JULIANA MACHADO ALMEIDA ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL DE VARIEDADES DE LÚPULO (Humulus lupulus L.) CULTIVADAS NO BRASIL POR CROMATOGRAFIA GASOSA UNI E BIDIMENSIONAL Botucatu 2020 JULIANA MACHADO ALMEIDA ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL DE VARIEDADES DE LÚPULO (Humulus lupulus L.) CULTIVADAS NO BRASIL POR CROMAOTOGRAFIA GASOSA UNI E BIDIMENSIONAL Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Agronomia (Horticultura) Orientadora: Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques Botucatu 2020 A447a Almeida, Juliana Machado Análise do óleo essencial de variedades de lúpulo (Humulus lupulus L.) cultivadas no Brasil por cromatografia gasosa uni e bidimensional / Juliana Machado Almeida. -- Botucatu, 2020 67 p. : il., tabs., fotos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu Orientadora: Marcia Ortiz Mayo Marques 1. Terpenos. 2. Mirceno. 3. Cannabaceae. 4. Constituintes químicos. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Aos meus amados pais, Marilene e Cleudes, dedico AGRADECIMENTOS À Deus pelo dom da vida e por ter me dado saúde e força para enfrentar as dificuldades. Aos meus pais e irmã Patrícia Machado Almeida por serem meu apoio e base na minha jornada acadêmica. A Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp, pela oportunidade de realização do mestrado. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos concedida Ao Instituto Agronômico (IAC) por disponibilizar o laboratório e equipamentos onde foi possível a realização das análises da pesquisa. Aos produtores pela doação das amostras de lúpulo e Associação Brasileira de Produtores de Lúpulo (APROLÚPULO) pelo apoio a realização da pesquisa. A Dra. Roselaine Facanali e ao professor Dr. Leandro Wang Hantao pelo suporte e ajuda nas análises cromatográficas em 2D no Instituto de Química da UNICAMP. A minha orientadora, Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques, pela oportunidade e apoio no andamento da dissertação. Agradeço muito pelas sugestões e conselhos importantes que me foram dados. Todo o meu ganho profissional durante esse período foi devido a sua paciência e amizade, sou eternamente grata! Ao meu colega de trabalho e amigo Júlio Cesar Rodrigues pelo suporte nas análises estatísticas e interpretação dos dados. Não tenho palavras suficientes para descrever minha gratidão por todo apoio que você proporcionou, não só no âmbito profissional, mas também pessoal. Sua amizade é muito importante. Aos amigos que fiz no laboratório de Fitoquímica do IAC, Dani, Lilian, Leticia, Leila, Jordany e Ana. Agradeço pelas agradáveis conversas no café da manhã, pela paciência em me ensinar a manusear os equipamentos, pelo suporte em todas as dúvidas que eu tive durante esse período, todos vocês contribuíram muito para que eu conseguisse finalizar essa pesquisa. A todos que direta e indiretamente contribuíram na conclusão do trabalho meu profundo agradecimento. RESUMO Pertencente à família Cannabaceae, o lúpulo (Humulus lupulus L.) é considerado um dos ingredientes mais importante da cerveja por proporcionar amargor e odor na bebida, devido aos α-ácidos e β-ácidos e ao óleo essencial presentes nas inflorescências femininas. Os óleos essenciais são responsáveis pelo perfil aromático das variedades de lúpulo, podendo variar de 0,5 a 3% de teor nos cones secos. No Brasil, o cultivo de lúpulo ainda é recente e advém de iniciativas de agricultores, em boa parte, de pequena escala, com potencial de crescimento desse nicho de mercado. Para o fomento da mesma, é importante analisar o perfil químico dos óleos essenciais, uma vez que, fatores genéticos, ambientais, de cultivo, época de colheita e processamento do material vegetal podem afetar sua composição química. O objetivo desse estudo foi caracterizar a composição química dos óleos essenciais de variedades de Humulus lupulus, cultivadas em diferentes localidades no Brasil. No total foram avaliadas 18 amostras de 13 variedades (Cascade, Chinook, TP, Medusa, Suíço, Mantiqueira, Saaz, EKG1, Columbus, Comet, Hallertau Mittelfrüch, Brazylinsk e Nugget) provenientes dos estados de São Paulo, Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, safra de 2019. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação em aparato Clevenger por três horas, a partir de 45 g de cones secos. A análise da composição química dos óleos essenciais foi realizada por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente acoplada a espectrometria de massas (CG×CG- EM). Os rendimentos dos óleos essenciais variaram de 0,09 % (Chinook/SP) a 2,29 % (Cascade/RJ). Houve variação do perfil químico entre as variedades. O mirceno, responsável por prover odor herbal no lúpulo, foi o constituinte majoritário em 15 amostras, seguido por α-humuleno (variedade Medusa, L09) e β-farneseno (Cascade/SP: L04, e Saaz/RJ: L05). A técnica CG×CG-EM possibilitou a identificação adicional de 14 substâncias em relação a CG-EM. Palavras-chave: Terpenos. Mirceno. Cannabaceae. Constituintes químicos. ABSTRACT Belonging to the Cannabaceae family, hop (Humulus lupulus L.) is considered one of the most important ingredients in beer by providing the bitterness and odor of the drink due to α and β-acids and to the essential oil present in its female inflorescences. Essential oils are responsible for the aromatic profile of hop varieties, ranging from 0.5 to 3% of the content in dry cones. In Brazil, the cultivation of hops is still recent and comes from initiatives of small farmers with potential expansion of this market niche. However, to promote it, it is important to analyze the essential oils chemical profile, since genetic, environment and cultivation factors, as well as harvest season and plant material processing might affect its chemical composition. Thus, the aim of this study was to characterize the chemical composition of essential oils of Humulus lupulus varieties, cultivated in different locations of Brazil. In total, 18 samples of 13 varieties (Cascade, Chinook, TP, Medusa, Suíço, Mantiqueira, Saaz, EKG1, Columbus, Comet, Hallertau Mittelfrüch, Brazylinsk and Nugget) from São Paulo, Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states were evaluated, from a 2019 harvest. The essential oils were extracted by hydrodistillation in Clevenger apparatus for three hours, from 45 g of dry cones. The analysis of the chemical composition of essential oils was performed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and Comprehensive two dimensional gas chromatography coupled to mass spectrometry (GCxGC-MS). The essential oil yields ranged from 0.09 % (Chinook/SP) to 2.29 % (Cascade/RJ). There was variation in the chemical profile between the varieties. Myrcene, compound responsible for providing herbal odor in hops, was the major constituent in 15 samples, followed by α-humulene (Medusa variety, L09) and β-farnesene (Cascade / SP: L04, and Saaz / RJ: L05). The GCxGC-MS technique allowed the additional identification of 14 substances in relation to GC-MS. Keywords: Terpenes. Myrcene. Cannabaceae. Chemical contituents. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Corte transversal do cone de lúpulo feminino mostrando as glândulas de lupalina........................................................................ Figura 2 - Área de plantio de lúpulo................................................................... Figura 3 - Estrutura química dos α-ácidos e β-ácidos do lúpulo........................ Figura 4 - Reação de isomerização dos α-ácidos............................................. Figura 5 - Estrutura química do mirceno, (E)-cariofileno, α-humuleno, β- farneseno.......................................................................................... Figura 6 - Maiores produtores de lúpulo por área em 2017............................... Figura 7 - Rendimento dos óleos essenciais dos lúpulos cultivados no Brasil, safra 2019......................................................................................... Figura 8 - Cromatograma de íons totais (TIC) do óleo essencial de lúpulo, variedade Cascade produzido no Rio Grande do Sul..................................................................................................... Figura 9 - Classes de substâncias encontradas nos óleos essenciais nas 18 amostras das 13 variedades de lúpulo avaliadas............................. Figura 10 - Estrutura química das cetonas identificadas nas variedades de lúpulo................................................................................................ Figura 11 - Proporção relativa (%) do mirceno, α-humuleno, (E) cariofileno e β-farneseno nas amostras de lúpulo................................................ Figura 12 - Análise de Componentes Principais (ACP) aplicada a composição química das 18 amostras de 13 variedades de lúpulo................................................................................................ 23 24 26 27 28 30 38 40 41 42 49 51 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição química de cones secos de lúpulo Tabela 2 - Características de variedades de lúpulo cultivadas no Brasil Tabela 3 - Código, variedade, local de cultivo, safra, temperatura de secagem, embalagem e época de colheita de lúpulo Tabela 4 - Composição química dos óleos essenciais de 18 amostras de 13 variedades de lúpulo cultivadas no Brasil, safra 2019 Tabela 5 - Substâncias identificadas, exclusivamente, por cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG) de 16 amostras de 13 variedades de lúpulo, cultivadas no Brasil, safra 2019 25 31 35 44 53 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO................................................................................... 19 2 OBJETIVOS....................................................................................... 21 3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 22 3.1 Aspectos botânicos e de cultivo de lúpulo................................... 22 3.2 Composição química e atividade biológica do lúpulo................ 24 3.3 Variedades de lúpulo....................................................................... 30 3.4 Análise da composição química dos óleos essenciais............... 32 4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................. 34 4.1 Material vegetal................................................................................ 34 4.2 Extração e rendimento do óleo essencial..................................... 36 4.3 Análise da composição química do óleo essencial por Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM)............................................................................... 36 4.4 Cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG-EM)..................................................................................... 37 4.5 Análise estatística............................................................................ 37 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................... 38 5.1 Rendimento do óleo essencial....................................................... 38 5.2 Caracterização da composição química dos óleos essenciais por cromatografia em fase gasosa unidimensional (CG).................................................................................................... 39 5.3 Análise de Componentes Principais dos óleos essenciais......... 50 5.4 Caracterização da composição química dos óleos essenciais por cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG)............................................................................................ 52 6 CONCLUSÃO.................................................................................... 55 REFERÊNCIAS................................................................................. 57 19 1 INTRODUÇÃO Pertencente à família Cannabaceae, o lúpulo (Humulus lupulus L.) é uma planta de hábito trepador, perene, dioica, nativa da Europa, sendo distribuída pela América do Norte, Ásia e algumas áreas temperadas da América do Sul, África e Austrália. É considerado um dos ingredientes mais importante da cerveja, devido ao fornecimento e impacto nas características de amargor, controle bacteriano e aroma da bebida (PISTELLI 2018; ROSA ; AFONSO, 2014). As propriedades desejáveis do lúpulo são provenientes dos α-ácidos e β- ácidos, óleos essenciais e compostos fenólicos. Esses metabolitos estão presentes na base dos tricomas das inflorescências de plantas femininas (não fertilizadas) do lúpulo, chamadas glândulas de lupulina, as quais são responsáveis pela secreção de um pó amarelo resinoso, denominado de lupulina, cujo acumulo aumenta com o estágio de maturação das inflorescências (BOCQUET ET al., 2018; JELIAZKOVA et al., 2018). As glândulas de lupulina também são encontradas em plantas masculinas em pequena quantidade, motivo pelo qual nos cultivos comerciais são utilizadas plantas femininas (SPOSITO, et al 2019). Os óleos essenciais são responsáveis pelo perfil aromático das variedades de lúpulo, podendo variar de 0,5 a 3% de teor nos cones secos (inflorescências de plantas femininas). A composição química do óleo essencial de H. lupulus é complexa sendo descrito na literatura 485 compostos identificados (EYRES et al., 2007), pertencentes as classes dos monoterpenos, sesquiterpenos, cetonas, ésteres e aldeídos. A fração de hidrocarbonetos pode corresponder de 50% a 80% do óleo essencial. O mirceno (monoterpeno) é comumente descrito como o composto majoritário com até 60% da constituição química do óleo essencial, sendo o responsável pelo aroma característico de lúpulo fresco. Os sesquiterpenos (E)- cariofileno, α-humuleno e β-farneseno também são citados como componentes do óleo essencial, sendo o percentual relativo diferente de acordo variedade (AMALGUER et al., 2014; YAN et al., 2017). Mundialmente, o cultivo de lúpulo é considerado uma commoditie em vários países. Em 2018, a Europa foi a maior produtora com cerca de 58 mil t, onde 41 mil t foram referentes à produção da Alemanha e 5 mil t da República Tcheca, seguidos de EUA com 49 mil t ao ano (BARTH REPORT, 2018). No que se refere ao Brasil, 98% das importações de todo o lúpulo usado pelas cervejarias nacionais vieram da 20 Alemanha (55%) e dos Estados Unidos (43%), sendo em torno de 2,4 mil toneladas por ano, ao custo de cerca de US$ 35 milhões (CERVBRASIL, 2016; REVISTA FAPESP, 2018). O cultivo de lúpulo no Brasil ainda é recente e advém de iniciativas de agricultores, em boa parte, de pequena escala. Mas, esse cenário vem se modificando. Segundo dados de Sarnighausen et al. (2017), a área de plantio de lúpulo na safra 2017/2018 no Brasil foi de 18 hectares. Segundo informações obtidas da Associação Brasileira de Produtores de Lúpulo (Aprolúpulo), há no Brasil cultivos nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Distrito Federal, Rio de Janeiro, Espirito Santo, Rio Grande do Sul, Rio Grande do Norte, Santa Catarina e Paraná. Considerando o fato do Brasil ser o terceiro maior produtor de cerveja do mundo e, consequentemente, tendo uma demanda considerável de matéria-prima, o cultivo do lúpulo nacional é uma importante estratégia para o fomento da cadeia produtiva, possibilitando, futuramente, o desenvolvimento de produtos com identidade brasileira nas escolas de cervejaria. No entanto, é necessário que haja pesquisas visando a qualidade do lúpulo brasileiro, pois a composição química dos óleos essenciais pode ser influenciada por fatores genéticos, características agronômicas e condições ambientais dos locais de cultivo (LAFONTAINE et al., 2018). Tendo em vista o potencial do lúpulo cultivado no Brasil, a demanda de mercado e a escassez de informações sobre a composição química dos óleos essenciais das variedades cultivadas nas diferentes regiões do Brasil, torna-se imprescindível o desenvolvimento de pesquisas com foco na caracterização química desta matéria-prima, a fim de contribuir para a diferenciação das variedades e controle de qualidade. 21 2 OBJETIVO Caracterizar a composição química dos óleos essenciais de variedades de lúpulo (Humulus lupulus L.) cultivadas no Brasil. 22 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Aspectos botânicos e de cultivo do lúpulo O gênero Humulus é composto por três espécies: Humulus lupulus L., H. japonicus e H. yunnanensis. A espécie H. lupulus tem sua origem na Europa, sendo comercialmente cultivada para fins na produção de cerveja devido à alta produção de lupulina nos cones. O H. japonicus é nativa de regiões do Japão e China, diferente do lúpulo comum, essa espécie não produz lupalina em seus cones, sendo usado nessas localidades apenas para fins de ornamentação. A espécie H. yunnanensis tem sua origem em Yunnan na China e tem uso semelhante ao H. japonicus. Também não secreta lupalina em suas brácteas. (NEVE 1991; PERCIVAL 1905; SMALL 1978). O lúpulo é uma planta trepadeira, de hábito perene, dioica (plantas masculinas e femininas). Pode alcançar um crescimento de 20 cm a 30 cm ao dia, chegando a medir de 5 m a 7 m de altura em menos de cinco meses. Em cultivo comercial, é utilizado apenas flores femininas não fertilizadas (sem sementes), pois geram maior rendimento de lupulina. Sementes nos cones produzem um amargor não desejável a indústria. Plantas masculinas são usadas apenas para fins de hibridização no desenvolvimento de novas variedades, por isso é comum a retirada nos campos para garantir a não polinização de plantas femininas (DODDS, 2017). Os cones possuem a glândula de lupulina que produz um pó resinoso amarelo (FIGURA 1) que contém α-ácidos e β-ácidos, óleos essenciais e compostos fenólicos importantes para fabricação da cerveja. A maior parte da lupulina é produzida em torno da base das brácteas dentro do cone de lúpulo. (BOCQUET et al., 2017). 23 Figura 1 - Corte transversal do cone de lúpulo feminino mostrando as glândulas de lupulina Fonte: DURELLO et al., (2019). É uma planta que exige condições climáticas específicas. Precisa de calor e clima seco durante o crescimento, floração e o desenvolvimento das umbelas. A necessidade de horas luz para favorecer a indução da floração pode chegar a 13 horas por dia, sendo que a duração do dia é em função da latitude onde ele se encontra. O frio também é um fator importante, pois, ao final do verão e início de outono a planta passa pela fase de repouso, em resposta ao encurtamento dos dias, iniciando a dormência. A falta de horas de acumulação de frio pode resultar a quebra de dormência inadequada (DODDS 2017; KROTTENTHALER 2009). No campo, a planta necessita de tutoramento como pode ser visualizado na Figura 2. Solos de textura leve e profundo, bem abastecido com umidade, mas livre de alagamentos é considerado ideal para o seu cultivo, sendo recomendável o uso de irrigação em locais onde as médias de precipitações são baixas (NEVE 1991; DODDS 2017). 24 Figura 2 - Área de plantio de lúpulo Fonte: RODRIGUES et al. (2015, p.9). A colheita deve ser realizada quando os cones estiverem maduros devido ao acúmulo dos α-ácidos e β-ácidos e óleos essenciais, deve ocorrer ao final do verão a inicio do outono. Geralmente os cones apresentam um alto percentual de umidade com 75% a 80% e isso pode afetar a qualidade devido a oxidação dos componentes importantes para cerveja. Por isso, devem ser secos logo após a colheita em temperatura de 60 ºC a 70 ºC. Após esse processo devem ser acondicionados, embalados ou transformados em outros produtos como pellets para posterior venda (ALMAGUER, 2014). 3.2 Composição Química e atividade biológica do lúpulo Os cones do lúpulo apresentam substâncias que podem ser utilizados em variadas aplicações, como os α-ácido e β- ácido e óleos essenciais, que fornecem amargor e aroma na cerveja, além de possuir atividade antimicrobiana, e flavonoides que possuem comprovada atividade antioxidante na captação de radicais livres do organismo humano (MACHADO et al., 2018). A tabela 1 abaixo mostra o percentual dos constituintes encontrados no lúpulo. 25 Tabela 1 - Composição química de cones secos de lúpulo Constituintes Quantidade (%) Resinas totais 15-30 Óleo essencial 0,5-3 Proteínas 15 Monossacarídeos 2 Polifénois 4 Pectinas 2 Aminoácidos 0,1 Ceras e esteroides traços-25 Cinzas 8 Água 10 Celulose, etc 43 Fonte: ALMAGUER et al. (2014). As glândulas de lupulina consistem, em grande parte, de uma mistura de resinas moles e duras, quem podem ser divididos em α-ácidos (resinas moles) e β- ácidos (resinas duras). Os α-ácidos são os precursores dos princípios amargor da cerveja e são encontrados em maiores teores de 10% a 25% sendo os principais: cohumulona, humulona e adhumulona. Os β-ácidos são a lupulona, colupulona e adlupulona e encontrados em menores teores com cerca de 3% a 5% e tem a função de controle antimicrobiano na bebida e a estabilidade microbiológica geral da cerveja (NEVE, 1991; FERGUS, 2006; ). As estruturas químicas dos principais α-ácidos e β- ácidos estão demonstradas na Figura 3. 26 Figura 3 - Estrutura química dos α-ácidos e β-ácidos do lúpulo Fonte: Adaptado de DURELLO et al., (2019, p.902) Os α-ácidos não são diretamente transferidos para a cerveja, devido à baixa solubilidade em soluções aquosas, sendo então isomerizados através da fervura do mosto em compostos denominados iso-α-ácido, os quais são mais solúveis no mosto e consideravelmente mais amargos. A isomerização térmica é a reação mais importante para os ácidos amargos do lúpulo e ocorre via uma contração do anel acilado (ALMAGUER et al., 2014). Cada humulona dá origem a duas moléculas de isohumulona, as quais podem ter forma espacial cis-isohumulona ou trans-isohumulona, dependendo do arranjo espacial (Figura 4). Estas são consideradas mais amargas que os ácidos originais não isomerizados, sendo responsáveis por mais de 70% do amargor detectado sensorialmente em cerveja (TECHAKRIENGKRAIL et al., 2004; URBAN et al., 2012). 27 Figura 4 - Reação de isomerização dos α-ácidos Fonte: Adaptado de URBAN et al., (2012, p. 1553) A atividade antimicrobiana proveniente dos ácidos do lúpulo vem sendo relatada devido ao perfil presente nas cadeias laterais desse grupo. Essa atividade é capaz impedir o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, assim assegurando a qualidade microbiológica da cerveja (KEUKELEIRE, 1999). Bogdanova et al. (2018), estudando frações de α-ácidos, β-ácidos e xanthohumol contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, concluiu que todas as frações possuem moléculas biologicamente ativas, destacando um maior potencial da fração que contém xanthohumol. A atividade antimicrobiana de α-ácidos foi satisfatória, entretanto, parece estar ligada a maior concentração desses ácidos na planta. Os flavonóides prenilados são componentes importantes e encontrados nas glândulas de resina da planta do lúpulo feminino, que podem ser divididos em dois grupos principais: chalconas preniladas, como (XN), e flavanonas preniladas, como a 6-prenilnaringenina (HENLEY et al., 2014). Durante o processo de fabricação da cerveja o xanthohumol sofre isomerização a altas temperaturas formando isoxanthohumol (Durello et al, 2019). Na última década, por conta da ampla gama de potenciais benéficos a saúde, o xanthohumol tem sido a fonte de vários estudos, onde algumas pesquisas indicam efeitos positivos desse composto contra a obesidade e o diabetes pela regulação do metabolismo da glicose e do colesterol (MIRANDA et al., 2016; ZANOLLI; ZAVATTI 2008). O perfil aromático das variedades de lúpulo advém dos óleos essenciais, podendo variar de 0,5 a 3% de teor nos cones secos. Os óleos essenciais são 28 constituídos principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos, além de cetonas, ésteres e aldeídos. A fração de hidrocarbonetos monoterpênicos e sesquiterpênicos pode corresponder de 50% a 80% do óleo essencial. O mirceno (Figura 5), hidrocarboneto monoterpênico, é a substância majoritária com até 60% da fração na constituição química do óleo essencial, sendo o responsável pelo aroma característico de lúpulo fresco. Os sesquiterpenos (E)-cariofileno, α-humuleno e β-farneseno também são citados como componentes comumente encontrados nesta planta, sendo o percentual relativo variável para cada variedade (AMALGUER et al., 2014; YAN et al., 2017). Figura 5– Estrutura química do mirceno, E-cariofileno, α-humuleno, β-farneseno Fonte: ADAMS (2017). Segundo Almaguer at al. (2014), outros compostos, apesar de serem minoritários, são capazes de contribuir para aroma do lúpulo, como por exemplo, o linalol, álcool terpeno com odor floral, presente em quantidades de até 1,1%. O mirceno e o linalol são considerados os voláteis com maior odor em todas as variedades de lúpulo analisadas. O mirceno geralmente não contribui diretamente para o aroma na cerveja, porque sua concentração é muitas vezes muito abaixo do nível do limiar sensorial devido à sua evaporação durante a fervura do mosto. Cetonas e ésteres são compostos que mesmo em menores quantidades, contribuem para a formação de um leque aromático das variedades. As cetonas comumente encontradas são a 2-nonona, 2-decanona, 2-undecanona e 2-tridecanona (ABERL; COELHAN 2012). O desenvolvimento vegetal e, em especial, a produção de metabólitos especializados em plantas é influenciado por vários fatores bióticos (genética, 29 ontogenia) e abióticos (pragas, fotoperíodo, irradiação luminosa, temperatura, nutrição, irrigação, época de colheita, etc). (CARVALHO et al., 2010). Por isso diversos trabalhos buscam identificar como esses fatores podem influenciar na produção desses metabólitos. O lúpulo é altamente influenciado por fatores de processamento, como manuseio, secagem e armazenamento, assim como estágio de maturação na fase de colheita. Sharp et al. (2014), observou que o teor de óleo essencial de lúpulo aumentou na variedade Cascade colhida tardiamente, além do acréscimo nas concentrações de α-pineno, β-pineno, mirceno, limoneno, metil-heptanoato e linalol. Lafontaine et al. (2019), também encontrou resultados semelhantes onde a intensidade do aroma e a qualidade cítrica, devido a concentrações de álcoois terpênicos, foram afetados positivamente em razão da colheita mais tardia e mantendo os teores de α-ácidos desejáveis. A secagem e armazenamento são aspectos importantes a serem considerados, logo após a colheita normalmente os cones possuem de 75% a 80% de umidade, sendo necessário realizar a secagem em temperaturas de 60ºC a 70ºC por cerca de 8 a 15 horas até atingir um percentual de 10% a 12% umidade. (ALMAGUER et al., 2014). Rybka et al. (2018), analisando a influência de duas temperaturas de secagem nas características químicas do lúpulo, ao comparar com o lúpulo fresco, a quantidade de óleos essenciais decresceu 10% quando os cones foram secos a 40°C para as variedades Saaz e Harmonie, quando secos a 55°C este valor subiu 36% para a variedade Saaz e 43% para a variedade Harmonie, refletindo em perdas significativas. Apesar de não ter alterado a composição química do óleo essencial essa redução pode ser um fator na diminuição da intensidade do aroma de lúpulo. Além da importância sensorial, o óleo essencial de lúpulo mostrou atividade biológica. Frações de óleo essencial extraídos por período de 2-5 min. e 10-30 min. inibiram fortemente a bactéria Escherichia coli. A atividade de inibição mais forte contra Yersinia enterocolitica (Gram-negativa) e Clostridium perfringens (Gram- positiva) e Enterococcus faecalis foi observada com o óleo essencial extraído por período de quatro horas. As frações de óleo essencial de lúpulo ou o óleo essencial se mostrou promissor como agentes antimicrobianos ou para o desenvolvimento de novos medicamentos (JELIAZKOVA et al.,2018). 30 3.3 Variedades de lúpulo De acordo com Healey (2016), existem 265 variedades de lúpulo ao redor do mundo. Grande parte dos lúpulos mais conhecidos e cultivados mundialmente são provenientes de regiões da Europa e Estados Unidos. Os maiores cultivos são encontrados nos Estados Unidos, Alemanha, República Tcheca, Espanha, Eslovênia, Polônia, Austrália, Reino Unido e China, conforme demonstrado na Figura 5. Figura 6 - Maiores produtores de lúpulo por área em 2017 Mundialmente, as variedades e cultivares de lúpulo são classificadas como cultivares de amargo, cultivares de aroma e cultivares de flavour. Cultivares de amargor possuem maiores teores de α-ácido, em contrapartida as cultivares de aroma que apresenta um percentual menor. Cultivares de flavour possuem aptidão mistas com teores de α-ácidos e óleos essenciais em percentuais equilibrado (MORAIS, 2015). Os lúpulos de aroma carregam agradáveis compostos que dão características sensoriais singulares às cervejas, possuindo compostos aromáticos finos, como E- cariofileno e farneseno, os quais conferem aromas diferenciados às cervejas. Entretanto, lúpulos de aroma apresentam baixa quantidade de α-ácidos, de 2,4 a 5%, o que eleva o valor do produto. Em lúpulos de aroma os óleos essenciais são muito Fonte: BARTH HAAS (2017, p.1). 31 importantes, uma vez que estes possuem alta complexidade com mais de 300 compostos (FERGUS, 2006). Na Tabela 2 é possível visualizar as características quanto ao odor, teor de α-ácidos, β-ácidos e de óleos essenciais de variedades de lúpulo cultivadas no mundo, algumas das quais também sendo cultivadas no Brasil. Tabela 2 - Características de variedades de lúpulo cultivadas no mundo Variedade Característica Uso α-ácidos β-ácidos (%) Óleos essenciais Origem Cascade Floral, elementos cítricos e notas de toranja Amargor e Aroma 4.5%- 8.9% 3.6%- 7.5% 0.8-1.5 mL/100g USA Chinook Buquê de pinheiros e especiarias Amargor e Aroma 12%-14% 3%-4% 1.5-2.7 mL/100g USA Comet Toranja forte, sabores úmidos de resina Amargor & Aroma 9.4%- 12.4% 3%- 6.1% 1.98 mL/100g US Hallertauer Mittelfrüh Levemente florido e picante Aroma 3.5%- 3.5% 3.5%- 4.5% 0.6-1.2 mL/100g Alemanha Saaz Caráter nobre, carácteristica herbal Aroma 2.5%- 4.5% 4%-6% 0.4-0.8 mL/100g República Tcheca Nugget Amargo sólido, sabor leve, aroma de ervas Amargor & Aroma 9.5%- 14% 4.2%- 5.8% 1.5-3 mL/100g USA Columbus Aroma com notas cítricas Amargor & Aroma 14%-18% 4.5%- 6% 1.5-4.5 mL/100g USA Medusa Melão, limão Aroma 3.5 – 5.0% 5.0 – 5.6% 0.4 mL / 100g México Fonte: HEALEY (2016). Algumas variedades recebem o nome do seu local de origem como a variedade Hallertau Mittelfrueh (região de Hallertau, Alemanha). Essa variedade possui aroma delicado e conteúdo amargo médio e é muito popular. Quase entrou em declínio devido à sua alta suscetibilidade a virose da murcha, causada por Verticillium albo-atrum. O desenvolvimento de plantas livres de vírus permitiu na atualidade o seu cultivo (BARTH REPORT, 2018). Cascade é um dos lúpulos aromáticos mais populares e amplamente produzidos no mundo, representando cerca de 10% dos lúpulos cultivados nos EUA. A variedade foi criada no Oregon e lançado em 1972. Tem como características o baixo teor de α- ácidos e um bom percentual de óleos essenciais. Possui aroma cítrico, picante e de toranja agradável (DODDS, 2017; HEALEY, 2016). No Brasil vem sendo amplamente cultivada, devido a adaptabilidade de aptidão mista de uso para cervejaria. A variedade aromática Saaz é originária de Zatec, Bohemia, parte da República Tcheca, e registrada oficialmente em 1952. O uso do Saaz tcheco pelos cervejeiros e remonta a mais de 700 anos. É uma variedade considerada nobre devido as notas 32 aromáticas singulares. A Nova Zelândia, em particular, adotou o Saaz, criando vários descendentes, incluindo as populares variedades Motueka e Riwaka (B&D Saaz, respectivamente). Possui baixos teores de α-ácidos ( 2.5%-4.5%) e (0.4-0.8 mL/100g) de óleo essencial (HEALEY, 2016). A variedade Chinook foi desenvolvido pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e lançado em 1985 como uma variedade α-ácidos. Tem um aroma de cerveja altamente aceitável perfil com amargura suave e sabor completo (USA HOPS, 2017). A variedade Medusa é proveniente da subespécie neomexicanus do Novo México. É uma alternativa para um clima mais seco e árido. Necessita de menos água que o lúpulo europeu. E considerada uma variedade para aroma devido aos baixos teores de α-ácidos (KEGERATOR, 2017). 3.4 Análise da composição química dos óleos essenciais A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) é uma ferramenta universal utilizada para a identificação de voláteis em plantas, devido a sua capacidade de separação, em conjunto com detectores, hardware e software apropriados para sua aplicação em diferentes áreas. Porém, existem casos onde há amostras complexas que apresentam coeluição entre as substâncias, o que dificulta a detecção, identificação e quantificação desses compostos (MIGLIORINI et al., 2013). Em amostras complexas de óleo essencial, como por exemplo, a do lúpulo, a separação unidimensional pode permitir, principalmente em casos de compostos minoritários com coeluição, uma resolução representativa da amostra. Tendo em vista essa problemática, diversos estudos buscam adotar metodologias para resolver esses entraves. Por isso, a cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG) com detector de espectrometria de massas pode ser uma alternativa para sanar essas questões, onde, devido à presença de duas colunas há uma melhor separação das substâncias, aumento de capacidade de pico, seletividade, sensibilidade da fase estacionária e da polaridade dos compostos presentes na amostra (CHIN; MARRIOTT, 2014). Na cromatografia CG×CG os mecanismos de separação das duas colunas são independentes ou quase independentes um do outro (ortogonais), preservando a separação. A primeira coluna apresenta dimensões 33 convencionais e a segunda é mais curta, havendo um modulador entre elas, sendo a modulação a chave do processo de CG×CG (ZINI, 2009). O sistema de modulação entre as duas colunas promove a amostragem da banda cromatográfica que elui da primeira dimensão (1D), sendo esta banda direcionada para uma rápida separação na segunda dimensão (2D). O termo “abrangente” é dado a técnica porque o efluente da primeira coluna é transferido para a segunda, sendo ambas processadas simultaneamente, com o tempo de análise equivalente ao tempo empregado para uma análise monodimensional (ZINI, 2009; YAN et al., 2017). 34 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Material vegetal Os materiais foram cedidos por cinco produtores de lúpulo e oriundos de cultivo nas regiões do Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro e São Paulo, safra de 2019, sendo ao todo 13 variedades (Saaz, Cascade, Brazyli, Mantiqueira, Comet, EKG1,Suíço, TP, Medusa, Columbus, Chinook, Hallertau Mittelfrüch e Nugget), totalizando 18 amostras, conforme demonstrado na Tabela 3. As amostras foram enviadas pelos produtores na forma de cones desidratados, de acordo com metodologia de secagem própria, e embalados em plástico transparente ou embalagens metalizadas seladas a vácuo. No laboratório as amostras foram armazenadas em freezer (-5 0C). 35 Tabela 3 - Código, variedade, local de cultivo, safra, temperatura de secagem, embalagem e época de colheita de lúpulo Código Variedade Região de Cultivo Safra °C de secagem Colheita Embalagem L01 Cascade Rio de Janeiro 2019 Não informado Março Metalizada L02 Cascade São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L03 Cascade Rio Grande do Sul 2019 35°C a 37°C Fevereiro Transparente L04 Cascade São Paulo 2019 Não informado Não informado Transparente L05 Saaz Rio de Janeiro 2019 Não informado Março Transparente L06 Brasilynsk Rio de Janeiro 2019 Não informado Março Metalizada L07 Mantiqueira São Paulo 2019 Não informado Não informado Metalizada L08 TP São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L09 Medusa São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L10 EKG1 São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L11 Saaz São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L12 Chinook São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L13 Suiço São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L14 Nugget Rio Grande do Sul 2019 35°C a 37°C Fevereiro Transparente L15 Hallertau Mittelfrüch Rio Grande do Sul 2019 35°C a 37°C Fevereiro Transparente L16 Columbus Rio Grande do Sul 2019 35°C a 37°C Fevereiro Transparente L17 Comet São Paulo 2019 35°C a 40°C Abril Transparente L18 Chinook Rio Grande do Sul 2019 35°C a 37°C Fevereiro Transparente 36 4.2 Extração e rendimento do óleo essencial A extração de óleo essencial foi realizada no Laboratório de Produtos Naturais do Centro de Recursos Genéticos Vegetais do Instituto Agronômico (IAC), Campinas- São Paulo. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação em aparato Clevenger a partir de 45 g de cones secos por período de 3 horas. Após separação das fases o óleo essencial foi armazenado em vidro de cor âmbar (5 mL), com tampa e batoque, estocado em freezer (-5ºC) até o momento da análise da composição química. O rendimento dos óleos essenciais foi expresso com base em matéria seca. A umidade do material vegetal de cada variedade foi obtida a partir da secagem de 1 g de cones em estufa de circulação forçada de ar a 40º C até peso constante. 4.3 Análise da composição química do óleo essencial por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) As análises da composição química por CG-EM foram realizadas no Laboratório de Produtos Naturais do Centro de Recursos Genéticos Vegetais do Instituto Agronômico (IAC), Campinas- São Paulo. A análise do óleo essencial foi realizada em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (GC-EM, Shimadzu, QP-5000), operando por impacto de elétrons (70 eV) e coluna capilar OV - 5 ( 30m x 0,25mm x 0,25μm), com programa de temperatura de 60º a 240º C (3º C.min-1), hélio como gás de arraste (vazão:1 mL.min- 1), modo de injeção split (1/20). O injetor foi mantido a 220º C e a interface a 240º C. As amostras de óleos essenciais (1μL) foram solubilizadas em 1 mL de acetato de etila (Tédia, grau cromatográfico) e injetado 1 μL de solução. A identificação das substâncias dos óleos essenciais foi obtida pela comparação dos seus espectros de massas com banco do sistema CG-EM (NIST 69, Wiley) (WebNIST), literatura (Adams, 2017) e índice de retenção linear (IRL; Adams, 2017). Os índices de retenção lineares foram obtidos por meio da injeção de uma série de n-alcanos (C9-C25) no CG-EM, nas mesmas condições de análise das amostras e aplicando a equação de Van den Dool e Kratz (1963). 37 4.4 Cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente acoplada a espectrometria de massas (CG×CG-EM) A análise da composição química dos óleos essenciais por CG×CG foi realizada no Laboratório de Cromatografia Gasosa do Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) em colaboração com o Prof. Dr. Leandro Wang Hantao. As análises dos óleos essenciais foram conduzidas em cromatógrafo a gás Thermo (CG TRACE 1310) equipado com detector de ionização em chamas (DIC) e um espectrômetro de massas (EM) quadrupolo ISQ (QMS - Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). A linha de transferência e a fonte de íons estavam a uma temperatura constante de 300 ° C e 220 ° C, respectivamente. O conjunto de colunas utilizadas consiste em uma coluna primaria de 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm (HP- 5 MS) e uma coluna secundária de 5 m x 0,25 mm x 0,25 μm (HP 50 Wall cooted tubular (Wcot). O hélio foi utilizado como gás de arraste com vazão de 1 mL.min-1. A modulação foi realizada por meio de modulador INSIGHT (SepSolve Analytical - Frankfurt, Alemanha), com períodos de modulação de 5s. As amostras foram injetadas no modo split (1/20) e a análise conduzida no mesmo programa de temperatura do sistema unidimensional (CG-EM). Os dados foram processados em Software GCImage™ (Versão 2.2b5 GC×GC, LLC, University of Nebrasca). A identificação dos compostos se deu através de comparação dos espectros de massas das substâncias com à biblioteca NIST 17 (versão 2.3), NIST Webook, literatura específica (ADAMS, 2017) e o índice de retenção linear (IRL; Adams, 2017).Os índices de retenção linear foram obtidos de acordo com o procedimento descrito no item 4.3. 4.5 Análise estatística Os dados de composição química dos óleos essenciais foram previamente processados utilizando o autoescalamento e submetidos a análise multivariada de componentes principais (ACP) com o auxílio do programa metaboanalyst. (XIA et al. 2015). 38 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Rendimento do Óleo essencial Os resultados de rendimento de óleo essencial dos lúpulos cultivados no Brasil podem ser observados na Figura 6. Segundo a literatura para a variedade americana Cascade o rendimento é de 0,5 a 2,5% (ALMAGUER, 2014). As amostras que apresentaram o rendimento de óleo essencial dentro do relatado na literatura foram às cultivadas no Rio de Janeiro (L01) com 2,56 % e Rio Grande do Sul (L03) com 2,05%. As amostras provenientes de São Paulo L02 (0,31%) e L04 (0,42%) apresentaram um percentual abaixo do esperado para essa variedade. Vários fatores podem ter contribuído para essa diferenciação, como exemplo, o fato de ambas serem plantas de primeiro ciclo, enquanto as anteriores são de segundo ciclo. Figura 7 - Rendimento dos óleos essenciais das amostras de lúpulo cultivados no Brasil, safra 2019 Legenda: L01: Cascade cultivado no RJ; L02: Cascade cultivado em SP; L03: Cascade cultivado no Rio Grande do Sul; L04: Cascade cultivado em SP 2; L05: Saaz cultivado no RJ; L06: Brazylinsk cultivado no RJ; L07: Mantiqueira cultivado em SP; L08: TP cultivado em São Paulo; L09: Medusa cultivado em São Paulo; L10: EKG1 cultivado em SP; L11: Saaz cultivado em SP;L12: Chinook cultivado em SP; L13: Suiço cultivado em SP; L14: Nugget cultivado no RS: L15; Harllertauer Mittelfrueh cultivado em RS: L16; Columbus cultivado no RS- L17; Comet cultivado em SP- L18; Chinook cultivado no RS. 2,56% 0,31% 2,05% 0,42% 0,36% 0,65% 0,34% 0,57% 0,80% 0,46% 1,07% 0,13% 0,23% 1,89% 1,25% 1,94% 0,24% 2,27% 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 R e n d im e n to d o ó le o e s s e n c ia l (% ) Amostras de lúpulo 39 Todas as variedades cultivadas no Rio Grande do Sul (Cascade, Hallertau Mittelfrüch, Columbus, Nuget, Chinook) se destacaram com rendimento de óleo essencial acima de 1%. Condições edafoclimáticas, fotoperíodo, irrigação, manejo, colheita e pós-colheita bem como, fator genético de cada variedade podem ter contribuído para essa variação. Cada produtor utiliza métodos de manejo distintos, além do período de colheita, no caso, o mês de fevereiro para as plantas oriundas do Rio Grande do Sul e abril para plantas provenientes do estado de São Paulo. LAFONTAINE et al. (2019), analisando a influência da data de colheita por três anos no rendimento, composição química do óleo essencial e α-ácidos e β-ácidos do lúpulo, demonstrou que há um acréscimo de até de mais de 1% no rendimento do óleo essencial em função de época de colheita mais tardia, sem afetar significativamente os percentuais de humulonas produzidas nos cones de lúpulo. Segundo o guia de colheita do grupo americano Barth Haas (2019) sobre lúpulo lançado anualmente, o valor de referência de rendimento de óleo essencial para a variedade Harllertauer Mittelfrueh é de 0,7% a 1,3%, Saaz de 0,4% a 1% e Comet de 1,4 % a 3,31%. Nas amostras cultivadas em solo brasileiro, a variedade Harllertauer Mittelfrueh (L15) cultivada no Rio Grande do Sul obteve percentual condizente com a literatura: 1,25%. Na amostra L11 (Saaz, São Paulo) o rendimento foi de 1,07% valor semelhante a literatura, diferentemente da Saaz cultivada no Rio de Janeiro (L05) com percentual de 0,36%. As amostras L18 (Chinook: 2,27%) e L14 (Nugget: 1,89%) provenientes do Rio Grande do Sul obtiveram resultados semelhantes a literatura da Barth report 2018. 5.2 Caracterização da composição química dos óleos essenciais por cromatografia em fase gasosa unidimensional (CG) A análise por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) possibilitou a identificação, no total, de 66 substâncias nos óleos essenciais das 18 amostras de lúpulo. Na Figura 7 é possível visualizar o perfil dos 40 componentes majoritários comumente encontrados no lúpulo das diferentes variedades avaliadas. Figura 8 - Cromatograma de íons totais (TIC) do óleo essencial de lúpulo , variedade Cascade cultivado no Rio Grande do Sul. Fonte: Da autora As amostras apresentaram as classes de substâncias comumente encontradas para as variedades de lúpulo descritas na literatura: éster; cetona; aldeído; hidrocarbonetos monoterpênicos, monoterpenos oxigenados; hidrocarbonetos sesquiterpênicos e sesquiterpenos oxigenados. Como esperado para o óleo essencial de lúpulo a classe mais abundante em número de compostos foi a dos hidrocarbonetos sesquiterpênicos (TABELA 4), sendo identificadas vinte e sete substâncias. Na Figura 8 é possível visualizar a distribuição das classes de substâncias identificadas para cada amostra e variedade avaliada. 41 Figura 9 - Classes de substâncias identificadas nos óleos essenciais nas 18 amostras das 13 variedades de lúpulo avaliadas Legenda: L01: Cascade cultivado no RJ; L02: Cascade cultivado em SP; L03: Cascade cultivado no Rio Grande do Sul; L04: Cascade cultivado em SP 2; L05: Saaz cultivado no RJ; L06: Brazylinsk cultivado no RJ; L07: Mantiqueira cultivado em SP; L08: TP cultivado em São Paulo; L09: Medusa cultivado em São Paulo; L10: EKG1 cultivado em SP; L11: Saaz cultivado em SP;L12: Chinook cultivado em SP; L13: Suiço cultivado em SP; L14: Nugget cultivado no RS: L15; Harllertauer Mittelfrueh cultivado em RS: L16; Columbus cultivado no RS- L17; Comet cultivado em SP; L18; Chinook cultivado no RS. As variedades que apresentaram os maiores percentuais de hidrocarbonetos sesquiterpênicos foram L04 (Cascade/SP: 64,77%), L09 (Medusa/SP: 64,50 %) , L13 (Suiço/SP: 43,90%), L05 (Saaz/RJ:58,53%), L16 (Columbus/RS:57%) , L12 (Chinook/SP:58,60%)e L07 (Mantiqueira/SP: 56,85%). As amostras L11 (Saaz/SP: 58,60%) e L01 (Cascade/RJ:39,79%) obtiveram os maiores percentuais de 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 P ro p o rç ã o R e la ti v a ( % ) Amostras de lúpulo Ésteres Cetonas Aldeídos Àlcoois Hidrocarboneto monoterpênico Hidrocarboneto sesquiterpênico Epóxidos 42 hidrocarbonetos monoterpênicos. As amostras L08 (TP/SP) e L06 (Brazylinsk/RJ), foram as únicas que apresentaram époxido de humuleno II em sua composição química. Os ésteres e cetonas apresentaram menores proporções relativas nos óleos essenciais de lúpulo (Figura 9). Embora estejam em menores quantidades, os ésteres apresentam aromas que proporcionam à cerveja um agradável aroma frutado e picante (ASBC, 2018). Os ésteres foram mais abudantes nas variedades L08 (TP: 9,26%), L06 (Brazylisnk: 9,00%) e L11(Saaz/SP: 8,90%) cultivadas em São Paulo. As cetonas identificadas nos óleos essenciais foram: 2-nonanona, 2-decanona, 2-undecanona, 2-dodecanona, 2-tridecanona, 2-pentadecanona, (6Z)-pentadecen-2- ona, cuja estrutura química pode ser observada na Figura 10. Figura 10. Estrutura química das cetonas identificadas nas variedades de lúpulo avaliadas Fonte: Nist Webbook, (2019) Dentre as cetonas a 2-undecanona foi a única detectada em todas as amostras de lúpulo avaliadas, com maior proporção relativa (10,45%) na variedade Mantiqueira (L07). Segundo Eyres e Dufour (2009), os níveis de aldeídos são geralmente baixos em óleo essencial de lúpulo e são perdidos principalmente durante a secagem em estufa. 43 Os aldeídos identificados nas amostras são o n-nonanal, detectado em todas as amostras e geranial (classificado dentro da classe de monoterpeno oxigenado) detectado apenas na amostra Comet de São Paulo (L17). Na Tabela 4 pode ser visualizada a composição química dos óleos essenciais, sendo o mirceno o constituinte majoritário em 15 amostras, seguido por α-humuleno (variedade Medusa) e β-farneseno (Cascade/SP, Saaz/RJ). O mirceno é uma substância comum no lúpulo sendo o responsável pelo odor característico herbal do lúpulo (BOCQUET et al., 2018). Os maiores percentuais de mirceno foram encontrados nas variedades L11 (55%), L10 (41%), L2 (41,6 %) e L15 (38%) 44 Tabela 4 - Composição química (%) dos óleos essenciais de 18 amostras de 13 variedades de lúpulo cultivados no Brasil, safra 2019 Substância IRLC L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* Ésteres 5,72 0,51 6,6 0,43 3,56 9,00 1,59 9,26 5,10 0,52 8,90 0,60 2,10 0,90 4,20 0,90 3,66 3,30 propionato de isoamila 966 - - - - - 0,49 - 0,55 0,40 - - - - - - - - - - isoheptonoato de metila 985 - - - - - 0,36 - - - - - - - - - - - - - isobutirato de isoamila 1007 - - - - - 0,43 0,55 0,54 0,50 - 0,50 - - - - - - - - isobutanoato de isoamila 1013 1,03 - - - - 1,06 - 1,24 1,10 - 0,90 - - 0,30 - - - - - heptanoato de metila 1021 - 0,51 1,00 - 0,87 0,69 0,53 0,61 0,30 - 0,90 0,30 0,70 0,3 1,20 0,40 0,83 0,70 - metil-6-metil- heptanoato 1084 - - 0,50 0,43 0,42 0,53 - 0,68 - - - - - - - - 0,42 - - pentanoato de pentila 1106 - - - - - - - - 0,70 - - - - - - - - - - octanoato de metila 1122 - - 1,60 - 0,45 0,55 - 0,60 - - 0,90 - - - 1,20 - - 1,00 - nonanoato de metila 1223 - - 0,30 - 0,41 0,41 - - - - 0,60 - - - 0,70 - 0,52 - - dec-4-enoato de metila 1306 1,34 - 1,8 - 1,11 1,40 - 2,89 1,40 0,52 2,40 - 1,40 - 1,10 0,50 1,35 - - geranato de metila 1320 - - 1,40 - 0,30 0,59 0,51 0,79 0,70 - 1,20 0,30 - 0,30 - - 0,54 1,60 - isobutirato de linalila 1380 2,41 - - - - 1,72 - 1,36 - - 1,50 - - - - - - - - 45 Substância IRLC L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* isovalerato de linalila 1471 0,94 - - - - 0,77 - - - - - - - - - - - - - Cetonas 1,30 3,16 10,0 4,60 7,17 2,94 10,45 2,15 3,30 2,40 1,20 4,10 10,3 2,90 5,90 5,50 4,99 3,30 2-nonanona 1089 - 0,49 1,30 0,8 0,61 0,42 0,75 - - 0,50 0,50 0,40 1,50 0,40 1,00 0,70 0,89 0,60 Verde 2-decanona 1190 - 0,95 0,6 1,1 0,64 0,39 1,04 - - 1,30 - - - 0,70 0,60 1,30 0,83 - - 2-undecanona 1290 1,30 1,72 6,40 1,90 2,75 1,54 5,96 1,40 1,20 0,60 0,70 1,90 5,70 1,80 4,30 3, 0 2,92 2,20 Laranja, fresco, verde 2-dodecanona 1391 - - 0,40 0,50 0,57 - 1, 00 - - - - 1,30 1,10 - - 0,50 0,35 - - 2-tridecanona 1492 - - - - - - - - 2,10 - - - - - - - - - - 2-pentadecanona 1694 - - - - 0,40 - - - - - - - 1,00 - - - - - - (6Z)-pentadecen-2- ona 1667 - - 1,30 0,30 2,20 0,59 1,70 0,75 - - - 0,50 1,00 - - - - 0,5 - Aldeídos 0,44 0,70 0,80 1,19 0,55 0,70 0,73 0,6 0,7 0,00 0,6 2,1 0,8 1,10 1,20 0,65 0,50 n-nonanal 1101 - 0,44 0,7 0,8 1,19 0,55 0,7 0,73 0,6 0,7 - 0,60 2,10 0,80 1,10 1,2 0,4 0,50 - geranial 1267 - - - - - - - - - - - - - - - - 0,25 - Limão, menta Álcoois 1,10 0,59 1,30 0,40 1,06 1,98 0, 00 2,61 0,40 0,50 0,40 0,60 8,70 0,80 1,30 0,90 0,50 linalol 1095 1,10 0,59 1,30 0,40 1,06 1,07 - 0,67 0,4 0,50 - 0,60 1, 0 0,80 1,30 0,90 - 0,50 Floral Substância IRLc L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* 2-undecanol 1299 - - - - - - - - - - 0,40 - - - - - - - - 5-dodecen-1-ol 1566 - - - - - ;- - 0,73 - - - - - - - - - - - 46 Substância IRLC L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* acetato de (Z)-3- Octen-1-ol 1567 - - - - - 0,53 - - - - - - 0,70 - - - - - - 1-epi-cubenol 1627 - - - - - - - 0,34 - - - - - - - - - - - γ- eudesmol 1628 - - - - - - - - - - - - 1,00 - - - - - - β-eudesmol 1646 - - - - - - - - - - - - 2,00 - - - - - Madeira ,verde α-muurolol 1636 - - - - - - - 0,50 - - - - - - - - - - - α-eudesmol 1649 - - - - - 0,38 - - - - - - 4,00 - - - - - - (2Z,6E)-Farnesol 1721 - - - - - - - 0,37 - - - - - - - - - - Hidrocarboneto monoterpênico 39,79 43,09 34,80 26,10 17,85 35,32 20,54 34,18 20,20 42,20 58,60 28,10 13,00 36,60 41,30 28,70 40,04 33,20 β-pineno 974 2, 00 0,94 1,20 0,70 0,76 1,50 0,81 1,20 0,70 0,70 2, 0 0,60 - 1, 0 1,10 1,10 0,65 1,40 Resina, pinho mirceno 989 35,68 41,60 33,00 25, 00 15,59 32,4 19,40 32,10 19,00 41,00 55,00 27,00 13,00 35,00 38,00 27,00 34,40 30,00 Resina, pinho,ervas limoneno 1026 - - - - - - - - 0,50 - - - - - - - - - Limão, laranja β-felandreno 1027 1,18 0,55 0,60 0,40 0,44 1,01 0,33 0,88 - 0,50 1,60 0,50 - 0,60 0,70 0,60 0,44 1,00 Hortelã (E)-β-ocimeno 1045 0,93 - - - 1,06 0,41 - - - - - - - - 1,50 - 4,55 0,80 Doce, herbal Hidrocarboneto sesquiterpênico 34,77 49,55 40,5 64,77 58,53 42,56 56,85 41,63 64,50 49,8 24,00 58,6 43,9 55,00 41,6 57,00 41,34 46,30 α-copaeno 1373 - - - - - - - - 0,50 - - - - - - - - - Madeira, especiarias α-gurjuneno 1406 - - - - - - 0,39 - - - - - - - - - - - Madeira, balsâmico 47 Substância IRLC L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* (E)-cariofileno 1417 7,05 3,27 13 7,1 3,4 5,01 5,09 7,91 16 6,6 3,9 7,3 4,5 2,8 1,4 3,8 4,99 19 Picante, lenhoso, cravo β-copaeno 1427 - - - - - - - - 0,40 - 0,40 - - - - - - - - α-bergamoteno 1433 - 0,80 - 1,20 2,20 0,66 0,72 - 0,60 1,00 - 1,10 - 1,20 1,40 1,10 0,71 - Madeira, chá α-guaieno 1435 - - 0,80 - - - - - - - - - - - - - - - Madeira, balsâmico aromadendreno 1436 - - - - - - 2,52 - - - - - - - - - - - Madeira α-humuleno 1451 13,8 - 0,40 - 0,60 8,32 0,33 15,50 29 3,40 7,10 0,30 0,90 - - - - 0,6 Amadeirado β-farneseno 1454 13.97 23,5 3,60 27,00 21,00 14,00 18,20 8,62 9,30 19,00 3,00 24,00 12,00 22,00 24,00 24,00 12,40 5,20 Madeira, citrus, doce 4,5-di-epi- aristolocheno 1466 - - 0,40 0,50 0,40 - - - - - - 0,30 - 0,50 - - - - - trans-cadina- 1(6),4-dieno 1470 - - - - - - - - 0,4 - - - - - - - - - - Substância IRLc L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* γ-gurjuneno 1474 0,99 1,23 1,40 1,90 2,00 - 1,80 - - - 1,40 1,50 - 1,50 0,70 - - 1,40 - γ-muroleno 1475 - 0,44 - - 0,30 0,53 - 0,61 - 1,20 - - - 0,50 - - - 0,40 Herbal, madeira, especiarias α-amorfeno 1473 - - - - - - - - 0,4 - - - - - - - - - - ledeno 1492 4,48 10,9 11,00 14,00 12,00 4,94 13,9 3,57 2,10 11,00 3,20 12,00 11,00 15,00 6,90 15,00 13,42 10,00 - β-selineno 1482 2,99 9,41 7,60 12,00 9,60 3,30 9,26 1,70 0,50 7,20 2,30 10,00 7,3 11 5,20 12,00 9,82 8,70 Ervas 48 Substância IRLC L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* ledeno 1492 4,48 10,9 11,00 14,00 12,00 4,94 13,9 3,57 2,10 11,00 3,20 12,00 11,00 15 6,90 15,00 13,42 10,00 - (E,E)-α-farneseno 1505 1,80 - - 0,70 1,70 - 0,38 0,74 0,70 0,40 - 0,70 - 0,50 0,90 0,70 - - Madeira, doce β-bisaboleno 1506 - - - - - 0,86 - - - - - - - - - - - - Balsâmico α-bisaboleno 1511 - - - - - 1,54 - 1,69 - - - - - - - - - - - γ-cadineno 1510 - - - - 0,50 - - - 1,70 - - 0,70 - - - - - 0,50 Madeira (Z)-γ-bisaboleno 1514 - - - - 0,53 - - - - - - - - - - - - - - 7-epi-α-selineno 1514 - - - 0,37 - - - - - - 0,30 - - - 0,40 - - - δ-cadineno 1520 1,19 - 0,40 - 0,80 0,85 0,55 1,29 2,60 - 1,40 0,40 0,60 - - - - 0,50 Tomilho, madeira α-cadineno 1534 - - - - 0,40 - - - 0,30 - - - - - - - - - - selina-3,7(11)- dieno 1538 0,94 - 1,30 - 2,10 1,10 1,97 - - - - - 5,00 - 1,10 - - - - germacreno B 1553 1,53 - 0,60 - 0,70 1,45 1,74 - - - 0,50 - 2,60 - - - - - Madeira, especiarias Epóxidos 0,35 0,48 epóxido de humuleno II 1605 - - - - - 0,35 - 0,48 - - - - - - - - - - - IRLc= Índice de retenção linear calculado; (*) odor da substância descrito na literatura- http://www.flavornet.org/flavornet.html . Legenda: L01: Cascade cultivado no RJ; L02: Cascade cultivado em SP; L03: Cascade cultivado no Rio Grande do Sul; L04: Cascade cultivado em SP 2; L05: Saaz cultivado no RJ; L06: Brazylinsk cultivado o no RJ; L07: Mantiqueira cultivado o em SP; L08: TP cultivado em São Paulo; L09: Medusa cultivado em São Paulo; L10: EKG1 cultivado em SP; L11: Saaz cultivado em SP;L12: Chinook cultivado em SP; L13: Suiço cultivado em SP; L14: Nugget cultivado no RS: L15; Harllertauer Mittelfrueh cultivado em RS: L16; Columbus cultivado no RS- L17; Comet cultivado em SP- L18; Chinook cultivado no RS 49 Os sesquiterpenos (E)-cariofileno, α-humuleno e β-farneseno são considerados notas importantes nos perfis de lúpulo, pois a presença em maior proporção relativa desses três compostos é tipicamente associada ao lúpulo de aroma nobre (EYRES, 2009). Segundo a literatura, o α-humuleno e (E)-cariofileno possuem odores respectivamente amadeirado, picante e lenhoso (FlavorNET, 2019). Na Figura 8 é possível visualizar a proporção relativa dessas substâncias nas variedades estudadas. Figura 11 - Proporção relativa (%) do mirceno, α-humuleno, (E)-cariofileno e β- farneseno nas amostras de lúpulo Legenda: L01: Cascade cultivado no RJ; L02: Cascade cultivado em SP; L03: Cascade cultivado no Rio Grande do Sul; L04: Cascade cultivado em SP 2; L05: Saaz cultivado no RJ; L06: Brazylinsk cultivado no RJ; L07: Mantiqueira cultivado em SP; L08: TP cultivado em São Paulo; L09: Medusa cultivado em São Paulo; L10: EKG1 cultivado em SP; L11: Saaz cultivado em SP;L12: Chinook cultivado em SP; L13: Suiço cultivado em SP; L14: Nugget cultivado no RS: L15; Harllertauer Mittelfrueh cultivado em RS: L16; Columbus cultivado no RS- L17; Comet cultivado em SP; L18; Chinook cultivado no RS. Diferindo da literatura, onde o α-humuleno é citado como comumente encontrada nos cones de lúpulo (ALMAGUER et al., 2014), dentre as 18 amostras de lúpulo investigadas esta substância foi identificada em 12, com destaque nas amostras L01(Cascade/RJ: 13,80%), L06 (Brasilynsk/RJ: 8,32%), L08 (TP/SP: 15,50%), L09 (Medusa/SP: 29,00%) e L11 (Saaz/SP: 7,10%) com alta abundância. 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Mirceno (E)-cariofileno α-humuleno β-farneseno 50 O β-farneseno, que possui odores descritos como amadeirado, cítrico e doce, e (E)-cariofileno foram identificados em todas as amostras avaliadas. Os maiores percentuais de β-farneseno foram encontrados nas amostras L12, L15, L16, e (E)- cariofileno nas amostras L09, L08 e L03. Destaque também para os sesquiterpenos ledeno e β-selineno detectados em todas as amostras, em alguns casos com percentuais acima de 10%, como observado nas amostras L04, L12, L14 e L16. O geraniol é um álcool importante e possui propriedades sensoriais semelhantes ao linalol, porém encontrado em menor abundância (KROFTA et al., 2018 ). Nas variedades estudadas cultivadas no Brasil não foi detectado a presença de geraniol. Por apresentarem o oxigênio na sua estrutura química o geraniol e linalol são mais polares que os hidrocarbonetos, solubilizando no mosto da cerveja e conferindo caráter floral a mesma (ABERL; COELHAN, 2012; KROFTA et al., 2017; DURELLO et al., 2019). O linalol não foi detectado em apenas em três amostras: L07 (Mantiqueira/SP, L11 (Saaz/SP), L17 (Comet/SP). Dentre as variedades que se destacaram com percentuais acima de 1% estão principalmente as cultivadas no Rio de Janeiro L01 (Cascade), L05 (Saaz) e L06 (Brazilysnk), e no Rio Grande do Sul L3 (Cascade) e L14 (Nugget). O óleos essenciais das amostras das variedades L01 (Cascade/RJ), L06 (Brazilysnk/RJ), L08 (TP/SP) e L11 (Saaz/SP) apresentarem em sua composição química isobutanoato de linalila com os percentuais de 2,41%, 1,72%, 1,36% e 1,50%, respectivamente. As amostras L01 e L06 apresentarem isovalerato de linalila. O epóxido de humuleno I foi detectado apenas nos óleos essenciais das variedades, L06 (Brazilysnk), e L08 (TP/SP) . Os epóxidos de humuleno I a III e epóxido de cariofileno são tidos como substâncias que influenciam na fração aromática do lúpulo, entretanto, Opstele et al. (2013), em um estudo envolvendo cromatografia/olfatometria demonstrou que esses compostos não apresentaram atividade sensorial, embora estejam presentes na essência do lúpulo picante. 5.3 Análise de componentes principais dos óleos essenciais A análise de componentes principais aplicada a composição química do óleo essencial explicou 61% da variação dos dados, com as duas primeiras componentes 51 principais. A primeira componente principal (CP 1) englobou 34,20% da variação e a CP 2 26,8% da variância total dos dados (FIGURA 12). Figura 12 - Análise de Componentes principais (ACP) aplicada a composição química das 18 amostras de 13 variedades de lúpulo Legenda: L01: Cascade cultivado no RJ; L02: Cascade cultivado em SP; L03: Cascade cultivado no Rio Grande do Sul; L04: Cascade cultivado em SP 2; L05: Saaz cultivado no RJ; L06: Brazylinsk cultivado no RJ; L07: Mantiqueira cultivado em SP; L08: TP cultivado em São Paulo; L09: Medusa cultivado em São Paulo; L10: EKG1 produzido em SP; L11: Saaz cultivado em SP;L12: Chinook cultivado em SP; L13: Suiço cultivado em SP; L14: Nugget cultivado no RS: L15; Harllertauer Mittelfrueh cultivado em RS: L16; Columbus cultivado no RS- L17; Comet cultivado em SP- L18; Chinook cultivado no RS. Observa-se divergência do perfil químico entre as variedades, não sendo observado agrupamentos, mesmo entre as mesmas variedades. A variedade L11 se distancia das demais em razão da maior contribuição do mirceno. Nesta amostra a proporção relativa desta substância foi mais abundante, correspondendo a 55,00%. Para a variedade Medusa (L09) o α-humuleno, substância mais abundante nesta variedade (29,0%), contribuiu para a separação desta variedade das demais, o mesmo sendo observado para a variedade Cascade cultivada no Rio Grande do Sul (L03) onde 2-undecanona foi a mais abundante no óleo essencial (6,40%). 52 É importante destacar que o não agrupamento entre as variedades pode ser devido aos fatores genéticos, condições edafoclimáticas das regiões de cultivo, diferenças de manejo, colheita e pós-colheita das plantas. Estudo de Matsui et al. (2016), demostrou que colheitas tardias impactou positivamente aumentando a produção dos óleos essenciais e a quantidade dos monoterpenos linalol, geraniol e mirceno. 5.4 Caracterização da composição química dos óleos essenciais por cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG) O emprego da técnica de cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente acoplada a espectrometria de massas na caracterização dos óleos essenciais permitiu a identificação adicional de 14 substâncias nos óleos essenciais quando comparada a CG-EM. Para Wong, Permutter e Marriot (2017), esse fato decorre da melhor relação sinal/ruído dos sistemas bidimensionais acoplados à espectrometria de massas, que possibilitam, além de ganhos em separação de picos, a obtenção de espectros de melhor qualidade, mesmo para substâncias presentes baixos percentuais. As 14 substâncias identificadas estão demonstradas na TABELA 5 e os cromatogramas das análises por CG×CG no apêndice A. 53 Tabela 5 - Substâncias identificadas, exclusivamente, por cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG) de 16 amostras de 13 variedades de lúpulo, cultivadas no Brasil, safra 2019. Substância IRLc. L01 L03 L04 L06 L07 L08 L09 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 Descritores do odor* isobutirato de isobutila 912 0,13 - - 0,17 - 0,10 - - - - - 0,07 - - - - - α-pineno 939 0,19 0,17 0,26 0,19 - 0,13 0,22 0,23 0,25 0,07 - 0,11 0,15 0,16 0,13 0,19 Pinho (Z)-β-ocimeno 1035 0,60 - 0,35 0,63 - 0,60 0,52 0,43 0,66 0,35 0,20 0,36 0,31 - 0,42 - - perileno 1104 - - - - - - - - - 0,06 0,48 0,09 0,13 - 0,02 - Citrus, herbal e floral dec-9-en-1-ol 1257 - - 0,28 - - 0,11 - 0,29 - 0,15 0,5 0,11 0,69 - - - - undecanal 1308 0,02 - - 0,23 - 0,44 0,51 0,23 0,47 0,08 0,27 0,09 0,2 - 0,29 - - undec-(9E)-en-1-al 1313 - - - 0,24 - 0,31 0,12 - - 0,04 0,28 - 0,48 - 0,33 - - α-cubebeno 1384 - - - - 0,06 - - - - - - - - - - - - isoledeno 1387 0,29 - 0,14 0,25 0,14 0,19 0,44 0,20 0,22 0,13 0,42 0,07 - - - - - β-ylangeno 1443 - - - - 0,12 - - - - - - - - - - - - γ-himachaleno 1468 - - - - 0,94 - - - - - - - - - - - - aristolocheno 1488 - - - - 2,06 - - - - - - - - - - - - α-cadineno 1552 - - 0,01 - - - 0,01 - 0,25 - 7,13 - - - - - - óxido de cariofileno 1600 0,10 0,17 0,29 0,65 0,08 0,16 0,43 0,28 1,83 - - - - - Herbal doce, especiarias Legenda: IRLc= Índice de retenção linear calculado; (-): não detectado; (*) odor da substância descrito na literatura- http://www.flavornet.org/flavornet.html ; L01: Cascade cultivado no RJ; L03: Cascade cultivado no Rio Grande do Sul; L04: Cascade produzido em SP 2; L06: Brazylinsk cultivado no RJ; L07: Mantiqueira cultivado em SP; L08: TP cultivado em São Paulo; L09: Medusa cultivado em São Paulo; L10: EKG1 cultivado em SP; L11: Saaz cultivado em SP;L12: Chinook cultivado em SP; L13: Suiço cultivado em SP; L14: Nugget cultivado no RS: L15; Harllertauer Mittelfrueh cultivado em RS: L16; Columbus cultivado no RS- L17; Comet cultivado em SP- L18; Chinook cultivado no RS. 54 As substâncias identificadas estão em baixa proporção relativa nos óleos essenciais e distribuídas nas classes dos hidrocarbonetos sesquiterpênicos (isoledeno, α-cubebeno, γ-himachaleno, β-ylangeno, aristolocheno, α-cadineno e óxido de cariofileno), hidrocarbonetos monoterpênicos (α-pineno, perileno, (Z)-β- ocimeno), éster (isobutirato de isobutila), álcool (dec-9-en-1-ol) e aldeído (undecanal e undec-(9E)-en-1-al). Não foram identificadas substâncias adicionais nas variedades Cascade (L02) e Saaz (L05) cultivadas em São Paulo e Rio de Janeiro, respectivamente. Para as variedades Cascade (L03), Columbus (L16) e Chinook (L18) cultivadas no Rio Grande do Sul foi identificado adicionalmente apenas o α-pineno. O emprego da técnica de cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente resultou em ganhos de resolução na separação das substâncias dos óleos essenciais de lúpulo, permitindo a identificação de substâncias coeluidas ou em baixos percentuais (<1%) . 55 CONCLUSÃO Os óleos essenciais das 13 variedades de lúpulo obtiveram rendimentos distintos, com maior rendimento para Cascade cultivado Rio de Janeiro (L01: 2,56%) e menor Chinook cultivado em São Paulo (L12: 0,13%). Das 18 amostras avaliadas o mirceno foi o constituinte majoritário nos óleos essenciais nas variedades Saaz/SP (L11), EKG1/SP (L10), Cascade/SP (L02), Cascade/RS (L03), Cascade/RJ (L01), Hallertauer Mittelfrüh/RS (l15), Comet/SP (L17), Chinook/RS (L18), Chinook/SP (L12), Nugget/RS (L14), TP/SP (L08), Brazylinsk/RJ (L06) e Mantiqueira/SP (L07) , Suiço/SP (L13) e Columbus/RS (L16), Para o óleo essencial da variedade Medusa/SP o constituinte majoritário é o α- humuleno, variedade Saaz/RJ (L05) e a amostra Cascade/SP (L04) o β-farneseno. Houve variação do perfil químico dos óleos essenciais entre as variedades de lúpulo avaliadas e dentro da mesma variedade cultivada em diferentes regiões do Brasil. Há a necessidade da continuidade do estudo da composição química dos óleos essenciais a fim de caracterizar o perfil químico em diferentes épocas de colheita. O uso da cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente (CG×CG) resultou em ganho na separação das substâncias na análise dos óleos essenciais de lúpulo quando comparada com o unidimensional (CG). A falta de padronização no processamento pós-colheita (processo de secagem, tipo de embalagem) do lúpulo cultivado no Brasil pode ter contribuído para a variação das amostras estudadas. Por isso, é importante pesquisas visando a padronização dessas etapas de processamento voltada a realidade brasileira para garantir a uniformidade do produto. 56 57 REFERÊNCIAS ABERL, A, COELHAN, M. Determination of Volatile Compounds in Different Hop Varieties by Headspace-Trap GC/MS In Comparison with Conventional Hop Essential Oil Analysis. Journal of agricultural and food chemistry. 2012 Mar 7;60(11):2785-92. Adams, R.P. Identification of Essential Oil Components by Gas C romatography/Mass Spectroscopy, 4.1rd ed.;Allured Publ. Corp: Carol Stream, IL, USA, 2017. ALMAGUER, C. et al. 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