflammatory mediators, inhibition of the angiotensin II type 1 receptor (Agtr1), and increased expression of the type 2 receptor (Agt2r) in the telmisartan-treated animals. However, we found that the modulation of RAS components was similar between Wistar and SHR rats, which did not explain the observed differences between the models. Interestingly, microarray analysis revealed a distinct profile of miRNAs related to immune response and bone metabolism in SHR rats, as well as differentially modulated miRNAs between the models that were not previously associated with periodontal homeostasis or disorders. In summary, we demonstrated that RAS components significantly contribute to alveolar bone loss but do not fully explain the increased progression observed in SHR rats. However, the differential modulation of miRNAs in hypertensive animals suggests their involvement in these differences, highlighting potential therapeutic targets for PD and other bone disorders as well, which may be of interest for guiding future research. In this context, from the differentially expressed miRNAs in PD, we selected a miRNA of interest, miR- 127-3p, which presents a conserved sequences among multiple species (including rats, mice, and humans) and which role in osteogenesis has not been fully elucidated. We demonstrated an inhibitory effect of miR-127-3p on the osteogenic differentiation of human osteoprogenitor cells (bone marrow-derived mesenchymal stromal cells) through in vitro overexpression using a miRNA mimic. Further studies are needed to confirm an in vivo effect, but our results contribute to understanding the function of miR-127-3p in bone biology. Funding: CAPES (code 001), FAPESP (2015/03965-2, 2018/23676-3, and 2021/09597-6). Key words: Periodontal disease; hypertension; renin-angiotensin system; inflammation; microRNAs. LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO GERAL Figura 1. Componentes anatômicos básico ............................................................. 38 Figura 2. Principais características da doença periodontal ..................................... 40 Figura 3. Componentes do sistema renina-angiotensina ........................................ 47 Figura 4. Biogênese e mecanismo de ação dos microRNAs ................................... 53 Figura 5. Principais fases e marcadores da diferenciação osteogênica .................. 60 CAPÍTULO 1 Figura 1- 1. Pressão arterial sistólica e marcadores sistêmicos de remodelação óssea de ratos Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan .................. 80 Figura 1- 2. Microtomografia de mandíbula (região do primeiro molar inferior) de ratos Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan ................................ 82 Figura 1- 3. Expressão dos componentes do SRA em mandíbulas de ratos Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan .............................................. 85 Figura 1- 4. Expressão dos componentes do SRA em mandíbulas de ratos Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan .............................................. 85 Figura 1- 5. Produção de mediadores inflamatórios em mandíbulas de ratos Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan .............................................. 87 Figura 1- 6. Expressão gênica de marcadores de formação óssea em mandíbulas de ratos Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan ....................... 89 Figura 1- 7. Expressão gênica de marcadores de remodelamento e reabsorção em mandíbulas de Wistar e SHR com DP, tratados com telmisartan ....... 91 Figura 1- 8. Principais resultados ............................................................................ 99 CAPÍTULO 2 Figura 2- 1. Pressão arterial sistólica e perda óssea alveolar induzida por DP em ratos SHR e Wistar .................................................................................... 109 Figura 2- 2. MiRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) nas mandíbulas de SHR Controle versus Wistar Controle ....................................................... 112 Figura 2- 3. MiRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) nas mandíbulas de Wistar com DP versus Wistar Controle ........................................................ 114 Figura 2- 4. MiRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) nas mandíbulas de SHR com DP versus SHR Controle ........................................................... 118 Figura 2- 5. Diagrama de Venn para DEmiRs na DP ............................................ 120 Figura 2- 6. MiRNAs regulados diferencialmente em SHR com PD versus SHR Controle comparado a Wistar com PD versus Wistar Controle ......... 122 CAPÍTULO 3 Figura 3- 1. Expressão do miR-127-3p e miR-127-5p in vitro ................................ 143 Figura 3- 2. Silenciamento do miR-127-3p durante a osteogênese de hCTM ....... 145 Figura 3- 3. Superexpressão do miR-127-3p durante a osteogênese de hCTM ... 147 Figura 3-4. Marcação F-actina em hCTM com superexpressão do miR-127-3p ... 149 Figura 3- 5. Expressão gênica de marcadores osteogênicos e BCL6 durante osteogênese de hCTM ....................................................................... 151 LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 Tabela 1- 1. Relação dos ensaios TaqManTM utilizados ........................................... 76 Tabela 1- 2. Relação dos anticorpos e sistema de detecção utilizados para os ensaios de imunohistoquímica .......................................................................... 78 CAPÍTULO 2 Tabela 2- 1. MiRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) nas mandíbulas de SHR Controle versus Wistar Controle ........................................................ 112 Tabela 2- 2. MiRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) nas mandíbulas de Wistar com DP versus Wistar Controle ......................................................... 115 Tabela 2- 3. MiRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) nas mandíbulas de SHR com DP versus SHR Controle ............................................................ 119 Tabela 2- 4. MiRNAs regulados diferencialmente em SHR com DP versus SHR Controle comparado a Wistar com DP versus Wistar Controle .......... 123 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µA - Microampere µL - Microlitro µL - Microlitro µm - Micrometro 3' - Extremidade downstream de moléculas de DNA ou RNA 5' - Extremidade upstream de moléculas de DNA ou RNA Ace - Enzima conversora de angiontensina Ace2 - Enzima conversora de angiontensina 2 Actb - Beta actin Ago - Argonauta Agt - Angiotensinogenio Agt1r - Receptor de angiotensina II tipo 1 Agt2r - Receptor de angiotensina II tipo 2 Alp - Bone alkaline phosphatase Ang1-7 - Angiotensina 1-7 ANOVA - Analysis of variance, análise de variância ASB - Albumina sérica bovina AT1R - Receptor de angiotensina II tipo 1 AT2R - Receptor de angiotensina II tipo 2 BCL6 - B-cell lymphoma 6 transcription repressor, Repressor de transcrição de células B de linfoma 6 bFGF - Basic fibroblast growth fator; Fator de crescimento fibroblástico básico bFGF - Basic fibroblast growth factor; Fator de crescimento fibroblástico básico Bmp2 - Bone morphogenetic protein 2 Bsp/Ibsp - Bone sialoprotein; Integrin-binding sialoprotein BV/TV - Bone volume/Total volume, Volume ósseo/Volume total Catnb - Β-catenin / Cadherin associated protein beta 1 CCL20 - Chemokine (C-C motif) ligand 20; ligante quimiocina (motivo C-C) 20 cDNA - Complementary deoxyribonucleic acid, Ácido desoxirribonucleico complementar CINC-2 - Cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2, quimiotático de neutrófilo induzido por citocina-2 CN - Grupo experimenta Controle Negativo Co.Po - Porosidade cortical Co.Th - Espessura cortical Col1a1 - Collagen type I alpha 1 Ct - Cycle threshold, Ciclo limiar Ctsk - Cathepsin K CXCL2 - Chemokine (C-X-C motif) ligand 2; ligante quimiocina (motivo C-X- C) 2 DEPC - Diethyl pyrocarbonate, Pirocarbonato de dietila DNA - Deoxyribonucleic acid, Ácido desoxirribonucleico DNase - Desoxirribonuclease DP - Doença periodontal GO - Gene ontology; Ontologia genética hsa - Referente a espécie Homo sapiens I.U. - International unit; unidade internacional I.U./mL - Unidades internacionais por mililitro IL-10 - Interleukin-10, interleucina-10 IL-6 - Interleukin-6, interleucina-6 Itgav - Integrin, alpha V Itgb5 - Integrin, beta 5 KEGG - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; Enciclopédia de Genes e Genoma de Kioto Kg - Quilograma kVp - Pico de quilovoltagem Masr - Receptor Mas; Mas-related G protein-coupled receptor mg - Miligrama microCT - Micro-computed tomography, micro tomografia computadorizada MIP-3α - Macrophage inflammatory protein-3 alpha, Proteína inflamatória de macrófago-3 alfa miR - Microrna miR - Microrna miRNA - Microrna miRNA - Microrna mL - Mililitro mm - Milímetro mM - Milimolar Mmp2 - Matrix metalloproteinase 2 Mmp9 - Matrix metalloproteinase 9 mmu - Referente a espécie Mus musculus ms - Milissegundo ng - Nanograma ng/ml - Nanograma por mililitro NT - Grupo experimenta Não Transfectado Ocn/Bglap - Osteocalcin/Bone gamma-carboxyglutamate protein Opg - Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11b Opn/Spp1 - Osteopontina/Secreted phosphoprotein 1 Oscar - Osteoclast associated immunoglobulin-like receptor Osx/Sp7 - Osterix/Sp7 transcription factor p - Probabilidade PBS - Phosphate-buffered saline, Tampão fosfato salino Ppia - Peptidylprolyl isomerase A, Peptidilprolil isomerase A pré-miRNA - Microrna precursor pri-miRNA - Microrna primário Rank - Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a Rankl - Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 RCF - Relative centrifugal force, Força centrífuga relativa Ren - Renina RISC - RNA-induced silencing complex RNA - Ribonucleic acid, Ácido ribonucleico RNase - Ribonuclease rno - Referente a espécie Rattus norvegicus ROI - Region of interest, Região de interesse RQ - Relative quantitation, Quantificação relativa RT-qPCR - Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa Runx2 - Runt-related transcription factor 2; Fator de transcrição relacionado à Runt-2 SBF - Soro fetal bovino SC - Grupo experimental SHR controle SDP/SPD - Grupo experimental SHR com doença periodontal SEM - Standard error of the mean, Erro padrão da média SFB - Soro fetal bovino SHR - Spontaneously hypertensive rat, Rato espontaneamente hipertenso STELM - Grupo experimenta SHR com doença periodontal, tratado com telmisartan Tb.N - Trabecular number, Número de trabéculas Tb.Sp - Trabecular separation, Separação trabecular Tb.Th - Trabecular thickness, Espessura trabecular TNF-α - Tumor necrosis factor alpha, Fator de necrose tumoral Trap/Acp5 - Tartrate-resistant acid phosphatase/Acid phosphatase 5; Fosfatase ácida resistente ao tartarato/Fosfatase ácida 5 UTR - Região no codificante (do inglês, untranslated region) VOI - Volume of interest, Volume de interesse Vtn - Vitronectin, Vitronectina WC - Grupo experimental Wistar controle WDP - Grupo experimental Wistar com doença periodontal WTELM - Grupo experimenta Wistar com doença periodontal, tratado com telmisartan LISTA DE SÍMBOLOS LISTA DE SÍMBOLOS α - Alfa * - Asterisco β - Beta º - Grau ºC - Graus Celsius > - Maior que ≥ - Maior ou igual a + - Mais ± - Mais ou menos ® - Marca registrada < - Menor que ≤ - Menor ou igual a - - Menos : - Para (razão matemática) % - Porcentagem / Por cento TM - Trademark; Marca comercial ∆ - Delta; variação ∆∆ - Delta delta; variação da variação LISTA DE ANEXOS LISTA DE ANEXOS Anexo 1 - Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais ........................... 187 Anexo 2 - Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais ........................... 188 Anexo 3 - Resultado da prova de defesa pública de tese de doutorado ................ 189 Anexo 4 - Ata de defesa pública de tese de doutorado .......................................... 190 SUMÁRIO SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL Doença periodontal: aspectos gerais ................................................................. 37 Hipertensão arterial e sua relação com a doença periodontal ......................... 42 O sitema renina-angiotensia e sua relação com a doença periodontal ........... 46 MicroRNAs e sua relação com a doença periodontal........................................ 50 O tecido ósseo, osteogênese e a relação com micrornas ................................ 57 PROPOSIÇÃO ....................................................................................................... 63 OBJETIVOS Objetivo geral ........................................................................................................ 66 Objetivos específicos ........................................................................................... 66 - CAPÍTULO 1 - Papel dos telmisartan sobre o metabolismo ósseo na mandíbulas de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos com doença periodontal ....... 68 RESUMO ................................................................................................................ 68 1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO ............................................................................. 69 2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 71 2.1. Animais e aspectos éticos ........................................................................... 71 2.2. Tratamento com telmisartan ........................................................................ 72 2.3. Indução da doença periodontal ................................................................... 72 2.4. Medida não invasiva da pressão arterial sistólica ........................................ 73 2.5. Dosagem plasmática de fosfatase alcalina (FAL) e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) ............................................................................ 73 2.6. Microtomografia computadorizada (microCT) .............................................. 74 2.7. Dosagem de mediadores inflamatórios ....................................................... 74 2.8. Análise de expressão gênica ....................................................................... 75 4.9. Imunohistoquímica em cortes parafinizados ................................................ 77 4.10. Análise estatística ...................................................................................... 79 3. RESULTADOS ................................................................................................... 79 3.1. Telmisartan (TELM) reverte o fenótipo hipertensivo reduzindo a pressão arterial................................................................................................................. 79 3.2. SHR apresenta atividade aumentada de fosfatase alcalina (FAL) e fosfatase acida resistente ao tartarato (TRAP) no plasma ................................................. 80 3.3. TELM reduz a perda óssea alveolar induzida por DP ................................. 81 3.4. TELM reduziu a expressão de Agt1r e aumentou a expressão de Agt2r no osso alveolar ...................................................................................................... 83 3.5. TELM reduziu a produção de mediadores inflamatórios na mandíbula de ratos com DP ...................................................................................................... 86 3.6. TELM aumentou a expressão de Runx2 e Alp na mandíbula de SHRs com DP ...................................................................................................................... 88 3.7. O eixo Opg/Rankl/Rank foi modulado de maneira diferente pelo TELM em Wistar e SHR ...................................................................................................... 90 3.8. TELM reduz a expressão de marcadores de reabsorção óssea na mandíbula de ratos com DP ............................................................................... 90 4. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 92 5. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 98 - CAPÍTULO 2 - Perfil de expressão de micrornas na mandíbula de ratos espontaneamente hipertensos com doença periodontal ............................................................... 101 RESUMO .............................................................................................................. 101 1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ......................................................................... 102 2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 104 2.1. Animais e grupos experimentais ................................................................ 104 2.1. Indução da doença periodontal ................................................................. 104 2.3. Medida não invasiva da pressão arterial ................................................... 105 2.4. Coleta das amostras e avaliação da perda óssea alveolar ........................ 105 2.5. Extração do RNA total ............................................................................... 105 2.6. Microarranjo de microRNA ........................................................................ 106 2.7. Análise de dados de microarranjo ............................................................. 106 2.8. Predição in silico de alvos de miRNA e análise de enriquecimento de vias ......................................................................................................................... 107 3. RESULTADOS ................................................................................................. 108 3.1. Animais hipertensos tem maior perda óssea alveolar induzida pela doença periodontal (DP) ............................................................................................... 108 3.2. SHR apresentam diferenças intrínsecas na expressão de miRNAs na mandíbula ......................................................................................................... 110 3.3. Predição in silico sugerem vias de sinalização celular e resposta imune .. 113 modulados por miRNAs em mandíbula de ratos Wistar com DP ..................... 113 3.4. SHR apresenta um perfil distinto de miRNAs associado a DP .................. 116 3.5. MiRNAs são diferencialmente regulados no SHR com DP em relação aos grupos normotensos ......................................................................................... 121 4. DISCUSSÃO .................................................................................................... 124 5. CONLUSÃO ..................................................................................................... 132 - CAPÍTULO 3 - Efeito do hsa-miR-127-3p na diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana ....................................... 134 RESUMO .............................................................................................................. 134 1. INTRODUÇÃO e objetivos .............................................................................. 135 2. Material e mÉtodos ......................................................................................... 137 2.1. Cultura primária de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana (hCTM) ..................................................................................... 137 2.2. Indução da diferenciação osteogênica ...................................................... 137 2.3. Silenciamento e superexpressão do hsa-miR-127-3p ............................... 137 2.4. Análise da expressão do hsa-miR-127-3p ................................................. 138 2.5. Análise de proliferação celular ................................................................... 138 2.6. Análise da viabilidade celular .................................................................... 139 2.7. Análise do citoesqueleto de actina ............................................................ 139 2.8. Análise da expressão gênica de marcadores osteogênicos ...................... 140 2.9. Análise da expressão proteica BCL6 por western blot .............................. 141 2.10. Análise estatística .................................................................................... 141 3. RESULTADOS ................................................................................................. 142 3.1. A expressão do miR-127-3p não é modulada durante a diferenciação osteogênica ...................................................................................................... 142 3.2. Silenciamento do miR-127-3p não afetou a osteogênese em hCTM ........ 144 3.3. Superexpressão do miR-127-3p inibe a mineralização de hCTM .............. 146 3.4. Efeito do hsa-miR-127-3p na proliferação celular ...................................... 146 3.5. Superexpressão do miR-127-3p não afeta a organização do citoesqueleto em hCTM .......................................................................................................... 148 3.6. Superexpressão do miR-127-3p altera a expressão de marcadores osteogênicos .................................................................................................... 150 3.7. BCL6 não está envolvida nos efeitos do miR-127-3p na osteogênese de hCTM ................................................................................................................ 150 4. DISCUSSÃO .................................................................................................... 152 5. CONCLUSÃO ................................................................................................... 154 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................... 155 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 159 ANEXOS ................................................................................................................. 186 Anexo 1 - Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais ................... 187 Anexo 2 - Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais ................... 188 Anexo 3 - Resultado da prova de defesa pública de tese de doutorado ....... 189 Anexo 4 - Ata de defesa pública de tese de doutorado ................................... 190 37 INTRODUÇÃO GERAL 37 DOENÇA PERIODONTAL: ASPECTOS GERAIS O periodonto compreende os tecidos adjacentes aos elementos dentários, que exercem a função primária de suporte e proteção dos dentes (Kinane et al., 2017; Pihlstrom et al., 2005). O periodonto apresenta uma organização anatômica e funcional complexa, mas que pode ser dividida nas seguintes estruturas, representadas na Figura 1: a) Gengiva: Tecido conjuntivo mole que recobre o osso alveolar e a raiz dos dentes na região cervical (junção cemento-esmalte) e pode ser anatomicamente dividida em gengiva marginal e gengiva aderida. Sua função primária é proteger os tecidos internos do periodonto de danos mecânicos e desafios microbiológicos, sendo revestida por epitélios especializados, incluindo o epitélio juncional (aderido ao dente), sulcular (voltado ao dente, mas sem contato íntimo) e gengival (ou oral, voltado à cavidade bucal) (Cho & Garant, 2000); b) Ligamento periodontal: Tecido conjuntivo intimamente ligado ao cemento radicular, ancorando os dentes ao processo alveolar. Tem importante participação na transmissão das forças oclusais e na adaptabilidade e regeneração do periodonto (Newman et al., 2006); c) Cemento: Tecido conectivo mineralizado e não vascularizado que cobre a superfície radicular dos dentes, formando uma interface entre a dentina e o ligamento periodontal (Cho & Garant, 2000); d) Osso alveolar: Processo alveolar dos ossos da mandíbula e maxila que abriga as raízes dos dentes e recebe as pressões oclusais. Trata-se, assim, de uma estrutura ativa com grande capacidade de remodelamento, composto por osso trabecular e uma lâmina de osso compacto (Cho & Garant, 2000; Huja et al., 2006). 38 Figura 1. Componentes anatômicos básico. Criado com BioRender.com (Brito, 2023) A doença periodontal abrange diversas condições inflamatórias que afetam o periodonto. A forma mais comum é causada pelo acúmulo de placa bacteriana ao redor dos dentes devido à higiene oral inadequada (Pihlstrom et al., 2005). No entanto, outras causas também podem ser identificadas, como distúrbios genéticos com manifestações periodontais (Alaluusua et al., 1997; Bailleul-Forestier et al., 2008; Kapferer-Seebacher et al., 2016; Rai et al., 2010; Wiebe et al., 2008), síndromes metabólicas, como diabetes (Preshaw et al., 2012) e osteoporose (Wang & McCauley, 2016), hábitos prejudiciais, como tabagismo e consumo excessivo de álcool (Bergstrom, 2004; Tezal et al., 2001), deficiências imunológicas hereditárias ou 39 adquiridas (Al-Hezaimi et al., 2012), além de outros fatores menos prevalentes, como deficiências nutricionais, traumas e neoplasias (Newman et al., 2014). A doença periodontal é altamente prevalente em todo o mundo, estimando-se que afete entre 0,8 e 1,4 bilhões de pessoas, representando um desafio para a saúde pública, especialmente em regiões com populações socioeconomicamente vulneráveis (Chen et al., 2021a). É a principal causa de perda de dentes, resultando em dificuldades na mastigação, comprometimento da fala e impactos negativos na autoestima e qualidade de vida dos indivíduos afetados (Batchelor, 2014; Bonfim Mde et al., 2013). A patogênese da doença periodontal, ilustrada na Figura 2, envolve o acúmulo de placa bacteriana nos dentes, desencadeando uma resposta inflamatória autolimitada na gengiva (gengivite). Nessa fase, a higiene adequada interrompe o estímulo inflamatório, levando à resolução espontânea do processo (Hasan & Palmer, 2014; Lindhe et al., 2015). Entretanto, se a presença da placa bacteriana persistir, ocorre a cronificação do processo, calcificação da placa bacteriana (cálculo dentário) e formação de bolsas periodontais, caracterizadas pelo aprofundamento do sulco gengival e colonização por microrganismos de estruturas mais internas (Newman et al., 2014; Pihlstrom et al., 2005). A resposta inflamatória, inicialmente protetora, torna- se cada vez mais intensa e a principal responsável pela deterioração dos tecidos periodontais (Cekici et al., 2014). Nessa fase, a doença periodontal apresenta uma progressão mais acelerada e pode ter consequências irreversíveis para a saúde periodontal, tornando necessário o cuidado odontológico especializado. Sem tratamento, a deterioração dos tecidos pode levar à perda de inserção, resultando na perda do dente, que é uma das consequências mais graves da doença periodontal (Berglundh et al., 2002; Donos et 40 al., 2012; Schou et al., 2006). Com o tratamento periodontal adequado, é possível eliminar a infecção e promover a restauração parcial dos tecidos, mas a regeneração completa das estruturas periodontais geralmente não ocorre. Além disso, dependendo da gravidade da doença, pode ser necessária uma abordagem de reabilitação protética (Plessas, 2014; Teughels et al., 2014). Figura 2. Principais características da doença periodontal. Criado com BioRender.com (Brito, 2023) Devido à sua alta prevalência, a doença periodontal frequentemente está associada a outras doenças pré-existentes, o que tem um impacto significativo em sua progressão. Embora o fator microbiológico seja determinante para o 41 desenvolvimento da doença periodontal, sua progressão depende da interação dinâmica entre o patógeno e o hospedeiro (Cekici et al., 2014; Kulkarni & Kinane, 2014). Portanto, comorbidades como hipertensão, diabetes e osteoporose têm um impacto significativo na gravidade das consequências locais da doença periodontal. A relação causal entre essas doenças ainda não é totalmente compreendida, mas cada vez mais estudos sugerem que o aumento sistêmico da carga inflamatória seja o mediador comum entre a doença periodontal e as desordens sistêmicas (Caillon & Schiffrin, 2016; Hajishengallis & Chavakis, 2021). Além disso, a doença periodontal tem um impacto na saúde sistêmica e é considerada um fator de risco para doenças cardiovasculares, metabólicas e complicações gestacionais (Hajishengallis & Chavakis, 2021). Sabe-se que a doença periodontal leva a um quadro de inflamação sistêmica de baixo grau, associado a complicações extraorais, e alguns mecanismos foram propostos para explicar esta resposta, como bacteremias transitórias devido ao acesso de patógenos periodontais à circulação sistêmica por meio de úlceras no epitélio gengival (Ohki et al., 2012; Paraskevas et al., 2008). A doença periodontal não é apenas uma condição localizada na cavidade oral, mas também tem implicações sistêmicas significativas. Sua interação complexa com comorbidades e seu papel como fator de risco para doenças cardiovasculares, metabólicas e complicações gestacionais destacam a importância de abordagens interdisciplinares no cuidado e prevenção da doença periodontal. Desta forma, o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na progressão da doença periodontal, especialmente associada a comorbidades, é fundamental para o desenvolvimento de estratégias de tratamento e prevenção mais eficazes, visando à promoção da saúde global do indivíduo. 42 HIPERTENSÃO ARTERIAL E SUA RELAÇÃO COM A DOENÇA PERIODONTAL A hipertensão arterial sistêmica é caracterizada pelo aumento persistente da pressão arterial e, geralmente, não apresenta sintomas perceptíveis aos pacientes. Isso leva a diagnósticos tardios e complicações resultantes da falta de tratamento, sendo o principal fator de risco associado à morbidade e mortalidade por doenças cardiovasculares. A hipertensão pode ter diferentes causas, mas, de maneira geral, pode ser classificada como hipertensão secundária, quando possui uma causa definida, como alterações endócrinas ou renais, ou como hipertensão primária (ou essencial), quando é idiopática e multifatorial, sem uma causa bem definida (Oparil et al., 2018). A hipertensão essencial corresponde a aproximadamente 90% dos diagnósticos e, apesar de ser idiopática, pode estar associada a fatores genéticos, devido à sua alta herdabilidade, e, principalmente, a hábitos de vida prejudiciais, como sedentarismo, dieta desequilibrada e tabagismo (Carretero & Oparil, 2000; Harrison et al., 2021). Estima-se que 30% da população seja hipertensa, tornando-se assim um importante problema de saúde pública e, por vezes, considerada uma "epidemia" global (Mills et al., 2020). A probabilidade de coexistência da hipertensão e da doença periodontal é bastante alta, principalmente por compartilharem fatores de risco (Lockhart et al., 2012). Além disso, evidências têm mostrado uma relação causal entre essas duas patologias, sendo a inflamação sistêmica crônica o principal mediador comum (Boos & Lip, 2006; Dixon et al., 2020). O estabelecimento da hipertensão arterial apresenta um componente inflamatório importante, e já houve progressos na compreensão do papel da 43 imunidade inata e adaptativa na patogênese de doenças cardiovasculares (Dixon et al., 2020; Harrison et al., 2011). Por exemplo, o quadro hipertensivo já foi associado ao aumento de mediadores inflamatórios, estresse oxidativo e disfunções endoteliais (Brito et al., 2013; Mirhafez et al., 2014; Rothman et al., 2020). De maneira geral, o aumento da carga inflamatória sistêmica causado pela hipertensão é sugerido como um fator de risco para uma maior susceptibilidade e progressão aumentada da doença periodontal. Além disso, a hipertensão é considerada um fator de risco para as desordens de perda óssea (Ye et al., 2017), e já foram propostos mecanismos para explicar essa relação, como o metabolismo anormal de cálcio, aumento do paratormônio, alterações nos níveis séricos de vitamina D e K e alterações na produção de óxido nítrico (Ilic et al., 2013). O manejo clínico da perda óssea geralmente inclui agentes farmacológicos antirreabsortivos ou anabólicos (Rodan & Martin, 2000), mas estudos têm mostrado um efeito benéfico de drogas anti-hipertensivas, o que evidencia ainda mais a relação entre a hipertensão e a homeostasia óssea, sugerindo alternativas complementares às abordagens terapêuticas clássicas (Puttnam et al., 2017). Apesar de haver muitas evidências disponíveis, não há um consenso clínico sobre o efeito da hipertensão na perda óssea alveolar decorrente da doença periodontal. Estudos de coorte são mais claros ao mostrar uma relação da doença periodontal com comorbidades como diabetes (Roy et al., 2019; Stohr et al., 2021) e osteoporose (Hong et al., 2021; Lee, 2022), enquanto em relação à hipertensão, muitas vezes os resultados são inconclusivos. É importante considerar que, por se tratar de duas doenças com alta prevalência, há um viés epidemiológico relevante, havendo certa dificuldade em identificar indivíduos na população que apresentem apenas uma das duas doenças e apenas as duas doenças associadas. Outras 44 comorbidades e fatores dificultam a estratificação dos estudos, o que pode resultar em resultados inconclusivos. Diante disso, os modelos animais são uma alternativa interessante para a investigação experimental. No contexto da hipertensão, o rato espontaneamente hipertenso (SHR, do inglês spontaneously hypertensive rat) é um modelo amplamente utilizado no estudo de doenças cardiovasculares e se destaca por mimetizar muitos aspectos da hipertensão essencial humana. Os SHR são uma linhagem isogâmica (inbred) desenvolvida a partir do cruzamento exogâmico (outbred) de ratos Wistar Kyoto que apresentavam espontaneamente uma elevação acentuada da pressão arterial (Okamoto & Aoki, 1963). Os SHR são normotensos ao nascimento (90-100 mmHg) e apresentam aumento espontâneo da pressão arterial a partir da sexta semana de vida, podendo alcançar valores próximos a 200 mmHg aos 12 meses de idade (Yamori, 1994). Além da hipertensão, estudos anteriores, incluindo alguns realizados pelo nosso grupo de pesquisa, mostraram que os SHR apresentam alterações no metabolismo ósseo associadas ao genótipo e fenótipo hipertensivo. Essas alterações incluem menor crescimento e densidade mineral óssea, bem como um aumento no turnover ósseo (Inoue et al., 1995; Izawa et al., 1985; Tiyasatkulkovit et al., 2019). Observou-se também um atraso na osteogênese in vitro de precursores mesenquimais em SHR (Chaves Neto et al., 2018; Landim de Barros et al., 2016) e um prejuízos no reparo ósseo (Bastos et al., 2010; Manrique et al., 2012). Além disso, a resposta inflamatória na doença periodontal é aumentada em SHR em comparação com ratos normotensos (Bonato et al., 2012), Com base nisso, o SHR é um modelo interessante para investigar os mecanismos associados à progressão da doença periodontal no contexto da 45 hipertensão. Como mencionado, vários mecanismos estão envolvidos na patogênese da hipertensão e podem também estar relacionados à progressão da doença periodontal. Nesta tese, abordaremos especificamente a participação do sistema renina-angiotensina, um dos principais mecanismos fisiopatológicos na hipertensão, e os microRNAs, um mecanismo epigenéticos com importante papel na regulação transcricional, discutidos nos tópicos subsequentes desta introdução. 46 O SITEMA RENINA-ANGIOTENSIA E SUA RELAÇÃO COM A DOENÇA PERIODONTAL O sistema renina-angiotensina (SRA), esquematizada na Figura 3, é um sistema peptídico de natureza endócrina, com importante papel na regulação das funções cardiovasculares e renais, como a pressão arterial e o equilíbrio hidroeletrolítico (Laghlam et al., 2021). De maneira resumida, o sistema é composto pelo angiotensinogênio (Agt), que é o principal substrato do SRA e é produzido principalmente no fígado. O Agt é clivado na circulação pela enzima renina (Ren) (produzida majoritariamente pelas células justaglomerulares renais), formando a angiotensina I (AngI) (Hackenthal et al., 1990). A AngI é então convertida em angiotensina II (AngII) pela enzima conversora de angiotensina (Eca ou Ace), que está presente principalmente nas células endoteliais vasculares do tecido pulmonar (Soubrier et al., 1993). A AngII é considerada o principal peptídeo ativo do SRA e suas ações são mediadas pelos receptores de angiotensina II do tipo 1 e 2 (Agt1r ou AT1R e Agt2r ou AT2R) (de Gasparo et al., 2000). Ambos, receptores transmembrana acoplados a proteína G, mas interessante notar que o AT1R tem efeitos vasoconstritores, pró- inflamatórios e pró-oxidantes, enquanto o AT2R tem efeitos vasodilatadores e anti- inflamatórios, e tem sido demonstrado como um contrarregulador endógeno do AT1R (AbdAlla et al., 2001). Além do eixo AngII-AT1R/AT2R, existe um outro eixo chamado de não canônico, que envolve a produção de outros peptídeos ativos. Um desses peptídeos é a angiotensina 1-7 (Ang1-7), produzida a partir da clivagem da AngII pela Eca2. A 47 Ang1-7 também pode ser produzida a partir da AngI pela Eca2, através da formação de angiotensina 1-9 (Ang1-9) e subsequente conversão em Ang1-7 pela Eca. As ações da Ang1-7 são mediadas pelo receptor Mas (Masr), e possui efeitos biológicos similares aos do AT2R, incluindo vasodilatação, ação anti-inflamatória e antioxidante (Jackson et al., 1988). Em resumo, o eixo não canônico Eca2-Ang1-7- MasR atua como um mecanismo de contra regulação dos efeitos da via AngII-AT1R. Ele limita o acúmulo de AngII e exerce efeitos biológicos opostos, neutralizando, pelo menos em parte, as ações do AT1R (F. Jiang et al., 2014). Figura 3. Componentes do sistema renina-angiotensina. Adaptado de BioRender Template Brain Renin Angiotensin System (Walls A, 2023). 48 Além do sistema renina-angiotensina endócrino, classicamente descrito, foi observado que os componentes do SRA também estão presentes em diferentes tecidos, o que levou à caracterização dos chamados sistemas renina-angiotensina locais, ou tecido-específicos. Esses sistemas podem atuar parcialmente ou totalmente independentemente dos componentes circulantes do SRA (Paul et al., 2006), ampliando assim a compreensão do SRA como não apenas um sistema endócrino, mas também como um sistema parácrino e autócrino. A expressão dos componentes do SRA em tecidos específicos tem sido amplamente documentada (Campbell, 2014), e desempenham papéis importantes em diversas funções fisiológicas e patológicas, incluindo a resposta inflamatória, proliferação e diferenciação celular, metabolismo, resposta a lesões e estresse, e reparo tecidual (Almutlaq et al., 2021; Husain et al., 2015; Saravi et al., 2021; Shahveisi et al., 2014). No contexto da biologia periodontal, estudos têm descrito a presença de sistemas renina-angiotensina locais nos tecidos periodontais em diferentes modelos experimentais (Ohuchi et al., 2004; Santos et al., 2015; Souza et al., 2007). Além disso, a inibição da via AngII-AT1R já foi associada à inibição do processo inflamatório periodontal (Dionisio et al., 2020; Gabriele et al., 2017; Li et al., 2019; Oliveira et al., 2019). Essas evidências sugerem o envolvimento dos sistemas renina-angiotensina locais na regulação da inflamação e da resposta imune na doença periodontal. No entanto, a regulação desses sistemas no tecido ósseo alveolar ainda é pouco estudada e requer mais investigações. De fato, estudos clínicos e experimentais têm evidenciado um papel importante do sistema renina-angiotensina na biologia óssea (Mo et al., 2020; Zhao et al., 2019), no entanto, alguns resultados são conflitantes. Por exemplo, estudos mostraram que 49 a inibição de renina e a enzima conversora de angiotensina (Eca), pode reduzir a perda óssea alveolar induzida pela doença periodontal (Oliveira et al., 2019) e prejuízos ósseos decorrentes da ovariectomia em camundongos (Zhang et al., 2016). Além disso, a inibição da Eca foi associada a uma maior densidade mineral óssea em homens e mulheres em estudos de coorte (Garcia-Testal et al., 2006; Rianon et al., 2017) e foi capaz de prevenir parcialmente a osteoporose em ratas hipertensas ovariectomizadas (Shimizu et al., 2009). Em relação ao bloqueio do receptor de angiotensina, trabalhos já encontraram associação entre o bloqueio de AT1 e menor incidência de fraturas em idosos (Kwok et al., 2017), enquanto outro estudo não observou diferenças significativas (Butt et al., 2014) Além disso, o eixo Eca2/Ang1-7/Masr tem sido associado aos efeitos preventivos da inibição da Eca em ratas osteoporóticas (Abuohashish et al., 2017). No entanto, um estudo mostrou que o tratamento com os antagonistas de AT1R telmisartan e losartana não teve efeito nos marcadores de turnover ósseo em pacientes hipertensos (Aydogan et al., 2019), enquanto outro estudo mostrou que o telmisartan reduziu a densidade mineral óssea em ratos hipertensos (Birocale et al., 2016). É importante ressaltar que as diferenças nas populações estudadas, nos modelos experimentais e nas metodologias utilizadas podem contribuir para esses resultados conflitantes, e desta forma, a investigação e a melhor compreensão do SRA local na doença periodontal, especialmente na perda óssea alveolar no contexto da hipertensão, podem fornecer insights sobre novas estratégias terapêuticas direcionadas aos tecidos periodontais. 50 MICRORNAS E SUA RELAÇÃO COM A DOENÇA PERIODONTAL Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNA não codificantes, compostos por aproximadamente 22 nucleotídeos, que desempenham um papel fundamental na regulação da expressão gênica. Descobertos em nematoides (Caenorhabditis elegans) em 1993 (Lee et al., 1993), e, desde então, têm sido identificados em diversos organismos como um mecanismo epigenético de regulação pós- transcricional, envolvido em várias funções celulares (Bartel, 2004; Dexheimer & Cochella, 2020). A biogênese dos miRNAs é um processo complexo e finamente regulado. Resumidamente, na via canônica, os genes de miRNA, geralmente encontrados em regiões intergênicas, são transcritos pela RNA polimerase II, dando origem aos microRNAs primários (pri-miRNAs) (Lee et al., 2004). Os pri-miRNAs são transcritos longos, com aproximadamente 200 nucleotídeos, apresentando 5' cap e cauda poli-A, e adotam uma estrutura em forma de grampo (hairpin) (Bartel, 2004; Lee et al., 2002). Ainda no núcleo, os pri-miRNAs são processados pelo complexo microprocessador que inclui a enzima Drosha, uma ribonuclease III de classe 2, e seu cofator DGCRB8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8), uma proteína de ligação a RNA (RNA-binding protein). Os pri-miRNAs são clivados nas regiões terminais 3' e 5', gerando um hairpin menor chamado de miRNA precursor (pré-miRNA), com aproximadamente 70 a 100 nucleotídeos (Han et al., 2004; Lee et al., 2003) (Figura 4A). Os pré-miRNAs são então transportados para o citoplasma por proteínas como a Exportina-5, que reconhece e transporta os pré-miRNAs através dos poros nucleares (Kim, 2004; Lund et al., 2004). No citoplasma, os pré-miRNAs são 51 processados pela enzima Dicer, uma ribonuclease que cliva os pré-miRNAs em uma molécula de RNA de fita dupla (dúplex de microRNA), com cerca de 20-25 nucleotídeos (Lee et al., 2003). As dúplex de microRNA contém as fitas dos miRNAs maduros 3p e 5p, denominados a partir de sua orientação no pré-miRNA, e uma de suas características distintas é não serem perfeitamente paralelas ou complementadas, apresentando pequenos loops (Figura 4A) (Bartel, 2004). Além disso, também existe a biogêneses de miRNAs por vias alternativas, ou não canônicas (Miyoshi et al., 2010). Por exemplo, os miRNAs originados de íntrons de genes codificadores, conhecidos como mirtrons. Nesses casos, os pré-miRNAs são gerados durante o processo de splicing e não requerem o processamento pelo complexo microprocessador, mas seguem a via canônica após a exportação do núcleo (Okamura et al., 2007). A principal ação dos miRNAs é o silenciamento de RNAs mensageiros (mRNA) específicos, que é mediada por um complexo ribonucleoprotéico, denominado RISC (do inglês RNA-induced silencing complex) (Hammond et al., 2001). O miRNA duplex é incorporado ao RISC, e uma das fitas (3p ou 5p) é ancorada seletivamente à proteína Argonauta (Ago), tornando-se a fita funcional, enquanto a outra fita, conhecida como fita passageira, é ejetada do RISC e eventualmente degradada (Figura 4A) (Medley et al., 2021). Embora ambas as fitas possam ser selecionadas, geralmente apenas uma delas predomina como a fita funcional, mas em alguns casos, ambas as fitas são funcionais (Bartel, 2009). Acredita-se que as fitas de miRNA maduras que contenham uracila na região 5' e/ou aquelas com menor estabilidade termodinâmica tenham maior probabilidade de serem selecionadas, embora muitos casos não sigam esses padrões, e os mecanismos que governam a seleção da fita 52 funcional ainda não foram completamente elucidados (Medley et al., 2021; Meijer et al., 2014). Dentro do RISC, os miRNAs interagem com os mRNAs-alvo por meio de pareamento de bases complementares (Figura 4B) (Dexheimer & Cochella, 2020). A sequência seed dos miRNAs, geralmente composta pelos nucleotídeos 2 a 8 na extremidade 5', é o principal elemento de reconhecimento dos mRNAs-alvo, de modo que miRNAs que compartilham a mesma sequência seed são agrupados em famílias. Nos casos em que há o pareamento perfeito da sequência seed com a região 3' não codificante (3'UTR, do inglês untranslated region) do mRNA-alvo, ocorre a degradação desse mRNA. Por outro lado, em casos de pareamento parcial da sequência seed, a interação entre o miRNA e o mRNA pode ser estabilizada pelo pareamento complementar na região 3' do miRNA, resultando na inibição da tradução da proteína do mRNA-alvo (Bartel, 2004) (Figura 4C). Curiosamente, há evidências da ação direta dos miRNAs na regulação positiva da tradução de mRNAs, embora seja um mecanismo ainda pouco estudado (Ramchandran & Chaluvally-Raghavan, 2017). Esse fenômeno foi observado apenas in vitro durante a interrupção do ciclo celular, no estado G0, e não foi observado em estados proliferativos (Bukhari et al., 2016; Truesdell et al., 2012; Vasudevan et al., 2007). 53 Figura 4. Biogênese e mecanismo de ação dos microRNAs. (A) Biogênese dos microRNAs, (*) complexos proteicos representados pelo componente principal; (B) Complexo RISC (do inglês RNA-induced silencing complex); (C) Mecanismos de ação dos microRNAs. Criado com BioRender.com (Brito, 2023) A maioria dos processos biológicos é regulada de alguma forma por microRNAs Embora apenas cerca de 2% do genoma humano consista em genes miRNA, estima- se que mais de 60% dos genes codificadores sejam regulados por miRNAs em nível pós-transcricional (Friedman et al., 2009). Devido ao seu pequeno tamanho, os miRNAs têm o potencial de modular a expressão de centenas ou até milhares de genes simultaneamente. No entanto, é importante destacar que a função biológica dos miRNAs é específica para tecidos ou células. As interações entre miRNAs e mRNAs ocorrem quando o miRNA está suficientemente expresso simultaneamente com seus mRNAs-alvos (Bartel, 2009). 54 Essas interações resultam em alterações sutis na expressão gênica e/ou proteica e, às vezes, atuam de forma redundante nos circuitos de regulação gênica, mediando o chamado "efeito tampão" sobre o ruído transcricional. Isso contribui para a robustez das redes regulatórias de expressão gênica, reduzindo a flutuação na transcrição genética e, consequentemente, na tradução proteica (Ebert & Sharp, 2012; Strovas et al., 2014). A regulação de processos biológicos por miRNAs geralmente envolve uma rede de diferentes miRNAs que podem modular de forma redundante a mesma via biológica, produzindo coletivamente um efeito biológico robusto. Isso ocorre especialmente quando os alvos são elementos centrais de uma via biológica, produzindo coletivamente efeitos generalizados, como na sobrevivência e proliferação celular, metabolismo, diferenciação celular e morfogênese (Alvarez-Garcia & Miska, 2005; Ambros, 2004). A sofisticação e sutileza da regulação genética mediada por miRNAs são talvez seus aspectos mais interessantes. Os avanços nas técnicas para avaliação de sua expressão, assim como para a modulação de sua expressão in vivo e in vitro tem tornado os miRNAs potencialmente uteis no estudo de doenças complexas, inclusive como ferramentas terapêuticas e diagnósticas. No entanto, investigar a função de miRNAs específicos pode ser desafiador, uma vez que seus efeitos dependem dos mRNA-alvos. Identificar e validar essas interações requer o uso de técnicas como avaliação do transcriptoma, imunoprecipitação e ensaios de luciferase. Nesse contexto, avanços nas análises computacionais (in silico) têm se mostrado cada vez mais úteis para direcionar essas investigações (Riolo et al., 2020). Quanto à modulação da expressão dos miRNAs, técnicas baseadas em vetores virais e o uso de moléculas de RNA sintéticas que mimetizam ou antagonizam miRNAs endógenos têm se mostrado abordagens 55 experimentais muito úteis. Entretanto, a aplicação clínica dos miRNAs requer uma compreensão mais aprofundada de suas funções no transcriptoma e proteoma de diferentes tipos de células e tecidos, bem como de seus possíveis efeitos adversos (off-target) (Hanna et al., 2019; McAlinden & Im, 2018). Vários miRNAs já foram associados à regulação de processos inflamatórios e reparo tecidual (Jiang et al., 2022; Sonkoly & Pivarcsi, 2009), incluindo na doença periodontal (Irwandi & Vacharaksa, 2016; Mico-Martinez et al., 2021). Por exemplo, o miR-146a é um dos miRNAs mais estudados no contexto da inflamação periodontal, e sua regulação positiva no tecido gengival e na circulação tem sido associada à gravidade da doença periodontal, sendo considerado um importante biomarcador (Ghotloo et al., 2019; Motedayyen et al., 2015; Xie et al., 2011). Além disso, miRNAs da família miR-200 foram associados a efeitos anti-inflamatórios, reduzindo a produção de citocinas e a formação de osteoclastos (Akkouch, Eliason, et al., 2019; Akkouch, Zhu, et al., 2019; Krongbaramee et al., 2021). No entanto, é importante ressaltar que a maioria dos estudos na área da biologia periodontal tem se concentrado na investigação dos tecidos moles do periodonto, como a gengiva e o ligamento periodontal, além de matrizes biológicas, como saliva e fluido crevicular, mas a pesquisa sobre a modulação de miRNAs relacionada às alterações no osso alveolar ainda é limitada. O perfil de expressão de miRNAs já foi avaliado na mandíbula de camundongos com osteoporose induzida por ovariectomia (Hao et al., 2016) e na maxila de ratos com lesão periapical (Gao & Zheng, 2013). No entanto, em relação ao osso alveolar especificamente, no contexto da doença periodontal, os estudos ainda são escassos. Nas áreas da biologia óssea e ortopedia, os miRNAs tem sido extensivamente estudada na homeostase e em desordens do tecido ósseo (Hensley & McAlinden, 56 2021; Liu et al., 2019). Além disso, a função de vários miRNAs já foram funcionalmente caracterizada em osteoblastos (Arfat et al., 2015) e osteoclastos (Lozano et al., 2019; Weivoda et al., 2021). Há uma necessidade melhor compreender o papel de miRNAs na regulação do osso alveolar no contexto da doença periodontal, como proposto no capítulo 2 desta tese. Esse estudo pode fornecer insights sobre os mecanismos moleculares envolvidos na progressão da doença, e potencialmente evidenciar miRNAs relevantes que direcionem abordagens terapêuticas mais eficazes para o tratamento da doença periodontal e outras condições relacionadas ao tecido ósseo. 57 O TECIDO ÓSSEO, OSTEOGÊNESE E A RELAÇÃO COM MICRORNAS O tecido ósseo é uma forma rígida de tecido conjuntivo que desempenha diversas funções essenciais no organismo humano. Além de fornecer suporte e proteção aos tecidos moles, o tecido ósseo também possui funções metabólicas, endócrinas e hematopoiéticas, tornando-se um componente fundamental para a homeostase e a saúde geral do corpo (Burr & Allen, 2019). O desenvolvimento do esqueleto tem início no primeiro trimestre intrauterino e continua ao longo dos anos pós-natais, ocorrendo por meio de dois processos distintos: ossificação intramembranosa e ossificação endocondral. A ossificação intramembranosa resulta na formação de ossos chatos e de formato irregular, como os ossos do crânio, incluindo a mandíbula e a maxila, a escápula e a clavícula. Esse processo acontece dentro de membranas de tecido conjuntivo, através da aglomeração de células-tronco mesenquimais que se diferenciam em osteoblastos, formando um centro primário de ossificação. Por outro lado, a ossificação endocondral é responsável pela formação da maioria dos ossos e ocorre a partir de um molde de cartilagem, que é gradualmente substituído por tecido ósseo mineralizado, por meio da diferenciação osteogênica dos condrócitos. Macroscopicamente, os ossos maduros podem ser divididos em osso cortical (ou compacto), que é essencial para suportar cargas devido à sua maior densidade, e osso trabecular (ou esponjoso), que é mais poroso e possui uma microarquitetura específica, desempenhando um papel importante na redistribuição das tensões exercidas sobre o osso para a região cortical. A regulação da composição mineral e organização da matriz orgânica do tecido é essencial para a manutenção das propriedades e funções dos ossos. A matriz inorgânica, composta principalmente por 58 hidroxiapatita contendo cálcio e fosfato, representa cerca de 65% do peso seco dos ossos. Além disso, outros componentes, como carbonatos, citratos, sódio, fluoretos e estrôncio, estão presentes em proporções menores (Fleisch, 2000). A matriz orgânica, por sua vez, constitui aproximadamente 25% do peso dos ossos e é composta principalmente por proteínas colágenas (cerca de 90%) e proteínas não colágenas, como osteopontina, osteonectina, sialoproteína óssea e osteocalcina (Burr & Akkus, 2014). A matriz orgânica serve de arcabouço para a deposição mineral e é fundamental para a microarquitetura do tecido ósseo, conferindo força, rigidez e regulando a taxa de deposição mineral. A homeostase dinâmica do tecido ósseo é mantida através das atividades coordenadas de osteoblastos e osteoclastos. Os osteoclastos têm origem na diferenciação e fusão de macrófagos na medula óssea e são responsáveis pela reabsorção óssea através da liberação de enzimas e ácidos que degradam a matriz mineralizada (Veis & O'Brien, 2023). Eles desempenham um papel fundamental no remodelamento ósseo, um processo contínuo, que permite a substituição do tecido velho ou danificado por um tecido novo, essencial para a manutenção da integridade do esqueleto adulto (Siddiqui & Partridge, 2016; L. Wang et al., 2022). Os osteoblastos, por sua vez, têm origem nos precursores mesenquimais do estroma da medula óssea e são responsáveis pela formação óssea, incluindo a produção e a mineralização da matriz extracelular (Long, 2011). A osteogênese é um processo finamente controlado por diversos fatores que regulam os diferentes estágios da diferenciação. A diferenciação na linhagem osteogênica se inicia com o comprometimento fenotípico de células osteoprogenitoras, e depende de dois fatores de transcrição mestres, o fator de transcrição relacionado a runt-2 (Runx2, alternativamente, Cbfa1) (Komori et al., 59 1997), e osterix (Osx, alternativamente, Sp7) (Nakashima et al., 2002). Ambos são essenciais tanto nos estágios iniciais quanto na manutenção do fenótipo osteoblástico (Long, 2011)., e regulam a expressão de outros genes associados às funções dos osteoblastos como colágeno tipo I, fosfatase alcalina, sialoproteína óssea, e osteocalcina, brevemente descritos a seguir: a) Colágeno tipo I (Cal1a1): Amplamente produzido pelos osteoblastos e o principal constituinte da matriz extracelular que confere rigidez, estabilidade e resiliência ao tecido devido a sua configuração estrutural e organização (Brodsky & Persikov, 2005); b) Fosfatase alcalina (Fal ou Alp): Enzima ancorada na membrana dos osteoblastos com um importante papel na disponibilização de íons fosfato para o processo de deposição mineral (Pizauro et al., 1995; Simao et al., 2007); c) Osteopontina (Opn): Proteína não-colágena abundante com papel na adesão das células ósseas (Butler et al., 1996), além regulam sua ativação e motilidade (Denhardt et al., 2001; Reinholt et al., 1990; Ross et al., 1993); d) Sialoproteína óssea (Bsp): Proteína expressa no início da mineralização e com alta afinidade as fibras de colágeno, contribuindo para a nucleação inicial dos cristais de hidroxiapatita (Fujisawa et al., 1995; Ganss et al., 1999); e) Osteocalcina (Ocn): Uma das principais proteínas não colágenas da matriz óssea e considerada um marcador da maturação dos osteoblastos, por ser expressa no estágio tardio da diferenciação; Tem alta afinidade aos cristais de hidroxiapatita, sendo componente chave da mineralização, regulando o crescimento dos cristal (Boskey et al., 1998). O progresso da diferenciação é marcado pela relação inversa com proliferação destas células e pelo padrão temporal da expressão destas proteínas específicas, que 60 podem ser usadas como marcadores das fases do desenvolvimento e função dos osteoblastos, como esquematizados na Figura 5. Figura 5. Principais fases e marcadores da diferenciação osteogênica. Runx2, Runt-related transcription factor 2; Osx, osterix; Col1, colágeno tipo 1; OPN, osteopontina; ALP, fosfatase alcalina; OCN, osteocalcina; BSP, sialoproteína óssea; HÁ, hidroxiapatita. Criado com BioRender.com, baseado em Stein and Lian (1993). Após a maturação, os osteoblastos têm três destinos possíveis. Eles podem permanecer na matriz mineralizada, diferenciando-se em osteócitos, que constituem cerca de 95% das células no tecido ósseo maduro. Os osteócitos desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase do tecido, regulando a remodelação óssea em resposta a sinais mecânicos e hormonais (Delgado-Calle & Bellido, 2022; 61 Robling & Bonewald, 2020). Outra possibilidade é que os osteoblastos maduros se tornem osteoblastos quiescentes, que revestem as superfícies ósseas inativas (Miller et al., 1989), e por fim, alguns osteoblastos podem entrar em apoptose (Jilka et al., 1998). Os miRNAs têm um importante papel tanto na diferenciação das células osteoprogenitoras quanto na atividade das células maduras, regulando a rede de expressão gênica que governa as respostas dessas células a diferentes estímulos. Nesse contexto, um número crescente de miRNAs vem sendo identificado e estudado, como revisado por diferentes autores (Hensley & McAlinden, 2021; Huang et al., 2017; Wang et al., 2019). Por exemplo, estudos têm demonstrado que a superexpressão de miR-23a, miR-27b-3p, miR-93-5p, miR-132-3p e miR-145 inibe a diferenciação osteogênica in vitro de precursores mesenquimais (Hao et al., 2018; Peng et al., 2017; Xu et al., 2019; Zhang et al., 2019; Zhang et al., 2017), enquanto a superexpressão de miR-29a, miR-98 e miR-342-3p tem o efeito oposto (Gao et al., 2018; Han et al., 2018; Tan et al., 2018). As desordens esqueléticas geralmente são caracterizadas por um desequilíbrio na diferenciação e função dos osteoblastos e osteoclastos, por exemplo em condições como osteoporose, osteoartrite e doença periodontal. Nessas condições, processos inflamatórios crônicos dentro ou próximos aos ossos prejudicam a dinâmica tecidual adequada, e prejuízos na osteogênese podem comprometer o reparo da reabsorção óssea patológica (Epsley et al., 2020; Redlich & Smolen, 2012). Nesse contexto, devido a sua capacidade dos miRNAs em regular várias proteínas e vias diferentes, esses têm chamado a atenção como candidatos promissores para a terapia de doenças complexas (McAlinden & Im, 2018; Simonson & Das, 2015). 62 Os avanços nas tecnologias de modulação dos miRNAs in vivo têm aberto caminho para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas interessantes, e além disso os miRNAs podem ser úteis como marcadores diagnósticos e prognósticos, bem como para o monitoramento terapêutico. Um exemplo interessante é a modulação transiente de miRNAs por meio de inibidores e agonistas, também chamados de mímicos ou antagomiRs, que oligonucleotídeos sintéticos, com modificações químicas que os tornam mais estáveis que os miRNAs endógenos, o que já veem sendo explorados por a companhias biofarmacêuticas (Chakraborty et al., 2021). Entretanto, é importante ressaltar que a maioria dessas novas abordagens ainda são experimentais, e não uma realidade clínica. Avanços importantes ainda precisam ser feitos em relação a melhor caracterização dos efeitos dessas molecular a nível sistêmico, bom como possíveis efeitos off-target (Jin et al., 2015). Além disso, a administração local desses novos “medicamentos” ainda é desafiadora em tecidos mineralizados (Saiyed et al., 2022). Ainda assim, a caracterização funcionais de novos miRNAs na homeostase dos tecidos e em desordens de interesse clínico são de grande interesse para a comunidade, como proposto no capítulo 3 desta tese, onde avaliamos os efeitos do miR-127-3p na osteogênese de precursores mesenquimais in vitro, após identificarmos que este miRNA foi inibido na mandíbula de ratos com doença periodontal. 63 PROPOSIÇÃO A doença periodontal e a hipertensão arterial são altamente prevalentes e compartilham fatores de risco comuns, além de possíveis relações causais. Essas condições representam um desafio significativo à saúde pública, com impacto na qualidade de vida dos indivíduos acometidos, e especialmente preocupante nas populações em situação de vulnerabilidade socioeconômica, onde a prevalência é muito maior. Vale ressaltar que o estudo dessas condições em humanos é desafiador devido à dificuldade de estratificar populações que apresentem apenas uma dessas condições, uma vez que são amplamente prevalentes e frequentemente estão associadas a outras comorbidades. Nesse sentido, o uso de modelos experimentais desempenha um papel fundamental, pois permite um maior controle das variáveis a serem analisadas e oferece maior flexibilidade no delineamento de intervenções e condições experimentais, sempre respeitando as diretrizes éticas para o uso de animais em pesquisa. No contexto do presente trabalho, os animais SHR se destacam como um modelo interessante, uma vez que apresentam uma progressão agravada da doença periodontal associada ao fenótipo hipertensivo. Nosso trabalho teve como propósito investigar a participação do sistema renina-angiotensina, um mecanismo patológico importante na hipertensão que já foi associado à progressão da doença periodontal. Além disso, analisamos o perfil de miRNAs na mandíbula desses animais. A maioria dos estudos disponíveis se concentram nos tecidos moles do periodonto, havendo uma lacuna em relação aos microRNAs específicos do osso alveolar, e sua relação as alterações induzidas pela doença periodontal. 64 Por fim, a partir de miRNAs diferencialmente expressos na mandíbula de animais com doença periodontal, buscamos por aqueles que apresentassem sequência conservada entre espécies e cuja função na diferenciação de células osteoprogenitoras não houve sido elucidada, a fim de identificar miRNAs que pudessem ter um papel significativo não apenas no osso alveolar, mas na homeostase óssea, ou em desordens ósseas de outras naturezas. Nesse contexto, realizamos a caracterização funcional de um microRNAs de interesse, miR-127-3p, na diferenciação osteogênica de células mesenquimais da medula óssea humana. Esta tese foi então dividida em três capítulos, apresentados na forma de artigos científicos, cujos objetivos estão elencados a seguir. Destacamos aqui a importância destes trabalhos, que visam uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na progressão da doença periodontal no contexto da hipertensão arterial. 65 OBJETIVOS 66 OBJETIVO GERAL Investigar os mecanismos relacionados à perda óssea alveolar induzida pela doença periodontal em ratos hipertensos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS A. Avaliar a participação do sistema renina-angiotensina local na perda óssea alveolar em ratos espontaneamente hipertensos com doença periodontal, através da inibição farmacológica do receptor de angiotensina II do tipo 1. B. Avaliar o perfil de expressão diferencial de miRNAs associado à perda óssea alveolar em ratos espontaneamente hipertensos com doença periodontal, por meio de microarranjos, e evidenciar possíveis mecanismos regulados por miRNAs através de análises bioinformáticas. C. Caracterizar a função do miR-127-3p na diferenciação osteogênica, por meio do silenciamento e superexpressão in vitro em células osteoprogenitoras humanas 67 - CAPÍTULO 1 - 68 PAPEL DOS TELMISARTAN SOBRE O METABOLISMO ÓSSEO NA 1 MANDÍBULAS DE RATOS NORMOTENSOS E ESPONTANEAMENTE 2 HIPERTENSOS COM DOENÇA PERIODONTAL 3 4 Neste Capítulo 1, apresenta-se um estudo sobre a influência do sistema 5 renina-angiotensina na perda óssea alveolar induzida pela doença periodontal em 6 ratos espontaneamente hipertensos. Os dados foram publicados em forma de artigo 7 científico, do qual foram extraídas as figuras (Brito VGB, Patrocinio MS, de Sousa 8 MCL, Barreto AEA, Frasnelli SCT, Lara VS, Santos CF, Oliveira SHP. Telmisartan 9 Prevents Alveolar Bone Loss by Decreasing the Expression of Osteoclast Markers in 10 Hypertensive Rats with Periodontal Disease. Front Pharmacol. Nov 2020 11; 11 11:579926. doi: 10.3389/fphar.2020.579926). 12 13 14 RESUMO 15 A doença periodontal (DP) é uma condição inflamatória com alta prevalência, sendo 16 a perda óssea alveolar sua consequência mais severa. Estudos têm demonstrado um 17 papel importante do sistema renina-angiotensina (SRA) no processo inflamatório, o 18 qual já foi caracterizado em tecidos periodontais. Neste trabalho, nosso objetivo foi 19 avaliar os efeitos do telmisartan (TELM), um antagonista do receptor tipo 1 da 20 angiotensina II (Agtr1), na perda óssea alveolar induzida pela DP em ratos Wistar 21 (normotensos) e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs). A DP foi induzida por 22 meio de ligadura bilateral nos primeiros molares inferiores em ratos tratados com 23 TELM (10 mg/kg), durante 15 dias. Os SHRs apresentaram maior perda óssea 24 alveolar em comparação com os Wistar, a qual foi significativamente prevenida pelo 25 TELM, parcialmente explicada pela redução da produção de citocinas inflamatórias. 26 Em relação à modulação dos componentes do SRA na mandíbula, a DP resultou em 27 aumento da expressão de Agt, enquanto a expressão de Agtr2 diminuiu. Por sua vez, 28 o tratamento com TELM reduziu a expressão de Agtr1, aumentou a expressão de 29 Agtr2, além de elevar a expressão de Runx2 e Alp, e prevenir o aumento da expressão 30 de marcadores de reabsorção óssea, Mmp9, Ctsk e Vtn. Nosso estudo sugere que o 31 TELM possui um efeito protetor na progressão da DP, especialmente em animais 32 69 hipertensos, parcialmente explicado pela modulação na expressão dos receptores de 33 angiotensina II (Agtr1 e Agtr2), menor produção de mediadores inflamatórios, menor 34 expressão dos marcadores de reabsorção e aumento da expressão dos marcadores 35 de formação óssea. 36 37 38 1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO 39 A doença periodontal (DP) é considerada a doença inflamatória mais prevalente 40 mundialmente, afetando principalmente as estruturas que revestem e sustentam os 41 dentes, incluindo a gengiva, o ligamento periodontal e o osso alveolar (Pihlstrom et 42 al., 2005). Sem cuidados adequados, pode levar à perda dentária, redução na 43 qualidade de vida, dificuldades de mastigação e problemas na fala, sendo, portanto, 44 considerada um problema de saúde pública. A DP se inicia com a inflamação gengival 45 causada pelo acúmulo de biofilme nos dentes. No entanto, a progressão da DP não 46 depende apenas de fatores microbianos, mas também da resposta inflamatória do 47 organismo, que desempenha um papel fundamental na destruição dos tecidos. 48 Comorbidades como hipertensão podem afetar significativamente a gravidade da 49 doença, aumentando a carga inflamatória e induzindo alterações como aumento do 50 estresse oxidativo e ativação do sistema renina-angiotensina (SRA) (Macedo Paizan 51 & Vilela-Martin, 2014). 52 O SRA é um importante sistema endócrino que regula o equilíbrio de eletrólitos 53 e a pressão arterial, desempenhando um papel central na patogênese da hipertensão. 54 Além disso, tem sido amplamente estudado por seu papel na inflamação. De forma 55 resumida, o angiotensinogênio (Agt) é clivado pela renina em angiotensina (Ang) I, 56 que, por sua vez, é clivada pela enzima conversora de angiotensina (Ace) em Ang II. 57 Os principais efeitos da Ang II são mediados pelo receptor tipo 1 (At1r), incluindo 58 70 vasoconstrição, aumento da pressão arterial, estresse oxidativo e estado inflamatório 59 (Capettini et al., 2012; Paul et al., 2006). Por outro lado, o receptor tipo 2 da Ang II 60 (At2r) tem efeitos opostos, induzindo vasodilatação para reduzir a pressão arterial, 61 além de possuir ações anti-inflamatórias (Paz Ocaranza et al., 2020). 62 Além do eixo clássico, ou canônico, o eixo não-canônico do SRA envolve a 63 enzima conversora de angiotensina 2 (Ace2), que cliva a Ang II em Ang 1-7 ou a Ang 64 I em Ang 1-9, que pode ser clivada pela Ace em Ang 1-7. A Ang 1-9 pode ativar o 65 receptor At2r, enquanto a Ang 1-7 se liga ao receptor Mas (Masr), desencadeando 66 efeitos opostos aos da sinalização do At1r, semelhantes aos do At2r, constituindo um 67 mecanismo endógeno de contra regulação (Simoes e Silva et al., 2013). Os 68 componentes do SRA são expressos em diferentes tecidos, compondo SRA locais, 69 que podem atuar de maneira coordenada ou independente ao SRA sistêmico (Giese 70 & Speth, 2014; Shimizu et al., 2008). Estudos já mostram a existência de um SRA 71 local nos tecidos osseos (Asaba et al., 2009; Izu et al., 2009; Yongtao et al., 2014; 72 Zhang et al., 2014), além de estudos in vitro que evidenciaram a expressão dos 73 receptores de Ang II em osteoblastos e osteoclastos (Asaba et al., 2009) (Izu et al., 74 2009). 75 O telmisartan (TELM) é um potente antagonista do receptor At1r, e usado 76 clinicamente no tratamento da hipertensão, por apresentar vantagens em relação a 77 outras drogas da mesma classe, incluindo alto volume de distribuição, meia-vida longa 78 e, consequentemente, efeitos de maior duração, podendo ser administrado em doses 79 diárias únicas (Deppe et al., 2010; Frampton, 2011). Além disso, o TELM tem ação 80 como agonista parcial do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma-γ 81 (PPAR-γ) (Fujimura et al., 2013; Kakuta et al., 2014). Os efeitos do TELM no 82 metabolismo ósseo já foram estudados, porém os resultados são controversos. 83 71 Aydogan et al. (2019) observaram que TELM não teve efeitos sobre os marcadores 84 de remodelação óssea em hipertensos recém-diagnosticados. Por outro lado, Ma et 85 al. (2010) demonstraram que o TELM reduziu a perda óssea induzida por rosiglitazona 86 em ratas espontaneamente hipertensas (spontaneously hypertensive rats, SHRs) 87 ovariectomizadas, enquanto, Birocale et al. (2016) observaram que o tratamento com 88 TELM levou a prejuízos ósseos em SHRs machos. 89 Nosso grupo mostrou em trabalhos anteriores que SHRs apresentam um 90 processo inflamatório periodontal exacerbado associado ao fenótipo hipertensivo 91 (Bonato et al., 2012). Além disso, a inibição do SRA pode prevenir a reabsorção 92 alveolar induzida pela DP (Dionisio et al., 2019; Oliveira et al., 2019). Desta forma, 93 nosso objetivo foi avaliar os efeitos do TELM na perda óssea alveolar de ratos 94 normotensos e hipertensos com DP, uma vez que os efeitos desta droga ainda não 95 são claramente compreendidos, além de investigar a participação do SRA local na 96 DP, no contexto da hipertensão. 97 98 99 2. MATERIAL E MÉTODOS 100 101 2.1. Animais e aspectos éticos 102 Foram utilizados 66 ratos machos (Rattus novergicus), de 10 semanas de 103 idade, da linhagem Wistar e SHR (Spontaneouly Hypertensive Rats), oriundos do 104 Biotério do Departamento de Ciências Básicas, da Faculdade de Odontologia de 105 Araçatuba, Unesp. Os animais Wistar e SHR foram mantidos em salas, com umidade 106 e temperatura controlada (22 ± 1ºC), ciclo claro/escuro (12/12 horas), 3-4 animais por 107 caixa forradas com maravalha, consumindo o mesmo tipo de ração (Labina, Nestlé, 108 72 Brasil) e água potável ad libitum. Os protocolos experimentais foram aprovados pela 109 Comissão Local de Ética para Experimentação Animal (Protocolo CEUA/FOA nº 110 00686-2016; certificado encontra-se no Anexo I). 111 112 2.2. Tratamento com telmisartan 113 Os animais foram tratados com telmisartan 10 mg/kg/dia (Micardis®; 114 Boehringer Ingelheim; São Paulo, SP, Brasil). Um comprimido foi dissolvido em PBS 115 a 10 mg de telmisartan/mL, e administrada por gavage uma vez ao dia, por 15 dias, 116 começando 1 dia antes da indução da doença periodontal. Os animais foram pesados 117 a cada 5 dias para o ajuste do volume administrado. A dose de tratamento foi baseada 118 na literatura (Araujo et al., 2013; Wienen et al., 2001). 119 120 2.3. Indução da doença periodontal 121 Os animais foram anestesiados pela administração intraperitoneal de 122 hidrocloreto de quetamina 80 mg/Kg (Cetamim, Syntec; Hortolândia, SP, Brasil) e 123 hidrocloreto de xilazina 10 mg/Kg (Calmium, Agener União; Embu-Guaçu, SP, Brasil) 124 e posicionados em decúbito ventral, em mesa odontológica adaptada para roedores, 125 com retratores apoiados nos dentes incisivos. Foi então realizada a inserção das 126 ligaduras bilaterais (fio de sutura de seda USP 4-0; Ø 0,15 mm) nos primeiros molares 127 inferiores, com amarração mesial. Após 15 dias, foi realizada a medida da pressão 128 arterial média, e os animais foram submetidos à eutanásia (Isofluorano; Cristália, 129 Itapina, SP, Brasil), para coleta de plasma e hemi-mandíbulas. 130 131 132 73 2.4. Medida não invasiva da pressão arterial sistólica 133 A medida indireta da pressão arterial sistólica (PAS) foi realizada por 134 pletismografia de cauda (sistema NIBP acoplado ao PowerLab System; 135 ADInstruments; Sydney, Austrália). Brevemente, os animais foram imobilizados em 136 um contensor cilíndrico e um manguito de pressão foi instalado no terço proximal da 137 cauda, e um transdutor de pulso foi posicionado sob a artéria caudal. O manguito foi 138 inflado até 240 mmHg e lentamente desinflado, resultando na interrupção e retorno do 139 sinal de pulso, respectivamente. A medida de PAS foi determinada pelo valor de 140 pressão do manguito quando observado o retorno do sinal de pulso. Foram realizadas 141 três medidas consecutivas e o valor médio foi considerado. Os animais foram 142 ambientados ao procedimento uma vez ao dia, por três dias, para reduzir alterações 143 dos resultados causadas por estresse. 144 145 2.5. Dosagem plasmática de fosfatase alcalina (FAL) e fosfatase ácida resistente 146 ao tartarato (TRAP) 147 O sangue total dos animais foi coletado em tubos com heparina e o plasma foi 148 separado por centrifugação (10 min × 1500 RCF), e a atividade das enzimas foi 149 determinada por ensaio colorimétrico (Fernandes et al., 2020). Brevemente, para o 150 ensaio de ALP, a reação compreendeu 2,5 mM de p-nitrofenil fosfato (pNPP), 2 mM 151 de MgCl2 e 25 mM de tampão de glicina (pH 9,4) e a para o ensaio de TRAP, a reação 152 compreendeu 10 mM de pNPP, 50 mM de tartarato de sódio, 1 mM de p-hidroxi-153 benzoato de mercúrio e 100 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,8). A atividade 154 enzimática foi calculada pela quantidade de substrato hidrolisado (pNPP) por minuto, 155 a 37 °C, e normalizada pela quantidade de proteína total, determinado pelo método 156 de Lowry (Lowry et al., 1951). 157 74 158 2.6. Microtomografia computadorizada (microCT) 159 As hemi-mandíbulas direitas coletadas e foram armazenadas em PBS a -20°C 160 até a realização do ensaio. Os escaneamentos foram realizados em tomógrafo 161 SkyScan 1272 (Bruker microCT; Kontich, Bélgica). Os espécimes foram posicionados 162 verticalmente e as radiografias adquiridas com os seguintes parâmetros: 70kVp; 163 142μA; filtro de alumínio 0.5 mm; voxel isotrópico 9 µm; tempo de exposição 1100 ms; 164 rotação de 0.5º (rotação total de 180º). As imagens foram reconstruídas com o 165 software NRecon (v1.6, Bruker), alinhadas com o software DataViewer (v1.5.1.2, 166 Bruker), e analisadas com o software CT Analyser (v1.13, Bruker). 167 Para análise do osso alveolar, uma região de interesse (ROI) foi padronizada a 168 partir de pontos anatômicos (limite superior: teto da furca; limite inferior: 100 fatias a 169 partir do teto (900 µm); limite distal: raiz proximal do 2º molar; limite proximal: raiz 170 proximal do 1º molar; e limites vestibular e lingual: limites do osso alveolar). Um 171 volume de interesse (VOI) foi delimitado automaticamente considerando as bordas do 172 osso alveolar na ROI, removendo o volume do dente (cora e raízes). Foram medidas 173 a porcentagem de osso (BV/TV), e número, espessura e separação de trabéculas 174 (Tb.N, Tb.Th, e Tb.Sp) (Bouxsein et al., 2010). Imagens tridimensionais 175 representativas de cada grupo foram construídas com o software CTvox (v3.0, 176 Bruker). 177 178 2.7. Dosagem de mediadores inflamatórios 179 As hemi-mandíbulas esquerdas foram cortadas na região dos molares, os 180 tecidos moles adjacentes foram removidos, e os espécimes foram maceradas em 181 nitrogênio líquido, e homogeneizadas com um tampão de lise (Tris 100 mM, NaCl 150 182 75 mM, Tween 20 1%, deoxicolato de sódio 0.5% e coquetel inibidor de proteases 183 cOmplete™/Sigma, pH 7.4), usando um homogeneizador de tecidos (Omni TH, Omni 184 International; Tulsa, Oklahoma, EUA). As amostras foram centrifugadas (16000 RCF, 185 20 minutos, 4 ºC), e o sobrenadante coletado para o a quantificação dos mediadores 186 inflamatórios, para a quantificação de mediadores inflamatórios. 187 A técnica de ELISA realizada, utilizando os kits DuoSet (R&D systems, 188 Minneapolis, Minnesota, EUA) para fator de necrose tumoral-α (TNF-α; DY510), 189 interleucina-6 (IL-6; DY501), interleucina-10 (IL-10; DY506), e quimiocinas C-X-C motif 190 chemokine ligand 3/Cytokine-induced neutrophil chemoattractant 2 (CXCL3/CINC-2; 191 DY540) e CC chemokine ligand 20/Macrophage Inflammatory Protein-3 Alpha 192 (CCL20/MIP-3α; DY516), seguindo as recomendações do fabricante. A concentração 193 dos alvos foi normalizadas pelo conteúdo de proteínas totais (Lowry et al., 1951). 194 195 2.8. Análise de expressão gênica 196 As hemi-mandíbulas foram cortadas na região dos molares, limpas dos tecidos 197 moles adjacentes, e o RNA total foi extraído com reagente Trizol LS (InvitrogenTM), 198 com protocolo adaptado a partir do recomendado pelo fabricante. A quantificação do 199 RNA total foi realizada utilizando o Quant-iT™ RiboGreenTM RNA Assay Kit 200 (Invitrogen) em equipamento Nanodrop 4000 (Thermo Fisher Scientific), seguindo as 201 recomendações do fabricante. A pureza das amostras foi avaliada por 202 espectrofotometria, considerando as razões 260/280 (1.8-2.0) e 260/230 (2.0-2.2). As 203 amostras foram tratadas com DNAse I (Sigma-Aldrich), e o DNA complementar 204 (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 μg de RNA total, utilizando o High Capacity Kit 205 RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Themo Fisher Scientific), seguindo as 206 recomendações do fabricante. 207 76 As reações em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR) foram realizadas 208 com sistema TaqMan (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems) 209 (Tabela 1-1), em equipamento StepOne™ Real-Time PCR System (Thermo Fisher 210 Scientific), seguindo as instruções do fabricante. A expressão dos alvos foi 211 determinada pelo método de Ct comparativo, utilizando Actb como gene constitutivo 212 e o grupo Wistar Controle como referência (Livak & Schmittgen, 2001). 213 214 Tabela 1- 1. Relação dos ensaios TaqManTM utilizados 215 Componentes do sistema renina angiotensina Agt Angiotensinogen Rn00593114_m1 Ace Angiotensin I converting enzyme Rn00561094_m1 Agt1r Angiotensin II receptor, type 1 Rn02758772_s1 Agt2r Angiotensin II receptor, type 2 Rn00560677_s1 Ace2 Angiotensin I converting enzyme 2 Rn01416293_m1 Masr MAS1 proto-oncogene, G protein-coupled receptor Rn00562673_s1 Ren Renin Rn02586313_m1 Fatores de transcrição Runx2 Runt-related transcription factor 2 Rn01512298_m1 Osx/Sp7 Osterix/Sp7 transcription factor Rn02769744_s1 Catnb β-catenin/cadherin associated protein beta 1 Rn00584431_g1 Marcadores de formação óssea Alp Bone alkaline phosphatase Rn01516028_m1 Col1a1