RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 20/12/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ”JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE CIRURGIA E REPRODUÇÃO ANIMAL PROGRAMA DE PÓS‐GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL TRANSCRIPTOMA DAS CÉLULAS DA GRANULOSA DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM BOVINOS HENRY DAVID MOGOLLÓN GARCÍA Botucatu‑ SP Dezembro 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ”JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE CIRURGIA E REPRODUÇÃO ANIMAL PROGRAMA DE PÓS‐GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL TRANSCRIPTOMA DAS CÉLULAS DA GRANULOSA DURANTE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR EM BOVINOS HENRY DAVID MOGOLLÓN GARCÍA Tese de doutorado apresentada ao pro‐ grama de pós‐graduação em Biotecnologia Animal para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Animal. Orientador: Prof. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira Coorientador: Prof. Dr. John Kastelic Botucatu‑ SP Dezembro 2021 Palavras-chave: Expressão gênica; Foliculogênese; Ovário; Vacas. Mogollón García, Henry David. Transcriptoma das células da granulosa durante o desenvolvimento folicular em bovinos / Henry David García Mogollón. - Botucatu, 2021 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira Coorientador: John Kastelic Capes: 50504002 1. Bovinos. 2. Folículo ovariano. 3. Expressão gênica. 4. Transcriptoma. 5. Ovários. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. ii Henry David Mogollón García Data da defesa: 20/12/2021 COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira Presidente e orientador Departamento de Cirurgia e Reprodução Animal FMVZ‐ UNESP‐Botucatu Prof. Dr. Rodrigo de Andrade Ferrazza Membro titular Departamento de Zootecnia UEL‐Londrina Prof. Dr. Anthony Castilho Membro titular Departamento de Zootecnia UNOESTE‐Presidente Prudente Prof. Dr. Vitor R. G. Mercadante Membro titular Animal and Poultry Sciences Large Animal Clinical Sciences Virginia Tech Prof. Dr. Pedro Marcus P. Vidigal Membro titular Núcleo de Análise de Biomoléculas (NuBioMol) UFV‐Viçosa iii DEDICATÓRIA Todos os esforços aqui realizados, são dedicados aos animais, família, amigos e, em especial, a Ana So ía, minha ilha, que mesmo estando longe, sempre esteve perto. iv AGRADECIMENTOS Eternamente agradecido aos animais que emprestaram seu corpo e alma e permitiram o desenvolvimento do curso. Eternamente agradecido aos meus pais Henry de Jesús Mogollón Muñoz e María Floresmila García Montañez, às minhas irmãs Heidy Johana Mogollón García, Sandra GiselaMogollón García, Yinna TatianaMogollón García e Jésica PaolaMogollón García, à namorada e parceira da vida Gabriella Costa Ribeiro, à Rosalba Ayala e, em especial, à minha ilha, Ana So ía Mogollón Ayala, combustível que alimenta as minhas células. Eternamente agradecido aos meus amigos e amigas Juliana Moreno, Diego Sanz, Brayan Sayed Lopéz, Natália Celeita Rodríguez, Antônio Guilherme Roncada Pupulim. Yeimer Antonio Santiago e Felipe Bordin, vocês tem feito com que a caminhada pela vida seja mais agradável. Eternamente agradecido aos colegas da equipe, Jaqueline Carvalho, Eduardo Rossi, Flávia Florencio de Athayde e Guilherme Rizzoto. Eternamente agradecido ao professor Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira quem fez de mim uma melhor pessoa, me apoiando nos momentos bons e ruins. Eternamente agradecido ao professor Dr. John Kastelic, mestre com um grande co‑ ração, sempre disposto a espalhar conhecimentos. Eternamente agradecido aos funcionários da FMVZ, estagiários, residentes, admi‑ nistrativos e professores que contribuíram com o desenvolvimento da pesquisa. Por im, agradecido com a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio do projeto, com o Conselho Nacional de Desenvolvimento Cien‑ tí ico e Tecnológico (CNPq) e o Programa Estudante Convênio (PEC‑PG) pela bolsa de estudos. Agradecemos ao apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Su‑ perior (CAPES), Brasil (código de inanciamento 001). SUMÁRIO Capítulo 1..................................................................................................................................8 1. Introdução e justificativa.......................................................................................................9 2. Revisão de literatura.............................................................................................................12 2.1. Desenvolvimento folicular em bovinos................................................................12 2.2. RNA‐Seq e reprodução.................................................................................................12 2.3. Perfil transcriptômico durante o desenvolvimento folicular em outras espécies.......................................................................................................................................13 2.4. Perfil transcriptômico durante o desenvolvimento folicular em bovinos........................................................................................................................................14 2.5. Genes de interesse durante o desvio folicular...................................................16 3. Referências................................................................................................................................18 Capítulo 2...............................................................................................................................24 Artigo “Transcriptomic analysis of bovine granulosa cells during follicular development” ……………………………………………………………………………………….25 Mogollón García, H.D. Trasncriptôma das células da granulosa durante o desen‑ volvimento folicular em bovinos. Botucatu 2021. 39p. Defesa de Tese Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Os mecanismos pelos quais ocorrem o desenvolvimento folicular e o estabelecimento da dominância ainda são apenas parcialmente compreendidos, constituindo‐se como peças‐chave para o completo entendimento não apenas da isiologia reprodutiva, como também das patologias. O objetivo do estudo foi descrever, holisticamente, a expressão diferencial de genes nos estágios foliculares de pré‐desvio, desvio, pós‐ desvio e pré‐ovulatorio. Um total de 1805 genes foram diferencialmente expressos (DEGs). Desses DEGs, cento e cinco apresentaram intersecção nos diferentes estágios foliculares. A análise em conjunto da ontologia gênica (GO), enriquecimento em con‐ junto de genes (GSEA) e a interação de proteína‐proteína (IPP), mostrou que os DEGs se associaram a respostas esteroidogênicas, proliferação celular e processos vascu‐ lares no folículo durante o estágio de desvio. No folículo pós‐desvio e pré‐ovulatorio, esses processos mantiveram estreita relação com a resposta in lamatória; fenômeno que foi liderado, principalmente, por DEGs da família quinase. Moléculas como Fig‐α, kit‐ligante, FGFs e seus receptores, GDF‐9 e BMP‐15, IGFs, ativina, EGF, KGF, peptídeo intestinal vasoativo e angiotensina‐II foram identi icadas em vários estudos prévios e são relacionadas a numerosas atividades no contexto da dinâmica ovariana como a esteroidogênese, o crescimento e apoptose celular e a angiogênese. O nosso es‐ tudo complementou esses achados e mostrou a importância de DEGs que ainda não tinham sido descritos. Dentre esses DEGs, destacam‐se a ADM, NPR1, NPR3, CSF1R, RAGE. Em conclusão, os nossos resultados evidenciaram que a expressão do gene ADM, NPR1 e 3 é diferente entre o folículo desvio um e dois, regulando a vasculariza‐ ção e processos de desenvolvimento. Adicionalmente, a resposta in lamatória entre o folículo pós‐desvio e o folículo pré‐ovulatorio foi caracterizada pela expressão de genes agrupados no termo ontológico de RAGE e família das quinases, respectiva‐ mente. Palavras chave: Vacas; foliculogênese; expressão gênica; ovário Mogollón García, H.D. Transcriptomic analysis of bovine granulosa cells during follicular development. Botucatu 2021. 39p. Botucatu 2021. Defesa de Tese Facul‐ dade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Esta‐ dual Paulista. ABSTRACT The mechanisms by which follicular development and the establishment of domi‐ nance occur are still partially understood, constituting key elements for a complete understanding not only of reproductive physiology but also of pathologies. The aim of the study was to describe, holistically, the differential expression of genes in the pre‐deviation, deviation, post‐deviation, and pre‐ovulatory follicular stages. A total of 1805 genes were differentially expressed (DEGs). One hundred and ive DEGs pre‐ sented intersections in the different follicular stages. Together, gene ontology (GO), pooled gene enrichment (GSEA) and protein‐protein interaction (IPP) showed that DEGs were associated with steroidogenic responses, cell proliferation, and vascular processes in the follicle during the deviation. In the post‐deviation and pre‐ovulatory follicles, these processes were closely related to the in lammatory response; a phe‐ nomenon that was led mainly by DEGs of the kinase family. Molecules such as Fig‐ α, kit ligand, FGFs, and their receptors, GDF‐9 and BMP‐15, IGFs, activin, EGF, KGF, vasoactive intestinal peptide, and angiotensin‐II were identi ied in several previous studies and are related to numerous activities in the context of ovarian dynamics, notably steroidogenesis, follicle growth and apoptosis, and angiogenesis. Our study complemented these indings and showed the importance of DEGs that had not yet been described. Among these DEGs, were relevant ADM, NPR1, NPR3 and CSF1R. In conclusion, our results showed that the expression of the gene ADM, NPR1, and 3 is different between follicle deviation one and two, regulating vascularization and de‐ velopmental processes. Additionally, the in lammatory response between the post‐ deviation follicle and the pre‐ovulatory follicle was characterized by the expression of genes grouped in the ontological term of RAGE and kinase family, respectively. Palavras chave: cows; folliculogenesis; gene expression; ovary CAPÍTULO 1 9 1 Introdução e justi icativa De forma muito particular, o consumo de leite e derivados fornece inúmeros fato‐ res protetores à saúde humana, servindo, por exemplo, como fonte abundante de cál‐ cio, de micro‐organismos bené icos à microbiota do trato gastrointestinal, ou mesmo servindo de base para produtos não‐alimentícios, tais como hidratantes corporais (PEREIRA, 2014). Vale lembrar que, mesmo entre as pessoas que se declaram vege‐ tarianas, há subgrupos adeptos ao consumo de leite e/ou produtos lácteos, (KESS‐ LER et al., 2016), como os ovolactovegetarianos e os estritamente lactovegetarianos, o que evidencia a elevada demanda deste produto. Por essa perspectiva, ica claro que ainda há muito espaço para o desenvolvi‐ mento do segmento leiteiro, e é nesse nicho que a ciência deve se envolver. Queixas frequentes como altas taxas de vacas subprodutivas e falta de persistência na lac‐ tação estão intimamente atreladas à baixa e iciência reprodutiva. Dessa maneira, as biotecnologias da reprodução são capazes de introduzir inúmeros ganhos, tais como: melhoramento genético, padronização do rebanho, melhor manejo zootécnico, e oti‐ mização da aplicação de gametas masculinos e femininos (CUNNINGHAM, 1999). As biotecnologias reprodutivas, indispensáveis aliadas dos diversos setores da pecuária mundial, estão em constante processo de atualização e aprimoramento, no intuito de acompanhar as novas exigências da sociedade global contemporânea e o desenvolvimento de recentes técnicas de pesquisa, fortemente impulsionadas pelos avanços da ciência computacional e da biologia molecular. Portanto, existe ainda muito a se descobrir: moléculas a serem reveladas, mecanismos a serem esclareci‐ dos e todas as suas implicações. Dentre os eixos da pesquisa reprodutiva moderna, um dos que mais despertam interesse cientí ico é o que aborda a dinâmica ovariana. Existe conhecimento já muito bem sedimentado acerca do desenvolvimento folicular sob a perspectiva endócrina: os efeitos do eixo hipotalâmico‐hipo isário‐gonadal (PRICE; WEBB, 1988) se encon‐ tram amplamente discutidos na literatura, focando‐se em interações hormonais, me‐ canismos de retroalimentação, e suas consequências para os ciclos estral e menstrual das mais diversas espécies. Em relação especí ica aos bovinos, que são poliéstricos anuais, Fortune et al., (1988) evidenciaram a presença de ondas promotoras do crescimento folicular em resposta a estímulos hormonais do eixo supracitado, de tal modo que foi demons‐ trado (ADAMS et al., 1992) que é fundamental o aumento sérico do hormônio hi‐ po isário folículo‐estimulante (FSH) para que ocorra a emergência de uma onda de crescimento folicular, quando os próprios folículos, através da síntese de estróge‐ nos (principalmente, 17ß‐estradiol) pelas células de sua camada granulosa, inibem a liberação hipo isária de FSH, de tal modo que apenas um folículo (na maioria dos 10 casos) progride em desenvolvimento, sendo considerado dominante, enquanto os demais se tornam atrésicos. Tal evento foi descrito como divergência folicular (tam‐ bém conhecida como desvio) (GINTHER et al., 1996, 1999). Apesar do conhecimento acumulado relacionado aos fatores endócrinos que con‐ trolam o desenvolvimento folicular ovariano, os mecanismos moleculares que regu‐ lam a seleção de um folículo e o estabelecimento da dominância, a cada onda folicular, permanece, em grande parte, desconhecido. Como consequência, as pesquisas vem se voltando, cada vez mais, às técnicas de biologia molecular e à bioinformática para investigar a organização e o funcionamento genômico detalhado das células folicula‐ res (ZIELAK‐STECIWKO; EVANS, 2016). O destino dos folículos se subordina ao controle de fatores endócrinos, mas seus efeitos são também in luenciados por outros fatores intraovarianos, que agem no in‐ terior da célula ou por mecanismos parácrinos e/ou autócrinos. Neste sentido, o iní‐ cio e a regulação do estádio de desenvolvimento pré‐antral são predominantemente conduzidos por fatores de crescimento locais (AERTS; BOLS, 2010; MAGALHÃES et al., 2012). Diversas moléculas estão envolvidas na determinação da dominância folicular, dentre as quais se encontram os receptores de hormônio luteinizante (LH), propostos por Beg et al., (2001), além de numerosos fatores autócrinos e parácrinos do próprio ovário (MIHM et al., 2008). Adicionalmente, angiotensina II (FERREIRA et al., 2011), fatores de crescimento ibroblásticos (FGFs) (BURATINI et al., 2007), fator de cres‐ cimento semelhante a insulina (IGF1) e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGFBP) vêm sendo apontados como alguns dos principais en‐ volvidos na expressão de genes encarregados de variadas atividades regulatórias, como proliferação, diferenciação, e atresia folicular (PORTELA et al., 2010), que são essenciais à esteroidogênese e à proteção contra apoptose. Muitos estudos vêm sendo conduzidos, em inúmeras espécies, em busca de mar‐ cadores gênicos, protéicos, e metabolômicos que permitam uma compreensão mais integrada da isiologia e da patogênese das afecções que acometem o trato reprodu‐ tivo feminino (LABRECQUE; SIRARD, 2014; UPADHYAY et al., 2013). Essa abordagem vem sendo possível graças aos novos conceitos, ao re inamento das técnicas de pes‐ quisa e de análises de dados (MAZZONI et al., 2017). Talvez, a ciência que abrange os conceitos moleculares, estatísticos e computacionais de maior importância é a trans‐ criptômica. Estudos desenvolvidos na última década que utilizaram transcriptômica, permitiram revelar avanços importantes na área de reprodução animal, especi ica‐ mente, no desenvolvimento folicular. Esses estudos foram realizados em Iaque (LAN et al., 2014), ovelhas (CHEN et al., 2015; HERNÁNDEZ‐MONTIEL et al., 2019; PUT‐ TABYATAPPA et al., 2020), cabras (LIU et al., 2020), búfalos (CAPRA et al., 2020), porcos (YANG et al., 2020), ratos (BIAN et al., 2020) e bovinos (CHRISTENSON et al., 11 2013). Os resultados desses estudos contribuíram na compreensão dos principais mecanismos relacionados com a expressão gênica conexa com o desenvolvimento folicular e a atividade ovariana. No entanto, em bovinos, o número de estudos moleculares, que incluem a análise dos transcritos nas diversas fases do desenvolvimento folicular ainda é limitado. LI et al., (2016) estudaram o transcriptoma das células da granulosa de bovinos nas fases de pré‐desvio e no início do desvio, estudo que excluiu as fases restantes de aquisição da capacidade ovulatória (12 mm) e pré‐ovulatória. Um outro estudo realizado por Romereim et al., (2017) envolveu uma abordagem transcriptômica das células lute‐ ais, da granulosa e da teca, sendo que as células da granulosa e da teca foram colhidas do folículo com capacidade ovulatória e, do mesmo modo, excluiu as fases inicias do desenvolvimento folicular. Apesar desses estudos utilizarem a transcriptômica e se‐ rem realizados em bovinos, não contemplam uma visão holística dos principais fenô‐ menos moleculares associados às diferentes etapas do desenvolvimento folicular. Desse modo, o objetivo do presente estudo foi descrever a expressão gênica das células da granulosa de vacas Holandesas em quatro fases distintas de desenvolvi‐ mento folicular (pré‐desvio, desvio, após a aquisição da capacidade ovulatória e 24 horas após a indução da ovulação com GnRH), empregando‐se a técnica de RNA‐seq. 12 2 Revisão de literatura 2.1 Desenvolvimento folicular em bovinos Em vacas, são observados múltiplos folículos nos estágios iniciais de desenvol‐ vimento até o momento do desvio, quando, um folículo será selecionado e poderá, se as condições isiológicas permitirem, ovular; durante o tempo em que os folículos restantes sofrerão atresia (MIHM et al., 2002). O hormônio liberador das gonadotro‐ pinas estimula a secreção do hormônio folículo estimulante (FSH) que, nas células da granulosa, de folículos de inidos como pré antrais, se liga ao receptor de FSH (FSHr) estimulando o recrutamento de folículos pequenos com tamanhos em média de 3‐4 mm (ADAMS et al., 1992). O ciclo estral em vacas pode apresentar duas ou três ondas de crescimento folicu‐ lar, mostrando, respectivamente, uma duração média de ∼21 e 22 dias (GINTHER et al., 1989). A morfologia do folículo sofre alterações estruturais, há proliferação das células da granulosa, fenômeno que é acompanhado com o alinhamento das células da teca. Desse modo, essas alterações con luem na conversão de folículos primários em secundários e terciários (AUSTIN et al., 2001). O processo de esteroidogênese é estimulado, as células da teca produzem andrógenos, que são transformados em es‐ trógenos pelas células da granulosa (BADINGA et al., 1992). A função do estrógeno produzido é realizar uma retroalimentação negativa do FSH na glândula pituitária. Dessa forma, o folículo mais desenvolvido, continuará seu crescimento já superando o momento denominado de desvio (GINTHER, 2016). Durante o desvio, o folículo mais desenvolvido (dominante) produz inibina, hormô‐ nio que diminui o FSH nos folículos em desenvolvimento denominados como subor‐ dinados (GOOD et al., 1995). Os folículos subordinados entrarão em atresia, processo que também pode ser observado em folículos dominantes sob exposição a elevadas concentrações de P4 (AUSTIN et al., 2001). Em contraste, quando o folículo domi‐ nante se desenvolve com concentrações de P4 diminuídas, produto da luteólise, há uma produção do hormônio luteinizante (LH) que estimulara a ovulação (GINTHER, 2016). 2.2 RNA‑Seq e reprodução A transcriptômica faz parte das conhecidas ”ômicas”e é de inida como ”o conjunto de moléculas de mRNA geradas por uma célula ou população de células”(MCGETTIGAN, 2013). A transcriptômica foi desenvolvida com o objetivo de diminuir as restrições, até então encontradas, na técnica de hibridização. Com a chegada da transcriptômica, tem sido possível mapear e quanti icar os mRNAs, mediante o método conhecido como sequenciamento do RNA (RNA‐seq sigla em inglês). O resultado inal do RNA‐ seq permite obter a expressão dos genes na linhagem celular de interesse (WANG; 13 GERSTEIN; SNYDER, 2009). O primeiro artigo que incluiu o RNA‐seq foi publicado no ano 2006 (BAINBRIDGE et al., 2006) e foi desenvolvido com a tecnologia Roche 454, entretanto, foi no inal da década passada que as análises de RNA‐seq evoluíram com a chegada da tecnolo‐ gia de leitura curta concebida pela irma conhecida hoje como Illumina, achado que possibilitou a quanti icação dos transcritos do genoma do rato, acompanhado pela descrição de genes novos e genes sem anotações existentes na época. Do mesmo modo, foram identi icados promotores adicionais bem como regiões 3’ e exons no‐ vos (MORTAZAVI et al., 2008). A primeira análise de RNA‐seq na área de reprodução em bovinos, estudou as mudanças no per il transcriptômico de embriões cultivados in vitro, 1,6 milhões de bases não anotadas em 1.785 novas unidades transcritas foram reveladas (HUANG; KHATIB, 2010). No mesmo ano e, considerando a linha de produção de embriões, um outro estudo comparou o transcriptôma de embriões da espécie suína recuperados no dia 2 e cultivados in vitro com embriões colhidos in vivo no dia 6 após a insemina‐ ção arti icial (IA). O gene SLC7A1 apresentou elevada expressão no grupo cultivado in vitro (BAUER et al., 2010). Sob outra perspectiva, o RNA‐seq em espermatozoides bovinos criopreservados, revelou um aumento na expressão dos genes PRM1 e HMGB4, esse estudo constituiu o primeiro per il transcriptômico da espécie (CARD et al., 2013). Adicionalmente, a implementação do RNA‐seq permitiu a caracterização da contribuição de touros pre‐ viamente classi icados com alta e baixa fertilidade com a expressão de alguns genes nos embriões originários de ambos tipos de sêmen (KROPP et al., 2017). No gara‐ nhão, o primeiro relato do per il transcriptômico do espermatozoide, associou a pre‐ sença dos genes com as anotações em processos moleculares de transporte de íons e sinais de tradução ativadas por quimiotaxia. Além disso, os componentes celulares de maior importância foram a membrana e as vesículas. O estudo, também sugeriu a incorporação de novos exons, variantes de splice e outras localizações para os genes PKM2, CRIPS3, TNP2 e PRM1 (DAS et al., 2013). 2.3 Per il transcriptômico durante o desenvolvimento folicular em outras especies O ovário tem como função principal a produção de oócitos que serão fertiliza‐ dos. A produção de oócitos é precedida pelo desenvolvimento folicular, durante o qual os folículos sofrem alterações morfológicas, hormonais, moleculares entre ou‐ tras (GINTHER, 2016). Ao inal do desenvolvimento, o folículo é constituído por uma lâmina basal contornada por células da granulosa e, no centro, é apresentada uma cavidade de líquido denominada antro (HATZIRODOS et al., 2014a). O oócito tem comunicação parácrina com as células da granulosa, relação que ao longo do desen‐ volvimento folicular, altera a expressão gênica (ZHANG et al., 2010). Em humanos, 14 empregando‐se microarray, foram gerados os transcriptomas das células da granu‐ losa e células do cumulus derivadas de folículos pré‐ovulatórios; cento e cinquenta e seis genes diferencialmente expressos mudaram a sua expressão > 8 (fold change) com ontologia genética associada a funções celulares de resposta in lamatória, ma‐ triz extracelular e comunicação inter‐celular. Do mesmo modo, foram identi icados 1406 genes com expressão entre 2‐8 (fold change), com proliferação e metabolismo dos lipídeos como funções celulares destacadas (GRØNDAHL et al., 2012). O transcriptôma das células da granulosa e da teca foi estudado em éguas du‐ rante o desenvolvimento do folículo pré‐ovulatório utilizando‐se microarray. Nesse estudo, o folículo foi classi icado como: dominante precoce (diâmetro ≥ 22 mm), dominante tardio (diâmetro ≥ 33 mm) e pré‐ovulatório (34 hr após a administra‐ ção de eCG). Os genes diferencialmente expressos, que aumentaram a expressão no folículo dominante tardio, foram relacionados com a resposta imune e in lamató‐ ria (PTX3, NTS, SPP1, S100A12, OLR1), matriz extracelular e remodelação do tecido (HAS2, PCOLCE2, PLAT, TNFRSF12A, EFEMP1). Os genes que apresentaram uma ex‐ pressão decrescente nessa mesma fase, foram HSD17B1, CPS1; sendo relacionados com a esteroidogênese e remoção do excesso de amônio, respectivamente. Adici‐ onalmente, os genes ASPM, TPX2, CDC20, BUB1, BUB1B e TKK que desempenham um papel regulador na divisão celular, apresentaram uma diminuição na expressão. Ao mesmo tempo, no folículo pré‐ovulatório, foi observado o aumento na expressão dos genes SCGB2A1 e SCGB2A2, ortólogos das secretoglobulinas em humanos; PLAU, FGG, EDN2, PTGS2 e NTS, conexos com o fenômeno da ovulação, BDNF, NELL2, DKK1 e NIM1‐like associados com funções de diferenciação e sobrevivência da célula, AG‐ PAT4 e APOE relacionados com o metabolismo dos lipídeos e, o gene DEFB1, asso‐ ciado à imunidade. Os genes SPC25, TOP2A, UBE2C, HFM1, ASPM, NDC80, KIF11, CDC20 associados a processos de divisão celular e, os genes HSD17B1 e THSD1, exi‐ biram uma expressão decrescente (DONADEU et al., 2014). 2.4 Per il transcriptômico durante o desenvolvimento folicular em bovinos Em bovinos, a comparação das células da teca com as células da granulosa, bem como, entre as células da granulosa antrais e as células da granulosa associadas à membrana basal, antes e 21 hrs após indução do pico de LH, seguido da administra‐ ção exógena de GnRH, revelou a expressão de 11000 genes, dos quais somente 2% células da teca e 25% células da granulosa mudaram a sua expressão (CHRISTEN‐ SON et al., 2013). O pico de LH regulou a expressão dos mesmos genes nas células da teca e da granulosa. Além disso, as células da teca mostraram 57 genes únicos e, os genes CYP17A1 e NR5A1 pertenceram ao grupo de genes com expressão diminuída. Descoberta importante foi também, o aumento na expressão dos genes PTX3, RND3, PPP4R4 nas células da teca e da granulosa. Adicionalmente, a comparação células 15 da granulosa antrais e as células da granulosa associadas à membrana, demonstrou similaridade na expressão gênica (CHRISTENSON et al., 2013). Os principais processos moleculares que acontecem durante o desenvolvimento folicular e a maturação das células da granulosa foram estudados em bovinos. A com‐ paração foi realizada entre folículos < 5 mm e >10 mm. Os folículos maiores foram afetados nos processos de sinalização, imunologia e rearranjo celular. As redes de interação destacadas foram Notch, SLIT/ROBO, PI3K, ITGB5 e ERKs. Igualmente, os genes com atividade proeminente nos folículos maiores foram STAT e XBP1. Em con‐ trapartida, nos folículos menores, os genes KIT, IHH e MEST, associados a processos de desenvolvimento, foram os mais destacados; o gene MGEA5, relacionado com ati‐ vidades enzimáticas, foi identi icado como upstream (HATZIRODOS et al., 2014a). A expressão dos genes das células da teca interna, ao comparar folículos de ta‐ manho 9‐12 mm vs 3‐5 mm, revelou a ativação de processos de diferenciação do mi‐ oblasto, ubiquitinação das proteínas, oxido nítrico e fator de transformação do cres‐ cimento β. Adicionalmente, no folículo maior, a diminuição e o aumento respectivo da expressão dos genes WNT2B e FRZB induziu à supressão da via de sinalização Wnt, fenômeno possivelmente explicado pela alteração da função e estrutura celular (HATZIRODOS et al., 2014b). Nesse contexto, um outro estudo em bovinos, comparou o transcriptôma das cé‐ lulas da granulosa do folículo pré‐desvio (4 mm) vs o início do desvio (> 8.5 mm) (LI et al., 2016). Os genes com aumento ou diminuição na expressão gênica foram 42 e 43, respectivamente. Os genes com maior mudança na expressão gênica, den‐ tro de cada grupo (upregulated ou downregulated) respectivamente, foram GAPDH, gene associado à união de NAD e, o gene ACTR1A, relacionado com a motilidade de vesículas microtubulares. No início do desvio, os genes CYP11A1 e CYP19A1 mos‐ traram aumento na sua expressão, esses genes estão relacionados com a síntese de hormônios esteroides. O per il transcriptômico das células da granulosa nos folículos atrésicos, também foi estudado (HATZIRODOS et al., 2014c). As comparações da expressão diferencial dos genes mostraram que, no folículo atrésico, as funções de morte celular, desenvol‐ vimento do órgão, desenvolvimento do tecido e desenvolvimento embrionário foram afetadas. Ainda, os processos relacionados com o gene TP53 foram predispostos a serem ativados. As vias destacadas foram in lamatórias/ ibróticas, fator de transfor‐ mação de crescimento β e fator de necrose tumoral‐α (HATZIRODOS et al., 2014c). Nas células da teca, o per il transcriptômico da maioria dos genes diferencialmente expressos no folículo atrésico, foi associado com citocinas, hormônios, receptores, ci‐ clo celular e replicação do DNA (HATZIRODOS et al., 2014d). Os genes TP53, IKBKB e TGFB1 apresentaram aumento na expressão de transcritos. Adicionalmente, como genes upstream foram identi icados Retinoblastoma 1, Fator 1 de transcrição E2 e 16 fator de crescimento do hepatócito (HATZIRODOS et al., 2014d). Em estudo recente de nosso laboratório (FERRAZZA et al., 2017) realizamos a análise proteômica do luido folicular de bovinos em quatro momentos críticos do desenvolvimento folicular [fases pré‐desvio (7 mm), desvio (F1= 8,5 mm), de aquisi‐ ção da capacidade ovulatória (12 mm) e pré‐ovulatória (24 hora após GnRH)], esta‐ belecendo uma visão integrada das funções proteicas e suas inter‐relações durante o desenvolvimento folicular. Foram identi icadas 143 proteínas, das quais 22 tive‐ ram expressão diferenciada ao longo do desenvolvimento, tendo os momentos pré‐ desvio, pós‐desvio e pré‐ovulatório apresentado per is proteicos distintos. Quando estudados esses per is, importantes vias metabólicas foram identi icadas, como as de sinalização da resposta de fase aguda, do sistema de coagulação, do sistema com‐ plemento, de ativação do receptor hepático/retinoide X, e de biossíntese de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio. De acordo com o estágio de desenvolvimento folicular essas vias se alternaram apresentando‐se ativadas ou inibidas. Por exemplo, a via do sistema de coagulação apresentou‐se suprimida nos momentos pré‐desvio e de desvio folicular, contudo, foi seletivamente ativada no momento pós‐desvio, vol‐ tando a ter regulação reduzida no momento pré‐ovulatório. A dinâmica proteica ob‐ servada nesta via, sugere que a sua modulação é fator indispensável, de acordo com o estágio de desenvolvimento folicular, para a remodelação contínua da matriz ex‐ tracelular (FERRAZZA et al., 2017). 2.5 Genes de interesse durante o desvio folicular O desvio folicular acontece quando os folículos recrutados são diferenciados pelo diâmetro; desse modo, um folículo atinge o maior diâmetro em relação aos restan‐ tes que, posteriormente, sofrerão atresia (Ginther, 2016). Estudos que empregaram transcriptômica, permitiram relacionar alguns genes com a possível capacidade de um folículo se tornar dominante durante o desvio. Dentre esses genes, destacam‐se alguns com funções esteroidogênicas como o CYP19A1, CYP11A1, HSD17B1 e HSD3B1 (GUPTA et al., 2014; LI et al., 2016 e 2017; YAO et al., 2021). Um aumento na ex‐ pressão dos genes CYP19A1 e CYP11A1 no maior folículo versus o segundo maior folículo, durante o começo do desvio, estimula a produção de proteínas que levam o mesmo nome e que, no caso da CYP19A1, regulada pelos receptores de estrogênio e cAMP/protein kinase A ativa os processos moleculares que permitem a adquisição da dominância folicular, cascata de eventos que é sustentada pelo receptor de FSH nas células da granulosa (LUO et al., 2006). Um outro mecanismo que modula a esteroidogênese no folículo durante o começo do desvio pode ser explicado pelo efeito potencializador da via Wnt na ação do FSH (GUPTA et al., 2014). A via Wnt é responsável pela morfogênese de tecidos, função re‐ alizada na embriogênese e na reparação tecidual (PATEL et al., 2019). A via Wnt pode 17 estimular processos moleculares através de três vias: a canônica, via não canônica e via Wnt/Ca2+. A via canônica é caracterizada pela união do ligante Wnt ao recep‐ tor e co‐receptor, respectivamente, frizzled (FZD) e receptor relacionado à proteína (LRP); posteriormente, oDisheveled 1 (DVL1) é ligado a Axina 2 (AXIN2), mecanismo que impede a formação do complexo AXIN2/GSK3b/APC/ CTNNB1 (complexo de de‐ gradação proteolítica do CTTNNB1) e permite a transcrição de genes (BOYER et al., 2010). Em células da granulosa de folículos no começo do desvio e, cultivadas com IWR‐1 (inibidor de Wnt), foi observada uma diminuição da produção de estradiol e numero de células, efeito que, molecularmente, foi caracterizado pelo aumento da proteína AXIN2 e inibição da proteína CTNNB1. No entanto, o mesmo tratamento, sem a inclusão de FSH no meio de cultura, não ocasionou diminuição na produção de estradiol, resultados que demonstram uma ação da via Wnt FSH dependente (GUPTA et al., 2014). 18 3 REFERÊNCIAS ADAMS, G. P. et al. Association between surges of follicle‐stimulating hormone and the emergence of follicular waves in heifers. Journal Reproduction and Fertility, v. 94, p. 177–188, 1992. AERTS, J. M. J.; BOLS, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: A review with emphasis on the bovine species. Part I: folliculogenesis and pre‐antral follicle development. Re‑ production in Domestic Animals, v. 45, n. 1, p. 171–179, 2010. AUSTIN, E. J.; MIHM, M.; EVANS, A. C. O.; KNIGHT, P. G.; IRELAND, J. L. H.; IRELAND, J. J.; ROCHE, J. F. Alterations in intrafollicular regulatory factors and apoptosis during selection of follicles in the irst follicular wave of the bovine estrous cycle. Biology of Reproduction, v. 64, n. 3, p. 839–848, 2001. BADINGA, L.; DRIANCOURT, M. 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