AMAURI ALVES DE SOUZA JÚNIOR Aplicação de ionização por electrospray e química computacional no estudo de benzopiranos de espécies de Piperaceae Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Química. Orientadora: Profa Dra Maysa Furlan Coorientador: Prof Dr Ian Castro-Gamboa Araraquara 2018 Souza Júnior, Amauri Alves de. Aplicação de ionização por electrospray e química computacional no estudo de benzopiranos de espécies de Piperaceae. 2018. 143 f. Tese (Doutorado em Química) – Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2018. Página 10 e linha 27 (AGRADECIMENTOS) Onde se lê Agradeço o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento da bolsa de doutoramento e disponibilidade de reserva técnica, os quais foram imperativos para a realização do projeto de pequisa. Também aproveito para agradecer o apoio da FAPESP pelo financiamento da bolsa de estágio de doutoramento no exterior. Leia-se Agradeço o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento da bolsa de doutoramento e disponibilidade de reserva técnica, processo no 2014/22239-8 (FAPESP). Também aproveito para agradecer o apoio da FAPESP pelo financiamento da bolsa de estágio de doutorado no exterior, processo no 2017/15014-8 (FAPESP). Os recursos financeiros disponibilizados pela FAPESP e CAPES foram imperativos para a realização do projeto de pesquisa. SÚMULA CURRICULAR DADOS PESSOAIS Nome: Amauri Alves de Souza Júnior Filiação: Amauri Alves de Souza e Lúcia Dias Souza Nascimento: 17/01/1989, Ipameri – GO, Brasil e-mail: amaurialvejunior@gmail.com Citação bibliográficas: Souza, A. A.; Souza Júnior, A. A. FORMAÇÃO ACADÊMICA Doutorado em Química Estudos de benzopiranos de Piper aduncum e Peperomia obtusifolia (Piperaceae) por ESI-MS/MS combinados a termoquímica computacional com foco em abordagens metabolômicas Equipe Doutorando: Amauri Alves de Souza Júnior1 Orientadora: Profa Dra Maysa Furlan1 Coorientador: Prof Dr Ian Castro-Gamboa1 Período: 2014-2018 Agências de fomento: CAPES e FAPESP (2014/22239-8) 1Universidade Estadual Paulista - UNESP, Instituto de Química, Rua Professor Francisco Degni, 55, Quitandinha, 14800-060, Araraquara - SP, Brasil Estágio de doutoramento: University of California – UCDAVIS, DAVIS – CA, USA Supervisor: Prof. Dr. Dean J. Tantillo. Período: 01 de setembro a 31 de dezembro de 2017 Agência de fomento: FAPESP/BEPE (Processo: 2017/15014-8) Mestrado em Química Investigação da origem biossintética de cromenos e cromanos em Piper aduncum e Peperomia obtusifolia (Piperaceae) Equipe Doutorando: Amauri Alves de Souza Júnior1 Orientadora: Profa Dra Maysa Furlan1 Período: 2011-2014 Agências de fomento: CAPES e FAPESP (2011/16815-8) 1Universidade Estadual Paulista - UNESP, Instituto de Química, Rua Professor Francisco Degni, 55, Quitandinha, 14800-060, Araraquara - SP, Brasil Graduação em Química Instituição: Universidade Federal de Goiás – UFG, Departamento de Química Período: 2007-2011 Iniciação Científica Avaliação da fibra de coco (mesocarpo do fruto de Cocos nucifera L.) como adsorvente alternativo para a remoção de corantes orgânicos de meio aquoso. Equipe Aluno: Amauri Alves de Souza Júnior2 Orientadora: Profa Dra Silvia de Sousa Freitas2 Período: 2009-2011 Agências de fomento: CNPq 2Univervsidade Federal de Goiás – UFG, Departamento de Químia, Avenida Dro. Lamartine Pinto de Avelar, 1120, Setor Universitário, 75704-020, Catalão - GO, Brasil PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos 1. FINATO, A. C.; FRAGA-SILVA, T. F.; PRATI, A. U. C.; SOUZA JUNIOR, A. A.; MAZZEU, B. F; FELIPPE, L. G.; PINTO, R. A.; GOLIM, M. A.; ARRUDA, M. S. P.; FURLAN, M.; VENTURINI, J. Crude leaf extracts of Piperaceae species downmodulate inflammatory responses by human monocytes. Plos One, v. 13, p. e0198682, 2018. 2. POLITI, F. A. S.; SOUZA JUNIOR, A. A.; FANTATTO, R. R.; PIETRO, R. C. L. R.; BARIONI, W.; RABELO, M. D.; BIZZO, H. R.; DE SOUZA CHAGAS, A. C.; FURLAN, M. Chemical composition and in vitro anthelmintic activity of extracts of Tagetes patula against a multidrug-resistant isolate of Haemonchus contortus. Chemistry & Biodiversity, v.15, p. e1700507, 2018. 3. TAVARES, W. S.; GRAZZIOTTI, G. H.; SOUZA JÚNIOR, A. A.; SOUSA, S. F.; CONSOLARO, H. N.; RIBEIRO, P. E. A.; ZANUNCIO, J. C. Screening of Extracts of Leaves and Stems of Psychotria spp. (Rubiaceae) against Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) and Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) for Maize Protection. Journal of Food Protection, v. 76, p. 1892-1901, 2013. Artigo científico (em análise) 1. SOUZA, A. A.; VESSECCHI, R.; CASTRO-GAMBOA, I.; FURLAN, M. Combined use of electrospray ionization tandem mass spectrometry and computational chemistry to study protonated 2H-chromenes from Piper aduncum. Journal of Organic Chemistry, 2018. Artigo científico (em preparo) 1. SOUZA, A. A.; VESSECCHI, R.; SAUNDERS, C.; CASTRO-GAMBOA, I.; TANTILLO, D. J.; FURLAN, M. Computational chemistry approach to ESI- MS/MS data analysis: an examination of protonated chromanes, 2018. Participação em evento científico – Nacional 1. 40ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 7 a 14 de julho de 2017. São Paulo – SP, Brasil. 2. 1a Escola de Modelagem Molecular da Unesp Araraquara. Realizado no Instituto de Química, Araraquara – SP, Brasil. Período: 09 e 13 de janeiro de 2017. 3. XXXIV Escola de Verão em Química. Realizado na Universidade Federal de São Carlos, São Carlos – SP, Brasil. Período: 17 a 21 de fevereiro de 2014. Participação em evento científico – Internacional 1. The American Society of Pharmacognosy Annual Meeting. July 29 - August 2, 2017. Portland – OR, USA. 2. 46th World Chemistry Congress and IUPAC 49th General Assembly. July 7th - 14th, 2017. São Paulo - SP, Brazil. 3. 9th Joint Natural Products Conference. July 24-27, 2016. Copenhagen, Denmark. 4. II Simpósio Internacional de Medicina Regenerativa e Inovação em Saúde. November 19-21, 2015. Universidade Federal da Bahia, Salvador - BA, Brazil. 5. 2nd International Conference on Natural Products Utilization. October 14- 17, 2015. Plovdiv, Bulgária. 6. First Brazilian Workshop on Bioinformatics/Chemometrics for Metabolomics. March 13-14, 2015. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto – SP, Brazil. Apresentação de trabalho – Evento científico Internacional 1. SOUZA, A. A.; VESSECCHI, R.; CASTRO-GAMBOA, I.; FURLAN, M. ESI- MS/MS and computational chemistry: important tools for dereplication of benzopyrans from Piperaceae species. 2017. The American Society of Pharmacognosy Annual Meeting. Saturday, July 29 - August 2, 2017. Portland – OR, USA. 2. SOUZA JÚNIOR, A. A.; ZANIN, L. L.; CASTRO-GAMBOA, I.; FURLAN, M. Metabolomics studies of Piperaceae species: a correlation between miniaturization and direct extraction strategies. 2016. 9th Joint Natural Products Conference. July 24-27, 2016. Copenhagen, Denmark. 3. SOUZA JÚNIOR, A. A.; PIVATTO, M.; CASTRO-GAMBOA, I.; LOPES, N. P.; FURLANA, M. ESI-MS/MS of benzopyrans: a systematic study of fragmentation mechanism for metabolomic approach. 2015. 2nd International Conference on Natural Products Utilization. October 14-17, 2015. Plovdiv, Bulgária. 4. POLITI, F. A. S.; SOUZA JÚNIOR, A. A.; FANTATTO, R. R.; CHAGAS, A. C. S.; FURLAN, M. Phytochemical study and in vitro acaricidal action of Tagetes patula L. (Asteraceae) ethanolic extract against engorged females of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 2015. 5nd Brazilian Conference on Natural Products. October 26-29. Atibaia - SP, Brazil. Publicação de trabalho – Evento científico Internacional 1. SOUZA JÚNIOR, A. A.; ZANIN, L. L.; CASTRO-GAMBOA, I.; FURLAN, M. Metabolomics studies of Piperaceae species: a correlation between miniaturization and direct extraction strategies. Planta Medica, v. 81, p. S1- S381, 2016. Palestra 1. Espectrometria de massas: o universo m/z para aplicações biotecnológicas. 2016. Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia – Universdidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu - SP, Brasil. Seminário 1. Dinâmica metabólica de terpenos voláteis: uma correlação entre o efeito isotópico cinético e a hiperconjugação. 2016. Instituto de Química - UNESP, Araraquara - SP, Brasil. Conferência – Evento científico 1. Produtos naturais na saúde e na biotecnologia. 2015. II Simpósio Internacional de Medicina Regenerativa e Inovação em Saúde. Universidade Federal da Bahia, Salvador - BA, Brasil. Participação em cursos 1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE: princípios teóricos. 05 a 07 e agosto de 2015. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA, São Carlos - SP, Brasil. Carga Horária: 24 h. 2. Introduction to Plant Metabolomics. 17 a 21 de fevereiro de 2014. Universidade Federal de São Carlos – UFSCAR, São Carlos - SP, Brasil. Carga Horária: 20 h. Dedico esta tese à minha família, minha mamãe Lúcia, meu papai Amauri, meus irmãos, à Carla e meus avós (in memoriam). AGRADECIMENTOS Gostaria de fazer o primeiro agradecimento à minha oriendadora, Prof.a Dr.a Maysa Furlan, por me oferecer oportunidades transformadoras, pelo suporte científico, pelas discussões e conversas produtivas. Obrigado pela confiança e amizade que me foi concedida nestes anos. Aos membros do NuBBE agradeço pelo companherismo, apoio, troca de conhecimentos e momentos formidáveis no dia-a-dia. Ao meu coorientador, Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa, pela orientação, amizade e motivação. Ao meu supervisor no estágio de doutoramento, Prof. Dr. Dean J. Tantillo (UCDAVIS), pelo acolhimento na Universtiy of California, excelente convivência, acesso a infraestrutura e ensinamentos. Ao Prof. Dr. Ricardo Vessecchi (USP), pela colaboração e ensinamentos na parte de cálculo e espectrometria de massas. Também aproveito para agradecer ao Professor Ricardo Vessecchi e ao Professor Paulo Clairmont, pelas significativas contribuições no exame de qualificação. A Universidade Estadual Paulista, ao Instituto de Química de Araraquara e ao Programa de Pós-graduação em química, por ter me concedido a oportunidade da realização do doutorado. Aos servidores e grandes amigos João Bronzel, Juliana Rodrigues e Nivaldo Boralle pelos treinamentos recebidos. Ao Professor Norberto Peporine Lopes (USP) pelo suporte nas análises. Aos professores que compuseram essa banca de defesa, Prof.a Dr. a Maysa Furlan, Profa Dra Angela R. Araújo, Prof. Dr. Nailton M. Nascimento Jr., Prof.a Dr.a Taícia P. Fill e Prof. Dr. Ricardo Vessecchi, por suas contribuições, análise e avaliação do trabalho. Agradeço o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento da bolsa de doutoramento e disponibilidade de reserva técnica, os quais foram imperativos para a realização do projeto de pequisa. Também aproveito para agradecer o apoio da FAPESP pelo financiamento da bolsa de estágio de doutoramento no exterior. Aos meus pais, Amauri e Lúcia, por terem me criado e educado com tanto amor, carinho e dedicação incondicional. Uma felicidade estupenda dividir mais uma etapa com vocês! Aos meus Irmãos, Rudnei e Rusivelton, pela inestimada amizade e carinho. Agradeço carinhosamente a Carla, por estar presente e me acompanhar na minha caminhada científica, dividindo momentos de muito estresse e, principalmente, dias felizes e alegres. Obrigado pelo apoio, paciência, dedicação e carinho! Ao Sr. Américo (in memoriam) e Sra. Leda pelo apoio e amizade. Agradeço a todos os amigos e familiares pelo apoio e compreensão. Aos meus amigos-irmãos adquiridos durante o tempo de pós-graduação, em especial ao Alexander, ao Cristiann, ao Cristiano, ao Fernando, à Gislaine, ao Marcos, ao João, ao Juliano, à Marielle, ao Tiago e à Vânia. RESUMO A pesquisa por candidatos a fármacos pelas indústrias farmacêuticas e o desenvolvimento no Brasil de novos produtos aplicados à área da saúde humana e animal são processos que requerem otimização contínua. A metabolômica, particularmente, tem contribuído efetivamente no planejamento de estratégias eficientes aplicadas a bioprospecção de produtos naturais. Nesse contexto, 2H- cromenos e cromanos que mostram acúmulo em espécies de Piper aduncum e Peperomia obtusifolia (Piperaceae) foram selecionados para o desenvolvimento de uma abordagem teórica/experimental aplicada ao estudo de matrizes complexas. Para tanto, métodos computacionais com base na teoria do funcional de densidade foram aplicados para predizer grandezas termoquímicas de benzopiranos, incluindo afinidade protônica, basicidade em fase gasosa e diagramas de energia da coordenada de reação. As grandezas termoquímicas obtidas pela aplicação de química computacional foram empregadas em sinergia com os dados de ESI(+)- MS/MS, visando descrever o perfil de fragmentação do núcleo benzopirano do tipo 2H- cromeno e cromano, incluindo a descrição de mecanismos de fragmentação clássicos e dissociações específicas para cada subclasse. Além disso, uma abordagem metabolômica mimetizando etapas de um estudo de bioprospecção foi realizada com a finalidade de validar o perfil de fragmentação proposto para os 2H-cromenos e cromanos. Os resultados mostraram que a estrutura química dos benzopiranos confere características intrínsecas ao equilíbrio ácido-base que representa as espécies protonadas. Entre esses aspectos, o 2H-cromeno prenilado mostrou que a adição do próton na ligação dupla da unidade prenila está de acordo com um estado de transição de 6 membros. Além disso, as grandezas termoquímicas mostraram que a nucleofilicidade do anel pirano dos cromanos depende dos substituintes ligados ao C2. Assim, o aumento da contribuição por hiperconjugação favoreceu a clivagem heterolítica da ligação O-C2 do anel pirano. Consequentemente, uma bifurcação na fragmentação do núcleo benzopirano dos derivados de cromanos naturais justificou adequadamente a formação do íon diagnóstico após a perda de 122 u. Na maioria dos trabalhos, essa fragmentação é explicada atendendo ao mecanismo concertado de retro Diels Alder. Nessa perspectiva, o padrão de fragmentação de 2H-cromenos e cromanos corroborou com a distribuição de íons na curva de energia, e com o perfil de energia mensurado no modelo B3LYP/6-31+G(d,p). Usando as reações de fragmentação estudadas por ESI(+)-MS/MS, propostas de identificação estrutural de 2H-cromenos e cromanos foram descritas à partir da análise de espectros de massas adquiridos em mistura. Portanto, o presente trabalho confirmou que o uso integrado de ferramentas analíticas e computacionais se configura em uma abordagem eficiente para a pesquisa de substâncias naturais em misturas complexas. Palavras-chave: Piperaceae. Piper aduncum. Peperomia obtusifolia. Benzopiranos. Ionização por electrospray. Termoquímica computacional. Hiperconjugação. Reação retro Diels-Alder. ABSTRACT The research for new drug candidates by pharmaceutical companies and the development in Brazil of new products applied to human and animal health are processes that require continuous optimization. The metabolomics have contributed effectively to plan efficient strategies applied to the bioprospecting of natural products. In this context, 2H-chromenes and chromanes that show accumulation in Piper aduncum and Peperomia obtusifolia (Piperaceae) were selected for the development of a theoretical/experimental approach applied to the study of complex matrices. For this purpose, quantum-chemical calculations based on density functional theory were applied to predict some thermochemical parameters of benzopyrans, including proton affinity, gas-phase basicity and reaction coordinate energy diagrams. Such computational parameters were employed in synergy with the ESI(+)-MS/MS data, aiming to describe the fragmentation profile of the 2H-chromene and chromane, including the description of classical fragmentation mechanisms and specific dissociations for each subclass. Among these aspects, the prenylated 2H-chromene showed that the addition of the proton at the double bond of the prenyl unit is related to a 6-member transition state. Besides that, the thermochemical parameters have shown that the nucleophilicity of the pyran ring of the chromans depends on the C2- linked substituents. Thus, increased contribution by hyperconjugation favored the heterolytic cleavage of the O-C2 bond of the pyran ring. Consequently, a bifurcation in the fragmentation of the chromane derivatives justified adequately the formation of the diagnostic ion after the loss of 122 u. In most works, this fragmentation is explained by the concerted mechanism of retro Diels Alder. In this perspective, the fragmentation pattern of 2H-chromenes and chromanes corroborated with the ion distribution in the energy-resolved plot, and with the energy profile measured in the B3LYP/6-31+G(d,p) model. Using the fragmentation reactions studied by ESI(+)-MS/MS, structural analysis and identification for 2H-chromenes and chromanes were described from the analysis of mass spectra acquired in the mixture. Therefore, the present work confirmed that the integrated use of analytical and computational tools are efficient approaches for identification of natural compounds in complex matrices. Keywords: Piperaceae. Piper aduncum. Peperomia obtusifolia. Benzopyrans. Electrospray ionization. Computational thermochemistry. Hyperconjugation. Retro Diels-Alder reaction. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estruturas químicas de alguns dos produtos naturais isolados no século XIX: emetina, colchicina, quinina, salicina, atropina, morfina,* quinidina, codeína e efedrina. ................................................................................................................. 27 Figura 2 – Estrutura química do ácido acetilsalicílico.* .......................................................... 28 Figura 3 - Representação dos íons positivos e negativos que podem ser produzidos nas análises por ESI-MS.a,b,c ........................................................................................ 33 Figura 4 - Proposta para a formação de espécies protonadas de um benzopirano genérico com base no equilíbrio ácido-base de Brönsted-Lowry. ....................................... 35 Figura 5 - Estrutura química da piperina.* ............................................................................. 37 Figura 6 - Estruturas químicas e nomenclatura de 1-benzopiranos, incluindo cromano, 2H- cromeno e 4H-cromeno. Esses heterocíclicos são o núcleo base de uma extensa variedade de produtos naturais. ............................................................................ 37 Figura 7 - Estruturas químicas de alguns 1-benzopiranos naturais.* ................................... 39 Figura 8 - Estruturas químicas do 2H-cromeno ácido gaudichaudiânico isolado do extrato etanólico de Piper gaudichadianum (Piperaceae) e, do derivado esterificado obtido por modificação molecular..................................................................................... 40 Figura 9 - Estruturas químicas dos cromanos isolados do extrato etanólico de partes aéreas Peperomia obtusifolia (Piperaceae).* .................................................................... 40 Figura 10 - Estruturas químicas dos cromanos esterificados com monoterpenos do tipo endo- borneol e endo-fenchol, isolados da fração lipofílica do extrato etanólico das partes aéreas de Peperomia obtusifolia (Piperaceae). .................................................... 41 Figura 11 - Proposta biossintética de benzopiranos em espécies de Piper e Peperomia. .... 41 Figura 12 - Estruturas químicas dos 2H-cromenos 1-3 previamente isolados do extrato bruto das partes aéreas de Piper aduncum (Piperaceae). M.M. indica o valor da massa molecular em unidades de massa atômica (u). .................................................... 52 Figura 13 - Mapa do potencial eletrostático molecular (MEP) de 1 calculado no modelo B3LYP/6-31+G(d,p). A magnitude da densidade de elétrons é indicada pelas cores vermelho (maior) e azul (menor). A análise do orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO) é ilustrada a direita do MEP. ..................................................... 53 Figura 14 - Cargas atômicas (MK) usando o esquema Merz-Singh-Kollman para os átomos de oxigênios de 1-3 calculadas no modelo B3LYP/6-31+G(d,p). ........................ 53 Figura 15 - Afinidade protônica (valores em negrito) e basicidade em fase gasosa em kcal/mol para 1-3, calculadas para as principais formas protonadas no modelo B3LYP/6- 311++G(d,p)........................................................................................................... 54 Figura 16 - Espectro de massas ESI(+)-MS/MS da [1+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 235. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 20 eV. ............................................................. 55 Figura 17 - Proposta de fragmentação para a [1+H]+. Na figura são apresentadas duas rotas, denominadas a1 e a2.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p). .................. 57 Figura 18 - Curva de energia do íon precursor m/z 235 obtida a partir dos dados de ESI(+)- MS/MS. A faixa de ativação de íons variou de 5 a 40 eV. A m/z observada em alta resolução é mostrada na parte superior da curva de energia. Os experimentos foram adquiridos em aparelho Q-TOF. ................................................................. 58 Figura 19 - Espectro de massas ESI(+)-MS/MS da [2+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 219. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 20 eV. ............................................................. 59 Figura 20 - Curva de energia do íon precursor m/z 219 obtida a partir dos dados de ESI(+)- MS/MS. A faixa de ativação de íons variou de 5 a 40 eV. A m/z observada em alta resolução é mostrada na parte superior da curva de energia. Os experimentos foram adquiridos em aparelho Q-TOF. ................................................................. 59 Figura 21 - Proposta de fragmentação para a [2+H]+. Na figura são apresentadas duas rotas, denominadas b1 e b2.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p). .................. 60 Figura 22 - Espectro de massas ESI(+)-MS/MS da [3+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 287. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 20 eV. ............................................................. 61 Figura 23 - Curva de energia do íon precursor m/z 287 obtida a partir dos dados de ESI(+)- MS/MS. A faixa de ativação de íons variou de 5 a 40 eV. A m/z observada em alta resolução é mostrada na parte superior da curva de energia. Os experimentos foram adquiridos em aparelho Q-TOF. ................................................................. 62 Figura 24 - Diagrama de energia para a etapa de transferência do próton entre a unidade prenila e o átomo de oxigênio do anel pirano, produzindo duas espécies protonadas de 3 (C1 e C1’).* ................................................................................ 64 Figura 25 - Proposta de fragmentação para a [3+H]+. Na figura são apresentadas três rotas, denominadas de c1, c2 e c3.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p). . 65 Figura 26 - Diagrama de energia para a perda de 3-metilbuta-1,2-dieno a partir da [3+H]+ (C2).* ...................................................................................................................... 67 Figura 27 - Proposta de fragmentação para a [M+H]+ considerando o mecanismo retro Diels- Alder. M indica um benzopirano genérico. ............................................................ 68 Figura 28 - Estruturas químicas dos cromanos 4-6. As substâncias foram estudadas usando o modelo B3LYP/6-311++G(d,p). .......................................................................... 69 Figura 29 - Diagramas de energia da coordenada de reação para a fragmentação dos cromanos 4 (verde), 5 (amarelo) e 6 (azul), com base no mecanismo retro Diels- Alder e considerando a espécie neutra (M, neutra).* ........................................... 70 Figura 30 - Diagramas de energia da coordenada de reação para a fragmentação dos cromanos 4 (verde), 5 (amarelo) e 6 (azul), com base no mecanismo retro Diels- Alder e considerando a espécie protonada na hidroxila fenólica {[M+H]+, espécie protonada}.* ........................................................................................................... 71 Figura 31 - Diagramas de energia da coordenada de reação para a fragmentação dos cromanos 4 (verde), 5 (amarelo) e 6 (azul), com base no mecanismo retro Diels- Alder e considerando a espécie protonada no átomo de oxigênio do anel pirano {[M+H]+, espécie protonada}.* ............................................................................... 72 Figura 32 - Afinidade protônica (valores em negrito) e basicidade em fase gasosa em kcal/mol para as substâncias 4-12, calculadas para as principais formas protonadas no modelo B3LYP/6-311++G(d,p). ............................................................................. 74 Figura 33 - Geometrias otimizadas para os benzopiranos 4, 7, 8, 9 e 10 no modelo B3LYP/6- 311++G(d,p).* ........................................................................................................ 76 Figura 34 - Geometrias otimizadas para os benzopiranos 4, 7, 8, 9 e 10 no modelo B3LYP/6- 311++G(d,p).* ........................................................................................................ 77 Figura 35 - Espectro de massas ESI(+)-MS/MS da [10+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 327. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 15 eV. ............................................................. 79 Figura 36 - Curva de energia do íon precursor m/z 327 obtida a partir dos dados de ESI(+)- MS/MS. A faixa de ativação de íons variou de 5 a 40 eV. A m/z observada em alta resolução é mostrada na parte superior da curva de energia. Os experimentos foram adquiridos em aparelho Q-TOF. ................................................................. 79 Figura 37 - Proposta de fragmentação para a [10+H]+.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) relativas são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p).* ............................................................................................. 80 Figura 38 - Espectro de massas ESI(+)-MS/MS da [11+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 371. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 15 eV. ............................................................. 82 Figura 39 - Curva de energia do íon precursor m/z 371 obtida a partir dos dados de ESI(+)- MS/MS. A faixa de ativação de íons variou de 5 a 40 eV. A m/z observada em alta resolução é mostrada na parte superior da curva de energia. Os experimentos foram adquiridos em aparelho Q-TOF. ................................................................. 82 Figura 40 - Proposta de fragmentação para a [11+H]+.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6- 31+G(d,p). .............................................................................................................. 85 Figura 41 - Espectro de massas de ESI(+)-MS/MS da [12+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 371. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 15 eV. ............................................................. 86 Figura 42 - Curva de energia do íon precursor m/z 507 obtida a partir dos dados de ESI(+)- MS/MS. A faixa de ativação de íons variou de 5 a 40 eV. A m/z observada em alta resolução é mostrada na parte superior da curva de energia. Os experimentos foram adiquiridos em aparelho Q-TOF. ................................................................ 87 Figura 43 - Proposta de fragmentação para a [12+H]+.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6- 31+G(d,p). .............................................................................................................. 88 Figura 44 - Gráficos de rendimento em função do solvente de extração para as espécies: A) Piper aduncum (PIADU), B) Piper tuberculatum (PIARB) e C) Piper arboreum (PITUB). Para cada espécie os rendimentos dos extratos brutos e daqueles após o preparo de amostra são indicados pelas barras vermelhas e azuis, respectivamente. ................................................................................................... 90 Figura 45 - Perfil do número de bandas cromatográficas detectadas (nBCd),* a 254 nm, para as espécies: A) Piper aduncum (PIADU), B) Piper tuberculatum (PIARB) e C) Piper arboreum (PITUB). As fases móveis constituídas por ACN/H2O e MeOH/H2O são indicadas pelas barras vermelhas e azuis, respectivamente. .............................. 92 Figura 46 - Gráficos de rendimento em função do solvente de extração para as espécies: A) Piper aduncum (PIADU) e B) Peperomia obtusifolia (PEOBT). Para cada espécie os rendimentos dos extratos brutos e daqueles após o preparo de amostra são indicados pelas barras vermelhas e azuis, respectivamente. O valor na cor verde é o número de bandas cromatográficas detectadas (nBCd) a 254 nm.* ............. 95 Figura 47 - Espectros de massas ESI(+)-MS/MS obtidos em um aparelho Q-TOF selecionando os íons precursores: A) m/z 235 e B) m/z 219. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 15 eV. .......................................... 97 Figura 48 - Curvas de energia obtidas a partir dos dados de ESI(+)-MS/MS para os íons precursores: A) m/z 235 e B) m/z 219. A faixa de ativação de íons utilizada foi de 5 a 35 eV. A m/z observada em alta resolução para cada íon precursor é mostrada na parte superior da curva de energia. O experimento foi adquirido em um aparelho Q-TOF. .................................................................................................... 98 Figura 49 - Proposta de fragmentação para os íons m/z 235 e 219.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p). ............................................................................................ 101 Figura 50 - Espectros de massas ESI(+)-MS/MS obtidos em um aparelho Q-TOF selecionando os íons precursores: A) m/z 327 e B) m/z 371. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 15 eV. ........................................ 104 Figura 51 - Curvas de energia obtidas a partir dos dados de ESI(+)-MS/MS para os íons precursores: A) m/z 327 e B) m/z 371. A faixa de ativação de íons utilizada foi de 5 a 35 eV. A m/z observada em alta resolução para cada íon precursor é mostrada na parte superior da curva de energia. O experimento foi adquirido em um aparelho Q-TOF. .................................................................................................. 105 Figura 52 - Diagrama de energia para a etapa de transferência do próton entre a unidade prenila e o átomo de oxigênio do anel pirano produzindo duas formas protonadas da substância 6 (F1 e F1’).* ................................................................................ 107 Figura 53 - Proposta de fragmentação para o íon m/z 327. No esquema é apresentado uma terceira proposta para a química de fragmentação do cromano 10.* ................ 108 Figura 54 - Proposta de fragmentação para o íon m/z 371.* As energias relativas de Gibbs (em negrito) são indicadas em kcal/mol e foram calculadas com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p). ............................................................................................ 110 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES AceO acetona ACN acetonitrila AcOEt acetato de etila BuOH butanol CID dissociação induzida por colisão (collision-induced dissociation) CLAE cromatografia líquida de alta eficiência DFT teoria do funcional de densidade (density functional theory) EFS extração em fase sólida (solid phase extraction) Elab energia aplicada no processo de dissociação induzida por colisão eV eletronvolt ESI ionização por electrospray (electrospray ionization) ESI-MS espectrometria de massas com fonte de ionização por electrospray EtOH etanol GB basicidade em fase gasosa (gas-phase basicity) g gramas Hartree unidade atômica de energia HOMO orbital molecular ocupado de maior energia IsOH isopropanol MeOH metanol MEP mapa do potencial eletrostático molecular MM massa molecular MS espectrometria de massas (mass spectrometry) MS/MS espectrometria de massas sequencial m/z relação massa/carga nBCD número de bandas cromatográficas detectadas PA afinidade protônica (proton affinity) PNs produtos naturais Q-TOF analisador do tipo quadrupolo-tempo de vôo Q-TRAP analisador do tipo quadrupolo-ion trap rDA reação retro Diels-Alder u unidade de massa atômica unificada UV-Vis ultravioleta-visível v/v volume por volume SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 25 1.1 A importância dos produtos naturais .................................................................. 25 1.2 Metabolômica .......................................................................................................... 29 1.3 Processo de extração para estudos metabolômicos......................................... 31 1.4 Espectrometria de massas com fonte de ionização por electrospray ............ 32 1.4.1 Intepretração de dados de ESI-MS/MS assistida por química computacional ....... 34 1.5 A família Piperaceae............................................................................................... 36 1.5.1 Benzopiranos ............................................................................................................ 37 2 OBJETIVO ................................................................................................................ 42 2.1 Objetivos específicos............................................................................................. 42 3 PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................ 43 3.1 Suporte cromatográfico ......................................................................................... 43 3.1.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ...................................................... 43 3.1.2 Cartuchos para extração em fase sólida e membranas para filtração .................... 43 3.2 Equipamentos ......................................................................................................... 43 3.2.1 Instrumento para análises por CLAE ....................................................................... 43 3.2.2 Instrumentos para análises por espectrometria de massas em alta resolução ou experimentos sequenciais ........................................................................................ 44 3.3 Plataforma computacional .................................................................................... 45 3.3.1 Supercomputadores ................................................................................................. 45 3.3.2 Programas para processamento, análise e apresentação de dados ...................... 45 3.4 Métodos ................................................................................................................... 45 3.4.1 Coleta e classificação de material vegetal ............................................................... 46 3.4.1.1 Preparo do material vegetal ..................................................................................... 46 3.4.1.2 Isolamento e purificação de 2H-cromenos e cromanos .......................................... 47 3.4.2 Estudo de 2H-cromenos e cromanos por espectrometria de massas .................... 47 3.4.2.1 Preparo de amostra .................................................................................................. 47 3.4.2.2 Análises por ESI(+)-MS e ESI(+)-MS/MS ................................................................ 47 3.4.3 Estudo do processo de extração de espécies de Piper e Peperomia ..................... 48 3.4.3.1 Preparo dos extratos vegetais.................................................................................. 48 3.4.3.2 Preparo de amostra .................................................................................................. 48 3.4.3.3 Análises por CLAE ................................................................................................... 49 3.4.4 Análises dos extratos vegetais por ESI(+)-MS e ESI(+)-MS/MS ............................ 50 3.4.5 Métodos computacionais .......................................................................................... 50 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 52 4.1 Estudo do padrão de dissociação de 2H-cromenos isolados de Piper aduncum por ESI(+)-MS/MS e química computacional ..................................... 52 4.2 Estudo do padrão de fragmentação de cromanos isolados de Peperomia obtusifolia por ESI(+)-MS/MS e química computacional ................................... 68 4.3 Estudo do processo de extração de espécies de Piper: rastreamento analítico do perfil metabólico por CLAE .............................................................. 89 4.4 Estudo do processo de extração das espécies de Piper aduncum e Peperomia obtusifolia: rastreamento analítico do perfil metabólico por CLAE . .................................................................................................................................. 93 4.5 Identificação de 2H-cromenos e cromanos em extratos vegetais a partir dos dados obtidos nas análises por ESI(+)-MS/MS e química computacional ...... 96 5 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 111 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 113 APÊNDICE A – ESPECTROS DE MASSAS ........................................................ 123 APÊNDICE B – COORDENADAS CARTESIANAS (XYZ) E GRANDEZAS TERMOQUÍMICAS ................................................................................................. 126 APÊNDICE C – CROMATOGRAMAS DAS ANÁLISES POR CLAE .................. 137 25 1 INTRODUÇÃO 1.1 A importância dos produtos naturais Ao longo do processo de desenvolvimento da civilização e novas perspectivas de qualidade de vida da sociedade, os recursos naturais têm sido fonte de matéria- prima imperativa para a manutenção das mais diversas necessidades básicas. Nesse contexto, as plantas se configuram em excelentes fontes para suprir a demanda de itens essenciais, incluindo moradia, mobiliário, vestuário, combustível (biomassa), alimentação e medicamentos. Nessa perspectiva, um dos maiores pilares no desenvolvimento da humanidade pode ser atribuído ao uso das espécies vegetais para a prevenção e o tratamento de doenças que acometem o homem, permitindo consolidar a melhoria da saúde e a expectativa de vida da população1–6. Documentos datados de 2600 anos a.C. registraram o uso da medicina tradicional na região da Mesopotâmia, corroborado pelo desenvolvimento de sofisticadas formulações líquidas com propriedades terapêuticas produzidas a partir de extratos vegetais. Por exemplo, essa “extratoteca” contemplava o preparo de óleos essenciais de espécies de Cedrus, Cupressus, Glycyrrhiza, Commiphora e Papaver, perfazendo um conjunto de formulações que poderiam ser indicadas para o tratamento de inflamações, infecções parasitárias, resfriados e para o alívio das dores4,7. Historicamente, o documento egípcio (1500 a.C.) conhecido como "Papiro de Ebers", relata um número significativo de enfermidades e o emprego de formulações empíricas, de origem animal e vegetal, para os mais variados fins medicinais. Além disso, outros documentos na China e na Índia datados de 1000 a.C., registraram também o uso da medicina tradicional, cujo acervo contava com centenas de produtos naturais (PNs) oriundos de plantas7. A evolução da ciência e a difusão do conhecimento ao longo de muito tempo (p. ex., sólida medicina tradicional documentada em farmacopéias), especialmente a partir do início do século XIX, impulsionaram o isolamento de inúmeras substâncias farmacologicamente ativas obtidas a partir de plantas medicinais1–5,7. Neste sentido, os primeiros exemplos de PNs isolados de plantas medicinais foram: emetina (1817); 26 colchicina (1820); quinina (1820); salicina (1827); atropina (1831); morfina (1832); quinidina (1833); codeína (1848) e efedrina (1887), como esboçado na Figura 14,6. Nesta vertente, o arranjo sistemático desses resultados associado com o acesso a instrumentação analítica robusta e precisa permitiu o desenvolvimento de formulações e o início de uma nova era na medicina. Neste momento, os medicamentos poderiam ser administrados aos pacientes em doses precisas. Um exemplo clássico é o caso da Morfina®, um potente analgésico lançado no mercado pela empresa E. Merck, em 1926. A morfina é o princípio ativo desse medicamento (Figura 1), um produto natural extraído de Papaver somniferum (Papaveraceae)1,7–9. Outro exemplo de destaque dos avanços científicos do século XIX pode ser ilustrado com o desenvolvimento da Aspirina, um analgésico e antipirético comercializado pela empresa Bayer à partir de 1899. O princípio ativo da aspirina, o ácido acetilsalicílico (Figura 2), é uma substância pura obtida via semi-síntese com efeitos colaterais leves e eficácia terapêutica comprovada1,8,9. No contexto histórico, em 1828, o farmacêutico alemão J. A. Buchner concluiu que o glicosídeo do álcool salicílico era o principal princípio ativo da planta Salix alba (Salicaceae), a qual as cascas eram utilizadas popularmente para alívio das dores e febre. Em 1860, os químicos alemães H. Kolbe e E. Lautemann sintetizaram o ácido salicílico a partir do fenol inspirados pela estrutura química deste glicosídeo, contribuindo para que o químico alemão, F. Hoffmann, propusesse a obtenção do ácido acetilsalicílico via acetilação da hidroxila do ácido salicílico, em 18981,6,8,9. 27 * Esse alcaloide de importância milenar e com ação analgésica foi originalmente isolado de Papaver sommiferum (Papaveraceae), em 1804, pelo farmacêutico alemão Friedrich Wilhelm e é conhecido como o marcador de tempo da Química de Produtos Naturais1,6. Figura 1 - Estruturas químicas de alguns dos produtos naturais isolados no século XIX: emetina, colchicina, quinina, salicina, atropina, morfina,* quinidina, codeína e efedrina. Fonte: Elaborada pelo autor. 28 * A aspirina é o fármaco mais usado no mundo. Além de apresentar eficiência comprovada, os efeitos colaterais da aspirina são leves quando comparados a outros fármacos de interesse6. Figura 2 – Estrutura química do ácido acetilsalicílico.* Fonte: Elaborada pelo autor. As décadas 1930-1950 estabeleceram um novo marco importante da ciência para o provimento de saúde e bem-estar humano, por meio do desenvolvimento de novos medicamentos antimicrobianos a partir de PNs. Este período, denominado de “décadas dos antibióticos”, foi consagrado com a descoberta da penicilina (1939); da actinomicina (1942); da estreptomicina (1943); do cloranfenicol (1947); da neomicina (1949) e da eritromicina A (1950)6,9. A contribuição dos PNs para o planejamento de novos medicamentos também se mostrou extremamente importante para a quimioterapia antineoplásica. Os alcaloides vincristina e vimblastina, ambos isolados de Catharanthus roseus (Apocynaceae); o paclitaxel, isolado de cascas de árvores de Taxus brevifolia (Taxaceae); a daunorubicina e o seu análogo hidroxilado doxorrubicina, ambos isolados de Streptomyces sp. são exemplos que devem ser destacados8–10. Mais recentemente, em 2016, uma revisão sistemática realizada por Newman e Cragg reforçou a importância dos PNs nos avanços para descoberta de novos fármacos11. Um dado relevante do estudo conduzido por esses pesquisadores englobou a terapêutica antineoplásica e antimicrobiana, no período de 1940 a 2014. De acordo com esses autores, no intervalo avaliado, os PNs e derivados semissintéticos - inspirados em PNs – representaram 41% e 65%, dos fármacos aprovados para o desenvolvimento de novos medicamentos com ação frente à diversos tipos de tumores e doenças infecciosas, respectivamente11. Portanto, essa breve contextualização corrobora na perspectiva que a natureza é uma fonte inestimável de princípios ativos, que podem ser usados na produção de medicamentos eficazes para a cura de doenças que acomentem o homem2–6,8,11,12. 29 Em contrapartida, apesar dos inegáveis avanços alcançados no campo dos medicamentos oriundos de PNs, as análises sistemáticas têm indicado os desafios dos estudos de bioprospecção e, até mesmo, um acentuado declínio nos investimentos em programas de pesquisa voltados ao uso sustentável da biodiversidade. Entre os fatores que levaram a esse retrocesso, destaca-se o tempo demasiado necessário para a conclusão desse tipo de ciência; a grande demanda de investimentos em recursos humanos qualificados e, não menos importante, a infra- estrutura de ponta que é indispensável2,6,11–14. Nesse contexto, a Química de Produtos Naturais tem ganho relevância com o desenvolvimento das ciências “ômicas”, incluindo a genômica, transcriptômica, a proteômica e a metabolômica. A metabolômica, particularmente, têm contribuído efetivamente no planejamento de estratégias eficientes aplicadas a bioprospecção de PNs, integralizando as etapas de aquisição, mineração e interpetação do conjunto de dados gerados durante os delineamentos experimentais15–20. 1.2 Metabolômica A metabolômica é o termo usado para definir as análises de caráter qualitativo e quantitativo acerca de todos os metabólitos de uma determinada matriz de origem biológica (incluindo células, tecidos ou organismos), sob um conjunto de condições bióticas e abióticas específicas18. No entanto, o mapeamento completo da composição metabólica - análise metabolômica - de uma dada matriz, requer o uso de estratégias analíticas altamente sensíveis. Consequentemente, esse parâmetro é responsável por originar limitações ao planejamento de estudos metabolômicos16,17,21,22. Apesar disso, novas ferramentas – mais robustas e precisas – têm sido desenvolvidas e vêm sendo aplicadas com sucesso na pesquisa em PNs. Com a finalidade de sistematizar as oportunidades da metabolômica no contexto dos PNs, os estudos metabolômicos podem ser classificados em quatro diferentes abordagens: i) metabolômica, ii) impressão digital metabólica, iii) perfil metabólico e iv) análise alvo15,16,22,23. i) Metabolômica é o estudo que visa identificar e quantificar o conjunto de todos os metabólitos produzidos e/ou modificados por um organismo, célula ou tecido específico, sob condições bióticas ou abióticas 30 previamente definidas. No entanto, as aplicações dessa abordagem ainda apresentam limitações, pois determinados organismos podem produzir numerosos metabólitos. Consequentemente, a detecção quatitativa e simultânea de todos os metabólitos torna-se inviabilizada pelo uso de uma única técnica analítica. Adicionalmente, no contexto de elaboração de respostas, a interpretação da infinidade de dados gerados na metabolômica também é desafiadora17–19,22,24. ii) As análises com ênfase na impressão digital metabólica consistem em comparar um panorama geral do metaboloma de amostras distintas. Nesse tipo de abordagem, o objetivo é indicar diferenças na composição metabólica das amostras selecionadas. Assim, a capacidade para identificar e quantificar todos os metabólitos presentes nas matrizes em estudo não é um requisito para o desenvolvimento desse tipo de proposta. Por exemplo, a impressão digital metabólica pode ser utilizada no controle de qualidade de plantas medicinais. O conhecimento prelimiar sobre o metabolismo da espécie alvo, permite definir os métodos instrumentais e os modelos estatísticos mais adequados para aquisição, tratamento e interpretação de dados16,19,21,22. iii) O perfil metabólico por sua vez, é uma abordagem com objetivo de determinar variações qualitativas e quantitativas nas substâncias detectadas, de acordo com a técnica analítica de trabalho. Nessa proposta, a percepção de variações específicas em uma ou mais classes de substâncias, auxilia no entendimento da influência de fatores bióticos e/ou abióticos sobre a dinâmica metabólica dos indivíduos estudados. Por exemplo, o perfil metabólico pode ser utilizado para monitorar as respostas bioquímicas de indivíduos modificados geneticamente17,19,22,25. iv) A quarta abordagem metabolômica é denominada de análise alvo, que consiste na determinação qualitativa ou quantitativa de metabólitos específicos ou marcadores biológicos produzidos por um dado organismo, célula ou tecido. Os parâmetros que alicerçam a análise alvo estão em acordo com os princípios fundamentais relacionados a prospecção de PNs bioativos. Por exemplo, espécies vegetais previamente investigadas podem ser estudadas com a finalidade de 31 identificar substâncias inéditas. Paralelamente, análises comparativas de indivíduos que pertencem ao mesmo gênero ou família podem auxiliar a prospectar fontes alternativas de PNs de interesse terapêutico. Dessa forma, a otimização dos processos de extração, associados ao emprego de métodos de separação e detecção, com especificidade para os PNs alvos, pode auxiliar no desenvolvimento de modelos experimentais eficientes e versáteis no estudo de matrizes complexas15,17,19,22,24. 1.3 Processo de extração para estudos metabolômicos Na química de produtos naturais, a metodologia de extração é uma estratégia chave para otimizar o delineamento experimental, uma vez que o protocolo de extração pode priorizar a representatividade amostral ou a seletividade de grupos de substâncias. Assim, é importante ressaltar que a escolha do processo extrativo tem consequências diretas sobre a definição do perfil metabólico de referência. Além disso, os estudos metabolômicos são constituídos, em sua maioria, por um número expressivo de amostras. Nessa perspectiva, para a seleção ou adequação de um protocolo de extração do metaboloma, a metodologia deve considerar o objetivo analítico associado a executabilidade e a minimização de processos de degradação, modificação estrutural e perda de analitos17,22,26. Na busca por PNs utilizando-se de métodos clássicos, ou abordagens mais sofisticadas de metabolômica, vários processos de extração têm sido investigados, como a extração por solventes, extração por arraste a vapor, extração por fluído supercrítico e líquidos iônicos. A extração por maceração com solventes orgânicos é a metodologia empregada com maior frequência nos estudos metabolômicos de subtâncias bioativas, tanto para matrizes vegetais, quanto para fungos, bactérias e outros animais27,28. A principal vantagem do uso de solventes orgânicos para o preparo de extratos brutos é a possibilidade de otimização da capacidade de extração, uma vez que tanto a polaridade quanto a seletividade podem nortear a solubilidade do meio extrator17,29–32. Em termos qualitativos (diversidade estrututural) e quantitativos (quantidade de analitos alvos), o uso da extração com solventes orgânicos pode orientar para a 32 escolha de abordagens metabolômicas representativas ou simplesmente seletivas. Além disso, a polaridade do solvente extrator pode ser estabelecida à partir de misturas homogêneas, que combinam grupos específicos de solventes orgânicos, bem como solventes orgânicos e água15,27,33. Outra vantagem que justifica o número de trabalhos descritos avaliando-se o uso de solventes orgânicos (ou mistura de solventes) como meio extrator, é a compatibilidade com a maioria dos métodos analíticos utilizados nas abordagens metabolômicas, incluindo a cromatografia líquida de alta e ultra eficiência, a ressonância magnética nuclear e a espectrometria de massas com fonte de ionização por electrospray20,22,25,28. 1.4 Espectrometria de massas com fonte de ionização por electrospray A espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica em que os íons presentes em uma determinada amostra são gerados no estado gasoso e, posteriormente, separados por meio da razão massa/carga (m/z)34. Em termos do fenômeno de geração de íons durante a execução dos experimentos por MS de amostras líquidas, os processos que caracterizam a transferência dessas espécies da fase líquida para gasosa (Figura 3) podem ser sistematizados em três principais transformações químicas: i) os processos de remoção/adição de um elétron e posterior formação de íons radicais (M+. ou M−.); ii) os eventos de protonação ou desprotonação que ocorrem por reações ácido-base, gerando espécies protonadas ([M+H]+) ou desprotonadas ([M-H]-); e iii) a formação de espécies cationizadas (p. ex. [M+Na]+) ou anionizadas (p. ex. [M+Cl]-)34–36. Particularmente, as análises por espectrometria de massas com fonte de ionização por electrospray (ESI-MS) são compostas, em sua maioria, por espécies protonadas ([M+H]+) ou desprotonadas ([M-H]-). Nesse contexto, as análises por ESI- MS permitem escolher o modo de ionização que será utilizado nos experimentos (positivo ou negativo). Além do modo de ionização positivo e negativo, os modernos espectrômetros de massas podem ser empregados para determinar a m/z do analito em alta resolução, dependendo da tecnologia do analisador de massas. Consequentemente, a m/z de subtâncias de interesse podem ser mensuradas em alta resolução por ESI-MS, incluindo análises diretas ou hifenadas à cromatógrafos líquidos de alta e ultra eficiência. Outra contribuição do desenvolvimento dos analisadores de 33 massas ao campo da MS é a possibilidade de execução de experimentos em modo sequencial (p. ex. ESI-MS/MS)17,21,22,34–36. Nesse contexto, os analitos previamente ionizados no espectrômetro de massas (denominados de íons precursores) podem ser analisados em um segundo estágio. Nesse próximo estágio, os íons precursores selecionados serão submetidos ao processo de ativação de íons, o qual consiste em aumentar a energia interna do íon precursor e, consequentemente, favorecer a ocorrência de processos de dissociação em fase gasosa, os quais convertem um dado íon precursor em íons fragmentos17,22,35– 37. A técnica de ativação de íons utilizada com frequência na área de PNs é a dissociação induzida por colisão (CID-MS/MS). Nessa técnica a transferência de energia ocorre a partir da colisão induzida do íon precursor com o gás de colisão (p. ex.: gás N2)17,22,35–38. a Os íons precursores obtidos nas análises por ESI-MS podem ser do tipo: M+., M−., [M + Metal]+, [M + H]+, [M − H]− e [M − Cl]−. b Os íons precursores (carga positiva ou negativa) podem ser conduzidos a um segundo estágio analítico usando instrumentos de ESI-MS/MS ou ESI-MSn. c Esse próximo estágio corresponde ao processo de ativação de íons. Dependendo do tipo de íon gerado e da técnica de ativação de íons empregada, os íons fragmentos são produzidos de acordo com três principais classes de reações: mecanismos clássicos (derivados da ionização por elétrons); e mecanismos com retenção e migração de carga. Figura 3 - Representação dos íons positivos e negativos que podem ser produzidos nas análises por ESI-MS.a,b,c Fonte: Adaptado de Demarque et al.36 (2016). 34 Dessa forma, a intepretação dos processos reacionais envolvidos na formação dos íons fragmentos é uma ferramenta valiosa para a identificação estrutural de PNs previamente isolados. Além disso, a técnica de CID-MS/MS pode ser utilizada para propor estruturas químicas de classes de substâncias em misturas, fato que tem contribuído para o uso crescente da técnica de ESI-MS/MS no desenvolvimento de propostas de estudos metabolômicos, tanto focados em impressão digital metabólica, quanto em perfil metabólico e análise alvo17,22,25,35,36,39. Em contrapartida, a ausência de bases de dados pode ser um fator limitante na interpretação dos espectros de ESI-MS/MS, o que normalmente pode requerer o uso de padrões de referência para confirmar a identidade das substâncias. Nessa perspectiva, o uso integrado da técnica de ESI-MS/MS e química computacional surge como uma excelente alternativa no desenvolvimento de estratégias para a prospecção de PNs bioativos35,36,40,41. 1.4.1 Intepretração de dados de ESI-MS/MS assistida por química computacional As etapas elementares envolvidas nas reações químicas que formam as espécies protonadas ([M+H]+) e desprotonadas ([M-H]-), com base no fenômeno da ionização por electrospray, podem ser interpretadas à partir da teoria ácido/base de Brönsted-Lowry.35,36,42. Por outro lado, na maioria das vezes, os produtos naturais são substâncias orgânicas polifuncionais e, consequentemente, o sítio de protonação ou desprotonação pode ser representado por um ou mais grupos funcionais. Para exemplificar, a Figura 4 apresenta as espécies protonadas de um benzopirano, caracterizada por um equilíbrio químico entre três possíveis sítios de reatividade molecular35,36,42. Em princípio, o sentido do equilíbrio ácido-base encontra-se deslocado para o sítio de maior caráter básico, a carboxila. No entanto, a transferência para a fase gasosa ou a colisão com gás inerte pode promover a migração do próton para regiões de menor caráter básico. Diante das perspectivas apresentadas, o sítio de protonação não pode ser denominado uma região exata da estrutura química para iniciar a(s) proposta(s) de fragmentação por ESI-MS/MS. Do ponto de vista de proposta de identificação estrutural, esses eventos químicos governam o perfil de dissociação em 35 fase gasosa, o que torna a interpretação da química de fragmentação desafiadora35,36,40,42–44. Nessa perspectiva, a literatura tem comprovado que a química computacional demonstra ser uma ferramenta valiosa na predição de propriedades termodinâmicas de substâncias orgânicas por cálculos de acidez, basicidade, energia de dissociação de ligação, barreira de energia envolvida em um dado estado de transição e outros45,46. Dentre os vários métodos computacionais que podem ser empregados para predizer as grandezas termoquímicas citadas, a teoria do funcional de densidade (DFT), em sinergia com a química orgânica, tem sido o modelo mais amplamente utilizado para interpretar e correlacionar os resultados obtidos por ESI-MS/MS35,39– 41,43,44,47–49. Nos últimos dez anos, esses estudos de emprego de DFT em ESI-MS/MS têm sido realizados, principalmente: i) na predição da reatividade de cada sítio molecular em função da adição do próton; ii) na predição do perfil de energia relativa dos íons produtos (perfil de energia relativo ao íon precursor); e iii) na estimativa do perfil de energia da coordenada de reação de um dado rearranjo intramolecular e/ou de um dado mecanismo de fragmentação. Adicionalmente, o uso de descritores apropriados exercem um papel fundamental na descrição de etapas reacionais que ocorrem via um comportamento não clássico45,46,50–52. Nesse contexto, o uso integrado da técnica de ESI-MS/MS e química computacional é uma estratégia inovadora no estudo de matrizes complexas, uma vez que o entendimento dos fenômenos decorrentes dos experimentos por ESI-MS/MS permitem otimizar as etapas de aquisição, tratamento e interpretação de dados. Figura 4 - Proposta para a formação de espécies protonadas de um benzopirano genérico com base no equilíbrio ácido-base de Brönsted-Lowry. Fonte: Elaborada pelo autor. 36 1.5 A família Piperaceae A família Piperaceae é um importante táxon vegetal que engloba árvores, arbustos e plantas suculentas. Suas espécies são distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do planeta. Nessa família estão classificados cinco gêneros e aproximadamente 4300 espécies. Dentre os gêneros, os mais abrangentes são Piper (L.) e Peperomia (Ruiz e Pavon), com 2000 e 1700 espécies, respectivamente53–55. Os gêneros de menor representatividade em número de espécies identificadas são Manekia (Trel.)56, Zippelia (Blume) e Verhuellia (Miq.)57. Do ponto de vista de estudos químicos das espécies de Piperaceae, uma variedade de classes de PNs têm sido isolados e identificados, incluindo lignanas, secolignanas58, flavonoides59-60, alcaloides60, derivados do ácido benzoico54,61, amidas alifáticas e aromáticas62–64 e benzopiranos65–70. O metabólito secundário mais conhecido na família Piperaceae é a piperina, uma amida biossintetizada pela espécie Piper nigrum, popularmente conhecida por pimenta-do-reino (Figura 5). É importante destacar que, do ponto de vista econômico, a exportação de pimenta-do-reino no Brasil alcançou o patamar de 35.000 toneladas no ano de 2014, sendo o estado do Pará o principal produtor desta especiaria71,72. Do ponto de vista da importância farmacológica, a espécie Piper methysticum desempenha um papel que deve ser destacado pela descoberta e comercialização do Ansiopax®, um medicamento desenvolvido com base no extrato seco e padronizado da espécie. Comumente conhecido como Kava-Kava, esse medimento foi regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), sendo indicado para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central, como a ansiedade, a insônia e a hiperatividade73-74. Além disso, é importante ressaltar que a espécie Piper umbellata (sinon. Pothomorphe umbellata) foi inscrita na primeira edição da Farmacopéia brasileira, publicada em 192975. 37 * A principal fonte de acúmulo da piperina - isolada em 1819 pelo químico e físico dinamarquês Hans Christian Oersted - é o fruto da pimenta-do-reino, Piper nigrum (Piperaceae)71. Figura 5 - Estrutura química da piperina.* Fonte: Elaborada pelo autor. Em relação aos estudos de bioprospecção, o isolamento de substâncias majoritárias dos extratos vegetais de Piper e Peperomia conjugados a ensaios biológicos in vitro, têm indicado que o táxon Piperaceae é uma fonte promissora para a pesquisa de novos bioativos com ação de inibição enzimática, antimicrobiana, anti- inflamatória, citotóxica e antiprotozoária. Particularmente, os benzopiranos constituem um grupo de PNs farmacologicamente ativos biossintetizados por espécies de Piper e Peperomia53–55,62,65. 1.5.1 Benzopiranos Os cromenos e cromanos são substâncias heterocíclicas caracterizados pela presença de um núcleo benzopirânico, ou seja, um anel benzeno fundido a um anel pirano, com diferentes níveis de saturação76. Diferentemente dos cromanos, os cromenos são caracterizados pela presença de insaturação no núcleo 1-benzopirano, que pode estar localizada entre os carbonos C2 e C3 ou C3 e C4, sendo denominados de 4H-cromeno e 2H-cromeno, respectivamente (Figura 6)77. Figura 6 - Estruturas químicas e nomenclatura de 1-benzopiranos, incluindo cromano, 2H- cromeno e 4H-cromeno. Esses heterocíclicos são o núcleo base de uma extensa variedade de produtos naturais. Fonte: Elaborada pelo autor. 38 Na natureza, além dos cromanos e cromenos, o núcleo benzopirânico pode estar presente como subunidade em um número significativo de substâncias responsáveis por diversas propriedades farmacológicas, incluindo chalconas, cumarinas, flavonas, tocoferóis (vitamina E) e tetraidrocanabinoides76,78. A potencialidade farmacológica associada aos benzopiranos é atribuída, principalmente, à seletividade da ligação do fármaco a determinadas classes de receptores protéicos com alta afinidade. Essa propriedade ocorre em função do caráter lipofílico desses fármacos, que confere certa eficiência em atravessar o ambiente lipídico hidrofóbico da membrana plasmática celular79,80. Conjugado a esses aspectos, os benzopiranos permitem a introdução de variados substituintes por meio de síntese em fase sólida, incluindo estruturas químicas com um ou mais anéis heterocíclicos. Uma revisão da literatura demonstrou que cerca de 12.000 substâncias naturais, ou originárias de síntese planejadas, contém o núcleo benzopirano em sua estrutura química79,81. Além disso, nos últimos anos, ensaios in vitro têm mostrado o potencial de substâncias com núcleo benzopirano para o desenvolvimento de medicamentos com ação antitumoral82, antimicrobiana83, anticoagulante84 e antitripanossoma68. Com relação aos aspectos químicos, biológicos e biossintéticos dos 2H-cromenos e cromanos presentes em espécies de Piperaceae (Figura 7), vários estudos têm sido realizados85,86. Em se tratando de estudos de bioprospecção dessas duas classes de metabólitos da família Piperaceae, a atividade tripanocida têm tido o maior destaque. No trabalho publicado por Batista Junior et al.87 (2008), o cromeno, ácido gaudichaudiânico, isolado como mistura racêmica do extrato etanólico de folhas de Piper gaudichaudianum, e o seu respectivo análogo obtido por modificação molecular (Figura 8), demonstraram apresentar potente atividade tripanocida frente à forma epimastigota da cepa Y de Trypanossoma cruzi. Nesse trabalho, os autores também evidenciaram o potencial tripanocida de outros 2H-cromenos, incluindo àqueles característicos da espécie P. aduncum. Paralelamente, Mota et al.68 (2009), ao estudarem a composição química do extrato etanólico obtido de partes aéreas de Peperomia obtusifolia, verificaram que a mistura racêmica dos cromanos também é ativa frente à cepa Y de T. cruzi (Figura 9). 39 * Esses 2H-cromenos são biossintetizados em espécies de Piperaceae55. Figura 7 - Estruturas químicas de alguns 1-benzopiranos naturais.* Fonte: Elaborada pelo autor. Nessa perpectiva, estudos com a mistura racêmica do ácido gaudichaudiânico foi um marco importante para entender a relação entre atividade tripanocida e benzopiranos oriundos da família Piperaceae. Assim, Batista Junior et al.65 (2011) descreveram ensaios da mistura racêmica do ácido gaudichaudiânico, e dos seus respectivos enantiômeros frente ao parasita T. cruzi. Os resultados demonstraram a origem de sinergismo na ação tripanocida, uma vez que a atividade foi mais pronunciada para a mistura 50:50, quando comparada ao desempenho de cada um dos enantiômeros separadamente65. Aliado a esses aspectos, o estudo da fração lipofílica do extrato bruto de Peperomia obtusifolia culminou no isolamento, elucidação estrutural e determinação da configuração absoluta dos enantiômeros e diasteroisomeros do cromano ácido, esterificados com monoterpenos endo-borneol e endo-fenchol (Figura 10)66,67. Vale ressaltar que os derivados esterificados com monoterpenos do tipo endo-fenchol são constituintes minoritários. Consequentemente, a descrição acima corrobora que a família Piperaceae pode fornecer alvos farmacológicos promissores no cenário de desenvolvimento de novos medicamentos. 40 * Ensaio biológico in vitro foi realizado com a mistura racêmica desses 2H-cromenos frente a cepa Y de Trypanossoma cruzi87. Figura 8 - Estruturas químicas do 2H-cromeno ácido gaudichaudiânico isolado do extrato etanólico de Piper gaudichadianum (Piperaceae) e, do derivado esterificado obtido por modificação molecular. Fonte: Elaborada pelo autor. Em contrapartida, do ponto de vista de biogênese, a formação de 2H- cromenos e cromanos em plantas é determinada por duas rotas biossintéticas distintas. Assim, as porções aromáticas dos benzopiranos que mostram acúmulo em espécies de Piper e Peperomia são correlacionadas com as vias do chiquimato e policetídica, respectivamente85,86 (Figura 11). Consequentemente, os 2H-cromenos e cromanos de espécies de Piperaceae podem ser distinguidos com base no nível de saturação do anel pirano e no respectivo padrão de substituição do anel aromático. Além disso, estudos químicos têm mostrado a predominância de benzopiranos do tipo 2H-cromeno e cromano em espécies de Peperomia. No entanto, estudos apontam que as espécies de Piper são caracterizadas apenas por benzopiranos do tipo 2H- cromeno53,55,85,86. * A mistura racêmica de cada cromano foi ativa frente frente à cepa Y de Tripanossoma cruzi65. Figura 9 - Estruturas químicas dos cromanos isolados do extrato etanólico de partes aéreas Peperomia obtusifolia (Piperaceae).* Fonte: Elaborada pelo autor. 41 Figura 10 - Estruturas químicas dos cromanos esterificados com monoterpenos do tipo endo- borneol e endo-fenchol, isolados da fração lipofílica do extrato etanólico das partes aéreas de Peperomia obtusifolia (Piperaceae). Fonte: Elaborada pelo autor. Diante da abundância de benzopiranos na família Piperaceae e na particularidade das estruturas químicas de cada subclasse, novos questionamentos merecem ser elucidados a respeito do perfil de fragmentação por ESI(+)-MS/MS de 2H-cromenos e cromanos. Com base na potencialidade dos métodos computacionais baseados na DFT para o cálculo de grandezas termoquímicas de PNs, esse trabalho tem por objetivo investigar se as duas subclasses podem ser descritas a partir de um modelo de dissociação em fase gasosa em comum. Naturalmente, devido a particularidade das estruturas químicas, os resultados podem trazer subsídios para descrever um perfil de fragmentação para cada subclasse (Figura 11). Além disso, com a finalidade de avaliar a eficiência do perfil de fragmentação descrito para 2H- cromenos e cromanos, uma abordagem metabolômica em matrizes complexas foi estudada visando mimetizar as etapas de um estudo de bioprospecção. Figura 11 – Proposta biossintética de benzopiranos em espécies de Piper e Peperomia. Fonte: Adaptado de Batista et al.86 (2018). 42 2 OBJETIVO  Aplicar ferramentas experimentais e computacionais no desenvolvimento de estratégias em química de produtos naturais para a prospecção de 2H- cromenos e cromanos em matrizes complexas. 2.1 Objetivos específicos  Utilizar de métodos computacionais, obtidos por meio da teoria do funcional de densidade, para estudar os principais sítios de protonação de 2H- cromenos e cromanos;  Efetuar cálculos de diagramas de energia da coordenada de reação para a fragmentação do núcleo benzopirano com base no mecanismo de retro Diels-Alder;  Utilizar os dados obtidos por ESI-MS/MS e termoquímica computacional para propor um modelo de fragmentação para 2H-cromenos e cromanos isolados de espécies de Piperaceae.  Preparar extratos vegetais por maceração em solventes orgânicos e triar o perfil metabólico de espécies de Piper e Peperomia por cromatografia líquida de alta eficiência;  Analisar os extratos vegetais de Piper aduncum e Peperomia obtusifolia por ESI(+)-MS/MS;  Propor a identificação estrutural de 2H-cromenos e cromanos em extratos vegetais à partir da interpretação de dados obtidos por ESI(+)-MS/MS e termoquímica computacional. 43 3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Suporte cromatográfico 3.1.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) As análises por CLAE foram realizadas em modo reverso, sendo as colunas cromatográficas analíticas preenchidas com fase estacionária de octadecilsilano (C18):  Phenomenex Luna® C18 (100 × 4,6 mm, com tamanho de partícula de 5 µm) e uma pré-coluna: Phenomenex Luna® C18 (50 × 4,6 mm);  Phenomenex Luna® C18 (250 × 4,6 mm, com tamanho de partícula de 5 µm) e uma pré-coluna: Phenomenex Luna® C18 (50 × 4,6 mm). 3.1.2 Cartuchos para extração em fase sólida e membranas para filtração Para as análises por CLAE as amostras foram previamente submetidas a uma etapa de preparo de amostra, incluindo o processo de extração em fase sólida e filtração. Para esses procedimentos foram empregados:  Cartuchos empacotados com fase estacionária de octadecilsilano, marca Strata® (cartuchos de 3 mL preenchidos com 500 mg de fase estacionária);  Microfiltro de Nylon em carcaça de polipropileno, marca Chromafil®Xtra (membranas de 13 mm de diâmetro e porosidade de 0,22 µm). 3.2 Equipamentos 3.2.1 Instrumento para análises por CLAE  Cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu® (Kyoto, Japão) equipado com bombas LC-6AD, detector DAD modelo SPD-M20A, injetor automático modelo SIL-10AF, degaseificador DGU-20A5, controladora CBM-20A. A 44 interface equipamento/usuário é realizada por meio do software LC-Solution (versão 1.23 SP1). 3.2.2 Instrumentos para análises por espectrometria de massas em alta resolução ou experimentos sequenciais  Espectrômetro de massas Bruker Daltonics® modelo micrOTOF-Q II (Q-TOF) equipado com fonte de ionização por electrospray. Para a aquisição de dados foi utilizado o software Bruker DataAnalysis®, versão 4.1. As análises foram realizadas no Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintéticos (NPPNS), vinculado a Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo. O laboratório é coordenado pelo Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes;  Espectrômetro de massas Bruker Daltonics® modelo maXis impact (Q-TOF) equipado com fonte de ionização por electrospray. Para a aquisição de dados foi utilizado o software Bruker DataAnalysis®, versão 4.1. As análises foram realizadas no Laboratório de Espectrometria de Massas, vinculado ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo. O laboratório é coordenado pelo Prof. Dr. Eduardo Maffud Cilli;  Espectrômetro de massas AB SCIEX® modelo 3200 QTRAP (triplo quadrupolo-íon trap linear) equipado com fonte de ionização por elec trospray. Para aquisição de dados foi utilizado o software Analyst®, versão 1.5.2. As análises foram realizadas no Laboratório de Espectrometria de Massas, vinculado ao Departamento de Química Analítica do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo. O laboratório é coordenado pela Prof.a Dr.a Maria Valnice Boldrin Zanoni. 45 3.3 Plataforma computacional 3.3.1 Supercomputadores  National Science Foundation por meio da XSEDE (Extreme Science and Enginnering Discovery Environment) – Categoria Bridges (PSC), United States;  Núcleo de Computação Científica (NCC/GridUNESP) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Brasil. 3.3.2 Programas para processamento, análise e apresentação de dados  LC-Solution versão 1.23 SP1 (Shimadzu Corporation);  Bruker Data Analysis versão 4.1 (Bruker Daltonics);  ChemDraw 16 (PerkinElmer, Inc.);  Gaussian 09 (Gaussian, Inc.);  Gaussian 03 (Gaussian, Inc.);  Spartan’10 (Wavefunction, Inc.);  CYLview v1.0.561 BETA;  Molekel 5.4.0.8. 3.4 Métodos As etapas experimentais descritas a seguir foram desenvolvidas nos Laboratórios do Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais, vinculados ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo. Paralelamente, a colaboração com o Prof. Ricardo Vessecchi (FFCLRP - USP), e a participação em um estágio de doutorado no grupo do Prof. Dean J. Tantillo (Theoretical Organic Chemistry - UCDAVIS, USA) auxiliaram significativamente no aprendizado e na obtenção de dados relacionados as grandezas termoquímicas de benzopiranos e, consequentemente, para a conclusão da tese de doutoramento. 46 3.4.1 Coleta e classificação de material vegetal Para o desenvolvimento do trabalho, as espécies Piper aduncum, Peperomia obtusifolia, Piper tuberculatum e Piper arboreum foram coletadas na casa de vegetação do Instituto de Química, UNESP, Araraquara, SP, Brasil. As espécies P. aduncum e Peperomia obtusifolia foram identificadas pela Dra Inês Cordeiro do Instituto de Botânica (IBt, São Paulo, SP, Brasil) e suas exsicatas estão depositadas no Herbário do Instituto de Botânica (USP, São Paulo, SP, Brasil), exsicata Kato 0057, e no Herbário do Estado “Maria Eneyda P. Kaufmann Fidalgo” (São Paulo, SP, Brasil), exsicata Kato 070, respectivamente. P. tuberculatum e P. arboreum foram identificadas pelo professor Dr. Guillermo E. D. Paredes da Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (UNPRG, Lambayeque, Perú) e suas exsicatas estão depositadas no Herbário do Instituto de Botânica (USP, São Paulo, SP, Brasil), exsicata Kato-163, e no Herbário do Instituto de Biociências (USP, São Paulo, SP, Brasil), exsicata Cordeiro-1936, respectivamente. 3.4.1.1 Preparo do material vegetal As partes aéreas das espécies estudadas foram coletadas durante o período de 24 h, com intervalo de 8 h entre cada coleta. Essa metodologia foi utilizada com o propósito de aperfeiçoar a representatividade dos cromanos e 2H-cromenos nas amostras, uma vez que as preniltransferases envolvidas na formação de 2H-cromenos em Piper aduncum descrevem ritmo circadiano diurno70. Após coleta, o material vegetal foi submetido à etapa de preparo físico das amostras sólidas. Inicialmente, o material foi mantido em estufa de ar circulante a 40 oC e, a seguir, a redução da granulometria das partículas da matriz foi obtida por processo analítico de pulverização em moinho de facas e peneiramento manual por via seca, com designação das frações granulométricas < 0,35 mm de abertura. A homogeneização das amostras sólidas foi processada manualmente. Ao término de sucessivas etapas de peneiramento, o pó foi transferido para um recipiente de vidro fechado e submetido à mistura por rotação do frasco em várias direções. É importante ressaltar que o volume total de amostra por etapa equivale a 50% da capacidade máxima de armazenamento do frasco. A coleta do material vegetal consistiu na mistura dos órgãos vegetais (partes 47 aéreas), incluindo caules, folhas e frutos. Exceto para Peperomia obtusifolia, as partes aéreas dos indivíduos se referem aos caules e folhas. 3.4.1.2 Isolamento e purificação de 2H-cromenos e cromanos Os 2H-chromenos e cromanos estudados por espectrometria de massas e química computacional foram isolados das espécies de Piper aduncum e Peperomia obtusifolia (Piperaceae), respectivamente. O preparo de extrato bruto e o processo cromatográfico envolvido no isolamento de 2H-cromenos foi realizado como descrito por Morandim et al.70 (2005). Continuadamente, o preparo de extrato bruto e o processo cromatográfico envolvido no isolamento de cromanos foi realizado como descrito por Batista Junior et al.67 (2011). 3.4.2 Estudo de 2H-cromenos e cromanos por espectrometria de massas 3.4.2.1 Preparo de amostra Cada substância foi solubilizada na solução hidroalcoólica (MeOH/H2O, 1/1, v/v) para obter as respectivas soluções estoques na concentração de 1,0 mg/mL. A seguir, cada solução estoque foi diluída para a concentração final de 10 µg/mL (solução de trabalho). As soluções de trabalho foram analisadas por ESI-MS e ESI- MS/MS em modo positivo usando o aparelho micro-TOF-Q Bruker Daltonics. 3.4.2.2 Análises por ESI(+)-MS e ESI(+)-MS/MS Paras as análises por MS, as soluções de trabalho foram inseridas na fonte de ionização por meio de uma bomba de infusão com vazão de 10,0 µL/min, sendo os experimentos divididos em duas linhas analíticas: i) os íons precursores foram analisados em alta resolução, sendo mensurados as m/z das espécies protonadas de cromanos e 2H- cromenos com erro calculado inferior a 5 ppm; e ii) os íons precursores foram submetidos aos experimentos por ESI(+)- MS/MS usando a técnica de dissociação induzida por colisão (CID). O processo de ativação de íons por CID foi realizado com gás N2. Para 48 avaliar o perfil de distribuição de íons, o estudo por CID aplicou uma a faixa de energia (Elab) crescente: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 eV. Os cromatogramas de íons totais foram processados no software Data Analysis. Curvas de energia foram construídas para cada espécie protonada, usando a distribuição relativa de íons (intensidade, em %) em função da energia aplicada no processo de dissociação induzida por colisão (Elab, em eV). Os experimentos por ESI(+)-MS/MS também foram realizados em um espectrômetro de massas AB SCIEX® modelo 3200 QTRAP (triplo quadrupolo-íon trap linear). 3.4.3 Estudo do processo de extração de espécies de Piper e Peperomia 3.4.3.1 Preparo dos extratos vegetais Etapa 1: Cada extrato foi preparado pesando-se 1,0 g de material vegetal e, então, macerado em 10 mL do respectivo solvente (um conjunto de 3 solventes orgânicos foi utilizado: metanol, etanol e acetona). Após adição do solvente orgânico, os suportes de extração foram mantidos em banho de ultrassom por 10 min. Na próxima etapa, cada sobrenadante foi separado do resíduo vegetal por filtração em papel de filtro. Ao término, os extratos foram concentrados a pressão reduzida para fornecer os extratos secos. Etapa 2: Cada extrato foi preparado pesando-se 1,0 g de material vegetal e, então, macerado em 10 mL do respectivo solvente. Um conjunto de 5 solventes orgânicos foi utilizado: etanol, acetona, isopropanol, butanol e acetato de etila. Após adição do solvente orgânico, os suportes de extração foram mantidos em banho de ultrassom por 10 min e, a seguir, cada sobrenadante foi separado do resíduo vegetal por filtração em papel de filtro. Ao término, os extratos foram concentrados a pressão reduzida para fornecer os extratos secos. O delineamento experimental foi definido em triplicada (n = 3). 3.4.3.2 Preparo de amostra 49 Para as análises por CLAE, os extratos vegetais obtidos nas Etapas 1 e 2 do item 3.4.3.1 foram submetidos ao processo de extração em fase sólida (EFS), com a finalidade de remover o material graxo (p. ex., ceras e pigmentos lipofílicos) e pré- concentrar os analitos de interesse. Dessa maneira, para desenvolver o procedimento pré-analítico, cartuchos preenchidos com fase estacionária de octadecilsilano foram previamente ativados com metanol e, a seguir, equilibrados com MeOH/H2O (95/05, v/v). Os extratos foram solubilizados em MeOH/H2O (95/05, v/v) na concentração de 25 mg/mL (razão 1/20, matriz/fase estacionária). Na próxima etapa, 1,0 mL da solução foi aplicada ao cartucho, e os analitos eluídos com 3,0 mL de fase móvel MeOH/H2O (95/05, v/v). As amostras foram concentradas para determinar o rendimento dos extratos vegetais e reservadas para as análises por CLAE. 3.4.3.3 Análises por CLAE Após o processo de EFS, os extratos vegetais foram preparados na concentração de 1,0 mg/mL. Em seguida, as soluções foram filtradas em microfiltro de politetrafluoroetileno de 0,22 µm e analisados por CLAE de acordo com os métodos descritos a seguir. É importante ressaltar que as amostras obtidas nas Etapas 1 e 2 foram analisadas de acordo com os métodos designados por Análises 1 e 2, respectivamente. Análise 1: Para as análises por CLAE foi utilizada uma coluna Luna® C18 (L = 10 cm) e o método cromatográfico inicial foi realizado em gradiente linear exploratório como sugerido por Snyder, Kirkland e Dolan88 (2010), com a inserção de algumas modificações. A fase móvel inicial consistiu de 95% de A (H2O acidificada com 0,1% de ácido acético) e 5% de B (ACN ou MeOH) até 100% de B em 20 min, seguido por 100% de B até 24 min, com posterior equilíbrio da coluna com 5% de B por 6 min. A vazão utilizada foi de 1,0 mL/min, à temperatura de 25 ± 1 oC, o volume de injeção foi de 20 µL e a detecção na região do ultravioleta-visível (UV-Vis), sendo o intervalo de comprimento de onda entre 200 a 600 nm. Análise 2: Para as análises por CLAE foi utilizada uma coluna Luna® C18 (L = 25 cm), e o método cromatográfico inicial foi realizado em gradiente linear exploratório como sugerido por Snyder, Kirkland e Dolan88 (2010), com a inserção de algumas modificações. A fase móvel inicial consistiu de 95% de A (H2O acidificada com 0,1% 50 de ácido acético) e 5% de B (MeOH) até 100% de B em 35 min, seguido por 100% de B até 45 min, com posterior equilíbrio da coluna cromatográfica com 5% de MeOH por 15 min. A vazão utilizada foi 1,0 mL/min, com temperatura de 25 ± 1,0 oC, o volume de injeção de 20 µL e a detecção na região do UV-Vis, sendo o intervalo de comprimento de onda entre 200 a 600 nm. 3.4.4 Análises dos extratos vegetais por ESI(+)-MS e ESI(+)-MS/MS As amostras de Peperomia obtusifolia e Piper aduncum foram solubilizadas em solução hidroalcoólica (MeOH/H2O, 1/1, v/v) na concentração de 0,2 mg/mL. A seguir, as soluções foram filtradas em microfiltro de politetrafluoroetileno de 0,22 µm e analisadas em um aparelho micro-TOF-Q Bruker Daltonics. As soluções foram inseridas na fonte de ionização por meio de uma bomba de infusão com vazão de 1,0 µL/min. Os experimentos por MS foram divididos em duas linhas analíticas: i) os íons precursores foram analisados por ESI(+)-MS, sendo mensurados as m/z das espécies protonadas de 2H-cromenos cromanos com erro calculado inferior a 5 ppm; e ii) os íons precursores foram analisados por CID(+)-MS/MS. O processo de ativação de íons por CID foi realizado com gás N2. Para avaliar o perfil de distribuição de íons, o estudo de fragmentação aplicou uma faixa Elab crescente: 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 eV. Os cromatogramas de íons totais foram processados no software Data Analysis. Curvas de energia foram construídas para cada espécie protonada, usando a distribuição relativa de íons (intensidade, em %) em função da energia aplicada no processo de dissociação induzida por colisão (Elab, em eV). 3.4.5 Métodos computacionais Os cálculos com base na teoria do funcional de densidade (DFT) e buscas conformacionais foram realizados nos softwares Gaussian 0389 (Gaussian 03, 2003; É importante notar que os cálculos foram realizados na Universidade de São Paulo – USP, em colaboração com o Prof. Dr. Ricardo Vessecchi) e 0990 (Gaussian 09, 2013; É importante destacar que os cálculos foram realizados na Universidade Estadual Paulista - UNESP, sob a orientação da Profa Dra Maysa Furlan e na Universidade da 51 California – UCDAVIS, sob a orientação do Prof. Dr. Dean J. Tantillo) e Spartan’1091 (Spartan’10, 2010; É importante evidenciar que os cálculos foram realizados na Universidade da California – UCDAVIS, sob a orientação do Prof. Dr. Dean J. Tantillo), respectivamente. Ilustrações das estruturas moleculares usando o modelo “Balls & Sticks” foram geradas no software CYLview92 (CYLview, 2009). Inicialmente, todas as geometrias foram otimizadas usando o funcional B3LYP com o conjunto de função de base 6-31+G(d,p), uma vez que estudos publicados em periódicos especializados sugerem que este método apresenta os menores erros na predição de geometria e reatividade de substâncias orgânicas45,93–97. Além disso, a escolha do funcional B3LYP considerou o custo computacional e a descrição de um conjunto de dados moleculares para as respectivas sub-classes de benzopiranos, os quais poderão auxiliar trabalhos no futuro. Finalmente, testes críticos foram realizados previamente para as substâncias 2,3-dihidro-pirano e tetrahidropirano, sendo que os resultados com o modelo B3LYP/6-31+G(d,p) indicaram erros absolutos em torno de 2,0 kcal/mol. A metodologia selecionada para os estudos combinou os resultados obtidos nos cálculos baseados na DFT, com os dados gerados na busca conformacional de cada espécie na forma neutra e protonada. Essa estratégia híbrida foi aplicada para determinar os principais sítios de protonação, sendo selecionados descritores para o potencial eletrostático molecular, orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO), carga atômica, afinidade protônica e basicidade em fase gasosa35,98–104. Todos os pontos estacionários foram caracterizados por cálculos de frequência e as energias apresentadas incluem a correção da energia no ponto zero51,105,106. As propostas de fragmentação foram alicerçadas pelos valores de energia relativa de Gibbs dos íons produtos (os valores são relativos ao íon precursor da rota de fragmentação). É importante destacar que a análise dos valores de energia de Gibbs deve ser ponderada, uma vez que a condição de equilíbrio termodinâmico pode não ser atingida no processo de CID107,108. Os cálculos da coordenada intrínseca de reação foram aplicados para corroborar as estruturas dos estados de transição estudados109,110, os quais foram apresentados a partir do diagrama de energia da coordenada de reação51,105,106. Para avaliar a performance do estudo, as geometrias foram re-otimizadas no modelo B3LYP/6-311++G(d,p) para os cálculos de afinidade protônica, basicidade em fase gasosa e na investigação do mecanismo de retro Diels- Alder para a dissociação do núcleo benzopirano. 52 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Estudo do padrão de dissociação de 2H-cromenos isolados de Piper aduncum por ESI(+)-MS/MS e química computacional Para interpretar os espectros de massas sequenciais dos 2H-cromenos 1-3 protonados (Figura 12), cálculos químico-quânticos com base na teoria do funcional de densidade (DFT) foram realizados com a finalidade de mensurar os potenciais sítios de protonação. A análise dos dados obtidos para os 2H-cromenos no modelo B3LYP/6-31+G(d,p) mostrou que a carboxila é o sítio de protonação mais favorável, uma vez que o mapa do potencial eletrostático molecular (MEP) representa a maior densidade de elétrons nas substâncias 1-3 (Figura 13)98. Do ponto de vista espacial, a análise do orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO) mostrou que o sistema π contribui para a distribuição de densidade de elétrons no núcleo benzopirano (Figura 13). Assim, a protonação em 1, por exemplo, pode ocorrer preferencialmente nos grupos carboxila e hidroxila. Além disso, as cargas atômicas (Figura 14) associadas com as análises do MEP e HOMO confirmaram que o grupo carboxila é o sítio mais suscetível a etapa de protonação de 1-398. Figura 12 - Estruturas químicas dos 2H-cromenos 1-3 previamente isolados do extrato bruto das partes aéreas de Piper aduncum (Piperaceae). M.M. indica o valor da massa molecular em unidades de massa atômica (u). Fonte: Elaborada pelo autor. 53 Figura 13 - Mapa do potencial eletrostático molecular (MEP) de 1 calculado no modelo B3LYP/6-31+G(d,p). A magnitude da densidade de elétrons é indicada pelas cores vermelho (maior) e azul (menor). A análise do orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO) é ilustrada a direita do MEP. Fonte: Elaborada pelo autor. Figura 14 - Cargas atômicas (MK) usando o esquema Merz-Singh-Kollman para os átomos de oxigênios de 1-3 calculadas no modelo B3LYP/6-31+G(d,p). Fonte: Elaborada pelo autor. Com base nesses resultados, descritores que ponderam a estabilidade da substância após o evento químico podem ser aplicados para melhorar a qualidade do modelo. Nesse contexto, a afinidade protônica (PA) e a basicidade em fase gasosa (GB) foram mensuradas com modelo B3LYP/6-311++G(d,p)99–102. Os dados apresentados na Figura 14 mostraram que os valores calculados para PA e GB são coerentes com a basicidade de ésteres e, consequentemente, a etapa de protonação na carboxila é energeticamente favorecida em relação aos demais sítios moleculares avaliados111. Assim, a ordem que descreve os principais sítios de protonação do 2H- Potencial eletrostático 0,458 0,290 -0,048 -0,217 0,121 54 cromeno 1 (Figura 15) é: i - carboxila (PA = 213,4 kcal/mol); ii - átomo de oxigênio do anel pirano (PA = 195,6 kcal/mol); e iii - hidroxila fenólica (PA = 185,5 kcal/mol). A mesma analogia pode ser aplicada as substâncias 2 e 3. Além disso, os valores de PA e GB mostraram que a unidade prenila tem efeito sobre o caráter nucleofílico do átomo de oxigênio do anel pirano, como mensurado para o 2H- cromeno 3 (Figura 15). Usando a descrição dos potenciais sítios de protonação, as rotas de fragmentação por ESI-MS/MS foram propostas visando identificar um perfil de dissociação em fase gasosa para as substâncias 1-3. A análise do espectro de massas ESI(+)-MS/MS de 1 mostrou que o íon produto m/z 203 é o pico base (Figura 16). A fragmentação proposta para explicar a formação do íon m/z 203 a partir do íon precursor m/z 235 foi baseada em uma clivagem induzida por assistência do heteroátomo adjacente (Figura 17)36. Por outro lado, ao considerar a hibridização, a protonação de ésteres deve ocorrer no átomo de oxigênio da subunidade acila36,111, o que também reforça os dados de afinidade protônica e basicidade em fase gasosa obtidos no nível de teoria B3LYP/6-311++G(d,p). Portanto, a perda de metanol requer um equilíbrio tautomérico entre os átomos de oxigênio. Figura 15 - Afinidade protônica (valores em negrito) e basicidade em fase gasosa em kcal/mol para 1-3, calculadas para as principais formas protonadas no modelo B3LYP/6- 311++G(d,p). Fonte: Elaborada pelo autor. 55 Figura 16 - Espectro de massas ESI(+)-MS/MS da [1+H]+ obtido em um aparelho Q-TOF selecionando o íon precursor m/z 235. A energia de ativação por colisão empregada no experimento foi de 20 eV. Fonte: Elaborada pelo autor. Nesse contexto, a fragmentação do íon precursor pode ser estabelecida com base no fenômeno de transferência de energia em colisões simples entre o íon precursor e o gás nitrogênio (N2). Do ponto de vista matemático, a transferência de energia em colisões simples pode ser estimada para um determinado íon precursor e um valor de energia de ativação por colisão de referência. Dessa forma, a energia predita corresponde a um valor máximo que pode variar com o gás de colisão utilizado na análise por ESI-MS/MS112. Para exemplificar a álgebra envolvida na predição de transferência de energia, considere a ativação do íon precursor m/z 235 com os seguintes parâmetros: i - energia de colisão = 5 eV; e ii - gás de colisão = N2. Nessas condições, a transferência estimada de energia para o íon precursor m/z 235 corresponde a 12,3 kcal/mol, dado pela solução: [28/(235 + 28)] x 5 eV = 12,3 kcal/mol. Dessa forma, a etapa elementar de transferência do próton é favorecida nas condições de ativação de íons, principalmente, para valores de energia de colisão maiores que 5 eV. Assim, a formação do íon acílio m/z 203 com energia relativa de Gibbs de 15,7 kcal/mol corroborou a perda neutra de MeOH (32 u), após o equilíbrio tautomérico entre os átomos de oxigênio. Na etapa seguinte, o íon produto m/z 175 147.0794 157.0649 175.0737 203.0706 235.0957 +MS2(235.0957), 20eV, 6.9min #413 0.0 0.5 1.0 1.5 5x10 Intens. 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 m/z 56 com energia relativa de Gibbs de 76,2 kcal/mol é obtido a partir da perda de CO (Figura 17, rota a1)36. A análise da curva de energia da [1+H]+ (Figura 18) indicou que a intensidade relativa do íon produto m/z 175 é, aproximadamente, 50% para energia de colisão (Elab) ≥ a 30 eV, sendo a energia máxima transferida nessas condições de 73,6 kcal/mol113,114. Do ponto de vista energético, a formação do íon acílio é favorecida em comparação ao íon feníla, como reforça as energias relativas mensuradas com o conjunto de função de base 6-31+G(d,p), e a distribuição relativa de íons na curva de energia (Figura 18). Concomitantemente, uma segunda rota de fragmentação foi proposta para justificar a formação dos íons produtos m/z 193 e 161. Como esboçado na Figura 17, o ponto de partida para a formação dos íons m/z 193 e 161 é a abertura do anel pirano (rota a2). Na próxima etapa, o par de elétrons não ligante do átomo de oxigênio assiste a formação de uma nova ligação σ (O-H), em sincronia com a formação de uma ligação π (C=C), originando um íon isomérico m/z 235. Em termos energéticos, as etapas envolvidas nesse rearranjo estrutural são limitantes para obter os produtos da transformação e, consequentemente, a perda de 32 u descrita na rota a1 é mais favorável. Em contrapartida, a extensão da conjugação do sistema π contribui para minimizar parte da energia requerida na quebra das ligações químicas36. Além disso, os argumentos que justificam a rota a2 tem origem na etapa de protonação, ou seja, a adição do próton ocorre na carboxila. A energia relativa de Gibbs calculada para o íon isomérico m/z 235 corresponde a aproximadamente 16,0 kcal/mol (Figura 17, rota a2). Na próxima etapa, a perda de 42 u, via eliminação intramolecular do tipo 1,2, explica a formação do íon m/z 193 (∆G = 38,6 kcal/mol)36. Em condições de ESI-MS/MS, uma etapa subseque