UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA STADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Guilherme Ribeiro RomualdoUNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA STADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Guilherme Ribeiro Romualdo Guilherme Ribeiro Romualdo Efeitos da Deficiência e Suplementação de Zinco sobre a Hepatocarcinogênese em camundongosGuilherme Ribeiro RomualdoUNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA STADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Guilherme Ribeiro Romualdo Guilherme Ribeiro Romualdo Guilherme Ribeiro Romualdo Guilherme Ribeiro Romualdo Efeitos da Deficiência ou Suplementação de Zinco sobre a Hepatocarcinogênese química em camundongos Guilherme Ribeiro Romualdo Efeitos da Deficiência e Suplementação de Zinco sobre a Hepatocarcinogênese química em camundongos Guilherme Ribeiro Romualdo Guilherme Ribeiro Romualdo Efeitos da Deficiência e Suplementação de Zinco sobre a Hepatocarcinogênese química em camundongos Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Patologia. Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Barbisan Botucatu 2016 Guilherme Ribeiro Romualdo Efeitos da Deficiência e Suplementação de Zinco sobre a Hepatocarcinogênese química em camundongos Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de mestre em Patologia. Orientador: Prof.Dr. Luís Fernando Barbisan Botucatu 2016 Resumo O Zinco é um elemento essencial para uma grande diversidade de enzimas e fatores de transcrição envolvidos no reparo ao DNA, defesa antioxidante e proliferação celular. O consumo inadequado desse metal pode prejudicar tais funções e predispor ao desenvolvimento de doenças. Assim, o estudo avaliou se a deficiência ou suplementação de zinco alteram os estágios iniciais da hepatocarcinogênese. Para tanto, camundongos Balb/C receberam dose única intraperitoneal do carcinógeno dietilnitrosamina (50 mg/Kg) no 15º dia pós-natal (DPN), para iniciação da hepatocarcinogênese. Ao 28º DPN, os animais foram randomicamente alocados em três grupos experimentais (n=13/grupo) recebendo dieta AIN-93G contendo níveis adequados (35 mg/Kg), deficiência (3 mg/Kg) ou suplementação (180 mg/Kg) de zinco, além do agente promotor acetilaminofluoreno (0.02% em todas as dietas). Os animais foram eutanasiados após 12 e 24 semanas após a introdução das dietas. Amostras de sangue periférico foram coletadas antes da eutanásia para a avaliação de genotoxicidade pelo Teste do Cometa. Na necropsia, amostras de fígado foram retiradas para o Teste do Cometa, avaliação histopatológica e morfométrica análise imunoistoquímica, determinação do perfil antioxidante e western blot. Na 12ª semana, a deficiência de zinco reduziu a expressão de Nrf2 e os níveis de glutationa reduzida (GSH) e aumentou a expressão de NFκB e p53 e número de lesões pré- neoplásicas por cm². Já na 24ª semana, a deficiência reduziu os níveis de GSH e aumentou a genotoxicidade induzida por 2-AAF (sangue e fígado), o tamanho e a proliferação celular das lesões pré-neoplásicas. Por outro lado, a suplementação aumentou os níveis de GSH e a atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) e reduziu a expressão de β-catenina e genotoxicidade induzida por 2-AAF (sangue). Ademais, na 24ª semana, a suplementação aumentou os níveis de GSH e a atividade das enzimas GPx, superóxido dismutase e catalase. Os resultados indicam que a deficiência de zinco promove a hepatocarcinogênese em seus estágios iniciais, enquanto a suplementação aumenta a defesa antioxidante hepática. Abstract Zinc is required for a wide range of enzymes and transcription factors involved in DNA repair, antioxidant defense and cell proliferation. Inadequate zinc intake could impair these functions, predisposing to the development of human diseases. This study evaluated whether dietary zinc deficiency or supplementation alter early chemically- induced mouse hepatocarcinogenesis. Male Balb/C mice received a single dose of diethylnitrosamine (DEN, 50 mg/Kg) at postnatal day (PND) 15 as an initiating agent for hepatocarcinogenesis. At PND 28, animals were allocated into three groups (n=13/group) and were fed AIN-93G diet containing different concentrations of zinc: adequate zinc (35 mg/Kg diet), zinc deficiency (3 mg/Kg diet) or zinc supplementation (180 mg/Kg diet). Also, 2-acetylaminefluorene (2-AAF, 0.02%) was incorporated in all experimental diets as a promoting agent for hepatocarcinogenesis. Mice were euthanized at 12 or 24 weeks after introducing the experimental diets. Blood and liver samples were collected to perform Comet Assay. Other liver fragments were sampled for histopathological, morphometrical and immunohistochemical analyses, western blotting and antioxidant profiling. Zinc deficiency decreased Nrf2 expression and reduced glutathione (GSH) levels and increased NFκB, p53 expression and the number of preneoplastic altered hepatocyte foci (AHF) per cm² at week 12. In addition, zinc deficiency decreased GSH levels and increased 2-AAF-induced genotoxicity (peripheral blood and liver), cell proliferation into AHF and AHF size at week 24. In contrast, zinc supplementation increased GSH levels and Glutathione Peroxidase (GPx) activity and decreased 2-AAF- induced genotoxicity (blood) and β-catenin expression at week 12. Besides, zinc supplementation increased GSH levels and GPx, superoxide dismutase, and catalase activity at week 24. The findings indicate that zinc deficiency promotes early chemically- induced mouse hepatocarcinogenesis while zinc supplementation enhances hepatic antioxidant defense. Sumário Capítulo I - Revisão de Literatura ............................................................................................................ 2 1. O Carcinoma Hepatocelular .................................................................................................................. 2 1.1 Epidemiologia e Aspectos Demográficos ........................................................................................... 2 1.2 Fatores de Risco................................................................................................................................. 4 1.3 Hepatocarcinogênese Humana .......................................................................................................... 7 1.4 Diagnóstico, tratamento e prevenção .............................................................................................. 17 1.5 Modelos Experimentais de Hepatocarcinogênese............................................................................ 18 2. O Zinco .................................................................................................................................................. 22 2.1 Inorgânico ao Orgânico ................................................................................................................... 22 2.2. Consumo e fontes alimentares ........................................................................................................ 23 2.3 Homeostase ...................................................................................................................................... 26 2.4 Principais funções ............................................................................................................................ 30 2.5 Deficiência, Suplementação e Câncer ............................................................................................. 34 3. Referências ............................................................................................................................................ 41 Capítulo II – Artigo Científico ................................................................................................................ 67 Abstract ..................................................................................................................................................... 68 1. Introduction .......................................................................................................................................... 69 2. Materials and Methods ........................................................................................................................ 71 2.1 Experimental Design ........................................................................................................................ 71 2.2 Histopathological and Morphometrical Evaluations ....................................................................... 73 2.3 Immunohistochemistry and Semi-quantitative Analysis ................................................................... 74 2.4 Single Cell Gel Electrophoresis ....................................................................................................... 74 2.5 Hepatic Antioxidant Profiling and Serum ALT ................................................................................ 75 2.6 Zinc determination ........................................................................................................................... 76 2.7 Western Blot ..................................................................................................................................... 77 2.8 Statistical Analysis ........................................................................................................................... 78 3. Results ................................................................................................................................................... 78 3.1 General Findings and Hepatic zinc levels ....................................................................................... 78 3.2 Western Blot ..................................................................................................................................... 79 3.3 Antioxidant Profiling and SCGE ...................................................................................................... 80 3.4 Histopathological and Morphometrical analyses ............................................................................ 83 3.5 Immunoistochemistry ....................................................................................................................... 85 4. Discussion .............................................................................................................................................. 87 5. References ............................................................................................................................................. 93 1 Capítulo I – Revisão de Literatura Zn Zn Zn 2 Capítulo I - Revisão de Literatura 1. O Carcinoma Hepatocelular 1.1 Epidemiologia e Aspectos Demográficos Nas últimas décadas, as neoplasias malignas, antes consideradas doenças características de países desenvolvidos, têm acometido um grande contingente de pessoas também em países em desenvolvimento, convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial (Ferlay et al., 2010; GLOBOCAN, 2012). A Organização Mundial da Saúde (OMS), em seu último cálculo a nível global, estimou para o ano de 2012 cerca de 14,1 milhões de novos casos (incidentes) e 8,2 milhões de mortes por neoplasias malignas (GLOBOCAN, 2012). Entre todos os novos casos, 5,6% correspondem às neoplasias malignas primárias do fígado, atrás daquelas que acometem o pulmão (13%), mama (11,9%), colo e reto (9,7%), próstata (7,8%) e estômago (6,8%). Enquanto, em relação às mortes, 9,1% são causadas por neoplasias malignas primárias do fígado, somente atrás das neoplasias malignas de pulmão (19,4%) (GLOBOCAN, 2012). Além disso, de 2008 a 2012, foram observados crescimentos de aproximadamente 5% e 7% nos números estimados de casos incidentes e mortes relacionadas às neoplasias malignas do fígado, respectivamente (Ferlay et al., 2010; GLOBOCAN, 2012). Se comparadas as estimativas atuais com os dados de uma década atrás, os aumentos de casos incidentes e mortes relacionadas às neoplasias malignas de fígado atingem 20% em ambos (Parkin et al., 2005). Além disso, as taxas de sobrevivência dos indivíduos que possuem neoplasias malignas hepáticas são pequenas. Estudos indicam que após o diagnóstico, em média, os pacientes sobrevivam de 11 a 18 meses (Greten et al., 2005; op den Winkel et al., 2012). Em um período de três anos após o diagnóstico, somente 19% a 29% sobrevivem (op den Winkel et al., 2012; Greten et al., 2005). Esses dados epidemiológicos mundiais justificam a relevância das neoplasias malignas hepáticas e suscitam a necessidade de pesquisas nas áreas de prevenção e tratamento dessas doenças. Entre os tipos de neoplasias malignas primárias que acometem o fígado, o carcinoma hepatocelular (CHC) é considerado o mais importante, visto que é responsável por cerca de 75% a 80% de todos casos incidentes e das mortes mundialmente (Sanyal et al., 2010; GLOBOCAN, 2012) (Figura 1). O CHC é seguido pelo colangiocarcinoma e pelo hepatoblastoma, principalmente (Sanyal et al., 2010; GLOBOCAN, 2012) (Figura 1). Quanto às características da população acometida pelos cânceres primários de fígado e, 3 evidentemente, pelo CHC, destacam-se a distribuição geográfica e a disparidade em relação ao gênero (GLOBOCAN, 2012). Tanto incidência quanto mortalidade são aproximadamente 2,5 vezes maiores no sexo masculino em comparação com o feminino (Figura 1). Figura 1. As principais neoplasias malignas primárias do fígado e a distribuição mundial dos novos casos e mortes quanto ao gênero. Referências: Sanyal et al., 2010; GLOBOCAN, 2012. Geograficamente, cerca de 83% dos casos incidentes e mortes por neoplasias malignas hepáticas ocorrem em países da Ásia (particularmente nas regiões Leste e Sudeste, sendo que 50% correspondem somente à China) e da África (regiões Central e Oeste), considerados “países em desenvolvimento” (GLOBOCAN, 2012) (Figura 2). Enquanto 12% dos novos casos e mortes ocorrem em países da Europa e América do Norte, considerados “países desenvolvidos” (GLOBOCAN, 2012) (Figura 2). Na Ásia, tais neoplasias ocupam a quinta e segunda colocações entre as neoplasias malignas de maior incidência e mortalidade, respectivamente, e na África, quarta e segunda colocações (GLOBOCAN, 2012). Enquanto, na Europa e na América do Norte, o CHC não está entre as dez neoplasias malignas mais incidentes e de maior mortalidade 4 (GLOBOCAN, 2012). No entanto, nos Estados Unidos as taxas de incidência e mortalidade crescem 3,4% e 2,5% por ano, respectivamente (American Cancer Society, 2015). Tais diferenças na distribuição dos dados epidemiológicos estão diretamente relacionadas à ocorrência dos fatores de risco da doença, que serão discutidos a seguir (Sanyal et al., 2010). No Brasil, o CHC também não está entre as dez neoplasias malignas mais incidentes e de maior mortalidade (INCA, 2014). Os últimos dados expressivos fornecidos pelo Instituto do Câncer (INCA) datam de 1999, quando as neoplasias malignas hepáticas ocupavam a sétima posição entre as neoplasias de maior mortalidade, sendo responsável por 4.682 óbitos (INCA, 1999). Figura 2. Distribuição continental dos dados de incidência e mortalidade das neoplasias malignas primárias do fígado. Referências: GLOBOCAN, 2012. Outra característica populacional importante está associada com a idade (American Cancer Society, 2015). Mortalidade e incidência tendem a aumentar de acordo com a idade do indivíduo, atingindo a sua maior prevalência em pessoas com idade próxima aos 65 anos (American Cancer Society, 2015). Embora sejam neoplasias raras antes dos 50 anos de idade, um aumento na incidência em pessoas mais jovens vem sendo observada nos EUA nas duas últimas décadas (American Cancer Society, 2015). 1.2 Fatores de Risco O CHC é considerado uma doença multifatorial, complexa e de múltiplas etapas (Sanyal et al., 2010). A maioria dos pacientes desenvolve o CHC em um contexto de 5 cirrose hepática causado por hepatite crônica (Yang et al., 2011) (Figura 3). Assim, a cirrose é considerada o fator de risco mais importante e, consequentemente, as causas comuns de cirrose também são fatores de risco para o desenvolvimento desta neoplasia maligna (Yang et al., 2011). Dentre estes fatores, destacam-se as hepatites crônicas causadas pelos vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC), o consumo de alimentos contaminados com micotoxinas (aflatoxinas) produzidas pelos fungos do gênero Aspergillus, o consumo maciço e crônico de etanol, doença hepática gordurosa não- alcoólica (DHGNA), hemocromatose, doença de Wilson, deficiência de α-1-antitripsina, hepatite autoimune, entre outros (Figura 3) (Sanyal et al., 2010). Além disso, outros fatores como idade, gênero, pesticidas, cigarro e hormônios podem também contribuir para o desenvolvimento da doença (Sanyal et al., 2010). Figura 3. Proporção de casos de CHC relacioados à presença ou ausência de cirrose hepática, além dos principais fatores de risco associados ao CHC. Referências: Trevisani et al., 2010; Yang et al., 2011. Mundialmente, as infecções virais crônicas têm particular importância na ocorrência do CHC (Yang et al., 2011; El-Serag, 2012). Estima-se que a infecção crônica pelo VHB esteja relacionada a 55% dos casos de CHC, enquanto a infecção crônica pelo VHC, de 10 a 25% (Yang et al., 2011; El-Serag, 2012). Coinfecções com VHB e VHC também são comuns em pacientes com o CHC (Cho et al., 2011). O consumo de alimentos contaminados com aflatoxinas está relacionado a 5% a 28% dos casos de CHC no mundo, podendo também estar associado à infecção crônica pelo VHB (Liu & Wu, 2010). Tais fatores de risco são prevalentes nos países da Ásia e da África (Figura 4), contribuindo 6 para cerca de 80% a 90% do total de novos casos e mortes estimadas (El-Serag, 2012). Por outro lado, são menos frequentes na Europa e na América do Norte, sendo responsáveis por menos de um terço dos casos nos EUA, por exemplo (American Cancer Society, 2015). O consumo excessivo de álcool, por sua vez, pode ser considerado fator principal ou cofator de risco, dependendo da quantidade e frequência de consumo (Mohamed et al., 1992; Donato et al., 2002). Casos de CHC associados ao consumo de etanol são comuns nos EUA e na Europa, e podem estar associados à infecção crônica por VHB e VHC (Morgan et al., 2004; Donato et al., 2002). Por fim, os distúrbios metabólicos, principalmente a DHGNA, apesar de contribuírem com peso menor para o desenvolvimento do CHC mundialmente, são consideradas ameaças emergentes na Europa e na América do Norte (Figura 4), sendo atribuídas a um terço dos casos de CHC nos EUA (Baffy et al., 2012; American Cancer Society, 2015). Por outro lado, uma minoria dos pacientes não desenvolve o CHC em um contexto de cirrose hepática (Figura 3) (Trevisani et al., 2010). Como principais fatores de risco relacionados ao surgimento do CHC em fígado não-cirrótico, também estão as infecções crônicas pelo VHB e VHC, a ingestão de álcool e aflatoxinas (Figura 3). No entanto, tais fatores parecem contribuir mais para o desenvolvimento do CHC em fígado cirrótico (Trevisani et al., 2010). Distúrbios metabólicos e congênitos, como a hemocromatose e deficiência de α-1-antitripsina, além dos hormônios sexuais e outras substâncias parecem ter papel importante no CHC em fígado não-cirrótico (Trevisani et al., 2010) (Figura 3). A contribuição e importância dos principais fatores de risco no surgimento do CHC serão discutidas a seguir. 7 Figura 4. Distribuição continental dos principais fatores de risco associados ao desenvolvimento do CHC. Referências: Sanyal et al., 2010; GLOBOCAN, 2012; American Cancer Society, 2015. 1.3 Hepatocarcinogênese Humana O surgimento de cirrose causada por doença hepática crônica pode ser considerado fundamental para o desenvolvimento do CHC, visto que contribui com cerca de 70% a 90% dos casos (Figura 3) (Yang et al., 2011). É nesse contexto em que há alterações drásticas e progressivas do microambiente hepático normal, envolvendo os hepatócitos, as células estreladas (ou de Ito), as células do sistema imunológico, além da produção de várias citocinas e fatores de crescimento (Zhou et al., 2014). Sucintamente, a agressão crônica do fígado, causada pelos fatores de risco (citados no item 1.2), leva a um processo inflamatório contínuo, seguido de morte maciça de hepatócitos (por necrose, principalmente), estimulando a regeneração hepática pelo processo de hiperplasia compensatória (Figura 5) (Zhou et al., 2014). Além disso, há a ativação das células estreladas, que produzem e causam deposição de proteínas da matriz extracelular (MEC) (Figura 5) (Zhou et al., 2014). Assim, há alteração a arquitetura hepática pela substituição gradativa do parênquima normal pelo tecido fibroso, que forma septos conjuntivos entre os hepatócitos, caracterizando a fibrose (Friedman, 2010; Zhou et al., 2014). A cirrose, por sua vez, é o resultado final da fibrose, 8 caracterizada por uma diminuição progressiva da proliferação dos hepatócitos, indicando uma exaustão da capacidade regenerativa do fígado, além de comprometimento da função do órgão (Zhou et al., 2014) (Figura 5). O parênquima hepático, na cirrose, se restringe a nódulos de hepatócitos cercados por septos fibrosos (Zhou et al., 2014). De maneira geral, é nesse contexto hepático alterado em que há maior susceptibilidade ao desenvolvimento do CHC (Yang et al., 2011). Figura 5. Principais alterações relacionadas ao processos de fibrose e cirrose hepática mediante a exposição aos principais fatores de risco. Referências: Friedman, 2010; Zhou et al., 2014. Já o processo de desenvolvimento, ou patogênese, da principal neoplasia maligna hepática é denominado de hepatocarcinogênese (Coleman, 2003) (Figura 6). Este é considerado um processo complexo e longo (40 a 50 anos) no qual os hepatócitos, mediante a exposição prolongada aos fatores e cofatores de risco, adquirem e acumulam diversas alterações genéticas, epigenéticas e moleculares, modificando vias relacionadas a oncogenes e genes supressores de tumor (Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014) (Figura 6). Tais alterações contribuem para que os hepatócitos adquiram características fenotípicas incomuns a uma célula normal, como proliferação celular contínua, evasão a fatores supressores de crescimento, imortalização, invasão e metástase, entre outros, 9 denominados de “hallmarks” do câncer (Hanahan & Weinberg, 2011) (Figura 6). Por sua vez, essas características colaboram para a transformação maligna da célula, seguida do surgimento de lesão pré-neoplásica, AHC, do estabelecimento do CHC e, por fim, do possível desenvolvimento de um tumor secundário por metástase (Katyal et al., 2000; Libbretcht et al., 2005; Natsuizaka et al., 2005) (Figura 6). Portanto, o esclarecimento dos principais mecanismos pelos quais os fatores de risco atuam, causando diversas alterações genéticas, epigenéticas e moleculares é essencial para o entendimento dos processos de fibrose/cirrose e, sobretudo, da hepatocarcinogênese humana. O VHB (vírus de DNA) e o VHC (vírus de RNA) são vírus hepatotróficos que promovem a cirrose e o CHC por diversos mecanismos (Tarocchi et al., 2014; McGivern & Lemon, 2011) (Figura 6). O ciclo viral de ambos, culminando na expressão de proteínas virais, estimula o processo inflamatório pela ativação e interação de diferentes fatores de transcrição (Neuveut et al., 2010). As proteínas virais, como a preS/S e HBx (VHB) e NS3, NS5A e C (VHC), podem, no citoplasma, alterar a sinalização celular e, no núcleo, interagir com vários fatores de transcrição, modulando a expressão gênica (Kremsdorf et al., 2006; Arzumanyan et al., 2013). Além disso, o DNA viral do VHB pode integrar-se a diferentes regiões do genoma do hospedeiro e, consequentemente, alterar a expressão gênica e contribuir para a instabilidade genômica (Kremsdorf et al., 2006). Diferentemente do VHB, o VHC não se integra ao genoma do hospedeiro (Selimovic et al., 2012). Genótipos específicos do VHC estão associados a alterações na expressão de genes relacionados com o metabolismo de lipídios, podendo resultar em acúmulo de triglicerídeos no fígado (esteatose hepática) (Selimovic et al., 2012). Ademais, como outros possíveis mecanismos oncogênicos, tanto VHC quanto VHB parecem induzir de estresse oxidativo e também alterar a expressão de micro RNAs (miRNA) específicos (Arzumanyan et al., 2013, Rongrui et al., 2014). Estima-se que 4,5 bilhões de pessoas estejam sobre risco de ingestão de alimentos, como arroz, milho, amendoim, frutas secas, além de ovos, carnes e leite, contaminados com micotoxinas produzidas pelos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus (van Egmond, 1999). O armazenamento de alimentos em locais inadequados favorece o crescimento dos fungos e subsequente produção aflatoxinas, principalmente o tipo B1 (AFB1) (Williams et al., 2004). O principal mecanismo de ação das aflatoxinas associado à cirrose e à hepatocarcinogênese está na sua genotoxicidade e mutagenicidade (Aguilar et al., 1993; Gursoy-Yuzugullu et al., 2011) (Figura 6). Quando metabolizada pelo 10 citocromo P450 no fígado, a AFB1 dá origem a compostos ativos nucleofílicos, como o 8, 9-óxido de aflatoxina B1 (AFBO), capazes de formar adutos no DNA e dar origem a mutações genéticas específicas (Forrester et al., 1990; Aguilar et al., 1993). O etanol, como comentado anteriormente, pode ser considerado um fator ou cofator de risco para desenvolvimento do CHC, dependendo da frequência e quantidade de consumo (Donato et al., 2002). De fato, estudos epidemiológicos indicam que o consumo de 80 g de etanol por dia, durante 10 anos, seja considerado um fator de risco independente (Mohamed et al., 1992; Donato et al., 2002). Esse valor corresponderia a aproximadamente, 0,6 L de vinho ou 1,6 L de cerveja por dia (Morgan et al., 2004). Nos hepatócitos, o etanol é metabolizado a acetaldeído pelo citocromo P450 (CYP2E1) e pela enzima álcool desidrogenase (ADH), principalmente (Seitz & Stickel, 2007). O acetaldeído, por sua vez, já demonstrou ter efeitos genotóxicos e mutagênicos comprovados por estudos in vitro, podendo contribuir para a hepatocarcinogênese (Singh & Khan, 1995; Kayani & Parry, 2010) (Figura 6). Além disso, o consumo de etanol leva ao aumento da atividade da CYP2E1, enzima envolvida na ativação de vários pró- carcinógenos, como as aflatoxinas, as nitrosaminas e os hidrorcabonetos policíclicos aromáticos (Dilger et al., 1997). Essa maior atividade do CYP2E1 também resulta na produção de radicais hidroxietil (RHE), que podem causar peroxidação lipídica (Dupont et al., 1998). Ademais, o consumo de etanol já demonstrou reduzir atividade e/ou quantidade de diversos agentes antioxidantes endógenos, como o α-tocoferol e a glutationa e as enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (Kawase et al., 1989; Rouach et al., 1997) (Figura 6). Destaca-se também o papel do etanol na inibição síntese da enzima S-adenosil- 1-metionina (SAMe), responsável por reações de transferência de grupamentos metil (CH3-), e, portanto, sendo responsável pela hipometilação de vários genes (Lu et al., 2000) (Figura 6). Os mecanismos exatos que levam ao desenvolvimento de CHC em meio ao contexto de DHGNA ainda não estão totalmente esclarecidos, mas é possível estabelecer relação com o desenvolvimento de obesidade e diabetes (Loomba et al., 2012). Brevemente, ambas podem causar acúmulo de triglicerídeos no tecido hepático (esteatose) (Youssef & McCullough, 2002). Esse acúmulo leva a produção de diversas citocinas e lipocinas, ativando vias de sinalização relacionadas à inflamação, o que pode levar a esteatoepatite não-álcoolica (ENA), seguida de fibrose e cirrose hepática (Purushotham et al., 2009) . 11 Além disso, esse processo resulta em maior produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), que também ativam vias de sinalização relacionadas com inflamação, além de causarem dano às macromoléculas, como proteínas e o DNA (Kojima et al., 2007) (Figura 6). A α-1-antitripsina é uma proteína relacionada com a inibição de diversas proteases (Lindblad et al., 2007). Brevemente, na deficiência de α-1-antitripsina, causada por distúrbio genético hereditário (autossômico recessivo), os principais mecanismos de hepatocarcinogênese estão associados ao acúmulo da glicoproteína mutante Z seguida de morte de hepatócitos (Lindblad et al., 2007). Por fim, a hemocromatose e a doença de Wilson também se caracterizam por serem distúrbios genéticos hereditários (autossômicos dominante e recessivo, respectivamente), nos quais há a acúmulo de ferro (Fe) e cobre (Cu), respectivamente, em diversos órgãos do corpo, incluindo o fígado (Pietrangelo, 2010; Rosencrantz & Schilsky, 2011). Os acúmulos de Fe e Cu podem causar, diretamente e indiretamente (pela produção de EROs), dano ao DNA (Carmichael et al., 1995; Houglum et al., 1997; Cooksey et al., 2004). Além disso, o Fe pode estimular ativação das células estreladas e o Cu pode ligar-se a grupamentos sulfidrila de diversas proteínas hepáticas (Ramm et al., 1997; Mufti et al., 2006). Por fim, quanto ao papel do gênero no desenvolvimento do CHC, estudos in vivo em roedores têm apontado o papel inibitório do estrogênio sobre o desenvolvimento do CHC, podendo justificar maior incidência e mortalidade dessa malignade em homens (Naugler et al., 2007; Bakiri & Wagner, 2013). Naugler e colaboradores (2007) demonstraram que o estrogênio possui papel inibitório na produção da interleucina-6 (IL-6) pelas células de Kupffer. A grande produção de IL-6 no CHC é observada tanto em roedores quanto em seres humanos (Hsia et al., 2007; Naugler et al., 2007). Inclusive, a IL-6 é considerada um bom marcador tumoral em humanos, participando da patogênese dessa doença (Hsia et al., 2007). Nesse contexto, os perfis das alterações genéticas, epigenéticas e moleculares relacionadas à hepatocarcinogênese refletem a grande heterogeneidade e complexidade dos mecanismos de ação dos fatores de risco (Liu et al., 2014). O estudo e caracterização dessas alterações e suas consequências nas principais vias celulares podem auxiliar na identificação de potenciais estratégias para prevenção e tratamento do CHC (Liu et al., 2014). 12 Figura 6. Hepatocarcinogênese humana. Processo longo (40 a 50 anos) no qual os fatores de risco, por diferentes mecanismos, causam alterações genéticas, epigenéticas e moleculares, conferindo características fenotípicas (imortalização, proliferação, instabilidade genômica, invasão e metástase, entre outras) que contribuem para a transformação maligna da célula, surgimento de lesão pré-neoplásica, AHC, estabelecimento do CHC e desenvolvimento de tumores secundários por metástase. Referências: Coleman, 2003; Libbretcht et al., 2005; Hanahan & Weinberg, 2011; Natsuizaka et al., 2005; Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014. 13 A via mais frequentemente alterada no processo de hepatocarcinogênese é a via do gene supressor de tumor TP53 (Figura 7) (Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014). Em células saudáveis, a proteína p53 (codificada pelo gene TP53) associa-se com uma enzima denominada MDM2, que ubiquitina p53 e faz com que a proteína seja degradada no proteassoma (Prives & Hall, 1999. Riley et al., 2008). Como resultado, as concentrações de p53 são virtualmente indetectáveis em células normais (Prives & Hall, 1999. Riley et al., 2008). Por outro lado, a ativação de p53 acontece por dois mecanismos: (1) em células submetidas às condições de dano ao DNA e hipóxia, duas proteínas quinases, ATM e ATR, estimulam a fosforilação de p53 e MDM2, impedindo a degradação de p53 e permitindo seu acúmulo na célula; (2) a ativação de proteínas como a RAS acarreta à ativação “suprafisiológica” de vias relacionadas ao crescimento celular, como MAPK e PI3K/AKT (Prives & Hall, 1999. Riley et al., 2008). Essa ativação de p53 leva a maior expressão da proteína p14/ARK (codificada pelo gene CDKN2A), que se liga a MDM2, permitindo o acúmulo de p53 na célula (Prives & Hall, 1999. Riley et al., 2008). O aumento de p53 ativa a transcrição de genes que codificam proteínas relacionadas ao reparo ao DNA (GADD45), parada no ciclo celular (p21, codificada pelo gene CDKN1A) e apoptose (BAX e PUMA) (Prives & Hall, 1999. Riley et al., 2008). Por esses mecanismos de ação, a proteína p53 é denominada de “guardião do genoma”, impedindo que ocorram alterações que possam contribuir para transformação maligna das células do organismo (Prives & Hall, 1999. Riley et al., 2008). Em média, 26% dos casos de CHC possuem mutações inativadoras no gene TP53 (Hussain et al., 2007). Tais mutações variam, refletindo diferenças nos agentes etiológicos e fatores de suscetibilidade do hospedeiro (Hussain et al., 2007). No CHC decorrente de infecções por HBV e exposição à AFB1 na África e na Ásia, existe uma elevada proporção de casos relacionados à mutação na terceira posição do códon 249 do gene TP53 (Bressac et al., 1991; Scorsone et al., 1992). Na exposição à aflatoxina, especula-se que a mutação em TP53 seja um evento precoce na hepatocarcinogênese (Aguilar et al., 1994). Em outros estudos, no entanto, as mutações parecem ser um evento tardio, relacionado com a progressão tumoral (Tanaka et al., 1993). Alterações em outros genes da via do TP53 são comuns no CHC, por exemplo, mutações em ATM (6,9%), CDKN2A (11,7%) e CDKN1A, além da amplificação e hiperexpressão de MDM2 (Jablkowski et al., 2005; Shibata & Aburatani, 2014). Como resultado dessas alterações, pode haver inibição ou redução da atividade da via da proteína p53, contribuindo para instabilidade genômica e evasão dos sinais supressores 14 do crescimento, características fenotípicas associadas a hepatocarcinogênese (Figura 6) (Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014). Outra via importante alterada na hepatocarcinogênese é a via de sinalização Wnt/β- catenina (Figura 7) (Monga, 2011; Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014). Nessa via, a ausência da ligação da glicoproteína Wnt nos receptores Fz de membrana (Frizzled) impede o acúmulo citoplasmático e a translocação nuclear da proteína β-catenina, que é degradada por um complexo de proteínas (AXIN1, APC, PP2A, GSK3 e CK1α) (Clevers, 2006). Quando há ligação, o complexo de degradação da β-catenina é inibido e a proteína acumula-se no citoplasma, sendo translocada para o núcleo (Clevers, 2006). No interior do núcleo, a β-catenina se liga a proteína TCF (T Cell Factor) e leva à transcrição de diversos genes envolvidos na proliferação celular (por exemplo, MYC, MYB, CJUN e CYD1), angiogênese, antiapoptose e formação de MEC (Clevers, 2006). No fígado normal, a via Wnt/β-catenina está associada aos processos de crescimento e proliferação hepática pré e pós-natal, além contribuir para a regeneração hepática na vida adulta (Micsenyi et al., 2004; Tan el al., 2006; Apte et al. 2007). A ativação anormal da via, sem mutações, parece estar relacionada com o surgimento de nódulos displásicos (pré- neoplásicos) no fígado (Park et al., 2005; Rebouissou et al., 2008). No AHC, 15-46% apresentam mutações ativadoras no protooncogene CTNNB1 (β- catenina), relacionadas com maior potencial para desenvolvimento do CHC (Torbenson et al., 2002; Zucman-Rossi et al., 2006). Já no CHC, 26% dos casos de CHC possuem mutações ativadoras no gene CTNNB1 (β-catenina), enquanto que 9,6% e ~2% possuem mutações inativadoras nos genes supressores de tumor AXIN1 e APC, respectivamente (de La Coste et al., 1998; Taniguchi et al., 2002; Park et al., 2005). Além disso, o promotor do gene APC demonstrou estar hipermetilado em 53% dos casos de CHC (Yang et al., 2003). Já o miRNA 214, que está relacionado com a inibição da via Wnt/β-catenina em condições normais, tem sua expressão diminuída em pacientes com CHC (Xia et al., 2012). Essas alterações podem levar ao acúmulo de β-catenina e subsequente ativação da via, conferindo estímulo proliferativo contínuo aos hepatócitos e contribuindo para as diferentes fases da hepatocarcinogênese (Figura 6) (Monga, 2011; Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014). A via do fator de transcrição NFκB (Figura 7), um importante regulador da resposta inflamatória no tecido hepático, é ativada por uma diversidade de agentes, como moléculas derivadas de patógenos, como bactérias e vírus, incluindo o HBV, além de citocinas e estresse oxidativo (Pahl, 1999; Morgan & Liu, 2011). O fator de transcrição é 15 formado por cinco subunidades que podem ligar-se ao DNA: p50, p52, p65, crel e relB. Na ausência de estímulo, o NFκB está ligado a um grupo de proteínas denominado de IκB (como IκBα e IκBβ), que impedem sua translocação nuclear, mantendo-o no citoplasma da célula (Pahl, 1999; Morgan & Liu, 2011). Quando a via é ativada, o IκB é fosforilado pelo complexo IκB quinase (IKK), a subnidade IκBα é degradada e o NFκB é translocado para o núcleo, ligando-se ao DNA e levando à transcrição de diversos genes relacionados à resposta pró-inflamatória (citocinas e quimiocinas, moléculas de adesão, etc.), antiapoptose e proliferação celular (Pahl, 1999). A ativação anormal da via é frequentemente relacionada ao processo inflamatório que pode promover doença hepática crônica, fibrose e cirrose (Morgan & Liu, 2011). No CHC, a atividade do fator de transcrição NFκB demonstrou estar aumentada em 87% e 80% no tecido peritumoral e tumoral, respectivamente, quando comparada ao tecido hepático normal (Liu et al., 2002). A inflamação mediada pela ativação desse fator de transcrição pode alterar o microambiente hepático, contribuindo para o surgimento do CHC (Figura 6) (Liu et al., 2002; Luedde & Schwabe, 2011). Além disso, o aumento de NFκB parece mediar a expressão das metaloproteinases 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9), responsáveis pela degradação de várias moléculas da MEC e por facilitarem a invasão e metástase tumoral (Figura 6) (Li et al., 2011a; 2012). Já a telomerase é um complexo ribonucleoprotéico responsável por atuar no elongamento das extremidades cromossômicas, os telômeros, garantindo a manutenção da integridade comossômica, portanto, a estabilidade genômica (Callén & Surrallés, 2004). Esse complexo é formado por uma unidade catalítica, a telomerase transcriptase reversa (TERT), e um template de RNA (TERC) (Cohen et al., 2007). A TERT alonga os telômeros por sintetizar uma molécula de DNA a partir do template de RNA (Cohen et al., 2007). Esse complexo está ativo nas células germinativas e nas células-tronco e a sua atividade é silenciada na maioria das células somáticas durante a gestação (Hiyama & Hiyama, 2007). Assim, o progressivo encurtamento dos telômeros está relacionado à senescência e apoptose (Rodier et al., 2005). Um estudo recente revelou que o CHC (59%), o AHC (44%) e os nódulos displásicos (25%) possuem mutações na região promotora do gene TERT, que codifica a telomerase transcriptase reversa (Nault et al., 2013). Além disso, as mutações em TERT estão associadas à presença de mutações no gene CTNNB1 (Nault et al., 2013). As mutações em TERT podem levar ao aumento de sua expressão, inibindo o processo de senescência e apoptose e conferindo a capacidade de “imortalização” às células pré-neoplásicas e 16 neoplásicas, contribuindo para a hepatocarcinogênese (Figura 6) (Nault et al., 2013; Liu et al., 2014; Shibata & Aburatani, 2014). Figura 7. Caracterização das vias TP53, Wnt/β-catenina, e NF-κB, algumas das vias mais frequentemente alteradas na hepatocarcinogênese. Referências: Pahl, 1999; Prives & Hall, 1999; Clevers, 2006; Morgan & Liu, 2011. Essas e outras alterações contribuem para que os hepatócitos sofram o processo de transformação maligna, seguido da formação de uma lesão hepática pré-neoplásica (Libbretcht et al., 2005). Entre as lesões pré-neoplásicas, aquelas que apresentam alto grau de displasia e proliferação celular, como nódulos e alguns tipos de focos de hepatócitos alterados, frequentemente observados em figados cirróticos, têm maior potencial para o desenvolvimento do CHC (Su & Bannasch, 2003; Libbretcht et al., 2005). Além dos nódulos, os focos de pequenas e grandes células, além do AHC (principalmente os que possuem mutações em CTNNB1) também podem dar origem a essa neoplasia maligna (Torbenson et al., 2002; Zucman-Rossi et al., 2006). Por fim, quando o CHC se estabelece, tumores secundários podem se desenvolver nos pulmões (55%), nos ossos (28% a 38%) e nos linfonodos abdominais (34% a 41%) (Katyal et al., 2000; Natsuizaka et al., 2005). 17 1.4 Diagnóstico, tratamento e prevenção Os principais sintomas clínicos relacionados à presença do CHC são: dor abdominal, hepatomegalia, indisposição, ascite e icterícia (Trevisani et al., 1995; Lam et al., 2004). Além disso, grande parte dos pacientes (50-56%) com CHC possuem níveis séricos aumentados de α-fetoproteína, proteína expressa no fígado durante a embriogênese (Trevisani et al., 1995; Lam et al., 2004). No entanto, as melhores ferramentas para diagnóstico do CHC são os exames de imagem, como a ultrassonografia, tomografia e a ressonância magnética (Befeler & Bisceglie, 2002). Outro elemento importante para o diagnóstico é a biópsia hepática para caracterização histológica, seguida do estadiamento da neoplasia (Befeler & Bisceglie, 2002). Como já comentado, após o diagnóstico do CHC, a taxa de sobrevivência é pequena, e a morte normalmente ocorre por caquexia, sangramento visceral, falência hepática e ruptura do tumor com hemorragia fatal (Greten et al., 2005; op den Winkel et al., 2012). Assim, transplante de fígado, ressecção cirúrgica, ablação (física ou química), quimioembolização e quimioterapia são consideradas as principais estratégias de tratamento do CHC, aplicadas na dependência do tamanho e número de tumores, além da presença de tumores extrahepáticos (metástases) (Befeler & Bisceglie, 2002). Após o transplante de fígado, uma das estratégias de tratamento mais aplicadas, cerca de 69,1% e 40,5% dos pacientes sobrevivem cinco e dez anos, respectivamente (Doyle et al., 2012). É nesse contexto que suscita-se a necessidade de estratégias preventivas para o CHC. A implementação da vacinação para o VHB (adotada em ~175 países), reduziu o número de pessoas infectadas nos últimos anos, consequentemente reduzindo o número de casos de CHC (Chang et al., 2009; Luo & Ruan, 2012). Em relação às aflatoxinas, melhores condições de armazenamento dos alimentos reduzem o consumo de aflatoxinas, diminuindo o número de casos de CHC (Turner et al., 2005). As terapias antivirais com interferon (IFN) em pacientes infectados por VHB e VHC demonstraram reduzir o risco de desenvolvimento de CHC (Lin et al., 2007; Zhang et al., 2011). Além disso, componentes da alimentação diária podem atuar na prevenção do CHC. Bravi e colegas (2013) observaram redução de 40% no risco de desenvolvimento do CHC em indivíduos que tomam café com frequência. O consumo de ácidos graxos poliinsaturados n-3, presentes no peixe, ou vitamina E também demonstraram reduzir o risco de CHC (Sawada et al., 2012; Zhang et al., 2012). 18 1.5 Modelos Experimentais de Hepatocarcinogênese Modelos animais distintos têm sido aplicados ao estudo do diagnóstico, patogênese, tratamento e prevenção do CHC, principalmente utilizando-se de roedores, ratos (Rattus norvegicus) e camundongos (Mus musculus) (Heindryckx et al., 2009; Li et al., 2011b; Bakiri & Wagner, 2013). O estabelecimento dessas ferramentas de estudo é pertinente, visto que o padrão de desenvolvimento morfológico, molecular, epigenético e genético das neoplasias malignas no fígado de roedores é semelhante ao que pode ser observado em seres humanos (Heindryckx et al., 2009; Li et al., 2011b; Bakiri & Wagner, 2013). Os modelos em roedores também refletem a disparidade do gênero em relação ao desenvolvimento do CHC (Naugler et al., 2007). Li e colaboradores (2011b) apontaram alguns critérios essenciais para a seleção de um modelo animal de hepatocarcinogênese, considerando a analogia com o desenvolvimento do CHC em humanos: (1) permitir a avaliação dos eventos moleculares e celulares das diferentes fases a hepatocarcinogênese, (2) mimetizar o microambiente tumoral do CHC em humanos e (3) ser acessível financeiramente e ser de fácil manipulação. Entre os modelos, sobretudo aqueles que utilizam murinos, destacam-se os modelos geneticamente modificados, de xenoenxerto e de indução química (Heindryckx et al., 2009; Li et al., 2012; Bakiri & Wagner, 2013). Os modelos murinos geneticamente modificados são amplamente aplicados à pesquisa dos mecanismos virais de hepatocarcinogênese (VHB e VHC) (Heindryckx et al., 2009; Li et al., 2012; Bakiri & Wagner, 2013). Os modelos de VHB inicialmente foram produzidos em 1985, e a maioria está relacionada à introdução do gene que codifica a proteína viral HBx (citada no item 1.3) no genoma murino (Babinet et al., 1985). Os modelos de VHC foram desenvolvidos para expressar diferentes proteínas virais, como as estruturais e/ou não estruturais (citadas no item 1.3), apesar de o vírus de RNA não integrar- se ao genoma humano (Pasquinelli et al., 1997; Lerat et al., 2002). Outros modelos geneticamente modificados muito utilizados são aqueles que possuem alterações genéticas em vias oncogênicas específicas, como H-ras, Wnt/β-catenina e p53 (Ghebranious & Sell, 1998; Harada et al., 2004). A aplicação principal desses modelos está relacionada ao estudo de vias específicas e seu papel na hepatocarcinogênese (Heindryckx et al., 2009; Li et al., 2012; Bakiri & Wagner, 2013). Os modelos de xenoenxerto baseiam-se na inserção de células de CHC provenientes de material de biópsia ou de cultura celular de origem humana em camundongos atímicos (nude), ou nz inserção de células tumorais murinas em animais compatíveis (Li et al., 2001; 19 2004). Podem ser ectópicos, quando as células são enxertadas por via subcutânea, ou ortotópicos, quando são injetadas diretamente no fígado (Li et al., 2001; 2004). Esses modelos são utilizados para avaliar a capacidade e mecanismos de metástase, principalmente (Li et al., 2001; 2004). Já na hepatocarcinogênese química, basicamente, há dois tipos de compostos hepatocarcinogênicos: (1) inciadores, que são genotóxicos, ou seja, capazes de induzir mudanças estruturais na molécula de DNA e (2) compostos promotores (genotóxicos e/ou não-genotóxicos), que são capazes de promover a formação de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas após a iniciação, por facilitarem a expansão clonal das células iniciadas (Pitot & Dragan, 1991). Morfologicamente, o CHC induzido quimicamente em roedores ocorre através do desenvolvimento de alterações sequenciais, de maneira semelhante ao que ocorre no CHC humano (Figura 8) (Pitot, 1990; Pitot & Dragan, 1991; Ogawa, 2008). Após o início do tratamento com o hepatocarcinógeno, surgem os focos de hepatócitos alterados fenotipicamente (FHA), que são lesões compostas de hepatócitos de citoplasma claro, basofílico ou eosinofílico (Ogawa et al., 1980; Pitot, 1990 ). Os FHA decorrem da expansão clonal de hepatócitos iniciados e são considerados lesões pré-neoplásicas (Pitot, 1990; Pitot & Dragan, 1991; Ogawa, 2009). Sob estímulos químicos contínuos, essas lesões podem acumular alterações moleculares, genéticas e epigenéticas e adquirir novas características fenotípicas, tais como maior capacidade de sobrevivência e um potencial proliferativo elevado, podendo dar origem à lesões neoplásicas, tal como o CHC (Pitot, 1990; Pitot & Dragan, 1991; Ogawa, 2009). Os FHA podem ser facilmente identificados e quantificados em bioensaios de curto prazo e médio prazo, permitindo a investigação de potenciais fatores modificadores das etapas inciais da hepatocarcinogênese química (Pitot, 1990; Pitot & Dragan, 1991; Ogawa, 2008). A dietilnitrosamina (DEN) ou N-nitrosodietilamina (Figura 8) é um dos agentes químicos mais utilizados para a indução de hepatocarcinogênese desde os anos 60 da década passada (Rajewsky et al., 1966). A DEN pode ser encontrada em uma variedade de produtos, como a fumaça de cigarro, na carne e no uísque (Hedler & Marquardt, 1968). Esse carcinógeno é metabolizado pelo citocromo P450 no fígado (CYP2E1), sendo inicialmente hidroxilado a α-hidroxilnitrosamina e posteriormente bioativado em uma reação dependente de oxigênio e NADPH, resultando na formação de íons etildiazônio (Verna et al., 1996a; Jin et al., 2007). Esses íons ligam-se e causam dano ao DNA (Santos et al., 2014). O metabolismo dessa substância pelo citocromo P450 pode também causar 20 estresse oxidativo, produzindo peróxido de hidrogênio e ânions superóxido (Qi et al., 2008). O estresse oxidativo, por sua vez, também pode causar dano a diferentes macromoléculas, como o DNA, proteínas e lipídios (Verna et al., 1996a; Jin et al., 2007). Em relação ao perfil genético, os tumores induzidos pela DEN possuem mutações e/ou hiperexpressão do protooncogene H-ras (Figura 8) (Stahl et al., 2005). Tumores induzidos pelo mesmo modelo também possuem mutações no gene Catnb (análogo ao gene CTNNB1 em humanos), levando à ativação da via Wnt/β-catenina (Figura 8) (Stahl et al,. 2005). Além disso, uma análise genômica comparativa revelou o perfil genético do CHC induzido pela DEN assemelha-se ao CHC humano de mau prognóstico (Lee et al., 2004) A indução da hepatocarcinogênese pela DEN depende, sobretudo, da linhagem e idade do murino, da dose utilizada e do tempo de experimentação (Pitot & Dragan, 1991). Portanto, há grande variabilidade na aplicação do modelo em estudos experimentais. Especialmente, um dos modelos utilizados é o modelo do neonato, no qual os murinos são inciados para a hepatocarcinogênese no décimo quinto dia pós-natal (DPN) (Goldfarb et al., 1984). Nesse período, o fígado dos animais ainda está em desenvolvimento, sendo intrinsecamente mais susceptível à ação dos cancerígenos, como a DEN (Vesselinovitch & Mihailovitch, 1983; Vesselinovitch et al., 1984; Vesselinovitch, 1987). As taxas proliferativas dos hepatócitos do murino neonato são altas, facilitando a expansão clonal de hepatócitos iniciados e resultando no aparecimento de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas em um menor período de tempo, quando comparado a um murino submetido ao modelo na idade adulta (Vesselinovitch & Mihailovitch, 1983; Vesselinovitch et al., 1984; Vesselinovitch, 1987). Além dessas duas vantagens, o modelo ainda permite a introdução de um carcinógeno promotor em um período de 2 a 3 semanas após a inciação (protocolo de iniciação/promoção), também facilitando o desenvolvimento das lesões pré- neoplásicas e neoplásicas em menor período de tempo (Vesselinovitch & Mihailovitch, 1983; Vesselinovitch et al., 1984; Vesselinovitch, 1987). O 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) (Figura 8), por sua vez, é um carcinógeno derivado do fluoreno que tem papel iniciador/promotor da hepatocarcinogênese (Lee et al., 2013). O 2-AAF é uma substância sintética derivada do 2-aminofluoreno (2-AF), inicialmente desenvolvido como um inseticida (Wilson et al., 1941). Esse composto, como a DEN, é substrato para o citocromo P450 (CYP1A2), sofrendo N-hidroxilação seguida de deacetilação e originando íons nitrênio (Holme et al., 1986; Verna et al., 1996b). Esses íons, por sua vez, podem formar adutos e causar dano ao DNA (Jenkins & Parry, 2000; Murata et al., 2002). Além das propriedades genotóxicas, o 2-AAF parece promover a 21 hepatocarcinogênese por mecanismos não-genotóxicos, como afetar a respiração celular (Neumann et al., 1997). Tais mecanismos são responsáveis por causar alterações genéticas e epigenéticas no fígado dos animais, contribuindo para a hepatocarcinogênese (Jenkins & Parry, 2000; Bagnyukova et al., 2008; Pogribny et al., 2011). Por exemplo, destacam-se as mutações no gene Tp53 e a hipermetilação do gene p16 do fígado dos roedores, semelhante ao que ocorre na hepatocarcinogênese humana (Figura 8) (Jenkins & Parry, 2000; Narimastu et al, 2004; Bagnyukova et al., 2008; Pogribny et al., 2011). Figura 8. Hepatocarcinogênese química experimental induzida pel A DEN e o 2-AAF, a partir de mecanismos genotóxicos e/ou não-genotóxicos, causam alterações genéticas e epigenéticas que contribuem para o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas no fígado dos roedores. Referências: Jenkins & Parry, 2000; Anna et al., 2003; Stahl et al., 2005 Bagnyukova et al., 2008; Pogribny et al., 2011. 22 2. O Zinco 2.1 Inorgânico ao Orgânico O zinco (Zn) é um metal de transição pertencente à família IIB da Tabela Periódica, possuindo número atômico 30 (30 prótons e 30 elétrons) com massa atômica 65,38 (Figura 9) (IUPAC, 2013). É considerado o 23º elemento químico mais abundante da litosfera 10 mg a 300 mg/Kg de solo), também presente na atmosfera (~300 ng/m3) e na hidrosfera (0,1 µg a 50 µg/L) (Environmental Health Criteria, 2001). No ambiente, o metal ocorre em dois estados de oxidação, Zn (0) e Zn (+2), formando 55 compostos estáveis, entre sais de zinco e ligas metálicas, de larga aplicação industrial (Environmental Health Criteria, 2001). Normalmente, o zinco não é encontrado na sua forma metálica (Environmental Health Criteria, 2001). Entre os sais, destacam-se o óxido (ZnO, zincita), o fosfato (Zn3(PO4)2.4H2O, hopeíta), o silicato (Zn2SiO4, willeíta), o sulfeto (ZnS, esfalerita ou blenda) e o carbonato de zinco (ZnCO3, smithsonita), muito abundantes na litosfera e que possuem grande quantidade de zinco (Environmental Health Criteria, 2001). Já entre as ligas, o latão e o bronze (Environmental Health Criteria, 2001). Pelo fato de ser um elemento, o zinco não pode ser destruído e nem degrada-se (Environmental Health Criteria, 2001). A sua importância estende-se para outras partes do universo, visto que o metal e seus derivados já foram detectados na composição de estrelas e na atmosfera de exoplanetas (Takeda et al., 2002; Knutson et al., 2014; Kreidberg et al., 2014). Apesar de a sua importância para os seres vivos ter sido descoberta somente no século passado, o zinco desempenha papeis essenciais na composição da vida no planeta desde o seu surgimento (Sommer & Lipman, 1926; Rolinson, 1951; Prasad et al., 1961; Wiiliams, 2012). O zinco é o segundo metal mais abundante nos seres vivos, só atrás do ferro (Environmental Health Criteria, 2001). Acredita-se que em algum momento do processo evolutivo, o zinco presente no ambiente foi adquirido pela célula primitiva para desempenhar processos biológicos simples e, ao longo da evolução, foi incorporado aos processos mais complexos dos organismos de todos os reinos (Figura 9) (Wiiliams, 2012). Evidências da importância evolutiva do zinco nos processos biológicos estão relacionadas à quantidade de metaloproteínas, ou seja, proteínas estruturalmente associadas ao zinco, nos seres vivos: (1) nos procariotos, 5% a 6% de todas as proteínas do genoma têm relação estrutural com o zinco, já nos eucariotos, aproximadamente 10%; (2) em relação aos “dedos de zinco” (zinc fingers), importantes domínios proteicos que necessitam de átomos de zinco para sua estabilização, as bactérias do gênero Eubacterium possuem 23 somente 5 dedos de zinco, enquanto o Homo sapiens, ~3000 (Andreini et al., 2006; Emerson & Thomas, 2009; Wiiliams, 2012). Figura 9. (A) Representação do elemento químico zinco de acordo com a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC, 2013). Arquivo Pessoal. (B) Incorporação do zinco presente no ambiente pelas as diferentes formas de vida ao longo da evolução. Referências: Andreini et al., 2006; Wiiliams, 2012. 2.2. Consumo e fontes alimentares Quando considerado no contexto de outros metais, o zinco é único na sua diversidade funcional nos seres humanos (Stefanidou et al., 2006). Sabe-se que o zinco é parte estrutural essencial de diversas proteínas no ser humano, incluindo diversos fatores de crescimento, citocinas, receptores, enzimas (>300) e fatores de transcrição (>2000) associados a muitas vias celulares relacionadas, sobretudo, à apoptose, proliferação, crescimento celular, reparo ao DNA, defesa antioxidante e resposta inflamatória (Stefanidou et al., 2006). A estabilidade e, consequentemente, a funcionalidade dessas proteínas está diretamente relacionada com a concentração de zinco no organismo (Stefanidou et al., 2006). Mediante a diversidade funcional do zinco no corpo humano, além da homeostase diária desse metal, o organismo humano exige consumo diário de doses adequadas de zinco, visto que não há acúmulo de grandes quantidades do mesmo no corpo, como o cálcio e o ferro, por exemplo (Food and Nutrition Board, 2001). De acordo com a OMS, 24 há dificuldades inerentes à estimativa das necessidades de zinco para os seres humanos, visto que fatores fisiológicos, ambientais e dietéticos variam de acordo com as populações (Environmental Health Criteria, 2001). Assim, as estimativas para o consumo diário de zinco foram feitas para contemplar de 97% a 98% das necessidades nutricionais da população, por meio de estudos equilíbrio metabólico, levando-se em consideração a sua ingestão, excreção, quantidades necessárias para o crescimento e desenvolvimento, eventuais perdas e biodisponibilidade (Environmental Health Criteria, 2001). A Sociedade Alemã de Nutrição (2015) estabelece como recomendação diária de ingestão (RDI) para indivíduos adultos saudáveis 10 mg e 7 mg/dia para homens e mulheres adultos, respectivamente. Já a Food and Nutrition Board (2001), dos EUA, recomenda 11 mg e 8 mg/dia. Durante a infância, devido ao importante papel do zinco no crescimento, a mesma entidade recomenda quantidades crescentes da ingestão do metal: 3 mg (1 a 3 anos), 5 mg (4 a 8 anos) e 8 mg/dia (9 a 13 anos). Durante a gravidez e lactação, também se levando em consideração a importância do zinco no desenvolvimento e crescimento do organismo, recomenda-se de 11 a 13 mg/dia (Food & Nutrition Board, 2001). No Brasil, especificamente, as recomendações de ingestão diária de zinco não foram divulgadas pelo Ministério da Saúde no “Guia Alimentar da População Brasileira” (2014). A obtenção de zinco por meio da ingestão de alimentos é considerada o principal meio de suprir as recomendações diárias, enquanto a ingestão de água possui contribuição menor, em média <0.2 mg/dia (Environmental Health Criteria, 2001). No Brasil, empresas como a Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo (Sabesp) não realizam análises rotineiras sobre as concentrações de zinco na água fornecida à população, portanto, é difícil saber a contribuição da água nas recomendações diárias de ingestão de zinco. As principais fontes alimentares de zinco prontamente biodisponível são provenientes de produtos animais como as carnes bovinas e suínas, frutos do mar, aves, ovos, leite e derivados (Figura 10) (TACO, 2011). Por outro lado, os produtos vegetais não são considerados boas fontes de zinco (Figura 10) (TACO, 2011). Como exceção, os cereais, seus derivados (normalmente fortificados industrialmente) e o feijão possuem grandes quantidades do metal (Figura 10) (TACO, 2011). No entanto, a presença dos fitatos nos vegetais atrapalha a absorção intestinal e biodisponibilidade do zinco em seres humanos (Turnlund et al., 1984; Lönnerdal, 2000). O fitato, ou inositol hexafosfato, é um composto que pode fortemente se ligar a cátions, como o zinco, formando compostos 25 insolúveis e estáveis (van Steveninck et al., 1994; Lönnerdal, 2000). Portanto, populações em que a dieta é baseada no consumo de grãos, como em países considerados “em desenvolvimento”, há maior risco de menor consumo de zinco e portanto, de deficiência desse metal (Wessells & Brown, 2012). Além disso, um estudo de meta-análise recente revelou que dietas vegetarianas reduzem de maneira significativa a quantidade de zinco consumida e sérica em relação a indivíduos não vegetarianos (Foster et al., 2013). Em relação ao consumo do fitato, a OMS estabeleceu a razão molar desse composto em relação ao zinco como um indicador válido para estimar a biodisponibilidade do metal nas dietas (Morris & Ellis, 1989). Por exemplo, se o valor dessa razão é >15 mol fitato/mol zinco (F/Zn) (dieta rica em fitato), há redução de 50% da absorção intestinal do zinco ingerido (Morris & Ellis, 1989). Valores 5 até 15 correspondem a uma biodisponiblidade moderada de zinco, enquanto que <5, alta biodisponibilidade desse metal (Morris & Ellis, 1989). Apesar das diversas determinações de zinco nos alimentos, devem ser consideradas as condições de semeio das plantas e criação de animais (Hacisalihoglu et al., 2004; Alloway, 2009). A deficiência de zinco na agricultura ou na pecuária pode influenciar a característica e qualidade nutricional do alimento oferecido às populações, visto que esse metal é essencial para os processos biológicos dos vegetais e animais (Hacisalihoglu et al., 2004; Alloway, 2009). As condições de preparo dos alimentos também podem influenciar na quantidade do zinco nos alimentos e, portanto, na sua biodisponibilidade (TACO, 2011). Os roedores, como as diversas linhagens de ratos e camundongos utilizados em estudos de experimentação, também possuem necessidades diárias da ingestão de zinco. A National Academy of Sciences (2001) dos EUA indica dietas com valores de 30 mg a 35 mg de zinco elementar por quilograma de ração. 26 Figura 10. Fontes alimentares de Zinco (quantidades estimadas de zinco elementar a cada 100 g.). Observa- se que os produtos derivados de fontes animais (frutos do mar, carne bovina, ovos, carne de aves e queijos) possuem maior quantidade de zinco em comparação com os produtos vegetais (cenoura, alface crespa, cereais, feijão carioca, brócolis ninja). As variações na quantidade do metal nos alimentos estão relacionadas com as condições semeio das plantas, criação dos animais e preparo dos alimentos. Referência: TACO, 2011. 2.3 Homeostase O controle homeostático do zinco nas células dos mamíferos é um processo essencial e complexo, sendo realizado por vários transportadores transmembrana importadores (família ZIP/SLC39) e exportadores (família ZnT/SLC30) (Huang & Tepaamorndech, 2013; Jeong & Eide, 2013). A entrada de zinco na célula pela membrana plasmática é regulada positivamente pelos ZIPs e negativamente pelos ZnTs, enquanto a entrada de zinco nas organelas é regulada positivamente pelos ZnTs e negativamente pelas ZIPs (Huang and Tepaamorndech, 2013; Jeong and Eide, 2013). Ademais, as metalotioneínas (MT) e fatores responsivos à presença de metal, como o fator de transcrição MTF-1 (metal transcription factor-1), também contribuem para a homeostase do metal (Thirumoorthy et al., 2011; Kloubert & Rink, 2015). Esses componentes controlam, de maneira organismo/célula-dependente, eventos principais na manutenção da homeostase do zinco no organismo: (1) absorção, (2) distribuição, (3) armazenamento e (4) excreção (Figura 11) (Kambe et al., 2014). O entendimento da homeostase em indivíduos saudáveis é importante pois as variações na quantidade de zinco na dieta, assim como a manifestação de condições patológicas, como 27 o câncer, podem influenciar o processo em si, refletindo em alterações funcionais no organismo (Kambe et al., 2014). Em condições de ingestão adequada, cerca de 30% a 40% do zinco presente nos alimentos é absorvido pelos enterócitos do intestino delgado, principalmente (Gallaher et al., 1988). O transportador/importador ZIP4, presente tanto em murinos quanto em seres humanos, é o principal responsável por transportar o zinco da membrana apical para o citoplasma dos enterócitos (Figura 11) (Wang et al., 2002; Dufner-Beattie et al., 2004). A presença desse transportador nas células intestinais e a expressão do gene do transportador (Zip4) são sensíveis à quantidade de zinco no organismo: (a) quando há excesso, os transportadores ZIP4 sofrem endocitose, ubiquitinação e degradação, e há inibição da expressão de Zip4; resultando em menor quantidade do receptor na membrana das células; (b) quanto há falta, a degradação de ZIP4 é inibida e há maior expressão de Zip4, levando ao acúmulo de ZIP4 na membrana apical (Dufner-Beattie et al., 2003; Dufner-Beattie et al., 2004; Mao et al., 2006). Fatores como doenças intestinais absortivas, como a acrodermatite enteropática, além do consumo de fitato (como citado em 2.2) são considerados os fatores principais que influenciam a absorção do zinco pelo intestino (Lönnerdal, 2000; Duffner-Beattie et al., 2003). Após sua entrada pela membrana plasmática, parte do zinco permanece no citoplasma das células intestinais, sendo redistribuído pelos compartimentos celulares por diferentes transportadores, para que desempenhe funções celulares típicas desse metal (como comentado em 2.2) (Wang & Zhou, 2010). Para que o zinco absorvido pelos enterócitos alcance a circulação e seja distribuído aos demais órgãos do corpo, há a saída do metal pela membrana basolateral dos enterócitos (Yu et al., 2007). O transportador/exportador ZnT1 é o principal responsável pelo processo (Figura 11) (Liuzzi et al., 2000; Yu et al., 2007). Altos níveis de zinco aumentam expressão proteica do receptor, enquanto a deficiência parece não alterá-la (Liuzzi et al., 2000). No sangue, a maioria dos átomos de zinco liga-se à albumina (77%) por ligações fracas, facilitando a passagem do metal para diferentes órgãos. Outra parte liga-se à α2-macroglobulina (~20%) por ligações fortes, fazendo parte de um pool de zinco que não é transportado para os tecidos (Foote & Delves, 1984). Ademais, uma pequena parte do zinco permanece livre no sangue (Foote & Delves, 1984). Assim, a dosagem de zinco no soro sanguíneo humano é considerada um indicador do status geral do zinco no corpo, sendo rotineiramente aplicado ao diagnóstico de deficiência e excesso do metal no organismo (Rükgauer & Klein, 1997). Os valores de 28 zinco séricos considerados normais em humanos variam na faixa de 70 µg a 150 µg/dL (Rükgauer & Klein, 1997). Após alcançar a circulação sistêmica, o zinco é distribuído entre os diferentes órgãos (Wastney et al., 1986; Aggett, 1994). Esse metal é considerado um oligoelemento, pois se apresenta em quantidades diminutas no organismo, representando apenas 0,003% (de 1,4 g a 2,3 g) de todo o corpo humano (70 Kg) (Wastney et al., 1986; Aggett, 1994). A maior parte do zinco corpóreo é encontrada principalmente nos músculos esqueléticos (60%), ossos (30%), fígado (~5%) e pele (~5%) (Figura 11) (Wastney et al., 1986; Aggett, 1994). Como já citado, os diferentes órgãos possuem variações na quantidade e no tipo de transportadores importadores e exportadores de zinco, refletindo na quantidade desse metal dentro das células (Kambe et al., 2014). No fígado, especificamente, os transportadores/importadores ZIP5 e ZIP14 têm papel relevante na importação do zinco do meio extracelular para o citoplasma dos hepatócitos (Figura 11) (Liuzzi et al., 2005; Aydemir et al., 2012; Sun et al., 2014). Após o influxo do zinco para o meio intracelular, o metal distribui-se entre citoplasma (50%), núcleo (30% a 40%) e membrana plasmática (10%) para que desempenhe suas principais funções (Thiers & Valle, 1957; Kambe et al., 2014). Sobretudo, os transportadores ZIP7 e ZnT7 estão presentes nas organelas do hepatócito, como o retículo endoplasmático (RE), e participam desse processo (Figura 11) (Sun et al., 2014). Parte do zinco citoplasmático liga-se às MT (Figura 11), proteínas de baixo peso molecular e ricas em resíduos sulfidril cisteína que possuem alta afinidade por diversos íons metálicos (Thirumoorthy et al., 2011; Kloubert & Rink, 2015). Tais proteínas têm papel fundamental na homeostase dos metais na célula e também desempenham função antioxidante (Thirumoorthy et al., 2011; Kloubert & Rink, 2015). Especificamente, as MT parecem ser “reservatórios” de zinco, pois a expressão de tais proteínas é diretamente associada às alterações na concentração do zinco intracelular (Thirumoorthy et al., 2011; Kloubert & Rink, 2015). Mediante ao aumento do zinco intracelular, há ativação do fator de transcrição MTF-1, que estimula a expressão de MT (Szczurek et al., 2001; Saydam et al., 2002; Wang et al., 2004). Por sua vez, as MT ligam-se ao zinco e reduzem a quantidade desse metal no citoplasma. Em condições de redução de zinco intracelular, inibe-se a ativação e expressão de MTF-1 e MT, respectivamente, e as MTs liberam o zinco para o citoplasma (Szczurek et al., 2001; Saydam et al., 2002; Wang et al., 2004). Os transportadores/exportadores ZnT1 e ZnT2 têm papel importante na redução da concentração desse metal no fígado, visto que o aumento na quantidade de zinco 29 aumenta a expressão de tais transportadores, podendo resultar no efluxo do zinco dos hepatócitos para a corrente sanguínea (Figura 11) (McMahon & Cousins, 1998; Liuzzi et al., 2000). Por fim, a excreção do zinco também é mediada pela ação dos transportadores e ocorre principalmente pelas fezes via enteróticos/hepatócitos e pequena parte pela urina via células epiteliais tubulares renais (Krebs, 2000). O transportador/importador ZIP5, presente na membrana basolateral dos enterócitos, media a reentrada do zinco circulante para citoplasma (Figura 11), já o transportador/exportador ZnT6, presente na membrana apical dos enterócitos, pode ser responsável pela excreção do metal do citoplasma para o lúmen intestinal (Figura 11) (Yu et al., 2007; Geiser et al., 2013). Já nos rins, os transportadores ZnT1 e ZnT2 são importantes para o efluxo do zinco das células epiteliais tubulares renais (Liuzzi et al., 2000). Figura 11. Homeostase do zinco. A manutenção de concentrações adequadas de zinco na célula envolve os processos de (1) absorção pelos enterócitos, (2,3) distribuição do metal pelo organismo e pelos distintos compartimentos celulares hepatócito, (3) armazenamento pelas metalotioneínas (MT) e (4) excreção pelos enterócitos. Referências:Aggett, 1994; Liuzzi et al., 2000; Wang et al., 2004; Liuzzi et al., 2005; Mao et al., 2006; Yu et al., 2007. 30 2.4 Principais funções Grande parte do conhecimento das múltiplas funções do zinco, sobretudo nos seres humanos e roedores, está diretamente relacionado à descoberta dos efeitos da deficiência desse metal nos organismos (Todd et al., 1934; Prasad et al., 1961). De fato, o zinco desempenha funções atreladas a diversas vias celulares importantes. Destaca-se o papel do zinco, sobretudo, como parte estrutural e funcional de enzimas e fatores de transcrição, principalmente como parte de dedos de zinco (Stefanidou et al., 2006). Os dedos de zinco (Figura 12) são domínios proteicos descobertos por Hanas e colaboradores (1983) na espécie de sapo Xenopus laevis. São estruturas presentes na metade dos fatores de transcrição dos seres eucariotos, sobretudo humanos e murinos (Messina et al., 2004). Observou-se que os dedos de zinco são estruturas relativamente pequenas que necessitam de átomos de zinco para a manutenção da sua estrutura tridimensional e função (Figura 12) (Hanas et al., 1983). Essas estruturas possuem protusões que se assemelham a “dedos”, interagindo com a molécula de DNA e permitindo a transcrição gênica (Figura 12) (Hanas et al., 1983). Os dedos de zinco mais comuns no genoma eucariótico são aqueles formados por resíduos de cisteína e histidina (Cys2-His2) (Figura 12) (Razin et al., 2012). O átomo de zinco coordena a ligação entre esses resíduos, mantendo as estruturas de α-hélice e β- antiparalela funcionais (Figura 12) (Razin et al., 2012). Estruturalmente, o zinco também está presente em diversas enzimas. Por exemplo, o zinco faz parte de sítios estruturais e catalíticos da enzima ADH dos mamíferos (Brandt et al., 2009). Nessa enzima, o zinco está ligado a diferentes resíduos de cisteína por meio de ligações iônicas e covalentes, contribuindo para a sua manutenção estrutural (Brandt et al., 2009). 31 Figura 12. Dedo de zinco Cys2-His2. (A) Estrutura básica, formada por resíduos de cisteína e histidina ligados por um átomo de zinco, mantendo a forma de “dedo” característica da estrutura. (B) Interação de três dedos de zinco com uma molécula de DNA. Referência: Razin et al., 2012. Dentre as funções desempenhadas pelo zinco, destaca-se seu papel como agente antioxidante (Figura 13). O zinco, como metal, não parece desempenhar essa função per se e suas propriedades antioxidantes resultam de diversos mecanismos indiretos, quando associado a diferentes proteínas (Kloubert & Rink, 2015). Como resultado do metabolismo normal do oxigênio nas células, há a formação dos íons superóxido (O2-), que pode ligar-se a diversas biomoléculas e causar danos a célula. Assim, as metaloenzimas superóxido dismutase (SOD) catalisam a reação que transforma esse íon em oxigênio (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2), reduzindo a sua ação oxidante (Tainer et al., 1983). O zinco é parte estrutural fundamental da SOD1 ou CuZnSOD, enzima abundante no citoplasma das células, por ligar-se a um anel eletrostático formado por resíduos histidil e aspartil, mantendo a estabilização estrutural do homodímero que forma a SOD (Tainer et al., 1983). O zinco também é componente estrutural do fator de transcrição Sp1, mantendo a estabilização de três dedos de zinco formados por resíduos de cisteína e histidina (Cys2-His2) (Narayan et al., 1997). Por sua vez, esse fator de transcrição pode induzir a expressão do gene da enzima antioxidante catalase, que decompõe o H2O2 em O2 e H2O (Tate et al., 1997). Como já comentado em 2.3, a ativação do fator de transcrição MTF-1 é dependente da concentração de zinco intracelular (Saydam et al., 2002). O zinco liga-se de maneira direta e reversível aos dedos de zinco presentes em MTF-1, ativando- 32 o e induzindo a transcrição do gene das MTs (Saydam et al., 2002). As MTs, além do seu papel na homeostase de metais, tem ação antioxidante por possuir vários resíduos de cisteína que atuam na eliminação de radicais hidroxila (OH-) (Kang, 2006; Ruttkay- Nedecky et al., 2013). O zinco também parece ter importância na indução da via Keap1/Nrf2/ARE (Wang et al., 2015). Nessa via, o aumento do zinco celular inibe a degradação de Nrf2 pela metaloproteína Keap1, que também possui um dedo de zinco em sua estrutura, promovendo acúmulo de Nrf2 (McMahon et al., 2010; Ogura et al., 2010). Esse fator de transcrição liga-se ao elemento de resposta antioxidante (ARE) e leva ao aumento da expressão de genes relacionados à enzimas de defesa antioxidante (glutationa [GSH] e glutationa peroxidase [GSPx] e a própria SOD) e detoxificação de carcinógenos (glutationa-S-transferase-1 [GSTA1] e hemeoxigenase-1 [HO-1]) (Stefanson & Bakovic, 2014; Wang et al., 2015). Outra função de destaque do zinco está relaciona à proteína p53 (Figura 13) (Méplan et al., 2000; Loh, 2010). Como já comentado em 1.3, a p53 é um fator de transcrição que interage com DNA das células por um domínio proteico complexo que contém um átomo de zinco (Méplan et al., 2000; Loh, 2010). Sabe-se que presença zinco mantém a estabilização estrutural e, consequentemente, funcional da proteína p53 (Méplan et al., 2000; Loh, 2010). Portanto, as quantidades de zinco na célula estão diretamente atreladas à expressão de diversos genes controlados por p53, relacionados ao reparo do DNA (GADD45), parada no ciclo celular (CDKN1A) e apoptose (BAX e PUMA) (Méplan et al., 2000; Loh, 2010). Ainda em relação ao reparo, a Poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) é uma enzima envolvida no reparo por excisão de bases (BER), ligando-se ao DNA por meio de dois dedos de zinco (F1 e F2) (Petrucco & Percudani, 2008). Também foi identificado um dedo de zinco Cys2Hys2 na enzima DNA Y- polymerase η, responsável por sintetizar DNA em locais logo após a lesão ao DNA (denominada de síntese translesão), mantendo a estabilidade genômica (Bomar et al., 2007). Em relação ao sistema imunológico (Figura 13), o zinco também desempenha uma grande diversidade de funções, contribuindo tanto para a resposta imune inata quanto para a adaptativa (Rink & Haase, 2007). Um átomo de zinco é necessário para a manutenção da conformação estrutural da timulina, um hormônio produzido pelas células epiteliais tímicas e envolvido com a maturação, diferenciação e função dos Linfócitos T (Dardenne et al., 1985; Saha et al., 1995). Além disso, apesar de as proteínas envolvidas na via do 33 fator de transcrição NFκB (comentada em 1.3) não possuírem dedos de zinco na sua sequência de aminoácidos, a ativação dessa via nas células da resposta imunológica (como macrófagos e monócitos) demonstrou-se ser dependente da sinalização mediada pelo metal (Bao et al., 2007; Liu et al., 2013). O processo infeccioso leva à redistribuição corpórea e à redução do zinco plasmático (Gaetke et al., 1997). A redução do zinco atenua os mecanismos de defesa antioxidante, aumentando o estresse oxidativo (Song et al., 2009a,b). O NFκB, por sua vez, é ativado pelo estresse oxidativo, permitindo a expressão de diversos genes relacionados a resposta pró-inflamatória, como os genes da citocinas IL-2 e IL-2Rα (Prasad et al., 2002; Bao et al., 2007; Liu et al., 2013). Ademais, foi observado que a ativação de macrófagos pelas citocinas TNF-α e IFN-γ leva ao aumento da concentração de zinco nos fagolissosomos, que por sua vez, pode contibuir para a resposta microbicida direta (Wagner et al., 2005). O zinco está envolvido em processos de proliferação e crescimento celular tanto como elemento estrutural quanto como elemento regulatório de diversas vias (Figura 13) (Macdonald, 2000). Como componente estrutural, o zinco parece estabilizar a estrutura dos ribossomos e fazer parte de diversas metalenzimas, incluindo a RNA polimerase (Macdonald, 2000). Mais recentemente, o dedo de zinco ZNF191 demonstrou-se um potencial regulador da via Wnt/β-catenina (citada em 1.3), ligando-se ao promotor do gene CTNNB1 e ativando a expressão de β-catenina e de seus genes-alvo relacionados com a proliferação celular, como gene da proteína ciclina D1 (Liu et al., 2012; Zhao et al., 2015). No fígado, especificamente, os processos de crescimento e proliferação, essenciais para a regeneração hepática, parecem estar relacionados com o maior influxo de zinco citoplasmático, mediado pelo transportador/importador ZIP14 (Aydemir et al., 2012). A maior quantidade de zinco na célula aumenta a fosforilação de c-Met por ligar- se e inibir a atividade da enzima fosfatase PTP1B (Aydemir et al., 2012). A proteína c- Met está relacionada com diversas vias de proliferação e crescimento celular, incluindo a ativação da via Wnt/β-catenina (Aydemir et al., 2012). 34 Figura 13. Algumas das principais funções do zinco na (A) defesa antioxidante, (B) proliferação e crescimento, (C) p53 e reparo ao DNA e (D) sistema imunológico. Referências: Tainer et al., 1983; Narayan et al., 1997; Saha et al. 1995; Méplan et al., 2000; Saydam et al., 2002; Bomar et al., 2007; Petrucco & Percudani., 2008; McMahon et al., 2010; Aydemir et al., 2012; Liu et al., 2012. 2.5 Deficiência, Suplementação e Câncer Apesar de a média global estimada para o consumo do zinco atingir valores próximos ao sugeridos (11,4 mg/dia), estima-se que 17,3% da população mundial esteja sobre risco de consumo inadequado de zinco e, consequentemente, sob risco de deficiência desse metal (Figura 14) (Wessels & Brown, 2012). Esse valor corresponde a 1 bilhão e 211 milhões de pessoas, se considerarmos a população mundial em torno de 7 bilhões de pessoas. Além disso, mundialmente, estima-se que o valor da razão molar fitato/zinco seja ~16 F/Zn, considerado alto pela OMS e podendo influenciar na redução da absorção do zinco (Wessels & Brown, 2012). Isso pode ser explicado pela estimativa de que somente 35% do zinco ingerido mundialmente seja de origem animal (Figura 14) (Wessels & Brown, 2012). 35 Os países da Ásia (Sul e Sudeste) (~30% e 22%, respectivamente) e África Subsaariana (26%) possuem grande parte da população sobre risco de consumo inadequado de zinco (Figura 14) (Wessells & Brown, 2012). Nessas regiões, o consumo médio de zinco está abaixo do estimado: 8,4 mg a 9,8 mg/dia na Ásia e 8,9 mg/dia na África (Wessells & Brown, 2012). Outro agravante está no fato de que a obtenção do zinco nessas regiões é baseada no consumo de produtos vegetais, como os cereais (Figura 14) (Wessells & Brown, 2012). Estima-se que na Ásia, somente 11% do zinco é obtido por produtos animais, enquanto na África, ~20% (Wessells & Brown, 2012). Assim, o valor da razão molar fitato/zinco dessas regiões é alto: 16,5 F/Zn a 23 F/Zn na Ásia e 21 F/Zn na África (Wessels & Brown, 2012). Além disso, síndromes de má absorção causadas por doenças diarreicas endêmicas são comuns nessas regiões, também influenciando na absorção e levando à deficiência desse micronutriente (Wapnir, 2000). Por outro lado, estima-se que na América do Sul e na Europa, somente 6,4% e ~10% da população, respectivamente, esteja sob risco de consumo inadequado desse micronutriente (Figura 14) (Wessells & Brown, 2012). Nessas regiões, o consumo médio de zinco supera os níveis recomendados, ~12 mg/dia em ambas (Wessells & Brown, 2012). Essa estimativa pode ser justificada pelo alto consumo de produtos animais nessas regiões (Figura 14), que contribui com 60% e 52% de todo o consumo de zinco na América do Sul e na Europa, respectivamente (Wessells & Brown, 2012). Além do consumo inadequado, deficiência desse micronutriente possui outras etiologias importantes, tanto herdadas quanto adquiridas. A forma herdada mais comum é a acrodermatite enteropática, uma condição que resulta de uma mutação no gene do transportador/importador ZIP4 (Wang et al., 2002; Dufner-Beattie et al., 2003). Enquanto o consumo inadequado é relacionado à maioria dos casos e dá origem a uma deficiência de zinco moderada, a acrodermatite enteropática contribui com a menor parte dos casos e está relacionada à deficiência severa do micronutiente (Wang et al., 2002; Dufner- Beattie et al., 2003, Wessells & Brown, 2012). 36 Figura 14. Porcentagem da população de cada país/continente sob risco de consumo inadequado de zinco e suas respectivas principais fontes de ingestão do micronutriente (produtos de origem animal ou vegetal, principalmente cereais). Referências: Wessells & Brown, 2012; US Department of Agriculture, 2010. Os efeitos da deficiência de zinco nos seres humanos foram inicialmente registrados por Halsted e Prasad (1961), quando homens iranianos foram diagnosticados com alterações do crescimento, hipogonadismo, supressão da resposta imunológica, disfunções cognitivas e anormalidades cutâneas (acrodermatite), como consequências de alterações nas principais funções do zinco no organismo (citadas em 2.3). Estudos posteriores do mesmo grupo de pesquisa em pacientes egípcios também corroboraram com os achados (Prasad et al., 1963). Ao longo dos anos, tais sintomas tornaram-se clássicos para o diagnóstico da deficiência de zinco em seres humanos (Prasad, 1991). Apesar desses achados, ainda nos anos 90 do século passado, a deficiência de zinco ainda era considerada por alguns autores um problema negligenciado pelas principais agências de saúde mundiais (Prasad, 1998). No entanto, em 2002, a OMS estimou que, mundialmente, a deficiência de zinco estaria relacionada com 16% das infecções do trato respiratório inferior (como a pneumonia), 18% dos casos de malária e 10% das doenças diarreicas, principalmente nos países considerados “em desenvolvimento” na África e na Ásia. Assim, aproximadamente 1,4% (0,8 milhões) do total de mortes no mundo poderiam ser atribuídos à deficiência de zinco e suas consequências (OMS, 2002). O 37 aumento da susceptibilidade às infecções está diretamente relacionado aos efeitos da deficiência de zinco na supressão do sistema imunológico (Ibs & Rink, 2003). Dentro desse contexto, diversos modelos experimentais em roedores começaram a ser aplicados para o estudo dos efeitos da deficiência de zinco, visto que as características fisiopatológicas da deficiência nos roedores são semelhantes ao observado no ser humano (Todd et al., 1934; Silvestre et al, 2007). Especialmente em roedores, o modelo de deficiência de zinco em camundongos Balb/C é amplamente aplicado em comparação com outras linhagens, como a CD-1, pela sua semelhança única com a deficiência de zinco humana (Silvestre et al., 2007; Zhao et al., 2013). E a partir desses modelos em roedores, sabe-se que a deficiência de zinco causa no fígado, especialmente, alterações na expressão gênica e proteica de componentes de vias de controle do crescimento celular, metabolismo de lipídios e xenobióticos, resposta ao estresse e sinalização celular, principalmente (Dieck et al., 2003). Já no contexto de doença hepática é importante ressaltar que as regiões endêmicas para as infecções com o VHC e VHB sobrepõem-se àquelas de consumo inadequado de zinco e maior risco de deficiência desse micronutriente (Franco et al., 2012; Wessells & Brown, 2012; Messina et al., 2015). Sabe-se que a imunocompetência do hospedeiro é fundamental para determinar o resultado das infecções agudas por VHC e VHB (McMahon, 2009; Westbrook & Dusheiko, 2014). Em indivíduos imunocompetentes, a resolução da infecção aguda com clearance viral pode chegar a 34% e 90% dos pacientes infectados pelo VHC e VHB, respectivamente (McMahon, 2009; Westbrook & Dusheiko, 2014). Assim, levando-se em consideração os efeitos da deficiência de zinco na supressão do sistema imunológico, especula-se uma importância subjacente da deficiência desse metal nas consequências dessas infecções agudas, incluindo o desenvolvimento de doença hepática crônica e o CHC (Grüngreiff & Reinhold, 2010). Além disso, um estudo experimental recente em camundongos Balb/C demonstrou que a deficiência de zinco gestacional parece suprimir o sistema imunológico humoral e celular da prole, resultando em menor eficácia da vacinação contra o VHB (Zhao et al., 2013) Já nos últimos anos, a redução dos níveis de zinco tem sido atrelada ao maior risco de desenvolvimento de doenças crônicas, como o câncer (Gumulec et al., 2014). Em estudos tanto em humanos quando em roedores, a deficiência de zinco aumenta o estresse oxidativo seguido de aumento de dano no DNA (Song et al., 2009a,b). In vitro, a deficiência também demonstrou aumentar o dano ao DNA em células epiteliais prostáticas e fibroblastos normais, por alterar diversos mecanismos de defesa antioxidante 38 e reparo citados em 2.3, incluindo a redução da atividade de ligação do fator de transcrição p53 e redução na expressão de seus genes-alvo (Ho et al., 2003; Yan et al., 2008). A alteração da integridade genômica é considerada um fator de risco para o processo de transformação maligna e surgimento de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas malignas (Hanahan & Weinberg, 2011). Um estudo de meta-análise recente avaliou a concentração de zinco no soro e no tecido tumoral de pacientes com diversos tipos de neoplasias malignas (Gumulec et al., 2014). Observou-se que em neoplasias malignas dos pulmões, estômago e próstata há redução dos níveis séricos de zinco em comparação com pacientes saudáveis (Gumulec et al., 2014). Ademais, os níveis de zinco estão reduzidos no tecido tumoral de neoplasias malignas da próstata e da tireoide (Gumulec et al., 2014). Em relação às neoplasias malignas do esôfago, especificamente, já é antiga a relação epidemiológica entre a deficiência de zinco e maior risco de desenvolvimento dessas neoplasias (van Rensburg, 1981). Estudos recentes in vivo em modelos de carcinogênese química de esôfago em roedores, induzida pela droga N-nitrosometillbenzilamina (NMBA), demonstraram que a deficiência parece promover o surgimento dessas neoplasias malignas pela indução exacerbada da resposta inflamatória, mediada por alteração na expressão dos miRNA-31 e miRNA-21 (Alder et al., 2012; Taccioli et al., 2012). Além disso, ainda em modelos experimentais in vivo, a deficiência parece induzir e/ou promover a carcinogênese oral e de colo (Fong et al., 2006; Christudoss et al., 2008;2012). Já em estudos in vitro, a deficiência de zinco parece aumentar a expressão, mas reduzir a atividade de p53 em células de glioma, reduzindo a expressão de genes-alvo (Ho & Ames, 2002). Em células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2), a deficiência de zinco demonstrou causar ruptura de complexos juncionais intercelulares e causar desorganização do citoesqueleto, por alterações em ZO-1, ocludina, β-catenina, E-caderina e β-tubulina (Finamore et al., 2008). Assim como nas doenças hepáticas crônicas, há justaposição das regiões de maior incidência e mortalidade pelo CHC sobre aquelas de consumo inadequado de zinco e maior risco de deficiência desse micronutriente (GLOBOCAN, 2012; Wessels & Brown, 2012). Além disso, também é observada redução nos níveis de zinco séricos e teciduais em pacientes acometidos pelo CHC quando comparados a pacientes saudáveis (Gumulec et al., 2014). Experimentalmente, estudos in vitro com células de CHC (HepG2) demonstraram que a deficiência de zinco reduz a atividade de p53, reduzindo a expressão 39 do gene da proteína p21 (Reaves et al., 2000; Wong et al., 2007). In vivo, apesar de observar que a deficiência promove lesão hepática induzida pelo álcool, um fator de risco importante para o desenvolvimento de doença hepática crônica e CHC, não há estudos que avaliem os efeitos da deficiência de zinco na hepatocarcinogênese (Zhong et al., 2013). Portanto, a relação do CHC e da deficiência de zinco, apesar de clinicamente estabelecida, ainda segue negligenciada (Costello & Franklin, 2014). No contexto do câncer, de uma maneira geral, pela diversidade funcional do zinco, a deficiência desse micronutriente pode afetar diversas vias celulares, que podem contribuir para que as células adquiram características como instabilidade genômica e mutação, proliferação celular contínua, evasão a sinais supressores do crescimento, resistência a apoptose e inflamação, consideradas “hallmarks” do câncer (Figura 15) (Hanahan & Weinberg, 2011). Tais características podem contribuir para o processo de patogênese de diferentes tipos de neoplasias malignas, incluindo o CHC. Figura 15. O zinco, suas múltiplas funções e o possível papel nos “hallmarks” do câncer. Referência: Reaves et al., 2000; Wong et al., 2007; Fong et al., 2006; Alder et al., 2012; Taccioli et al., 2012; Hanahan & Weinberg, 2011. 40 A partir de 2002, como resultado da estimativa da OMS quanto à importância da deficiência de zinco a nível mundial, regimes de readequação de consumo, suplementação e de fortificação de alimentos foram amplamente aplicados para reduzir os efeitos da deficiência, principalmente sobre o desenvolvimento de doenças infecciosas (Yakoob et al., 2011). Os regimes de suplementação de zinco utilizam diversos sais de zinco e variam globalmente em relação a dosagem e frequência (Brown et al., 2004). No entanto, a escolha do regime em si deve levar em consideração fatores como a solubilidade do sal na água, solubilidade intragástrica, sabor, custo, efeitos colaterais e segurança (Brown et al., 2004). Dentre os sais, os mais comumente aplicados são o acetato, aminoato, ascorbato, citrato, gluconato, histidinato, óxido, o picolinato e o sulfato de zinco (Brown et al., 2004). O acetato, o gluconato e o sulfato de zinco merecem destaque pois são compostos hidrossolúveis e facilitam a absorção intestinal (Brown et al., 2004). De fato, um estudo de meta-análise recente revelou que diferentes regimes de suplementação de zinco, quando aplicados em um período mínimo de três meses em países considerados “em desenvolvimento”, reduziram 15% da mortalidade causada pela pneumonia e 13% da mortalidade causada por doenças diarreicas (Yakoob et al., 2011). No contexto de doença hepática, diferentes regimes de suplementação já foram aplicados. A suplementação com gluconato de zinco (50 mg/dia, 5 vezes por semana por 24 semanas) demonstrou aumentar a eficácia de terapias antivirais contra a infecção crônica com o VHC (Ko et al., 2005). Além disso, a suplementação com histidinato de zinco (33 mg/dia, 7 vezes por semana por ~8 anos) parece atenuar o quadro clínico e reduzir o risco de desenvolvimento de CHC em pacientes com infecção crônica pelo VHC (Matsumura et al., 2012). Assim, a suplementação vem sendo considerada como terapia adjunta para o tratamento/prevenção de doenças hepáticas crônicas (Grüngreiff & Reinhold, 2010). Já em relação ao câncer, estudos in vitro demonstraram que a suplementação protege células CHC (HepG2) do dano oxidativo causado por um agente genotóxico, por aumentar a expressão das MT 1 e 2 (Zheng et al., 2013). Além disso, a suplementação demonstrou aumentar a ação apoptótica da droga quimioterápica adriamicina em células de câncer de mama (MCF7) por restaurar a função de p53 (Puca et al., 2009). Em células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2), opostamente à deficiência, a suplementação parece alterar a composição e aumentar a seletividade das junções oclusivas (Wang et al., 2013). In vivo, estudos em roedores demonstraram que a suplementação atenua o desenvolvimento de lesões pré-neoplasicas ou neoplásicas malignas em modelos 41 quimicamente induzidos de carcinogênese de estômago, de próstata, de colo e oral (Dani et al., 2007; Banudevi et al., 2011a,b; Fong et al., 2011; Sun et al., 2011). Além disso, a suplementação de zinco, quando aliada à adriamicina, também atenua o desenvolvimento de tumores mamários em um modelo murino transgênico de hiperexpressão de HER2/neu (Magalit et al., 2012). O principal mecanismo de ação do zinco também está relacionado ao aumento da apoptose por restauração da atividade de p53, corroborando com os achados in vitro de Puca e colaboradores (2009) (Magalit et al., 2012). Devido aos achados recentes e pela diversidade de funções desempenhada por esse metal, autores têm considerado a aplicação da suplementação de zinco para a prevenção ou tratamento adjunto de diversas neoplasias em seres humanos (Dhawan & Chadha, 2010). No entanto, os mecanismos moleculares, genéticos e epigenéticos relacionados à suplementação desse metal ainda devem ser elucidados (Dhawan & Chadha, 2010). Em relação ao CHC, apesar de observar que a suplementação atenua o desenvolvimento de lesão hepática induzida pelo álcool em murinos, por aumentar a atividade das enzimas ADH e glutationa redutase, não há estudos que avaliem os efeitos da suplementação desse micronutiente em modelos de hepatocarcinogênese (Zhou et al., 2005). 3. Referências Aggett PJ, Aspects of neonatal metabolism of trace metals. Acta Paediatr Suppl. 402:75– 82, 1994. Aguilar F, Harris CC, Sun T, Hollstein M, Cerutti P. Geographic variation of p53 mutational profile in nonmalignant human liver. 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